WO2005012259A1 - オステオポンチン産生抑制方法 - Google Patents

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WO2005012259A1
WO2005012259A1 PCT/JP2004/010810 JP2004010810W WO2005012259A1 WO 2005012259 A1 WO2005012259 A1 WO 2005012259A1 JP 2004010810 W JP2004010810 W JP 2004010810W WO 2005012259 A1 WO2005012259 A1 WO 2005012259A1
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phenyl
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alkoxy
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Yukihiko Saeki
Yuichiro Tabunoki
Tomoyuki Koshi
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Kowa Co., Ltd.
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    • C07D237/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazine or hydrogenated 1,2-diazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D237/14—Oxygen atoms

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing the production of osteovontin, and more particularly to a method for preventing and treating diseases associated with increased production of osteovontin, for example, multiple myeloma and urolithiasis.
  • Osteopontin (hereinafter abbreviated as OPN) is a secreted phosphoglycoprotein that was initially identified as an extracellular matrix of bone, and in cells, osteoclasts, macrophages, activated T cells, and smooth cells. It is expressed in muscle cells, epithelial cells, etc., and expressed in tissues such as bone, kidney, placenta, smooth muscle, and secretory epithelium.
  • OPN has an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence and binds via avi31, ⁇ 3 and 5 integrins in various cells to induce adhesion, chemotaxis and signal transduction. It has been pointed out that OPN is involved in physiological diseases, which are known to be normal in the process of normal tissue repair such as promotion of bone absorption, promotion of angiogenesis, wound healing, and tissue damage.
  • Non-Patent Document 1 restenosis after PTCA (Non-Patent Document 1), renal disease (Non-Patent Document 2), tuberculosis (Non-Patent Document 3), sarcoidosis (Non-Patent Document 3).
  • Non-patent Document 5 chronic liver diseases such as cirrhosis (Non-patent Document 5), various cancers shown below; colon cancer (Non-patent Document 6), ovarian cancer (Non-patent Document 7), prostate cancer (Non-patent Document 8) ), Breast cancer (Non-patent document 9), and urinary calculus (Non-patent document 10) are known, as well as myeloma-type tumors (especially multiple myeloma) as described in Examples below. However, it can be expected that the prevention or treatment effect of these diseases can be obtained by suppressing the production or inhibiting the function of ⁇ PN.
  • PPAR y agonists Non-Patent Document 11
  • HMG-CoA reductase inhibitors Non-Patent Document 12
  • OPN production inhibitors or inhibitors include troglitazone, piglitazone, rosiglitazone, etc.
  • HMG_CoA reductase inhibitors include rospastatin, lovastatin, And ampastatin, pravastatin, full pastatin, atorvastatin, cerivastatin, pitapastatin, mepastatin and the like.
  • few compounds with OPN production inhibitory action are known.
  • Non-Patent Document l Circ. Res. 2002 Jul. 12; 91 (1): 77-82
  • Non-Patent Document 2 Am. J. Hypertens. 2003 Mar .; 16 (3): 214-22
  • Non-Patent Document 3 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2003 May 15; 167 (10): 13
  • Non-Patent Document 4 Lung. 2001; 179 (5): 279—91
  • Non-Patent Document 5 Biochem.Biophys.Res.Commun. 1999 Mar. 24; 256 (3): 5 27-31
  • Non-Patent Document 6 J. Natl. Cancer Inst. 2002 Apr. 3; 94 (7): 513-21
  • Non-Patent Document 7 JAMA. 2002 Apr. 3; 287 (13): 1671-9
  • Non-Patent Document 8 Clin.Cancer Res. 1999 Aug; 5 (8): 2271-7
  • Non-Patent Document 9 Clin. Cancer Res. 1997 Apr .; 3 (4): 605-11
  • Non-Patent Document 10 J. Biol. Chem. 1993 Jul. 15; 268 (20): 15180-4
  • Non-Patent Document 12 Br. J. Pharmacol. 2001; 133: 83-88
  • An object of the present invention is to provide a novel method for suppressing OPN production.
  • the present invention provides a compound represented by the general formula (I) [0008] [Formula 1]
  • R 1 represents a halogen atom or an alkoxy group having a carbon number of 1 to 13 substituted with 1 to 3, a phenyl group, a phenyl group or a pyridinole group:
  • R 2 is substituted with a C 16 alkoxy group or a C 16 alkylthio group at the 4-position, and a halogen atom, a C 16 alkoxy group and a C 16 Represents a phenyl group which may be substituted with one or two selected from the alkylthio groups represented by:
  • R 3 is a hydrogen atom; an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; an alkyl halide group having 1 to 6 carbon atoms; a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms; a halogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; 113 selected from an alkoxy group having 16 carbon atoms, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms, a nitro group, an amino group, an alkylamino group having 16 carbon atoms and an alkylthio group having 16 carbon atoms A phenyl group, a pyridinole group or a phenyloxy group which may be substituted; a piperidino group, a piperidyl group, a piperazino group or a monorefolino group which may have a substituent; A minocarbonyl group; an alkylcarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms; or
  • A represents a single bond; a linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms; or a linear or branched alkenylene group having 2 to 9 carbon atoms:
  • X represents an oxygen atom or a sulfur atom.
  • R 3 is a halogenated alkyl group having 16 carbon atoms, A is a single bond.
  • a method of inhibiting ⁇ PN production which comprises administering an effective amount of a pyridazine derivative represented by the formula (1) or a salt thereof.
  • the present invention also provides a ⁇ PN production inhibitor comprising the pyridazine derivative represented by the above general formula (I) or a salt thereof as an active ingredient, and an agent for preventing or treating a disease associated with enhanced OPN production. .
  • the present invention also provides use of the pyridazine derivative represented by the above general formula (I) or a salt thereof for the production of an OPN production inhibitor and a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with enhanced OPN production. It is.
  • the present invention provides an OPN production inhibitor composition
  • the present invention provides a method for treating a disease associated with enhanced OPN production, which comprises administering a pyridazine derivative represented by the above general formula (I) or a salt thereof.
  • an osteobontin production inhibitor which is useful for the prevention and treatment of diseases associated with osteobontin production, for example, multiple myeloma and urinary calculus.
  • FIG. 1 shows the results of immunocytochemical staining of osteobontin in multiple myeloma-derived bone marrow cells (left) and control group (MGUS) (right).
  • FIG. 2 shows MGUS (A), myelodysplastic syndrome (MDS) (B), idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) (C), acute myeloid leukemia (AML) (D),
  • FIG. 3 shows the results of immunocytochemical staining of osteovontin in gonadotrophic erythrocytosis (HSC) (E).
  • FIG. 3 is a diagram showing expression of osteopontin (OPN) and GAPDH in various cell lines by RT-PCR.
  • FIG. 4 is a diagram showing the expression of osteopontin (OPN) in various cells by Western blotting.
  • FIG. 5 is a diagram showing the distribution of osteobontin concentration in plasma of patients with multiple myeloma (MM), MGUS, and healthy subjects.
  • Fig. 6 is a diagram showing plasma osteobontin concentrations in multiple myeloma patients at stage I, stage II (inactive) and stage II I (active).
  • FIG. 7 is a graph showing the difference in plasma osteovontin concentration in patients with multiple myeloma depending on the presence or absence of bone pain.
  • Figure 8 shows plasma osteoscopy of patients with multiple myeloma with or without bone resorbable bone destruction. It is a figure which shows the difference of a bontin density
  • the pyridazine derivative represented by the general formula (I) or a salt thereof used in the present invention has an excellent interleukin-11 ⁇ production inhibitory action as described in International Publication No. W099Z25697.
  • it is known to be useful as a preventive and therapeutic agent for various diseases such as immune system diseases and inflammatory diseases caused by enhanced interleukin-11 ⁇ production.
  • it is not known at all whether the compound represented by the general formula (I) has a ⁇ production inhibitory action.
  • the contents of International Publication No.W099 / 25697, such as the method for producing compound (I) and the method for preparing a preparation containing compound (I) as an active ingredient, are incorporated herein by reference. .
  • R 1 is a phenyl group or a pyridyl group which may be substituted by 113 selected from a halogen atom and an alkoxy group having 116 carbon atoms.
  • the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
  • the C16 alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an isopropoxy group and the like. These substituents are preferably present at the 3, 4 or 5 positions.
  • R 2 is an alkoxy group or an alkylthio group having 1 one 6 carbon number 1 one 6 carbon atoms substituted at its 4-position, further halogen atom at another position, an alkoxy group having 1 one 6 carbon atoms and carbon
  • One or two selected from the alkylthio groups of formulas (1) to (6) are a substituted or unsubstituted phenyl group.
