WO2005014651A1

WO2005014651A1 - 糖鎖改変抗hm1.24抗体

Info

Publication number: WO2005014651A1
Application number: PCT/JP2004/011812
Authority: WO
Inventors: Masayuki Tsuchiya; Shigeyuki Iijima; Izumi Sugo; Masamichi Sugimoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-08-11
Filing date: 2004-08-11
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2006-02-11
Also published as: JPWO2005014651A1; EP1666501A1; EP1666501A4; US20070142627A1

Abstract

糖鎖の改変により抗体依存性細胞傷害性（Antibody-Dependent CellularCytotoxicity；ADCC）が増強された、HM1.24抗原に対する抗体（抗HM1.24抗体、具体的にはα-1,6コアーフコース（α-1,6corefucose）を含まない糖鎖を有する抗体、バイセクティング（bisecting）Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）構造を有する糖鎖を有する抗体、又はα-1,6コアーフコース（α-1,6corefucose）を含まない糖鎖を有し、且つバイセクティング（bisecting）Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）構造を有する糖鎖を有する抗体。

Description

明細書糖鎖改変抗 HM1.24抗体技術分野

本発明は、抗体依存性細胞傷害性（Antibody- Dependent Cellula r Cytotoxicity； ADCC) が増強された、 HM1.24抗原に対する抗体（抗 HM1.24抗体）及びその製造方法に関する。背景技術

HM1.24抗原は、骨髄腫細胞表面に高発現する分子量 29〜33kDaの膜蛋白質であり（Ishikawa J. et al. , Genomics 26(1995) , 527-5 34) 、骨髄腫細胞以外にも B腫瘍細胞及び T腫瘍細胞においても発現が認められている。正常細胞においては、ィムノグロブリン産生 Β細胞や活性化 Τ細胞で確認されており、その他の細胞においてはほとんど発現が認められていない（Goto T. et al.， Blood 84(199 4), 1922-1930) 。

HM1.24抗原の上記の如き組織分布にため、 HM1.24抗原に対する抗体（抗匪 1.24抗体）は、腫瘍に特異的に集積するため、この抗体をラジオァイソトープで標識することによる腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピー（radioimmunotherapy) などのミサイル療法への利用が期待されるほか、抗丽 1.24抗体は、それ自体、抗体依存性細胞傷害性 (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity； ADCC) を有する（Ozaki S. et al.， Blood 90(1997) , 3179-3186) ので、多発性骨髄腫などの骨髄腫治療薬などとしての利用が期待される。

このような、抗 HM1.24抗体の療法的使用に当っては、ヒトに対する免疫原性が低いことが望ましく、このため抗匪 1.24抗体の再構成ヒト（ヒト化）抗体が開発されている（W0 98/14580) 。しかしながら、 ADCC活性が一層増強された HM1.24抗体、特に ADCC活性が増強されたヒト化 HM1.24抗体の提供が望まれている。

抗体の ADCC活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、 W0 99/54342には、抗体のグリコシル化を修飾することにより ADCC活性を改良することが記載され.ている。また、 W0 00/61739には、抗体の糖鎮におけるフコースの存否により ADCC活性を調節することが記載されている。 W0 02/31140には、 YB2/0細胞において抗体を産生せしめることにより、 a- l，6cor e fucoseを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。 W0 02/79255には、パイセクティング GlcNAcを有する糖鎖を有する抗体が記載されている。しかしながら、糖鎖の修飾によつて ADCC活性が増強された HM1.24抗体は知られていない。

特許文献 1 W0 98/14580

特許文献 2 W0 99/54342

特許文献 3 W0 00/61739

特許文献 4 W0 02/31140

特許文献 5 W0 02/79255

非特許文献 1 Ishikawa J. et al. , Genomics 26(1995) , 527-5

34

非特許文献 2 Goto T. et al.， Blood 84(1994), 1922-1930 非特許文献 3 Ozaki S. et al. , Blood 90(1997) , 3179-3186 発明の開示

従って、本発明は糖鎖の修飾によって A D C C活性が増強された抗匪 1.24抗体及びその製造方法を提供しようとするものである。

本発明者は上記の課題を解決すべく種々検討した結果、 ο; - 1，6コァーフコース（ _α - l，6core fucose) (還元末端の N—ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位とが α結合している。 ) を含まない糖鎖を有する抗 HM1.24抗体、及びパイセクティング（bisectin g) N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) 構造を有する糖鎖を有する抗体が高い ADCC活性を有するほか、 α - 1，6コアーフコース（ α _1 ,6core fucose) をまなヽ Hllとノイセクティング (bisecting) N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) 構造を有する糖鎖を共に有する抗 HM1.24抗体が、一層高い ADCC活性を有することを見出し本発明を完成した。

従って本発明は、糖鎖が改変された、 HM1.24抗原に対する抗体（抗 HM1.24抗体）、例えば糖鎖の改変により抗体依存性細胞傷害性（ Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity； ADCC) 力 S増強された、 ΗΜ1· 24抗原に対する抗体（抗 HM1.24抗体）を提供する。この抗体は、典型的にはモノク口ーナル抗体またはそれに由来する抗体であり、例えばキメラ抗体、又は更に好ましくはヒト化抗体である。より具体的には、本発明は、ひ -1,6コアーフコース（ひ- l，6core fuc ose) を含まない糖鎖を有する抗体、及びパイセクティング（bisec ting) N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) 構造を有する糖鎖を有する抗体、更には、 α -1,6コアーフコース（ a- l，6core fucose) を含まない糖鎖を有し、且つパイセクティング（bisecting) N - ァセチルダルコサミン（GlcNAc) 構造を有する糖鎖を有する抗体を提供する。

