WO2005001019A1 - 胚様体形成用容器及び胚様体の形成方法 - Google Patents

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container
group
embryoid body
forming
cells
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Hiroshi Kurosawa
Shujiro Sakaki
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    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a container for forming an embryoid body used for forming an embryoid body and a method for forming an embryoid body.
  • Embryonic stem cells have the ability to differentiate into various cells in vitro.
  • Methods for differentiating ES cells in vitro include a method of forming a pseudo embryo called an embryoid body by suspension culture and a method of co-culturing with cells that support differentiation and proliferation, such as stromal cells.
  • ES cells are cultured to a high density without the addition of leukemia inhibitory factor (LIF), and cultured in suspension so as not to adhere to a culture vessel such as a petri dish to form a cell mass. It is known to differentiate into different types of cells.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • EB embryoid body
  • suspension culture is the most widely used method for differentiating ES cells in vitro.
  • the embryoid body has a ball-like structure with double cell stratification, with the outer layer being the proximal endoderm and the inner layer being the embryonic ectoderm.
  • the two germ layers are separated by a basement membrane.
  • the structure closely resembles a cylindrical embryo, which is a 6-day embryo of a mouse, and so close to the normal developmental stage of the embryo.
  • induction of mesoderm also occurs, and cardiomyocytes, blood cells, and even a primitive vascular network develop.
  • the embryoid body When the embryoid body is attached to a culture dish and culture is continued, it differentiates into various types of cells. These include nerve cells, keratinocytes, chondrocytes, adipocytes and the like.
  • the cells that differentiate through the formation of embryoid bodies are not limited to somatic cells, and it has recently been confirmed that differentiation into the germline occurs. Thus, the formation of embryoid bodies is convenient for showing the pluripotency of ES cells.
  • the "no-nging-drop method" which is devised so that ES cells do not adhere to a culture vessel, is widely used.
  • Hanging drop method in which ES cells are placed in a water drop hanging from the lid of a glass container for culturing.Drop method 1, or hanging method in which mineral oil is put in a culture vessel in advance and ES cells are layered on top of this and cultured.
  • the hanging-drop method 2 using mineral oil microscopy cannot be performed until the embryoid body is transferred to another culture vessel after the formation of the embryoid body. R & D was very difficult.
  • Patent Document 1 discloses that a method for producing 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine (hereinafter abbreviated as MP / C) and that a polymer thereof has excellent biocompatibility
  • Patent Document 2 discloses that MP Patent Document 3 discloses that a copolymer of A / C and methacrylic acid ester is useful as a medical material that is less susceptible to adhesion and aggregation of platelets and adhesion of plasma proteins.
  • Patent Documents 4 and 5 disclose that a medical material using a copolymer is coated with a polymer having a phosphorylcholine-like group on a resin surface to obtain excellent biocompatibility.
  • a separating agent and a method for separating and recovering blood cells, cell lines, and primary culture cells are developed, respectively, by coating a polymer having a phosphorylcholine-like group onto polyethylene terephthalate. It is.
  • Patent Document 1 JP-A-54-36025
  • Patent Document 2 JP-A-3-39309
  • Patent Document 3 JP-A-9-183819
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 6-502200
  • Patent Document 5 Japanese Patent Publication No. 7-502053
  • Patent Document 6 JP-A-2002-098676
  • An object of the present invention is to provide an embryoid body-forming container used for easily forming an embryoid body from ES cells without using a complicated technique.
  • Another object of the present invention is to provide a method for forming an embryoid body, which can easily culture an ES cell and form an embryoid body without using a complicated technique.
  • a container for embryoid body formation for forming embryoid bodies by suspension culture of embryonic stem cells (ES cells), which forms a region for suspension culture of ES cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • PC-like group a compound having a phosphorylcholine-like group represented by the formula (1)
  • R 2 and R 3 are the same or different and represent a hydrogen atom, an alkyl group having 16 carbon atoms or a hydroxyalkyl group.
  • n is an integer of 1 to 4.
  • a coating layer formed using a compound having a PC-like group represented by the above formula (1) is provided on the surface of a container for forming a region for suspension culture of ES cells.
  • a forming method is provided.
  • an embryoid body formation container for forming an embryoid body by suspending and culturing ES cells, the surface of the container forming a region for suspending and culturing ES cells.
  • the present invention also provides use of a container for forming an embryoid body, comprising a coating layer formed using a compound having a PC-like group represented by the above formula (1).
  • the container for forming embryoid bodies of the present invention has a coating layer formed using a compound having a PC-like group on a desired surface, and thus is useful when forming embryoid bodies from ES cells.
  • FIG. 1 is a copy of a phase contrast micrograph of an embryoid body formed in Example 2-1.
  • FIG. 2 is a photocopy of phase-contrast microscopy of embryoid bodies cultured in Comparative Example 2-1 using an untreated plate.
  • FIG. 3 is a copy of a phase contrast micrograph of an embryoid body formed by the hanging 'drop method performed in Comparative Example 2-2.
  • the embryoid body-forming container of the present invention is a container used to form an embryoid body by suspending and culturing ES cells.
  • the container is characterized in that a coating layer formed using a compound having a PC-like group represented by the above formula (1) is provided on a surface forming a region where ES cells are suspended and cultured.
  • R 1 R 2 and R 3 are the same or different groups and represent a hydrogen atom, an alkyl group or a hydroxyalkyl group having 1 to 16 carbon atoms.
  • Examples of the alkyl group having 16 carbon atoms include a methynole group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a cyclohexyl group, and a phenyl group.
  • Examples of the hydroxyalkyl group having 16 carbon atoms include a hydroxymethyl group, a 2-hydroxyethyl group, a 3-hydroxypropyl group, a 4-hydroxybutyl group, a 5-hydroxypentyl group, and a 6-hydroxyhexyl group. And the like.
  • a reaction reagent containing a compound having a PC-like group is added to a desired surface of a container.
  • a method of fixing a polymer having a PC-like group to a desired surface of a container by a coating method, and a method of fixing a polymer having a PC-like group to a desired surface of a container by a chemical bonding method is simple and easy.
  • the polymer having a PC-like group may be a polymer having a PC-like group represented by the formula (1) .
  • a PC-like group-containing monomer (M) represented by the formula (2) Preferred are at least one of a homopolymer and a copolymer of the monomer (M) and another monomer.