  • the alkylthio group having 16 carbon atoms, which is a substituent on the phenyl group of R 2 includes a methylthio group, an ethylthio group, a propylthio group, an isopropylthio group and the like.
  • halogen atom and the alkoxy group having 16 carbon atoms which are substituents on the phenyl group of R 2 , are the same as those described above for R 1 . These substituents are preferably present only in the 4-position, 3- and 4-positions, or 3-, 4- and 5-positions.
  • R 3 is a hydrogen atom; an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms; a halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms; a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms; a halogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms Selected from an alkoxy group having 16 carbon atoms, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group having 2-7 carbon atoms, a nitro group, an amino group, an alkylamino group having 16 carbon atoms and an alkylthio group having 16 carbon atoms 1- to 3-substituted phenyl, pyridinole or phenyl A alkoxy group; a piperidino group, a piperidyl group, a piperazino group or a monoreholino group which may have a substituent; a substituted or unsubstituted amino group; an alkylcarbonyl group having 2 to 7 carbon
  • examples of the alkoxy group and halogen atom having a carbon number of 16 include the same as those described above for R 1 .
  • the alkylthio group having 1 one 6 carbon like et be the same as the R 2.
  • examples of the halogenated alkyl group having 1 one 6 carbon atoms include those halogen atoms mentioned in the previous Symbol R 1 an alkyl group having 1 one 6 carbon atoms and 1 one three substituents.
  • Examples of the cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, and a cyclohexyl group.
  • Examples of the alkyl group having 16 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and an n-butyl group.
  • Examples of the alkoxycarbonyl group having 27 carbon atoms include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, and a propoxycarbonyl group.
  • the alkylamino group having 16 carbon atoms has one or two alkyl groups having 116 carbon atoms, and examples thereof include a methylamino group, a dimethylamino group, an ethylamino group, and a propylamino group.
  • Examples of the group that can be substituted with a piperidino group, a piperidyl group, a piperazino group, or a morpholino group include a halogen atom, a C 16 alkoxy group, and a C 16 alkyl group.
  • Examples of the group which can be substituted with an aminocarbonyl group include an alkyl group having 16 to 16 carbon atoms, an alkoxy group having 116 carbon atoms, and an aralkyl group having 6 to 12 carbon atoms such as a benzyl group and a phenethyl group.
  • Examples of the alkylcarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms include a methylcarbonyl group and an ethylcarbonyl group.
  • examples of the linear or branched alkylene group having 16 carbon atoms include a methylene group, an ethylene group, and a trimethylene group.
  • the straight-chain or branched alkenylene group having 2 to 9 carbon atoms is preferably a straight-chain or branched alkenylene group having 2 to 9 carbon atoms and having 13 double bonds, for example, an ethylene group, a propenylene group, a butenylene group. And butagelenylene groups.
  • R 1 is a phenyl group or a pyridyl group which may be substituted at the 4-position with a halogen atom selected from fluorine, chlorine and bromine, or an alkoxy group having a carbon number of 116.
  • R 2 is a phenyl group substituted with a C 16 alkoxy group or a C 16 alkylthio group at the 4-position
  • R 3 is a phenyl group which may be substituted with a hydrogen atom or a halogen atom, or
  • R 1 is a phenyl or pyridyl group optionally substituted with a chlorine atom or a methoxy group at the 4-position:
  • R 2 is a methoxy group or a methylthio group at the 4-position Is a substituted phenyl group:
  • R 3 is a hydrogen atom, phenyl group, 4-chlorophenyl group, 2_pyridyl group or 3_pyridyl group: A force S methylene group, ethylene group or 2_propyl group Those which are nylene groups are most preferred.
  • the active ingredient is 5_ (4-chlorophenyl) -6_ [4- (methylthio) phenyl] _2_ (2-pyridylmethyl) _2H-pyridazine-3-thione, 5_ (4-chlorophenyl) _6_ [4- (Methylthio) phenyl] _2_ (3-pyridylmethyl) -2H-pyridazine—3—one, 5,6-bis (4-methoxyphenyl) —2— Cinnamyl) — 2H—pyridazin-3_one, 2_benzyl-5_ (4_chlorophenyl) —6_ [4_ (methylthio) phenyl] _2H—pyridazin-3_one, 2_ (4-cyclobenzyl) _6_ (4- (methoxyphenyl) -5- (4-pyridinyl) -2H-pyridazin-3-one, 5,6
  • the salt of the pyridazine derivative (1) used in the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt.
  • hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide Acid addition salts of mineral acids such as sulphates, nitrates, phosphates, or benzoates, methanesulphonates, ethanesulphonates, benzenesulphonates, p-toluenesulphonates, succinates, Acid addition salts of organic acids such as maleate, fumarate, tartrate, citrate and the like can be mentioned.
  • the compound used in the present invention may also exist in the form of a solvate represented by a hydrate, that is, in the form of a tautomer of ketoenol. Such a solvate and isomer may also be present in the present invention. Included in the invention.
  • the pyridazine derivative (1) or a salt thereof has excellent ⁇ PN production suppression and production as shown in Examples described below, and is associated with ⁇ PN production enhancement such as restenosis after PTCA, renal disease, Conclusion Chronic liver diseases such as nucleus, sarcoidosis, cirrhosis, etc., various cancers shown below; colorectal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, etc. It is useful as a 'preventive' therapeutic agent.
  • the medicament of the present invention contains the above-mentioned pyridazine derivative (1) or a salt thereof as an active ingredient, and may be administered in the form of a tablet, capsule, granule, powder, syrup or the like.
  • Parenteral administration by administration or intravenous injection, intramuscular injection, suppository, inhalant, percutaneous absorption, eye drops, nasal drops and the like can be mentioned.
  • the active ingredient is pharmaceutically acceptable.
  • Carrier can be compounded.
  • Such carriers include excipients, binders, extenders, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, flavoring agents, fragrances, coating agents, carriers, diluents and the like as appropriate. They can be used in combination.
  • the dosage of the medicament of the present invention varies depending on age, body weight, symptoms, administration form, number of administrations, and the like. It is preferable to administer 000 mg, preferably 0.1 to 100 mg orally or parenterally in one or several divided doses.
  • MGUS monoclonal gammopaties with uncert ain significance
  • Blood disease Bone marrow cells from five affected patients were used. Bone marrow cells were isolated by density gradient centrifugation. 1 ⁇ 10 5 bone marrow cells from each patient prepared therefrom were fixed on glass slides using Cytospin2 (Shando n Soutern Products Ltd, Cheshire, UK).
  • mice were stored at 80 ° C until use.
  • the mouse anti-human osteopontin monoclonal IgG antibody (4C1) (J. Cellular Biochemistry 2002; 84: 420-432) prepared by the present inventors was used as a primary antibody.
  • Piotinylated anti-mouse IgG antibody (Vector, Laboratories, Burlingame, USA) was used as a secondary antibody. Cytospin-treated slides were immersed in cold isopropanol for 2 minutes to fix the cells.
  • MGUS Myelodysplastic syndrome
  • Photo B myelodysplastic syndrome
  • Photo C idiopathic thrombocytopenic purpura
  • Photo D acute myeloid leukemia
  • Photo E hereditary In myelocytic erythrocytosis
  • no bone marrow cells of any origin showed any staining showing osteobontin expression.
  • osteobontin is specifically expressed in myeloma cells.
  • Example 2 (Analysis of osteobontin by RT-PCR method) B cell lineage cells of different stages (RPMI8226; myeloma cell line, Daudi; lymphoblastoid B cell line derived from Burkitt lymphoma, Ramos; lymphoblast B cell line derived from Burkitt lymphoma, Raji; derived from Burkitt lymphoma
  • the expression of osteopontin mRNA in lymphoblast B cell line, Kopn-8; pre-B cell line, NALM_16; pro_B cell line, Reh; pro_B cell line) was determined by using a specific primer (sense probe) designed from human osteopontin.
  • the primers were examined by RT-PCR using 5'-GGACTCCATT GACTCGAACG-3 '(SEQ ID NO: 1) and an antisense primer; 5'-TAATCTGGACTGCTTGTGGC-3' (SEQ ID NO: 2).
  • 100 ng of mRNA was purified from each cell line using TRIZOL reagent (Life Technologies, Rockville, USA), and each cDNA was synthesized therefrom.
  • PCR was performed using the osteobontin-specific primer under the following conditions. That is, denaturation was performed at 94 ° C for 1 minute, annealing was performed at 57 ° C for 1 minute, and extension was performed at 72 ° C for 2 minutes. This cycle was repeated 30 times.
