WO2005017152A1 - 銅イオンの添加により植物の形質転換効率を向上させる方法 - Google Patents

銅イオンの添加により植物の形質転換効率を向上させる方法 Download PDF

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently introducing a gene into a plant material via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • Gene transfer by the agrobacterium method is a method for transforming a plant utilizing the function of agrobacterium.
  • T DNA which is part of the Ti (tumor inducing) plasmid involved in the pathogenesis of Agrobacterium tumemi, is integrated into the plant genome. It has a function to be performed.
  • the method for transforming plants by the agrobacterium method is to prepare a transformation plasmid in which the TDNA region of the Ti plasmid has been replaced with a gene desired to be introduced into the plant genome, and to transform the transformation plasmid into the Ti plasmid. This is a method in which a gene desired to be introduced into the plant genome is introduced into the plant genome by utilizing the function of the above-mentioned agrobacterium using agrobacterium prepared as a substitute.
  • Agrobacterium bacteria are said to use only dicotyledonous plants as hosts and do not infest monocotyledonous plants
  • the plant transformation method using the Agrobacterium territory method was primarily used for dicotyledonous plants. It was developed as a method for transforming plants. After that, various attempts have been made to introduce genes into monocotyledonous plants by the agrobacterium method, and a super-noary vector having a part of the virulence gene of the strongly pathogenic agrobacterium has been developed. It has been reported that the method using E. coli can stably and relatively efficiently transform monocotyledonous plants such as rice and corn (for example, Patent No. 2,649,287; Patent No. 3).
  • Transformation methods using agrobacterium are generally highly efficient, have a low copy number of the gene to be introduced, and can be introduced without fragmenting a specific region of T DNA. It has many excellent features, such as the fact that transformants can be obtained by short-term cultivation, so that there are few variations in culture. For this reason, it is now widely used as the most useful means of transformation for many plant species, both dicotyledonous and monocotyledonous.
  • the composition of a test material and a culture medium are different depending on the plant species.
  • the agrobacterium suspension is brought into contact with a tissue to be a material in any plant.
  • the common point is that transformed cells are selected after co-culture to produce transformed plants.
  • the plant tissue that is the source of the material is infected with Agrobacterium territory without the need to sterilize or otherwise treat it as needed (eg, Rogers, S. G "et al.
  • Transformation with Agrobacterium is the power reported in many plant species. The transformation efficiency varies greatly depending on the species, genotype, and tissue of the plant (eg, Potrykus, I., et. al., (1998), Agricultural Biotechnology, NY: See Mercel Dekker Inc., p.119-159).
  • tissue of the plant eg, Potrykus, I., et. al., (1998), Agricultural Biotechnology, NY: See Mercel Dekker Inc., p.119-159.
  • Transformation methods that do not depend on plant species or genotype are extremely useful for efficiently cultivating commercial varieties.
  • the development of a transformation method that does not depend on the plant tissue used as the material is also necessary for efficient transformation.
  • Various attempts to improve the transformation efficiency of corn by the bacterium method include selection of transformed cells on N6 basal medium (for example, Zhao, ZY., Et al., (2001), Mol. Breed., Vol. 8, p. 323-333), addition of silver nitrate and carbecillin to the medium (eg, Zhao, ZY., Et al "(2001), Mol. Breed., Vol. 8, p. 323-333; and Ishida, Y “et al., (2003), Plant Biotechnology, Vol. 14, p. 57-66). Addition of tin (see, for example, Frame, BR, et al., (2002), Plant Physiol, Vol. 129, p.
  • Copper sulfate is contained as a trace inorganic salt in various types of medium for plant tissue culture. Typically, the concentration of copper sulfate in the tissue culture medium of a plant is 0.1 ⁇ . Recently, monocotyledonous plants It has been reported that various effects can be obtained by adding 50-500 times or more of normal amount of copper sulfate to a culture medium in tissue culture and transformation test. Ghaemi et al. (Uhaemi, M., et al., (1994), Plant Cell, Tissue and urgan culture, Vol. 36,
  • calli obtained by culturing immature embryos in a medium containing copper sulfate may increase the redistribution rate and the number of regenerated plants per callus (eg, Dahleen, L. S " 1995), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Vol. 43, p. 267-269; and Cho, M-J., Et al., (1998), Plant Science, Vol. 138, p. 229-244. And rice (see, for example, Sahrawat, AK and Chand, S., (1999), J. Plant Physiol., Vol. 154, p. 517-522).
  • Tissues having a green redistribution ability induced in a medium are considered to be suitable as a material for transformation (for example, Visser, RGF, (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5: l- 9, Kluwer Academic Publishers; and McCormick, S., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B6: l-9, Kluwer Academic Publishers).
  • Ishida et al. See Ishida, Y., et al., (2003), Plant Biotechnology, Vol. 14, p. 57-66 reported that corn was inoculated with agrobacterium and co-cultured.
  • the immature embryos (variety H99) were cultured in a medium containing 1 lOO ⁇ l of copper sulfate and callus formation from the immature embryos was examined. The effect of improving the callus formation rate in a medium containing 110 10 of copper sulfate The effect was slight.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 2,649,287
  • Patent Document 2 Patent No. 3,329,819
  • Patent document 3 WO 02 12520 pamphlet
  • Patent Document 4 JP 2000-342256
  • Patent Document 5 JP 2000-342255
  • Patent Document 6 JP-A-2000-342253
  • Patent Document 7 U.S. Patent No. 6,235,529
  • Patent Document 8 U.S. Patent No. 6,541,257
  • Patent Document 9 International Publication No.95Z06722 pamphlet
  • Non-patent literature l Hiei, Y., et al., (1994), The Plant Journal, Vol. 6, p. 27 1-282.
  • Non-Patent Document 2 Ishida, Y., et al., (1996), Nature Biotechnology, Vol. 4, p. 745-750.
  • Non-Patent Document 3 Cheng, M., et al., (1997), Plant Physiol., Vol. 115, p. 9 71-980.
  • Non-Patent Document 4 Tingay, S., et al., (1997), Plant J., Vol. 11, p.
  • Non-Patent Document 5 Zhao, Z-Y., Et al., (2000), Plant Mol. Biol., Vol. 44, p. 789-798.
  • Non-Patent Document 6 Rogers, S.G., et al., (1988), Method for Plant Molecular Biology, p.423—436, CA: Academic Press Inc.
  • Non-Patent Document 7 Visser, R.G.F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B 5: 1-9, Kluwer Academic Publishers.
  • Non-Patent Document 8 McCormick, S., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B 6: 1-9, Kluwer Academic Publishers.
  • Non-Patent Document 9 Lindsey, K., et al., (1991), Plant Tissue Culture Manu al, B7: l—13, Kluwer Academic Publishers.
  • Non-Patent Document 10 Potrykus, I., et al., (1998), Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc., p.119-159.
  • Non-patent literature ll Negrotto, D., et al., (2000), Plant Cell Reports, Vol. 19, p. 798-803.
  • Non-Patent Document 12 Zhao, Z-Y., Et al., (2001), Mol. Breed., Vol. 8, p. 323—333.
  • Non-Patent Document 13 Frame, B.R., et al., (2002), Plant Physiol., Vol.129, p.13-22.
  • Non-Patent Document 14 Ishida, Y., et al., (2003), Plant Biotechnology, Vol. 14, p. 57-66.
  • Non-Patent Document 15 Ghaemi, M., et al., (1994), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Vol. 36, p. 355-359.
  • Non-Patent Document 16 Zhang, S., et al., (1999), Plant Cell Reports, Vol. 18, p. 959-966.
  • Non-Patent Document 17 Dahleen, L.S., (1995), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Vol. 43, p. 267—269.
  • Non-Patent Document 18 Cho, M-J., Et al., (1998), Plant Science, Vol.138, p.2 29-244.
  • Non-Patent Document 19 Sahrawat, A.K. and Chand, S., (1999), J. Plant Physiol., Vol.154, p.517-522.
  • Non-Patent Document 20 Trick, H.N. and Finer, J.J., (1997), Transgenic Research, Vol. 6, p. 329-336.
  • Non-Patent Document 21 Amoah, B., et al., (2001), Journal of Experimental Botany, Vol. 52, P. 1135—1142.
  • Non-Patent Document 22 Hoekema, A., et al., (1983), Nature, Vol. 303, p. 179-180.
  • Non-Patent Document 23 Komari, T. and Kubo T., (1999), Methods of Genetic Transformation: Agrobacterium tumefaciens.In Vasil, IK (ed. ) Molecular improvement of cereal crops., Kluwer Academic Publis hers, Dordrecht, p. 43-82.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for gene transfer that is higher and more efficient than the efficiency of plant gene transfer in the conventional method for gene transfer to plants via bacteria of the genus Agrobacterium. Is to develop. In addition, a method for growing transformed cells with higher efficiency than the conventional method for introducing a gene into a plant via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium is used. To develop. Another object of the present invention is to develop a method for producing a transformed plant using the above method.
  • the inventors of the present invention have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have decided to introduce a gene into a plant via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium using a medium having an increased metal salt concentration. As compared with the case where a medium containing a metal salt at a normal concentration is used, gene transfer can be performed more stably and more efficiently, and cell growth from a tissue into which the gene has been transferred more stably and efficiently can be achieved. Was found. Furthermore, in addition to performing gene transfer using a medium with an increased concentration of metal salts, heating and centrifuging before infecting plant material with Agrobacterium sp. It has been found that gene transfer can be performed with even higher efficiency.
  • a transformant was further selected from the transgenic plant material, and the transgenic plant material was transfected using a medium in which the metal salt concentration was increased. It has been found that the transformation efficiency is dramatically improved as compared with the case where E. coli was used.
  • the present invention relates to the above-mentioned method, characterized in that a medium with an increased content is used.
  • the metal salt added to the medium at a high concentration is a metal salt containing copper ions.
  • Preferred metal salts for use in the present invention are copper sulfate or copper dalconate, most preferably copper sulfate. Copper sulfate is not limited to any of the anhydrous salts and hydrated salts.
  • the medium in which the concentration of the metal salt is increased includes N6 basic medium, MS (LS) basic medium, B5 basic medium, NN basic medium, and NT basic medium, which are well known to those skilled in the art.
  • N6 basic medium MS (LS) basic medium
  • B5 basic medium B5 basic medium
  • NN basic medium NT basic medium
  • Kao's basal medium Kao's basal medium
  • White's basal medium etc., a medium containing a high concentration of metal salts compared to the concentration of metal salts contained in the basic medium. High concentration means higher than the concentration of metal salt contained in the basal medium.
  • the concentration of the metal salt in each basic medium for example, the concentration of CuSO5HO is determined by the N6 group.
  • OmgZl in this medium 0.025mg / l in MS (LS) basic medium, 0.025mgZl in B5 basic medium, 0.025mg / U in NN basic medium, 0.025mg / U in NT basic medium, 0.025mg / U Kao in basic medium 0.025 mgZl and OmgZl in White's basal medium.
  • LS MS
  • B5 basic medium
  • NN NN
  • NT basic medium 0.025mg / U in NT basic medium
  • OmgZl in White's basal medium a medium made from these basic media contains a higher concentration of copper sulfate than the copper sulfate contained in the basal medium.
  • the metal salt containing a copper ion means a metal salt containing a copper ion that is generally included in, in, or in a trace amount of the exemplified basal medium.
  • copper sulfate and copper dalconate have a concentration of 110 M, preferably 11 M, and more preferably 110 ⁇ M.
  • the step of using a medium having an increased metal salt concentration includes the following steps: 1) a step of preparing a plant material, and / or 2) a step of infecting the plant material with agrobacterium. This is one of the steps.
  • a medium in which the concentration of the metal salt is increased in the step of infecting the plant material with agrobacterium is used. More preferably, use is made of a medium in which the concentration of metal salts has been increased at the stage of co-culture, which is included in at least 2) the step of infecting the plant material with Agrobacterium.
  • Step 2) may further include performing at least one treatment selected from the group consisting of pressure treatment, heat treatment, centrifugal treatment, and ultrasonic treatment on the plant material.
  • the pressurizing treatment of the plant material is performed by pressurizing the plant in a liquid medium at 1.7 to 10 atm for 0.1 to 14 hours, preferably at 2.4 to 18 atm for 1 second to 130 minutes.
  • the plant material can be treated by the method described in the literature (JP-A-2000-342255; and JP-A-2000-342253).
  • the centrifugal treatment of the plant material can be performed by the method of Hiei et al. (WO 02Z12520 pamphlet; and JP-A-2000-342256), for example, at 100 G to 250,000 G for 1 second. Centrifugation is performed for 14 hours, preferably at 20,000 G for 10 minutes.
  • Hiei et al. WO 02Z12520 pamphlet; and JP-A-2000-342256
  • Centrifugation is performed for 14 hours, preferably at 20,000 G for 10 minutes.
  • sonication see the literature (e.g., Trick, HN and Finer, JJ, (1997), Transgenic Research, Vol.o, p.j29-33b; and Amoah, B., et al., (2001), Journal of Experimental Botany, Vol. 52, p. 1135-1142).