  • R 2 , R 3 and n are the same as in formula (1), R 4 represents an alkyl group having 16 to 16 carbon atoms, and R 5 represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • the monomer (M) represented by the formula (2) for example, 2-((meth) atalyloyloxy) ethyl-2 ′ (trimethylammonio) ethyl phosphate, 3 ((meta) ) (Atariloyloxy) propyl 2 '(trimethylammonio) ethyl phosphate, 4 ((meth) atalyloyloxy) butyl-2- (trimethylammonio) ethyl phosphate, 5-(((meth) atalyloyloxy) ) Pentyl-2 (trimethylammonio) ethyl phosphate, 6 ((meth) atalyloyloxy) hexyl _2- (Trimethylammonio) ethyl phosphate, 2 _ ((meth) atalyloyloxy) ethynole (Triethylammonio) ethyl phosphate, 2 _ ((
  • 2-((meth) atalyloyloxy) ethyl 2- (trimethylammonio) ethyl phosphate is preferred, and 2- (methacryloyloxy) ethyl 2- (trimethylammonio) ethyl phosphate (2 —Methacryloyloxetyl phosphorylcholine, MPC Abbreviation) is more preferable in terms of availability and the ability to prevent ES cells from adhering to the culture vessel, and exhibiting embryoid body-forming ability.
  • Other monomers for obtaining the copolymer include a hydrophobic monomer, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxybutyl (meth) acrylate, and 4-hydroxybutyl ( Hydroxyl-containing (meth) acrylates such as (meth) phthalate; acrylic acid, methacrylic acid, styrene sulfonate, (meth) atalyloyloxyphosphonic acid, 2-hydroxy_3- (meth) acryloxypropyltrimethylammonium ⁇ ⁇ ⁇ Ionic group-containing monomers such as muchloride, and nitrogen-containing monomers such as (meth) acrylamide, aminoethyl methacrylate, and dimethylaminoethyl (meth) atalylate
  • hydrophobic monomer examples include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, 2_ethylhexyl (meth) acrylate, and lauryl (meth) acrylate.
  • the constitutional unit derived from a hydrophobic monomer is preferably 90 mol% or less, more preferably 20 90 mol%, in the constitutional unit of the copolymer.
  • a copolymer having a structural unit derived from a hydrophobic monomer has improved elution resistance.
  • the structural unit derived from a hydrophobic monomer exceeds 90 mol%, the formula (1) This is not preferable because the amount of the PC-like group represented by the formula (1) may decrease and the effect of the coating may not be sufficiently exhibited.
  • the elution resistance is improved, and a surfactant or an organic solvent can be used in a medium or the like. Good.
  • a copolymer using glycidinole (meta) acrylate can react with amino groups, propyloxyl groups, and the like on the surface of the container, and the copolymer can be chemically bonded to a desired surface.
  • s can.
  • the proportion of structural units derived from monomers other than the hydrophobic monomer is preferably 70 mol% or less.
  • the molecular weight of the homopolymer of the PC-like group-containing monomer (M) represented by the formula (2) or the copolymer of the monomer (M) and another monomer is expressed by weight
  • the average molecular weight is usually 5,000 to 500,000, and is preferably 100,000 to 2,000, 000, from the viewpoint that the adhesion of ES cells to the culture vessel can be effectively prevented, the embryoid body forming ability is expressed, and the elution resistance of the polymer is improved.
  • the coating amount of the coating layer can be evaluated by a surface analysis method. Specifically, based on the spectrum measured by X-ray photoelectron spectroscopy, the peak area P of phosphorus and
  • the P / C value for expressing embryoid body forming ability is preferably in the range of 0.002-0.3, and more preferably in the range of 0.01-0.2.
  • the container for forming embryoid bodies of the present invention is not particularly limited, and for example, existing containers such as a cell culture dish, a cell culture multi-dish, a cell culture plate, a cell culture bag, and a cell culture flask. Cell culture vessels. In order to obtain an embryoid body of an appropriate size, a cell culture dish or a cell culture plate is more preferable.
  • the material of the container for forming embryoid bodies is not particularly limited, and examples thereof include polystyrene, polypropylene, polyethylene, acrylic resin, glass, and metal.
  • the surface of the container forming the coating layer is preferably a surface that has been subjected to surface processing such as corona treatment.
  • a coating layer is formed at a desired location on the container surface using at least one of the homopolymer of the monomer ( ⁇ ⁇ ) and the copolymer of the monomer ( ⁇ ) and another monomer.
  • the polymer is dissolved alone in water, ethanol, methanol, isopropanol, or the like, or dissolved in a mixed solvent of water and ethanol, ethanol and isopropanol, and then the container is immersed or placed in the container.
  • the polymer solution etc. Can be applied.
  • the copolymer has a chemically bondable functional group such as an epoxy group, an isocyanate group, a succinimide group, an amino group, a carboxy group, or a hydroxyl group, the amino group, the carboxyl group, or the hydroxyl group on the surface of the container may be used.
  • a chemically bondable functional group such as an epoxy group, an isocyanate group, a succinimide group, an amino group, a carboxy group, or a hydroxyl group
  • the amino group, the carboxyl group, or the hydroxyl group on the surface of the container may be used.
  • the solution containing the copolymer is dissolved in a solvent that does not react with the chemically bondable functional groups, and chemically bonded to the surface of the container to form a coating layer.
  • the container for embryoid body formation can also be obtained by the above method.
  • the method for forming an embryoid body of the present invention uses a compound having a PC-like group represented by the above formula (1) on the surface of a container for forming a region for suspension culture of ES cells.
  • Examples of the container prepared in the step (A) include the above-mentioned container for embryoid body formation of the present invention, and all the above-described containers can be applied to the container prepared in the step (A).
  • the ES cells are cultured in suspension by, for example, culturing ES cells in an undifferentiated state cultured on a single feeder cell by a known method and conditions in the embryoid body formation container.
  • the suspension culture can be carried out according to the following procedure.
  • the culture solution in the embryoid body forming container may be shaken gently, even in a stationary state.
  • IMDM medium Iscove's modified Dulbecco's medium
  • the concentration of ES cells in the culture solution varies depending on the size and shape of the embryoid body formation container prepared in step (A), and is usually 1.0 ⁇ 10 2 ⁇ 1.0 ⁇ 10 6 cellsZmL. .
  • the concentration of the ES cells when using 96 well plates can form a 1. 0 X 10 3 1. 0 X 10 5 It is cellsZmL force reproducibly embryoid bodies It is preferred.
  • Sample A sample was dissolved in a mixed solvent containing 0.5% by weight of lithium bromide and mixed with formaldehyde / methanol (6/4 (volume ratio)) to prepare a 0.5% by weight polymer solution. .
  • the amount of sample solution used is 20L.
  • Elution solvent A mixed solvent of 0.5% by weight of lithium bromide in chloroform / methanol (6Z4 (vol%)) at a flow rate of 1. OmLZ.
