WO2005014813A1

WO2005014813A1 - 糖尿病改善薬のスクリーニングに利用できる新規蛋白質

Info

Publication number: WO2005014813A1
Application number: PCT/JP2004/011585
Authority: WO
Inventors: Hideki Endoh; Yoshitaka Ueda
Original assignee: Astellas Pharma Inc.
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2005-02-17
Also published as: CA2517489A1; EP1652922A1; JP4264904B2; US20070015155A1; JPWO2005014813A1; EP1652922A4

Abstract

本発明は、2型糖尿病改善薬のスクリーニング方法を提供する。c-Cblに結合する蛋白質CbAP40を見出した。マウスCbAP40遺伝子は糖尿病モデルマウスの筋肉において正常個体より発現量が顕著に増加していること、ヒトCbAP40遺伝子を筋肉由来細胞に高発現させると糖の取り込みが阻害されることを明らかにし､同蛋白質が糖尿病態の原因因子であることを見出した。さらにヒトCbAP40遺伝子のプロモーター領域を同定し､該プロモーター由来の転写誘導活性がインスリン抵抗性を改善するチアゾリジン誘導体により抑制されることを明らかにした。これをもとに該プロモーター活性及びc-CblとCbAP40との相互作用の変化を指標としたインスリン抵抗性改善効果を有する物質のスクリーニング系を構築した。

Description

糖尿病改善薬のスクリーニングに利用できる新規蛋白質技術分野

明

本発明は、 2型糖尿病改善薬のスクリーニング方法に関する。 C- Cblに結合する新規なポリぺプチド及び該ポリぺプチドをコドするポリヌクレオチドに関す書一

る。また該ポリペプチドの発現量を制御するプロモーター、前記ポリヌクレオチド又は該プロモーターを含有する発現べクター、該発現ベクターを含有する形質転換細胞に関する。さらに、前記ポリペプチド、プロモーター、発現ベクター及び/又は形質転換細胞の 2型糖尿病改善薬スクリーニングのための使用に関する。背景技術

インスリンは勝臓ランゲルハンス島の ]3細胞より分泌され、主に筋肉、肝臓、脂肪に作用して血中の糖を細胞に取り込ませて貯蔵、消費させることにより血糖値を降下させる。糖尿病は、このインスリンの作用不足から引き起こされるが、患者にはィンスリ'ンの生産又は分泌に障害をもつ 1型と、インスリンによる糖代鶴す促進が起こりにくくなる 2型の 2つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖値が健常人より高くなるが、 1型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対して、 2型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の細胞における取り込み又は消費が促進されないィンスリン抵抗性が生じている。 2型糖尿病は遺伝的素因に加えて過食や運動不足、ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣病である。今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの 2型糖尿病患者が急激に増加しており、日本では糖尿病患者の 95%を占めている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性の改善により糖代謝を促進する 2型糖尿病の治療を対象とした研究の必要性が増大している。

現在 1型糖尿病患者の治療にはィンスリン注射製剤が処方されている。一方、 2型糖尿病患者に処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膨臓の β細胞に作用してィンスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤

(SU剤）や、嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つビグアナィド系血糖降下剤の他、糖質の消化吸収を遅らせる α _ダルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にィンスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内への糠の取り込みと細胞内における糖利用の促進である。このチアゾリジン誘導体はペルォキシソーム増殖剤 j心答性受容体ガンマ (peroxisome proliferator activated

receptor :PPAR y )のァゴニストとして作用することが示されている（非特許文献 1参照）。しかしチアゾリジン誘導体はィンスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮腫を惹起する副作用が知られている（非特許文献 2 - 3参照)。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用なので、インスリン抵抗性改善のために、 PPAR y にかわるより有用な創薬標的分子が求められている。

インスリン作用のシグナルは細胞膜上にあるィンスリン受容体を介して細胞内へ伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の 2経路が存在する。

(非特許文献 4参照）。第一経路においては、活性ィヒされたインスリン受容体から IRS-1及び IRS- 2、 PI3キナーゼ、 PDK1を介して Aktl (PKB α )又は Akt2 (PKB j3 ) 、或いは PKCえ又は PKC へ順次シグナルが伝達され、その結果として細胞内に存在するグルコーストランスポーター GLUT4を細胞膜上へ移行させることにより、細胞外からの糖の取り込みを促進する（非特許文献 5参照)。一方、第二経路ではィンスリン受容体から C- Cbl及び CAPを介して CrK II、 C3G、及ぴ TC10へ順次.シグナルが伝達され、結果 GLUT4による糖の取り込みを促進する（非特許文献 6参照)。し力し、これらィンスリンシグナル伝達経路の詳細についてはいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構を経てグルコーストランスポーターを介した細胞の糖取り込みを促進するのか明らかではない。

c - Cblはィンスリンシグナル第二経路上に存在するシグナル伝達仲介因子であり、プロリンに富む 120 k Daの細胞質蛋白質である。 C- Cblはィンスリン刺激によつて一過性にチロシンがリン酸化され、 SH2、 SH3を有する種々のシグナル伝達分 . 子と会合する。例えばィンスリンシグナル第二経路に存在するアダプタータンパク質で、インスリン感受性組織である肝臓、骨格筋、腎臓や心臓で強く発現している（非特許文献 7参照） CAP (Cbl associated protein) は、その C末端側にある SH3ドメインを介して C- Cblと結合する。この CAPん- Cbl複合体はィンスリンシグナルに応答して Crk II-C3G複合体及び、 TC10を介してグルコーストランスポーター GLUT4の細胞膜への移行を促進する。 c - Cblとの結合ドメィンである SH3を欠損させた CAPは、 PI3キナーゼ活性には影響は与えないが、細胞の糖取り込みを阻害することが報告されている（非特許文献 8参照)。また CAPの発現はインスリン抵抗性を改善する PPAR vのァゴニストであるチアゾリジン誘導体によって亢進することが知られている。これらの事実から、 c_Cblは CAPとの結合を通じて細胞内への糖取り込みに働くシグナル伝達仲介因子であり、その機能阻害は CAPから下流のインスリンシグナルを遮断してインスリン抵抗性を引き起こすと考えられている (非特許文献 9参照)。したがってィンスリン抵抗性が見られる 2型糖尿病患者の細胞内では何らかの機序により C- Cblを介したィンスリンシグナル伝達が阻害されていると考えられている（非特許文献 9参照）。しかしこれまで C- Cblと直接相互作用してィンスリンシグナル伝達に関わる活·生を負に調節する分子はこれまでに知られていなかった。

(非特許文献 1 ) 「ザ · ジャーナル ·オフ、、 ·バイオロジカノレ 'ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry) J 、 (米国) 、 1995年、第 270卷、 p. 12953 - 12956

(非特許文献 2 ) 「ダイアビーテイーズフロンティア（Diabetes Frontier) 」、

(米国) 、 1999年、第 10卷、 p. 811-818

(非特許文献 3 ) 「ダイアビーテイーズフロンティア（Diabetes Frontier) 」、

(米国) 、 1999年、第 10卷、 p. 819- 824

(非特許文献 4 ) 「ザ · ジャーナル ·ォプ · クリ二カル ·ィンべスティゲーション（The Journal of Clinical Investigation) 」、（米国）、 2000年、第 106卷、第 2号、 p. 165-169

(非特許文献 5 ) 「ザ'ジャーナル ·ォプ ·パイォロジカル 'ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry) J 、 (米国) 、 1999年、第 274卷、第 4号、 p. 1865-1868

(非特許文献 6 ) 「ネイチヤー（Nature)」、（英国）、 2001年、第 410卷、第 6831号、 p. 944-948 ' '

(非特許文献 7 ) 「モレキュラー 'アンド ·セルラー 'バイオロジー（Molecular and Cellular Biology) J (米国) 、 1998年、第 18卷、第 2号、 p. 872-879

(非特許文献 8 ) 「ザ ' ジャーナル ·ォブ '·バイオロジカル 'ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry) J 、 (米国) 、 2001年、第 276卷、第 9号、 p. 6065-6068

(非特許文献 9 ) 「ザ · ジャーナル ·ォブ ·パイォロジカル · ケミストリー (The Journal of Biological Chemistry) J 、 (米国) 、 2000年、第 275卷、第 13号、 p. 9131-9135 発明の開示 .

本発明の目的は、 2型糖尿病改善薬のスクリ一二ング方法を提供することである。

本発明者らは、 c-Cblに結合する蛋白質を酵母ツーハイプリッドシステムにより同定した。その結果、 c- Cblに結合する蛋白質ヒト CbAP⁴0 (Cbl associated protein 40) を見出し、加えて、該蛋白質をコードする遺伝子の発現がインスリン応答組織の一つである骨格筋に偏在していることを明らかにした。また、マウス CbAP40遺伝子及ぴ蛋白質を取得し、 c_Cblと結合することを明らカにした。さらにマウス CbAP40遺伝子は糖尿病モデルマウスの筋肉において正常個体より発現量が顕著に増加していること、ヒト CbAP40遺伝子を筋肉由来細胞に高発現させると糖の取り込みが阻害されることを明らかにし、該蛋白質が糖尿病態の原因因子であることを見出し、新たな 2型糖尿病改善薬スクリ一二ングツールを提供した。さらにヒト CbAP40遺伝子のプロモーター領域を同定し、該プロモーター由来の転写誘導活性がィンスリン抵抗性を改善することが知られているチアゾリジン誘導体により抑制されることを明らかにした。これらの知見から、 CbAP40プロモーター由来の転写誘導活性を抑制することによりインスリン抵抗性改善効果が得られることを明らかにした。これらの知見をもとに上記プロモータ一活性を指標とした 2型糖尿病治療効果を有する物質のスクリーニング系を構築した。すなわち本発明は、以下のスクリーニング方法、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、該発現べクタ一で形質転換された細胞、並びにそれらの用途に関する。

〔1〕 ( 1 ) (i) 配列番号 3で表される塩基配列、（i i) 配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番で表される塩基配列、又は（iii) 配列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは（iv) 前記（i) 〜（ii i) で表される塩基配列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及ぴ Z又は挿入された塩基配列を含み、配列番号 2若しくは配列番号 26で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド

を含む発現ベクターで形質転換された細胞と試験物質とを接触させる工程、及び

( 2 ) プロモーター活性を検出する工程

を含む、試験物質が前賈己（i)乃至（iv)のポリヌクレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法。

〔2〕〔1〕に記載の方法による分析工程、及ぴ

プ口モータ'一活性を阻害する物質を選択する工程

を含む、請求の範囲 1に記載のポリぺプチドの発現を抑制する物質をスタリー二ングする方法。

〔3〕〔2〕'に記載の方法により 2型糖尿病改善薬をスクリーニングする方法。〔4〕 ( 1 ) 配列番号 3で表される塩基配列、（2 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番で表される塩基配列、又は（3 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは（4 ) 前記（1 ) 〜（3 ) で表される塩基配列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入、及ぴズ又は付カ卩された塩基配列からなり、〔1〕に記載のポリべプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。

〔5〕 ( 1 ) 配列番号 2又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列、（2 ) 配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列において、 1〜： L0個のアミノ酸が欠失、置換、及ぴ Z若しくは挿入されたアミノ酸配列、あるいは（3 ) 配列番号

2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ c- Cblと結合及び Z若しくは過剰発現により糖取り込みを阻害するポリペプチドと c - Cblと試験物質とを接触させる工程、及び

前記ポリペプチドと c - Cblとの結合を検出する工程

を含む、試験物質が前記結合を阻害するか否かを分析する方法。

〔6〕〔5〕に記載の方法による分析工程、及び .