  • any one of these pressure treatment, heat treatment, centrifugal treatment, and ultrasonic treatment may be performed, or a plurality of them may be performed in combination.
  • the method of the present invention comprises, following the step 2) of infecting a plant material with Agrobacterium territory,
  • a step may be included.
  • the method of the present invention further increases the concentration of the metal salt containing copper ions in at least one of the following steps following the step 2) of infecting the plant material with agrobacterium.
  • a medium Using a medium,
  • a step may be included.
  • the gene transfer method of the present invention can improve the gene transfer efficiency and the transformation efficiency, and as a result, can efficiently obtain a transformed plant.
  • the present invention also relates to a method for producing a transformed plant, which comprises using the method for gene transfer of the present invention.
  • the present inventors further regenerate the transformant from the transformed plant material using a medium in which the concentration of a metal salt containing copper ions is increased, so that a normal concentration of copper ions can be obtained. It was found that the growth of regenerated plants was promoted as compared to the case where a medium containing a metal salt was used.
  • the present invention further provides:
  • the method is characterized in that it is used.
  • the present invention is characterized in that in the step of redistributing a plant from a plant cell which has been depolarized, a medium having an increased concentration of a metal salt containing copper ions is used.
  • the dedifferentiated plant cell may or may not be a transformed cell, and if it is a transformed cell, it may or may not have been transformed by the Agrobacterium method.
  • Gene transfer using a bacterium of the genus Agrobacterium generally comprises the following steps: a) preparing plant material;
  • step c) a step of infecting the plant material prepared in step a) with the bacteria of the genus Agrobacterium prepared in b).
  • auxin for example, 2,4-D ( The plant material is cultivated in a medium containing 2,4-dichloromouth phenoxyacetic acid)
  • cytokinin to bring the plant material into a state of dedigestion or in a process of dedigestion.
  • immature embryos are not subjected to dedifferentiation treatment, and a method characterized by culturing in a medium containing auxin (eg, 2,4-D) or cytodynamics in step c) above can be used.
  • auxin eg, 2,4-D
  • the term "plant” used for gene transfer includes both monocotyledonous plants and dicotyledonous plants.
  • Monocotyledonous plants include, but are not limited to, rice, corn, wheat, wheat, asparagus, sorghum and others.
  • Dicots include but are not limited to tobacco, soybeans, potatoes, potatoes, sunflowers, and others.
  • the plant is a monocotyledonous plant, most preferably, corn.
  • the "plant material” includes, but is not limited to, cells, leaves, roots, stems, nuts, and any other parts of the plant to be used for transformation of the plant by the agrobacterium method. It encompasses all aspects of a plant such as a plant tissue, an immature embryo, a callus or an adventitious embryo-like tissue (hereinafter referred to as callus or simply callus in the present specification), or a complete plant.
  • the preferred form of the plant used in the method of the present invention is an immature embryo or callus, and the most preferred is an immature embryo.
  • an immature embryo refers to an embryo of an immature seed that is in a ripening process after pollination.
  • the stage (ripening stage) of the immature embryo used in the method of the present invention is not particularly limited, and may be any stage after pollination. However, those after 2 days after pollination are preferred. After transformation described below, dedifferentiate and regenerate normal individuals by the method described below.
  • the immature embryos are preferably immature embryos of inbred, Fl between inbreds, Fl between inbred and naturally pollinated varieties, and F1 varieties for sale.
  • callus refers to an undivided cell mass that grows randomly.
  • differentiated cells of plant tissue can be obtained by culturing the cells in a medium containing a plant growth regulator such as auxin (for example, 2,4D) or cytokinin (referred to as dedifferentiation medium). .
  • the process for obtaining this callus is called the dedifferentiation process, and this process is called the dedivision process! / ⁇ ⁇ .
  • step a if necessary, plant tissues, immature embryos, and the like are taken out from plants, seeds, and the like, and materials suitable for transformation are prepared. If desired, the plant material may be cultured prior to infection with Agrobacterium.
  • a medium having an increased concentration of a metal salt containing copper ions is used in the step of preparing a plant material in step a) and in the step of infecting an agrobacterium in step Z or step c). It is characterized by the following. Pressing may be performed during the process of preparing the plant material in step a).
  • T DNA which is part of the Ti plasmid, was found to be integrated into the plant genome. Later, it was revealed that the T DNA contained genes involved in the synthesis of hormones (cytokinins and auxins) required for carcinoma induction, and that it was expressed in plants, even though it was a bacterial gene. Genes present in the virulence region (vir region) on the Ti plasmid are required for excision of TDNA and transmission to plants, and borders at both ends of T DNA are required for T DNA excision. Array required.
  • Agrobacterium rhizogenes another bacterium belonging to the genus Agrobacterium, has a similar system using the Ri plasmid (for example, FIGS. 3 and 4 of JP-A-2000-342256).
  • T DNA Since T DNA is integrated into the plant genome due to infection with Agrobacterium, insertion of a desired gene into T DNA may cause this gene to also be integrated into the plant genome. Expected. However, since the Ti plasmid is as large as 190 kb or more, it was difficult to insert the gene into the T DNA on the plasmid using standard genetic engineering techniques. Therefore, a method for inserting a foreign gene on T DNA was developed.
  • LBA4404 Hoekema, A., et al, (1983), Nature, Vol. 3
  • C58C1 pGV3850
  • GV3TilSE GV3TilSE
  • One of them is to use an intermediary vector, which is easy to manipulate, can insert the desired gene, and can replicate in Escherichia coli, into the T DNA region of the disarmed Ti plasmid of Agrobacterium by the three-way hybridization method ( This method is introduced by homologous recombination via tripal ental mating), and is called an intermediate vector method.
  • the other is the so-called binary vector method, which requires the vir region to integrate T-DNA into plants. It is not necessary that the T-DNA be present on the same plasmid in order to function. Not based on results.
  • the vir region includes vir A, virB, virC, virD, virE, and virG (Plant Biotechnology Encyclopedia (published by Enterprises Co., Ltd. (1989))), and the vir region is defined as vir A, virB, virC VirD, virE and virG.
  • the binary vector is obtained by incorporating TDNA into a small plasmid that can be replicated in both agrobacterium and Escherichia coli, and is used by introducing it into an agrobacterium having a disarmed Ti plasmid.
  • Introduction of the binary vector into the agrobacterium can be performed by a known method such as an electoral poration method or a three-way crossing method.
  • a known method such as an electoral poration method or a three-way crossing method.
  • binary vectors such as pBIN19, pBI121, and pGA482, and many new binary vectors have been constructed based on these and used for transformation. Similar vectors have also been constructed and used for transformation in the Ri plasmid system.
  • Agrobacterium A281 is a super-virulent strain, has a broad host range, and has a higher transformation efficiency than other strains. This characteristic is the According to Sumid's pTiBo542. So far, two new systems have been developed using pTiBo542. One uses strains EHA101 and EHA105, which have the disarmed Ti plasmid of pTiBo542.By applying these strains to the above-described binary vector system, various plant traits can be obtained as a system with high transformation ability. Used for conversion!
  • This system comprises a disarmed Ti plasmid and T plasmid having vir regions (virA, virB, virC, virD, virE, and virG (hereinafter, each may be referred to as a “vir fragment region”;)).
  • virA, virB, virC, virD, virE, and virG each may be referred to as a “vir fragment region”;
  • It is a kind of binary vector system because the plasmid carrying DNA also becomes powerful.
  • at least one vir fragment region of the vir fragment region is substantially removed from the plasmid having the T DNA, that is, the binary vector, and the fragment of the vir region (preferably at least virB or virG is preferable).
  • a fragment containing virB and virG In order to introduce a T-DNA region incorporating a desired gene into an Agrobacterium having a superbinary vector, homologous recombination via a three-way hybridization method can be
  • the host Agrobacterium genus is not particularly limited! Agrobacterium tumefaciens (f column is upper;! ⁇ Agrobacterium turn efaciens LBA4404 (Hoekema , A., et al., (1983), Nature, Vol. 303, p. 179-180)) and EHA101 can be preferably used.
  • a significant effect can be obtained without particular limitation as long as it is a gene transfer system based on the expression of a gene group of a pathogenic (vir) region in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium. Can be obtained. Therefore, the above-mentioned intermediate vector, binary vector, strong pathogen The present invention can also be used for a misaligned vector system such as a binary vector and a super binary vector, and the effects of the present invention can be obtained. The same applies to the case where a different vector system in which these vectors are modified is used (for example, a vir region which is obtained by cutting out a part or all of the vir region of Agrobacterium spp.
  • a part of the whole is cut out and introduced into the agrobacterium as a part of a new plasmid). Further, according to the method of the present invention, even in a wild-type Agrobacterium bacterium, the efficiency of introduction of a wild-type T DNA region into a plant can be increased, thereby effectively improving the infection efficiency.
  • a desired gene to be introduced into a plant can be incorporated into a restriction enzyme site in the TDNA region of the above-described plasmid by a conventional method, and can be used for a drug such as kanamycin or paromomycin which is simultaneously or separately incorporated into the plasmid. Selection can be performed based on an appropriate selection marker such as a gene having resistance. For large ones with many restriction sites, it may not always be easy to introduce the desired DNA into the TDNA region using conventional subcloning techniques. In such a case, the target DNA can be introduced by utilizing the homologous recombination in the cells of the genus Agrobacterium by the three-way hybridization method.
  • the size of the gene to be introduced is preferably about 100 bp! —200 kbp.
  • the operation of introducing a plasmid into Agrobacterium genus bacteria such as Agrobacterium tumefaciens can be performed by a conventional method.
  • Examples of the operation include the above-described three-way hybridization method, the electoral poration method, and the electoral method.
  • Injection method, method by chemical treatment such as PEG, etc. are included.
  • the gene to be introduced into the plant is basically located between the left and right border sequences of T DNA, as in the conventional technique.
  • the plasmid is circular, the number of boundary sequences may be one or more. If multiple genes are to be arranged at different sites, there may be three or more boundary sequences. It may also be located on a Ti or Ri plasmid or on another plasmid in the bacterium of the genus Agrobacterium. Furthermore, it may be arranged on a plurality of types of plasmids.
  • step i) The method of introducing a gene via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium can be performed by simply bringing the plant material into contact with the bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • a suspension of Agrobacterium bacterium having a cell concentration of about 10 6 to 10 11 cells Zml is prepared, and the plant material is immersed in the suspension for about 3 to 10 minutes, and then placed on a solid medium. It can be performed by co-culturing for several days.
  • the plant material is co-cultured with the Agrobacterium at the same time as the plant material is infected with the Agrobacterium, or after the infection and before the Agrobacterium is removed.
  • a known medium can be used for co-culture.
  • LS-AS medium, nN6-As medium used in the examples, or N6S3-AS medium, 2N6-AS medium Hiei, Y., et al, (1994), The Plant Journal, Vol. , p.271-282.
  • At least one selected from the group consisting of pressure treatment, heat treatment, centrifugal treatment, and ultrasonic treatment before or during the step c) of infecting the plant material with Agrobacterium territory may be performed on the plant material. It is known that these treatments also enhance the efficiency of gene transfer as compared with the method of transferring genes into plant material via bacteria of the genus Agrobacterium.
  • centrifugation is described in a literature (for example, International Publication No. 02Z12520 pamphlet; and JP-A-2000-342256), and is preferably performed at 100 G to 250,000 G for 1 second to 4 hours. Perform by centrifugation.
  • the heat treatment is described in a literature (for example, JP-A-2000-342255).
  • the heat treatment is performed at a temperature in the range of 33 ° C to 60 ° C for 5 seconds to 24 hours.
  • ultrasonic treatment is described in the literature (eg, Trick, HN and Finer, JJ, (1997), Transgenic Research, Vol. 6, p. 329-336; and Amoah, B “et al” (2001). , Journal of
  • any one of these treatments such as pressurization, heating, centrifugation, and ultrasonic waves may be performed, or a plurality of them may be performed in combination.
  • these treatments such as pressurization, heating, centrifugation, and ultrasonic waves may be performed, or a plurality of them may be performed in combination.
  • Rogers, SG, et al., (1988), Method for Plant Molecular Biology, p. 423-436, CA: Academic Press Inc. describes a combination of heat treatment and centrifugation. RU
  • step d) selecting transformed cells
  • the concentration of the metal salt containing copper ions is Alternatively, use a medium with an increased concentration.
  • the step of selecting transformed cells means selecting cells having a desired trait based on phenotypic data and Z or physical data.
  • the phenotypic data can be obtained by, for example, determining the transformation efficiency by introducing a marker gene and Z or a selectable marker gene together with a gene desired to be introduced into a plant and evaluating the expression.
  • Marker gene and Z or selection marker One gene includes, for example, GUS (
  • the transformation efficiency can be evaluated by evaluating the color-forming power of X-gulc (5-promo 4-cloguchi-3-indolyl ⁇ -D-glucuronic acid) associated with GUS cleavage.
  • X-gulc 5-promo 4-cloguchi-3-indolyl ⁇ -D-glucuronic acid
  • the gene transfer efficiency can be evaluated by, for example, evaluating the range of transient expression of the introduced gene.