  • GMA isopropanol
  • MPC 12.6 g
  • BMA 8.6 g
  • GMA 6.0 g
  • MPC / BMA / GMA 30/40/30 (molar ratio) dissolved in 358 g of isopropanol, put into a four-necked flask, and blown with nitrogen for 30 minutes
  • 2.18 g of a toluene solution of t_butyl peroxybivalate at 20% by weight at 60 ° C. was added and a polymerization reaction was performed for 5 hours, and the polymerization solution was not stirred in 3 L of getyl ether.
  • copolymer (A) synthesized in Synthesis Example 1 0.5 g was dissolved in 100 mL of ethanol to prepare a copolymer solution. After 0.3 mL of the copolymer solution was placed in each well of a U-bottom polystyrene 96-well plate, the copolymer solution was removed from each well by suction. The container for embryoid body formation (A) was prepared by drying under reduced pressure at 50 ° C for 5 hours.
  • a 96-well U-bottom polystyrene plate was subjected to corona treatment in air under the conditions of an irradiation energy of lj / cm 2 to generate carboxyl groups on the surface.
  • 0.5 g of the copolymer (B) synthesized in Synthesis Example 2 was dissolved in 100 mL of isopropanol to prepare a copolymer solution. After 0.3 mL of the copolymer solution was placed in each well of a U-bottomed 96-well plate subjected to corona treatment, the copolymer solution was suctioned from each well and removed.
  • a container for embryoid body formation (C) was prepared in the same manner as in Example 1-2, except that the copolymer (C) synthesized in Synthesis Example 3 was used instead of the copolymer (B).
  • a 2 ⁇ 10 4 cellsZmL suspension of mouse ES cells prepared by the following preparation method was inoculated into each of the embryoid body formation containers (A) prepared in Example 11-1 in an amount of 0.2 mL per well. 37 ° C, 5% CO
  • FIG. 1 shows a copy of a phase contrast micrograph.
  • the evaluation of embryoid body formation in Table 2 is A when the embryoid body is large enough to differentiate and B when the embryoid body is formed but not large enough. C when no body was formed.
  • SIM mouse fibroblasts (hereinafter abbreviated as STO cells) were used as one feeder cell.
  • STO cells 25Units / mL penicillin, 25 g / mL streptomycin and 10 volume 0/0 inactivated treated ⁇ Shi calf serum (FCS) Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with (abbreviated hereinafter DMEM medium, manufactured by Gibco Co.) And cultured.
  • FCS Shi calf serum
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with (abbreviated hereinafter DMEM medium, manufactured by Gibco Co.)
  • the cultured STO cells were treated with lOgZmL of mitomycin C solution (Sigma) for 3 hours to obtain a cell suspension.
  • the suspension of ST cells was seeded on each well in a 6-well multi-dish at 5 ⁇ 10 5 cells.
  • Feeder cells were prepared by culturing at 37 ° C and 5% CO for 16 hours.
  • ES cells As ES cells, 129V mouse ES cells were used. ES cell culture media were 15% KnockOut (registered trademark) serum replacement (KSR: Gibco), ImM sodium pyruvate (Gibco), 0. ImM nonessetial amino acids (Gibco), 0. ImM 2 — DMEM medium (hereinafter abbreviated as ES medium) containing menolecaptoethanol (Sigma), 25 units / mL penicillin, 25 g / mL streptomycin, and lOOOOunits / mL murine leukemia inhibitory factor (mLIF: Chemicon) . 2 ⁇ 10 5 cells / well ES cells were seeded on the feeder cell prepared in the above (1).
  • KSR KnockOut (registered trademark) serum replacement
  • KiSR Gibco
  • ImM sodium pyruvate Gabco
  • ImM nonessetial amino acids Gabco
  • ImM 2 — DMEM medium hereinafter abbreviated as ES medium
  • mice ES cells were cultured for 3 days under the conditions of 37 ° C and 5% CO.
  • the mouse ES cells cultured in the above (2) were detached with 0.1% trypsin-EDTA in a usual manner, and then 15% FCS, 0. Suspension in IMDM medium containing ImM2-mercaptoethanol (Sigma), 25 units / mL penicillin and 25 g / mL streptomycin (Gibco, mLIF-free), 2 x 10 4 cells / mL suspension of mouse ES cells was prepared.
  • Example 2-1 The experiment was performed in the same manner as in Example 2-1 except that an untreated 96-well polystyrene plate was used instead of the embryoid body formation container (A). Table 2 shows the results. Also, a phase contrast microscope The state of embryoid body formation was observed. A copy of this phase contrast micrograph is shown in FIG.
  • the formed embryoid bodies were transferred to a U-bottom polystyrene 96-well plate. Then, observation was performed with a phase-contrast microscope in the same manner as in Example 2-1. Table 2 shows the results. Fig. 3 shows a copy of a phase contrast micrograph.
  • Example 2 shows the results.
  • Example 2-1 The embryoid body obtained in 1-2 was sucked out together with 0.1 mL of the medium and transferred to a gelatin-coated dish prepared by the following preparation method. The medium was exchanged every half day for half of the medium. After culturing for 7 days at 37 ° C and 5% CO, the cells were observed with a phase contrast microscope.
  • the cells adhered to the bottom of the plate of Comparative Example 2-1 were transferred to a gelatin-coated dish, but could not be transferred.
  • Example 3-1 An experiment was performed in the same manner as in Example 3-1 except that the embryoid bodies obtained in Comparative Example 2-2 (Comparative Example 3-2) and Comparative Example 2_3 (Comparative Example 3-3) were used. Table 3 shows the results.
  • the P / C value was 0.038 to 0.074, and the embryoid body forming containers (A) to (C) It was found that it was covered with a coating layer of a polymer having a PC-like group. From Table 2, it was found that culturing mouse ES cells in the embryoid body formation containers (A)-(C) successfully formed embryoid bodies. From Table 3, it was found that the embryoid bodies formed from the embryonic body-forming vessels (A) and (C) and derived from mouse ES cells had a high ability to differentiate into myocardium.
  • FIG. 1 it was found from FIG. 1 that the embryoid body having a size sufficient for differentiation was formed by using the embryoid body forming container according to the present invention. From FIG. 2, it was found that no embryoid body was formed in the case of the untreated polystyrene container.
  • Figure 3 shows that the embryoid bodies formed by the hanging-drop method are not large enough.