本発明はまた、フコースを含まない糖鎖を有する抗 HM1.24抗体を含む抗体組成物であって、フコースを含まない糖鎖の相対比率が 30 %以上である抗体組成物を提供する。かかる相対比率は、より好ましくは 35%以上である。

本発明はまた、上記の糖鎖が修飾された抗体製造方法において、匪 1.24抗原に対する抗体（抗丽 1.24抗体）をコードする核酸が導入された YB2/0細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法； N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ III (GnTIII ) をコードする核酸を導入した宿主細胞を培養し、当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法；並びに、 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ I II

(GnTIII ) をコードする核酸を導入した YB2/0細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、 YB2/0で発現させた精製ヒト化抗ヒト HM1.24抗体の SDS - P AGE (12%T) のパターンを示す。左図：還元条件下、右図：非還元条件下。精製ヒト化抗ヒト HM1.24抗体各 4 _gをアプライした。

図 2は、 HM1.24抗体- DG44と HM1.24抗体- YBの各抗体濃度におけるヒト PBMCの ADCC活性を、 4種類の HM1.24抗原発現 CH0細胞（HM26, HM3 1， HM21, HM36)を標的細胞として、 E/T rat io = 25で測定した結果である。

図 3は、 HM1.24抗体一 DG44と HM1.24抗体— YB lmg/mLにおけるヒト P BMCの ADCC活性を、 HM31を標的細胞として、 E/T ratio = 1, 5， 25で測定した結果である。

図 4は、 CH0由来の抗体（a)及び YB2/0由来抗体（b)から調製した PA 化糖鎖の逆相 HPLCク口マトグラムである。産生細胞の種類により糖鎖パターンが変化し、特に YB2/0由来抗体では、フコース無しと推定されるピーク群（A-D)が増加していることを示している。

図 5は、第 4図と第 1表で示した糖 A〜Hの構造を示す。

図 6は、第 4図と第 1表で示した糖 I〜 Oの構造を示す。図 7は、ヒト GnTIII cDNAの PCRによる全合成に使用したプライマ一配列と組合わせを示した。予めプライマーに導入した BamHI配列の前後の PCR断片を同部位で連結し、ヒト GnTIII cDNA全配列を取得した。

図 8は、 HM1.24抗体 - DG44及び GnTIII発現ヒト化抗ヒト HM1.24抗体産生株由来抗体 100n_g/mUこおける ADCC活性の比較。 GnTIIIを発現させることにより ADCC活性が増強している抗体産生株が得られた。図 9は、 HM1.24抗体- DG44と GnTIII発現 CHO細胞由来ヒト化抗ヒト HM1.24抗体の各抗体濃度におけるヒト PBMCの ADCC活性を、 HM36を標的細胞として、 E/T ratio = 25で測定した結果である。

図 1 0は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 28) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 29) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 1 1 は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 28) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 29) (GnTIII mut. nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 1 2は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 28) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 29) (GnTIII mut. nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 1 3は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 28) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 29) (GnTIII mut. nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 1 4は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 28) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 29) (GnTIII mut. nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 1 5は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号

： 28) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 29) (GnTIII mut. nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明において、糖鎖が改変された抗体（糖鎖改変抗体）とは、基準となる宿主細胞により産生される抗体（好ましくは、かかる宿主細胞により産生される抗体のうち、最も高い割合で産生される抗体）の糖鎖構造と比較した場合に、これとは異なる糖鎖構造を有する抗体をいい、これには、基準となる宿主細胞によっては通常（又は主としては）産生されない糖鎖構造を有する抗体なども含まれる。また、本発明の糖鎖改変抗体を、必ずしも均一ではない種々の構造の糖鎖を有する抗体分子の集合体（本願においては、抗体組成物とも称する）として考える場合には、基準となる宿主細胞により産生される抗体組成物と比較して、これとは糖鎖改変抗体の割合が異なる抗体組成物であることを意味し、このような本発明の抗体組成物には、基準となる宿主細胞によっては通常（又は主としては）産生されない糖鎖構造を有する抗体を含む抗体組成物なども含まれる基準となる宿主細胞は特に限定されず、例えば、 CHO dhfr—細胞 (ATCC CRL-9096) 、 CHO Kl (ATCC CCL-61) 、 CHO DG44等を挙げることができるが、 CHO DG44細胞を基準となる宿主細胞として用いることが好ましい。糖鎖改変抗体の例としては、フコース（好ましくは、 α -1，6コアーフコース（ _α - l，6core fucose) が欠損した糖鎖を有するフコース欠損抗体、糖鎖にパイセクティング（bisecting) N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) が付加した抗体などを挙げることができる本発明の糖鎖改変抗体を抗体組成物として捉える場合には、全て同一の構造の糖鎖を有する均一な抗体を含有する組成物である必要はなく、従って、本発明においては、抗体組成物に含まれる糖鎖改変抗体の割合が、上述のような基準となる宿主細胞により産生される抗体組成物に含まれる糖鎖改変抗体と比較して異なっていればよい。本発明は、このような糖鎖改変抗体組成物を含む。本発明の糖鎖改変抗体組成物であるか否かは、対象となる抗体組成物に含まれる糖鎮改変抗体の割合が、上述のような基準となる抗体組成物に含まれる糖鎖改変抗体の割合と異なるか否かで判断することができる。かかる割合の比較は、例えば、後述の実施例 8に記載のような分祈方法により認識される各糖鎖の相対比率を比較することにより行うことができる。

