WO2004108924A1 - Ｃｄ９／ｃｄ８１二重欠損非ヒト動物 - Google Patents

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WO2004108924A1
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double
animal
human
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Eisuke Mekada
Kenji Miyado
Isao Tachibana
Yoshito Takeda
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Osaka Industrial Promotion Organization
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    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to a double-deficient non-human animal lacking the CD9 gene and the CD81 gene, which can be used as a model animal for the development of a therapeutic agent for osteoporosis or a therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease.
  • CD9 and CD81 are known as members of a family of proteins called tetraspanins. Tetraspanin, as the name implies, is a superfamily with a structure that penetrates the cell membrane four times, and about 30 members have been known so far in mammals. It is said to be involved in cell proliferation, motility, fusion, invasion and metastasis of cancer cells, but details of its function were unknown.
  • knockout mice with CD81 for example, see Non-Patent Document 1
  • CD9 for example, see Non-Patent Document 2
  • these cells show abnormalities in antibody / cytokine production and infertility, respectively. And the importance of tetraspanin in the reproductive system.
  • Osteoporosis is a disease primarily found in postmenopausal women and the elderly, causing pathological fractures and spinal deformities. Therefore, there is a need to develop more effective therapeutic agents for osteoporosis, but there are few model animals that can be used as experimental models. Ovariectomized mice are frequently used as osteoporosis model animals at present, and these mice are excellent as osteoporosis model animals with increased osteoclast activity due to decreased estrogen, which are often seen in postmenopausal women.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD patients not only have lungs but also have high rates of systemic complications such as weight loss, muscle weakness, and osteoporosis, which accelerates ADL and decreased respiratory function (eg, See Patent Document 3).
  • systemic complications such as weight loss, muscle weakness, and osteoporosis, which accelerates ADL and decreased respiratory function (eg, See Patent Document 3).
  • Steroid administration, vitamin D deficiency, and smoking are thought to be factors in these systemic changes, but the true mechanism of extrapulmonary involvement is unknown.
  • mice have been created to elucidate the mechanism of the onset of emphysema and to develop therapeutic methods. For example, it has been confirmed that emphysema occurs in mice that overexpress collagenase, a type of protease. As for knockout mice, emphysema has been reported in surfactant protein D integrin ⁇ 6 knockout mice (for example, see Non-patent Document 4 and Non-patent Document 5). There are no reports of extrapulmonary involvement such as osteoporosis.
  • Non-Patent Document 1 Maecker HT.J Exp Med 185: 1505-1510, 1997
  • Non-Patent Document 2 Miyado K. Science 287: 321-324, 2000
  • Non-Patent Document 3 Biskobing DM. Chest 121: 609-620, 2002
  • Non-patent document 4 Wert SE.Proc Natl Acad Sci USA 97: 5922-5977, 2000 (Non-patent document 5) Morris DG Nature 422: 169-173, 2003 Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to solve the conventional problems and achieve the following objects. That is, a CD9 / CD81 double deficient non-human animal that can be used as a model animal that well represents at least one of the pathological conditions of osteoporosis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and that the non-human animal is an osteoporosis model Animal COP D model It is intended to provide a method for use as at least one of animals.
  • the present inventors have created a double-deficient mouse of CD9 and CD81, members of the tetraspanin protein family, and obtained the knowledge that osteoporosis and COPD occur in this mutant mouse. Reached.
  • a non-human CD9ZCD81 double-deficient animal characterized in that the functions of the gene encoding CD9 and the gene encoding CD81 are defective in at least somatic cells.
  • ⁇ 2> The non-human animal according to ⁇ 1>, wherein the non-human animal is a rodent.
  • the gene encoding CD9 is any of the following (a) and (b), and the gene encoding CD81 is any of the following (c) and (d):
  • ⁇ 3> is a non-human CD9 / CD81 double deficient animal described in any of ⁇ 3>.
  • At least one of a gene encoding CD9 and a gene encoding CD81 is introduced downstream of the promoter of a gene that is specifically expressed in germ cells.
  • the non-human CD9 / CD81 double-deficient animal according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein at least one of the functions of the gene encoding CD81 is not deleted.
  • the CD9 / CD81 double deficiency according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the deficiency is at least one of a phenotype in which osteogenesis is inhibited and a phenotype similar to chronic obstructive pulmonary disease. It is a non-human animal.
  • the non-human CD9 / CD81 double deficient animal according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, which is at least one of an osteoporosis model animal and a chronic obstructive pulmonary disease model animal. .
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, further comprising the step of measuring the degree of osteogenesis inhibition of a CD9 / CD81 double-deficient non-human animal. This is a method of using the CD9 / CD81 double deficient non-human animal as an osteoporosis model animal.
  • the test substance is administered to a non-human CD9 / CD81 double-deficient non-human animal according to any one of the above ⁇ 1> Karak ⁇ , and the test substance suppresses osteogenesis inhibition.
  • the method described in the above ⁇ 9> which is a method for screening for an osteoporosis drug, which tests whether or not the drug has osteoporosis.
  • ⁇ 11> a step of measuring the degree of phenotype similar to chronic obstructive pulmonary disease in a non-human CD9 / CD81 double-deficient animal according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>.
  • a test substance is administered to a CD9 / CD81 double-deficient non-human animal according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the test substance exhibits chronic obstructive pulmonary disease.
  • Screening agent for chronic obstructive pulmonary disease screening for phenotypic effects The method described in ⁇ 11> above, which is a marking method.
  • ⁇ 13> At least one of a CD9 / CD81 double deficient non-human animal described in ⁇ 1> and an osteoporosis model animal or a chronic obstructive pulmonary disease model animal is produced. Is for use. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 represents the full-length DNA sequence of CD9.
  • FIG. 2 shows the full-length DNA sequence of CD81.
  • FIG. 3 depicts genomic DNA, construction vectors and recombinant DNA for gene targeting for CD9 knockout mouse production.
  • FIG. 4 shows the results of a CD 9 Southern blot.
  • FIG. 5 shows the results of CD 9 PCR.
  • FIG. 6 is an X-ray image of the whole body skeleton of a 30-week-old wild-type (wi1d) and CD9 / CD81 double-deficient (DKO) mouse.
  • FIG. 7 is an X-ray image of the femur of a 30-week-old wild-type (wi1d) and CD9 / CD81 double-deficient (DKO) mouse.
  • FIG. 8 is an X-ray image of the spine of a 30-week-old wild-type (wi1d) and CD9ZCD81 double-deficient (DKO) mouse.
  • Figure 9 shows bone tissue in the proximal tibia of 8-week-old wild-type (wiId) and CD9 / CD81 double-deficient (DKO) mice stained with toluidine blue in the upper row and TRAP in the lower row. It shows the result of the test.
  • Fig. 1 OA shows the results of pQCT analysis of 8-week-old wild-type (wild) and CD9-deficient mice, CD81-deficient mice, and CD9 / CD81 double-deficient (DKO) mouse bones.
  • FIG. 1 OB shows the analysis results of bone mass.
  • FIG. 1 OC shows the analysis results of bone strength.
  • Figure 11A shows 8-week-old wild-type, CD9-deficient (CD9KO) mice, CD81-deficient (CD81KO) mice, and CD9ZCD81 double heterologous (CD9 / CD81).
  • (DHO) Mouse, CD9 ZCD81 double deficient homozygous (CD9 / CD81 DKO) Indicates the unit bone mass of the morphometric results of the proximal tibia of the mouse.
  • FIG. 11B shows the trabecular width of the morphological measurement results of the mouse similar to FIG. 11A.
  • FIG. 11C shows the number of bones in the morphological measurement results of the mouse as in FIG. 11A.
  • FIG. 11D shows the osteoid thickness of the morphological measurement results of the mouse similar to FIG. 11A.
  • FIG. 11E shows the osteoid surface of the morphological measurement results of the mouse similar to FIG. 11A.
  • FIG. 11F shows the osteoblast surface of the mouse morphometry results similar to FIG. 11A.
  • FIG. 11G shows the number of osteoclasts in the mouse morphometry results similar to FIG. 11A.
  • Fig. 11H shows the osteoclast surface of the mouse morphometry results similar to Fig. 11A.
  • Figure 12A shows 8-week-old wild-type (wi1d) mice, CD9-deficient (CD9KO) mice, CD81-deficient (CD81KO) mice and CD9 / CD81 double-deficient mice.
  • Loss (DKO) represents the results of luciferin atssie in mice.
  • FIG. 12B shows the rate of bone formation by Calcine Atsushi.
  • FIG. 13 shows expansion of the air space and infiltration of inflammatory cells into the alveolar septum in a wild-type (Wi1d) mouse and a CD9ZCD81 double-deficient (DKO) mouse in Example 8.
  • FIG. 14 shows the age-related changes in the alveolar cavity diameter of wild-type (WiId) mice and CD9 / CD81 double-deficient (DKO) mice by morphometry in Example 8.
  • FIG. 15 shows fission of elastic fibers and hyperplasia of goblet cells in wild-type (Wild) mice and CD9 / CD81 double-deficient mice (DKO) in Example 8.
  • FIG. 9 shows the enhancement of MMP activity in bronchoalveolar lavage fluid of a wild-type (WiId) mouse mouse CD 9ZCD81 double deficient (DKO) mouse in Example 9.
