WO2005017139A1

WO2005017139A1 - Thrombine provenant de venin de agkistrodon acutus utilisee comme medicament pour traiter une hemorragie

Info

Publication number: WO2005017139A1
Application number: PCT/CN2003/001048
Authority: WO
Inventors: Zhong Wu
Original assignee: Liu, Xianying; Lin, Wenhong; Su, Weiwei
Priority date: 2003-08-14
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2005-02-24
Also published as: CN1488399A; CN1218747C; AU2003292882A1

Description

尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物

本发明所属技术领域

本发明涉及一种从尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶，命名为尖吻蝮蛇凝血酶（ Haemocoagulase Acutus，简写为 Hal_aSe)。本发明涉及尖吻蝮蛇凝血酶用于制备治疗出血性疾病的药物的用途。

在本发明之前的现有技术

在临床急救医学中，出血是经常发生的急症。根据出血的原因可将出血分为两大类：一种是血液病或出血性疾病，往往是由于机体凝血机能发生障碍而导致的自发性出血。出血性疾病可原发或继发临床各种疾病，如血小板数目减少性紫癜、血友病、再生障碍性贫血、白血病、高血压脑病、消化系统疾病、消化道出血等。另一类是由于受伤或外伤引起的血管组织损伤所致的出血，其发生的原因比出血性疾病简单。

无论是出血性疾病或外伤性出血，机体都有一个正常止血过程。一般可分为三期：每一期为血管期，主要表现是血管反应性收缩，使血管腔变窄，血流变慢，使出血减少甚至停止。第二期是细胞期，即血小板聚集形成血小板栓子，以达到机械性堵塞血管的初步止血。第三期血浆期，或血液凝固过程。即在凝血酶的作用下，使纤维蛋白质变成纤维蛋白，将红细胞、白细胞、血小板网络在一起，引起血液凝固，促进或加固止血过程。

根据上述正常止血机理过程，按出血的发病机理可将出血的原因分为三种：一是血管异常性出血，即由于血管本身的因素，如血管不能闭合，以及毛细血管抵抗力降低或血管周围组织结构异常等引起的出血；二是血小板异常，如血小板生成不足或血小板破坏过多引起的血小板减少；三是凝血机制障碍引起的出血。针对上述引起出血的不同原因，而采取不同的止血方法和措施。临床上常用的止血药物也可据此分为以下三类：

第一类是作用于血管壁的止血剂。血管性出血的发病机理主要是血管壁通透性和脆性增高，血管周围的结缔组织松弛，血管的收缩能力下降或损伤因素所致。因此，临床上所用的作用于血管壁的止血剂，一般都是作用于微血管，改善其功能和结构而达到止血作用。

第二类是作用于血小板的止血剂，血小板异常引起的出血有以下两种类型：一种是血小板功能缺陷性疾病，大多数是先天性的。另一种是血小板减少所致的出血。无论是血小板功能缺陷性或血小板减少性出血，出血严重时，均采用静注血小板悬液来治疗。

上述作用于血管壁和血小板的止血药物在临床应用中，其适应性和疗效都有很大的局限性。

第三类是作用凝血过程的止血药物。由于正常凝血过程的复杂性，本类止血药的作用与作用机理比上述两类复杂得多。正常的血液凝固过程简要地说，是在凝血酶的作用下，纤维蛋原变成纤维蛋白，后者将红细胞、白细胞、血小板网络在一起而起起血液凝固的过程。但另一方面，血液凝固而产生的纤维蛋白网状物必须发生溶解（即纤维蛋白溶解）才能保持血管的通畅，维持血液的流态。这就是血液凝固与纤维蛋白溶解的动态平衡过程。

从血凝固和纤溶蛋白的溶解过程来看，凝血酶和纤溶酶是止血药物作用的关键靶酶，促进凝血酶的活性或具有凝血酶类似作用的类凝血酶都能促进纤维蛋白原变成纤维蛋白，因而具有止血作用；而抑制纤溶酶活性，减少纤维蛋白的降解也具有止血作用。

抑制纤溶酶的药物又称抗纤溶药物，在临床上已有广泛应用，主要用于纤溶系统亢进的出血。但由于该类药物有止血机制，需严格掌握适应症，才能收到良好的止血效果。如不加选择地应用，不仅不能收到预期的止血效果，甚至还会发生血栓形成的危险。