本発明の糖鎖の修飾により ADCC活性が増強された抗 HM1.24抗体を得るには、 α— 1，6コアーフコース（ α— l，6core fucose) を付加する能力を有しないか又はその能力が低い宿主細胞中で抗 HM1.24抗体を発現させる力、あるいは糖鎖にパイセクティング（bisecting) N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) 構造を形成する能力を有する宿主細胞中で抗丽 1.24抗体を発現させる必要がある。そして、そのためには、目的とする抗匪 1.24抗体をコードする遺伝子がクローニングされなければならない。そして、クローニングされた遺伝子によりコードされた抗 HM1.24抗体としては、モノクローナル抗体、可変領域がマウスなどのヒト以外の動物に由来し、不変領域がヒトの抗体に由来するキメラ抗体、可変領域中の相補性決定領域のみがマウスなどのヒト以外の動物の抗体に由来し、それ以外の抗体部分はヒト抗体に由来するヒト化抗体などが上げられる。

W0 98/14580の記載から明らかな通り、モノクロ一ナル抗 HM1, 24 抗体を産生するハイプリドーマは既に樹立されており、このハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、平成 7年 4月 27日に、 FERM BP- 5233として寄託されている。また、このハイプリドーマから、軽鎖可変領域（L鎖 V領域）をコードする DNA及び重鎖可変領域（H鎖 V領域）をコードする DNAがクローユングされ、そしてこれらの DNAを含むプラスミドを収容した大腸菌が、それぞれ、 Escherichia coli DH5 a (pUC19-l.24L-g κ ) (FERM BP - 5646) 及び Escherichia coli DH5 a (pUC19-l.24H-g γ 1) (FERM BP- 5644) として、平成 8年 8月 29日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に寄託されている。さらに、上にクローニングした L鎖 V領域をコードする DNA及び H鎖 V領域をコードする DNAから、キメラ抗 HM1.24抗体及びヒト化抗 HM1.24抗体が作成された。ヒト化抗体については、 W0 98/14580の第 37頁〜第 40頁の表 1〜表 4に示されるように、ヒト化抗体の L鎖についてはパージョン^ _及びが作製され、 H鎖については、パージヨン _§_〜_§_が作製され、これらを込み合わせたヒト化抗体の抗原結合活性の測定の結果、 L鎖パージョン^_と H鎖パージョン _又はとの組合わせから成るヒト化抗体が強力な抗原結合活性を有することが確認された。

従って、本発明においては、上に引用した W0 98/14580に記載されている種々のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することができる。しかしながら、上記の抗体のみならず、 HM1. 24に対する他のモノクローナル抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することもできる。その場合、これらの調製方法としては、例えば W0 98/14580に記載されている方法を用いることができる。

抗 HM1. 24抗体に結合する糖鎖には、抗体分子のァスパラギンの側鎖の N原子に結合する N —ダリコシド結合糖鎖と、抗体分子のセリン又はスレオニンの側鎖ヒドロキシル基に結合する O —グリコシル結合糖鎖とがあり、本発明においてフコースの存否が問題となるのは N _ダリコシル結合糖鎖である。この N —グリコシル結合糖鎖は、図 5及び図 6に示すごとく、 1個のマンノース（Man) と 2個の N —ァセチルダルコサミン（Gl cNAc) が ]3 1，4結合で結合した基本構造（コア）「- Man j3 1- 4Gl cNAc l_4Gl cNc -」を有し、この構造の右の GlNAcを還元末端と称し、左側の Manを非還元末端と称する。フコース（Fuc) が結合している場合、これは主として、還元末端の N —ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位とが α結合している。

本発明の一つの態様によれば、抗 HM1. 24抗体は上記のフコースを含まない糖鎖を有する。抗体分子が複数の Ν—ダリコシル糖鎖を有する場合、少なくとも 1個の糖鎖は上記のフコースを有しない。このような、フコースを含まない糖鎖を有する抗体は、当該抗体を、糖鎖へのフコース付加能を欠失した細胞、すなわち、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い宿主中で発現させれば良い。本発明においては、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い任意の宿主を用いることができるが、具体例として、ラットミエローマ YB2/3HL, Ρ2. Gil . 16A_g. 20細胞（YB2/0細胞と略される）（ ATCC CRL 1662として保存されている）が挙げられる。本発明で用いることができるその他の細胞としては、例えば、 FTVI I Iノックァゥ卜 CHO細胞（WO 02/31140)、 Lecl3 細胞（W003/035835)、フ n—ス卜ランスポーター欠損細胞（特願 2003- 174006、特願 2003- 282081、特願 2003 - 174010、特願 2003- 282102) を挙げることができる。

本発明のもう一つの態様によれば、本発明の抗 HM1.24抗体は、バイセクティング (bisecting) N—ァセチルダルコサミンを有する糖鎖を有する。 N—グリコシル結合糖鎖は前記の如き基本構造（コァー）を有し、その非還元末端には、図 5に示すごとく、マンノースを含む 2個の鎖が α 1，6結合及びひ 1，3結合により結合している。他方、図 6に示す糖鎖においては、基本構造（コア一）の非還元末端に、前記 2個の糖鎖のほかに、 1個の Ν—ァセチルダルコサミン