  • primers specific to GAPDH (Glyceraldehyde_3_Phosphate dehydrogenase) (sense primer; 5, _AATTACCACAACCCCTACAAAC_3, (SEQ ID NO: 3), antisense primer; 5′—CAACTCTGCAACATCTTCCTC—3 ′ (SEQ ID NO: 4)) were used.
  • the PCR products were electrophoresed on a 2% agarose gel to check for the presence of bands.
  • a perforated anti-human osteopontin antibody (OPN2) (J Cell Biochem 2000; 77: 487-498) prepared by the present inventors was added and reacted overnight at 4 ° C. After washing, HRP-labeled goat anti-Peacock IgG antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing, the film was exposed to light using a Renaissance reagent (NEN Life Science Products, Boston, USA) to detect a signal.
  • the osteopontin band was observed only in RPMI8226, but not in other cells.
  • osteobontin is specifically expressed in myeloma cell lines and not expressed in other tumor lines.
  • Plasma osteopontin concentrations in 30 multiple myeloma patients were measured using a human osteopontin ELISA kit (Immuno-Biological Laboratories ⁇ Gunma, Japan). As a control, plasma collected from 21 MGUS patients and 30 healthy volunteers was used. Data are shown as mean soil standard error. Mann-Whitney U
  • the test was performed using Test. When the p-value was less than 0.05 (when the risk factor was less than 5%), it was considered significant.
  • the plasma osteovontin concentration of the multiple myeloma patient showed a significantly higher value than that of the MGUS patient or a healthy subject.
  • Plasma osteobontin concentration mean soil standard error ng / mL; multiple myeloma 1053 ⁇ 957, MGUS 355 ⁇ 205, healthy subject 309 ⁇ 184;
  • FIG. 6 shows that multiple myeloma patients were classified into Stage 1 (6), Stage II (inactive) (12), and Stage ⁇ (active) according to the classification of Durie & Salmon (Cancer 1975; 36: 842-54).
  • FIG. 9 shows the results of comparison of plasma osteobontin concentration in three clinical stages (sex) (12 subjects). As is evident from FIG. 6, the plasma osteobontin level of patients with multiple myeloma showed a significant increase depending on the stage and activity.
  • Stage III (activity) vs. Stage I, Stage II (inactivity) * p
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of comparing the plasma osteobontin concentration of multiple myeloma patients between the two groups.
  • One group consisted of patients with little or no bone pain, and the other gnolepe consisted of patients with significant bone pain. Patients with significant bone pain had significantly higher plasma levels of osteovontin compared to less painful gnorape.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of comparison of the plasma osteobontin concentration of patients with multiple myeloma between the two groups.
  • One group consisted of patients whose magnetic resonance imaging (MRI) had little or no bone resorbable bone destruction.
  • the other group consisted of patients with remarkable bone resorbable bone destruction.
  • the plasma osteobontin concentration of gnolape which shows remarkable bone resorbable osteolysis, was significantly higher than that of the group, and was significantly higher than that of the group.
  • Example 12 (5,6_bis (4-methoxypheninole) -2_ (4_clocincinamyl) _2H-pyridazine_3_one, hereinafter referred to as compound 3) in the publication,
  • Example 51 (2 —Benzyl_5_ (4-chlorophenyl) —6_ [4_ (methylthio) phenyl] —2H-pyridazin-3-one (hereinafter referred to as compound 4)
  • Example 78 (2- (4 Diphenyl) -6- (4- (methoxyphenyl) _5_ (4-pyridyl) -2H-pyridazine_3_one, hereinafter referred to as compound 5), and
  • Example 163 (5,6_bis (4-methoxypheny
  • the compound 1-16 was dissolved in dimethylsulfoxide (DMS ⁇ ) to prepare a 20 mmol ZL solution of each compound. It was further diluted with DMSO to prepare 6, 2, 0.6, and 0.2 mmol / L solutions of each compound. Each of the prepared concentrations (0.2 to 20 mmol / L), a DMSS solution of each compound (116), or DMSO (as a group to which no conjugate was added) was added to a medium (10% fetal bovine serum). FBS) supplemented RPMI-1640 medium) and diluted 1000-fold, and 0 (non-supplemented group), 0.2, 0.6, 2, 6, 20 zmol / L of each compound (1-6) Solutions were each prepared.
  • DMS ⁇ dimethylsulfoxide
  • a 2 ⁇ 10 5 cellsZmL cell suspension of RPMI8226 cells was prepared and seeded at 2 mL each in a 6-well plate.
  • each well After the culture, the cells in each well were collected, the number of cells was counted for each well, and each was again prepared as a suspension of 2 ⁇ 10 5 cells / mL. The seeds were inoculated at 0.5 mL each.
  • each solution corresponding to the same concentration as in the above culture (concentration 0 (non-addition group) of compound 16), 0.2, 0.6, 2, 6, 20 Ai mol / L
  • Each solution was prepared in the same manner as in the previous culture, added to each well in an amount of 0.5 mL, and mixed, and then cultured at 37 ° C in the presence of 5% CO for 3 days as a late culture.
  • the culture supernatant was collected for each well, and the ⁇ PN concentration in the culture supernatant was measured by ELIS A method (Human Osteopontin measurement kit IBL, Immune Biological Laboratory Co., Ltd.). It was quantified using a photometer.
  • the obtained measured values were analyzed by the following procedure using the SAS preclinical package Version 5.0. That is, the concentration was converted to a logarithm (the compound-free group (0 ⁇ mol / L) was replaced with lpmol / L), and the measured values (6 concentrations, 2 measured values for each concentration, 12 measured values in total) were used. Fitting to the dystic curve was performed. From the obtained curve, the concentration at which the reaction rate is 50% ( IC) was calculated. Table 1 shows the results.