,結合を阻害する物質を選択する工程

を含む、〔5〕に記載のポリペプチドと C- Cblとの結合阻害物質をスクリーニングする方法。

〔7〕〔6〕に記載の方法により 2型糖尿病改善薬をスクリーニングする方法。〔 8〕配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列、あるいは配列番号 2 又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列において、， 1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、 ^つ c-Cblと結合及び Z 若しくは過剰発現により糖取り込みを阻害するポリぺプチド。

〔 9〕配列番号 2若しくは配列番号 26で表されるァミノ酸配列からなるポリべプチド。

〔1 0〕配列番号 26で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド

又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列において 1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、揷入及び Z若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c - Cblと結合及び Z若しくは過剰発現により糖取り込みを阻害するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド。

〔1 1〕〔4〕又は〔1 0〕に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。〔1 2〕〔1 1〕に記載の発現べクタ一で形質転換された細胞。

〔1 3〕 ( 1 ) 〔8〕に記載のポリペプチド、（2 ) 〔8〕に記載のポリべプチドをコードするポリヌクレオチド又は〔1〕の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレォチド、あるいは（3 ) 〔8〕のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は〔1〕の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞からなる 2型糖尿病改善薬スクリーニングツール。〔1 4〕 ( 1 > 〔8〕に記載のポリペプチド、（2 ) 〔8〕に記載のポリべプチドをコードするポリヌクレオチド又は〔1〕の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレォチド、あるいは ( 3 ) 〔8〕のポリべプチドをコードするポリヌクレオチド又は〔 1〕の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクターで形質転換された細胞の 2型糖尿病改善薬スクリ一ユングのための使用。

〔3〕又は〔7〕記載の 2型糖尿病改善薬をスクリーニングする方法は、 2型糖尿病改善作用分析工程を更に含むことがより好ましい。

本発明のスクリ一ユング方法で得られる 2型糖尿病改善薬は、特にィンスリン抵抗性改善薬及び Z又は糖代謝改善薬として好ましい。また、本発明の 2型糖尿病改善薬スクリ一二ングツールは、特にィンスリン抵抗性改善薬及び/又は糠代謝改善薬のスクリーニングツールとして好ましい。

配列番号 26に記載の配列からなる本発明のポリぺプチドと同一の配列は知られていない。本願優先日（2003年 8月 8日）以前に、配列データベース GenPeptに、ァクセッション番号 AK091037として、本発明のポリべプチドの一つの配列である配列番号 2で表されるァミノ酸配列と同一配列が、また本願優先日（2004年 1月 6 日）以前に、配列データベース GenPeptに、ァクセッション番号 AK044445として、本発明のポリぺプチドの一つの配列である配列番号 26で表されるアミノ酸配列において、 4個のアミノ酸が置換され、 103個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列が収載されている。し力しながら、実際にこれらポリペプチドを取得したとの情報はおろか、どのように取得できるかの具体的情報もない。また、当該ポリぺプチドの具体的用途についても記載されていない。ァクセッション番号 AK044445はデータベース上にポリぺプチドの配列が推定上の（putative)ものであると記载されている。本発明者らは本発明のポリペプチドを初めて製造し、本発明のポリぺプチドの発現亢進及ぴ c - Cblとの相互作用が糖尿病病態の原因であることを初めて明らかにした。また、本発明のポリペプチドと c - Cblとの結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明者らによつて初めて提供された方法である。本願優先日前に、配列データベース GenBankに、ァクセッション番号 AL5⁹0235 として、配列番号 3で表される 3119塩基の塩基配列のうち 1個の塩基が置換された配列を一部に含む 159246塩基からなる配列が収载されているが、配列が開示されたにすぎず、'その具体的用途については記載されていない。本発明.の配列番号 3 で表される塩基配列、配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番で表される塩基配列、又は配列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜さ 119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一のポリヌクレオチドは知られておらず、本発明のポリヌクレオチドのプロモーター活性を指標とした本発明のスクリー^ ング方法は本発明者らによって初めて提供された方法である。

図面の簡単な説明

図 1は、培養細胞におけるヒト CbAP40の発現を示す図面である。レーン 1は空ベクターを、レーン 2は pcDNA-CbAP40を導入した場合を示している。レーン 3 は分子量マーカーを示している。

図 2は、正常マゥス C57BL/6Jと m+/m+、および 2型糖尿病モデルマゥス KKAVTaと db/dbの筋肉組織における CbAP40遺伝子発現量を比較した図である。図の縦軸はマウス筋肉における相対発現量を示す。 C57BL/6Jにおける発現量を 1 として表示している。

図 3は、 CbAP40を過剰発現させた筋肉細胞における糖取り込み量を示す図である。図の縦軸は 2-デォキシ- D -グルコースの取り込み量（cpm) を示す。図の横軸は測定時における培地中のィンスリン濃度を示す。黒塗りのバーは CbAP40を高発現させた筋肉細胞、白塗りのバーはコントロールウィルスを感染させた筋肉細胞における結果を示す。

図 4は、 CbAP40プロモーターの転写誘導活 14およびピオグリタゾンによるその抑制作用を示す図である。図の縦軸の数値は、ルシフヱラーゼ活性を示す。図の横軸の数値は、ピオグリタゾンの濃度 ¾1) を示す。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

く本発明のポリぺプチド >

差替え用弒（規則 26) 本発明のポリぺプチドには、

( 1 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド；及ぴ

( 2 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列

あるいは配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個（好ましくは 1〜 7個、より好ましくは 1〜5個、更に好ましくは 1〜3個）のァミノ酸が欠失、置換、及び Z若しくは揷入されたァミノ酸配列 '

を含み、かつ c_Cblに結合及び/又は過剰発現により糖取り込みを阻害する（好ましくは C- Cblに結合及び過剰発現により糖取り込みを阻害する）ポリぺプチド (以下、ヒト機能的等価改変体と称する）；

( 3 ) 配列番号 26で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド；及ぴ

( 4 ) 配列番号 26で表されるァミノ酸配列

あるいは配列番号 26で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個（好ましくは 1 〜7個、より好ましくは 1〜5個、更に好ましくは 1〜3個）のァミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは揷入されたアミノ酸配列

を含み、かつ c- Cblに結合及び/又は過剰発現により糖取り込みを阻害する（好ましくは c- Cblに結合及び過剰発現により糖取り込みを阻害する）ポリぺプチド

(以下、マウス機能的等価改変体と称する）；

が含まれる。

また、本発明のヒト又はマウス機能的等価改変体の起源はヒト又はマウスに限定されない。例えば、配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列のヒト又はマウスにおける変異体が含まれるだけでなく、前述の（1) 乃至（4) のいずれかに該当する限り、ヒト又はマウス以外の他の脊椎動物（例えばラット、ゥサギ、ゥマ、ヒッジ、ィヌ、サル、ネコ、クマ、ブタ、ニヮトリなど）由来のものも含まれる。更には、前述の（1) 乃至（4) のいずれかに該当する限り、天然ポリぺプチドに限定されず、配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリべプチドも含まれるが、天然ポリぺプチド、特には脊椎動物由来のポリぺプチドがより好ましい。

「c_Cblに結合する」とは、 c- Cbl (好ましくは GenBankのァクセッション番号 X57111によりコードされるポリペプチド）にポリペプチドが結合することを意味しており、「結合する」か否かは以下の方法により確認することができる。 ' 結合するか否かの検討対象ポリぺプチドの一部若しくは全長域、または GSTや Flag, Hisなどのタグを融合させた検討対象ポリべプチドの一部若しくは全長域を細胞に発現させる。前記細胞としてはィンスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗 C- Cbl抗体を用いた免疫沈降により c-Cbl蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。得られた c_Cblおよびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウェスタンブロティングにより検討対象のポリぺプチドが C- Cblに結合するか否かを確認することができる。ここで用いる抗体は、検討対象のポリペプチド若しくはその部分配列をもとに作製した検討対象のポリぺプチドに対する抗体、または上記タグを認識する抗体を利用することができる。

また検討対象のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液、または、インビトロで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液と、 GSTなどのタグをつけて精製した c_Cbl蛋白質とを用いた in vitroのプルダウン法（実験工学、 Voll3、 No. 6、 1994年 528頁松七五三ら) と上述と同様のウェスタンブロッティングを組み合わせるによっても c - Cblと検討対象のポリペプチドの結合を検出することができる。好ましくは、実施例 9に示すように検討対象蛋白質発現用プラスミドから直接検討対象蛋白質をインビトロトランスレーシヨンキット（例えば TNTキット

(プロメガ社） ) を用いて in vitroで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液を用いて結合を検出できる。より好ましくは、実施例 9に記載の方法により検討対象のポリペプチドと c-Cblとの結合を検出することができる。

「過剰発現により糖取り込みを阻害する」とは、あるポリペプチドが過剰発現されることによって、過剰発現されない場合に比較して糖取り.込みを阻害することをいう。「糖取り込みを阻害する」か否かは以下の方法により確認することができる。検討対象のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現べクターで細胞（例えば筋肉細胞 L6細胞）を形質転換する。形質転換により、該細胞に検討対象のポリペプチドが高発現（過剰発現）したか否かは、該細胞の抽出液を用い検討対象のポリぺプチドを検出できる抗体を利用したウェスタンプロッティング又は検討対象のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを用いたリアルタイム PCRなどにより確認することができる。

•検討対象のポリぺプチドが糠取り込みを阻害するか否かは、該ポリぺプチドを過剰発現した又は過剰発現していなレ、細胞を用レ、て細胞内に取り込まれるダルコ一ス量を測定することにより確認することができる。検討対象ポリぺプチドを過剰発現していない細胞に比較して過剰発現した細胞のグルコース取り込み量が減少した場合、検討対象ポリぺプチドは過剰発現により糖取り込みを阻害すると判断できる。

好ましくは実施例 6に記載の方法により検討対象ポリぺプチドが過剰発現により糖取り込みを阻害する力否かを確認できる。

以上、本発明のポリぺプチドについて説明したが、配列番号 2又は配列番号 26 で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、及び本発明のヒト又はマウス機能的等価改変体を総称して、以下、「本発明のポリペプチド」と称する。「本発明のポリペプチド」のうち、配列番号 2で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「ヒト CbAP40蛋白質」、配列番号 26で表されるアミノ酸からなるポリペプチドである蛋白質を「マウス CbAP40蛋白質」と称する。

本発明のポリぺプチドとしては、配列番号 2又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチド、あるいはヒト又はマウス機能的等価改変体のうち、配列番号 2又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドが最も好ましい。

本発明のポリペプチドの一つである CbAP40が C- Cblと結合することを見出し (実施例 1及び実施例 9 ) 、更にヒト CbAP40をコードする遺伝子を筋肉細胞に高発現させると糖取り込み量が減少することを見出した（実施例 6 ) 。従って、 CbAP40はィンスリンのシグナル伝達における c-Cblの機能を妨げていると考えられ、本発明のポリペプチドと C- Cblとの結合を阻害する物質は糖取り込みを改善する物質、即ち 2型糖尿病改善薬となることがわかった。本発明のポリペプチドは前記結合阻害物質（即ち 2型糖尿病改善薬、特に糖取り込み改善物質）をスク . リーユングする方法のスクリーニングツールとして有用である。 <本発明のポリヌクレオチド及び本明細書のポリヌクレオチドの製造法 > 本発明のポリヌクレオチドには、

[ 1 ] マウス CbAP40蛋白質及びマウス機能的等価改変体であるポリぺプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（以下、マウス型ポリヌクレオチドと称する）；