  • FIG. FIG. 17 shows the increase in the number of cells in bronchoalveolar lavage fluid of wild-type (WiId) mice and CD9 / CD81 double-deficient (DKO) mice in Example 9. 4008261
  • the present inventors first created a double-deficient mouse of CD9 and CD81, members of the tetraspanin protein family, and obtained the knowledge that osteoporosis would occur in this mutant mouse.
  • CD9 / CD81 double deficient mice had smaller skeletons, kyphosis, thinner cortical bone, and increased bone X-ray permeability.
  • Morphological analysis of bone tissue suggested an increase in osteoclasts and decreased function, and a decrease in osteoblast function.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the non-human animal of the present invention lacks the function of the gene encoding CD9 and the gene encoding CD81 in at least somatic cells (refer to “CD9 ZCD812- It is sometimes referred to as "double loss").
  • the non-human animal is not particularly limited as long as it is an animal other than a human, and examples thereof include mammals such as mice, rats, egrets, pigs, dogs, sheep, goats, birds such as chickens, and trout. And the like, and are preferably mammals, and more preferably rodents. Among them, mice are particularly preferable because they have a short life cycle and are easy to breed, and technology for producing a gene-deficient animal has been established.
  • non-human animal deficient in gene function refers to a non-human animal having a gene deficient in gene function due to mutation in the gene.
  • Genes with defective functions include genes whose gene expression is suppressed or whose gene product activity is lost or decreased as compared to a normal gene without mutation.
  • mutations include not only deletions but also additions and substitutions, and there are no restrictions on the site or length of the mutation.
  • There are no particular restrictions on the method of introducing the mutation but by introducing DNA into the cell in which a mutation has been introduced into the base sequence of the target gene and selecting a homologous recombinant, the target gene can be suddenly transformed.
  • the mutation can be introduced by a gene targeting technique.
  • the targeting site for introducing a mutation may be any of a promoter region, an untranslated region, a translated region, and the like.
  • a mutant gene whose transcriptional activity is impaired can be obtained by deletion or substitution of the nucleotide sequence of the promoter region of the gene.
  • a mutant gene in which a stable transcript cannot be synthesized due to deletion or substitution of the base sequence in the untranslated region can also be obtained.
  • gene products cannot be obtained due to deletion or substitution of a nucleotide sequence in the translation region, or even if a gene product is obtained, a mutant gene that does not function properly as a protein can be obtained.
  • the non-human animal of the present invention may be a non-human animal in which a mutant gene deficient in function is present in a homologous state on a chromosome (homozygote), or a heterozygous state. (Heterozygotes). Heterozygotes can be used primarily for homozygous breeding.
  • CD9 examples include salmon (AF427519), chicken (AB032767), mouse (NM_007657), rat (XM_216279), cat (D30786), dog (U15792), pig (AF525029), It is known to be present in mosquitoes (NM_173900), monkeys (D10726) and humans (NM 001769). JP2004 / 008261
  • NM-131518 Zebrafish (NM-131518), chicken (AB101638), mouse (NM-133655), rat (NM-013087), monkey (AF116600) and human (NM-004356).
  • GenBank accession number of GenBank, from which the base sequence information of the gene and the amino acid sequence information of the protein encoded by the gene can be accessed.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding CD9 in the previously reported mouse is described in SEQ ID NO: 1 (FIG. 1)
  • the nucleotide sequence of the gene encoding CD81 is described in SEQ ID NO: 2 (FIG. 2).
  • the amino acid sequence of mouse CD9 protein is shown in SEQ ID NO: 10
  • amino acid sequence of CD81 protein is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the DNA coding for CD81 exists as a DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • stringent conditions include hybridization in 4 ⁇ SSC at 65 ° C., followed by washing in 0.1 ⁇ SSC at 65 ° C. for 1 hour.
  • amino acid sequence of the protein encoded by DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 10
  • one or more, preferably one or several amino acids include a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which residues are added, deleted or substituted.
  • one or several Examples include a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which amino acid residues are added, deleted or substituted.
  • the non-human animal of the present invention has a deficient function of the gene encoding CD9 and the gene encoding CD81, and this “deficient function” occurs at least in the somatic cell system. Just do it. That is, the functions of the CD9 gene and CD81 gene, which are native to the non-human animal, are deficient, and the genes encoding CD9 and CD9 newly introduced under a promoter that is not expressed under normal conditions in somatic cells. The present invention is not excluded from the present invention even when a gene encoding CD81 exists.
  • a transgenic mouse in which CD9 or CD81 has been introduced under a promoter specifically expressed in germ cells may be used.
  • CD9 gene-deficient female mice are infertile, these mice are usually obtained by crossing heterozygotes or crossing between female heterozygous females and male mice deficient in CD9 gene. There is a need to .
  • Female mice deficient in the CD81 gene also have a small number of births and are known to be infertile depending on the type of mouse. Therefore, in order to generate homozygotes of CD9 / CD81 double-deficient mice using current technology, it is necessary to use CD9 / CD81 double-deficient male mice and CD9ZCD81 double-deficient heterozygous female mice.
  • CD 9 gene Defective female mice are infertile because CD9 is expressed on egg cells and is essential for inducing fertilization with sperm. However, once fertilization has been established, it has been shown that CD 9 is not required for subsequent developmental processes, and that mice that do not have CD 9 give birth to fetuses. Based on this finding, we introduced at least CD9 under a promoter specifically expressed in cultured cells, which we devised so that it could be mated between homozygous males and females and strained.
  • CD9 / CD81 double deficient mouse (CD81 may also be introduced) is also included in the present invention.
  • CD9ZCD81 double-deficient mouse having CD81 introduced under a promoter specifically expressed in germ cells is not excluded from the present invention.
  • the CD9 / CD81 double-deficient mouse having CD9 or the like introduced under a promoter specifically expressed in germ cells as described above can be produced, for example, as follows.
  • a transgenic mouse (TGPzp3 :: CD9) was prepared by introducing a CD9 structural gene downstream of the promoter of the ZP3 gene, which is a gene specifically expressed in egg cells. :: When CD9 and CD9 gene-deficient mice were bred to create a mouse that did not have the CD9 gene but had the Pzp3 :: CD9 gene, the resulting mouse had CD9 in the egg cells. It was able to express and produce offspring.
  • CD9 / CD81 double-deficient mouse created by crossing the CD9-deficient mouse obtained in this way with the CD81-deficient mouse obtained by a conventional method, Cells also have newly introduced CD 9 (TG P zp 3:: CD 9), but do not express CD 9 under normal conditions in somatic cells. Nevertheless, it can be said that CD9 deficiency occurs at least in somatic cell lines. Therefore, such a mouse is also included in the scope of the present invention.
  • the infertility tendency of CD81-deficient female mice is thought to be due to the necessity of CD81 in the fertilization process, and can be resolved by the same method as that for CD9 gene-deficient mice.
  • Such a CD9 / CD81 double-deficient mouse expressing CD9 or CD9 and CD81 downstream of the ZP3 gene promoter is a mouse homozygous for the CD9 / CD81 double-deficient mouse. It is possible to breed between males and females, which is advantageous from the viewpoint that mass production is easy as a model mouse.
  • the homozygote has a phenotype in which osteogenesis is inhibited.
  • Having a phenotype in which osteogenesis is inhibited refers to a decrease in bone formation rate and histomorphometry in at least some bone tissues compared to wild-type compared to wild-type. Means that any of the bone formation parameters (osteoid thickness, osteoid surface, osteoblast surface) has decreased due to
  • the homozygote has a phenotype similar to that of human COPD.
  • the phenotype similar to COPD is most notably the infiltration of inflammatory cells and the expansion of air spaces in the alveolar septum of aged non-human animals.
  • Histological analysis of the CD9 / CD81 double-deficient mouse lung shows that with aging, more inflammatory cells infiltrate the alveolar septum than wild-type mice, and the air space is enlarged. These are consistent with the histological features of emphysema in human COPD.
  • ruptured images of the alveolar septum and hyperplasia of bronchial mucus-producing cells were observed, which are consistent with the pathology of COPD in humans.
  • the non-human animal can be at least one of an osteoporosis model animal and a COPD model animal.
  • the method of using the non-human animal as an osteoporosis model animal comprises the step of measuring the inhibition of bone formation of the non-human animal of the present invention.
  • a method of measuring osteogenesis inhibition in addition to the measurement of actual bone mass, etc., the morphological measurement of atsey and bone formation parameters (osteoid thickness, osteoid surface, osteoblast surface) by the injection of luciferin, and fracture
  • atsey and bone formation parameters osteoid thickness, osteoid surface, osteoblast surface
  • luciferin luciferin
  • fracture There is no particular limitation as long as it is a measurement method related to osteogenesis inhibition, such as measurement of bone resorption parameters by bone cells, and it can be appropriately selected from known measurement methods.
  • a method for screening for a therapeutic agent for osteoporosis may be mentioned.
  • the test compound which is a drug candidate compound, is administered to the non-human animal, the degree of osteogenesis inhibition is measured, and it is determined whether the test substance has an effect of suppressing osteogenesis inhibition. It is possible to screen for various drugs.