  • the transient expression of the GUS gene in the scutellum of immature embryos was evaluated using a five-point index of 1 (spot-like expression is scattered) and 5 (expression over the entire scutellum).
  • the overall expression level is low, it can be evaluated by counting the number of all spots.
  • the transformation efficiency is, for example, the inoculated immature embryo power
  • those showing the expression of the GUS gene are counted as transformants, and the total number thereof is the number of inoculated immature embryos. It can be calculated by dividing.
  • those showing resistance to the selection pressure can be counted as transformants, and the total number can be calculated by dividing the total number by the number of immature embryos inoculated.
  • the growth promotion of the regenerated plant is performed, for example, by increasing the leaf length, the leaf area, and the Z or weight of the regenerated plant by using a medium containing a normal concentration of a metal salt or by increasing the concentration of the metal salt. It can be evaluated by comparing with the case where the medium was used.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of copper sulfate added to a co-culture medium on transient expression of the GUS gene of maize (A188).
  • the vertical axis represents the value of the range of the site showing the transient expression of the GUS gene, which was expressed numerically in the range of 0 (no expression) force 4 (expressed on almost the entire scutellum).
  • “Cu X” (where X represents a number) shown on the horizontal axis of the graph indicates that the concentration of copper sulfate in the co-culture medium is XM.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of the concentration of copper sulfate in a co-culture medium on callus formation of corn (H99) after co-culture.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the concentration of copper sulfate in the co-culture medium on the formation of phosphinothricin (PPT) -resistant calli of maize (A188) after co-culture.
  • PPT phosphinothricin
  • the vertical axis represents the value obtained by numerically demonstrating the callus formation, and was numerically degraded from 0 (no callus formation) to 3 (the entire scutellum was callidiaged).
  • “Cux” (where X represents a number) shown on the horizontal axis of the graph indicates that the concentration of copper sulfate in the co-culture medium is XM.
  • Fig. 4 is a graph showing the effect of the addition of copper sulfate to a co-culture medium on the transient expression of the rice (IR64) GUS gene.
  • the vertical axis shows the value of the range of the site showing the transient expression of the GUS gene, which was numerically plotted, and was quantified in the range of 0 (no expression) force 4 (expressed on almost the entire scutellum).
  • “Cu 5” shown on the horizontal axis of the graph indicates that the concentration of copper sulfate in the co-culture medium is 5 ⁇ M.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the addition of copper dalconate to a co-culture medium on transient expression of the GUS gene in maize (A188).
  • the vertical axis shows the value of the range of the site showing the transient expression of the GUS gene by numerical values, and was quantified in the range of 0 (no expression) force 4 (expression on almost the entire scutellum).
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of addition of copper dalconate to a co-culture medium on callus formation of maize (A188).
  • the vertical axis is a numerical value of callus formation. Numerical values were obtained at a stage of 0 (no callus formation) and 3 (callus of the entire scutellum).
  • Fig. 7 is a graph showing the effect of addition of copper sulfate or copper dalconate to a co-culture medium on the growth of immature embryos of rice (Yukihikari).
  • the vertical axis represents the average value of the weight of callus immature embryos per immature embryo.
  • Experiments 1, 2, and 3 on the horizontal axis show experiments performed independently. cont. indicates a control containing no copper sulfate or copper dalconate, Cu indicates copper sulfate, and CG indicates copper dalconate.
  • the numbers after Cu and CG indicate the concentrations ( ⁇ ) in the respective co-culture media.
  • Fig. 8 shows the effect of the addition of copper sulfate or copper dalconate to the redistribution medium on the growth of transformed plants regenerated from maize (A188) transformed calli. It is a graph. The vertical axis is the average value of the leaf length of the plant that was redistributed. The horizontal axis cont. Indicates a control containing no copper sulfate or copper dalconate, Cu indicates copper sulfate, and CG indicates copper dalconate. Add 10 M of calorie in the co-culture medium of copper sulfate and copper dalconate. It was.
  • Fig. 9 is a graph showing the effect of addition of copper sulfate or copper dalconate to a redistribution medium on the growth of transformed plants regenerated from rice (Yukihikari) transformed calli. It is rough.
  • the vertical axis is the average value of the leaf length of the plant that was redistributed.
  • the horizontal axis cont. Indicates a control not containing copper sulfate or copper dalconate, Cu indicates copper sulfate, and CG indicates copper dalconate.
  • the mixture was co-cultured at 10 M in a co-culture medium of copper sulfate and copper dalconate.
  • Immature embryos (size 1.0-1.5 mm) of maize (varieties: ⁇ 188, ⁇ 99) 7 to 14 days after pollination are aseptically collected, and LS-inf liquid medium (LS inorganic salt, 0.5 mg) / l nicotinic acid, 0.5mg / l pyridoxine hydrochloride, lmgZl thiamine hydrochloride, lOOmgZl myo-inositol, lg / 1 casamino acid, 1.5mg / l 2,4-D, 68.5g / l sucrose, 36g / ⁇ Glucose, pH 5.2; see Ishida, Y., et al, (1996), Nature Biotechnology, Vol.
  • Pretreatment heat treatment at 46 ° C for 3 minutes and centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes was performed on some immature embryos.
  • Acid 0.5mg / l pyridoxine hydrochloride, lmgZl thiamine hydrochloride, lOOmgZl myo-inositol, 700mg / l L-proline, 1.5mg / l 2, 4-D, 20g / l sucrose, 10gZl glucose, 500mgZl MES, 100 , u M acetocyringone, 8 gZl agar, pH 5.8; see Ishida, Y "et al” (1996), Nature Biotechnology, Vol. 4, p. 745-750.
  • the solidification agent is 8gZl agarose) with 0-10 / z M concentration of CuSO.
  • the immature embryos inoculated with Agrobacterium in the medium were placed on top of the scutellum.
  • the immature embryos cultured on the coculture medium for 3 days were cultured in LSD 1.5 medium (LS inorganic salt, 0.5 mg / l nicotinic acid, 0.5 mg / l pyridoxine hydrochloride, lmgZl thiamine hydrochloride, lOOmgZl myo —Inositol, 700 mg / l L—Proline, 1.5 mg / l 2,4—D, 20 gZl sucrose, 500 mg / l MES, 8 g / l agar, pH 5.8; Ishida, Y., et al., ( 1996), Nature Biotechnology, Vol. 4, p.
  • LSD 1.5 medium LS inorganic salt, 0.5 mg / l nicotinic acid, 0.5 mg / l pyridoxine hydrochloride, lmgZl thiamine hydrochloride, lOOmgZl myo —Inositol, 700
  • the immature embryos (variety A188) cultured in various coculture media for 3 days were stained with X-glue, and the range of the site where the GUS gene was transiently expressed (the site showing blue) was 0 (no expression). (Expressed almost all over the scutellum).
  • Immature embryos (variety H99) cultured in various co-culture media for 3 days were cultured for about J 4 weeks in a culture medium without selection pressure! / ⁇ , and the diameter of callus formed was examined.
  • the immature embryos cultured in the coculture medium containing 5 ⁇ ⁇ silver nitrate showed almost the same callus growth as those cultured in the control medium.
  • immature embryos cultured in a co-culture medium supplemented with 10 ⁇ copper sulfate and 5 ⁇ silver nitrate were treated with a copper sulfate supplemented with copper sulfate whose average diameter was at least 2 mm larger than that of immature embryos cultured in a co-culture medium with a control. It was shown that callus growth was promoted (Figure 2).
  • immature embryos (cultivar A188) cultured in a selection medium containing PPT for 1 week were cultured in 4 stages from 0 (no callus formation) to 3 (callus in the entire scutellum).
  • the immature embryos cultured in the medium supplemented with copper sulfate show higher callus formation than the immature embryos cultured in the control medium, and it is clear that the addition of copper sulfate improves the efficiency of transformed callus formation. ( Figure 3).
  • selection was carried out using a medium containing PPT, and the obtained virulent was cultured in a redistribution medium containing PPT to obtain a PPT-resistant plant.
  • A Number of immature embryos inoculated
  • B Number of promising cells for the differentiation of RUS Number of GUS positive plants
  • Example 2 Effect of addition of copper sulfate to co-culture medium on gene transfer to rice
  • Agrobacterium tumefaciens super binary vector LBA4404 (pSB134) (A ubiquitin intron driven by a maize ubiquitin promoter was ligated to the T-DNA region.
  • PSB134 was constructed from pKY205 (see WO 03/027290) as an expression marker from PSB32 Roh 35S-intron GUS-a nos fragment scraped with a platinum loop rows ivy) by inserting the Hindlll site, AA1 liquid medium containing 100 M Asetoshiringon at a concentration of about 10 9 cfuZml (AA major inorganic salts, LS trace inorganic salts MS vitamin, AA amino acid, 0.2g Zl casamino acid, 4gZ euucrose, 2gZl glucose, PH5.2 suspended in 1ml.
  • nN6-As medium N6 inorganic salt, N6 vitamin, 0.5 g Zl casamino acid, 0.5 g / ⁇ L-proline, lmg / 1 2, 4- D, 0.5 mg / l NAA, 0.1 mg / l 1 6BA, 20 g / l sucrose, lOg / 1 glucose, 10 M AgNO, 100 ⁇ M acetosyringone,
  • the plate was placed on a plate and cultured at 25 ° C. for 1 week in the dark.
  • the immature embryos after co-culture were stained with X-glue, and the range of the site (blue region) where transient expression of the GUS gene was expressed was 0 (no expression) force 4 (expressed almost all over the scutellum) It was evaluated on a five-point scale.
  • Immature embryos (size: 1.0-1.5 mm) of corn (variety: A188) on days 7 to 14 after pollination were aseptically collected and washed once with LS-inf liquid medium.
  • Pretreatment heat treatment at 46 ° C for 3 minutes and centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes
  • OxlO 9 was Ag robacterium tumefaciens LBA4404 suspended inoculum (pSB131) in CfuZml.
  • LS-AS medium containing 5 ⁇ M AgNO is supplemented with copper dalconate at a concentration of 0-10 ⁇ .
  • Immature embryos inoculated with agrobacterium in a preservation medium were placed on the scutellum so that they face upward.
  • calli formation in immature embryos cultured for 7 days on a co-culture medium was 0 (no callus formation), 1 (partially callused), 2 (approximately half of the scutellized callus). And 3 (callus formation of 3Z4 or more of the scutellum).
  • the immature embryos (variety A188) cultured in various coculture media for 3 days were stained with X-glue, and the range of the site where the GUS gene was transiently expressed (the site showing blue) was 0 (no expression). (Expressed almost all over the scutellum). Immature embryos cultured for 3 days in a co-culture medium containing 1, 5 and 10 / zM copper dalconate showed transient expression of the GUS gene in a wider and wider scutellum than immature embryos cultured in control medium. (Figure 5).
  • Example 4 Addition of copper sulfate and copper gluconate to the rice bran source liquid medium impairs the transfer to rice.
  • the cells were suspended in 1 ml of the medium.
  • 1 ml of agrobacterium suspension was placed in an eppendorf tube containing aseptically collected immature embryos (variety Yukihikari), stirred with a vortex mixer for 30 seconds, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • the immature embryos were placed on an nN6-As medium and cultured in the dark at 25 ° C for 1 week.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pSB131) is inoculated into immature embryos (size: 1.0-1.5 mm) of maize (cultivar: A188), and transformed callus is obtained by culturing in LSD1.5 medium containing PPT.
  • LSD1.5 medium containing PPT.
  • the cells were cultured at 25 ° C. for 3 weeks under illumination, and the leaf length of the redistributed plants was measured.
  • Example 6 The addition of copper sulfate and copper gluconate to the regeneration medium resulted in rice-type cattle.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404 was inoculated into immature embryos of rice (cultivar: Yukihikari), and nN6CC medium containing hygromycin (N6 inorganic salts, N6 vitamins, 0.5gZl casamino acid, 0.5g / l L-proline, lmg / 1 2, 4-D, 0.5 mg / l NAA, 0.1 mg / 16 BA, 20 g / l sucrose, 55 g / l sorbitol, 250 mg / l cefotaxime, 250 mg Zl carbecillin, 5 g / l l Transformed callus was obtained by culturing with Gelrite, pH 5.8). Cut transformed calli to approximately 2 mm in size and regenerate N6R containing 10 M CuSO.5 ⁇ or copper dalconate and hygromycin
  • the leaf length of plants regenerated in a regeneration medium containing copper sulfate or copper dalconate is significantly longer than that of plants regenerated in a control regeneration medium. ⁇ The effect was also shown in rice (Fig. 9).
  • the present invention develops an inexpensive and simple method for gene transfer with higher efficiency than the conventional agrobacterium method.
  • the present invention provides a method that can be applied to plant species and varieties for which gene transfer has been difficult with the conventional agrobacterium method.
  • the method of the present invention has a higher gene transfer efficiency and And enhances transformation efficiency and promotes the growth of z or regenerated plants.
  • the gene transfer efficiency for maize which is a monocotyledonous plant, was reduced by using a medium containing copper sulfate. 2 to 2.5 times higher than in the past. Further, the addition of the heating / centrifugation treatment improved the gene transfer efficiency by 1.5 to 3 times as compared with the case where the copper sulfate-free medium and the untreated plant material were used.