作用于凝血酶或与凝血酶具有类似作用的类凝血酶是止血药物作用的另一个重要靶酶。已有从人或牛的血浆中直接提取的凝血酶，作为止血药物应用，但凝血酶溶解后的活性不稳定，而且凝血酶脉注射列为绝对禁忌，因其有引起弥散性血管内凝血的危险性。另外，从蛇毒中提取的类凝血酶具有凝血酶的部分类似活性，但作用和作用特点不同。虽然已从蛇毒中发现多种类凝血酶，但真正在临床取得成功应用的是瑞士素高药厂生产的立止血（Reptilase), 该制品是从蝰科洞蝮蛇属蝮蛇（Bothropsatrox)蛇毒中提取的类凝血酶。在许多国家都已广泛地用于临床，证明是一种高效、速效、安全的止血药物。立止血的作用机理是使纤维蛋白原变成纤维蛋白，纤维蛋白原（Fbg) 是由两个相同亚单位组成的糖蛋白，每个亚单位包含三条肽链，即 Α α链、 80链和¥链。整个纤维蛋白原可用（Α α、 Β β , Υ ) ₂表示。立止血的作用机理是水解纤维蛋白原的 Α α链，使纤维蛋白原变成纤维蛋白单体。由于立止血对纤维蛋白稳定因子（νπι因子）无激活作用，因而形成的纤维蛋白单体为可溶性纤维蛋白单体。其降解物迅速被体内巨噬细胞系统吞噬、代谢，不引起血栓形成。

立止血（Reptilase)的原料是蝰科洞蝮蛇属蝮蛇（Bothrops atorx) 蛇毒，但中国没有该蛇的分布。

发明目的

本发明的目的是提供一种从尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus ) 蛇毒中分离纯化的类凝血酶，即尖吻蝮蛇凝血酶（Haemocoagulase Acutus, 简写为 Halase); 以及提供尖吻蝮蛇凝血酶在制备用于治疗出血性疾病的药物中的应用。

本发明釆用的技术方案

本发明从中国华南地区的尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus ) 蛇毒中分离纯化了一种类凝血酶，命名为尖吻蝮蛇凝血酶（Haemocoagulase Acutus,简写为 Halase)。尖吻蝮蛇凝血酶的结构；本品是由两个亚基构成的糖蛋白，以二硫键连接。 N末端 15个氨基酸序列的测定结果如下： A 亚基： DCPSDWSSYE GHCYK; B亚基： DCSSGWSSYEGHCYK。分子量： 29076. IDa, 等电点为 5. 78，含 1. 89%- 1. 95%中性己糖。药理和毒理实验结果表明：本品具有较强的止血作用，且毒性非常低。尖吻蝮蛇凝血酶是一种与立止血具有相似的止血作用，但结构完全不同的新的止血药物。

本发明实验证实：尖吻蝮蛇凝血酶（Haemocoagulase Acutus，简写为 Halase ) 是从尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus ) 蛇毒中分离纯化的类凝血酶。药理和毒理实验结果表明，本品具有较强的止血作用，且毒性非常低，是一种安全有效的止血药物。

本发明中，尖吻蝮蛇凝血酶结构确证实验结果如下-

1.高效液相色谱（HPLC)测定结果：尖吻蝮蛇凝血酶呈单一对称峰，纯度〉 98%。 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)结果：尖吻蝮蛇凝血酶为单一区带。 3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 结果；尖吻蝮蛇凝血酶由 14.8KD和 16.0KD两个亚基构成。

4.基体辅助激光解吸 /电离 -飞行时间质谱分析结果：尖吻蝮蛇凝血酶分子量为 29076. lDa。

5.等电聚焦电泳测定结果：尖吻蝮蛇凝血酶的等电点（pi)为 5.98.

6. N末端 15 个氨基酸序列的测定结果如下： A 亚基： DCPSDWSSYE GHCYK; B亚基： DCSSGWSSYEGHCYK。二个亚基由二硫键连接。

本发明中，尖吻蝮蛇凝血酶药效学实验结果如下- 1. 尖吻蝮蛇凝血酶对小鼠剪尾出血时间的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以

0.棚 /Kg、 0.24U/kg和 0.12U/Kg—次静注后 30min，小鼠剪尾的平均出血时间分别为 32.79±10.55、 34.35±11.25和 37.52±10.78秒；生理盐水组的平均出血时间为 62.44±10.87秒；阳性对照药立止血的平均出血 ' 时间为 40.90±10.74秒。表明尖吻蝮蛇凝血酶能明显縮短小鼠剪尾出血的时间。