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Description

明 細 書
ォステオボンチン産生抑制方法
技術分野
[0001] 本発明は、ォステオボンチン産生抑制方法に関し、詳細には、ォステオボンチン産 生亢進に伴う疾患、例えば、多発性骨髄腫や尿路結石等の予防 ·治療方法に関す る。
背景技術
[0002] ォステオポンチン（osteopontin ;以下、 OPNと略す）は、当初、骨の細胞外基質と して同定された分泌型リン糖タンパク質であり、細胞では破骨細胞、マクロファージ、 活性化 T細胞、平滑筋細胞、上皮細胞等で、組織では骨、腎臓、胎盤、平滑筋、分 泌上皮等で発現してレ、る。 OPNはアルギニン一グリシン—ァスパラギン酸（RGD)配 列を有し、各種の細胞において a v i3 1、 β 3及び 5インテグリンを介して結合し、 接着、走化、シグナル伝達を誘導する。 OPNの作用として、生理的なものでは骨吸 収促進、血管新生促進、創傷治癒、組織障害などにおける正常な組織修復過程等 が知られている力 疾患への関与についても指摘されている。
[0003] 血中あるいは組織中 OPNの増加が関与する疾患としては、 PTCA後の再狭窄（非 特許文献 1)、腎疾患 (非特許文献 2)、結核 (非特許文献 3)、サルコイドーシス (非特 許文献 4)、肝硬変 (非特許文献 5)等の慢性肝疾患、以下に示す各種の癌;大腸癌 ( 非特許文献 6)、卵巣癌 (非特許文献 7)、前立腺癌 (非特許文献 8)、乳癌 (非特許文 献 9)等、あるいは尿路結石（非特許文献 10)等が知られている他、後記実施例に示 すようなミエローマ系腫瘍（特に多発性骨髄腫）があるが、〇PNの産生抑制あるいは 機能阻害を実現することにより、これらの疾患の予防又は治療効果が得られるものと 期待できる。
[0004] OPN産生抑制剤又は阻害剤として知られているものとして、 PPAR yァゴニスト（ 非特許文献 11)及び HMG - CoA還元酵素阻害剤（非特許文献 12)等が挙げられる 。 PPAR yァゴニストとしては、トログリタゾン、ピ才グリタゾン及びロシグリタゾン等が 挙げられ、 HMG_CoA還元酵素阻害剤としては、ロスパスタチン、ロバスタチン、シ ンパスタチン、プラバスタチン、フルパスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ピ タパスタチン及びメパスタチン等が挙げられる。し力し、 PPARyァゴニストや HMG— CoA還元酵素阻害剤以外に、 OPN産生抑制作用を有する化合物はあまり知られて いない。
非特許文献 l:Circ. Res.2002 Jul.12； 91 (1)： 77-82
非特許文献 2:Am. J. Hypertens.2003 Mar. ； 16 (3)： 214-22
非特許文献 3:Am. J. Respir. Crit. Care Med.2003 May 15 ; 167 (10) : 13
55-9
非特許文献 4: Lung.2001 ;179 (5) :279— 91
非特許文献 5:Biochem. Biophys. Res. Commun.1999 Mar.24 ;256 (3) :5 27-31
非特許文献 6:J. Natl. Cancer Inst.2002 Apr.3 ; 94 (7) : 513-21 非特許文献 7:JAMA.2002 Apr.3 ; 287 (13) : 1671-9
非特許文献 8:Clin. Cancer Res.1999 Aug; 5 (8) : 2271-7
非特許文献 9:Clin. Cancer Res.1997 Apr. ;3(4) :605—11
非特許文献 10:J. Biol. Chem.1993 Jul. 15 ; 268 (20) : 15180—4
非特許文献 ll:Circ. Res.2002 ; 90 : 348— 355
非特許文献 12: Br. J. Pharmacol.2001 ; 133 : 83—88
発明の開示
[0005] 本発明の目的は、新規な OPN産生抑制方法を提供することにある。
[0006] 力、かる実状に鑑み、本発明者らは鋭意検討した結果、全く意外にもインターロイキ ン一 1 β産生抑制作用を有することで知られる後記一般式 (I)の化合物に、〇ΡΝ産 生抑制作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち、本発明は、一般式 (I) [0008] [化 1]
Figure imgf000005_0001
( I )
[0009] (式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2— 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基；置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モノレホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合；炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基；又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩の有効量を投与することを特徴とする〇PN 産生抑制方法を提供するものである。
[0010] また本発明は、上記一般式 (I)で表されるピリダジン誘導体又はその塩を有効成分 とする〇PN産生抑制剤及び OPN産生亢進に伴う疾患の予防治療剤を提供するも のである。 [0011] また本発明は、上記一般式 (I)で表されるピリダジン誘導体又はその塩の OPN産 生抑制剤及び OPN産生亢進に伴う疾患の予防治療剤製造のための使用を提供す るものである。
[0012] また本発明は、上記一般式 (I)で表されるピリダジン誘導体又はその塩及び薬学的 に許容される担体を含有する OPN産生抑制剤組成物及び〇PN産生亢進に伴う疾 患の予防治療剤組成物を提供するものである。
[0013] さらに本発明は、上記一般式 (I)で表されるピリダジン誘導体又はその塩を投与す ることを特徴とする、 OPN産生亢進に伴う疾患の処置方法を提供するものである。
[0014] 本発明によれば、ォステオボンチン産生を伴う疾患、例えば、多発性骨髄腫や尿路 結石等の予防 '治療に有用な、ォステオボンチン産生抑制剤を提供することができる 図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は、多発性骨髄腫由来骨髄細胞 (左）及び対照群（MGUS) (右）における ォステオボンチンの免疫細胞化学染色結果を示す図である。
[図 2]図 2は、 MGUS (A)、脊髄形成異常症候群 (MDS) (B)、特発性血小板減少 性紫斑病（ITP) (C)及び急性骨髄性白血病 (AML) (D)、遺伝性球状赤血球症 (H SC) (E)におけるォステオボンチンの免疫細胞化学染色結果を示す図である。
[図 3]図 3は、 RT—PCR法による、種々の細胞系におけるォステオポンチン（OPN) 及び GAPDHの発現を示す図である。
[図 4]図 4は、ウェスタンブロッテイング法による、種々の細胞におけるォステオポンチ ン（OPN)の発現を示す図である。
[図 5]図 5は、多発性骨髄腫患者（MM)、 MGUS及び健常人の血漿中ォステオボン チン濃度分布を示す図である。
[図 6]図 6は、多発性骨髄腫患者のステージ I、ステージ II (非活動性)及びステージ II I (活動性）における血漿中ォステオボンチン濃度を示す図である。
[図 7]図 7は、多発性骨髄腫患者の骨疼痛の有無による血漿中ォステオボンチン濃 度の差を示す図である。
[図 8]図 8は、多発性骨髄腫患者の骨吸収性骨破壊像の有無による血漿中ォステオ ボンチン濃度の差を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明で使用する一般式 (I)で表されるピリダジン誘導体又はその塩は、国際公開 番号 W099Z25697号公報に記載されているように優れたインターロイキン一 1 β産 生抑制作用を有し、インターロイキン一 1 β産生亢進に起因する免疫系疾患、炎症性 疾患等の各種疾患の予防 ·治療剤として有用であることが知られている。しかし、一 般式 (I)で表わされる化合物が ΟΡΝ産生抑制作用を有するか否かは、全く知られて いない。なお化合物 (I)の製造方法や、化合物 (I)を有効成分として含有する製剤の 調製方法等、国際公開番号 W099/25697号公報記載の内容は、本明細書の一 部としてここに引用する。
[0017] 一般式 (I)中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1 一 3個が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基である。ここで、ハロゲン原子 としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。炭素数 1一 6のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキ シ基等が挙げられる。これらの置換基は 3, 4又は 5位に存在するのが好ましい。
[0018] R2は、その 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基 が置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換してレ、てもよレ、フエニル基であ る。ここで R2のフエニル基上の置換基である炭素数 1一 6のアルキルチオ基としては、 メチルチオ基、ェチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基等が挙げられる。 また R2のフエニル基上の置換基であるハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ 基としては、前記 R1と同様のものが挙げられる。これらの置換基は、 4位のみ、 3位と 4 位、又は 3位と 4位と 5位に存在するのが好ましい。
[0019] R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2— 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基；置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モノレホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示す。
[0020] ここで、炭素数 1一 6のアルコキシ基、ハロゲン原子としては、前記 R1と同様のもの が挙げられる。炭素数 1一 6のアルキルチオ基としては前記 R2と同様のものが挙げら れる。炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基としては、炭素数 1一 6のアルキル基に前 記 R1で示したハロゲン原子が 1一 3個置換したものが挙げられる。炭素数 3— 6のシク 口アルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロ へキシル基が挙げられる。
[0021] 炭素数 1一 6のアルキル基としては、例えばメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、ィ ソプロピル基、 n—ブチル基等が挙げられる。炭素数 2 7のアルコキシカルボニル基 としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボ二 ル基等が挙げられる。炭素数 1一 6のアルキルアミノ基としては、炭素数 1一 6のアル キル基を 1又は 2個有するもので、例えばメチルアミノ基、ジメチルァミノ基、ェチルァ ミノ基、プロピルアミノ基等が挙げられる。