[ 2 ] ( 1 ) 配列番号 3で表される塩基配列、（2 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番で表される塩基配列、又は（3 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは（4 ) 前記（1 ) 〜（3 ) で表される塩基配列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、及び/又は揷入された塩基配列を含み、ヒト CbAP40蛋白質又はヒト機能的等価改変体であるポリべプチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド (プロモーター型ポリヌクレオチドと称する) ；

が含まれる。

マウス型ポリヌクレオチドとしては、マウス CbAP40蛋白質及ぴマゥス機能的等価改変体であるポリべプチドをコ一ドする塩基配列なら何れの種由来であってもよく、マウス CbAP40をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが好ましく、配列番号 25で表されるポリヌクレオチドが最も好ましい。プロモーター型ポリヌクレオチドのうち最も好ましいのは配列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

マウス型ポリヌクレオチドとしては、マウス CbAP40蛋白質及びマウス機能的等価改変体であるポリぺプチドをコードする限りあらゆる変異体が含まれる。プ口モーター型ポリヌクレオチドとしては、（1 ) 配列番号 3で表される塩基配列、

( 2 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番で表される塩基配列、又は（3 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは（4 ) 前記（1 ) 〜（3 ) で表される塩基配列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、揷入及ぴ Z又は付カ卩された塩基配列かちなり、ヒト若しくはマウス CbAP40蛋白質又はヒト若しくはマウス機能的等価改変体であるポリぺプチドのプロモーター活性を含む限り、あらゆる変異体が含まれる。より具体的には天然に存在する変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加及び挿入を有する変異体が含まれる。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変して作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及ぴ手段を問わない。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法

(Methods in Enzymology、（1987) 154、350， 367- 382)等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法ゃリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Science, 150， 178、 1968)を挙げることができる。それらの組み合わせによつて所望の塩基置換を伴う DNAを得ることが可能である。あるいは PCR法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることにより DNA分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。

本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド及び本発明のポリべプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造 ·取得することが出来る。

本発明のプロモータ一及び本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作 I Molecular CloningJ LSambrook, Jり、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressヽ 1989年、等]でも得ることができる。

例えば、（1 ) PCRを用いた方法、（2 ) 常法の遺伝子工学的手法（すなわち cDNAライブラリ一で形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法) を用いる方法、又は ( 3 ) 化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、 W001/34785に記載されているのと同様に実施できる。

PCRを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 a)第 1製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト骨格筋を挙げることができる。ヒト骨格筋から mRNAを抽出する。次いで、この mRNAをランダムプライマーまたはオリゴ dTプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖 cDNAを合成することが出来る。得ちれた第一鎖 cDNAを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ 2種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応

(PCR) に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より _具体的には、例えば実施例 1、実施例 7、又は実施例 8に記載の方法により本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド及び/又は本発明のプロモ一ター型ポリヌクレオチドを製造することが出来る。、

常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 b)第 2製造法に記載された手順により、本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド及び Z又は本発明のプロモ一ター型ポリヌクレオチドを製造することができる。

化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 c)第 3製造法、 d)第 4製造法に記載された方法によつて、本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチド及び Z又は本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを製造することができる。

本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを用い、試験化合物が本発明のプロモーター活性を阻害するか否かを分析することにより、本発明のポリペプチドの発現を抑制する物質をスクリーニングすることができる。本発明者らは、本発明のポリぺプチドの 1つであるヒト CbAP40は糖の取り込みを阻害すること（実施例 6 ) 、インスリン抵抗性を改善することが知られているチアゾリジン誘導体により本発明のプロモーター由来の転写誘導活性が抑制されること（実施例 7 ) を明ら力にした。これらのことから前記本発明のポリベプチドの発現を抑制する物質は、糖取り込み阻害を改善し 2型糖尿病改善薬、特にィンスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬として有用である。従って、本発明のプロモーターは 2 型糖尿病改善薬、特にィンスリン抵抗性改善薬及び Z又は糖代謝改善薬のスクリ一二ングツールとして使用することができる。

本発明のマウス型ポリヌクレオチドにより本発明のポリペプチド、例えばマウス CbAP40を製造することができる。

<本発明のポリぺプチドの製造方法 >

本発明には、本発明のポリぺプチドをードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現べクターにより形質転換された細胞を培養することを特徴とする本発明のポリぺプチドの製造方法も包含される。

上述のように得られた本発明のポリべプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Molecula,r Cl'oning Sambrook, Jら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 1989年」等に記載の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることができる。具体的には上述のように得られた本発明のポリぺプチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鎵型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリべプチドの発現が可能である。

あるいは上述の本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを適当なプラスミドベクターに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体 DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なプラスミドベクターに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及ぴ形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリぺプチドを発現させることが可能である。宿主細胞は、特に限定されるわけではなく、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャー RNAレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性の CbAP40が豊富に存在する筋肉由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。

宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」 2 ) 本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを揷入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより所望の宿主細胞をトランスフヱクシヨンすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例 2又は実施例 8に記載のように所望のポリヌクレオチドを哺乳類動物細胞用の発現ベクター pcDNA3. 1 (インビトロジェン社）に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現べクターを得ることができ、該発現ベクターをリン酸カルシウム法を用いて 293細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。

上記で得られる所望の形質転換細胞は、'常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。例えば上記 293細胞であれば牛胎児血清 (FBS)等の血清成分を添加したダルべッコ修飾イーグル最小必須培地 (DMEM)等の培地に G418を加えたものを使用できる。

本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウェスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリぺプチドを、ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ（GST)、プロテイン Α、 β—ガラタトシダーゼ、マルトースーパインディングプロテイン（ΜΒΡ)など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。より具体的には以下のようにしてタグ蛋白質を利用して精製することができる。

本発明のポリぺプチド (例えば、配列番号 2又は配列番号 26で表されるポリペプチド）は、これらをコードするポリヌクレオチドを、例えば Hisタグが融合されるベクター、より具体的には例えば実施例 1又は実施例 8に記載の pcDNA3. l/V5-His-T0P0 (インビトロジヱン社）等に組み込むことで培養細胞に発現させ、 Hisタグを用いて精製した後でタグ部分を除去することにより得ることができる。例えば実施例 1又は実施例 8において pcDNA3. l/V5-His-T0P0を用いて作製したヒトあるいはマウスの CbAP40発現プラスミドは、いずれも CbAP40の C- 末端に V5および Hisタグが付加されるように設計されている。これにより、それらの Hisタグを利用して、実施例 2又は実施例 8に示した CMP40を発現させた培養細胞から CbAP40蛋白質を精製することができる。具体的には公知の方法 (実験医学別冊タンパク質の分子間相互作用実験法、 1996年 32頁中原ら）に従って、破砕した細胞の抽出液より Hisタグと融合した CbAP40蛋白質を Ni²⁺ - NTA- Agarose (フナコシ）に結合させて遠心分離により単離することができる。より具体的には培養フラスコ（例えば 10cm径のシャーレ）に培養させた本発明のポリペプチド発現細胞を適当な量の緩衝液 (例えば、 1 ml) を加えて搔き取つた後、毎分 15000回転で 5分間の遠心分離によつて上清を分離し、適当な緩衝液で置換した適量（例えば 50 μ M) の Ni²⁺-NTA- Agaroseを加えて十分に混合する

(例えば、ローテ一ターで 10分以上攪拌する）ことができる。続いて遠心分離 (例えば毎分 2000回転で 2分間）により上清を分離して除去し、 _PHを 6. 8にした緩種 ί液を適量 (例えば 0. 5 ml)加えて再度遠心分離することにより洗浄する。これを 3回繰り返した後適量（例えば 50 i l) の lOOmM EDTAを加えて 10分置き、上清を回収することにより遊離した本発明のポリぺプチドを精製することができる。上記緩衝液としては、例えば緩衝液 B (8 M Urea, 0. 1 M Na₂HP0₄, 0. 1 M NaH₂P0₄, 0. 01 M Tris-HCl pH8. 0) を用いることができる。精製した蛋白質分子中の His タグは、例えば N末端側に Hisタグを融合させるよう設計することにより

TAGZyme System (キアゲン社）を用いることで分子中から除去することができる。あるいは所望により、タグ蛋白質を利用しない方法、例えば、本発明のポリべプチドからなる蛋白質の物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によつても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトダラフィ一、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。

本発明のポリぺプチドは、配列番号 2又は配列番号 26に示すァミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を 1個ずつ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリぺプチドは前記した各種の方法に従つて精製を行うことが出来る。 <本発明の発現ベクター及び細胞 > '

本発明の発現ベクターには、本発明のマウス型ポリヌクレオチドを含む発現べクタ一、及びプロモーター型ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。本発明の細胞には、本発明のマウス型ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞（以下、マウス型ポリヌクレオチド発現細胞と称する）、及ぴプロモーター型ポリヌクレオチドを含む発現べクターで形質転換された細胞

(以下、プロモーター発現細胞と称する）が含まれる。本発明の細胞としては、マウス型ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞又はプロモ一ター型ポリヌクレオチドを含む発現べクターで形質転換された細胞のうち、マウス型ポリヌクレオチドを発現している細胞又はプロモーター型ポリヌクレオチドのプロモーター活性を発現している細胞が好ましい。

本発明のマウス型ポリヌクレオチド形質転換細胞又はプロモーター形質転換細胞は、目的に応じ適宜選択した宿主細胞に本発明のマウス型ポリヌクレオチド又はプロモーター型ポリヌクレオチドを組み込むことにより製造できる。目的に応じ適宜選択したベタターに本発明のマウス型ポリヌクレオチド又はプロモーター型ポリヌクレオチドを組み込むことにより製造するのが好ましい。

例えばプロモーター形質転換細胞は、プロモーター活性を阻害するか否かを分析する系の構築を目的とする場合には実施例 7に示したように、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を組み込んだベクターに本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを組み込んで製造することが好ましい。プロモーター領域と融合するレポーター遺伝子は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、パクテリアトランスポゾン由来のクロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (CAT) 、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Luc) 、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子

(GFP) 等があげられる。レポーター遺伝子は、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドと機能的に融合されていればよい。例えば、本発明のプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング系の構築を目的とする場合には、細胞としては哺乳動物（例えば、ヒト、マウス又はラットなど）由来の細胞を用いることが好ましく、ヒト由来の細胞を用いることがより好ましい。マウス型ポリヌクレオチド形質転換細胞は本発明のポリぺプチドを製造するために利用することができる。

本発明の発現ベクター及び細胞は本発明のスクリーニング方法（例えば、プロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法（実施例 7 ) 、本発明のポリぺプチドと c-Cbl との結合を利用したスクリーニング方法）に用いることができ、該スクリーニングのツールとして有用である。

<本発明のスクリ一二ングツール及ぴスクリーユングのための使用 >

本発明には、（1 ) 本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド、又は本発明のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞からなる 2型糖尿病改善薬スクリーニングツール、

( 2 ) 本発明のポリぺプチド、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞の 2型糖尿病改善薬スクリ一二ングのための使用が含まれる。