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Abstract

　煩雑な手法を用いることなく、容易にES細胞より胚様体を形成するために使用する胚様体形成用容器及び該容器を用いた、容易で効率良い胚様体の形成方法であって、該形成方法は、ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、特定のPC類似基を有する化合物を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器を準備する工程(A)と、該容器内において、胚様体を形成するためにES細胞を浮遊培養する工程(B)とを含む。

Description

明 細 書
胚様体形成用容器及び胚様体の形成方法
技術分野
[0001] 本発明は、胚様体を形成する際に用いる胚様体形成用容器及び胚様体の形成方 法に関する。
背景技術
[0002] 胚性幹細胞 (ES細胞)は、試験管内でも様々な細胞に分化する能力をもつ。 ES細胞 を試験管内で分化させる方法としては、浮遊培養によって胚様体と呼ばれる擬似的 な胚を形成させる方法、ストローマ細胞のように分化と増殖を支持する細胞と共培養 する方法が利用されている。 ES細胞は、 LIF (白血病阻止因子： leukemia inhibitory factor)を加えずに高密度になるまで培養し、シャーレ等の培養容器に接着しないよう に浮遊培養させて細胞塊を形成すると、その後、様々な種類の細胞に分化すること が知られている。浮遊培養で形成された細胞塊は、胚様体 (EB)と呼ばれ、浮遊培養 は、 ES細胞を試験管内で分化させる際に最も広く用いられる方法である。
胚様体は、二重の細胞層力 成るボールのような構造をもち、外層は近位内胚葉、 内層は胚体外胚葉にあたる。 2つの胚葉は、基底膜によって隔てられている。該構造 は、マウスの 6日胚である円筒胚によく似ており、その限りにおいて胚の正常な発生 段階に近い。胚様体においては、中胚葉の誘導も起き、心筋細胞、血液細胞、更に は原始的な血管網も発生する。また、胚様体を培養シャーレに付着させて培養を続 けると様々な種類の細胞に分化する。この中には、神経細胞、ケラチノサイト、軟骨細 胞、脂肪細胞等が含まれる。胚様体の形成を経て分化する細胞は、体細胞に限らず 、最近では生殖細胞系譜への分化も起きることが確認されている。このように胚様体 の形成は ES細胞の多分化能を示すのに都合がよい。
[0003] 胚様体を形成させる為には、 ES細胞を培養容器に接着しないように工夫した「ノ、ン ギング 'ドロップ法」が広く用いられている。ガラス容器のふたから垂れ下がった水滴 の中に ES細胞を入れて培養するハンギング ·ドロップ法 1、又は培養容器に予めミネ ラルオイルを入れておき、その上に ES細胞を重層し培養するハンギング 'ドロップ法 2 が知られている。し力し、ハンギング 'ドロップ法 1は、垂れ下がった水滴が落ちないよ うに、あるいは重層したミネラルオイルと細胞懸濁液の界面が乱れなレ、ようにする必 要があり、培養時の調製及び扱いが非常に煩雑であった。また、ミネラルオイルを用 レ、たハンギング 'ドロップ法 2では、胚様体の形成後に、胚様体を別の培養容器に移 すまで検鏡することができず、胚様体の形成過程における研究開発が非常に困難で あった。
ホスホリルコリン基含有重合体は、生体膜に由来するリン脂質類似構造に起因して 、血液適合性、補体活性、生体物質非吸着性等の特性を有していることが明らかに され、当該機能を利用した生体関連材料の開発が盛んに行われている。例えば、特 許文献 1には、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン (以下 MP/Cと略記)の 製造方法とその重合体が優れた生体適合性を有することが、特許文献 2には、 MP/ Cとメタクリル酸エステルとの共重合体が血小板の粘着 ·凝集や血漿蛋白質の付着が 起こりにくぐ医療用材料として有用であることが、特許文献 3には、ホスホリルコリン 類似基を側鎖に有する共重合体を用いた医療用材料が、特許文献 4及び 5には、ホ スホリルコリン類似基を有する重合体を樹脂表面にコーティングして、優れた生体適 合性が得られることが、特許文献 6には、ホスホリルコリン類似基を有する重合体をポ リエチレンテレフタレートにコーティングして、血球細胞、株細胞、初代培養細胞を分 離'回収する分離剤及び分離'回収方法がそれぞれ開示されている。
しかし、 ES細胞を浮遊培養するにあたり、ホスホリルコリン類似基を有する重合体を 被覆した容器を使用することについては知られていない。
特許文献 1 :特開昭 54 - 36025号公報
特許文献 2：特開平 3 - 39309号公報
特許文献 3 :特開平 9 - 183819号公報
特許文献 4：持表平 6 - 502200号公報
特許文献 5：特表平 7 - 502053号公報
特許文献 6 :特開 2002— 098676号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0005] 本発明の目的は、煩雑な手法を用いることなぐ容易に ES細胞より胚様体を形成す るために使用する胚様体形成用容器を提供することにある。
本発明の別の目的は、煩雑な手法を用いることなぐ容易に ES細胞を培養し、胚様 体を形成できる胚様体の形成方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明によれば、胚性幹細胞 (ES細胞)を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚 様体形成用容器であって、 ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容 器表面に、式 (1)で表されるホスホリルコリン類似基 (以下、 PC類似基と略記)を有する 化合物を用いて形成した被覆層を備える胚様体形成用容器が提供される。
[化 1]
0 R1
II I
.0-P-0-(CHz)„-N+-Rz ... (1 )
0- R3
(式中、
Figure imgf000004_0001
R2及び R3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数 1一 6のァ ルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。 nは 1一 4の整数である。 )
また本発明によれば、 ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表 面に、前記式 (1)で表される PC類似基を有する化合物を用いて形成した被覆層を備 える胚様体形成用容器を準備する工程 (A)と、胚様体形成用容器内において、胚様 体を形成するために ES細胞を浮遊培養する工程 (B)とを含む胚様体の形成方法が提 供される。
更に本発明によれば、 ES細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形 成用容器の使用であって、該容器の ES細胞を浮遊培養するための領域を形成する 表面に、前記式 (1)で表される PC類似基を有する化合物を用いて形成した被覆層を 備える胚様体形成用容器の使用が提供される。
発明の効果