  • the administration form of the test substance is not particularly limited, and can be administered, for example, orally, by injection, or by application.
  • the method for use as the COPD model animal comprises a step of measuring the degree of a phenotype similar to chronic obstructive pulmonary disease in a CD9 / CD81 double deficient non-human animal of the present invention.
  • a method of measuring phenotypes similar to chronic obstructive pulmonary disease histological analysis of the lung was used to determine the infiltration of inflammatory cells in the alveolar septum and the expansion of the air space in the lungs of aged non-human animals. There is a method for analysis.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • Examples of a method for using the non-human animal as a COPD model animal include a method for screening for a therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease.
  • the non-human animal is administered a test substance, which is a scavenging compound of a drug, and the degree of osteogenesis inhibition is measured to determine whether the test substance has an effect of suppressing the phenotype indicative of chronic obstructive pulmonary disease. This allows screening for effective drugs.
  • the CD9 gene is isolated, and a targeting vector containing the mutant gene sequence in which a part of the gene is replaced with a genetic marker is prepared.
  • This targeting vector is introduced into mouse embryonic stem cells (ES cells) to cause homologous recombination with the CD9 gene, and ES cells that have undergone homologous recombination using a genetic marker as an index are obtained.
  • ES cells mouse embryonic stem cells
  • phase Mouse ES cells that have undergone homologous recombination are microinjected into fertilized eggs and transplanted into the uterus of pseudopregnant female mice, which are developed to obtain adult chimeric mice.
  • the male chimeric mouse is bred to a wild-type female mouse, and a heterozygote of a chimeric mouse individual in which an ES cell-derived CD9-deficient gene has been incorporated into the germ line based on coat color and the like is selected. Similarly, heterozygotes are obtained for CD81. A cross between a CD9 deficient heterozygote and a CD81 deficient heterozygote yields a CD9 / CD81 double deficient mouse.
  • mice were bred in an environmentally regulated clean room under specific pathogen-free (SPF) conditions at the Animal Research Facility attached to the Osaka University School of Medicine. All equipment and food, including cages, water bottles, wood shavings and food grains, were used sterile.
  • SPF pathogen-free
  • Genomic DNA for mouse CD9 was isolated from a 129 / sV mouse genomic phage library purchased from Stratagene using the full-length mouse CD9 cDNA (SEQ ID NO: 1) as a probe. Approximately 9 x 10 5 phage clones were screened by plaque hybridization and 20 positive clones were obtained. To determine if these clones encoded CD9, a second screen using a CD9 probe was performed separately. As a result, it was found that all clones were CD9-positive clones derived from a single phage clone. The resulting clones were digested with several restriction enzymes and partially sequenced to create a structural map of the genomic clones ( Figure 3). The resulting CD9 clone covered 60 kb of the gene and contained homologous sequences corresponding to the human CD9 gene exons 1 to ethasons 6.
  • Figure 3 shows the targeting strategy for the CD9 gene.
  • a portion of the isolated genomic clone was deleted with a restriction enzyme, and a positive selectable marker gene (neo-po 1 yA cassette) (po 1 yA means poly A) Yes) was purchased.
  • the construction of the targeting vector for CD9 involves constructing part of the second transmembrane region for mature CD9 between the ApaI and BamHI sites of exon 3 and etason4 from the fourth transmembrane region.
  • the DNA fragment of about 1.3 kb was deleted, and a neo-po1yA cassette was inserted instead of the DNA fragment.
  • a diphtheria toxin A fragment gene (DT) as a negative marker was inserted into the third and the end of the vector under the control of the thymidine kinase promoter (Fig. 3).
  • the homology regions at the 5 'and 3' ends were approximately 4 kb and 5 kb, respectively.
  • the ES cells used in the present invention are TT2 cells obtained from C57BL6 + CBA mice.
  • TT 2 cells can be obtained as described in Dr. Shinichi Aizawa (Experimental Medicine Separate Volume Biomanual Series 8, Gene Targeting-Generating Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha, 1995) .
  • elect port Paule ⁇ "Deployment against ES cells, 1 0 7 cells per approximately 20 -. 25 g to introduce linearized targeting vector electronics Toro Po configuration, for example Bio - in Rad Gene Pulser
  • the cells can then be transferred to ES medium (20% fetal serum serum (Sigma), mouse leukemia inhibitory factor (LIF Ezgro Amrad), sodium pyruvate (Nacalai Tesque).
  • Neomycin 200 ⁇ g / m1 sigma as a selective drug in Du1becco-modified Eag1e medium (Nacalai Tester) supplemented with, non-essential amino acids (Wako) and beta-mercaptoethanol (Nacalai Tesque) Change the culture medium containing the drug every day.
  • ES cells targeting the CD9 gene were implanted into fertilized embryos.
  • the method of transplantation can be appropriately modified by those skilled in the art, but in this example, it was modified from the report of Origin Nanore (Nagy et al., 1993, Proc. Acad. Sci. USA 90, 8424-8428).
  • a chimeric embryo was prepared by the injection method for the 8-cell stage embryo. Put ES cells between the zona pellucida and the blastomere in the 8-cell stage where compaction has not occurred in the hole on the plastic dish, and culture overnight in BBW medium or M16 medium. The formed blastocysts were transferred into the offspring of pseudopregnant female mice (Hogan et al.
  • Embryos that can be used as 8-cell stage embryos in the injection method may be derived from a cross between pure lines or from a cross between pure lines. In the present invention, 1. Embryo from shaku 1 It is desirable to use 4008261.
  • the mouse After maturation of an OS cell-derived embryo-derived chimeric mouse, the mouse is mated with a pure mouse female mouse, and ES cells are introduced into the germ line of the chimeric mouse by the coat color of the next-generation offspring. You can confirm that.
  • ES cells derived from the agouti line (TT2) were used, the chimeric mouse of oss produced was crossed with a black C57BL6 female mouse, and It was confirmed that the ES cells were introduced into the germ line of the chimeric mouse by the color of the coat color of the offspring of the offspring of the offspring of the offspring of the offspring.
  • TT2 agouti line
  • mice obtained by crossing the heterozygotes were screened for the presence of homologously recombined alleles by PCR using DNA isolated from the tail. For the PCR reaction, those having SEQ ID NOS: 3 to 5 below the primers were used.
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were used to detect the deleted aryl, and SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 were used to detect the wild type aryl.
  • PCR reaction buffer was 50 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.001% Tween 20, 0.001% the NP - 40, 5 0% Guriseronore were performed at 2 5 mM Mg S 0 4, 2mMdNTP and 1 U / ⁇ 1 polymerase (KODP 1 us Toyobo).
  • the PCR cycle conditions were as follows: a reaction was performed at 94 ° C for 15 seconds, at 62 ° C for 30 seconds, and at 68 ° C for 1 minute as one cycle, and the reaction was performed for 30 cycles. As shown in Fig. 5, it was confirmed that the heterozygous (H) has both the recombined allele and the wild-type allele, and the homozygous (K) has only the recombined allele.
  • PC orchid 004/008261 We also found that homozygotes were produced according to the Mendelian ratio by crossing heterozygotes.
  • a region containing all of exons 3 to etason 7 and a part of etason 8, that is, a DNA fragment of about 3 kb including a portion from the second transmembrane region to the C-terminus of mature CD81 was deleted with restriction enzyme BamHI and a neo-po1yA cassette was inserted instead of the DNA fragment.
  • the intron and exon information of CD81 can be found at accession number AJ251835.
  • ES clones grown in the presence of neomycin were pooled and genomic DNA was isolated from them. Clones were screened by Southern blot hybridization to confirm whether homologous recombination had occurred.
  • CD81 gene-deficient mice were created in the same manner as CD9. Heterozygotes were healthy and fertile in the CD81-deficient mouse pups created. Mice obtained by crossing heterozygotes were screened for PCR using homologous recombination alleles using PCR using DNA isolated from the tail. In the PCR reaction, primers having the following SEQ ID NOs: 6 to 9 were used.
  • P2 5,-TCTCATGGAAAGTCTTCACCACAG-3, (SEQ ID NO: 7)
  • SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 are wild type allyl
  • SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are missing 2004/008261 Used to detect aryl.
  • the knockout mouse of CD81 was prepared according to the method described in Non-Patent Document 1, “Maecker HT, Levy S. J Exp Med. 1997 Apr 21; 185 (8): 1505- 10. Normal lymphocyte development but delayed humoral Immune response in CD81-null mice. "and" Tsitsikov EN, Gutierrez-Ramos JC, Geha RS. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Sep 30; 94 (20): 10844-9. Antibody response to type II T independent antigen and reduction of Bl cells in CD81—deficient mice. ”
  • a heterozygous mouse was produced for the CD9 / CD81 gene double-deficient mouse. Furthermore, by crossing male and female heterozygotes of the double deficient mouse of CD9 / CD81 gene, a mouse homozygote of double deficient mouse of CD9 / CD81 gene was produced.
  • Histological examination of the proximal tibia was performed using an 8-week-old mouse.
  • the tibia of 8-week-old wild-type and CD9ZCD81 double-deficient mice were fixed with 90% ethanol, and non-decalcified specimens were embedded in glycomethacrylate. A 3 mm wide section of the proximal tibia was stained with toluidine blue or TRAP.