[0022] ピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基又はモルホリノ基に置換し得る基としては 、ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基、炭素数 1一 6のアルキル基が挙げられ る。ァミノカルボニル基に置換し得る基としては、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素数 1一 6のアルコキシ基の他、ベンジル基、フエネチル基等の炭素数 6— 12のァラルキ ル基が挙げられる。炭素数 2— 7のアルキルカルボニル基としては、メチルカルボ二 ル基、ェチルカルボニル基等が挙げられる。
[0023] Aで示されるもののうち、炭素数 1一 6の直鎖又は分岐状のアルキレン基としては、 例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基等が挙げられる。また、炭素数 2— 9の 直鎖又は分岐状のアルケニレン基としては、好ましくは炭素数 2— 9で二重結合を 1 一 3個有するもので、例えばエテュレン基、プロぺニレン基、ブテニレン基、ブタジェ 二レン基等が挙げられる。
[0024] また、一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は 炭素数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり： R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換し たフエニル基であり： R3が水素原子又はハロゲン原子が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり： Aが炭素数 1一 2のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ 二レン基であるものがさらに好ましい。
[0025] さらに、一般式（1 )中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフ ェニル基又はピリジル基であり： R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフ ェニル基であり： R3が水素原子、フエ二ル基、 4—クロロフヱニル基、 2_ピリジル基又は 3_ピリジル基であり： A力 Sメチレン基、エチレン基又は 2_プロぺニレン基であるものが 最も好ましい。
[0026] さらにまた、より具体的には、有効成分が 5_ (4—クロロフヱ二ル)— 6_[4—(メチルチ ォ）フエニル] _2_ (2—ピリジルメチル）_2H—ピリダジン— 3—チオン、 5_ (4—クロロフ ヱニル） _6_ [4— (メチルチオ）フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル）—2H—ピリダジン— 3 —オン、 5, 6—ビス（4ーメトキシフエ二ル）— 2— (4—クロ口シンナミル）— 2H—ピリダジン一 3_オン、 2_ベンジルー 5_ (4_クロ口フエ二ル）— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル ]_2H —ピリダジン一 3_オン、 2_ (4—クロ口ベンジル) _6_ (4- (メトキシフエ二ル)—5— (4—ピ リジニル）—2H—ピリダジン一 3—オン、 5, 6—ビス（4ーメトキシフエ二ル）— 2—ェチルー 2 H—ピリダジン一 3—オン又はそれらの塩である請求項 1記載の方法が特に好ましい。
[0027] また、本発明に用いられるピリダジン誘導体（1 )の塩としては、薬学上許容される塩 であれば特に制限されないが、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫 酸塩、硝酸塩、リン酸塩のような鉱酸の酸付加塩、又は安息香酸塩、メタンスルホン 酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩、シユウ 酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クェン酸塩のような有機酸の酸付加塩 などが挙げられる。
[0028] また、本発明に用いられる化合物は、水和物に代表される溶媒和物の形態ゃケトー ェノールの互変異性体の形態でも存在し得るが、かかる溶媒和物及び異性体も本発 明に包含される。
[0029] ピリダジン誘導体（1 )又はその塩は、後記実施例に示すように優れた〇PN産生抑 制作用を有し、〇PN産生亢進に伴う疾患、例えば PTCA後の再狭窄、腎疾患、結 核、サルコイドーシス、肝硬変等の慢性肝疾患、以下に示す各種の癌；大腸癌、卵巣 癌、前立腺癌、乳癌等、あるいは尿路結石等の他、ミエローマ系腫瘍 (特に多発性骨 髄腫)等の予防'治療剤として有用である。
[0030] 本発明の医薬は、前記ピリダジン誘導体（1)又はその塩を有効成分とするものであ り、この投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤など による経口投与又は静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐薬、吸入薬、経皮吸収剤、点眼 剤、点鼻剤などによる非経口投与が挙げられる。このような種々の剤型の医薬組成 物を調製するにあたっては、この有効成分に薬学的に許容され
る担体を配合することができる。かかる担体としては、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊 剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、矯味剤、香料、被膜剤、担体、 希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
[0031] 本発明の医薬の投与量は年令、体重、症状、投与形態及び投与回数などによって 異なるが、通常は成人に対してピリダジン誘導体 (I)又はその塩として 1日 0. 01— 1 000mg、好ましくは 0. 1— lOOmgを 1回又は数回に分けて経口投与又は非経口投 与するのが好ましい。
実施例
[0032] 以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される ものではない。
[0033] 合成例 1
5- (4—クロロフヱニル） _6_ [4- (メチルチオ）フエニル] _2_ (2—ピリジルメチル） _2 H—ピリダジン— 3—チオン メタンスルフォネートの合成
• 5- (4—クロロフヱニル） _6_ [4- (メチルチオ）フエニル] _2_
(2—ピリジルメチル）_2H—ピリダジン _3_オンの合成
5- (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ）フエニル]—2H—ピリダジン _3_オン 5 OOmg (l . 52mmol)の N, N—ジメチルホルムアミド lOmL溶液に炭酸カリウム 525m g (3. 78mmol)、 2_ピコリノレクロリド塩酸塩 300mg (1. 83mmol)をカロえ、 80oCにて 12時間攪拌した。反応液にクロ口ホルム 50mLを加え、水、飽和食塩水の順に洗浄 後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去して得られた残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル /へキサン = 1/1一 2/1)で分離精製し微 黄色アモルファスとして標題化合物 623mg (97.5%)を得た。
[0034] 'H-NMRCCDCl ) δ :2.45(3H、 s)、 5.58(2H、 s)、 6.96(1H、 s)、 7.06-7.
3
ll(6H、m)、 7.21(lH、m)、 7.27-7.33(3H、m)、 7.67(1H、 m)、 8.59( 1H、 m).
IR(KBr) cm—1 ： 1667、 1593、 1584, 1492, 1092.
Mass (m/z) :421 (M+)、 419 (M+).
[0035] · 5_(4—クロロフヱ二ル）— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル] _2_
(2—ピリジルメチル）_2H—ピリダジン— 3—チオンの合成
5- (4—クロロフヱニル） _6_ [4- (メチルチオ）フエニル] _2_ (2—ピリジルメチル） _2 H—ピリダジン— 3—オン 345mg (0.822mmol)のトルエン 5mL溶液に Lawesson' s 試薬 400mg(0.989mmol)をカロえ、 100°Cで 2時間攪拌した。反応液にクロ口ホル ム 30mLをカ卩え、水、飽和食塩水の順に洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶 媒を減圧下留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム /へキサン =4/1一クロ口ホルム）で分離精製し黄色アモルファスとして標題化合物 331mg(92.4%)を得た。
[0036] ^-NMR CDCl ) δ :2.46(3H、 s)、 6.09(2H、 s)、 7.09-7.14(4H、 m)、
3
7.21(1H、 m)、 7.26-7.34(5H、 m)、 7.67(1H、 m)、 7.82 (1H、 s)、 8. 60(1H、 m).
IR(KBr) cm→:1593, 1473、 1159、 1099.
Mass (m/z) :437 (M+)、 435 (M+).
[0037] · 5_(4—クロロフヱ二ル）— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル] _2_
(2—ピリジルメチル）_2H—ピリダジン— 3—チオン メタンスルフォ
ネートの合成
5- (4—クロロフヱニル） _6_ [4- (メチルチオ）フエニル] _2_ (2—ピリジルメチル） _2 H—ピリダジン— 3—チオン 210mg(0.582mmol)のメタノール 2mL溶液に、氷水冷 却下 1 mmol/mLメタンスルホン酸—ジォキサン溶液 0.53mL(0.53mmol)をカロ え、同温度にて 5分間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をメタノール -ェ 一テルから結晶化し、黄色結晶性粉末として標題化合物 248mg (96.8%)を得た。
[0038] 融点： 215.0-217.4。C
'H-NMRCDMSO-D ) δ :2.37 (3H、 s)、 2.45 (3Η、 s)、 6.08 (2Η、 s)、 7.
6
15(2H、d、J = 8.8 Hz)、 7. 19(2H、 d、 J = 8.8 Hz)、 7.31 (2H、 d、 J = 8.8 Hz)、 7.45(2H、 d、J = 8.8 Hz)、 7.53— 7.58 (2H、 m)、 7.80 ( 1H、 s)、 8.06(1H、 m)、 8.68(1H、 m).
IR(KBr) cm→:1228, 1169、 1100.
[0039] 合成例 2
5- (4—クロロフヱニル） _6_ [4- (メチルチオ）フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル） _2 H—ピリダジン _3_オン メタンスルフォネートの合成
5- (4—クロロフヱニル） _6_ [4- (メチルチオ）フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル） _2 H—ピリダジン— 3—オン 226mg(0.583mmol)、 Immol/mLメタンスルホン酸—ジ ォキサン溶液 0.59mL(0.59mmol)より実施例 1_3)の場合と同様に処理しメタノ 一ルーエーテルから結晶化し、微褐色結晶性粉末として標題化合物 268mg (96.5 %)を得た。
[0040] 融点： 184.4-187.1°C
'H-NMRCDMSO-d ) δ :2.35(3H、 s)、 2.45(3Η、 s)、 5.53(2Η、 s)、 7.06
6
(1Η、 s)、 7.10(2Η、 d、J = 8.6 Hz)、 7.17(2H、 d、J = 8.6 Hz)、 7.25 (2H 、d、J = 8.6 Hz)、 7.44(2H、 d、 J =8.6Hz)、 7.93(1H、 dd、 J = 5.6、 8. lHz)、 8.42(1H、 m)、 8.66(1H、 dd、 J =1.2、 5.6Hz)、 8.94(1H、 d、J = 2 .0Hz) .
IR(KBr) cm→:1665, 1227、 1212、 1194、 1156.