[0007] 本発明の胚様体の形成法方は、本発明の胚様体形成用容器を用いて培養するの で、従来のハンギング 'ドロップ法の ES細胞の培養における、煩雑な手法を用いるこ となぐ容易に ES細胞より胚様体を効率良く形成することができる。また本発明の胚様 体形成用容器は、所望表面に PC類似基を有する化合物を用いて形成した被覆層を 備えるので、 ES細胞より胚様体を形成する際に有用である。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1は、実施例 2— 1で形成した胚様体の位相差額微鏡写真の写しである。
[図 2]図 2は、未処理プレートを用いた比較例 2— 1で培養した胚様体の位相差顕微 鏡写真の写しである。
[図 3]図 3は、比較例 2-2で実施したハンギング 'ドロップ法で形成した胚様体の位相 差顕微鏡写真の写しである。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 以下本発明を更に詳細に説明する。
本発明の胚様体形成容器は、 ES細胞を浮遊培養させ胚様体を形成させるために 使用する容器である。該容器は、 ES細胞を浮遊培養する領域を形成する表面に、前 記式 (1)で表される PC類似基を有する化合物を用いて形成した被覆層を備えることを 特徴とする。
前記式 (1)において R1 R2及び R3は、同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭 素数 1一 6の、アルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。
前記炭素数 1一 6のアルキル基としては、例えば、メチノレ基、ェチル基、プロピル基 、ブチル基、ペンチル基、へキシル基、シクロへキシル基、フエニル基等が挙げられ る。前記炭素数 1一 6のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、 2 ーヒドロキシェチル基、 3—ヒドロキシプロピル基、 4ーヒドロキシブチル基、 5—ヒドロキシ ペンチル基、 6—ヒドロキシへキシル基等が挙げられる。
[0010] 前記容器表面に式 (1)で表される PC類似基を有する化合物を用いて被覆層を形成 するには、例えば、 PC類似基を有する化合物を含む反応試薬を、容器の所望表面 に化学修飾法により固定する方法、 PC類似基を有する重合体を容器の所望表面に コーティング法により固定する方法、 PC類似基を有する重合体を容器の所望表面に 化学結合法により固定する方法が挙げられる。特に、前記コーティング法は、簡便に
、 PC類似基を有する化合物による均一な被覆層を形成できるので好ましい。 前記 PC類似基を有する重合体は、式 (1)で表される PC類似基を有するポリマーで あれば良ぐ例えば、式 (2)で表される PC類似基含有単量体 (M)の単独重合体、及び 該単量体 (M)と他の単量体との共重合体の少なくとも 1種が好ましく挙げられる。
[0011] [化 2]
· . · (2〉
Figure imgf000006_0001
式 (2)中、 、 R2、 R3及び nは式 (1)と同様であり、 R4は炭素数 1一 6のアルキル基を示 し、 R5は水素原子又はメチル基を示す。
[0012] 式 (2)で表される単量体 (M)としては、例えば、 2- ((メタ)アタリロイルォキシ)ェチル- 2' (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 3 ((メタ)アタリロイルォキシ)プロピル 2' (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 4 ((メタ)アタリロイルォキシ)ブチルー 2 し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 5— ((メタ)アタリロイルォキシ)ペンチルー 2し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 6 ((メタ)アタリロイルォキシ)へキシル _2し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ)ェチノレ— 2し (トリェチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ)ェチノレ— 2し (トリプロピルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ)ェチル _2し (トリブチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ)ェチル —2し (トリシクロへキシルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ） ェチル _2し (トリフエ二ルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ )プロピル— 2し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ )ブチル _2し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ） ペンチルー 2し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート、 2_ ((メタ)アタリロイルォキシ )へキシルー 2し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフェート等が挙げられ
る。
[0013] 中でも 2— ((メタ)アタリロイルォキシ)ェチルー 2し (トリメチルアンモニォ)ェチルホスフ エートが好ましぐさらに 2- (メタクリロイルォキシ)ェチルー 2し (トリメチルアンモニォ)ェ チルホスフェート (2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンともいう。以下、 MPC と略記)が入手性及び ES細胞の培養容器への接着を防止でき、胚様体形成能を発 現させる点でより好ましい。
[0014] 前記共重合体を得るための他の単量体としては、疎水性単量体、 2—ヒドロキシェチ ル (メタ)アタリレート、 2—ヒドロキシブチル (メタ)アタリレート、 4—ヒドロキシブチル (メタ)ァ タリレート等の水酸基含有 (メタ)アタリレート；アクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホ ン酸、（メタ)アタリロイルォキシホスホン酸、 2—ヒドロキシ _3— (メタ)アクリルォキシプロ ピルトリメチルアンモニゥムクロライド等のイオン性基含有単量体、（メタ)アクリルアミド 、アミノエチルメタタリレート、ジメチルアミノエチル (メタ)アタリレート等の含窒素単量体
、ポリエチレングリコール (メタ)アタリレート、グリシジル (メタ)アタリレート又はこれらの 2 種以上の混合物等が挙げられる。
[0015] 前記疎水性単量体としては、例えば、メチル (メタ)アタリレート、ェチル (メタ)アタリレ ート、ブチル (メタ)アタリレート、 2_ェチルへキシル (メタ)アタリレート、ラウリル (メタ)ァク リレート、ステアリル (メタ)アタリレート等の直鎖又は分岐アルキル (メタ)アタリレート、シ クロへキシル (メタ)アタリレート等の環状アルキル (メタ)アタリレート、ベンジル (メタ)ァク リレート、フエノキシェチル (メタ)アタリレート等の芳香族 (メタ)アタリレート、ポリプロピレ ングリコール (メタ)アタリレート等の疎水性ポリアルキレングリコール (メタ)アタリレート、 スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体、メチルビニル エーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体、酢酸ビュル、プロ ピオン酸ビニル等のビュルエステル系単量体又はこれらの 2種以上の混合物等が挙 げられる。