  • Figure 9 shows the results of staining with Tolusimple I and the results of staining with TRAP. 08261
  • the arrowhead indicates the cortical bone, and the cortical bone was thinner in the CD9ZCD81 double-deficient mouse than in the wild type.
  • osteoclasts are dark (red in actual pictures).
  • the femoral shaft was analyzed by p QCT (peripheral quant itative computed tomography) analysis.
  • the pQCT analysis was performed using XCTrese arsch S A (Stratectechnik) after fixing the mouse femur with 10% formalin.
  • the diaphyseal contour was determined by automatic analysis using the pQCT soft-to-air algorithm. Analysis results are shown in Fig. 10 AC
  • CD9 / CD81 double-deficient (WKO) mice have reduced bone mass and bone strength compared to wild-type mice, CD9-deficient (KO) mice, and CD81-deficient (KO) mice was.
  • Morphometry of the proximal tibia of an 8-week-old mouse was performed.
  • Calcine assay is a well-established technique used to measure osteoblastic bone formation, taking advantage of the fact that calcium is incorporated into bone during bone formation.
  • FIGS. 12A and B show photographs by a fluorescence microscope and bone formation rates calculated by an Osteoplan II (Zeiss) semi-automation system.
  • CD9 / CD81 double-deficient mice In the CD9 / CD81 double-deficient (DKO) mouse, the distance between the two bands was smaller than that in the wild-type (wi1d) mouse, and the bone formation rate was reduced. Bone formation rate of CD 9 / CD 81 double-deficient mice was reduced to about 60% of wild type
  • the CD9 / CD81 double-deficient mice are mice lacking membrane proteins and exhibit a pathology similar to low-rotation osteoporosis seen in aging. This confirmed that it could be used as an animal model for low-rotation osteoporosis.
  • Isolate ZP3 a gene specifically expressed in egg cells, and promote this gene.
  • An Eco RV site was artificially inserted downstream of a fragment of about 6 kb containing the PC Kasumi 004 protein, and a vector was prepared in which a blunt-ended CD9 structural gene was inserted into this Eco RV site.
  • Transgenic mice (TGPzp3 :: CD9) carrying this gene were created.
  • mice were bred to produce mice that did not have the CD9 gene but had the Pzp3 :: CD9 gene.
  • Pzp3 CD9-deficient mouse having the CD9 gene and a CD81-deficient mouse obtained by a conventional method were crossed, and both germ cells and somatic cells were newly introduced.
  • Orcein staining showed rupture of elastic fibers
  • PAS staining showed hyperplastic images of goblet cells (stained in red) with mucus-producing ability. (Fig. 15).
  • Bronchoalveolar lavage fluid was collected from randomly selected 10-week-old CD9 / CD81 double-deficient mice and wild-type mice, and MMP activity was examined by gelatin zymogram. Bronchoalveolar lavage
  • Bronchoalveolar lavage fluid supernatant was collected from four randomly selected 10-week-old wild-type CD 9 / CD 8 1 double-deficient mice and concentrated 10-fold in Centricon 10. .
  • the concentrate was injected into a 10% gelatin zygogram gel and electrophoresed under non-reducing conditions. After staining with Coomassie blue, destaining was performed and the gelatin dissolving activity of MMP was detected.
  • the CD9 / CD81 double-deficient mice showed emphysema and hyperplasia of mucus-producing cells, and had lung lesions matching the pathological image of COPD in humans.
  • osteoporosis which is associated with a high rate of COPD in COPD patients, is considered to be a disease model that reflects the pathology of COPD more faithfully than the gene-engineered mice reported so far.
  • COPD model animals are also effective for screening therapeutic agents.
  • a CD9 / CD81 double-deficient non-human animal which is well represented and can be used as a model animal, showing the pathology of osteoporosis and COPD, and the non-human animal as an osteoporosis model animal COPD model Methods can be provided for use as at least one of the animals.

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Abstract

　本発明の目的は、低回転型の骨粗鬆症および慢性閉塞性肺疾患の病態をよく表しモデル動物として、骨粗鬆症治療薬または慢性閉塞性肺疾患治療薬の薬剤スクリーニング等に利用できる非ヒト動物を提供することにある。本発明は、少なくとも体細胞において、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子が欠損することを特徴とする非ヒト動物並びに該非ヒト動物の骨形成阻害の程度を測定する工程を含んでなる該ヒト動物の骨粗鬆症モデル動物としての使用方法および該非ヒト動物の慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の程度を測定する工程を含んでなる該ヒト動物の慢性閉塞性肺疾患モデル動物としての使用方法である。

Description

明 細 書
C D 9 / C D 8 1二重欠損非ヒ ト動物 技術分野
本発明は、 モデル動物として骨粗鬆症治療薬または慢性閉塞性肺疾患治療薬の 開発等に利用できる、 C D 9遺伝子および C D 8 1遺伝子を欠損した二重欠損非 ヒ ト動物に関する。 背景技術
C D 9および C D 8 1は、 テトラスパニンと呼ばれるタンパク質のファミリ一 メンバーとして知られている。 テトラスパニンはその名が示すとおり、 細胞膜を 4回貫通する構造を持つスーパーファミリーであり、 ほ乳類ではこれまでに約 3 0のメンパーが知られている。 細胞の増殖、 運動、 融合や癌細胞の浸潤、 転移な どに関わっているとされているがその機能の詳細は不明であった。 しかし最近、 C D 8 1 (例えば非特許文献 1参照） や C D 9 (例えば非特許文献 2参照） のノ ックァゥトマウスが作成され、 それぞれ抗体 ·サイ トカイン産生の異常と不妊症 を示すことから、 免疫系や生殖系におけるテトラスパニンの重要性が明らかにさ れた。