本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングの為に用いる物 (具体的には、スクリーニングの為に用いるポリペプチド、ポリヌクレオチド又は細胞）をいう。「2型糖尿病改善薬スクリーニングツール」とは、 2型糖尿病改善薬（特にィンスリン抵抗性改善薬及び Z又は糖代謝改善薬）をスクリ一二ングするために、本発明のスクリーニング方法において、試験化合物を接触させる対象となる細胞、ポリヌクレオチ,ド又はポリペプチドである。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は細胞の、 2型糖尿病改善薬（特にインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬）スクリ一二ングのための使用も本発明に含まれる。く本発明の分析方法又はスクリーニング方法 > 本発明のポリぺプチドの一つである CbAP40が c_Cblと結合すること（実施例 1、実施例 9 ) 、糖尿病モデルマゥスで発現が増加していること（実施例 5 ) を見出し、更にヒト CbAP40蛋白質をコードする遺伝子を筋肉細胞に高発現させると糖取り込み量が減少することを見出した（実施例 6 ) 。従って、本発明のポリペプチドと c-Cblとの結合を阻害する物質は糠取り込みを改善する物質となることがわかった。カロえて、本発明のポリペプチドのプロモーター由来の転写誘導活性がィンスリン抵抗性を改善することが知られているチアゾリジン誘導体により抑制されることを明らかにした（実施例 7 ) 。このことから該プロモーター活性を指標として 2型糖尿病改善作用を有する物質（特にィンスリン抵抗性改善作用及び/又は糖代謝改善作用を有する物質）をスクリーニングできることがわかつた。

即ち、本発明の分析方法又はスクリーニング方法には、本発明のポリペプチドを使用した、本発明のポリペプチドと c - Cbl蛋白質との相互作用の変化を指標とすることからなる 2型糖尿病改善作用を有する物質（特にインスリン抵抗性改善作用を有する物質及び/又は糖代謝改善作用を有する物質）のスクリーニング方法が含まれる。また、本発明の分析方法又はスクリーニング方法には、本発明プ口モーター型ポリヌクレオチドを利用して、該プロモーター活性の変化を指標とすることからなる 2型糖尿病改善作用を有する物質（特にィンスリン抵抗性改善作用を有する物質及ぴ又は糖代 ®ί改善作用を有する物質）のスクリーニング方法が含まれる。

c-Cbl蛋白質との相互作用を利用した本発明のスクリ一ユングに用いるポリぺプチドとしては、本発明のポリぺプチド又は相同ポリぺプチドを挙げることができる。配列番号 2又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、 C- Cblに結合する蛋白質であるポリぺプチドのことを相同ポリペプチドと称する。本明細書の相同ポリペプチドは、配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列との相同性が 90%以上であるァミノ酸配列からなり、かつ、 c-Cblに結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列に関して、好ましくは 95%以上、更に好ましくは 98%以上の相同性を有するァミノ酸配列からなるポリぺプチドが好ましい。

なお、本明細書における前記「相同性」とは、 Clustal program (Higgins and Sharp, Gene 73, 237-244， 1998； Thompson et al. Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680, 1994) (Clustal V) 検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値（同一性）を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。 ' '

Pairwise Alignment Parametersとし一

K tuple 1

Gap Penalty 3 '

Window 5

Diagonals Saved 5

本発明のスクリーニングに用いることができるポリペプチド（すなわち本発明のポリぺプチド及ぴ相同ポリぺプチド）をスクリーニング用ポリペプチドと称する。

本発明の分析方法又はスクリ一二ング方法には、より具体的には以下の方法が含まれる。

本発明のプロモーターを利用する系として、 . <1> ( 1 ) 本発明のプロモーター発現細胞と試験物質とを接触させる工程、及ぴ

( 2 ) プロモーター活性を検出する工程

を含む、試験物質が本発明のプロモーターの活性を阻害するか否かを分析する方法。 '

<2>く 1>に記載の方法による分析工程、及ぴ

プロモーター活性を阻害する物質を選択する工程

を含む、本発明のポリべプチドの発現を抑制する物質あるいは 2型糖尿病改善薬をスクリーニングする方法。

本発明のポリぺプチドと c_Cblとの結合を利用した系として、

<3>本発明スクリーニング用ポリべプチドと c-Cblと試験物質とを接触させるェ程、及び

前記ポリぺプチドと c-Cblとの結合を検出する工程を含む、試験物質が前記結合を阻害するか否かを分析する方法。

<4> く 3〉に記載の方法による分析工程、及び

結合を阻害する物質を選択する工程

を含む、本発明のスクリーニング用ポリペプチドと c-Cblとの結合阻害物質あるいは 2型糖尿病改善薬をスクリーニングする方法。

本発明のプロモーターを利用する系としての実施態様の一つとしてレポーター遺伝子アツセィ系が上げられる。レポーター遺伝子アツセィ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、 1993年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその 5' 上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモータ一を活性化すれば、プロモータ一領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性ィヒする。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを用いたレポーター遺伝子アツセィにより、本発明のポリべプチドの発現調節に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド（例えば配列番号 3で表される塩基配列からなる配列） ' と融合された「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、パクテリァトランスポゾン由来のク口ラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子（CAT) 、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Luc) 、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（GFP) 等があげられる。レポーター遺伝子は、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドと機能的に融合されていればよい。本発明のプロモータ一と融合されたレポ一タ一遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析することができる。上記工程を実施することにより、本発明のポリべプチドの発現を抑制する物質あるいはインスリン抵抗性改善薬及び又は糖代謝改善薬のスクリーニングを実施できる。具体的には、実施例 7に記載の方法により、前記スクリ一ユングを実施できる。

本発明のポリペプチドと c - Cblとの結合を利用した系として、具体的には、本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域、あるいは GSTや Flag, 6 X Hisなどのタグを融合させた本発明のスクリーニング用ポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。前記試験用細胞としてはィンスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗 c - Cbl抗体を用いた免疫沈降により c_Cbl蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られた c- Cblおよびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウェスタンプロティングによりスクリーニング用ポリペプチドの量を測定することにより、スクリーニング用ポリペプチドと c - Cblとの結合を阻害する試験物質を選択することができる。ここで用いる抗体は、スクリーニング用ポリぺプチド或いはその部分配列をもとに作製したスクリ一二ング用ポリぺプチドに対する抗体（例えば抗 CbAP40抗体）、あるいは上記タグを認識する抗体を利用することができる。 '

また上述と同様にスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞の抽出液に試験物質を添加あるいは未添加したものから、 GSTなどのタグをつけて精製した c - Cbl蛋白質を用いた in vitroのプルダウン法（実験工学、 Voll3、 No. 6、 1994 年 528頁松七五三ら) とウェスタンブロッテイングを組み合わせるによっても c-Cblとスクリーニング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択することができる。あるいはここでスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞の抽出液を用いずに、スクリーニング用ポリペプチドの発現プラスミドから直接スタリーニング用ポリぺプチドである蛋白質を TNTキット（プロメガ社）を用レ、て in vitroで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添カ卩あるいは未添加したものを用いても同様に c_Cblとスクリーニング用ポリペプチドとの結合を阻害する試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウェスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリ一二ングすることが可能である。また上述と同様のタグを融合させて発現させたスクリーエング用ポリぺプチドおよび c- Cblを同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知の ELISA法に従っても c_Cbl とスクリーユング用ポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択するスクリーニングが可能である。また公知の哺乳類細胞におけるツーハイプリッドシステム (クロンテック社）を利用して、べィトに GAL4の DNA 結合領域と融合させた c - Cblを、プレイ側に VP16の転写促進領域を融合させたスクリーニング用ポリぺプチドを配置することにより、既存の CATあるいはルシフェラーゼ活性の検出により c-Cblとスクリーニング用ポリぺプチドとの結合を阻害する試験物質を大多数の母集団からスクリ一ユングし選択することが可能である。

本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル ·ケミストリー技術（N. Terrett et al. , Drug Discov. Today, 4 (1) : 41， 1999 )によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ぺプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。

2型糖尿病改善作用の分析は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いることにより実施することができる。例えば、本発明のスクリー二ング法により選択された化合物を糖尿病モデル動物に連続投与し、常法に従って随時血糖低下作用を確認することにより、あるいは、経口糠負荷試験後の血糖上. 昇抑制作用の確認を行なうことにより、 2型糖尿病改善効果の有無を判定することができる。また、ヒトのインスリン抵抗性を測定し、その値の改善を指標に 2 型糖尿病改善作用を分析することもできる。インスリン抵抗性はヒトでは主に 2 つの方法で測定されている。ひとつは絶食後に血糖値とインスリン濃度を測定するものであり、他方はブドウ糖負荷試験といわれるもので、グルコース液を経口投与し、血液循環からのクリアランス率を知る方法である。さらに、より正確な試験としてはオイグリセミック .高インスリン血症クランプ法が挙げられる。この試験は、血中のインスリンとグルコースは一定濃度に維持されるという原理を利用したもので、時間の経過に伴って投与されたグルコース液の総量と代謝に利用されるインスリン濃度を測定するものである。

<糖尿病の検査方法 > '

本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズするプローブを用いることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を調べることができ、その発現量（好ましくは骨格筋における発現量）の増加を指標として糖尿病の診断をすることができる。糖尿病の検査方法において、「ストリンジヱントな条件」とは、非特異的な結合が起こらない条件を意味し、具体的には、 0. 1%ラウリル硫酸ナトリウム (SDS)を含有する 0. I X SSC (Saline- sodium citrate buffer)溶液を使用し、温度が 65°Cである条件を意味する。プローブとしては、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも 15 bpの鎖長の DNAが用いられる。 ' 糖尿病の検出方法では、上述のプローブと試験試料とを接触させ、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、 mR A又はそれ由来の cDNA) と前記プローブとの結合体を、公知の分析方法（例えば、ノザンプロッテイング）で分析することにより、糖尿病であるか否かを検出することができる。また、上述のプローブを DNAチップに適用し、発現量を分析することもできる。前記結合体の量、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量が、健常人に比べて増加している場合には、糖尿病であると判定することができる。

本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの発現レベルを測定する方法として、発現レベルを本発明のポリペプチドの検出によって測定する方法が可能である。このような検查方法としては、例えば、試験試料を本発明のポリべプチドに結合する抗体、好ましくは、本発明のポリぺプチドに特異的に結合する抗体を利用したウェスタンプロッティング、免疫沈降法、 ELISA法などを利用することが出来る。試験試料中に含まれる本発明のポリべプチドの量を定量する際、本発明のポリペプチドを標準量として利用することができる。また、本発明のポリペプチドは本発明のポリぺプチドに結合する抗体を作製するために有用である。本発明のポリべプチドの量が健常人に比べて増加している場合には、糖尿病であると判定することができる。以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Molecular CloningJ Sambrook, Jら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 1989年、等)に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。 ·

[実施例 1 ] c-Cbl結合分子 CbAP40の遺伝子クローニングと発現べクターの構築 ( 1 ) c-Cbl遺伝子のクローユング

遺伝子データベース GenBankのァクセッション番号 X57111に記載されたマウス c - Cblの全長領域をコードする cDNA配列を参照して設計した配列番号 4及び配列番号 5 (5' 側）、並びに配列番号 6および配列番号 7 (3' 側）で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、マウス骨格筋 cDNAを錶型として、 DNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA Polymerase, 宝酒造社）を用いて、 95°C 3分間の熱変性反応の後、 98°C 10秒間、 60°C 30秒間、 74°C 1分 30秒からなるサイクルを 40 回、さらに 74°C 7分間の条件で PCRを行なった。これにより生成した約 1. 3 kbp および 1. 5 kbpの DNA断片を、プラスミド pZErO™- 2. 1 (インビトロジェン社）の EcoRV認識部位に揷入することにより、マウス c - Cbl cDNAの 5，側と 3，側をそれぞれサブクローユングした。どちらの遺伝子断片もマウス C- Cbl cDNA上に唯一存在する BamHI認識部位を含んでいる。この BamHI認識部位と配列番号 4に付加した Kpnl認識部位、および配列番号 7に付加した Xhol認識部位を利用し、各サブクローンから 5'側の Kpnl-BamHI断片、 3'側の BamHI - Xhol断片を切り出し、 pcDNA3. 1 (+)の Kpnl-Xhol間に挿入することにより、マウス c- Cbl cDNAの全長を得た。なおシーケンシングキット (アプライドバイオシステム社) 及びシーケンサー（ABI 3700 DNA sequencer アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ベクタ一上にクローニングした c - Cbl cDNAの塩基配列が報告されてレ、る配列と一致することを確認した。