[0016] 前記共重合体において、疎水性単量体に由来する構成単位は、共重合体の構成 単位中 90モル％以下が好ましぐ特に 20 90モル％が好ましレ、。疎水性単量体に 由来する構成単位を有する共重合体は、耐溶出性が向上するが、疎水性単量体に 由来する構成単位が 90モル％を超えると、容器表面における式 (1)で表される PC類 似基の被覆量が少なくなり、被覆の効果が十分に発揮できなくなる恐れがあるので 好ましくない。
上述の疎水性単量体以外の単量体に由来する構成単位が共重合体に含まれると 耐溶出性が向上し、培地等に界面活性剤、有機溶剤を使用できることになるので好 ましい。
例えば、グリシジノレ (メタ)アタリレートを用いた共重合体は、容器表面のアミノ基、力 ルポキシル基等と反応させることができ、該共重合体を、所望表面に化学的に結合さ せること力 sできる。
前記共重合体において、疎水性単量体以外の単量体に由来する構成単位の割合 は、 70モル％以下が好ましい。
[0017] 式 (2)で表される PC類似基含有単量体 (M)の単独重合体、又は該単量体 (M)と他の 単量体との共重合体の分子量は、重量平均分子量で通常 5000 5000000であり 、 ES細胞の培養容器への接着を有効に防止でき、胚様体形成能を発現させ、重合 体の耐溶出性を向上させる点から 100000— 2000000が好ましい。
[0018] 本発明において前記被覆層の被覆量は、表面分析方法により評価できる。具体的 には、 X線光電子分光分析によって測定したスペクトルに基づいて、リンのピーク面 積 Pと
炭素のピーク面積 Cの比、即ち P/C値で評価できる。胚様体形成能を発現させるた めの P/C値 ίま、 0. 002— 0. 3の範囲力 S好ましく、 0. 01— 0. 2の範囲力 Sより好まし レ、。
[0019] 本発明の胚様体形成用容器は特に限定されないが、例えば、細胞培養用ディッシ ュ、細胞培養用マルチディッシュ、細胞培養用プレート、細胞培養用バック、細胞培 養用フラスコ等の既存の細胞培養容器が挙げられる。適度な大きさの胚様体を得る ために、更に望ましくは、細胞培養用ディッシュ又は細胞培養用プレートが好ましい。 胚様体形成用容器の材質は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレ ン、ポリエチレン、アクリル樹脂、ガラス、金属等が挙げられる。また、前記被覆層を形 成する容器表面は、コロナ処理等の表面加工を施した表面であることが好ましい。
[0020] 前記単量体 (Μ)の単独重合体、及び単量体 (Μ)と他の単量体との共重合体の少なく とも 1種を用いて容器表面の所望箇所に被覆層を形成するには、例えば、前記重合 体を、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール等に単独に溶解あるいは、水とェ タノール、エタノールとイソプロパノール等の混合溶剤に溶解した後に、容器を浸漬 あるいは、容器に重合体溶液をスプレーする方法等によりコーティングすることで実 施できる。
また、前記共重合体が、エポキシ基、イソシァネート基、スクシンイミド基、アミノ基、 カルボキシノレ基又は水酸基等の化学結合可能な官能基を有する場合には、容器表 面のアミノ基、カルボキシル基又は水酸基と化学反応させるために、共重合体を含む 溶液を化学結合可能な官能基が反応しない溶剤に溶解し、容器表面と化学結合さ せ被覆層を形成した後に、未反応の重合体を洗浄除去する方法によっても胚様体 形成用容器を得ることができる。
[0021] 本発明の胚様体の形成方法は、 ES細胞を浮遊培養するための領域を形成するた めの容器表面に、前記式 (1)で表される PC類似基を有する化合物を用いて形成した 被覆層を備える胚様体形成用容器を準備する工程 (A)と、胚様体形成用容器内にお いて、胚様体を形成するために ES細胞を浮遊培養する工程 (B)とを含む。
工程 (A)において準備する容器は、上述の本発明の胚様体形成用容器が挙げられ 、上述した例示した容器は全て工程 (A)で準備する容器に適用することができる。
[0022] 工程 (B)において ES細胞を浮遊培養するには、例えば、フィーダ一細胞上で培養し た未分化状態の ES細胞を、前記胚様体形成用容器内で公知の方法や条件等に従 つて浮遊培養することにより行なうことができる。この際、胚様体形成用容器内の培養 液は、静置状態でも、緩やかに振とうしても良い。
前記培養液を構成する培地としては、従来のハンギング 'ドロップ法等に用いられ ている各種成長因子、例えば、 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM培地)等 を用いることができる。
前記培養液中の ES細胞の濃度は、工程 (A)により準備する胚様体形成用容器の大 きさや形態等によって異なる力 通常 1. 0 X 102- 1. 0 X 106cellsZmLである。特に 、胚様体形成用容器として、 96穴プレートを用いる場合の前記 ES細胞の濃度は、 1. 0 X 103 1. 0 X 105cellsZmLであること力 再現性良く胚様体を形成できるので好 ましい。
実施例
[0023] 以下、実施列及び比較例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら に限定されない。尚、例中の容器表面における P/C値は以下の方法に従って算出 した。
<胚様体形成用容器表面の P/C値の測定方法 >
X線光電子分光分析器 (商品名「ESCA-3300」、島津製作所製)を用いて、 X線照射 角が 900の各元素のスペクトルを測定し、リン元素及び炭素元素のピーク面積から、 下記式により PZC値を算出した。
P/C=Ap (リン元素のピーク面積) /Ac (炭素元素のピーク面積）
[0024] 合成例 1
MPC 35. 7g及び n_ブチルメタタリレート (BMA)4. 3g(MPCZBMA = 80Z20(モノレ 比》をエタノール 160gに溶解して 4つ口フラスコに入れ、 30分間窒素を吹き込んだ 後、 60°Cでァゾビスイソブチロニトリル 0. 82gを加えて 8時間重合反応させた。重合 液を 3Lのジェチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ化し、 48時 間室温で真空乾燥を行って粉末 29. 6gを得た。以下に示す条件の GPCにより測定 した重量平均分子量は 153000であった。 H-NMRにて組成分析した結果、 MPC/ BMA= 80/20(モル比)であった。これを共重合体 (A)とする。
< GPCの測定条件 >
(1)試料: 0. 5重量％臭化リチウムを含むクロ口ホルム/メタノール (6/4(体積比))混 合溶媒に試料を溶解し、 0. 5重量％の重合体溶液を調製した。試料溶液の使用量 は 20Lである。
(2)カラム： PLgel 5 μ πι MIXEDC_C、 2本直列 (ポリマ一'ラボラトリー社製)、カラム温 度は 40°C、東ソ一社製のインテグレーター内蔵分子量計算プログラム (SC-8020用 GPCプログラム)にて調製した。
(3)溶出溶媒： 0. 5重量％臭化リチウムを含むクロ口ホルム/メタノール (6Z4(体積％ ))混合溶媒、流速は 1. OmLZ分である。
(4)検出:示差屈折計、
(5)標準物質：ポリメチルメタタリレート (PMMAXポリマー 'ラボラトリー社製)。
[0025] 合成例 2