骨粗鬆症は主に閉経後の女性や高齢者に見られる疾患であり、.病的骨折や脊椎 変形の原因となる。 そこで、 骨粗鬆症のより有効な治療薬の開発が求められてい るが、 その際の実験モデルとなるモデル動物は少ない。 現在骨粗鬆症モデル動物 としては、 卵巣を摘出したマウスが多用されており、 このマウスは、 閉経後の女 性に多く見られる、 エストロゲンの低下による破骨細胞活性亢進型の骨粗鬆症の モデル動物として優れていると考えられている。 一方、 骨粗鬆症のメカニズムと しては、 骨形成に関わる骨芽細胞の活性が低下するいわゆる低回転型のものもあ り、 このよ'うな病態をよく表すモデル動物が求められている。
なお、 骨芽細胞による骨形成と前記テトラスパニンとの関係については、 その 関係は全く不明であった。
一方、 閉塞性呼吸機能障害をきたす慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive P ulmonary Disease, 以下 C O P Dと称することがある）は、 胞隔の破壊と気腔の 拡大を特徴とする肺気腫と気道分泌物の慢性的な増加を伴う慢性気管支炎とから なるが、 しばしばこの両者が混在する。 その病態は、 喫煙に対する肺への異常な 炎症細胞浸潤とタンパク分解酵素の産生である。
COPDは喫煙が発症の大きなリスクファクターであり、 その罹患率は世界中 で上昇している。 WHOによると、 現在 COPDは死亡原因の第 5位であり、 2 0 20 年には第 3位になると予測されている。 しかし、 CO PDの発症メカ二 ズムはまだ明らかではない。 また、 スモーカーであっても CO PDを発症するの はその 1 5-20%であり、 喫煙に対する感受性に個人差があると考えられるが 、 その科学的な裏付けも十分されていない。
さらに最近、 COPD患者が単に肺のみならず、 高率に体重減少や筋力低下、 骨粗鬆症などの全身性合併症を併発し、 AD Lや呼吸機能の低下を加速すること が分かってきた （例えば非特許文献 3参照） 。 ステロイ ド薬の投与、 ビタミン D 不足、 喫煙などがこれら全身性変化の要因と考えられているが、 肺外病変の真の メカニズムは不明である。
これまでに肺気腫発症のメカニズム解明や治療法開発のため遺伝子操作マウス が作成され、 例えばプロテアーゼの一種であるコラゲナーゼ過剰発現マウスでは 肺気腫を生じることが確認されている。 ノックアウトマウスとしては、 surfacta nt protein D ゃィンテグリン β 6ノックァゥトマウスなどでの肺気腫の報告が なされている （例えば非特許文献 4および非特許文献 5参照） がその数は少なく 、 またこれらのマウスで骨粗鬆症などの肺外病変を合併するとの報告はない。
(非特許文献 1) Maecker HT. J Exp Med 185:1505-1510, 1997
(非特許文献 2) Miyado K. Science 287:321-324， 2000
(非特許文献 3) Biskobing DM. Chest 121:609-620， 2002
(非特許文献 4) Wert SE. Proc Natl Acad Sci USA 97:5922-5977, 2000 (非特許文献 5) Morris DG Nature 422:169- 173, 2003 発明の開示
本発明は、 従来における前記諸問題を解決し、 以下の目的を達成することを課 題とする。 即ち、 骨粗鬆症および慢性閉塞性肺疾患 （COPD) の少なくともい ずれかの病態をよく表すモデル動物として利用できる CD 9 /CD 8 1二重欠損 非ヒ ト動物、 並びに、 該非ヒ ト動物を骨粗鬆症モデル動物おょぴ COP Dモデル 動物の少なく ともいずれかとして使用する方法を提供することを目的とする。 発明者らは、 テトラスパニンタンパクファミリーのメンバーである CD 9と C D 8 1の二重欠損マウスを作成し、 この変異マウスに骨粗鬆症および CO PDが 起こるとの知見を得たことにより、 本発明に至った。
すなわち本発明の前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
< 1 > 少なく とも体細胞において、 CD 9をコードする遺伝子および CD 8 1をコードする遺伝子の機能が欠損することを特徴とする CD 9ZCD 8 1二重 欠損非ヒ ト動物である。
< 2 > 非ヒ ト動物が齧歯類動物である前記 < 1〉に記載の CD 9/CD 81 二重欠損非ヒ ト動物である。
< 3 > 齧歯類動物がマウスである前記 < 2 >に記載の CD 9/CD 8 1二重 欠損非ヒ ト動物である。
< 4 > CD 9をコードする遺伝子が下記（a)および（b)のいずれかであり、 CD 8 1をコードする遺伝子が下記（c)および（d)のいずれかである前記く 1〉 からく 3 >のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物である。
( a )配列番号 1に記載の塩基配列からなる D N A
(b)配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAに相捕的な DNAとス トリンジ ヱントな条件下でハイプリダイズする DN A
( c )配列番号 2に記載の塩基配列からなる D N A
(d)配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNAに相補的な DNAとストリンジ ヱントな条件下でハイプリダイズする DNA
< 5 > 体細胞および生殖細胞においても、 CD 9をコードする遺伝子および CD 8 1をコードする遺伝子の機能が欠損する前記 < 1 >から < 4 >のいずれか に記載の CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物である。
< 6 > 生殖細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターの下流に CD 9をコ 一ドする遺伝子および CD 8 1をコードする遺伝子の少なくともいずれかが導入 され、 生殖細胞において CD 9をコードする遺伝子および CD 8 1をコードする 遺伝子の少なくともいずれかの機能が欠損しない前記 < 1 >から < 4 >のいずれ かに記載の CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物である。 '
< 7 > 骨形成が阻害された表現形質および慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質 の少なくともいずれかを有する前記 < 1〉から < 6 >のいずれかに記載の CD 9 /CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物である。
< 8 > 骨粗鬆症モデル動物および慢性閉塞性肺疾患モデル動物の少なく とも いずれかである前記 < 1 >からく 7 >のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重 欠損非ヒ ト動物である。
< 9 > 前記 < 1〉から < 7 >のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重欠損 非ヒ ト動物の骨形成阻害の程度を測定する工程を含んでなることを特徴とする、 該 CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物を骨粗鬆症モデル動物として使用する方 法である。
< 1 0 > 前記 < 1 >からく Ί〉のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重欠 損非ヒ ト動物に被験物質に投与し、 該被験物質が骨形成阻害を抑制する効果を有 するかどうか検定する骨粗鬆症治療薬スクリーユング方法である前記 < 9 >に記 載の方法である。
< 1 1 > 前記く 1 >から < 7 >のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重欠 損非ヒ ト動物の慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の程度を測定する工程を含んで なることを特徴とする、 該 CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物を慢性閉塞性肺 疾患モデル動物として使用する方法である。
< 1 2 > 前記く 1 >から < 7 >のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重欠 損非ヒ ト動物に被験物質に投与し、 該被験物質が慢性閉塞性肺疾患を表す表現形 質を抑制する効果を有するかどうか検定する慢性閉塞性肺疾患治療薬スクリ一二 ング方法である前記 < 1 1〉に記載の方法である。
< 13 > 前記く 1 >に記載の CD 9 /CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物の、 骨粗鬆 症モデル動物おょぴ慢性閉塞性肺疾患モデル動物の少なく ともいずれかを製造す るための使用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 CD 9の全長 DNA配列を表す。
図 2は、 CD 8 1の全長 DNA配列を表す。
図 3は、 CD 9ノックァゥトマウス製造のための遺伝子ターゲッティングに関 するゲノム DNA、 構築ベクターおよび組換え DNAを表す。
図 4は、 CD 9サザンブロットの結果を表す。
図 5は、 CD 9 P C Rの結果を表す。
図 6は、 30週令の野生型 （w i 1 d) および CD 9/CD 81二重欠損 （D KO) マウスの全身骨格の X線像である。
図 7は、 30週令の野生型 （w i 1 d) および CD 9/CD 81二重欠損 （D KO) マウスの大腿骨の X線像である。
図 8は、 30週令の野生型 （w i 1 d) および CD 9ZCD 81二重欠損 （D KO) マウスの脊椎の X線像である。
図 9は、 8週令の野生型 （w i I d) および CD 9/CD 8 1二重欠損 （DK O) マウスの脛骨近位部における骨組織を、 上段がトルイジンブルーおよび下段 が TRAPで染色した結果を表す。
図 1 OAは、 8週令の野生型 （w i l d) と CD 9欠損マウス、 CD 8 1欠損 マウス、 CD 9/CD 81二重欠損 （DKO) マウス骨の p Q C T解析結果を表 す。