(GlcNAc) が j31，4結合により結合している。この N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) が、「バイセクテング N—ァセチルダルコサミン」である。

パイセクティング N—ァセチルグルコサミンを有する糖鎖は、 O ーグリコシル結合糖鎖又は N—グリコシル結合糖鎖であり、 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ III (GnTIII ) により、 N—ァセチルダルコサミンを糖鎖に転移させることにより形成される。この酵素をコードする遺伝子は既にクローニングされており、そのアミノ酸配列及びそれをコードする DNAの塩基配列は記載されている（NCBIデーターベース（ACCESSION D13789) ) 。また、この DNAは、上記の配列情報に基づいて PCR法など、常法に従って、クローニングすることができる。

GnTIII をコードする DNAを用いて、パイセクティング N—ァセチルダルコサミンを有する糖鎖を形成するには、この DNAを含んでなる発現ベクターにより、抗丽 1.24抗体を産生する宿主細胞を形質転換すればよい。すなわち、 GnTIII をコードする DNAを含んで成る発現ベクターと抗 HM1.24抗体をコードする DNAを含んで成る発現べクターとにより、宿主細胞を形質転換し、これを培養すればよい。本発明の第三の態様によれば、本発明の抗 HM1. 24抗体は、 1，6 コアーフコース（ α l，6core fuc o s e) を有しない糖鎖とパイセクティング N—ァセチルダルコサミンを有する糖鎖の両方を有する。このタイプの抗体を製造するには、 GnT I I I をコードする DNAを含んで成る発現ベクターと抗腿 1. 24抗体をコードする DNAを含んで成る発現ベクターとにより、 α - 1，6コアーフコースを有する糖鎖を形成する活性を有しないか又はこの活性が弱い宿主細胞、例えば ΥΒ2/0 細胞、を形質転換し、これを培養すればよい。

宿主細胞の形質転換方法、培養方法、及び培養物からの抗体の単離 · 精製方法は、常法に従って行うことができる。

また、本発明の糖鎖改変抗体は ADCC活性が増強されていることが好ましい。本発明において、 ADCC活性が増強されているか否かは、糖鎖が改変されていない抗体又は糖鎖が改変されていない抗体組成物の ADCC活性と比較して、これよりも高い ADCC活性を示す場合には ADCC活性が増強されていると判断される。

ADCC活性は当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、エフェクター細胞、標的細胞及び抗 HM1. 24抗体を混合し、 AD CCの程度を調べることにより測定することができる。より具体的には、例えば、エフェクター細胞としてマウス脾細胞ゃヒト末梢血や骨髄から分離した単核球等を利用し、標的細胞としては匪 1. 24抗原を発現する CH0細胞等を用いる。標的細胞をあらかじめ^{5 1} Crにより標識し、これに抗匪 1. 24抗体を加えインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えィンキュベーシヨンを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の放射活性を力ゥントすることにより ADCC活性を測定することができる。実施例

次に、実施例により、本願発明を更に具体的に説明する。

実施例 1. ラットミエロ一マ YB2/0でのヒト化抗ヒト HM1.24抗体の発現

のヒト化抗ヒト HM1.24抗体発現べクタ一（AHi/N5KGlV- lark , Barnett , R. S. et al. Antibody Product ion in Chinese Hamste r Ovary Cells Using an Impaired Selectable Marker. In : Wan , H. Y. & Imanaka, T. ( eds ) ACS Symposium Series Vol 604： Ant ib ody Expression and Engineering, 27， 1995, WO 98/4580) を 2X1 0⁶Z0.6 mL PBS (-）の YB2/0 (ATCC CRT - 1662) へ、エレク卜ロボレーシヨン法で 1.5kV， 25 μ Fの条件で導入した。培養は 5% C02インキュベータ一内で 37°Cで行った。

10% FCSを含む RPMI1640培地（Gibco社）に權 μ g/mL Geneticin を加えて選択した後、 50 nM MTX, 100 ηΜ ΜΤΧ, 200ηΜ ΜΤΧと順次 ΜΤ X濃度をあげ、遺伝子増幅を行った。また、 96ゥエルプレート（Fal con社） ίこ 200nM MTX、 400 μ g/mL Geneticinを含む 10% FCS/RPMI164 0中、 0.5 cells I 100 μ L / wellで蒔きこみ、限界希釈法にて細胞のクローニングを行った。

ヒト化抗ヒト HM1.24抗体遺伝子を導入した YB2/0細胞の培養上清は実施例 2で示す ELISAにより定量した。

実施例 2. ヒト化抗匪 1.24抗体の定量（ELISA法）

96-ゥエル ELISA用プレート（Nunc社製）にコート緩衝液（100mmol/L 炭酸水素ナトリウム， pH9.6)で 100n_g/ml程度に希釈した可溶型 HM1 .24抗原を 100 Lずつ添加し、 4°Cで 1晚以上反応させた。反応後、 1 % BSA-PBSを 200 μ!7ゥエルで加え室温で約 2時間放置し、作製したプレートは 4°Cで保存した。 1%BSA- PBSを転倒除去した後、各 wellを Tween- PBSで洗浄した。適宜希釈したヒト化抗匪 1.24抗体標準液又はサンプル溶液と 100η _g/mLに希釈したピオチン標識ヒト化抗 HM1.24抗体を 1:1で混ぜた後、 lOO^L/wellで分注した。室温で、約 1時間反応させた後、各ゥエルを Tween-PBSで洗浄した。ァビジン標識 HRPを各ゥエルに添加し、室温で 15分以上反応させ、 TMB liqid(Sigma社製）を 100μ L/ゥェルで加え、 2 mol/L硫酸を 50 μ L/ゥエル加えることにより反応を止めた後、 450nmの吸光度を測定した。ヒト化抗 HM1.24抗体標準液の濃度一吸光度の検量線から、サンプル溶液のヒト化 HM1.24抗体濃度を算出した。 '