[0041] 実施例 1 (ォステオボンチンの免疫細胞化学的検討）
典型的な多発性骨髄腫患者 3名力 採取した骨髄細胞におけるォステオボンチン の発現を、アビジン一ピオチン一パーォキシダーゼ複合体法を用いた免疫細胞化学 白 3手法により検寸し 7こ。メ 照、群として、 monoclonal gammopaties with uncert ain significance (MGUS:単クローン性の免疫グロブリンの増加を認める力 多発 性骨髄腫の診断基準を満たさなレ、もの。 ) を含む多発性骨髄腫とは異なる血液疾 患患者 5名の骨髄細胞を使用した。骨髄細胞は密度勾配遠心法によって単離した。 そこから調製したそれぞれの患者由来の骨髄細胞 1 X 105を、 Cytospin2 (Shando n Soutern Products Ltd、 Cheshire、 UK)を用いてガラス製スライド上に定着 させた。スライドは使用するまで一 80°Cで保管した。今らが作製したマウス抗ヒトォス テオポンチンモノクローナル IgG抗体（4C1) (J. Cellular Biochemistry 2002 ; 8 4 : 420— 432)を 1次抗体として使用した。ォステオボンチンとは無関係の同濃度のマ ウス IgG抗体（Pharmingen、 San Diego, USA)をネガティブコントロールとして 1 次抗体に使用した。ピオチン化ゥマ抗マウス IgG抗体（Vector, Laboratories, Bur lingame、 USA)を 2次抗体として使用した。 Cytospin処理したスライドを冷イソプロ パノール中で 2分間浸して細胞を固定した。 10%正常ゥマ血清を用いてブロッキング した後、 4C1またはネガティブコントロール抗体を 4°Cでー晚反応させた。内因性の パーォキシダーゼ活性を 0. 3%hydrogen peroxidaseメタノール溶液の 30分間処 理により阻害した。 PBS (リン酸緩衝液）で洗浄後ピオチン化 2次抗体を室温で 2時間 反応させた。洗净後 avidin—horseradish peroxidase complex (VECTASTAI N Elite ABC kit, Vector Laboratories Buriingame、 USA)を 1時間反応 させた。その後ジァミノベンゼンテトラヒドロクロリド（DBA)を用いた基質で発色させ、 さらに細胞数の計数のためにギムザ染色を行なった。
[0042] その結果、図 1に示すように、典型的なミエローマ細胞の形態を有していた骨髄細 胞の大部分が、マウス抗ヒトォステオポンチンモノクローナル IgG抗体である 4C1によ つて茶色に染色された (左写真)。一方、コントロール抗体では着色が観察されなか つた (右写真)。
[0043] また、図 2に示すように、 MGUS (写真 A)、脊髄形成異常症候群（写真 B)、特発性 血小板減少性紫斑病（写真 C)、急性骨髄性白血病（写真 D)、遺伝性球状赤血球症 (写真 E)の、どの由来の骨髄細胞にもォステオボンチンの発現を示す染色は認めら れなかった。
[0044] 従って、ォステオボンチンはミエローマ細胞において特異的に発現していることが わ力る。
[0045] 実施例 2 (RT— PCR法によるォステオボンチンの分析） ステージの異なる B細胞系細胞（RPMI8226；ミエローマ細胞系、 Daudi；バーキッ トリンパ腫由来のリンパ芽球様 B細胞系、 Ramos ;バーキットリンパ腫由来のリンパ芽 球 B細胞系、 Raji ;バーキットリンパ腫由来のリンパ芽球 B細胞系、 Kopn-8 ; pre-B 細胞系、 NALM_16 ; pro_B細胞系、 Reh;pro_B細胞系）におけるォステオポンチ ンの mRNA発現を、ヒトォステオボンチンより設計した特異的なプライマー（センスプ ライマー； 5 '— GGACTCCATT GACTCGAACG— 3 ' (配列番号 1 )、アンチセン スプライマー； 5 ' -TAATCTGGACTGCTTGTGGC-3 ' (配列番号 2) )を用いた RT— PCR法により検討した。それぞれの細胞株から TRIZOL試薬（Life Technol ogies、 Rockville, USA)を用いて lOOngの mRNAを精製し、これからそれぞれの cDNAを合成した。 PCRは以下に述べる条件で、ォステオボンチン特異的なプライ マーを用いて行なった。すなわち、 94°C1分間で変性を行ない、 57°C1分間でァニ 一リングし、 72°C2分間で伸長を行なった。このサイクルを 30回繰り返した。対照とし て GAPDH (Glyceraldehyde_3_Phosphate dehydrogenase)に対する特異的 なプライマー（センスプライマー； 5，_AATTACCACAACCCCTACAAAC_3， ( 配列番号 3)、アンチセンスプライマー； 5 '— CAACTCTGCAACATCTTCCTC— 3' (配列番号 4) )を使用した。 PCR産物は 2%ァガロースゲルで電気泳動しバンドの 有無を確認した。
[0046] その結果、図 3に示すように、ミエローマ細胞系である RPMI8226に明確なバンド が認められ、 Daudiにも若干のバンドが認められた。し力し、ミエローマ細胞系ではな い他の細胞系ではォステオポンチンのバンドが認められなかった。
[0047] 実施例 3 (ウェスタンブロッテイング法によるォステオボンチンの分析）
自発的なォステオボンチン産生を検討するために、実施例 2と同様の異なるステー ジの B細胞系を用いて、ウェスタンブロッテイング解析を行なった。それぞれの細胞を in vitroで 3日間培養し、培養上清を採取した。それぞれの細胞の培養上清 20 μ L から、 4— 20%アクリルアミド濃度勾配ゲルを用いた 4時間の SDS— PAGEによりタン パク質を分離したのち、 Immobilon Pメンブレン（Millipore、 Bedford, USA)に 4 。C下でー晚かけてタンパク質をトランスファーした。タンパク質をトランスファーしたメ ンブレンは、 10%スキムミノレクと 0. l%Tween20を含むリン酸緩衝液（PBS)を用い てブロッキングした。メンブレンを洗浄した後、今らが作製した、ゥサギ抗ヒトォステオ ポンチン抗体（OPN2) (J Cell Biochem 2000 ; 77 : 487—498)をカ卩えて 4°Cで 一晩反応させた。洗浄後 HRP標識ャギ抗ゥサギ IgG抗体を加えて室温で 1時間反 応させた。洗浄した後 Renaissance試薬（NEN Life Science Products, Bos ton, USA)を用いてフィルムにー晚かけて感光させてシグナルを検出した。
[0048] その結果、図 4に示すように、ォステオポンチンのバンドは RPMI8226にのみ認め られ、他の細胞では認められなかった。
これら図 3及び図 4より、ォステオボンチンは、ミエローマ細胞株で特異的に発現し ており、他の腫瘍株では発現していないことがわかる。
[0049] 実施例 4 (ELISA法による血漿中ォステオポンチンの定量）
30名の多発性骨髄腫患者の血漿中ォステオボンチン濃度を、ヒトォステオポンチ ン ELISAキット (Immuno—Biological Laboratories^ Gunma、 Japan)を用レヽ て測定した。対照として、 21名の MGUS患者及び 30名の健常者ボランティアより採 取した血漿を使用した。データは平均値土標準誤差で示した。 Mann-Whitney U
Testを用いて検定を行なった。 p値が 0· 05より小さいとき（危険率 5%未満のとき） を有意差ありとした。
[0050] その結果、図 5に示すように多発性骨髄腫患者の血漿中ォステオボンチン濃度は、 MGUS患者や健常者のそれよりも有意な高値を示した。
血漿中ォステオボンチン濃度 平均値土標準誤差 ng/mL ;多発性骨髄腫 1053 ± 957、 MGUS 355 ± 205、健常者 309 ± 184；
多発性骨髄腫対 MGUSおよび健常者 * p < 0. 05
[0051] 図 6は、多発性骨髄腫患者を Durie&Salmonの分類（Cancer 1975 ; 36 : 842- 54)に従って Stage 1 (6名）、 Stage II (非活動性）（12名）、 Stage ΠΙ (活動性）（ 12名）の 3つの臨床ステージに分類して、血漿中ォステオボンチン濃度を比較した結 果を示す図である。図 6から明らかなように多発性骨髄腫患者の血漿中ォステオボン チン濃度は、病期や活動性に依存した有意な上昇を示した。
血漿中ォステオボンチン濃度 平均値土標準誤差 ngZmL ; Stage I 389 ± 89 、 Stage II (非活動性） 816 ±446、 Stage III (活動性） 1991 ± 953、 Stage II (非活動性）対 Stage I * p< 0. 05
Stage III (活動性）対 Stage I、 Stage II (非活動性) * pく 0. 05
[0052] 図 7は、多発性骨髄腫患者の血漿中ォステオボンチン濃度を 2つの集団の間で比 較した結果を示す図である。一方のグループは、ほとんど骨疼痛を感じない患者で、 もう一方のグノレープは顕著な骨疼痛を有する患者で構成した。顕著な骨疼痛を伴う 患者の血漿中ォステオボンチン濃度は、ほとんど痛みを感じないグノレープと比較して 有意な高値を示した。
血漿中ォステオボンチン濃度 平均値土標準誤差 ngZmL;骨疼痛 [一] 776 ± 66 0、骨疼痛 [ + ] 1822± 994；骨疼痛 [ + ]対骨疼痛 [―] * pく 0. 05
[0053] 図 8は、多発性骨髄腫患者の血漿中ォステオボンチン濃度を 2つの集団の間で比 較した結果を示す図である。一方のグループは磁気共鳴映像法 (MRI)によってほと んど骨吸収性の骨破壊像が確認できなかった患者で構成した。もう一方のグループ は顕著な骨吸収性の骨破壊像が確認できた患者で構成した。顕著な骨吸収性骨破 壊像が認められるグノレープの血漿中ォステオボンチン濃度は、ほとんど認められな レ、グループと比較して有意な高値を示した。
血漿中ォステオボンチン濃度 平均値土標準誤差 ng/mL ;骨吸収性骨破壊像 [ ] 486 ± 169、骨吸収性骨破壊像 [ + ] 1498 ±486；骨吸収性骨破壊像 [ + ]対骨吸 収性骨破壊像 [ ] * p< 0. 05
[0054] 実施例 5 (培養細胞を用いた OPN産生抑制作用の検討）
1)使用した化合物
以下の検討には、前記合成例 1及び 2で得られた化合物（以下、それぞれ化合物 1 、化合物 2と表記する）の他、国際公開番号 W099/25697号公報に記載されてい る以下の各化合物、すなわち当該公報中の実施例 12 (5， 6_ビス (4ーメトキシフエ二 ノレ)— 2_(4_クロ口シンナミル )_2H—ピリダジン _3_オン、以下化合物 3と表記する） 、実施例 51 (2—ベンジル _5_ (4—クロロフヱ二ル）— 6_[4_ (メチルチオ）フエ二ル]— 2H—ピリダジン一 3—オン、以下化合物 4と表記する）、実施例 78 (2— (4一クロ口べンジ ノレ) -6- (4- (メトキシフヱニル) _5_ (4—ピリジル)—2H—ピリダジン _3_オン、以下化 合物 5と表記する）、及び実施例 163 (5, 6_ビス（4—メトキシフヱニル)一 2—ェチルー 2 H-ピリダジン- 3-オン、以下化合物 6と表記する）の 4ィ匕合物を、それぞれ記載され た方法に従つて合成して用レヽた。
[0055] 2)化合物の溶液調整
ィ匕合物 1一 6を、 dimethylsulfoxide (DMS〇）に溶解し、各化合物の 20mmolZ L溶液を調整した。さらに DMSOにて希釈し、各化合物の 6、 2、 0. 6、 0. 2mmol/ L溶液を調製した。調製した各濃度（0. 2— 20mmol/L)、各化合物（1一 6)の DM S〇溶液、または DMSO (ィ匕合物非添加群として）を、培地（10%fetal bovine ser um (FBS)添加 RPMI - 1640培地）を用いて 1000倍に希釈し、 0 (非添加群）、 0. 2 、 0. 6、 2、 6、 20 z mol/Lの各化合物（1一 6)の溶液を、それぞれ調製した。
[0056] 3) RPMI8226細胞における、各化合物の〇PN産生抑制作用の検討
RPMI8226細胞の 2 X 105cellsZmL細胞懸濁液を調製し、 6well plateに 2mL ずつ播種した。各 wellに対し、 2)で調製した各溶液 (ィ匕合物 1一 6の、濃度 0 (非添カロ 群）、 0. 2、 0. 6、 2、 6、 20 mol/Lの各溶液）を 2mLずつ添加して混和し、各 wel 1の化合物 1一 6の終濃度を、 0 (非添カ卩群）、 0. 1、 0. 3、 1, 3、 lO /i mol/Lとした。 これら各条件の細胞は、前期培養として 37°C、 5% CO存在下で 3日間培養した。
2