図 1 O Bは、 骨量の解析結果を示す。
図 1 O Cは、 骨強度の解析結果を示す。
図 1 1 Aは、 8週令の野生型、 CD 9欠損 （CD 9 KO) マウス、 CD 8 1欠 損 （CD 8 1 KO) マウス、 CD 9ZCD 8 1ダブルへテロ （CD 9/CD 8 1 DHO) マウス、 CD 9 ZCD 81二重欠損ホモ （ C D 9 / C D 81 D K O) マ ウスの脛骨近位部の形態計測結果のうち、 単位骨量を表す。
図 1 1 Bは、 図 1 1 Aと同様のマウスの形態計測結果のうち、 骨梁幅を表す。 図 1 1 Cは、 図 1 1 Aと同様のマウスの形態計測結果のうち、 骨粱数を表す。 図 1 1 Dは、 図 1 1 Aと同様のマウスの形態計測結果のうち、 類骨厚を表す。 図 1 1 Eは、 図 1 1 Aと同様のマウスの形態計測結果のうち、 類骨面を表す。 図 1 1 Fは、 図 1 1 Aと同様のマウスの形態計測結果のうち、 骨芽細胞面を表 す。
図 1 1 Gは、 図 1 1 Aと同様のマウスの形態計測結果のうち、 破骨細胞数を表 す。
図 1 1 Hは、 図 1 1 A.と同様のマウスの形態計測結果のうち、 破骨細胞面を表 す。
図 1 2 Aは、 8週令の野生型 （w i 1 d) マウス、 CD 9欠損 （CD 9 KO) マウス、 CD 8 1欠損 （CD 8 1 KO) マウスおよび CD 9/CD 8 1二重欠 損 （DKO) マウスにおける力ルセインアツセィの結果を表す。
図 1 2 Bは、 カルセィンアツセィによる骨形成率を表す。
図 1 3は、 実施例 8における、 野生型 （W i 1 d) マウスおょぴ CD 9ZCD 8 1二重欠損 （DKO) マウスにおける気腔の拡大と胞隔への炎症細胞浸潤を表 す。
図 14は、 実施例 8における、 形態計測による野生型 （W i I d) マウスおよ び CD 9/CD 8 1二重欠損 （DKO) マウス肺胞腔径の加令変化を表す。 図 1 5は、 実施例 8における、 野生型 （W i l d) マウスおよび CD 9/CD 8 1二重欠損マウス （DKO) における弾性線維の靳裂と杯細胞の過形成を表す 図 1 6は、 実施例 9における、 野生型 （W i I d) マウスおょぴ CD 9ZCD 8 1二重欠損 （DKO) マウス気管支肺胞洗浄液中の MMP活性亢進を表す。 図 1 7は、 実施例 9における、 野生型 （W i I d) マウスおょぴ CD 9ノ CD 8 1二重欠損 （DKO) マウスの気管支肺胞洗浄液中の細胞数増加を表す。 4008261
発明を実施するための最良の形態
発明者らは、 テトラスパニンタンパクフアミリーのメンパーである CD 9と C D 8 1の二重欠損マウスを初めて作成し、 この変異マウスに骨粗鬆症が起こると の知見を得た。 CD 9/CD 8 1二重欠損マウスはワイルドタイプマウスに比べ 、 骨格が小さく脊椎後弯を認め、 皮質骨の菲薄化、 骨の X線透過性亢進が認めら れた。 骨組織の形態学的解析から、 破骨細胞の増加と機能低下、 骨芽細胞の機能 低下が示唆された。 また、 力ルセイン注射により、 CD 9 /CD 8 1二重欠損マ ウスでの骨形成率はワイルドタイプの 6 0 %に低下していることが明らかとなつ た。 以上から、 CD 9/CD 8 1二重欠損マウスは低回転型の骨粗鬆症を示し、 ヒ トの老化の一徴候としての骨粗鬆症のモデルとなることが確認された。
発明者らは、 更に、 この変異マウスにヒ トの慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstr uctive Pulmonary Disease, COPD)類似の病態が起こるとの知見を得た。 CD 9 /CD 8 1二重欠損マウス肺を組織学的に解析すると、 加齢とともにワイルドタ イブマウスに比べ胞隔に多くの炎症細胞が浸潤し、 気腔の拡大を認めた。 また、 胞隔弹性線維の断裂像と気管支粘液産生細胞の過形成像が観察され、 ヒ トでの C O PDの病態に矛盾しないものであったため、 該 CD 9/CD 8 1二重欠損マウ スは C O P Dのモデルとなることが確認された。
本発明の非ヒ ト動物は、 少なく とも体細胞において、 CD 9をコードする遺伝 子おょぴ CD 8 1をコードする遺伝子の機能が欠損する （本明細書中、 「CD 9 ZCD 8 1二重欠損」 ということがある） 。
非ヒ ト動物は、 ヒ ト以外の動物であれば特に制限はないが、 例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ、 ィヌ、 ヒッジ、 ャギなどの哺乳動物、 ニヮトリなどの鳥 類、 マス等の魚類等が挙げられ、 哺乳動物であることが好ましく、 齧歯類動物で あることがより好ましい。 中でもマウスはライフサイクルが短く繁殖が容易であ り、 遺伝子欠損動物の作成技術も確立されている点で特に好ましい。
ここで、 「遺伝子の機能が欠損する非ヒ ト動物」 とは、 遺伝子に変異を有する ことにより、 該遺伝子の機能が欠損している遺伝子を有する非ヒ ト動物をいう。 機能が欠損した遺伝子としては、 変異の無い正常遺伝子と比較して、 遺伝子発現 が抑制されるか、 その遺伝子産物の活性が失われたり低下したりする遺伝子が挙 げられる。 この要件を具備する限り、 変異は欠失のみでなく、 付加および置換も 含み、 変異の部位や長さには制限がない。 変異の導入方法としては特に制限はな いが、 細胞に、 標的となる遺伝子の塩基配列に変異を導入した D N Aを導入し、 相同的組換え体を選択することにより、 標的とする遺伝子に突然変異を導入する 遺伝子ターゲッティングの手法により行なうことができる。 変異を導入するター ゲッティングの部位は、 プロモータ領域、 非翻訳領域、 翻訳領域などいずれであ つてもよい。 例えば、 遺伝子のプロモータ領域の塩基配列の欠失や置換によって 、 転写活性が損なわれた変異遺伝子を得ることができる。 また、 非翻訳領域の塩 基配列の欠失や置換によって安定な転写産物が合成されなくなった変異遺伝子を 得ることもできる。 また、 翻訳領域内の塩基配列の欠失や置換によって、 遺伝子 産物が得られないか、 遺伝子産物が得られても、 それがタンパク質として正常に 機能しない変異遺伝子などを得ることもできる。 遺伝子の機能を効率よく完全に 欠損させるには、 翻訳領域をターゲット部位とすることが好ましい。 また、 導入 される遺伝子には、 薬剤に対する耐性遺伝子等、 選択マーカーを挿入することが 目的の組換え体を容易に選択することができる観点などから好ましい。 ここで、 C D 9をコードする遺伝子および C D 8 1をコードする遺伝子の機能が欠損する とは、 C D 9をコードする遺伝子の機能と C D 8 1をコードする遺伝子の機能と が共に欠損することをいい、 主として、 いわゆるダブルノックアウトをいう。 また、 本発明の非ヒ ト動物としては、 機能が欠損している変異型遺伝子が染色 体上でホモの状態で存在しているもの （ホモ接合体） であってもよいし、 ヘテロ の状態で存在しているもの （ヘテロ接合体） であってもよい。 ヘテロ接合体は主 にホモ接合体の繁殖のために利用できる。
ここで、 C D 9をコードする遺伝子は、 サケ （AF427519) 、 ニヮトリ （AB0327 67) 、 マウス （NM_007657) 、 ラット （XM_216279) 、 ネコ （D30786) 、 ィヌ （U1 5792) 、 ブタ （AF525029) 、 ゥシ （NM_173900) 、 サル （D10726) およびヒ ト （N M 001769) などに存在することが知られており、 C D 8 1をコードする遺伝子は JP2004/008261
、 ゼブラフィッシュ （NM— 131518) 、 ニヮ トリ （AB101638) 、 マウス （NM一 133655 ) 、 ラット （NM— 013087) 、 サル （AF116600) およびヒ ト （NM一 004356) などに存 在することが知られている。 なお、 括弧内は G e n b a n kのァクセッション番 号であり、 この番号から、 遺伝子の塩基配列情報および該遺伝子がコードするタ ンパク質のアミノ酸配列情報にアクセスすることができる。 例えば、 既報のマウ スにおける、 CD 9をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 1 (図 1) 、 CD 8 1をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 2 (図 2) に記載した。 また、 マ ウスの CD 9タンパク質のァミノ酸配列を配列番号 1 0に、 CD 81タンパク質 のァミノ酸配列を配列番号 1 1に示す。
配列番号 1 0 :
mpvkggskci kyllf gfnf i fwlagiavla lglwlrf dsq t sif eqenn hssfytgvyi ligagalmml vgf lgccgav qesqcmlglf f gf llvif ai eiaaavwgyt hkdevikelq efykdtyqkl rskdepqret lkaihmaldc cgiagpleqf isdtcpkkql lesf qvkpcp eaisevfnnk fhiigavgig iavvmif gmi f smilccair rsremv
配列番号 1 1 ：
mgvegctkci kyllfvfnfv fwlaggvilg val lrhdpq ttsllylelg nkpapntfyv giyiliavga vmmfvgf lgc ygaiqesqcl lgtfftclvi If acevaagi wgfvnkdqia kdvkqfydqa lqqavmddda nnakavvktf hetlnccgsn alttltttil rns丄 cpsggn iltpllqqdc hqkidelf sg klyligiaai vvavimif em ilsmvlccgi rnssvy また、 CD 9をコードする遺伝子および CD 81をコードする遺伝子は、 既報 の配列を有するものに限られず、 前記以外の動物においても、 CD 9をコードす る遺伝子は、 配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAに相補的な DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA、 CD 81をコードする遺 伝子は、 配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNAに相補的な DNAとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする DN Aとして存在する。 ここで、 スト リンジェントな条件の例としては、 65°C 4x SSCにおけるハイプリダイゼーショ ン、 次いで 65°Cで 1時間 0. lx SSC中での洗浄などが挙げられる。 また、 前記以外 の動物の CD 9をコードする遺伝子としては、 配列番号 1に記載の塩基配列から なる DN Aがコードするタンパク質のアミノ酸配列 （配列番号 10) において、 1若しくは複数、 好ましくは 1若しくは数個のアミノ酸残基が付加、 欠失または 置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。 同様に、 前記以外の動物の CD 81をコードする遺伝子としては、 配列番号 2に 記載の塩基配列からなる DN Aがコードするタンパク質のアミノ酸配列 （配列番 号 1 1) において、 1若しくは数個のアミノ酸残基が付加、 欠失または置換され たァミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