実施例 3. YB2/0で発現させたヒト化抗ヒト HM1.24抗体の精製ヒト化抗ヒト HM1.24抗体.の発現が確認された細胞は、 1700cm²のローラーボトル（CORNING社）で拡大培養を行った。すなわち 1X10 ⁹個のヒ卜化抗ヒ卜匪 1.24抗体発現 YB2/0細胞を 400mLの 200nM MTX、 400 μ g/mL ゲンタマイシンを含む 10% FCS/RPMI1640培地で（2.5rpm) でコンフルェントになるまで培養した。その後、培養上清の回収用に FCSを PBS (―)で平衡ィ匕した rProteinA FF ( Amer shamPharmac ia社）を予め素通りさせることでゥシ由来 IgGを除き（FCS (-））、この FCS (- ；)を用いた 200nM MTX、 400 μ g/mLゲンタマイシンを含む 10%FCS(- )/R PMI1640培地で 3〜4日間培養した。

培養上清は 0.22μ mフィルター処理した後、 rProteinA FF(PBS/PB S -クェン酸：リ二アグラジェント溶出）および Sourcel5S (20mM酢酸、 0-0.5mM NaCl:リニアグラジェント溶出）で精製した。精製したヒト化抗ヒト腿 1.24抗体は HM1.24抗体 - YBと名付けた（図 1 )。

実施例 4. 匪 1.24抗原（BST- 2)を発現する CH0細胞の作製

匪 1.24抗原蛋白質を発現する CH0細胞を次のようにして作製した（ Ohtomo ί. et al.， Biochemical and Biophysical Research Commu nications 258(1999) , 583-591)。即ち、 DHFRを欠損した CH0細胞株に、 HM1.24抗原をコードする発現ベクター p3.19 (上記文献）を導入し、 500 μ g/mlの G418で選択し、さらに限界希釈法により HM26、 H M31、 HM21及び HM36の 4つの細胞株を得た。細胞表面上の HM1.24抗原の発現数は特願 2001-115889に記された方法にてフローサイトメトリーで測定したところ、それぞれ細胞あたり 3.8X10³、 2.2X10 , 2.2X10⁴及び 1.8X10⁵個であった。

実施例 5. ヒト末梢血由来 PBMCを用いた ADCC活性の測定

( 1 ) ヒト PBMC溶液の調製

健常人よりへパリン加採血した末梢血を、 PBS (-)で 2倍に希釈し、 Fi col 1-Paque™ PLUS (Amer sham Pharmacia Biotech AB)に重層した。これを遠心（500Xg、 30分間、 20°C) した後、単核球画分である中間層を分取した。 3回洗浄後、 10% FBS/RPMIに懸濁し、ヒト PBM C溶液とした。

( 2 ) 標的細胞溶液の調製

実施例 4に示した HM1.24抗原（BST- 2)を発現する CH0細胞は、細胞剥離緩衝液（Invitrogen Corp)を用いてディッシュから剥離し、 10% FBS/RPMI 200 μ Lに浮遊し、 5.55MBqの Chromium— 51をカロえ、 5%炭酸ガスィンキュベータ中 37°C1時間培養した。この細胞を 3回洗浄した後、 10%FBS-RPMI1640培地中個々の細胞濃度に調製し、標的細胞溶液とした。

( 3 ) クロム遊離試験（ADCC活性）

標的細胞溶液を 96ゥエル U底プレートに 50 μ Lずつ分注し、各濃度に調製した抗体溶液 50 μ Lを添加し、氷上で 1時間反応させた後に、ヒト PBMC溶液 ΙΟΟμΙ^を加え、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37°C4時間培養し、培養後培養上清 100 中の放射活性をガンマ力ゥンターで測定した。下式により特異的ク口ム遊離率を求めた。

特異的ク口ム遊離率（％)= (A-C) X100/(B- C) Aは各ゥエルにおける放射活性（cpm)の平均値、 Bは標的細胞浮遊液を 50 /z L、 10%NP-40水溶液（Nonidet (商標） P- 40，ナカラィテスク社製）を 20 ^ L、 10%FBS/RPMI培地を 130 / L添加したゥヱルにおける放射活性（cpm)の平均値、 Cは標的細胞浮遊液を 50 μ L、 10%FBS/ RPMI培地を 150 _β L添加したゥェルにおける放射活性（cpm)の平均値を示す。