  • the transfection efficiency of the plant by the agrobacterium method since the transfection efficiency of the plant by the agrobacterium method has been improved, a large number of transgenic products can be obtained efficiently, and the cultivars to which the practical gene has been introduced can be grown. Contributes to improving efficiency.
  • monocotyledonous plants, especially corn have a low transformation efficiency in the conventional agrobacterium method, and therefore, it is significant that the transformation efficiency is improved by the method of the present invention.

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Abstract

　本発明は、 　１）植物材料を処理し、次いで 　２）植物材料をアグロバクテリウムに感染させる、 ことを含む、アグロバクテリウム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法であって、上記１）および／または２）の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法を提供する。また、本発明は、本発明の遺伝子導入方法を用いることを特徴とする形質転換植物の製造方法を提供する。

Description

銅イオンの添加により植物の形質転換効率を向上させる方法 技術分野
[0001] 本発明は、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を効率よく 行う方法に関する。
背景技術
[0002] ァグロバタテリゥム法による遺伝子導入は、ァグロバタテリゥムの機能を利用した植 物の形質転換方法である。土壌細菌ァグロバタテリゥム (Agrobacterium tumefac iens)は、植物に感染すると、ァグロバタテリゥムの病原性に関与している Ti (tumor inducing)プラスミドの一部である T DNAが植物ゲノムに組み込まれる機能を有 している。ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換方法は、 Tiプラスミドの T DN A領域を植物ゲノムに導入を所望する遺伝子に置き換えた形質転換用プラスミドを 調製し、当該形質転換用プラスミドを Tiプラスミドの代わりに有するように調製したァ グロバタテリゥムを用いて、上記のァグロバタテリゥムの機能を利用することにより、当 該植物ゲノムに導入を所望する遺伝子を植物ゲノム中に導入する方法である。
[0003] ァグロパクテリゥム属細菌は双子葉植物のみを宿主とし、単子葉植物には寄生しな いとされていたため、当初、ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換法は主として 双子葉植物の形質転換法として発展した。その後、単子葉植物へのァグロバクテリウ ム法による遺伝子導入についても様々な試みがなされ、強病原性ァグロバタテリゥム の病原性遺伝子の一部を有するスーパーノイナリーベクターが開発され、このべクタ 一を用いた方法においては、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物においても安定し て、比較的効率よく形質転換されることが報告された (例えば、特許第 2, 649, 287 号公報；特許第 3, 329, 819号公報； Hiei, Y., et al., (1994), The Plant Journal, Vol.6, p.271-282;および、 Ishida, Y., et al., (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750を参照）。さらに、コムギ、ォォムギおよびソルガムといった単子葉植物に ついてもァグロパクテリゥム法による形質転換の成功例が報告され (例えば、 Cheng, M., et al., (1997), Plant Physiol, Vol.115, p.971-980; Tingay, S.， et al., (1997), Pla nt J" Vol.11, p.1369-1376;および、 Zhao, Z- Y.， et al, (2000), Plant Mol. Biol, Vol.44, p.789-798を参照）、単子葉植物についてもァグロバタテリゥム法による形質 転換が広く行われるに至った。
[0004] ァグロパクテリゥムによる形質転換法は、一般的に、効率が高い、導入される遺伝 子のコピー数が少な 、、 T DNAと 、う特定の領域を断片化させることなく導入でき る、短期間の培養により形質転換体を得ることができるため培養変異が少ないなど、 多くの優れた特徴を持っている。このため、現在では双子葉、単子葉を問わず多くの 植物種で最も有用な形質転換の手段として広く用いられて 、る。
[0005] ァグロバタテリゥムによる形質転換方法は、植物種により供試材料、培養培地の組 成は異なる力 いずれの植物においても材料となる組織にァグロバタテリゥム懸濁液 を接触させ、共存培養の後に形質転換細胞の選抜を行い、形質転換植物を作出す る点は共通している。一般に、材料となる植物組織は、必要に応じ滅菌処理がなされ る力 それ以外に特別な処理をすることなくァグロバタテリゥムの感染が行われる（例 えば、 Rogers, S. G" et al., (1988), Method for Plant Molecular Biology, p.423- 436, CA: Academic Press Inc.; Visser, R. G. F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5: l- 9, Kluwer Academic Publishers; McCormick, S., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B6:ト 9, Kluwer Academic Publishers;および、 Lindsey, K., et al" (1991), Plant Tissue Culture Manual, B7: l- 13, Kluwer Academic Publishers ^を参照)。
[0006] ァグロバタテリゥムによる形質転換は多くの植物種で報告されている力 その形質 転換効率は植物の種、遺伝子型そして材料となる組織により大きく異なる（例えば、 Potrykus, I., et al., (1998), Agricultural Biotechnology, NY: Mercel Dekker Inc., p.119-159を参照）という問題点もある。実用遺伝子を導入した品種を育成する場合、 多数の形質転換植物を作出する必要があり、一年を通じて高い効率で安定して形質 転換植物の得られる技術の開発は重要である。また、植物の種や遺伝子型によらな い形質転換法は、効率的に実用品種を育成する上で極めて有用である。さらに、材 料となる植物の組織によらない形質転換法の開発も、形質転換を効率的に進める上 で必要である。
[0007] このように遺伝子導入効率を向上させる、あるいは遺伝子導入が困難な植物種や 遺伝子型も形質転換できる方法の開発は重要である。現在までに、培地組成の検討 、マーカー遺伝子もしくはプロモーターの改変、供試材料の検討、供試材料の処理 方法の検討など、様々な側面から、効率よく形質転換植物を得るための多くの技術 が報告されている。例えば、供試材料の処理方法では、組織を付傷することで感染 効率を向上させたり、または、組織を付傷せずに植物組織を遠心処理 (例えば、国際 公開第 02Z12520号パンフレット；特開 2000— 342256を参照）、加熱処理 (例え ば、特開 2000— 342255 ;特開 2000— 342253を参照）したりする方法などが報告さ れている。また、本発明者らは、植物組織を加圧処理することが遺伝子導入効率の 向上に有用であることを見 、だして!/、る（結果は未発表である）。
[0008] また、特に単子葉植物の中でもトウモロコシについては、ァグロバタテリゥム法による 形質転換における形質転換効率力 Sイネと比較して低いことが問題であった。これまで にも、ァグロパクテリゥム法によるトウモロコシの形質転換において形質転換効率を向 上させるための種々の試みがなされてきた（例えば、 Negrotto, D., et al.， (2000), Plant Cell Reports, Vol.19, p.798- 803; Zhao, Z- Y., et al, (2001), Mol. Breed., Vol.8, p.323-333; Frame, B. R.， et al., (2002), Plant Physiol, Vol.129, p.13-22;お よび、 Ishida, Y" et al., (2003), Plant Biotechnology, Vol.14, p.57- 66、を参照）。ァグ ロバクテリウム法でのトウモロコシの形質転換効率を向上させる種々の試みとしては、 N6基本培地での形質転換細胞の選抜（例えば、 Zhao, Z-Y., et al., (2001), Mol. Breed., Vol.8, p.323-333を参照）、培地への硝酸銀およびカルべ-シリンの添加（例 えば、 Zhao, Z-Y., et al" (2001), Mol. Breed., Vol.8, p.323-333;および、 Ishida, Y" et al., (2003), Plant Biotechnology, Vol.14, p.57- 66を参照）、共存培地へのシスティ ンの添加（例えば、 Frame, B. R., et al., (2002), Plant Physiol, Vol.129, p.13- 22を 参照）等がなされてきたが、その効果はまだ低い。トウモロコシのような主要な穀物で あって形質転換効率の低い植物については、特に、実用的な形質転鎌物を作出 する場合のみならず、新規な遺伝子の効果を確認する場合にも、更に形質転換効率 の高 、形質転換方法が望まれて 、る。
[0009] 硫酸銅は植物組織培養の多種の培地に微量無機塩として含まれて 、る。通常、植 物の組織培養培地に含まれる硫酸銅の濃度は 0. 1 μ Μである。近年、単子葉植物 の組織培養および形質転換試験において培地に通常の 50— 500倍以上の硫酸銅 を添加することにより種々の効果のみられることが報告されて 、る。 Ghaemiら（ uhaemi, M., et al., (1994), Plant Cell, Tissue and urgan culture, Vol.36,
p.355-359を参照）はコムギの葯を lOmgZlの硫酸銅および 2. 5— 5mgZlの硝酸銀 を含む培地で培養することにより胚状体 (embryoid)の形成率が高まることを報告した 。 Zhangら（Zhang, S., et al., (1999), Plant Cell Reports, Vol.18, p.959— 966を参照） はォォムギの完熟種子力 発芽したシュートを 5 /z M 硫酸銅および 30gZl マルト ースを含む培地で培養することにより苗条分裂組織培養 (shoot meristematic cultures： SMCs)の誘導率が高まること報告した。マルトースは褐変組織の減少に効 果があり、硫酸銅は苗条分裂組織培養が誘導されたときのシュートの発育の促進に 効果があるとしている。また、未熟胚を硫酸銅を含む培地で培養することにより得られ たカルスでは再分ィ匕率やカルス当たりの再分化植物数が増大することがォォムギ (例 えば、 Dahleen, L. S" (1995), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Vol.43, p.267-269;および、 Cho, M- J., et al., (1998), Plant Science, Vol.138, p.229- 244を 参照）やイネ（例えば、 Sahrawat, A. K. and Chand, S.， (1999), J. Plant Physiol., Vol.154, p.517-522を参照）で報告されている。さらに硫酸銅を含む培地で誘導され た緑色の再分ィ匕能を有する組織は形質転換の材料として適したものであるとされて いる（例えば、 Visser, R. G. F., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B5:l— 9, Kluwer Academic Publishers;および、 McCormick, S., (1991), Plant Tissue Culture Manual, B6: l- 9, Kluwer Academic Publishersを参照)。
[0010] Ishidaら（Ishida, Y.， et al., (2003), Plant Biotechnology, Vol.14, p.57- 66を参照） はァグロバタテリゥムを接種し、共存培養を行ったトウモロコシ（品種 H99)の未熟胚 を 1一 100 μ Μの硫酸銅を含む培地で培養し未熟胚からのカルス形成を調査した。 1一 10 Μの硫酸銅を含む培地でカルス形成率の向上がみられた力 その効果は わずかであった。
[0011] 以上のように高濃度の硫酸銅を培地に添加することにより単子葉植物の組織培養 において種々の効果のみられることが報告されている。しかし、銅イオンを含む金属 塩の添加が遺伝子導入効率および ζまたは形質転換効率に及ぼす効果を調査した 報告はこれまでにない。
特許文献 1:特許第 2, 649, 287号公報
特許文献 2:特許第 3， 329, 819号公報
特許文献 3:国際公開第 02 12520号パンフレット
特許文献 4:特開 2000— 342256
特許文献 5:特開 2000— 342255
特許文献 6：特開 2000 - 342253
特許文献 7:米国特許第 6, 235, 529号明細書
特許文献 8:米国特許第 6, 541, 257号明細書
特許文献 9:国際公開第 95Z06722号パンフレット
非特許文献 l:Hiei, Y.， et al.， （1994), The Plant Journal, Vol.6, p. 27 1-282.
非特許文献 2:Ishida， Y. , et al. , (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p. 745-750.
非特許文献 3:Cheng， M. , et al. , (1997), Plant Physiol. , Vol. 115, p. 9 71-980.
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非特許文献 5: Zhao, Z-Y. , et al. , (2000) , Plant Mol. Biol. , Vol.44， p. 789-798.
非特許文献 6: Rogers, S. G. , et al. , (1988), Method for Plant Molecul ar Biology, p.423— 436, CA: Academic Press Inc.
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非特許文献 8:McCormick, S. , (1991), Plant Tissue Culture Manual, B 6: 1—9, Kluwer Academic Publishers.
非特許文献 9:Lindsey, K. , et al. , (1991), Plant Tissue Culture Manu al, B7:l— 13, Kluwer Academic Publishers. 非特許文献 10:Potrykus, I. , et al. , (1998), Agricultural Biotechnology , NY:Mercel Dekker Inc.， p.119—159.
非特許文献 ll:Negrotto， D. , et al.， (2000) , Plant Cell Reports, Vol.1 9, p.798-803.
非特許文献 12:Zhao, Z-Y. , et al. , (2001), Mol. Breed.， Vol.8, p.323— 333.
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非特許文献 15:Ghaemi， M. , et al. , (1994), Plant Cell, Tissue and Org an Culture, Vol.36, p.355—359.
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非特許文献 18:Cho, M-J.， et al. , (1998), Plant Science, Vol.138, p.2 29-244.
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非特許文献 20: Trick, H. N. and Finer, J. J. , (1997), Transgenic Resea rch, Vol.6， p.329—336.
非特許文献 21:Amoah, B. , et al. , (2001) , Journal of Experimental Bo tany, Vol.52, P. 1135— 1142.
非特許文献 22:Hoekema, A. , et al. , (1983), Nature, Vol.303, p.179—1 80.