MPC 38. Og及びグリシジルメタタリレート 2. 0g(GMA)(MPC/GMA = 90/l0(モル 比》をイソプロパノール 358gに溶解して 4つ口フラスコに入れ、 30分間窒素を吹き込 んだ後、 60°Cで 20重量％の ブチルパーォキシビバレートのトルエン溶液 2. 18g をカ卩えて 5時間重合反応させた。重合液を 3Lのジェチルエーテル中に撹拌しながら 滴下し、析出した沈殿を濾過し、 4. 8時間室温で真空乾燥を行って粉末 28. 4gを得 た。 ^-NMRにて組成分析した結果、 MPC/GMAは 90Z10 (モル比)であった。合成 例 1と同様に GPCにより測定した重量平均分子量は 53000であった。これを共重合 体 (B)とする。
[0026] 合成例 3
MPC 12. 6g、 BMA 8. 6g及び GMA 6. 0g(MPC/BMA/GMA = 30/40/30(モ ル比》をイソプロパノール 358gに溶解して 4つ口フラスコに入れ、 30分間窒素を吹き 込んだ後、 60。Cで 20重量％の t_ブチルパーォキシビバレートのトルエン溶液 2. 18 gを加えて 5時間重合反応させた。重合液を 3Lのジェチルエーテル中に撹拌しなが ら滴下し、析出した沈殿を濾過し、 48時間室温で真空乾燥を行って粉末 28. 4gを得 た。 H-NMRにて組成分析した結果は、 MPC/BMA/GMA = 30/40/30(モル比） であった。合成例 1と同様に GPCにより測定した重量平均分子量は 42000であった。 これを共重合体 (C)とする。
[0027] 実施例 1 1
合成例 1で合成した共重合体 (A)0. 5gをエタノール lOOmLに溶解し、共重合体溶 液を調製した。 U底ポリスチレン製 96穴プレートの各ゥエルに前記共重合体溶液 0. 3mLを入れた後、各ゥエルから共重合体溶液を吸引し除去した。 50°Cで 5時間減圧 下で乾燥することにより胚様体形成用容器 (A)を作製した。
胚様体形成容器 (A)における共重合体 (A)被覆層を有するゥエル内表面の P/C値 を測定した。結果を表 1に示す。
[0028] 実施例 1一 2
U底ポリスチレン製 96穴プレートを空気中で、照射エネルギー lj/cm2の条件にお いてコロナ処理して表面にカルボキシノレ基を生成させた。合成例 2により合成した共 重合体 (B)0. 5gをイソプロパノール lOOmLに溶解し、共重合体溶液を調製した。コロ ナ処理した U底 96穴プレートの各ゥヱルに前記共重合体溶液 0. 3mLを入れた後、 各ゥエルから共重合体溶液を吸引し除去した。 60°Cで 3時間、プレート表面のカルボ キシル基と共重合体中のエポキシ基とを反応させた。 0. 2Mチォ硫酸ナトリウム水溶 液を、各ゥエルに 0. 3mL入れて、 25°C、 24時間の条件で未反応のエポキシを開環 させた。蒸留水で各ゥエルを 3回洗浄した後、 50°Cで 5時間減圧下で乾燥することに より胚様体形成用容器 (B)を作製した。
胚様体形成容器 (B)における共重合体 (B)被覆層を有するゥエル内表面の PZC値 を測定した。結果を表 1に示す。
[0029] 実施例 1一 3
共重合体 (B)の代わりに合成例 3により合成した共重合体 (C)を用いた以外は実施 例 1 - 2と同様に行い、胚様体形成用容器 (C)を作製した。
胚様体形成容器 (C)における共重合体 (C)被覆層を有するゥエル内表面の PZC値 を測定した。結果を表 1に示す。
[0030] 比較例 1
未処理の U底ポリスチレン製 96穴プレートのゥエル内表面の P/C値を測定した。 結果を表 1に示す。
[0031] [表 1]
Figure imgf000012_0001
[0032] 実施例 2— 1
下記調製法で調製した 2 X 104cellsZmLのマウス ES細胞の懸濁液を、実施例 1一 1 で作製した胚様体形成用容器 (A)に各ゥエル 0. 2mLずつ播種した。 37°C、 5% CO
2 の条件下で 5日間培養した後に、位相差顕微鏡にて胚様体形成状態を観察した。結 果を表 2に示す。また、位相差顕微鏡写真の写しを図 1に示す。
表 2における胚様体形成の評価は、分化するのに十分な大きさの胚様体が形成さ れた場合を A、胚様体は形成されたが大きさが十分でない場合を B、胚様体が形成 されなかった場合を Cとした。
[0033] <マウス ES細胞の懸濁液の調製法 > (1)フィーダ一細胞の培養
フィーダ一細胞として SIMマウスの繊維芽細胞 (以下、 STO細胞と略記)を用いた。
STO細胞は、 25units/mLペニシリン、 25g/mLストレプトマイシン及び 10体積0 /0非 動化処理したゥシ胎児血清 (FCS)を添加した Dulbecco's modified Eagle's medium (以 下 DMEM培地と略記、 Gibco社製)を用い培養した。培養した STO細胞を lOgZmL のマイトマイシン C溶液 (Sigma社製)で 3時間処理した後、細胞懸濁液とした。 ST〇細 胞の懸濁液を各ゥヱルに 5 X 105cellsになるように 6穴マルチディッシュに播種した。 3 7°C、 5% COの条件下で 16時間培養してフィーダ一細胞を調製した。
(2)マウス ES細胞の培養
ES細胞として 129Vマウス ES細胞を用いた。 ES細胞の培地は、 15%KnockOut (登 録商標） serum replacement(KSR : Gibco社製)、 ImMピルビン酸ナトリウム (Gibco社製） 、 0. ImM nonessetial amino acids(Gibco社製)、 0. ImM 2—メノレカプトエタノーノレ (Sigma社製)、 25units/mLペニシリン、 25g/mLストレプトマイシン及び lOOOunits /mLの murine leukemia inhibitory factor(mLIF : Chemicon社製)を含む DMEM培地（ 以下 ES培地と略記)とした。前記 (1)で調製したフィーダ一細胞上に 2 X 105cell/ゥェ ルの ES細胞を播種した。 37°C、 5%COの条件下で 3日間、マウス ES細胞を培養した 前記 (2)で培養したマウス ES細胞を 0. 1 %トリプシン一 EDTAで常法により剥がした 後、 15%FCS、 0. ImM 2—メルカプトエタノール (Sigma社製)、 25units/mLぺニシリ ン及び 25g/mLストレプトマイシンを含む IMDM培地 (Gibco社製、 mLIFを含まなレ、） に懸濁して、 2 X 104cells/mLのマウス ES細胞の懸濁液を調製した。
[0034] 実施例 2— 2及び 2— 3
胚様体形成用容器 (A)の代わりに、実施例 2 - 2及び実施例 2 - 3で調製した胚様体 形成用容器 (B)又は胚様体形成用容器 (C)を用いた以外は、実施例 2— 1と同様に実 験を行った。結果を表 2に示す。
[0035] 比較例 2
胚様体形成用容器 (A)の代わりに、未処理のポリスチレン製 96穴プレートを用いた 以外は、実施例 2 - 1と同様に実験を行った。結果を表 2に示す。また、位相差顕微鏡 にて胚様体形成状態を観察した。この位相差顕微鏡写真の写しを図 2に示す。
[0036] 比較例 2 - 2
平底ポリスチレン製 96穴プレートの各ゥエルにリン酸緩衝液 130 β L及びミネラルォ ィノレ 200 μ Lを予め入れておき、ここに前記調製した 2 Χ 104cells/mLのマウス ES糸田 胞の懸濁液を 50 μ L播種した。 37°C、 5%COの条件下で 5日間培養した後に、形
2
成された胚様体を U底ポリスチレン製 96穴プレートに移した。次いで、位相差顕微鏡 にて実施例 2— 1と同様に観察を行なった。結果を表 2に示す。また、位相差顕微鏡 写真の写しを図 3に示す。