[0057] 前記培養後、各 wellの細胞を回収し、 well毎に細胞数を計数した後、それぞれを 再度 2 X 105cells/mLの懸濁液に調製し、各条件の細胞とも 2wellに 0. 5mLずつ 播種した。各条件の wellには、前記培養時と同濃度に該当する各溶液 (化合物 1一 6の、濃度 0 (非添加群）、 0. 2、 0. 6、 2、 6、 20 Ai mol/Lの各溶液）を、前期培養時 と同様の方法で調製して各 wellに 0. 5mLずつ添加して混和した後、後期培養とし て 37°C、 5% CO存在下で 3日間培養した。
2
[0058] 後期培養終了後、培養上清を well毎に回収し、培養上清中の〇PN濃度を、 ELIS A法（Human Osteopontin測定キット IBL、株式会社免疫生物研究所）にて、吸 光光度計を用いて定量した。
[0059] 得られた測定値は、 SAS前臨床パッケージ Version5. 0を用いて以下の手順で解 析した。すなわち、濃度を対数変換して (化合物非添加群（0 μ mol/L)は lpmol/ L に置き換えた）、測定値 (6濃度、各濃度 2測定値、計 12測定値)を用いた口ジス ティック曲線への当てはめを行なった。得られた曲線から反応率が 50%になる濃度（ IC )を算出した。結果を表 1に示す。
50
[0060] [表 1] 化合物 （番号） I C50 κμτηο 1 /L)
1 2. 09
2 2. 91
3 2. 76
4 2. 56
5 2. 42
6 1. 12
[0061] 表 1に示すように、化合物 1一 6は、いずれも優れた OPN産生抑制作用を示した。

Claims

請求の範囲
一般式 (I)
[化 2]
Figure imgf000019_0001
( I )
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2— 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基;置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モルホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合；炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基；又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩の有効量を投与することを特徴とする OPN 産生抑制方法。
[2] 一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり： R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり：
R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 1 記載の方法。
一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり：
R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フヱニル基、 4—クロロフヱニル基、 2_ピリジル基又は 3_ピリジル基 であり：
Aがメチレン基、エチレン基又は 2—プロぺニレン基である請求項 1記載の方法。 有効成分が 5—（4ークロロフヱニル) _6_[4— (メチルチオ）フエニル] _2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン一 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル)—2H—ピリダジン一 3_オン、 5, 6_ビス（4ーメトキ シフエニル）—2— (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン一 3—オン、 2—ベンジルー 5— ( 4_クロ口フエ二ル)— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル ]_2H—ピリダジン一 3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル) _6_ (4- (メトキシフエ二ル) _5_ (4—ピリジニル)—2H—ピリダジン一 3—オン、 5, 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチルー 2H—ピリダジン一 3—オン又は それらの塩である請求項 1記載の方法。
一般式 (I)
[化 3]
Figure imgf000020_0001
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基;置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モルホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合;炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基;又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩を有効成分とする OPN産生抑制剤。
[6] 一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり：
R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり：
R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 5 記載の抑制剤。
[7] 一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり： R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フエニル基、 4一クロ口フエ二ル基、 2—ピリジル基又は 3—ピリジノレ基 であり：
Aがメチレン基、エチレン基又は 2_プロぺニレン基である請求項 5記載の抑制剤。 有効成分が 5_ (4—クロロフヱニル) _6_[4_ (メチルチオ）フヱニル]— 2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン— 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル）—2H—ピリダジン _3_オン、 5， 6_ビス（4—メトキ シフエニル） -2- (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン _3_オン、 2_ベンジル— 5_ ( 4_クロ口フエニル） _6_[4_ (メチルチオ）フエ二ル]— 2H—ピリダジン _3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル） _6_ (4- (メトキシフエ二ル） _5_ (4—ピリジニル）—2H—ピリダジン— 3—オン、 5， 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチル _2H—ピリダジン— 3—オン又は それらの塩である請求項 5記載の抑制剤。
一般式 (I)
[化 4]
Figure imgf000022_0001
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基；置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モノレホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合；炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基；又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩を有効成分とする OPN産生亢進に伴う疾患 の予防治療剤。
[10] 一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり：
R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり：
R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 9 記載の予防治療剤。
[11] 一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり：
R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フヱニル基、 4—クロロフヱニル基、 2_ピリジル基又は 3_ピリジル基 であり：
Aがメチレン基、エチレン基又は 2—プロぺニレン基である請求項 9記載の予防治療 剤。
[12] 有効成分が 5_ (4—クロロフヱニル) _6_[4_ (メチルチオ）フエニル] _2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン— 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル）—2H—ピリダジン _3_オン、 5， 6_ビス（4—メトキ シフエニル）—2— (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン一 3—オン、 2—ベンジルー 5— ( 4_クロ口フエ二ル)— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル ]_2H—ピリダジン一 3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル) _6_ (4- (メトキシフエ二ル) _5_ (4—ピリジニル)—2H—ピリダジン一 3—オン、 5， 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチル _2H—ピリダジン— 3—オン又は それらの塩である請求項 9記載の予防治療剤。
一般式 (I)
[化 5]
Figure imgf000024_0001
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基;置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モルホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合；炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基；又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩の OPN産生抑制剤製造のための使用。
[14] 一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり：
R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり：
R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 1 3記載の使用。
[15] 一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり：
R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フエニル基、 4一クロ口フエ二ル基、 2—ピリジル基又は 3—ピリジノレ基 であり：
Aがメチレン基、エチレン基又は 2_プロぺニレン基である請求項 13記載の使用。
[16] 有効成分が 5—（4一クロ口フエニル) _6_[4— (メチルチオ）フエニル] _2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン一 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル)—2H—ピリダジン一 3_オン、 5, 6_ビス（4ーメトキ シフエニル）—2— (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン一 3—オン、 2—ベンジルー 5— ( 4_クロ口フエ二ル)— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル ]_2H—ピリダジン一 3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル） _6_ (4- (メトキシフエ二ル） _5_ (4—ピリジニル）—2H—ピリダジン— 3—オン、 5， 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチル _2H—ピリダジン— 3—オン又は それらの塩である請求項 13記載の使用。