非特許文献 23:Komari, T. and Kubo T. , (1999), Methods of Genetic Transformation： Agrobacterium tumefaciens. In Vasil, I. K. (ed. ) Molecular improvement of cereal crops. , Kluwer Academic Publis hers, Dordrecht, p. 43—82.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明が解決しょうとする課題は、従来のァグロパクテリゥム属細菌を介した植物へ の遺伝子導入方法における植物の遺伝子導入効率よりも、高 、効率で遺伝子導入 のなされる方法を開発することにある。また、従来のァグロパクテリゥム属細菌を介し た植物への遺伝子導入方法における植物の供試組織からの形質転換細胞の増殖 率よりも高い効率で、形質転換細胞の増殖のなされる方法を開発することにある。さ らに、本発明が解決しょうとする課題は、前記方法を使用した、形質転換植物の製造 方法を開発することにある。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、金属塩の濃度を高め た培地を用いてァグロパクテリゥム属細菌を介した植物への遺伝子導入を行うことに より、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いたときと比較して、安定して高い効率で 遺伝子導入のなされること、および安定して高 ヽ効率で遺伝子導入した組織からの 細胞の増殖がみられることを見いだした。さらに、金属塩の濃度を高めた培地を用い て遺伝子導入を行うことに加えて、ァグロパクテリゥム属細菌に植物材料を感染させ る前に、加熱'遠心処理を行うと、安定してさらに高い効率で遺伝子導入のなされるこ とを見いだした。また、遺伝子導入された植物材料について、さらに形質転換体の選 抜を行 ヽ、金属塩の濃度を高めた培地を用いて遺伝子導入を行った植物材料は、 通常の濃度の金属塩を含む培地を用いたときと比較して、飛躍的に形質転換効率が 向上することを見いだした。
[0014] したがって、本発明は、
1)植物材料を処理し、
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる、
ことを含む、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法 であって、上記 1)および Zまたは 2)の工程において銅イオンを含む金属塩の濃度 を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法に関する。
[0015] 本発明の方法において、培地に高い濃度で添加される金属塩は、銅イオンを含む 金属塩である。本発明に用いる好ましい金属塩は、硫酸銅またはダルコン酸銅であり 、最も好ましくは硫酸銅である。硫酸銅には、無水塩および含水塩がある力 いずれ かに限定されるものではない。
[0016] 本発明の方法において、金属塩の濃度を高めた培地とは、当業者によく知られて いる N6基本培地、 MS (LS)基本培地、 B5基本培地、 NN基本培地、 NT基本培地 、 Kaoの基本培地、 Whiteの基本培地などの基本培地に含まれる金属塩の濃度と比 較して高濃度の金属塩を含む培地をいう。高濃度とは、当該基本培地に含まれる金 属塩の濃度よりも高 、ことを言う。
[0017] 具体的には、各基本培地の金属塩の濃度、例えば CuSO · 5H O濃度は、 N6基
4 2
本培地では OmgZl、 MS (LS)基本培地では 0. 025mg/l, B5基本培地では 0. 0 25mgZl、 NN基本培地では 0. 025mg/U NT基本培地では 0. 025mg/U Kao の基本培地では 0. 025mgZl、 Whiteの基本培地では OmgZlであり、これらの基 本培地をもとに作成した培地において、当該基本培地に含まれる硫酸銅の濃度より も高濃度の硫酸銅を含む場合には、その培地は金属塩の濃度を高めた培地である。
[0018] 本発明における、銅イオンを含む金属塩とは、例示した基本培地に一般に、含まれ て!、な 、か、または微量に含まれる銅イオンを含む金属塩を意味する。
[0019] 好ましい濃度の例を挙げると硫酸銅およびダルコン酸銅では 1一 100 M、好まし くは 1一 M、さらに好ましくは 1一 10 μ Μである。
[0020] 本発明の方法において、金属塩の濃度を高めた培地を用いる工程は、 1)植物材 料を調製する工程、および/または 2)植物材料をァグロパクテリゥムに感染させるェ 程の 、ずれか 1の工程である。好ましくは少なくとも 2)植物材料をァグロバタテリゥム に感染させる工程で金属塩の濃度を高めた培地を用いる。さらに好ましくは、少なくと も 2)植物材料をァグロパクテリゥムに感染させる工程に含まれる、共存培養の段階で 金属塩の濃度を高めた培地を用いる。
[0021] 本発明の方法においては、さらに遺伝子導入効率を向上させるために、植物材料 を調製する工程 1)、および/または、植物材料をァグロパクテリゥムに感染させるェ 程 2)において、加圧処理、熱処理、遠心処理、および超音波処理からなる群から選 択される少なくとも 1の処理を植物材料に行うことを更に含んでもょ 、。植物材料の加 圧処理は、当該植物を液体培地中で 1. 7— lOatmで 0. 1秒間一 4時間、好ましくは 2. 4一 8atmで 1秒間一 30分間、加圧することで行う。植物材料の加熱処理は、当該 植物材料を文献 (特開 2000— 342255 ;および、特開 2000— 342253)に記載の方 法により処理することができ、たとえば、 33— 60°Cで 5秒間一 24時間、好ましくは 46 。C、 3分間加熱することで行う。植物材料の遠心処理は、当該植物材料を Hieiらの方 法（国際公開第 02Z12520号パンフレット；および、特開 2000— 342256)により処 理することができ、たとえば、 100G— 25万 Gで 1秒間一 4時間、好ましくは 2万 Gで 1 0分間遠心することで行う。超音波処理については、文献 (例えば、 Trick, H. N. and Finer, J. J., (1997), Transgenic Research, Vol.o, p.j29~33b;および、 Amoah, B., et al., (2001), Journal of Experimental Botany, Vol.52, p.1135- 1142)に記載されている 方法により処理することができる。
これらの加圧処理、加熱処理、遠心処理、および超音波処理の処理はいずれか 1つ を行ってもよく、また複数組み合わせて行ってもよい。
[0022] 本発明の方法は、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)に次いで、さ らに、
3)形質転換細胞を選抜し、
4)所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含んでいてもよい。
[0023] また、本発明の方法は、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)に次い で、さらに、少なくとも以下の 1の工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を高め た培地を用いて、
3)形質転換細胞を選抜し、
4)所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含んでいてもよい。
[0024] 本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子導入効率を向上させるとともに、形質転換効 率を向上させ、結果として形質転換された植物を効率よく得ることができる。したがつ て、本発明は、本発明の遺伝子導入方法を使用することを特徴とする、形質転換植 物の製造方法にも関する。
[0025] さらに本発明者らは、形質転換された植物材料について、銅イオンを含む金属塩 の濃度を高めた培地を用いて形質転換体を再分化させることにより、通常の濃度の 銅イオンを含む金属塩を含む培地を用いたときと比較して再分化植物の生長が促進 されることを見いだした。
[0026] したがって、本発明はさらに、
1)植物材料を調製し、
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させ、
3)形質転換細胞を選抜し、
4)選抜された形質転換体を再分化する、
ことを含む、ァグロパクテリゥム属細菌を介した植物材料の形質転換による形質転換 植物の製造方法であって、上記 4)の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度 を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法に関する。
[0027] または、本発明は、脱分ィ匕した植物細胞から植物体を再分ィ匕させる工程において、 銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、再分化植物 の生長を促進させる方法、に関する。この場合、脱分化した植物細胞は、形質転換 細胞であってもなくてもよぐまた、形質転換細胞であった場合には、ァグロバクテリウ ム法により形質転換されて 、てもされて 、なくてもよ!、。
ァグロパクテリゥム) ^田 を用いた遣伝 入および开^ ff転椽 去
ァグロパクテリゥム属細菌を用いた遺伝子導入は、一般には以下の工程を含む： a)植物材料を調製する工程；
b)所望の導入遺伝子を含むベクターを含むァグロパクテリゥム属細菌を調製する 工程；
c)工程 a)で調製した植物材料を b)で調製したァグロパクテリゥム属細菌に感染さ せる工程。
[0028] さらに、形質転換体を得るために、上記工程 c)に次、で
d)形質転換細胞を選抜する工程；および e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
を施してもよい。
[0029] 具体的には、単子葉植物においては、文献 (特許第 2, 649, 287号公報）に記載 されているように、上記 a)の工程でオーキシン（例えば、 2, 4-D (2, 4ージクロ口フエ ノキシ酢酸)）またはサイトカイニン等を含む培地で培養して植物材料を脱分ィ匕の状 態または脱分ィ匕過程にある状態にし、上記 c)の工程でァグロバタテリゥムに感染させ ることを特徴とする方法;または、文献 (特許第 3, 329, 819号公報）に記載されてい るように、植物材料として当該植物の未熟胚を用い、上記 a)の工程では未熟胚を脱 分化処理せず、上記 c)の工程においてオーキシン (例えば、 2, 4— D)またはサイト力 ィニン等を含む培地で培養することを特徴とする方法を用いることができる。
[0030] 工程 a)について
本明細書において、遺伝子導入に供される「植物」は、単子葉植物および双子葉 植物のいずれも含む。単子葉植物には、イネ、トウモロコシ、ォォムギ、コムギ、ァスパ ラガス、ソルガムその他が含まれるがこれらに限定されるものではない。双子葉植物 にはタバコ、ダイズ、ジャガイモ、ヮタ、ヒマヮリ、その他が含まれる力 これらに限定さ れるものではない。好ましくは、植物は単子葉植物であり、最も好ましくはトウモロコシ である。
[0031] また、「植物材料」とは、非限定的に、ァグロバタテリゥム法による植物の形質転換に 供するための当該植物の細胞、葉、根、茎、実、その他いずれの部位の植物組織、 未熟胚、カルスもしくは不定胚様組織 (以下、本明細書においてカルス等、または単 にカルスという）、または完全な植物体など植物のあらゆる態様を包含する。
[0032] 本発明の方法に用いる植物の形態として好ま 、のは未熟胚またはカルスであり、 最も好ましいのは未熟胚である。本明細書において、植物の細胞、組織、完全な植 物体という表現は、技術分野において一般的に用いられる意味で用いられる。本明 細書において、未熟胚とは、受粉後の登熟過程にある未熟種子の胚をいう。また、本 発明の方法に供される未熟胚のステージ (熟期）は特に限定されるものではなぐ受 粉後いかなる時期に採取されたものであってもよい。もっとも、受粉後 2日以降のもの が好ましい。後述の形質転換後、後述の方法により、脱分化し、正常な個体を再生 する能力を有するカルスを誘導できる未熟胚胚盤を用いることが好ましい。また、未 熟胚はインブレッド、インブレッド間の Fl、インブレッドと自然受粉品種間の Fl、巿販 F1品種の未熟胚であることが好ましい。本明細書において、カルスとは、無秩序に増 殖する未分ィ匕状態の細胞塊をいう。カルスを得るためには、植物組織の分化した細 胞をオーキシン (例えば、 2, 4 D)またはサイトカイニン等の植物成長調節物質を含 む培地 (脱分化培地という）において培養して得ることができる。このカルスを得るた めの処理を脱分化処理と ヽ、またこの過程を脱分ィ匕過程と!/ヽぅ。
[0033] 工程 a)にお 、て、必要に応じ、植物組織、未熟胚などを植物体、種子などから取り 出し、形質転換に好適な材料を調製する。また、所望により植物材料をァグロバクテ リウムに感染させる前に培養してもよい。
[0034] 本発明では、工程 a)で植物材料を調製する過程、および Zまたは、工程 c)でァグ ロバクテリゥムに感染させる過程において、銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培 地を用いることを特徴とする。カロえて、工程 a)で植物材料を調製する過程において加 圧処理を行ってもよい。
[0035] 工程 b)について
土壌細菌ァグロバタテリゥム (Agrobacterium tumefaciens)が多くの双子葉植 物に根頭癌腫病（crown gall disease)を引き起こすことは古く力も知られており、 1970年代には、 Tiプラスミドが病原性に関与すること、さらに Tiプラスミドの一部であ る T DNAが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。その後この T DNAには 癌腫の誘発に必要なホルモン (サイトカイニンとオーキシン)の合成に関与する遺伝 子が存在し、細菌遺伝子でありながら植物中で発現することが明らかにされた。 T-D NAの切り出しと植物への伝達には Tiプラスミド上のヴィルレンス領域 (vir領域）に存 在する遺伝子群が必要であり、また T DNAが切り出されるためには T DNAの両 端に存在するボーダー配列が必要である。他のァグロバタテリゥム属細菌である Agr obacterium rhizogenesも Riプラスミドによる同様なシステムを有して 、る（例えば 、特開 2000— 342256の図 3および図 4)。