[0037] 比較例 2 - 3
胚様体形成用容器 (A)の代わりに、スミロンセルタイトスフエロイド (96穴プレート、登 録商標、住友ベークライト社製)を用いた以外は、実施例 2-1と同様に実験を行った 。結果を表 2に示す。
[0038] [表 2]
Figure imgf000014_0001
[0039] 実施例 3— 1一実施例 3— 3
実施例 2— 1一 2— 3で得られた胚様体を 0. lmLの培地ごと吸出し、下記調製法にて 調製したゼラチンコートディッシュに移した。培地交換は 3日毎に半量の交換を行つ た。 37°C、 5% COの条件下で 7日間培養した後に位相差額微鏡にて観察した。結
3に示す。
表 3における心筋への分化評価は、拍動している心筋が観察された場合を A、拍動 している心筋が僅かに観察された場合を B、作業が行えなかった場合を Cとした。
[0040] <ゼラチンコートディッシュの調製法 >
121°C、 20分間オートクレープ滅菌を施した 0. 1重量％のゼラチン水溶液を培養 用 24穴マルチディッシュに均一に加えた。冷蔵保存を行い、使用直前に、ァスピレ 一ターにてゼラチン溶液を吸引した。 15%FCS、 0. ImM 2—メルカプトエタノール (Sigma社製)、 25units/mLペニシリン及び 25g/mLストレプトマイシンを含む IMDM 培地 (Gibco社製、 mLIFを含まなレ、)を各ゥヱルに lmLずつ加えた。
[0041] 比較例 3— 1
比較例 2—1のプレート底部に接着した細胞をゼラチンコートディッシュに移そうとし たが移せなかった。
[0042] 比較例 3— 2及び比較例 3— 2
比較例 2— 2(比較例 3—2)、比較例 2_3(比較例 3— 3)で得られた胚様体を用いた以 外は、実施例 3-1と同様に実験を行った。結果を表 3に示す。
[0043] [表 3]
Figure imgf000015_0001
[0044] 表 1より、実施例 1—1一 1—3において P/C値が 0· 038— 0. 074であること力ら、胚 様体形成用容器 (A)— (C)は、 PC類似基を有する重合体による被覆層により被覆され ていることがわかった。表 2より、胚様体形成用容器 (A)— (C)でマウス ES細胞を培養 すると、良好に胚様体を形成できることがわかった。表 3より、胚様体形成用容器 (A) 一 (C)で形成された、マウス ES細胞からの胚様体は、心筋への分化能が高いことがが わかった。
また、図 1より、本発明にかかる胚様体形成用容器を用いることにより、分化するの に十分な大きさの胚様体が形成されることがわかった。図 2より、未処理のポリスチレ ン製容器の場合は胚様体が形成されないことがわかった。図 3より、ハンギング 'ドロ ップ法で形成した胚様体は、大きさが十分でなレ、ことがわかった。

Claims

請求の範囲 [1] 胚性幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器であって 胚性幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、式 (1)で表 されるホスホリルコリン類似基を有する化合物を用レ、て形成した被覆層を備える胚様 体形成用容器。
[化 1]
O R1
II ！
-0-P-0-(CH2)n-N+- 2 .. · (1 )
(式中、
Figure imgf000016_0001
R2及び R3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数 1一 6のァ ルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。 nは 1一 4の整数である。 )
[2] ホスホリルコリン類似基を有する化合物が、式 (2)で表されるホスホリルコリン類似基 含有単量体 (M)の単独重合体、及び該単量体 (M)と他の単量体との共重合体の少な くとも 1種である請求項 1の胚様体形成用容器。
[化 2]
·■■ (2〉
Figure imgf000016_0002
(式中、
Figure imgf000016_0003
R2及び R3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数 1一 6のァ ルキル基又はヒドロキシアルキル基を、 R4は炭素数 1一 6のアルキル基を、 R5は水素 原子又はメチル基を示す。 nは 1一 4の整数である。 )
[3] 前記被覆層を形成した容器表面における、 X線高電子分光分析によって測定した スぺ
タトルに基づくリン元素の量 Pと炭素元素の量 Cとの比 (P/C)が、 0. 002-0. 3であ る請求項 1の胚様体形成容器。
[4] 胚性幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器表面に、式 (1)で表 されるホスホリルコリン類似基を有する化合物を用レ、て形成した被覆層を備える胚様 体形成用容器を準備する工程 (A)と、
[化 3]
0 1
II I
-0-P-0-(CHz)n-N+- z ■ -■ (1 )
0 - R*
(式中、
Figure imgf000017_0001
R2及び R3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数 1一 6のァ ルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。 nは 1一 4の整数である。 )
胚様体形成用容器内において、胚様体を形成するために胚性幹細胞を浮遊培養 する工程 (B)とを含む胚様体の形成方法。
[5] ホスホリルコリン類似基を有する化合物力 式 (2)で表されるホスホリルコリン類似基 含有単量体 (M)の単独重合体、及び該単量体 (M)と他の単量体との共重合体の少な くとも 1種である請求項 4の形成方法。
[化 4]
· · · (2〉
Figure imgf000017_0002
(式中、
Figure imgf000017_0003
R2及び R3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数 1一 6のァ ルキル基又はヒドロキシアルキル基を、 R4は炭素数 1一 6のアルキル基を、 R5は水素 原子又はメチル基を示す。 nは 1一 4の整数である。 )
[6] 前記被覆層を形成した容器表面における、 X線高電子分光分析によって測定した スぺ
タトルに基づくリン元素の量 Pと炭素元素の量 Cとの比 (P/C)が、 0. 002— 0. 3であ る請求項 4の形成方法。
[7] 胚性幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器の使用で あって、該容器の胚性幹細胞を浮遊培養するための領域を形成する表面に、式 (1) で表されるホスホリルコリン類似基を有する化合物を用レ、て形成した被覆層を備える 胚様体形成用容器の使用。 [化 5]
O 1
II I
-0-P-0-{CH2)n-N*- 2 .-.(1)
O- R5
(式中、
Figure imgf000018_0001
R2及び R3は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数 1一 6のァ ルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。 nは 1一 4の整数である。 )
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