本発明の非ヒ ト動物は、 CD 9をコードする遺伝子および CD 8 1をコードす る遺伝子の機能が欠損するものであるが、 この 「機能の欠損」 は少なく とも体細 胞系において起こっていれば良い。 すなわち、 該非ヒ ト動物元来の CD 9遺伝子 および CD 8 1遺伝子の機能が欠損しており、 体細胞において通常の条件におい て発現しないプロモーター下に新たに導入された CD 9をコードする遺伝子およ び/または CD 8 1をコードする遺伝子が存在している場合等であっても本発明 から排除されない。 生殖細胞に特異的に発現するプロモーター下に CD 9や CD 81を導入したトランスジェユックマウスであってもよい。
すなわち、 後述するような通常の遺伝子ターゲッティングの手法によれば、 生 殖細胞を含めた全ての細胞で組換えが起き、 全ての細胞で機能を有する標的タン パク質が発現しない非ヒ ト動物が得られるが、 CD 9遺伝子欠損雌マウスは不妊 であるため、 通常このマウスを得るためにはへテロ接合体同士の交配、 あるいは へテ口接合体雌と C D 9遺伝子欠損雄マウスの交配によって作成する必要がある 。 また、 CD 8 1遺伝子欠損雌マウスも出産数が少なく、 マウスの系統によって は不妊になることが知られている。 したがって、 現行の技術で、 CD 9 /CD 8 1二重欠損マウスホモ接合体を作成するためには、 CD 9 /CD 81二重欠損雄 マウスと CD 9ZCD 81二重欠損へテロ接合体雌マウスの交配によって得るこ とが最も効率的であるが、 この交配で CD 9 /CD 8 1二重欠損マウスホモ接合 体が生まれる確立は 25%であり、 実験モデルマウスとして有用な CD 9/CD 81二重欠損マウスホモ接合体を大量に作成するには不利である。 CD 9遺伝子 欠損雌マウスが不妊である理由は、 CD 9が卵細胞に発現しており、 精子と受精 反応を起こす際に必須であることによる。 しかし、 ひとたび受精が成立すると、 その後の発生過程に CD 9は必要でなく、 CD 9を持たないマウスにおいても胎 仔を出産することが明らかになつている。 この知見をもとに、 ホモ接合体雌雄間 において交配可能であり、 ストレイン化可能なように本発明者らが考案した、 生 殖細胞に特異的に発現するプロモーター下に少なく とも CD 9を導入した （CD 81も導入していてもよい） CD 9/CD 8 1二重欠損マウスも本発明に含まれ る。 また、 同様に、 生殖細胞に特異的に発現するプロモーター下に CD 81を導 入した CD 9ZCD 8 1二重欠損マウスも本発明から排除されない。
前記のような生殖細胞に特異的に発現するプロモーター下に CD 9等が導入さ れた CD 9 /CD 8 1二重欠損マウスは、 例えば以下のように作製できる。 卵細 胞特異的に発現する遺伝子である Z P 3の遺伝子のプロモーターの下流に CD 9 構造遺伝子を導入したトランスジェユックマウス （TGP z p 3 : ： CD 9 ) を 作成し、 次に、 TGP z p 3 ： ： CD 9と CD 9遺伝子欠損マウスを交配させ、 CD 9遺伝子は持たないが P z p 3 ： ： CD 9遺伝子を持つマウスを作成したと ころ、 得られたマウスは、 卵細胞においては CD 9を発現し、 子孫を作ることが できた。 このように、 Z P 3のような卵細胞特異的に発現する遺伝子のプロモー ターの下流に CD 9を遺伝子導入する手法を用いることにより、 体細胞では CD 9遺伝子の機能が欠損して CD 9が発現せず、 CD 9遺伝子欠損マウスの性質を 有し、 かつ、 ホモ接合体雌雄間での交配が可能となり、 CD 9遺伝子欠損マウス や CD 9/CD 8 1二重欠損マウスを大量に作成する上で大変有利である。
このようにして得られた CD 9欠損マウスと通常の方法により得られた CD 8 1欠損マウスとを交配させることにより作成された CD 9 /CD 8 1二重欠損マ ウスは、 生殖細胞も体細胞も新たに導入された CD 9 (TG P z p 3 ： : CD 9 ) を有しているが、 体細胞においては通常の状態で CD 9を発現しないことから 、 機能を有する CD 9を発現するとはいえず、 少なくとも、 体細胞系において、 CD 9欠損が起こっているといえる。 したがって、 このようなマウスも本発明の 範囲に含まれる。 CD 8 1欠損雌マウスの不妊傾向も CD 8 1が受精過程に必要であるからと考 えられており、 CD 9遺伝子欠損マウスと同様の方法で解決が可能である。 この ような、 Z P 3遺伝子プロモーターの下流で CD 9、 又は、 CD 9と CD 8 1 と を発現する CD 9 /CD 8 1二重欠損マウスは、 CD 9 /CD 8 1二重欠損マウ スホモ接合体雌雄間での交配が可能となり、 モデルマウスとして大量作成が容易 である観点から有利である。
本発明の CD 9/CD 8 1二重欠損動物において、 ホモ接合体は、 骨形成が阻 害された表現形質を有する。 骨形成が阻害された表現形質を有するとは、 体の少 なくとも一部の骨組織において、 野生型に比べて、 少なく とも力ルセイン注射に より測定される骨形成率の低下および組織形態計測による骨形成パラメーター （ 類骨厚、 類骨面、 骨芽細胞面） の減少のいずれかが生じていることをいう。
また、 本発明の CD 9/CD 8 1二重欠損動物において、 ホモ接合体は、 ヒ ト の COPDに類似の表現形質を有する。 COPDに類似の表現形質とは、 最も特 徴的には、 加齢した非ヒ ト動物の肺の胞隔における炎症細胞の浸潤および気腔の 拡大が挙げられる。 CD 9/CD 8 1二重欠損マウス肺を組織学的に解析すると 、 加齢とともにワイルドタイプマウスに比べ胞隔に多くの炎症細胞が浸潤し、 気 腔の拡大が認められる。 これらは、 ヒ トの COPDにおける肺気腫の組織学的特 徴と一致する。 また、 胞隔弾性線維の断裂像と気管支粘液産生細胞の過形成像が 観察され、 ヒ トでの C O PDの病態と矛盾しない。
前記非ヒ ト動物は、 骨粗鬆症モデル動物および COPDモデル動物の少なく と もいずれかとなることができる。
該非ヒ ト動物を骨粗鬆症モデル動物として使用する方法は、 前記本発明の非ヒ ト動物の骨形成阻害を測定する工程を含んでなる。 骨形成阻害の測定方法として は、 実際の骨量の測定等の他、 前記力ルセイン注射によるアツセィおよび骨形成 パラメーター （類骨厚、 類骨面、 骨芽細胞面） の組織形態計測や、 破骨細胞によ る骨吸収のパラメータの測定等、 骨形成阻害に関連する測定方法であれば、 特に 制限はなく、 公知の測定方法中からの中から適宜選択することができる。
また、 前記非ヒ ト動物を骨粗鬆症モデル動物として使用する方法としては、 骨 粗鬆症治療薬スクリーニング方法が挙げられる。 該非ヒ ト動物に、 薬剤の候補化 合物である被験物質を投与し、 骨形成阻害の程度を測定し、 該被験物質が骨形成 阻害を抑制する効果を有するかどうか検定することにより、 有効な薬剤をスクリ 一ユングできる。
被験物質の投与形態には特に制限はなく、 例えば、 経口、 注射、 塗布等により 投与することができる。
該 C O P Dモデル動物として使用する方法は、 本発明の C D 9 / C D 8 1二重 欠損非ヒ ト動物の慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の程度を測定する工程を含ん でなる。 慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の測定方法としては、 肺の組織学的解 析により、 加齢した非ヒ ト動物の肺における、 胞隔における炎症細胞の浸潤およ ぴ気腔の拡大を解析する方法が挙げられる。 また、 組織学的解析により、 胞隔弾 性線維の断裂像や気管支粘液産生細胞の過形成像を解析する方法も挙げられる。 更に、 本発明の非ヒ ト動物に認められ、 C O P Dに関与すると考えられる、 気管 支肺胞洗浄液中のマクロファージの数増加や、 マトリックスメタ口プロテアーゼ (matrix metalloproteinase, MM P )活性 （特に MM P - 2およぴ MM P - 9 ) の 增強を測定する方法も挙げられる。
また、 前記非ヒ ト動物を C O P Dモデル動物として使用する方法としては、 慢 性閉塞性肺疾患治療薬スクリーニング方法が挙げられる。 該非ヒ ト動物に、 薬剤 の候捕化合物である被験物質を投与し、 骨形成阻害の程度を測定し、 該被験物質 が慢性閉塞性肺疾患を表す表現形質を抑制する効果を有するかどうか検定するこ とにより、 有効な薬剤をスクリーニングできる。
C D 9 / C D 8 1二重欠損非ヒ ト動物の製法については、 特に制限はなく、 公 知の方法で行うことができるが、 マウスに例を挙げると、 通常以下のように製造 することができる。
C D 9遺伝子を単離して、 その一部を遺伝マーカーで置換した変異遺伝子配列 を含むターゲッティングベクターを作成する。 このターゲッティングベクターを マウス胚性幹細胞 （E S細胞） に導入し、 C D 9遺伝子と相同的組換えを起こさ せ、 遺伝マーカーを指標にして相同的組換えを起こした E S細胞を取得する。 相 同的組換えを起こしたマウス E S細胞を受精卵へマイクロインジェクションし、 偽妊娠雌マウスの子宮へ移植し、 発生さてキメラマウスの成獣を得る。 この雄キ メラマウスを野生型雌マウスと交配し、 毛色等から生殖細胞系に E S細胞由来の CD 9欠損遺伝子がとりこまれたキメラマウス個体と野生型とのヘテロ接合体を 選択する。 CD 8 1についても同様にへテロ接合体を得る。 CD 9欠損へテロ接 合体と CD 8 1欠損へテロ接合体とを交配させて、 CD 9/CD 81二重欠損マ ウスが得られる。