( 2 ) 酵母ツーパイブリツド検索

上述のマウスの c- Cbl cDNAを特許文献（Ψ003/0δ2427) 実施例 2 ( 2 ) に示された方法に従い酵母ツーハイプリッド用発現ベクターに相同組み換えを利用して揷入した。ここでは配列番号 8及び配列番号 9に示すプライマーを設計し、これらを用いて上述のマウスの c-Cbl cDNAを铸型として PCR反応により相同組み換えに必要な 40 merの配列を前後に付随させた C- Cbl cDNA断片を得た。相同組み換えにより作製した発現べクターは上記遠藤らの特許文献実施例 2 ( 2 ) の方法に従い配列の確認を行った後、同実施例 2 ( 3 ) と同一の方法に従いヒト骨格筋ライブラリ一中から相互作用因子をスクリーニングした。 c - Cblに結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、同細胞からライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、同実施例 2 ( 2 )に示した方法に従い塩基配列決定した結果、配列番号 1に示す塩基配列の 3' 末端側にある 934番目から 1101番目の塩基に相当する部分の配列を含む 1クローンが含まれていることを確認した。このクローンは配列番号 2に示すポリぺプチドのカルボキシル末端側の正味 55アミノ酸を含む蛋白質をコードする DNA配列を有しており、酵母中で該 55アミノ酸のポリぺプチドを含む融合蛋白質を発現する能力を有している。従って配列番号 2に示すポリぺプチドはカルボキシル末端側の 55 ァミノ酸部分で c_Cblと結合する能力を有する蛋白質であることが示された。

( 3 ) ヒト CbAP40遺伝子の全長 cDNAのクローエング

前述（2 ) の結果、配列番号 1で表される塩基配列の一部を含む遺伝子断片を持ったライブラリー由来のプラスミドが得られ、 c- Cblに結合する因子の存在が示された。そこで配列番号 1で示された塩基配列の第 1079〜： 1089番の塩基配列の相捕鎖に相当する配列番号 10で表される塩基配列のプライマ一を合成（プロリゴ社）し、該プライマーを用いて、前記特許文献（W003/062427) の実施例 1

( 4 ) に示した方法に従い、前述の骨格筋由来 cDNAライプラリー中から PCR法により全長 cDNAの増幅を試みた。 PCR反応は DNAポリメラーゼ（TAKARA LA Taq；宝酒造社）を用い、 94°C (3分）の後、 94°C (30秒） ' 58°C (1. 5分） · 72°C (4分）のサィクルを 35回繰り返し、その PCR産物を铸型にしてさらに同じ条件で PCRを行つた。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約 1200塩基対の DNA断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同 DNA断片を発現べクタ一 (pcDNA3. 1/V5- His- T0P0;インビト口ジェン社) に T0P0 TA Cloning システム（インビトロジェン社）を用いてク ΰ一エングした。得られたプラスミド中の揷入 DNA断片の塩基配列を、ベクター上の Τ7 プロモーター領域に結合するプライマー（T0P0 TA Cloning kit/ィンビトロジェン社；配列番号 11) とシーケンシングキット (アプライドバイォシステム社) 及びシーケンサー（ABI 3700 DNA sequencer アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、酉己列番号 1に示す DNA配列を含むクローンであることを確認し、配列番号 1よりさらに 5' 側上流約 70塩基対の配列が得られたが、配列番号 2に示アミノ酸配列をコードする DNAのトリプレツトに従うと配列番号 1の初めにある ATG (開始コドン）より上流には別の開始コドンは認められず、ストップコドンのトリプレットが存在した。これにより配列番号 1に示す遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この配列番号 1の塩基配列で表される遺伝子をヒト CbAP40遺伝子と名付けた。

( 4 ) ヒト CbAP40発現ベクターの作製

配列番号 1に示す塩基配列情報に従い、配列番号 12に示すプライマーを合成 (プロリゴ社）し、該プライマーと前述の配列番号 10に示すプライマーを用いて、正味ヒト CbAP40蛋白質をコードする cDNAを前述の（3 )で得られたプラスミドを鎳型として PCR法により増幅した。これら 2種類の DNAプライマーはそれぞれ配列番号 1が示す CbAP40遺伝子の 5 ' 側、 3，側の部分配列と相同な塩基配列を有する。 PCR反応は DNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA Polymerase；宝酒造社）を用い、 98°C (1分）の後、 98°C (5秒）、 55°C (30秒）、 72°C (5分）のサイクルを 35回繰り返した。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約 1. 1 kbpの DNA断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同 DNA断片を発現ベクター（p_CDNA3. 1/V5- His- TOP0;インビトロジェン社）に T0P0 TA Cloning システム（インビトロジェン社）を用いてサプクローニングした。このとき用いた配列番号 10に示すプライマーはクローニング後 3，側にベクター由来の V5ェピ卜ーフ (paramyxovirus SV5の V protein由来、 Southern J A,

J. Gen. Virol. 72, 1551-1557, 1991) 及び His6タグ（Lindner P BioTechniques22, 140-149, 1997) が CbAP40遺伝子のトリプレツトと同じフレームで続くように、ヒト CbAP40のストップコドン配列が除かれるよう設計した。得られたプラスミド中の挿入 DNA断片の塩基配列を、ベクタ二上の T7プロモーター領域に結合するプライマー（T0P0 TA Cloning kit；インビトロジェン社；配列番号 11) とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及ぴシーケンサー (ABI 3700 DNA sequencer；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号 1に示す正味ヒト CbAP40蛋白質をコードする 1101塩基対のヒト CbAP40 cDNAが DNA配列の 3' 側のストップコドンを除いた DNAとして前述の発現べクタ一 pcDNA3. 1/V5 - His - T0P0に揷入されていることを確認した。以下この発現プラスミドを pcDNA - CbAP40と略記する。

[実施例 2 ] ヒト CbAP40蛋白質を発現する培養細胞の作製

( 1 ) ヒト CbAP40発現細胞の作製

上述の実施例 1 ( 4 )で作製した発現プラスミド pcDNA- CbAP40又は空べクタ一 (pcDNA3. 1) (ィンビトロジェン社）を 293細胞に導入した。 293細胞は 6ゥェル培養プレート（ゥエル直径 35 mm) の培養皿に各ゥル 2 mlの 10%牛胎児血清

(シグマ社）を含む最少必須培地 DMEM (ギブコ社）を加えて 70%コンフルェントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシゥム法（Graham et al. , Virology, 52, 456, 1973；新井直子、遺伝子導入と発現/解析法 13 - 15頁 1994年）により pcDNA- CbAP40 (3. 0 μ g/ゥエル）を一過性に導入した。 30 時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下 PBSと略称する）で洗浄した後にゥェルあたり 0. 1 mlの細胞溶解液（100 mM リン酸カリゥム（pH7. 8)、0. 2%トリトン X- loo)を添力 aして細胞を溶解した。

( 2 ) ヒト CbAP40蛋白質の検出

上記ヒト CbAP40発現細胞の溶解液 10 μ 1に 10 1の 2倍濃度 SDSサンプルバッファー（125 mM トリス塩酸 (pH6. 8)、 3%ラウリル硫酸ナトリウム、 20% グリセリン、 0. 14 M ]3 -メルカプトエタノール、 0. 02%ブロムフエノールブルー）を添加し、 100°Cで 2分間処理した後、 10%の SDSポリアクリルァミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッテイング装置（バイオラッド社）を用いてポリアクリルアミド中の蛋白質をニトロセル口ース膜に転写した後、常法に従、ウェスタンブロッテイング法により該ニトロセルロース上のヒト CbAP40蛋白質の検出を行った。一次抗体には CbAP40の C末端に融合させた V5ェピトープを認識するモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用い、二次抗体にはラビット IgG- HRP融合抗体（バイオラッド社）を用いた。その結果、図 1に示す通り、 45アミノ酸からなる C末端側のタグを含む合計 411ァミノ酸からなる CbAP40- V5-His6融合蛋白質を示す約 45 kDaの蛋白質が発現ベクター pcDNA_CbAP40の細胞導入に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のヒト CbAP40遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとりうることが明らかになった。

[実施例 3 ] ヒト CbAP40蛋白質の作製

ヒト CbAP40の cDNAを GST融合発現ベクター pGEX - 6P-1 (アマシャムバイオサイエンス社）に挿入するため、配列番号 33および 34に示すプライマーを用いて前述実施例 1で作製した pcDNA- CbAP40を铸型として PCR反応を行レ、、 CbAP40遺伝子 cDNA の 5' 末端に制限酵素 BamHI サイトを、 3' 末端側には制限酵素 Xhol サイトをそれぞれ付加した DNA断片を作製した。 PCR反応は DNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA Polymerase；宝酒造社）を用い、 98°C (1分）の後、 98°C (5秒）、 55°C (30秒）、 72°C (5分）のサイクルを 35回繰り返した。該 DNA断片を BamHI及ぴ Xholで酵素処理して、 pGEX- 6P- 1の BamHIおよび Xhol部位に組み換え、発現プラスミド pGEX- CbAP40を得た。

pGEX- CbAP40を大腸菌 BL21を用いて、 heat shock法による形質転換を行い、 2. 4 mlの培養液でー晚振盪培養した後、その全量を 400 ml培養液に移し変え、 37°Cで 3時間振盪培養した後、最終濃度が 2. 5 raMとなるように IPTG (シグマ社）を添加し、更に 3時間振盪培養して GST融合 CbAP40蛋白質（以下 GST-CbAP40と略記する）の発現を誘導した。菌体を回収し、実験工学、 Voll3、 No. 6、 1994年 528頁松七五三らに従って GST-CbAP40をグルタチオンセファロースビーズ (Glutathione Sepharose 4B；アマシャム'ファルマシァ社) 上に精製した。コントロールとして pGEX- 6P- 1で形質転換した大腸菌 BL21から GST部分のみの蛋白質（以下 GST蛋白質と略記する）を上述と同様に発現誘導して精製した。精製したこれらの蛋白質は、公知の方法に従って SDSゲル電気泳動法による分離と、クーマジープリリアントブルー染色により期待される分子量の蛋白質（GST- CbAP40； 67 kDa、GST蛋白質； 26 kDa) が精製されていることを確認した。

この CbAP40蛋白質の精製標品は、 C- Cblとの相互作用解析、 CbAP40蛋白質の抗体作製など多岐の用途に利用できる。具体的には、後述の実施例 9 ( 3 ) に示す方法により、 c- Cbl蛋白質との直接の相互作用の有無を GST-pull down法（実験ェ学、 Voll3、 No. 6、 1994年 528頁松七五三ら）によって確認することが可能である。より具体的には、 c- Cblの cDNAを鍚型として TNT kit (TNT^RQuick Coupled Trans cr ipt i on/Trans 1 at i on System;プロメガ社）およぴラジオァイソトープ

(redivue Pro-mix L- [³¾] ；アマシャム）を用いて添付のプロトコールに従い in vitroでの転写 ·翻訳によりラジオアイソトープラベルされた c-Cbl蛋白質を調製する。この c_Cbl蛋白質にグルタチオンビーズ上に精製した GST- CbAP40蛋白質をを添加して 4°Cで 1時間振盪した後、遠心分離によりビーズ上の GST- CbAP40蛋白質に結合する蛋白質を共沈殿させる。沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従って SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィによりラベルされた c_Cblを検出することにより、本発明の CbAP40と c-Cbl蛋白質との直接の相互作用を調べることが可能である。