[0036] ァグロバタテリゥムの感染によって T DNAが植物ゲノムに組み込まれるので、 T DNA上に所望の遺伝子を挿入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれることが 期待された。し力しながら、 Tiプラスミドは 190kb以上と巨大であるため、標準的な遺 伝子工学手法ではプラスミド上の T DNA上に遺伝子を挿入することは困難であつ た。そのため、 T DNA上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。
[0037] まず、腫瘍性の Tiプラスミドの T DNAからホルモン合成遺伝子が除去されたディ スアーム型の菌系（disarmed strains)である LBA4404 (Hoekema, A., et al, (1983), Nature, Vol.303, p.179- 180参照）、 C58C1 (pGV3850)、 GV3Til lSEな どが作製された。これらを用いることにより、所望の遺伝子をァグロバタテリゥムの Tiプ ラスミドの T DNA中に、あるいは所望の遺伝子を有する T DN Aをァグロバクテリウ ムに導入する 2種類の方法が開発された。このうちの一つは、遺伝子操作が容易で 所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製ができる中間ベクターを、ァグロ バクテリウムのデイスアーム型 Tiプラスミドの T DNA領域中に、三系交雑法 (tripar ental mating)を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼 ばれる。
[0038] もう一つは、バイナリーベクター（binary vector)法とよばれるもので、 T—DNAの 植物への組み込みに vir領域が必要である力 機能するために同じプラスミド上に存 在する必要はないという結果に基づいている。この vir領域には vir A、 virB、 virC、 vi rD、 virEおよび virGが存在し、（植物バイオテクノロジー事典 (ェンタプライズ株式会 社発行（1989) ) )、 vir領域とはこの vir A、 virB、 virC、 virD、 virEおよび virGの全 てを含むものをいう。したがって、バイナリーベクターは、 T DN Aをァグロバクテリウ ムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これをディ スアーム型 Tiプラスミドを有するァグロバタテリゥムに導入して用いる。
[0039] ァグロバタテリゥムへのバイナリーベクターの導入には、エレクト口ポレーシヨン法や 三系交雑法などの、公知の方法により行うことができる。バイナリーベクターには、 pB IN19、 pBI121、 pGA482など力 Sあり、これらをもとに数多くの新たなバイナリーべク ターが構築され、形質転換に用いられている。また、 Riプラスミドのシステムにおいて も、同様なベクターが構築され形質転換に用いられている。
[0040] ァグロバタテリゥム A281は、強病原性（super— virulent)の菌系であり、その宿主 範囲は広ぐ形質転換効率も他の菌系より高い。この特性は、 A281が有する Tiブラ スミドの pTiBo542によるものである。 pTiBo542を用いて、これまでに 2つの新しい システムが開発されて 、る。一つは pTiBo542のデイスアーム型の Tiプラスミドを有 する菌系 EHA101および EHA105を用いたものであり、これらを上述のバイナリー ベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の 植物の形質転換に利用されて!、る。
[0041] もう一つは、スーパーバイナリーベクター（'super— binary' vector) (Hiei, Y.， et al.， (1994), The Plant Journal, Vol.6, p.271-282; Ishida, Y.， et al., (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750; Komari, T. and Kubo T., (1999), Methods of Genetic Transformation: Agrobacterium tumefaciens. In Vasil, I. K. (ed.) Molecular improvement of cereal crops., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p.43- 82 ;お よび国際公開第 95Z06722号パンフレットを参照）システムである（例：特開 2000— 342256の図 4)。このシステムは、 vir領域（virA、 virB、 virC、 virD、 virEおよび vir G (以下、これらをぞれぞれ「vir断片領域」ということもある。；)）を持つデイスアーム型 の Tiプラスミドおよび T DNAを有するプラスミド力もなることから、バイナリーベクタ 一システムの一種である。しかしながら、 T DNAを有する側のプラスミド、即ちバイ ナリーベクターに vir断片領域のうち、少なくとも一つの vir断片領域を実質的に取除 V、た vir領域の断片（このうち好ましくは少なくとも virBまたは virGを含む断片、さらに 好ましくは virBおよび virGを含む断片）を組み込んだスーパーバイナリーベクターを 用いる点で異なる。なお、スーパーバイナリーベクターを有するァグロバタテリゥムに 、所望の遺伝子を組み込んだ T - DNA領域を導入するには、三系交雑法を介した 相同組換えが容易な手法として利用できる。
[0042] 本発明の方法においては、宿主となるァグロバタテリゥム属細菌としては、特に限定 れな! /、力、、 Agrobacterium tumefaciens (f列 は上;!^の Agrobacterium turn efaciens LBA4404 (Hoekema, A., et al., (1983), Nature, Vol.303, p.179— 180を 参照））および EHA101を好ましく用いることができる。
[0043] 本発明の方法によれば、ァグロバタテリゥム属細菌における病原性 (vir)領域の遺 伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、特に限定されることなく有意な効果 を得ることができる。したがって、上述の中間ベクター、バイナリーベクター、強病原 性のバイナリーベクター、スーパーバイナリーベクターなど 、ずれのベクターシステム に対しても用いることができ、本発明による効果を得ることができる。これらのベクター 類を改変した、異なるベクターシステムを用いた場合においても同様である（例えば、 ァグロバタテリゥム属細菌の vir領域の一部または全部を切り出し付加的にプラスミド 中に組み込む、 vir領域の一部または全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてァ グロパクテリゥムに導入するなど)。また、本発明の方法によれば、野生型のァグロバ クテリゥム属細菌においても、植物へ野生型の T DNA領域の導入効率を高め、事 実上感染効率を向上することができる。
[0044] 植物に導入しょうとする所望の遺伝子は、上記プラスミドの T DNA領域中の制限 酵素部位に常法により組み込むことができ、当該プラスミドに同時に若しくは別途組 込んだカナマイシン、パロモマイシン等の薬剤に対する耐性を有する遺伝子等の適 当な選抜マーカーに基づ 、て選抜することができる。大型で多数の制限部位を持つ ものは、通常のサブクローユングの手法では所望の DNAを T DNA領域内に導入 することが必ずしも容易でないことがある。このような場合には、三系交雑法により、ァ グロバタテリゥム属細菌の細胞内での相同糸且換えを利用することで目的の DNAを導 入することができる。限定されるわけではないが、導入される遺伝子の大きさは好まし くは約 lOObpな!ヽし 200kbpである。
[0045] また、プラスミドを Agrobacterium tumefaciens等のァグロバタテリゥム属細菌に 導入する操作は従来法により行うことができ、例としては、上記した三系交雑法ゃェ レクト口ポレーシヨン法、エレクト口インジェクション法、 PEGなどの化学的な処理によ る方法などが含まれる。
[0046] 植物に導入しょうとする遺伝子は、従来の技術と同様に基本的には T DNAの左 右境界配列の間に配置されるものである。しかし、プラスミドが環状であるため、境界 配列の数は 1つでもよぐ複数の遺伝子を異なる部位に配置しょうとする場合には、 境界配列が 3個以上あってもよい。また、ァグロバタテリゥム属細菌中で、 Tiまたは Ri プラスミド上に配置されてもよぐまたは他のプラスミド上に配置されてもよい。さらには 、複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。
[0047] 工程 ς)について ァグロパクテリゥム属細菌を介して遺伝子導入を行う方法は、植物材料をァグロパク テリゥム属細菌と単に接触させることにより行うことができる。例えば、 106 一 1011細 胞 Zml程度の細胞濃度のァグロパクテリゥム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中 に植物材料を 3— 10分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養することにより 行うことができる。
[0048] 好ましくは、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させると同時に、あるいは感染後、 ァグロバタテリゥムを除去する前に、植物材料をァグロバタテリゥムと共存培養させる。 共存培養には公知の培地を使用できる。例えば、実施例で使用した LS— AS培地、 n N6— As培地、あるいはその他、 N6S3— AS培地、 2N6— AS培地（Hiei, Y., et al, (1994), The Plant Journal, Vol.6, p.271-282を参照）等の培地が知られている。
[0049] 本発明において、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 c)の前または最 中に、加圧処理、熱処理、遠心処理、および超音波処理からなる群から選択される、 少なくとも 1つの処理を植物材料に行ってもよい。これらの処理も、ァグロバタテリゥム 属細菌を介して植物材料への遺伝子導入する方法にぉ ヽて、遺伝子導入の効率を 高めることが知られている。例えば、遠心処理については、文献 (例えば、国際公開 第 02Z12520号パンフレツ卜；および、特開 2000— 342256)に記載されており、好 ましくは、 100Gないし 25万 Gで 1秒間ないし 4時間、遠心することで行う。熱処理に ついては、文献 (例えば、特開 2000— 342255)に記載されており、好ましくは、 33°C ないし 60°Cの温度範囲で、 5秒間ないし 24時間の熱処理を行う。さらに、超音波処 理については、文献（例えば、 Trick, H. N. and Finer, J. J., (1997), Transgenic Research, Vol.6, p.329— 336;および、 Amoah, B" et al" (2001), Journal of
Experimental Botany, Vol.52, p.1135- 1142)に記載されている。
[0050] これらの加圧、加熱、遠心、および超音波等の処理はいずれか 1つを行ってもよぐ また複数組み合わせて行ってもよい。例えば、 Rogers, S. G., et al., (1988), Method for Plant Molecular Biology, p.423- 436, CA: Academic Press Inc.は、熱処理と遠心 処理を組み合わせて行うことにつ 、て記載して 、る。
[0051] 工程 d)および e)について
さらに所望により、形質転換体を得るためには、上記工程 c)に次いで d)形質転換細胞を選抜する工程；および
e)所望により選抜された形質転換体を再分化する工程
が必要である。即ち、一般に植物の形質転換を行うためには、植物細胞に外来遺伝 子を導入した後に、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれた植物細胞を選抜 することが必要である。
[0052] 本発明では、工程 d)で形質転換細胞を選抜する工程、および Zまたは、工程 e)で 所望により選抜された形質転換体を再分化する工程において、銅イオンを含む金属 塩の濃度を高めた培地を用いてもょ 、。
[0053] 形質転換された細胞を選抜する工程は、表現型のデータおよび Zまたは物理的デ ータにより、目的の形質を有する細胞を選抜することを意味する。
[0054] 表現型のデータは、例えば、形質転換効率は植物への導入を所望する遺伝子と共 に、マーカー遺伝子および Zまたは選抜マーカー遺伝子を導入してその発現を評 価することで行うことで得ることができる。マーカー遺伝子および Zまたは選抜マーカ 一遺伝子としては、例えば、 GUS ( |8—ダルク口ニダーゼ)遺伝子、および Zまたは、 抗生物質耐性遺伝子 (例えば、 PPT (フォスフィノスライシン)耐性遺伝子、カナマイ シン耐性遺伝子)など、を用いることができる。マーカー遺伝子として GUS遺伝子を 用いた場合、形質転換効率の評価は X— gulc (5—プロモー 4 クロ口— 3—インドリル β—D—グルクロン酸)の GUSによる切断に伴う発色力も評価することができる。選抜 マーカー遺伝子として抗生物質耐性遺伝子を用いた場合には、形質転換した後、抗 生物質を加えた選抜培地上での成長の度合いから評価することができる。
[0055] さらに、外来遺伝子が安定して染色体に組み込まれたことを確認するために、サザ ンブロット等の物理的データを得てもよい。また、有性生殖による子孫への伝達、並 びに子孫集団への遺伝的および分子的分析に基づく選抜、の工程を行ってもょ 、。