2. 尖吻蝮蛇凝血酶对兔耳缘静脉出血时间的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0.16U/Kg、 0.08 U/Kg和 0.04 U/Kg—次静注后 30min，兔耳缘静脉的平均出血时间分别为 2.99 ±0.42、 3.27±0.44和3.86±0.48111 ；生理盐水组的平均出血时间为 6.11±0.74min_; 阳性对照药立止血的平均出血时间为 3.68±0.48min。表明尖吻蝮蛇凝血酶能明显縮短兔耳缘静脉出血的时间。

3. 尖吻蝮蛇凝血酶对兔全血凝固时间的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0. 16 U/Kg、 0. 08 U/Kg和 0. 04 U/Kg—次静注后 30min、 lh、 3h、 6h、 12h，明显缩短兔全血凝固时间。药物在给药后， 30 分钟左右达到最大效应，维持约 12小时，然后全血凝固时间逐渐恢复正常。阳性对照药立止血也能明显縮短兔全血凝固时间。

4. 尖吻蝮蛇凝血酶对凝血酶原时间（PT )、活化部分凝血酶时间

(ΑΡΤΤ) 和纤维蛋白原的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0. 16 U/Kg、 0. 08U/Kg 和 0. 04 U/Kg一次静注后 30min、 lh、 3h、 6h、 12h、 24h, 对 PT、 APTT 和纤维蛋白原无明显影响；立止血对上述三项指标也无明显影响。

5. 尖吻蝮蛇凝血酶对纤溶系统优球蛋白溶解时间的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0. 16U/Kg、 0. 08U/Kg和 0. 04 11/ —次静注后30111^、 lh、 3h、

6h、 12h、 24h，对优球蛋白溶解时间无明显影响；立止血对优球蛋白溶解时间也无明影响。

6. 尖吻蝮蛇凝血酶对兔白细胞、红细胞、血小板计数和血红蛋白的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0. 16U/Kg、 0. 08U/Kg和 0. 04 U/Kg一次静注后 30min、 lh、 3h、 6h、 12h、 24h，对兔白细胞、红细胞、血小板计数和血红蛋白无明显的影响；立止血对上述四项指标也无明显影响。

7. 尖吻蝮蛇凝血酶对全血粘度的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0. 16U/Kg、 0. 08U/Kg和 0. 04 1!/ —次静注后3(½:11₁、 lh、 3h、 6h、 12h、 24h,对高切变率（120mPa. s)、中切变率（60mPa. s)和低切变率（lOmPa. s) 时的全血粘度无明显影响；立止血对上述三种切变率下的全血粘度也无明显影响。

8. 尖吻蝮蛇凝血酶对兔血小板聚集的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0. 16U/Kg、 0. 08U/Kg和 0. 04 U/Kg—次静注后 30min、 lh、 3h、 6h、 12h，对兔血小板聚集无明显影响；立止血对兔血小板聚集也无明显影响。

9. 尖吻蝮蛇凝血酶对血小板生成 TXB₂的影响：尖吻蝮蛇凝血酶以 0. 16U/Kg、 0. 08U/Kg和 0. 04 U/Kg—次静注后 lh、 3h、 6h、 12h和 24h，对兔全血 TXB₂含量无明显影响；立止血对兔全血 TXB₂含量也无明显影响。

本发明中，尖吻蝮蛇凝血酶一般药理学实验结果如下：小鼠静脉一次注射剂量为 0. 96、 0. 48和 0. 24U/Kg的尖吻蝮蛇凝血酶，对小鼠自主活动次数无明显影响。麻醉猫静脉一次注射剂量为 0. 32、 0. 16和 0. 08 U/Kg 的尖吻蝮蛇凝血酶，对心血管系统一心率和血压无明显影响；对呼吸系统呼吸频率和幅度也无明显影响。

本发明中，尖吻蝮蛇凝血酶毒理学实验结果如下：

1. 尖吻蝮蛇凝血酶 48U/Kg—次给小鼠和大鼠静注或肌注后，未观察到毒性反应和动物亡。

2. Beagle犬以 1.2、 0.6、 0.3U/Kg和大鼠以 2. 4、 1. 2、 0. 6U/Kg高、中、低三个剂量连续静注本品两周，均未观察到毒性反应和动物死亡。本品停药后两周恢复期内，也未观察到物的毒性反应和死亡。

3.鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验、小鼠睾丸染色体畸变试验、小鼠骨髓微核试验为阴性。

4.生殖毒性试验：大鼠致畸敏感期毒性试验为阴性。

5.过敏性试验、溶血性试验、血管和肌肉局部剌激试验为阴性。

6.出血毒试验为阴性。热原试验、异常毒性试验和无菌试验为阴性。本发明中，尖吻蝮蛇凝血酶代动力学实验结果如下： 1.大鼠静注 0. 6、 1. 2和 2. 4Ug/Kg本品后的消除半衰期 t_1/2P分别为 8. 50、 9. 74和 10. 87h; 八11(分别为31. 06、 65. 28和 139. 39ng. h/ml。