[実施例 4 ] ヒト CbAP40遺伝子の組織別発現分布解析

前述配列番号 10および 12に示すプライマーを用いて、 CbAP40遺伝子の全長 cDNA断片を、ヒト各種組織由来 cDNAから PCR反応を用いて増幅を試み、各種組織における CbAP40の発現の有無を調べた。ヒト骨髄、脳、軟骨、心臓、腎臓、白血球、肝臓、肺、リンパ球、乳腺、卵巣、膝臓、胎盤、前立腺、骨格筋、脂肪、大動脈由来の cDNAライブラリー（クロンテック社）各を铸型として PCR反応は DNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA Polymerase；宝酒造社））を用い、 98°C (1 分）の後、 98°C (5秒）、 55°C (30秒）、 72°C (5分）のサイクルを 35回繰り返した。得られた PCR産物をァガロースゲル電気泳動によって分離した結果、骨格筋、膝臓由来の cDNAライブラリ一から所望するヒト CbAP40遺伝子と思われる約 1100塩基対の DNA断片が増幅された。これらの DNA断片をァガロースゲル中から分離した後、上述の実施例 1 ( 4 )に記した方法に従い配列番号 12に示すプライマーを用いて該 DNA断片の塩基配列をそれぞれ決定した結果、配列番号 1に示すヒト CbAP40遺伝子であることを確認した。このことから、ヒト CbAP40遺伝子の発現は、インスリンシグナルに応答する筋肉おょぴ朦臓などごく限定された臓器で特異的に制 Pされていることが判明した。

[実施例 5 ] 正常マウスおよび糖尿病モデルマウスにおける CbAP40発現量の測定上述の知見により本発明のヒト CbAP40蛋白質は c_Cblと結合し、骨格筋などのィンスリン応答組織に発現していることが判明した。 c - Cbl蛋白質はィンスリンシグナル第 2経路に作用する因子であることから、本発明の CbAP40の作用がインスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで正常マウス C57BL/6Jと m+/m+、および 2型糖尿病モデルマウス KKA^y /Taと db/dbの筋肉における CbAP40 遺伝子のメッセンジャ一 RNA (mRNA)発現量を測定した。

遺伝子発現量は、本発明のマウス CbAP40遺伝子の発現量を測定し、同時に測定したグリセルアルデヒド 3-リン酸脱水素酵素（Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (G3PDH) ) 遺伝子の発現量により補正した。測定系としては PRISM™ 7700 Sequence Detection Systemと SYBR Green PCR Master Mix (アプライドバイォシステムズ社）を用いた。本測定系においては PCRで増幅された 2本鎖 DNAがとりこむ SYBR Green I色素の蛍光量をリアルタイムに検出 ·定量することにより、目的とする遺伝子の発現量が決定される。

具体的には、以下の手順により測定した。

( 1 ) 全 RNA (totalRNA)の調製

15週齢のォスの C57BL/6Jマウス、 KKA^y /Taマウス、 m+/m+マウス、 db/dbマウス（いずれも日本クレア社）を使用した。各マウスの筋肉を摘出し、 RNA抽出用試薬（Isogen；二ツボンジーン社）を用いて説明書に従い全 RNAを調製した。調製した各々の全 R Aはその後デォキシリボヌクレアーゼ（二ツボンジーン社）を用いて処理し、フエノール/クロ口ホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解し- 20°Cで保存した。

( 2 ) 1本鎖 cDNAの合成

全 RNA.から 1本鎖 cDNAへの逆転写は、（ 1 ) で調製した 1 μ gの RNAをそれぞれ用い、逆転写反応用キット（Advantage™ RT- for- PCR Kit；クロンテック社）を用いて 20 μ 1の系で行った。逆転写後、滅菌水 180 1を加えて- 20°Cで保存した。

( 3 ) PCRプライマーの作製

4つのオリゴヌクレオチド（配列番号 13-配列番号 16) を（4 ) の項で述べる PCRのプライマーとして設計した。マウス CbAP40遺伝子に対しては配列番号 13 と配列番号 14の組合せ、 G3PDH遺伝子に対しては配列番号 15と配列番号 16の組み合わせで使用した。

( 4 ) 遺伝子発現量の測定

PRISM™ 7700 Sequence Detection Systemによる PCR増幅のリアルタイム測定は 25 μ 1の系で説明書に従って行った。各系において 1本鎖 cDNAは 5 l、 2 Χ SYBR Green試薬を 12. 5 1、各プライマーは 7. 5 pmol使用した。ここで 1本鎖 cDNAは（ 2 )で保存したものを 100倍希釈して使用した。なお検量線作成には、 1 本鎖 cDNA に代えて 0. l /^ g/ z lのマウスゲノム DNA (クロンテック社）を適当に希釈したものを 5 μ ΐ用いた。 PCRは、 50°Cで 10分に続いて 95°Cで 10分の後、 95°Cで 15秒、 60°Cで 60秒の 2ステツプからなる工程を 45サイクル繰り返すことにより行った。

各試料におけるマウス CbAP40遺伝子の発現量は、下記式に基づいて G3PDH遺伝子の発現量で補正した。

[CbAP40補正発現量] = [CbAP40遺伝子の発現量（生データ） ] / [G3PDH遺伝子の発現量（生データ） ]

筋肉組織における発現量の比較においては C57BL/6Jマウスの発現量を 1とした相対量を図 2に示した。図の値は平均土 SEを示している。図中の記号「*」は Dunnett検定における評価を示しており、有意差が pく 0. 05であることを意味している。

図 2に示す通り、本発明のマウス CbAP40遺伝子の発現は、糖尿病モデルマゥスの筋肉において発現が顕著に増加していることが判明した。またヒトにおいてはィンスリンに依存した細胞への糖取り込みの 75%が骨格筋で行われることが知られている。従って本発明の CbAP40は筋肉における発現亢進を介してインスリン抵抗性を惹起すると考えられ、インスリン抵抗性への関与が大きいと結論づけられる。

また本実施例の結果より、 CbAP40発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。

[実施例 6 ] ヒト CbAP40高発現細胞における糖取り込み能の測定

( 1 ) アデノウィルスベクターを利用したヒト CbAP40高発現ウィルスの作製基本的に次の Webサイトの情報 (He T— Cら、 A simplified system for rapid generation of recombinant adenoviruses. A practical guide for using the AdEasy system. )を基にウィルスを作製した。

http : //www. coloncancer. org/adeasy/protocol. htm

実施例 1で作製した pcDNA - CbAP40から制限酵素 ΚρηΙと Notlを用いてヒト CbAP40遺伝子断片を切り出し、同制限酵素を利用してベクター pAdTrack- CMV (He T— C.ら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 95， 2509—2514, 1998) にヒト CbAP40 遺伝子をサブクローニングした（以下 pAdTrack-CMV_CbAP40) 。これを制限酵素 Pmelで消化し大腸菌内でアデノウィルスベクター _PAdEasy_lに組み換えた。組み換えが起きたことは、制限酵素 Pad消化及びァガロースゲル電気泳動により 4. 5 kbの遺伝子断片が見られることで確認された。組み換えられたウィルスベクターを調製し制限酵素 Paclで消化して 1本鎖化したのち、リボフェクトァミン 2000 試薬（ィンビトロジェン社）を利用して 293細胞に遺伝子導入した。ヒト CbAP40 高発現ウィルスは、 293細胞で大量に増殖させたのち以下に示す塩ィヒセシゥムを用いた密度勾配遠心により精製して実験に用いた。

まずヒト CbAP40高発現ウィルスに感染させた 293細胞をコラーゲンコートしたシャーレからスクレーパーを用いてはがし、 1500 rpmで 5分遠心して集めた。培地を除去したのち 293細胞を PBSに懸濁し、ドライアイスエタノールを用いた凍結と 37°Cの湯浴を用いた融解および激しい懸濁の 3ステップからなる工程を 4 回繰り返した。この操作により細胞内で増殖したウィルスが細胞外に出てくる。細胞懸濁液を 1500 rpmで 5分遠心し、その上清画分を集めた。次に 1リットルあたり NaCl 43. 9 g, KC1 3. 7 g, Tris 30. 3 g， Na2HP04 1. 42 gを含み HC1で pH7. 4に調製した溶液を作製し、これに塩ィヒセシウムを溶解させて、密度 1. 339， 1. 368， 1. 377の 3種の塩化セシウム溶液を用意した。密度 1. 377の塩化セシウム溶液に密度 1. 339の塩ィ匕セシウム溶液を重層し、さらにその上に先に集めたウイルス上清画分を重層して、ベックマンの SW41ローターを用いて 35000 rpmで 1. 5 時間超遠心した。一番下に見られるバンドにウィルスが含まれるので、これを 18 ゲージのシリンジで回収した。密度 1. 368の塩化セシウム溶液にこのウィルス画分を重層し、もう一度 35000 rpmで 18時間超遠心した。 18ゲージのシリンジでウィルスを回収し、透析チューブに移して、透析液（10 mM Tris-HCl, 1 mM MgC12, 135 mM NaCl pH7. 5) を用いて透析した。透析後、 260 nmにおける吸光度 (A260)を測定して下記の計算式によりウィルスを定量、換算し、グリセロールを 10%になるように添カ卩し、実験に使用するまで- 80°Cでウィルスを保存した。

[式] 1 A260 = 1. 1 X 10¹²ウイノレス粒子 = 3. 3 X 10¹¹ pfu/ml

( 2 ) 筋肉細胞の分ィ匕とヒト CbAP40発現アデノウイルスの添カロ

L6細胞を用いて CbAP40の糖とりこみに対する効果を評価した。 L6細胞を 10% ゥシ胎児血清 (FCS)を含む α最小必須培地（ a MEM, インビトロジェン社）に懸濁し、コラーゲンコートした 24穴プレート (旭テクノグラス社) に 1. 6 X 10⁵個/穴になるようにまいた。翌日、 2% FCSを含む α MEMに培地を交換して L6細胞の筋肉への分化を誘導し、さらにその 3日後に同培地 400 μ 1に交換した。その翌日ヒト CbAP40発現アデノウィルスを 1穴あたり 1. 6 X 10¹。 pfuの濃度で培地に添加した。コントロールとしては _eGFPのみを発現させるアデノウィルスを用いた。

( 3 ) ヒト CbAP40高発現細胞における糖取り込み能の測定

アデノウィルスを添加して 24時間後、糖取り込みに対する効果を評価した。まず培地を所定濃度のインスリンを含む KRP緩衝液 (136 mM NaCl, 4. 7 mM KC1, 1. 25 mM CaC12, 1. 25 mM MgS04, 5 mM Na2HP04₅ pH 7. 4) 0. 25 mlに交換し、 37°Cで 20分ィンキュベートした。次に 1 mMの 2 -デォキシ- D-グルコースを含む KRPに 1 nilあたり 15 1の 2 -デォキシ- D_[U- 14C]グルコース（アマシャムバイォサイエンス社）を加えたものを用意し、各穴に 50 μ 1ずつ添加して 37°Cで 10 分インキュベートした。その後、冷えたリン酸緩衝生理食塩液 (PBS) で 3回洗い、 0. 1% ラウリノレ硫酸ナトリウム（SDS) を用いて細胞を溶解し、 2 mlのシンチレーター (Aquazol - 2、パッカードバイオサイエンス社) と混合して、細胞内に取り込まれたグルコース量を液体シンチレーシヨンアナライザー (トライカーブ B2500TR、パッカード社）を用いて測定した。結果を図 3に示す。図の値は平均土 SEを示している。図中の記号「*」は Dunnett検定における評価を示しており、「*」は有意差が Pく 0. 05であることを、「**」は有意差が pく 0. 01であることを意味している。