実施例 6. ガラクトシダーゼ安定発現 CH0細胞株を用いた ADCC 活性測定法

エフヱクタ一細胞として健常人の末梢血より比重遠心法で分離した単核球を用いた。すなわち、健常人の末梢血に等量の PBSを加え、 Ficoll-PaquePLUS(Pharmacia)に積層し、 500gで 30分間遠心した。単核球相を分取し、 10%FCSを含む RPMI1640で 3回洗浄後、 10%F CSを含む a -MEMで細胞数が 5xl0⁶ /mLになるように調製した。

トリプシン— EDTAで剥がし、 10%FCSを含むひ -MEMで懸濁した 2x1 0⁵ 細胞/ mLの ]3ガラクトシダーゼ安定発現 CH0#30細胞株 50 t Lと、様々な濃度の抗 HM1.24抗体 50 _μ Lを 96ゥエル U底プレートに加え、 4 °Cで 15分間反応させた。ついでエフェクター細胞 100 μ Lを加え、 37°Cで 4時間培養した。培養後、 20 / Lの培養上清を採取し、 β ガラクトシダーゼ活性を測定した。最大遊離酵素量は Galactone-star アツセィキットの細胞溶解緩衝液により遊離される酵素量とした。細胞傷害活性は、

細胞傷害活性（％) = (A-C)X100/(B-C)

(% β —ガラクトシダーゼ）

として計算した。ここで Αは抗体存在下において遊離された ]3ガラクトシダーゼ活性（RLU/sec)、 Bは細胞溶解緩衝液により遊離された ]3ガラクトシダーゼ活性（RLU/sec)、 Cは抗体を含まず培養液のみで遊離された β ガラクトシダーゼ活性（RLU/sec)を示す。実施例 7. YB2/0由来ヒト化抗ヒト HM1.24抗体の ADCC活性の測定 YB2/0で発現させた HM1.24抗体（HM1.24抗体- YB) の ADCC活性を実施例 5の方法にて測定した結果を図 2〜図 3に示した。図 2に示したように、いずれの標的細胞においても、 HM1.24抗体- YBは、 DG44 (DHFR欠損 CH0細胞： Urlaub, G. et al. (1986) Effect of Gamma Rays at the Dihydrof o丄 ate Reductase Locus： Deletions) and In versions. Somatic Cell and Molecular Genetics, 12: 555, 1986 ) で産生した HM1.24抗体（HM1.24抗体 -DG44) よりも高い ADCC活性を示した。

具体的には、より低濃度で ADCC活性の誘導が認められ、最大の AD CC活性にも向上が見られた。特に HM1.24抗原の発現数が少ない標的細胞 HM26， HM31を用レヽた場合、 ΗΜ1· 24抗体一 DG44では非常に低レ、 ADC C活性しか示さなかったのに対して匪 1.24抗体- YBでは高い AD C C活性が出現した。また、図 3に示したように、標的細胞数に対する PBMC 数の割合（E/T比）が 25の時のみならず、 E/T比が 5の場合も HM1.24抗体 - YBは匪 1.24抗体- DG44よりも高レ、 ADCC活性を示した。

実施例 8. 糖鎖の解析

1. 2-アミノビリジン標識糖鎖（PA化糖鎖）の調製

本発明の YB2/0由来抗体、及び対照試料として CH0由来の抗体に、 N -グリコシダーゼ F(Roche)を作用させ、糖鎖を蛋白質から遊離させに (Weitzhandler M. et al. , Journal of Pharmaceutical Scien ces 83:12(1994) , 1670-1675)。セルロースカートリッジ（TAKARA製 )を用レヽた固相抽出（Shimizu Y. et al. , Carbohydrate Research 3 32(2001) , 381- 388)により脱塩した後濃縮乾固し、 2-アミノビリジンによる光標言载を行った（Kondo A. .et al.， Agricultural and B iological Chemistry 54:8(1990), 2169-2170)。得られた PA化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製 PA化糖鎖とした。

2 . 精製 PA化糖鎖の逆相 HPLCによる分析

上記実施例 8の 1項の方法で、本発明の YB2/0由来抗体、及び対照試料として CH0由来の抗体について PA化糖鎖の調製を行った後、 0DS カラム（TAKARA製 Palpak Type R)による逆相 HPLC分析を行い、クロマトグラムを比較した。 CH0由来抗体の糖鎖に比較して、 YB2/0由来抗体の糖鎖は、 20分から 35分までに溶出するフコース無しと推定される糖鎖（A-D )のピーク増加が確認された（図 4 )。

3 . 精製 PA化糖鎖の二次元マッピングによる分析

上記実施例. 8の 1項の方法で、本発明の YB2/0由来抗体について PA 化糖鎖の調製を行った後、 0DS力ラムによる逆相 HPLC分析及びァミンカラム（TAKARA製 Palpak Type N )による順相 HPLC分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施した。具体的には、ァミンカラムによる順相 HPLCで、精製 PA化糖鎖のメインピークを粗分画し、各分画を逆相 HPLCにて分析した。

各糖鎖の同定は、 P A化糖鎖標準品（TAKARA製、ホーネン製、生化学工業製；図 5の K， 0 , Ρを除く）との HPLCにおける溶出位置の比較及び TOF- MSによる分子量確認にて行った。同定された各糖鎖の相対比を第 1表に示す（J， Kの区別及び N， 0の区別は本実施例においては行っていない）。また、表 1 に示す糖鎖の構造を図 5及び図 6に示す。この結果本発明の YB2/0由来抗体は、フコースの無い糖鎖が 3 0%以上存在し、且つパイセクティング Gl cNAcを持つ糖鎖が存在することが確認された。表 1