2.肝、脾和心在给药后 5min药物浓度达峰，其它绝大部分组织在给药后 30min药浓度达峰。肝组织药物浓度显著高于其它组织、脾、肺、肾、胃、心等组织药物浓度较高，脑、脂肪组织浓度最低。

3.给药后 96h内 73.52%的药物从尿中排出， 12.13%从粪中排泄。给药后 24h内胆汁累积排泄量为 4.16%, 表明本品排泄完全。

本发明中，用尖吻蝮蛇凝血酶制备注射用制剂时，取尖吻蝮蛇凝血酶原料药和赋形剂右旋糖酐加注射用水溶解，定容至一定体积，过滤除菌后分装，冷冻干燥后即得注射用尖吻蝮蛇凝血酶粉针剂。该制剂为白色冻干粉末，无嗅无味，易溶于水，水溶液澄清透明。在 pH值为 4. 0- 7. 0时活性稳定。本品的效价以促人血浆凝固时间的活性单位表示。一个活性单位是指在 37°C条件下，促使标准人血浆在 60±20秒内振摇后出现絮状物的尖吻蝮蛇凝血酶量。

实施例

实施例 1. 尖吻蝮蛇凝血酶对小鼠剪尾出血时间的影响：

健康昆明种小鼠 50只，雌雄各半，按体重随机分成 5组，即尖吻蝮蛇凝血酶高剂量组 ( 0. 48U/Kg )、中剂量组 ( 0. 24U/K_g )、低剂量组 (0. 12U/Kg), 阳性对照立上血组（0. 24U/Kg) 和阴性对照灭菌注射用水组。采用一次尾静脉注射给药方式，给药后 30min用非常锋利的剪刀在小鼠尾尖部向上约 lcm处快速剪断尾部，并立即用秒表记时，同时不断用滤纸吸流出的血液。从剪尾开始至出血停止这段时间即为小鼠剪尾出血时间。采用 SPSS8. 0统计软件进行分析，检验方法为 t检验。结果见表 1。低高中

齐弃齐

表 1 结果量量量显示：尖吻蝮蛇凝血酶高剂量组（0. 48U/K_g )、中剂量组

(0. 24U/Kg)、低剂量组 (0. 12U/Kg), 能明显縮短小鼠剪尾出血时间，阳性药物立止血也能明显缩短小鼠剪尾出血时间，尖吻蝮蛇凝血酶三个剂量组及立止血组与阴性对照灭菌注射用水组相比较，均有显著性差异

(P〈0. 01 )。表 1 尖吻蝮蛇凝血酶对小鼠剪尾出血时间的影响（n=10，X±SD)

\ 剂量（u/Kg) 出血时间（s)

灭菌注射用水组 62. 44± 10. 87

立止血组 0. 24 40. 70 ± 10. 74" 尖吻蝮蛇凝血酶

0. 48 32. 79 ± 10. 55"

0. 24 34. 35 ± 11. 25**

0. 12 37. 52± 10. 78" 注：与灭菌注射用水组比较 **P〈0. 01

实施例 2. 尖吻蝮蛇凝血酶对兔耳缘静脉出血时间的影响：将 30只健康日本大耳白兔按体重随机分成 5组，每组 6只，雌雄各半， 5组为：尖吻蝮蛇凝血酶高剂量组（0. 16U/Kg)、中剂量组（0. 08U/kg) 低剂量组（0. 04U/kg)，阳性对照立止血（0. 04 U/kg) 和阴性对照灭菌注射用水组。 3个尖吻蝮蛇凝血酶组和立止血组均按试验设计剂量采用一次兔耳缘静脉注射给药，阴性对照给予等体积灭菌注射用水。给药 30min 后将已剪毛消毒的兔耳尖部的耳缘静脉区用一次性采血针穿刺耳缘静脉, 自创面出血后开始记时，每隔 20秒用滤纸条轻轻蘸吸直至血液不再渗出，即滤纸条上不再沾有血迹为止，记录从出血开始直至出血停止时的时间，为出血时间。进行统计学分析。结果见表 2。表 2结果显示：尖吻蝮蛇凝血酶高剂量组（0.16U/Kg)、中剂量组（0.08U/kg)、低剂量组（0.04U/kg) , 能明显缩短兔耳缘静脉出血时间，阳性药物立止血组也能明显地缩短兔耳缘静脉出血时间，尖吻蝮蛇凝血酶高、中剂量组及立止血组与阴性对照灭菌注射用水组相比较，均有显著性差异（P〈0.01)，尖吻蝮蛇凝血酶低剂量组与阴性对照灭菌注射用水组相比较，有显著性差异（P<0.05)。