[17] 一般式 (I)
[化 6]
Figure imgf000026_0001
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2— 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基；置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モノレホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合;炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基;又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩の OPN産生亢進に伴う疾患の予防治療剤 製造のための使用。
一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり：
R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり： R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 1 7記載の使用。
一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり：
R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フヱニル基、 4—クロロフヱニル基、 2_ピリジル基又は 3_ピリジル基 であり：
Aがメチレン基、エチレン基又は 2_プロぺニレン基である請求項 17記載の使用。 有効成分が 5_ (4—クロロフヱニル) _6_[4_ (メチルチオ）フヱニル]— 2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン— 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル)—2H—ピリダジン一 3_オン、 5, 6_ビス（4ーメトキ シフエニル）—2— (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン一 3—オン、 2—ベンジルー 5— ( 4_クロ口フエ二ル)— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル ]_2H—ピリダジン一 3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル) _6_ (4- (メトキシフエ二ル) _5_ (4—ピリジニル)—2H—ピリダジン一 3—オン、 5, 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチルー 2H—ピリダジン一 3—オン又は それらの塩である請求項 17記載の使用。
一般式 (I)
[化 7]
Figure imgf000027_0001
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基;置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モルホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合；炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基；又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩及び薬学的に許容される担体を含有する O PN産生抑制剤組成物。
[22] 一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり：
R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり：
R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 2 1記載の組成物。
[23] 一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり：
R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フヱニル基、 4—クロロフヱニル基、 2_ピリジル基又は 3_ピリジル基 であり:
Aがメチレン基、エチレン基又は 2-プロぺニレン基である請求項 21記載の組成物 有効成分が 5_ (4—クロロフヱニル) _6_[4_ (メチルチオ）フヱニル]— 2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン— 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル）—2H—ピリダジン _3_オン、 5， 6_ビス（4—メトキ シフエニル） -2- (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン _3_オン、 2_ベンジル— 5_ ( 4_クロ口フエニル） _6_[4_ (メチルチオ）フエ二ル]— 2H—ピリダジン _3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル） _6_ (4- (メトキシフエ二ル） _5_ (4—ピリジニル）—2H—ピリダジン— 3—オン、 5， 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチル _2H—ピリダジン— 3—オン又は それらの塩である請求項 21記載の組成物。
一般式 (I)
[化 8]
Figure imgf000029_0001
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基；置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モノレホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合；炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基；又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 )
で表されるピリダジン誘導体又はその塩及び薬学的に許容される担体を含有する O PN産生亢進に伴う疾患の予防治療剤組成物。
[26] 一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり：
R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり：
R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 2 5記載の組成物。
[27] 一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり：
R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フエニル基、 4一クロ口フエ二ル基、 2—ピリジル基又は 3—ピリジノレ基 であり：
Aがメチレン基、エチレン基又は 2_プロぺニレン基である請求項 25記載の組成物
[28] 有効成分が 5_ (4—クロロフヱニル) _6_[4_ (メチルチオ）フエ二ル]— 2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン— 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル）—2H—ピリダジン _3_オン、 5， 6_ビス（4—メトキ シフエニル） -2- (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン _3_オン、 2_ベンジル— 5_ ( 4_クロ口フエ二ル)— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル ]_2H—ピリダジン一 3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル) _6_ (4- (メトキシフエ二ル) _5_ (4—ピリジニル)—2H—ピリダジン一 3—オン、 5, 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチルー 2H—ピリダジン一 3—オン又は それらの塩である請求項 25記載の組成物。
一般式 (I)
[化 9]
Figure imgf000031_0001
(式中、 R1はハロゲン原子及び炭素数 1一 6のアルコキシ基から選ばれる 1一 3個が 置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基を示し：
R2はその 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が 置換し、さらに他の位置にハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルコキシ基及び炭素数 1 一 6のアルキルチオ基から選ばれる 1又は 2個が置換していてもよいフエ二ル基を示 し：
R3は水素原子；炭素数 1一 6のアルコキシ基；炭素数 1一 6のハロゲン化アルキル基 ；炭素数 3— 6のシクロアルキル基；ハロゲン原子、炭素数 1一 6のアルキル基、炭素 数 1一 6のアルコキシ基、カルボキシル基、炭素数 2— 7のアルコキシカルボニル基、 ニトロ基、アミノ基、炭素数 1一 6のアルキルアミノ基及び炭素数 1一 6のアルキルチオ 基から選ばれる 1一 3個が置換していてもよいフエニル基、ピリジノレ基若しくはフエ二 ルォキシ基；置換基を有してもよいピペリジノ基、ピペリジル基、ピペラジノ基若しくは モルホリノ基；置換基を有してもょレ、ァミノカルボニル基；炭素数 2— 7のアルキルカル ボニル基；又は置換基を有してもょレ、ピペラジノカルボ二ル基を示し：
Aは単結合；炭素数 1一 6の直鎖若しくは分岐状のアルキレン基；又は炭素数 2— 9 の直鎖若しくは分岐状のアルケニレン基を示し：
Xは酸素原子又は硫黄原子を示す。ただし、 R3が炭素数 1一 6のハロゲン化アルキ ル基のとき、 Aは単結合である。 ) で表されるピリダジン誘導体又はその塩の有効量を投与することを特徴とする OPN産生亢進に伴う疾患の処置方法。
[30] 一般式（1)中、 R1が 4位にフッ素、塩素、臭素から選ばれるハロゲン原子又は炭素 数 1一 6のアルコキシ基が置換していてもよいフエニル基又はピリジル基であり：
R2が 4位に炭素数 1一 6のアルコキシ基又は炭素数 1一 6のアルキルチオ基が置換 したフエニル基であり：
R3が水素原子又はハロゲン原子が置換してレ、てもよレ、フエニル基又はピリジノレ基 であり：
Aが炭素数 1一 3のアルキレン基又は炭素数 3— 4のァルケ二レン基である請求項 2 9記載の方法。
[31] 一般式（1)中、 R1が 4位に塩素原子又はメトキシ基が置換していてもよいフエニル 基又はピリジノレ基であり：
R2が 4位にメトキシ基又はメチルチオ基が置換したフエニル基であり：
R3が水素原子、フエニル基、 4一クロ口フエ二ル基、 2—ピリジル基又は 3—ピリジノレ基 であり：
Aがメチレン基、エチレン基又は 2—プロぺニレン基である請求項 29記載の方法。
[32] 有効成分が 5—（4一クロ口フエニル) _6_[4— (メチルチオ）フエニル] _2_ (2—ピリジ ルメチノレ）—2H—ピリダジン一 3—チオン、 5_ (4—クロ口フエニル） _6_ [4- (メチルチオ )フエニル] _2_ (3—ピリジルメチル)—2H—ピリダジン一 3_オン、 5, 6_ビス（4ーメトキ シフエニル）—2— (4—クロ口シンナミル）—2H—ピリダジン一 3—オン、 2—ベンジルー 5— ( 4_クロ口フエ二ル)— 6_[4_ (メチルチオ）フエニル ]_2H—ピリダジン一 3_オン、 2_(4 —クロ口ベンジル） _6_ (4- (メトキシフエ二ル） _5_ (4—ピリジニル）—2H—ピリダジン— 3—オン、 5， 6—ビス（4—メトキシフエ二ル）— 2—ェチル _2H—ピリダジン— 3—オン又は それらの塩である請求項 29記載の方法。
[33] OPN産生亢進に伴う疾患が、 PTCA後の再狭窄、腎疾患、結核、サルコィドーシ ス、肝硬変、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、尿路結石又はミエローマ系腫瘍であ る請求項 29記載の方法
[34] OPN産生亢進に伴う疾患が、多発性骨髄腫である請求項 29記載の方法。
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