塘鎖グループ各糖鎖相対比各グル -プ相対比

A -Fuc， -Bisecting GlcNAc 17.7% 33. .5%

B 9.9%

C 3.9%

D 1.9%

E +Fuc , -Bisecting GlcNAc 22.9% 55, .2%

F 21.4%

G 5.5%

H 5.4%

I -Fuc， +Bisecting GlcNAc

3. 3%

J (K)

M +Fuc ,+Bisecting GlcNAc 3.7% 8. 0%

N(O) 4.2% 実施例 9. ヒト GnTIII発現ベクターの o CO作製

ヒト GnTIII遺伝子配列は NCBIデーターベース（ACCESSION D13789 ) より入手した。配列は GENETYX-SV/RCで解析し、繰返し配列が多いことから、 PCRによる増幅を容易にする目的で、サイレント変異を複数箇所導入したプライマーをデザインし、 PCRによる合成にて取得した。 PCRには K0Dポリメラーゼ（T0Y0B0社）を用い、塩基番号 801から 870までの二本鎖を最初の錶型とし、下に示すプライマーを用いて順次、 PCRを行った。下記のプライマー配列において、大文字はサイレント変異を導入した塩基を示す。また、数字は翻訳開始部位からの何塩基目かを示す。図 7は、 GnTIII 遺伝子に対する各プライマーの位置を示す。

リバースプライマー

End (Hindi II) ： TTTAAGCTTActagacttccgcctcgtccagtttTcc

15%- 1488： ctagacttccgcctcgtccagtttTccccgAgcAggcggTct tccTtcAggacccctgtggcgccaTcc icccgcAgccgtgctcctgggctcctggtaggggt tgt( 1508-1407： ggctcctggtaggggttgtccagAaggtagtggaaccggtcgtagttcttcagcaggtacttgggcgcatacatgtgctcgctggggtctgcaggcgggtac 1427-1324: ctggggtctgcaggcgggtactcTtgctgcgtgccgtcgaaccagcccccggtgcggatcaggccgcggatgtagt tcaggtcccgct tgtcc tcgtagtcacc 1344-1244： ccgcttgt cct cgtagtcaccccagcgtgggaagtcgccattctgggcggacacgagcttgaagtagatgccctcgggcgtgaagcaccaggagcagtgcc 1264-1162： tgaagcaccaggagcagtgccagccggcgaagtgAagggggctgcccagcgaccactgcaccaggatgtgTccggtgcggttctcatactgtct aagttgg

1103-1004： agcatgtccaccgtgcagcctgacaccacctccagggt cccggTtgcttccaAaagaaTccgtagagcgacgtgcgcat tggaaggcgaagggctcgg

1023-922: gtggaaggcgaagggctcggtccagccatcgtagagcttgaggaaCaggacgccgtcacgggccgggatctcgtccgcatcgtcaatgatgaagacgtcgtc 941-851： t caat gat aagacgtcgtcgggccgcaggttgcgcagccgcgagacgccgtcctgggtgaggaaggtgcgcaggtagt cgtcggcgatcc

870-801： caggtagtcgtcggcgatccaTccAtcTtgTcgTccTccAggAggAaagtggtccaggaagacatagagc

380-300 ggcggTctctccagcatcttggtgccgggtttgaagcagacgccTccAgccttggtgcgcacgaaatactcggtggtgtcc

320-241 acgaaatactcggtggtgtcctcgggcagcaccaagtccacccggtggagctcctcggccgccttgctgggcggcagcgg

Bam— 359 TTTggaTccgttggccccctcaggcttctcctccggTcgtcccggAggcggTctctccagcat cttgg

フォワードプライマー

Initial (BamHI ) ： TTTCTCGAGatgagacgctacaagctctttctcatgttc

1-97： atgagacgctacaagctctttctcatgttctgtatggccggcctgtgcctcatctccttcctgcacttcttcaagaccctgtcctatgtcaccttcc

78-177: cctgtcctatgtcacct tcccAcgagaactggcctccctcagccctaacctggtgtccagctttttctggaacaatgccccggtcacgccccaggccagc

158- -259: cggt cacgcc ccaggc cage ccTgagccaggaggc cctgacc tgctgc taccccactctact cccact cgcccctgctgcagccgctgccgcccagcaagg

239- -331: agccgctgccgcccagcaaggcggccgaggagctccaccgggtggacttggtgctgcccgaggacaccaccgagtatttcgtgcgcaccaagg

312- -409: gtatttcgtgcgcaccaaggcTggAggcgtctgcttcaaacccggcaccaagatgctggagagAccgccTccgggacgAccggaggagaagcct agg

390- -472: AccggaggagaagcctgagggggccaacggAtcctcggcCcggcgAccaccccggtacctcctgagcgcccgggagcgcacgg

453- -556: gagcgcccgggagcgcacggggggccgaggTgcAcgAcgcaagtgggtggagtgcgtgtgTctgcccg Atggcacggacccagc tgcggcgtgcccac tgtgg

535- -618: agctgcggcgtgcccact tggtgcagtaTtccaacctgccTaccaaggagcggctggtgcccagggaggt ccgcgccgcgtc

598- -696: agggaggtgccgcgccgcgtcatTaaTgcTatcaacgtcaaccacgagttcgacctgctggacgtgcgcttccacgagctgggcgacgtggtggacgcc