図 3に示す通り、ヒト CbAP40遺伝子を筋肉細胞に高発現させると糖取り込み量が減少することが判明した。

[実施例 7 ] ヒト CbAP40遺伝子のプロモーター配列の同定、および該配列の転写誘導活性を利用したィンスリン抵抗性を改善する化合物のスクリ一ユング系

( 1 ) ヒト CbAP40遺伝子のプロモーターのクローニング

インスリンシグナル第 2経路にある分子で c-Cblと結合することが報告されている CAP (Cbl-assosiated protein) はインスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジン誘導体によってその発現量が増加することが知られており、該発現量の増加はチアゾリジン誘導体によるインスリン抵抗性改善作用の一機序を担うと考えられている。本発明の CbAP40は CAPと同様に c- Cblに結合する力上述の事実から CbAP40は CAPとは対照的にィンスリン抵抗性をもたらす糖尿病の増悪因子であると考えられる。このため CbAP40の発現についても CAPとは対照的な調節を受けていることが予想された。しかしヒト CbAP40の発現調節に関わるプロモーター配列は明らかでなかった。そこで、ヒト CbAP40プロモーター配列の取得を試み、該プロモーター配列の下流にレポーター遺伝子を配置することにより、ヒト CbAP40の発現を検出して定量化可能な系を構築し、ヒト CbAP40遺伝子の発現調節機構を調べた。配列番号 17および 18に示す一対のプライマ一を設計した。これらのプライマ一を用いてヒトゲノム DNA (クロンテック社）を铸型とし、 PCR法（DNAポリメラ 'ーゼ（LA Taq DNA polymerase；宝酒造社）により、ヒト CbAP40のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの増幅を試みた。 PCRの反応条件は、 98 °C (5分）の後、 96 °C (30秒）、 55 °C (30秒）、 72 °C (90秒）のサイクルを 35回繰り返した後 72でで 7分加温した。その結果約 3. 1 kbpのポリヌクレオチドの増幅に成功した。次に該ポリヌクレオチドがヒト CbAP40の発現を制御するプロモータ一を含むことを示すため、この PCRによって得られた DNA断片を制限酵素 Xhol および BaraHI (宝酒造社）で処理し、同様に制限酵素 Xholおよび Bglllで処理したルシフェラーゼレポーターベクター（pGL3- Basicベクター；プロメガ社）に連結して CbAP40遺伝子プロモーター連結レポーターベクター（pGL3- CbAP40p) を構築した。

_PGL3-CbAP40pに揷入した 3. 1 kbpのポリヌクレオチドは、配列番号 17及ぴ 18 に示すプライマー並びに pGL3 - Basicベクターのマルチクローニングサイトの前後に結合する配列番号 19及ぴ 20に示す DNAプライマー（プロリゴ社）を用いて塩基配列を部分的に決定した。さらに決定した塩基配列情報をもとに設計した配列番号 21、 22、 23、及び 24に示す 4種類の DNAプライマー（プロリゴ社）を用いてさらに該ポリヌクレオチドの全長の塩基配列を決定した。その結果、該ポリヌクレオチドは配列番号 3に示す 3119 bpのポリヌクレオチドであることを明らかにした。

次に同塩基配列情報をもとに上述の pGL3_CbAP40pを制限酵素 Hindlll処理し、続いてライゲーシヨン反応により同プラスミドを連結して配列番号 3に示すポリヌクレオチドから 1231番目から 3119番目の塩基までの配列を除去したプラスミド pGL3-CbAP40p [1-1231]を作製した。さらに pGL3 - CbAP40pを制限酵素 Smal及び Hindlllで処理して配列番号 3に示すポリヌクレオチドの 1364番目から 3119番目の塩基に相当する DNA断片を切り出し、同断片を制限酵素 Smal及び Hindlllで処理した pGL3_Basicベクターに連結して pGL3_CbAP40p [1364 - 3119]を作製した。さらに配列番号 18及ぴ 23、配列番号 18及ぴ 24の 2対のプライマーを用いて、 pGL3-CbAP40pを鍀型として上述実施例 7 ( 1 ) に示した条件と同様の PCR反応により配列番号 3に示すポリヌクレオチドの 2125から 3119番目の塩基を含む DNA 断片及び同 2569から 3119番目の塩基を含む DNA断片をそれぞれ抽出した。これらの DNA断片をそれぞれ制限酵素 Sacl及び BamHIで処理し、同様に制限酵素 Sacl および Bglllで処理した pGL3- Basicベクターに連結して pGL3- CbAP40p [2125_ 3119]及び、 pGL3-CbAP40p [2569- 3119]をそれぞれ構築した。これら pGL3- CbAP40p [1-1231]、 pGL3 - CbAP40p [1364-3119]、 pGL3-CbAP40p [2125-3119]及び pGL3-CbAP40p [2569-3119]はいずれも上述の配列番号 19及び 20に示す DNAプライマ一を用いて揷入配列の塩基配列を決定した。その結果いずれも配列番号 3に示すポリヌクレオチドの部分断片を有しており、各プラスミド名の括弧内に記した数値に相当する該ポリヌクレオチドの塩基配列部分を含むことを確認した。

( 2 ) ヒト CbAP40プロモーターの転写誘導活性を利用した化合物のスクリ一二ング系の構築

pGL3-CbAP40pを上述の実施例 2 ( 1 ) に示した方法に従つて COS- 1細胞にトランスフエタトし、空ベクター pGL3 - Basic Vectorをトランスフエクトした場合と比較することにより、該ポリヌクレオチドのプロモーターとしての発現誘導活性をルシフヱラーゼの活性を指標に測定した。細胞へのトランスフエクション効率の補正及ぴルシフェラーゼァッセィの詳細は以下の方法に従った。培養細胞 293 細胞（セルパンク社）は 12ゥヱル培養プレート（ゥエル直径 22 mm) の培養皿に各ゥヱル 1mlの 10%牛胎児血?冑（シグマ社）を含む最少必須培地 DMEM (ギブコ社）を加えて 70%コンフルェントの状態になるまで培養した。この細胞にリボフェクタミン法 (LIP0FECTAMINE™2000；インビトロジ工ン社）を用いて、添付のプ口トコールに従い上述の pGL3- CbAP40pあるいは p GL3 - Basic Vector (0. 8 g/ ゥエル）を、一過性にトランスフエクトした。ピオグリタゾン (pioglitazone, (+) -5- [4- [2- (5-ェチル -2-ピリジニル）ェトキシ]ベンジル] -2， 4-チアゾリジンジオン） 0. Ι μ Μあるいは 1. 0 μ Μ、あるいは 10 μ Μを培地に添加して 24時間培養した後、培地を除去し、細胞を PBSで洗浄した後にゥエルあたり 0. 1 mlの細胞溶解液 (100 mM リン酸カリウム（ρΗ7· 8) 、 0. 2%トリトン X- 100) を添加して細胞を溶解した。ピオグリタゾンは特許 1853588号明細書の方法に従って合成した。この細胞溶解液 100 μ 1にルシフエラ一ゼ基質溶液 ΙΟΟ , Ι (ピッ力ジーン社）を添加し、 AB- 2100型化学発光測定装置（アト一社）を用いて 10秒間の発光量を測定した。ルシフエラーゼレポ一タ遺伝子と同時に -ガラタトシダーゼ発現遣伝子をもつプラスミド p CHllO (アマシャムフアルマシァパイォテク社) ΟΛ μ gノウエルを細胞にコトランスフヱタトし、 β -ガラクトシダーゼ活性検出キット Galacto- Light Plus™system (アプライドバイオシステム社）を用いて ]3 -ガラクトシダーゼ活性を測定及び数値ィ匕した。れを導入遺伝子のトランスフヱクション効率として上述のルシフヱラーゼ活性を各ゥエル毎に補正した。

結果を図 4に示す。図の値は平均土 SEを示している。ヒト CbAP40遺伝子上流配列の存在に依存した有意なプロモーター活性が確認された。さらにこのプロモ一ター活性はィンスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジン誘導体の一種ピオグリタゾン 0. 1-10 μ Μを加えた場合に抑制されることが明らかになった。さらに、同じ実験を pGL3- CbAP40pに替えて上述で作製した pGL3-CbAP40p [1-1231]、 pGL3- CbAP40p [1364-3119] , pGL3-CbAP40p [2125-3119]、あるいは pGL3- CbAP40p [2569 - 3119]に置き換えて実施した。 pGL3-CbAP40p [1364- 3119]又は pGL3- CbAP40p [2125_ 3119]を用いた場合は、プロモーター活性が検出され、その活性はピオダリタゾンにより抑制された。 pGL3_CbAP40p [2569- 3119]を用いた場合には、プロモータ一活性は検出されたが、ピオグリタゾンによる抑制効果は観察されなかった。 pGL3- CbAP40p [l - 1231]を用いた場合には、プロモーター活性は検出されなかった。従って、プロモーター活性の発現には配列番号 3のポリヌクレオチドの第 2125〜 3119番の塩基配列が含まれていれば良いことがわかった。また、ピオグリタゾンによるプロモータ一活性の抑制作用は配列番号 3のポリヌクレオチドの第 2125〜 2569番の塩基までの DNA配列の存在に依存して引き起こされることが明らかになつた。すなわち、配列番号 3、配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番及び第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにはヒト CbAP40の発現を制御するプロモータ一配列が含まれており、このプロモーターはインスリン抵抗性を低減させるピオグリタゾンなどの PPAR yリガンドによって負に制御されることを示された。この事実から、インスリン抵抗性を低減させるチァゾリジン誘導体によって CbAP40の発現が抑制されることによりインスリン抵抗性の低減が引き起こされていることが予想された。したがって本実施例におけるヒト CbAP40のプロモーターアツセィは、 PPAR y 蛋白質あるいはその応答配列を利用せずに PPAR yリガンドあるいはインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングするために利用できる。

さらに、ピオグリタゾンによるプロモーター活性の抑制作用は上述のとおり配列番号 3の第 2125〜2569番の塩基配列の存在に依存して引き起こされること力ら、この配列部分を含むポリヌクレオチドを、 CbAP40以外の遺伝子の、転写誘導に必要な TATAボックスを含む最低限の長さのプロモーター配列の上流に配置することによって、同様に PPAR y蛋白質あるいはその応答配列を利用せずに PPAR 7リガンドあるいはィンスリン抵抗性改善薬をスクリ一ユングする,ために利用することができる。

本スクリーニング方法により得られる化合物には、従来の PPAR y蛋白質を介在させるスクリーエング方法によって得られたチアゾリジン誘導体などの典型的な PPAR yリガンドとは異なる構造的特徴を有するものが含まれうる。すなわち、チァゾリジン誘導体に見られる浮腫や脂肪重量増加などの副作用を付帯しない 2型糖尿病改善剤を得ることが可能である。