表 2 尖吻蝮蛇凝血酶对兔耳缘静脉出血时间的影响（n=6,X土 SD) 组别剂量（U/Kg) 出血时间（min) 灭菌注射用水组 6.11 + 0.74

立止血组 0.04 3.68 ±0.48

尖吻蝮蛇凝血酶

高剂量组 0.16 2.99 ±0.42*' 中剂量组 0.08 3.27±0.44"

低剂量组 O04 3.86 ±0.48"

注：与灭菌注射用水组比较 **P<0.01,*P<0.05

实施例 3. 尖吻蝮蛇凝血酶对兔全血凝固时间的影响：

将 24只健康日本大耳白兔按体重随机分成 4组，每组 6个，即尖吻蝮蛇凝血酶高剂量组（0.16U/½)、中剂量组（0.08U/kg)、低剂量组 (0.04U/kg) 和立止血组（0.04U/kg)。首先测定每只兔的正常凝血时间作为自身空白对照，然后，按试验设计给药剂量采用一次兔耳缘静脉给药，分别给药后 5min、 30min、 lh、 3h、 6h、 12h和 24h, 用一次性采血针穿刺兔耳中动脉，采 lml血置入消毒的玻璃试管中，将玻璃试管放在 37°C 水浴箱中，并记录时间。然后倾斜试管观察血液是否凝固，直至血液不再流动全部凝固为止。其判断终点为：将试管倾斜 90度时，血液不再流动为止。

从加入血液置入试管开始至血液达到凝固终点的时间为全血凝周时间。并将给药后各时间点与给药前相比较，采用 SSPS8. 0统计软件进行 t 检验。结果见表 3。表 3结果显示：尖吻蝮蛇凝血酶后 30min、 lh、 3h、 6h、和 12h, 三个剂量组均能明显地缩短兔全血凝固时间。立止血在给药后 30min、 lh、 3h、 6h、和 12h，也能明显缩短兔全血凝固时间。

尖吻蝮蛇凝血酶对兔全血凝固时间（s ) 的影响（n=6, X士 SD)

注：与给药前比较 **P<0.01，*P<0.05 实施例 4. 注射用尖吻蝮蛇凝血酶粉针剂处方组成：

称取尖吻蝮蛇凝血酶原料药（1000个单位的原料药）和赋形剂右旋糖酐 10g，置于玻璃容器中，加适量无菌注射用水溶解混匀后，最终将无菌注射用水加至 500ml。用滤膜（膜孔径 0. 22 μ η 过滤除菌后，在洁净室超静工作台分装，每瓶含尖吻蝮蛇凝血酶 1个单位（1 U/瓶)。然后加盖冻干用胶塞，冷冻干燥后即得注射用尖吻蝮蛇凝血酶粉针剂。

Claims

权利要求

1.一种尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物，该酶是从尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶，命名为尖吻蝮蛇凝血酶（Haemocoagulase Acutus), 其特征是尖吻蝮蛇凝血酶可用于制备治疗出血性疾病的药物。

2.根据权利要求 1 所述的尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物，其特征是：所说的治疗出血性疾病包括治疗人的出血性疾病和家畜的出血性疾病。

3. 根据权利要求 1所述的尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物，其特征在于：尖吻蝮蛇凝血酶是由两个亚基构成的糖蛋白，以二硫键连接， N末端 15个氨基酸序列的测定结果如下: A亚基: DCPSDWSSYEGHCYK; B 亚基： DCSSGWSSYEGHCYK; 分子量： 29076. IDa, 等电点为 5. 78，含 1. 89%-1. 95%中性已糖。

4. 根据权利要求 1所述的尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物，其特征在于：用尖吻蝮蛇凝血酶制备注射用制剂时，取尖吻蝮蛇凝血酶原料药和赋形剂右旋糖酐加注射用水溶解，定容至一定体积，过虑除菌后分装，冷冻干燥后即得注射用尖吻蝮蛇凝血酶粉针剂；在 pH 值为 4. 0-7. 0时活性稳定。

5. 根据权利要求 1所述的尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物，其特征在于：尖吻蝮蛇凝血酶加适量药用辅料，可以制成滴剂、喷剂、膏剂、涂抹剂外用剂型。