[0056] 所望により選抜された形質転換体の再分化を行！ヽ、再分化個体を生育させ、そし て完全な植物体を得てもよ!ヽ。選抜した形質転換細胞から完全な植物体を再生する には、公知の方法（例えば、 Hiei, Y" et al.， (1994), The Plant Journal, Vol.6, p.271-282;および、 Ishida, Y., et al, (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750)により行うことができる。 [0057] 本発明の方法は、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いた場合と比較して、遺伝 子導入効率および Zまたは形質転換効率を向上させ、および Zまたは再分化植物 の生長を促進させる。遺伝子導入効率は、例えば、導入した遺伝子の一過性の発現 の範囲を評価することにより行うことによって評価できる。後述の実施例では、未熟胚 の胚盤での GUS遺伝子の一過性の発現を 1 (スポット状の発現が散見）一 5 (胚盤の 全面で発現)の 5段階の指数で評価した。あるいは、全体の発現量が低い場合には、 全てのスポット数を数えることにより評価することもできる。
[0058] 形質転換効率は、例えば、接種した未熟胚力 得られた再分化植物のうち GUS遺 伝子の発現を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数 で除すことによって算出できる。あるいは、再分化植物のうち、選抜圧に対して抵抗 性を示したものを形質転換体として数え、その総数を接種した未熟胚の数で除するこ とにより算出することちできる。
[0059] 再分化植物の生長促進は、例えば再分化植物の葉長、葉面積、および Zまたは重 量を、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いた場合と、金属塩の濃度を高めた培 地を用いた場合とで比較することにより、評価することができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により 限定されるものではな、。当業者は本明細書の記載に基づ 、て容易に本発明に修 飾-変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
図面の簡単な説明
[0060] [図 1]図 1は、共存培地への硫酸銅の添カ卩による、トウモロコシ (A188)の GUS遺伝 子の一過的発現に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、 GUS遺伝子の一過的 発現を示す部位の範囲を数値ィ匕した値であり、 0 (無発現)力 4 (胚盤のほぼ全面で 発現)の範囲で数値化した。グラフの横軸に示す" Cu X" (ここで、 Xは数字を表す）は 、共存培地中の硫酸銅濃度が X Mであることを示す。
[図 2]図 2は、共存培養後のトウモロコシ (H99)のカルス形成に及ぼす、共存培地中 の硫酸銅濃度の効果を示すグラフである。グラフの横軸における、 "Ag X"および" C u x" (ここで、 Xは数字を表す）はそれぞれ、共存培地中の硝酸銀および硫酸銅の 濃度が X μ Μであることを示す。 [図 3]図 3は、共存培養後のトウモロコシ (A188)のフォスフィノスライシン (PPT)抵抗 性カルス形成に及ぼす、共存培地中の硫酸銅濃度の効果を示すグラフである。縦軸 は、カルス形成を数値ィ匕した値であり、 0 (カルス形成なし)から 3 (胚盤全体がカルス ィ匕)の段階で数値ィ匕した。グラフの横軸に示す" Cu x" (ここで、 Xは数字を表す）は、 共存培地中の硫酸銅濃度が X Mであることを示す。
[図 4]図 4は、共存培地への硫酸銅の添カ卩による、イネ (IR64)の GUS遺伝子の一過 的発現に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、 GUS遺伝子の一過的発現を示 す部位の範囲を数値ィ匕した値であり、 0 (無発現)力 4 (胚盤のほぼ全面で発現)の 範囲で数値化した。グラフの横軸に示す" Cu 5"は、共存培地中の硫酸銅濃度が 5 μ Μであることを示す。
[図 5]図 5は、共存培地へのダルコン酸銅の添カ卩による、トウモロコシ (A188)の GUS 遺伝子の一過的発現に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、 GUS遺伝子の一 過的発現を示す部位の範囲を数値ィ匕した値であり、 0 (無発現)力 4 (胚盤のほぼ全 面で発現)の範囲で数値化した。
[図 6]図 6は、共存培地へのダルコン酸銅の添カ卩による、トウモロコシ (A188)のカル ス形成に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、カルス形成を数値化した値であり 、 0 (カルス形成なし)力も 3 (胚盤全体がカルス化)の段階で数値ィ匕した。
[図 7]図 7は、共存培地への硫酸銅あるいはダルコン酸銅の添カ卩による、イネ（ゆきひ かり）の未熟胚の増殖に及ぼす効果を示すグラフである。縦軸は、カルス化した未熟 胚の重量の 1未熟胚あたりの平均値である。横軸の実験 1、 2、 3はそれぞれ独立に 行われた実験を示す。 cont.は硫酸銅あるいはダルコン酸銅を含まない対照を、 Cuは 硫酸銅を、 CGはダルコン酸銅をそれぞれ示す。 Cuおよび CGの後の数値はそれぞ れの共存培地中の濃度（ μ Μ)を示す。
[図 8]図 8は、再分ィ匕培地への硫酸銅あるいはダルコン酸銅の添カ卩による、トウモロコ シ (A188)形質転換カルスから再分化した形質転換植物の生長に及ぼす効果を示 すグラフである。縦軸は、再分ィ匕した植物の葉長の平均値である。横軸 cont.は硫酸 銅あるいはダルコン酸銅を含まない対照を、 Cuは硫酸銅を、 CGはダルコン酸銅をそ れぞれ示す。硫酸銅およびダルコン酸銅それぞれの共存培地中に 10 Mで添カロし た。
[図 9]図 9は、再分ィ匕培地への硫酸銅あるいはダルコン酸銅の添カ卩による、イネ（ゆき ひかり）形質転換カルスから再分化した形質転換植物の生長に及ぼす効果を示すグ ラフである。縦軸は、再分ィ匕した植物の葉長の平均値である。横軸 cont.は硫酸銅あ るいはダルコン酸銅を含まない対照を、 Cuは硫酸銅を、 CGはダルコン酸銅をそれぞ れ示す。硫酸銅およびダルコン酸銅それぞれの共存培地中に 10 Mで添カ卩した。 実施例
¾施例 ί 共存焙地への硫酴錮の添加がトウモロコシの形皙転橼に及ぼす効菜 材料および方法
受粉後 7から 14日目のトウモロコシ（品種: Α188、 Η99)の未熟胚（大きさ 1. 0—1. 5mm)を無菌的に採取し、 LS— inf液体培地 (LS無機塩、 0. 5mg/l ニコチン酸、 0. 5mg/l ピリドキシン塩酸塩、 lmgZl チアミン塩酸塩、 lOOmgZl ミオーイノシ トール、 lg/1 カザミノ酸、 1. 5mg/l 2, 4— D、 68. 5g/l シユークロース、 36g /\ グルコース、 pH5. 2 ;Ishida, Y., et al, (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750を参照）で 1回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるための前処理 (46°C、 3分間の熱処理および 15, 000rpm、 10分間の遠心処理）を一部の未熟胚で行った 。 100 Mァセトシリンゴンを含む LS— inf液体培地に約 1. OxlO9 cfu/mlで Agro bacterium tumefaciens LBA4404 (pSB131) (T— DNA領域にカリフラワーモ ザイクウィルス 35Sプロモーターでドライブされた PPT (フォスフィノスライシン）耐性 遺伝子、およびカリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーターにヒマ カタラーゼィ ントロンを結合した GUS遺伝子を有する； Ishida, Y., et al., (1996), Nature
Biotechnology, Vol.4, p.745-750を参照）を懸濁し接種源とした。採取'洗浄した未熟 胚および熱，遠心処理した未熟胚に接種源を加え、 30秒間撹拌した後、 5分間室温 で静置した。 5 M AgNOを含む LS— AS培地（LS無機塩、 0. 5mg/l ニコチン
3
酸、 0. 5mg/l ピリドキシン塩酸塩、 lmgZl チアミン塩酸塩、 lOOmgZl ミオーィ ノシトール、 700mg/l L—プロリン、 1. 5mg/l 2, 4— D、 20g/l シユークロース 、 10gZl グルコース、 500mgZl MES, 100 ,u M ァセトシリンゴン、 8gZl 寒天 、 pH5. 8 ; Ishida, Y" et al" (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p.745-750を参照 、固化剤は 8gZlァガロース）に 0—10 /z Mの濃度で CuSO · 5Η Οを添カ卩した共存
4 2
培地にァグロパクテリゥムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。
[0062] 25°C、暗黒下で 3日間培養した後、一部の未熟胚を 0. 1%の Triton X— 100を含 む 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 8)に浸漬し、 37°Cで 1時間静置した。リン酸緩衝液で ァグロバタテリゥムを除去した後、 1. OmM 5—ブロモー 4—クロ口— 3—インドリノレー j8— D—グルクロン酸 (X— glue)および 20%メタノール含むリン酸緩衝液を添カ卩した。 37 °Cで 24時間処理した後、顕微鏡下で観察し、青色を呈する組織の範囲を調査した。
[0063] 共存培地上で 3日間培養した未熟胚を LSD 1. 5培地 (LS無機塩、 0. 5mg/l 二 コチン酸、 0. 5mg/l ピリドキシン塩酸塩、 lmgZl チアミン塩酸塩、 lOOmgZl ミ ォ—イノシトール、 700mg/l L—プロリン、 1. 5mg/l 2, 4— D、 20gZlシユークロ ース、 500mg/l MES、 8g/l寒天、 pH5. 8 ;Ishida, Y.， et al.， (1996), Nature Biotechnology, Vol.4, p.745- 750を参照）に置床し、 25°C、暗黒下で約 4週間培養し た後、増殖したカルスの直径を測定した。また、共存培地上で 7日間培養した未熟胚 を 5mgZlのフォスフィノスライシン（PPT)を含む LSD1. 5培地に置床し、 25°C、喑 黒下で 1週間培養した後、顕微鏡下で観察し、カルス形成の程度を調査した。さら〖こ これらのカルスを 10mg/l PPTを含む同培地で 6週間、同条件で培養した。増殖し た PPT抵抗性カルスを LSZ再分化培地（LSD1. 5培地から 2, 4— Dを除き、 5mgZl ゼァチンを添加）に置床し、 25°C、照明下で 2— 3週間培養した。再分化した植物 の葉片を切り取り、 GUS遺伝子の発現を X— glueにより調査した。
[0064] S
各種共存培地で 3日間培養した未熟胚（品種 A188)を X— glueにより染色し、 GU S遺伝子の一過的発現を示す部位 (青色を呈する部位)の範囲を 0 (無発現)力 4 ( 胚盤のほぼ全面で発現)の 5段階で評価した。
[0065] 1、 5および 10 μ Μの硫酸銅を含む共存培地で 3日間培養した未熟胚は対照の培 地で培養した未熟胚に比べ胚盤の広い範囲で GUS遺伝子の一過的な発現を示し た。共存培地に硫酸銅を添加することによる GUS遺伝子の一過的発現を示す範囲 の増大は熱 ·遠心の前処理の有無に関わらず認められた（図 1)。これらのことから、 共存培地に硫酸銅を添加することにより遺伝子導入効率が高まることが明らかとなつ た。
[0066] 各種の共存培地で 3日間培養を行った未熟胚（品種 H99)を選抜圧を含まな!/ヽ培 地で約 J 4週間培養した後、形成されたカルスの直径を調査した。 5 ^ Μ 硝酸銀を含 む共存培地で培養した未熟胚は対照の培地で培養したものとほぼ同様のカルス増 殖を示した。これに対し、 10 Μ 硫酸銅および 5 Μ 硝酸銀を添加した共存培地 で培養した未熟胚は直径の平均が対照の共存培地で培養した未熟胚に比べ 2mm 以上も大きぐ硫酸銅の添カ卩によりカルスの増殖が促進することが示された（図 2)。
[0067] 1週間の共存培養後、 PPTを含む選抜培地で 1週間培養した未熟胚 (品種 A188) 力も増殖したカルスを 0 (カルス形成なし)から 3 (胚盤全体がカルス化）の 4段階で評 価した。硫酸銅を添加した培地で培養した未熟胚は対照の培地で培養した未熟胚 に比べ高いカルス形成を示し、硫酸銅の添加により形質転換カルス形成の効率が向 上することが明ら力となった（図 3)。さらに PPTを含む培地で選抜を行 、得られた力 ルスを PPTを含む再分ィ匕培地で培養することにより PPT抵抗性植物を得た。これら の植物の葉片を切り取り、 GUS遺伝子の発現を調査した。その結果、 5および 10 M 硫酸銅を含む共存培地で培養した未熟胚では硫酸銅を含まな!/ヽ共存培地で培 養した未熟胚に比べ 2— 3倍の高 、形質転換効率を示した (表 1)
[0068] [表 1] 表 1 共存培地への硫酸銅の添加が形質転換効率に及ぱす効果
接種未熟胚数 （A) 冉分化勸数 GUS陽性植物数 （B) 形質転換効率 （B/A, ¾)
0 13 2 2 15. 4
1 13 2 1 1 5. 4
5 13 6 6 46. 2
10 14 6 5 35. 7
以上のように共存培地への硫酸銅の添力卩はァグロバタテリゥムによる遺伝子導入効 率を高め、カルス形成および増殖を促進し、形質転換効率を向上させる効果のある ことが示された。
実施例 2 共存培地への硫酸銅の添加がイネへの遺伝子導人に及ぼす効
材料および方法
Figure imgf000023_0001
Λ ΚΗ ΡΟ、 lg/1 NaH ΡΟ、 lg/1 ΝΗ Cl、 300mg/l MgSO · 7H 0、 1
2 4 2 4 4 4 2
50mg/l KC1、 10mg/l CaCl、 2. 5mg/l FeSO - 7H 0、 5g/l グルコース
2 4 2
、 15g/l 寒天、 pH7. 0 ; Chilton, M.— D. , et al. , (1974) , Proc. Natl. Ac ad. Sci. U. S. A. , 71 : 3672— 3676)上で 3— 4日間培養した Agrobacterium t umefaciensスーパーバイナリーベクター LBA4404 (pSB134) (T—DNA領域に トウモロコシュビキチンプロモーターでドライブされたュビキチンイントロンを結合した