[実施例 8 ] マウス CbAP40のクロー-ング

( 1 ) マウス CbAP40のクローニング

前述実施例 5で作製した糖尿病モデルマゥスの筋肉由来 mRNAを鎵型とした 1 本鎖 DNAのライブラリーを用いて、公知の方法によりこれを铸型としてさらに PCRを行って 2本鎖 DNAからなる cDNAライブラリーを作製した。これを錶型とし、配列番号 27及び配列番号 28に示す一対のプライマーを用いて、前述の実施例 1 ( 3 )と同様の PCR法により、 CbAP40マウスオルソ口グ遺伝子全長 cDNAの増幅を試みた。その結果得られた約 1. 4 kbpの DNA断片を、実施例 1と同様の方法に従い塩基配列を決定したところ、配列番号 25に示す 1404 bpからなる遺伝子の全長 cDNAが含まれることを確認した。該 cDNAは配列番号 26に示すポリぺプチドをコードする新規の遺伝子である。公知の登録遺伝子 GenBank匪 _172708及ぴ AK044445は、該新規遺伝子と部分的に同一の配列を有するが、 cDNAの 3' 端が異なっており、コードするポリぺプチドはカルボキシル末端長および配列が全く異なる分子である。対照的に該新規遺伝子はヒト CbAP40とほぼ同一の C末端構造を有しており、配列番号 1に示すヒト CbAP40遺伝子と 75. 6%、コードするポリペプチドは配列番号 2·に示すヒト CbAP40蛋白質と 71. 1%の高い相同性をそれぞれ示す。この知見から該新規遺伝子は本発明ヒト CbAP40のマウスオルソ口グ遺伝子であり、ヒト CbAP40とマウス CbAP40は同じ機能を有するといえる。

( 2 ) マウス CbAP40発現ベクターの作製'

前述の実施例 1 ( 4 ) に示した方法と同様の方法により上記マゥス CbAP40cDNA を pcDNA3. 1- V5-T0P0 (ィンビト口ジェン社）にクローニングした。クローニングに際してマウス CbAP40の停止コドンを除いてタグを融合させるため、配列番号 29 及ぴ配列番号 27に示すプライマーを用いて PCRおよびべクタ一へめリクローニングを行つた。作製した該発現べクタ一を pcDNA - mCbAP40と名付けた。

( 3 ) マウス CbAP40発現細胞の作製、およびマウス CbAP40蛋白質の検出前述実施例 2の（ 1 ) に示した方法に従い、 pcDNA_mCbAP40を 293細胞にリン酸カルシウム法を用いて一過性に導入した。 30時間培養した後、培地を除去し、細胞を PBSで洗浄した後にゥエルあたり 0. 1 mlの細胞溶解液（100 mM リン酸カリウム（pH7. 8)、0. 2%トリトン X - 100)を添カ卩して細胞を溶解した。続いて前述実施例 2 ( 2 ) に示した方法に従い、ポリアクリルアミド電気泳動による分離と抗 V5抗体を用いたウェスタンプロットでマウス CbAP40蛋白質の検出を行った。その結果、 45ァミノ酸からなる C末端側のタグを含む合計 512ァミノ酸からなるマウス CbAP40- V5 - His6融合蛋白質を示す約 60 kDaの蛋白質が発現ベクター pcDNA - mCbAP40の細胞導入に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローユングした前述のマウス CbAP40は、遺伝子の全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとりうることが明らかになった。

[実施例 9 ] ヒトおよびマゥス CbAP40と c - Cblの相互作用の検証

' ( 1 ) GST融合 c-Cbl発現プラスミドの作製

マウス C- Cblの cDNAを GST融合発現ベクター pGEX- 6P- 1 (アマシャムパイォサィエンス社）に揷入するため、実施例 1 ( 1 ) で得られたマウス C- Cblの cDNAを鐯型として配列番号 30および 31で表される DNAオリゴプライマー（プロリゴ社）を用いた PCR反応により、 cDNAの両末端に末端にそれぞれ制限酵素 EcoRVサイトと Xholサイトを付加した。なお PCR反応は実施例 1 ( 1 ) で述べた条件で行った。この cDNA断片を制限酵素 EcoRV及ぴ Xholで、ベクター pGEX - 6P- 1を制限酵素 Smal及ぴ Xholでそれぞれ切断し、直鎖状にした。両者を混合したものを DNA ligase液（DNA ligation kit II；宝酒造社）と混合して 16°Cで 3時間処理し、 pGEX-6P - 1のマルチクローユングサイトに c_Cbl cDNAが挿入されたプラスミド（以下 pGEX_Cblと略称する）を作製した。配列番号 32に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット (アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー (ABI 3700 DNA sequencer アプライドバイォシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、 c- Cblの cDNAのコード領域と pGEXベタタ一の GSTタグ翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。

( 2 ) GST融合 c - Cblタンパク質の精製

上述の（1 ) で得られたプラスミド pGEX_Cblを用いて、実施例 3と同様に、 GST-Cblを精製した。コントロールとして pGEX- 6P-1で形質転換した大腸菌 BL21 から GST部分のみの蛋白質（以下 GST蛋白質と略記する）を上述と同様に発現誘導して精製した。公知の方法に従つて SDSポリアタリルァミドゲル電気泳動法による分離及びクーマジープリリアントブルー染色を行い、期待される分子量の蛋白質（GST- Cbl； 100 kDa、GST蛋白質； 26 kDa) が精製されていることを確認した。

( 3 ) c - Cbl蛋白質とヒト又はマウス CbAP40蛋白質との生化学的結合の確認上述（2 ) で作製した GST- Cbl蛋白質を用いて、ヒトおよびマウス CbAP40蛋白質と c_Cbl蛋白質の直接の相互作用の有無を GST- pull do皿法（実験工学、 Voll3、 No. 6、 1994年 528頁松七五三ら）によって確認した。まず上述実施例 1 ( 4 )で作製した pcDNA - CbAP40あるいは上述実施例 8 ( 2 ) で作製した pcDNA- mCbAP40の 0. 5 μ gをそれぞれ錶型として TNT kit (TNT^RQuick Coupled

Transcript i on/Trans 1 at i on System;プロメガ社） 40 μ 1およびラジオアイソトープ（redivue Pro-mix L- [³⁵S] ；アマシャム） 1. 3 MBqを用いて添付のプロトコ一ルに従い in vitroでの転写 ·翻訳によりラジオアイソトープラベルされたヒトあるいはマウス CbAP40蛋白質を調製した。このヒトあるいはマウス CbAP40蛋白質調製液各 15 ^ 1と上述（2 ) でダルタチオンビーズ上に精製した GST蛋白質あるいは GST- Cbl各又は 1 μ gを混合し、 0. 3 mlの Buffer A (50 mMトリス塩酸

(pH7. 5) 、 10%グリセロール、 120 mM NaCl、 1 mM EDTA、 0. 1 mM EGTA、 0. 5 mM PMSF、 0. 5%NP-40) を添カロして 4°Cで 1時間振盪した。の後遠心分離によりビーズ上の GST蛋白質あるいは GST- Cblに結合する蛋白質を共沈殿させた。これを上述の Buffer Aの NaCl濃度を 100 mMに置換した緩衝液 0. 5 mlでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を 4回繰り返したのち、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従って SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、オートラジオグラフィによりヒトあるいはマウス CbAP40蛋白質を検出した。その結果、 GST蛋白質を混合した場合には検出されないバンドが GST_Cblを混合した場"^'に検出された。これにより、本発明のポリペプチドの一つであるヒトあるいはマウス CbAP40は、同様に c-Cbl蛋白質と相互作用することが明らかになり、これらヒト、マウスの CbAP40は両動物種で互いに同一の機能を担うカウンターパートであることが裏付けられた。従って本発明のマウス CbAP40は、本発明のヒト CbAP40と同様に c - Cbl蛋白質との相互作用を介してィンスリン抵抗性の惹起に関与することがわかつた。

産業上の利用可能性

CbAP40はィンスリンシグナルに関わる新たな新規分子であり、本発明のポリぺプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は、 2型糖尿病改善薬、特にインスリン抵抗性改善薬若しくは糖代謝改善薬の同定及ぴスクリーユングに有用である。本発明のスクリーニング方法により 2型糖尿病改善薬をスクリーニングすることができる。また、本発明のポリペプチド及ぴ該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは糖尿病の診断に有用である。，配列表フリーテキスト

以下の配列表の数字見出しく 2 2 3 >には、「Art icial Sequence の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号 8， 9， 11, 19， 20, 30， 31， 33, 34の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲

1. ( 1 ) (i) 配列番号 3で表される塩基配列、（ii) 配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番で表される塩基配列、又は（iii) E列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは（iv) 前記（i) 〜（iii) で表される塩基配列において、 1〜； 10個の塩基が欠失、置換、及ノ又は挿入された塩基配列を含み、配列番号 2若しくは配列番号 26で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドのプロモータ一活性を有するポリヌクレオチド

を含む発現べクターで形質転換された細胞と試験物質とを接触させる工程、及び

( 2 ) プロモーター ^性を検出する工程

を含む、試験物質が前記（i)乃至（iv)のポリヌクレオチドのプロモーター活性を阻害するか否かを分析する方法。

2. 請求の範囲 1に記載の方法によ.る分析工程、及び . プロモータ一活性を阻害する物質を選択する工程 '

を含む、請求の範囲 1に記載のポリべプチドの発現を抑制する物質をスクリ一二ングする方法。

3. 請求の範囲 2に記載の方法により 2型糖尿病改善薬をスクリーニングする方法。

4. ( 1 ) 配列番号 3で表される塩基配列、（2 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 1364〜3119番で表される塩基配列、又は（3 ) 配列番号 3で表される塩基配列の第 2125〜3119番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは（4 ) 前記（1 ) 〜（3 ) で表される塩基配列において、 1〜10個の塩基が欠失、置換、揷入、及び Z又は付加された塩基配列からなり、請求の範囲 1に記載のポリペプチドのプロモータ一活性を有するポリヌクレオチド。

5. ( 1 ) 配列番号 2又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列、（2 ) 配列番号 2又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個のアミノ酸が欠失置換、及び Z若しくは挿入されたアミノ酸配歹 IJ、あるいは（3 ) 配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列との相同性が 90%以上であるァミノ酸配列を含み、かつ _c- Cblと結合及び若しくは過剰発現により糖取り込みを阻害するポリペプチドと c-Cblと試験物質とを接触させる工程、及び

前記ポリぺプチドと c - Cblとの結合を検出する工程

6. 請求の範囲 5に記載の方法による分析工程、及び

結合を阻害する物質を選択する工程 '

を含む、請求の範囲 5に記載のポリべプチドと c- Cblとの結合阻害物質をスクリ一二ングする方法。

7. 請求の範囲 6に記載の方法により 2型糖尿病改善薬をスクリーニングする方法。

8. 配列番号 2又は配列番号 26で表されるァミノ酸配列、あるいは配列番号 2又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ c - Cblと結合及ぴ Z若しくは過剰発現により糖取り込みを阻害するポリぺプチド。

9. 配列番号 2若しくは配列番号 26で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド、。

10. 配列番号 26で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチド

又は配列番号 26で表されるアミノ酸配列において 1〜： 10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c - Cblと結合及び/若しくは過剰発現により糖取り込みを阻害するポリべプチドをコードするポリヌクレオチド。

11. 請求の範囲 4又は請求の範囲 10に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクター。

12. 請求の範囲 11に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。

13. ( 1 ) 請求の範囲 8に記載のポリペプチド、（2 ) 請求の範囲 8に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は請求の範囲 1の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレオチド、あるいは（3 ) 請求の範囲 8のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は請求の範囲 1の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞からなる 2型糖尿病改善薬スクリー二ングツール。

14. ( 1 ) 請求の範囲 8に記載のポリペプチド、（2 ) 請求の範囲 8に記載のポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド又は請求の範囲 1の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレオチド、あるいは（3 ) 請求の範囲 8のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は請の範囲 1の（i)乃至（iv)に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクターで形質転換された細胞の 2型糖尿病改善薬スクリ一二ングのための使用。