677- -777: tgggcgacgtggtggacgcctttgtggtgtgcgagtccaacttcacggcttatggggagccgcggccgctcaagttccgggagatgctgaccaatggcacc

758- -820: agatgctgaccaat gcaccttcgagtacatccgccacaaggtgctctatgtcttcctggacc

801- -870: gctctatgtct tcctggaccacttTccTccTggAggAcgAcaAgaTggAtggatcgccgacgactacctg

必要に応じて増幅断片をァガロースゲル電気泳動して、目的断片をゲルから切り出して精製したものを次の PCRの铸型とした。最終的に PCRのみで全長を増幅することが困難であったため、予めブライマ一内にサイレント変異として挿入しておいた BamHI部位を用いて、その前後の断片を増幅後に連結することにより、全長ヒト GnTI II遺伝子を取得した。図 11〜図 15に、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 28) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnT III をコードする塩基配列（配列番号： 29) (GnTIII mut. nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

ヒ卜 GnTIIIは、 pcDNA3. l(Hygro-) ( Invitrogen社）の Xhol/Hindl II部位に組込み、配列を確認した。

実施例 10. HM1.24抗体 - DG44発現 CH0細胞での GnT I IIの発現

上記実施例 · 9で得られた 10 β gの GnTIII/pcDNA3. l(Hygro- )を HM1. 24抗体 - DG44発現 CH0株にェレクトロポレーション法で 1.5kV， 25 μ F の条件で導入した。培養は 5% C02インキュベーター内で 37°C で行つた。 96ゥエルプレート（Falcon社）に、 10% FCSを含む IMDM培地 (Gibco社）を用いて、 10細胞/ 100 μ L/wellで蒔きこみ、 2日間培養した。 400 μ g/mLハイグロマイシンを含む 10% FCS-IMDM培地に代え、 1〜2週間、細胞の選択を行った。ハイグロマイシン耐性コロニーが出現し、増殖の認められた細胞の培養上清を回収し、ヒト化抗ヒト HM1.24抗体抗体量を実施例.2の ELISA法により測定した。

実施例 11. GnTI II発現ヒト化抗ヒト HM1.24抗体産生 CH0細胞の AD CC活性によるスクリーニング

GnTIIIを強制的.に発現させたヒト化抗ヒト HM1.24抗体産生細胞（クローン No.：!〜 31) に由来する化抗ヒト HM1.24抗体及び HM1.24抗体 - DG44の培養液を抗体濃度 400ng/mlに培地を用いて希釈し、実施例 6に示した方法を用いて ADCC活性を測定し比較した（図 8 ) 。最終的に ADCC活性とヒト化抗ヒト HM1.24抗体発現量および増殖速度を考慮してスクリーニングを行い、クローン No.6 (57B2) を得た実施例 12. GnTIII発現 CH0細胞由来ヒト化抗ヒト丽 1.24抗体の AD CC活性の測定

GnTIIIを強制的に発現させたヒト化抗ヒト HM1.24抗体産生細胞に由来するヒト化抗ヒト匪 1.24抗体の ADCC活性を実施例（B)の方法にて測定した結果を図 9に示した。クローン No.3， No.6 (57B2) と HM 1.24抗体- DG44を比較した結果、いずれのクローンも匪 1.24抗体 - DG 44よりも高い ADCC活性を示した。産業上の利用可能性

本発明によれば、高い ADCC活性を有する抗 HM1.24抗体を製造することができる。

Claims

1 . 糖鎖が改変された、 HM1.24抗原に対する抗体（抗 HM1.24抗体

2. 糖鎖の改変により抗体依存性細胞傷害性（Antibody-Depende nt Cellular Cytotoxicity； ADCC) が増強された、請求項 1 に記载青

の HM1.24抗原に対する抗体（抗 HM1.24抗体）。

3 . 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項 1又は 2に記载の抗体。の

4. 前記抗体がキメラ抗体である、請求項 1又は 2に記載の抗体囲

5 . 前記抗体がヒト化抗体である、請求項 1又は 2に記載の抗体

6. ひ — 1，6コアーフコース（ a— l，6core fucose) を含まない糖鎖を有する、請求項 1 〜 5のいずれか 1項に記載の抗体。

7. バイセクティング (bisecting) N—ァセチノレグノレコサミン (GlcNAc) 構造を有する糖鎖を有する、請求項 1〜 5のいずれか 1 項に記載の抗体。

8. α— 1，6コアーフコース（ a—l，6core fucose) を含まない糖鎖を有し、且つパイセクティング（bisecting) N—ァセチルグルコサミン（GlcNAc) 構造を有する糖鎖を有する、請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の抗体。

9 . フコースを含まない糖鎖を有する抗匪 1.24抗体を含む抗体組成物であって、フコースを含まない糖鎖の相対比率が 30%以上である抗体組成物。

1 0. 請求項 6に記載の抗体の製造方法において、 HM1.24抗原に対する抗体（抗匪 1.24抗体）をコードする核酸が導入された糖鎖へのフコース付加能力を欠失した細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法。

1 1 . 請求項 7に記載の抗体の製造方法において、 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ III (GnTIII ) をコードする核酸を導入した宿主細胞を培養し、当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法。

1 2 . 請求項 8に記載の抗体の製造方法において、 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ III (GnTIII ) をコードする核酸を導入した糖鎖へのフコース付加能を欠失した細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法。