HPT遺伝子 (ノヽイダロマイシン耐性遺伝子）およびカリフラワーモザイクウィルス 35S プロモーターでドライブされたヒマカタラーゼイントロンを結合した GUS遺伝子を有す る； PSB134の作成は pKY205 (WO 03/027290を参照）に発現マーカーとして PSB32由来の 35S— intron GUS— nos断片を Hindlll部位に挿入することにより行 つた）を白金耳でかきとり、約 109 cfuZmlの濃度で 100 Mァセトシリンゴンを含む AA1液体培地 (AA主要無機塩、 LS微量無機塩、 MSビタミン、 AAアミノ酸、 0. 2g Zlカザミノ酸、 4gZンユークロース、 2gZlグルコース、 PH5. 2) 1mlに懸濁した。無 菌的に採取した未熟胚（品種 IR64)を入れたエツペンドルフチューブにァグロバクテ リウム懸濁液 lmlを加え、 30秒間ボルテックスミキサーで撹拌後、室温で 5分間静置 した。未熟胚を nN6-As培地（N6無機塩、 N6ビタミン、 0. 5gZlカザミノ酸、 0. 5g /\ L—プロリン、 lmg/1 2, 4— D、 0. 5mg/l NAA、 0. lmg/1 6BA、 20g/l シユークロース、 lOg/1グルコース、 10 M AgNO 、 100 μ Mァセトシリンゴン、
3
8gZlァガロース、 PH5. 2)および の CuSO · 5Η Οを含む ηΝ6— As培地に置
4 2
床し、暗黒下、 25°Cで 1週間培養した。
[0069] S
共存培養後の未熟胚を X— glueにより染色し、 GUS遺伝子の一過的発現を示す部 位 (青色を呈する部位)の範囲を 0 (無発現)力 4 (胚盤のほぼ全面で発現)の 5段階 で評価した。
[0070] 5 μ Μの硫酸銅を含む共存培地で 1週間培養した未熟胚は対照の培地で培養した 未熟胚に比べ胚盤の広 、範囲で GUS遺伝子の一過的な発現を示した（図 4)。この ことから、共存培地への硫酸銅の添カ卩による遺伝子導入効率の向上はトウモロコシだ けでなぐイネにおいてもみられることが明ら力となった。 実施例 3 共存培地へのダルコン酸銅の添加がトウモロコシへの遣伝子導入に及ぼ す
材料および方法
受粉後 7から 14日目のトウモロコシ（品種: A188)の未熟胚（大きさ 1. 0-1. 5mm) を無菌的に採取し、 LS— inf液体培地で 1回洗浄した。遺伝子導入効率を高めるため の前処理 (46°C、 3分間の熱処理および 15, 000rpm、 10分間の遠心処理）を行つ た。 100 iu Mァセトシリンゴンを含むLS—inf液体培地に約l. OxlO9 cfuZmlで Ag robacterium tumefaciens LBA4404 (pSB131)を懸濁し接種源とした。熱-遠 心処理した未熟胚に接種源を加え、 30秒間撹拌した後、 5分間室温で静置した。 5 μ M AgNOを含む LS— AS培地に 0—10 μ Μの濃度でダルコン酸銅を添カ卩した共
3
存培地にァグロパクテリゥムを接種した未熟胚を胚盤が上になるように置床した。
[0071] 25°C、暗黒下で 3日間培養した後、一部の未熟胚を 0. 1%の Triton X— 100を含 む 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 8)に浸漬し、 37°Cで 1時間静置した。リン酸緩衝液で ァグロバタテリゥムを除去した後、 1. OmM 5—ブロモー 4—クロ口— 3—インドリノレー j8— D—グルクロン酸 (X— glue)および 20%メタノール含むリン酸緩衝液を添カ卩した。 37 °Cで 24時間処理した後、顕微鏡下で観察し、青色を呈する組織の範囲を調査した。
[0072] また、共存培地上で 7日間培養した未熟胚におけるカルス形成を 0 (カルス形成な し）、 1 (胚盤の一部がカルス化）、 2 (胚盤の約半分がカルス化）、 3 (胚盤の 3Z4以 上がカルス化)の指数で評価した。
[0073]
各種共存培地で 3日間培養した未熟胚（品種 A188)を X— glueにより染色し、 GU S遺伝子の一過的発現を示す部位 (青色を呈する部位)の範囲を 0 (無発現)力 4 ( 胚盤のほぼ全面で発現）の 5段階で評価した。 1、 5および 10 /z Mのダルコン酸銅を 含む共存培地で 3日間培養した未熟胚は対照の培地で培養した未熟胚に比べ胚盤 の広 、範囲で GUS遺伝子の一過的な発現を示した（図 5)。
[0074] 共存培地で 1週間培養した未熟胚のカルス形成を調査した。 1、 5および 10 μ Μの ダルコン酸銅を含む共存培地で培養した未熟胚は 、ずれもダルコン酸銅を含まな!/ヽ 培地で共存培養した未熟胚に比べ高いカルス形成を示した。特に 5および 10 Μの ダルコン酸銅を含む共存培地では対照に比べ有意に高 ヽカルス形成を示した（図 6
) o
[0075] これらのことから、共存培地にダルコン酸銅を添加することにより硫酸銅を添加した 時と同様に遺伝子導入効率及びカルス形成率が高まることが明らかとなった。
実施例 4 接糠源液体培地への硫酸銅およびグルコン酸銅の添加がイネへの遣伝 入に ぼす ¾
材料および方法
Figure imgf000026_0001
一 4日間培養した Agrobacterium tumefaciensスーノ ーノイナリーベクター LB A4404 (pSB134)を白金耳で力きとり、約 109 cfuZmlの濃度で 100 Mァセトシ リンゴンおよび 0— 50 /z Mの CuSO · 5Η Οあるいはダルコン酸銅を含む AA1液体
4 2
培地 lmlに懸濁した。無菌的に採取した未熟胚（品種ゆきひかり）を入れたエツペン ドルフチューブにァグロバタテリゥム懸濁液 lmlをカ卩え、 30秒間ボルテックスミキサー で撹拌後、室温で 5分間静置した。未熟胚を nN6 - As培地に置床し、暗黒下、 25°C で 1週間培養した。
[0076] 腿
共存培養後の未熟胚の重量を測定した。 3回の試験を行ったが、いずれの試験に ぉ 、ても接種源液体培地に硫酸銅あるいはダルコン酸銅を加えた場合、無添加の対 照の未熟胚に比べ、旺盛な増殖を示した（図 7)。このことから、硫酸銅およびダルコ ン酸銅の添カ卩によるカルス増殖の促進は共存培地だけでなく接種源の液体培地に 添加した時にも同様にみられることが明ら力となった。
実施例 5 再分化培地への硫酸銅、グルコン酸銅の添加がトウモロコシ形皙転槺被 物の牛.音に及ぼす効
材料および方法
トウモロコシ（品種： A188)の未熟胚（大きさ 1. 0-1. 5mm)に Agrobacterium t umefaciens LBA4404 (pSB131)を接種し、 PPTを含む LSD1. 5培地で培養す ることにより形質転換カルスを得た。形質転換カルスを約 2mmの大きさに刻み 10 μ Μの CuSO · 5Η Οあるいはダルコン酸銅、および ΡΡΤを含む LSZ再分化培地に置 床した。照明下、 25°Cで 3週間培養し、再分ィ匕した植物の葉長を測定した。
[0077] S
硫酸銅あるいはダルコン酸銅含む再分化培地で再分化した植物の葉長は対照の 再分化培地で再分化した植物に比べ有意に長ぐ硫酸銅ある ヽはダルコン酸銅に再 分化植物の生長を促進する効果のあることが示された (図 8)。
実施例 6 再分化培地への硫酸銅、グルコン酸銅の添加がイネ形皙転槺被物の牛.音 に ぼす ¾
材料および方法
イネ（品種：ゆきひかり）の未熟胚に Agrobacterium tumefaciens LBA4404 ( PSB134)を接種し、ハイグロマイシンを含む nN6CC培地（N6無機塩、 N6ビタミン、 0. 5gZlカザミノ酸、 0. 5g/l L—プロリン、 lmg/1 2, 4— D、 0. 5mg/l NAA、 0. lmg/1 6BA、 20g/l シユークロース、 55g/l ソルビ卜ール、 250mg/l セ フォタキシム、 250mgZl カルべ-シリン、 5g/l ゲルライト、 pH5. 8)で培養する ことにより形質転換カルスを得た。形質転換カルスを約 2mmの大きさに刻み 10 M の CuSO · 5Η Οあるいはダルコン酸銅、およびハイグロマイシンを含む N6R再分化
4 2
培地（主要無機塩を 1Z2に減じた Ν6無機塩、 Ν6ビタミン、 ΑΑアミノ酸、 lgZlカザ ミノ酸、 0. 5mg/l 力イネチン、 20g/l シユークロース、 30g/l ソルビトール、 4g Λ ゲルライト、 pH5. 8)に置床した。照明下、 25°Cで 3週間培養し、再分化した植 物の葉長を測定した。
[0078] S
硫酸銅あるいはダルコン酸銅含む再分化培地で再分化した植物の葉長は対照の 再分化培地で再分化した植物に比べ有意に長ぐ硫酸銅ある ヽはダルコン酸銅に再 分化植物の生長を促進する効果のあることがイネにおいても示された（図 9)。
産業上の利用可能性
[0079] 本発明は、従来のァグロパクテリゥム法よりもより高い効率で遺伝子導入のなされる 安価で簡便な方法を開発する。また、従来のァグロパクテリゥム法では遺伝子導入が 困難とされていた植物種および品種にも適応できる方法を提供する。本発明の方法 は、通常の濃度の金属塩を含む培地を用いた場合と比較して、遺伝子導入効率およ び zまたは形質転換効率を向上させ、および zまたは再分化植物の生長を促進さ せる。
[0080] 図 1に示したように、硫酸銅を高濃度含む共存培地を用いることにより、単子葉植物 であるトウモロコシにつ 、ての遺伝子導入効率が、硫酸銅を含まな 、培地を用いたと きと比較して 2倍ないし 2. 5倍に向上した。また、さらに加熱'遠心処理を加えることで 、遺伝子導入効率は硫酸銅を含まな!/ヽ培地および未処理の植物材料を用いたときと 比較して 1. 5倍ないし 3倍に向上した。
[0081] 本発明により、植物のァグロバタテリゥム法による遺伝子導入効率が向上したことか ら、多数の形質転 ^¾物を効率よく得ることができ、実用遺伝子を導入した品種の育 成を効率よぐ容易にするのに貢献する。特に、単子葉植物、なかでもトウモロコシは 従来のァグロパクテリゥム法では形質転換効率が低力 たため、本発明の方法により 形質転換効率が向上したことの意義は大きい。

Claims

請求の範囲
[I] 1)植物材料を調製し、次！、で
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる、
ことを含む、ァグロパクテリゥム属細菌を介して植物材料への遺伝子導入を行う方法 であって、上記 1)および Zまたは 2)の工程において、銅イオンを含む金属塩の濃度 を高めた培地を用いることを特徴とする、前記方法。
[2] 金属塩が、硫酸銅またはダルコン酸銅である、請求項 1に記載の方法。
[3] 金属塩が、硫酸銅である、請求項 1に記載の方法。
[4] 少なくとも、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)にお 、て金属塩の 濃度を高めた培地を用いる、請求項 1な 、し 3の 、ずれか 1項に記載の方法。
[5] 少なくとも、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)において、硫酸銅ま たはダルコン酸銅の濃度を高めた培地を用いる、請求項 1ないし 4のいずれか 1項に 記載の方法。
[6] 少なくとも、植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)において、 1一 50 M、好ましくは 1一 10 Mの硫酸銅またはダルコン酸銅を含む培地を用いる、請求 項 1な!、し 5の!、ずれか 1項に記載の方法。
[7] 植物材料を調製する工程 1)、および Zまたは、植物材料をァグロバクテリウムに感 染させる工程 2)において、加圧処理、熱処理、遠心処理、および超音波処理からな る群から選択される、少なくとも 1の処理を植物材料に行うことをさらに含む、請求項 1 な！、し 6の!、ずれか 1項に記載の方法。
[8] 植物が、単子葉植物である、請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の方法。
[9] 植物が、トウモロコシである、請求項 1ないし 7のいずれ力 1項に記載の方法。
[10] 植物が、イネである、請求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の方法。
[II] 植物材料が未熟胚である、請求項 1ないし 10のいずれか 1項に記載の方法。
[12] 植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)に次いで、さらに、
3)形質転換細胞を選抜し、
4)所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含む、請求項 1ないし 11に記載の方法。
[13] 植物材料をァグロバタテリゥムに感染させる工程 2)に次いで、さらに、 少なくとも以下の 1の段階において銅イオンを含む金属塩の濃度を高めた培地を用 いて、
3)形質転換細胞を選抜し、
4)所望により選抜された形質転換体を再分化する、
工程を含む、請求項 1ないし 11に記載の方法。
[14] 請求項 12または 13に記載の方法を使用することを特徴とする、形質転 ^¾物の製 造方法。
[15] 1)植物材料を調製し、
2)植物材料をァグロバタテリゥムに感染させ、
3)形質転換細胞を選抜し、そして
4)選抜された形質転換体を再分化する、
ことを含む、ァグロパクテリゥム属細菌を介した植物材料の形質転換による形質転換 植物の製造方法であって、上記 4)の工程において銅イオンを含む金属塩の濃度を 高めた培地を用いることを特徴とする、
j記方法。
[16] 金属塩が硫酸銅またはダルコン酸銅である、請求項 15に記載の方法。
[17] 金属塩の濃度が 1一 50 μ Μ、好ましくは 1一 10 μ Μである、請求項 15または 16に 記載の方法。
[18] 植物が単子葉植物である、請求項 15ないし 17のいずれか 1項に記載の方法。
[19] 植物がトウモロコシである、請求項 15ないし 17のいずれ力 1項に記載の方法。
[20] 植物がイネである、請求項 15ないし 17のいずれか 1項に記載の方法。
[21] 植物材料が未熟胚である、請求項 15ないし 20のいずれか 1項に記載の方法。
[22] 脱分化した植物細胞から植物体を再分化させる工程にお!ヽて、銅イオンを含む金 属塩の濃度を高めた培地を用いることを特徴とする、再分化植物の生長を促進させ る方法。
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