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これにより本発明の範囲 が限定されるものではない。 実施例においてすベてのマウスは、 大阪大学医学部 附属動物実験施設において、 特定病原体フリー （S PF) の条件下、 環境的に調 節されたクリーンルーム内で飼育した。 ケージ、 水ビン、 木屑そして餌粒を含め たすベての器具おょぴ糧食は、 滅菌して用いた。
(実施例 1 )
CD 9 ZCD 8 1遺伝子 2重欠損マウス （ダブルノックアウ トマウス） の製造 (ステップ 1 ) CD 9遺伝子のゲノム DNAクローニングと CD 9欠損マウス の作出
マウス CD 9に対するゲノム DN Aは、 マウス CD 9の c DN A全長 （配列番号 1 ) をプローブとして、 Stratagene社から購入した 1 29/ s Vマウスゲノムフ ァージライブラリ一から単離した。 およそ 9 x 1 05 のファージクローンをプラ ークハイブリダイゼーションによりスクリ一ユングし、 そして 20個の陽性ク口 ーンを得た。 これらのクローンが CD 9をコードしているか否かを決定するため に、 CD 9プローブを用いた第 2スクリーニングを別個に行った。 この結果、 す ベてのクローンが単一のファージクローン由来の CD 9陽性クローンであること がわかった。 得られたクローンをいくつかの制限酵素によるゲノムクローンの消 化および部分配列決定により、 ゲノムクローンの構造地図を作製した （図 3) 。 得られた CD 9クローンは、 遺伝子の 60 k bをカバーし、 そしてヒ ト CD 9遣 伝子のェクソン 1からエタソン 6に対応する相同配列を含んでいた。
(ステップ 2) CD 9ターゲッティングベクターの構築 4008261
CD 9遺伝子のターゲッティングストラテジーを図 3に示す。 CD 9遺伝子の ターゲッティングベクターを作製するために、 単離したゲノムクローンの一部を 制限酵素により削除し、 陽性選択マーカー遺伝子 （n e o— p o 1 yAカセッ ト ) (p o 1 y Aはポリ Aを意味する） を揷入した。
CD 9のターゲッティングベクターの構築は、 それぞれェクソン 3およびエタ ソン 4の A p a Iおよび B a mH I部位間の成熟 CD 9についての第 2膜貫通領 域の一部から第 4膜貫通領域までを含む約 1. 3 k bの DNA断片を削除し、 そ して n e o - p o 1 y Aカセッ トを DNA断片の代わりに挿入した。 さらに陰性 マーカーとしてジフテリア毒素 A断片遺伝子 （DT) をチミジンキナーゼプロモ 一ター調節下においてベクターの 3，末端に挿入した （図 3) 。 5 'および 3'末端 の相同領域は、 それぞれ約 4 k bおよび 5 k bであった。
(ステップ 3) ターゲッティングベクターを導入した E S細胞の作製
本発明において使用する E S細胞は、 C 57 B L 6 +CB Aマウスから得られた TT 2細胞である。 TT 2細胞は、 相沢慎一博士 （実験医学別冊バイオマ二ユア ルシリーズ 8、 ジーンターゲティング一 E S細胞を用いた変異マウスの作製， 羊 土社， 1995) に記載されているように取得することができる。 E S細胞に対して エレク ト口ポーレ^ "ションを行うことにより、 1 07 細胞あたり約 20 - 25 gの直鎖化ターゲッティングベクターを導入する。 エレク トロポーレーションは 例えば Bio - Rad Gene Pulser中で、 250Vおよび 500 μ Fで行うことができ る。 次いで細胞を、 E S培地 （20%ゥシ胎児血清 （シグマ） 、 マウス白血病阻 止因子 （L I F ェズグロアムラ ド社） 、 ピルビン酸ナトリ ウム （ナカライテス ク） 、 非必須アミノ酸 （和光） 、 およびベータメルカプトエタノール （ナカライ テスク） を添加した Du 1 b e c c o改変 E a g 1 e培地 （ナカライテスタ） 中 で、 ネオマイシン （200 μ g/m 1 シグマ） を選択薬剤として用いて選択培 養する。 薬剤を含む培地は毎日交換する。
ネオマイシン存在下に生育した 1 1 6個の E Sクローンをプールし、 それらか らゲノム DNAを単離した。 クローンは相同組み換えが起こったかどうかを確認 するため、 サザンプロットハイプリダイゼーション法によってスクリ一ユングし T/JP2004/008261 た。 八 31- &1断片を 5，プローブ （図 3プローブ A) として、 そして Xhol- EcoRI 断片を 3，プローブ （図 3プローブ B) として使用し、 ターゲッティングされた CD 9遺伝子についてサザンプロッ トハイプリダイゼーション解析を行った。 E S細胞から得られたゲノム DNAを Hindlllにより消化し、 0. 5 %ァガロース ゲル上で電気泳動し、 そしてナイロンメンプレン （Amasham) に転写する。 ハイ ブリダイゼーシヨンはハイブリダイゼーシヨンバッファ一中 (東洋紡) で3 2 P で標識されたプローブ Aおよび Bを用いて 6 8°Cで行う。 メンブレンは洗浄後フ イルムに感光させ検出した。
サザンハイプリダイゼーションにより、 CD 9の野生型ァリル由来のパンドに相 当する 6. 4 k b (プローブ A) および 6. 8 k b (プローブ B) のバンド、 お ょぴ変異アレル由来のパンドに相当する 7 · 5 k b (プローブ A) および 5 · 7 k b (プローブ B) の予想される DNAバンドを検出した （図 4) 。 このことは ターゲッティングされる E Sクローン中の野生型ァレルのうち 1つが、 変異遺伝 子により正しく置換されていることを示していた。 CD 9遺伝子のターゲッティ ング効率は、 6. 0%であった。 このうちターゲッティングされる遺伝子の生殖 系列への導入は、 2クローン中 2クローンで確認された。
(ステップ 4) CD 9遺伝子欠損マウスの作出
CD 9遺伝子をターゲッティングした E S細胞を、 受精胚中に移植した。 移植 する方法は当業者が適宜改変することができるが、 本実施例においては、 オリジ ナノレの報告 （Nagy et al. , 1993, Proc. Acad. Sci. USA 90， 8424-8428) 力 ら改 変した、 8細胞期胚に対するインジェクショ ン法により、 キメラ胚を作製した。 すなわち、 プラスチックディッシュ上の穴の中で、 コンパクションを起こしてい ない 8細胞期の透明帯と割球の間に E S細胞を入れ、 そして BBW培地または M16培 地中で一晩培養し、 その後十分に形成した胞胚を偽妊娠メスマウスの子宫内に移 した (Hogan et al. Manipurating the mouse embryo, coldspring harbor la boratory press, 1994) 。 インジェクション法において 8細胞期胚として使用す ることができる胚の由来する系統は、 純系どうしの交配に由来するものでも純系 間での交配に由来するものでもよい。 本発明においては、 1 。尺の 1由来の胚 4008261 を使用することが望ましい。
E S細胞導入胚由来のォスのキメラマウスが成熟した後、 このマウスを純系マ ウス系統のメスマウスと交配させ、 そして次世代産仔の被毛色により、 E S細胞 がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認するできる。 本実施例におい ては、 前述した様に野鼠色 （agouti) 系統 （TT2) 由来の E S細胞を使用したた め、 作出したォスのキメラマウスを、 黒色である C57BL6メスマウスと交配させ、 そして次世代産仔の被毛色野鼠色 （agouti) +黒色 （black) であることにより、 E S細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認した。 得られた CD 9遺伝子欠損マウスへテロ接合体同士を交配させることにより、 目的とする CD 9の遺伝子欠損ホモ接合体マウスを得ることができた。
(ステップ 5) 遺伝子型解析
本実施例で作出された CD 9遺伝子欠損マウスの仔において、 ヘテロ接合体は健 康で繁殖能力も有していた。 ヘテロ接合体同士の交配で得られたマゥスにおいて 、 相同組み換えされたアレルを持つかどうかを尻尾から単離された DN Aを使用 した PCRにてスクリ一二ングを行った。 PCR反応はプライマー以下の配列番号 3か ら 5のものを用いた。
P 1 ： 5，- AATGGGCTGACCGCTTCCTCG- 3， （配列番号 3 )
P 2 ： 5し CCTCCCTCAGGAGTGTACATTC - 3 ' (酉 3列番号 4)
P 3 ： 5，- GAGGAACCCGAAGAACTAGAAGAC - 3 ' (配列番号 5 )
配列番号 3と配列番号 4は欠損したァリル、 配列番号 4と配列番号 5は野生型 ァリルを検出するために用いた。 PCR反応バッファ一は、 5 0mMの T r i s - HC 1 (p H 8. 0) 、 0. l mMのEDTA、 l mMのDTT、 0. 0 0 1 % の Tw e e n 20、 0. 00 1 %の NP - 40、 5 0%グリセローノレ、 2 5 mM Mg S 04 、 2mMdNTPそして 1 U/μ 1のポリメラーゼ （KODP 1 u s 東洋紡） にて行った。 P CRサイクルの条件は、 94°Cで 1 5秒、 6 2°Cで 3 0秒， 6 8 °Cで 1分を 1サイクルとして 3 0サイクルの反応を行った。 図 5に示 すようにへテロ接合体 （H) では組み換えを起こしたアレルと野生型のアレル両 方を， ホモ接合体 （K) では組み換えを起こしたアレルのみ持つことが確認され PC蘭 004/008261 た。 またホモ接合体はへテロ接合体同士の交配でメンデル比に従って産まれるこ とを見出した。
(ステップ 6) CD 81ターゲッティングベクターの構築
「Miyazaki, T. et al. (1997) The EMBO Journal Vol.16, pp4217-4225」 に 記載されている方法に従って作製したが、 簡単に説明すると、 CD 8 1遺伝子の ターゲッティングベクターを作製するために、 単離したゲノムクローンの一部の DNA断片を制限酵素により削除し、 陽性選択マーカー遺伝子 （n e o— p o 1 y Aカセッ ト） を挿入した。
具体的には、 ェクソン 3からエタソン 7のすべてとエタソン 8の一部を含む領 域、 即ち成熟 CD 8 1についての第 2膜貫通領域の一部から C末端までを含む約 3 k bの DNA断片を制限酵素 B a mH Iで削除し、 n e o— p o 1 y Aカセッ トを DNA断片の代わりに挿入した。 （CD 8 1のイントロン、 ェクソン情報と しては、 ァクセッション番号 AJ251835で見ることができる）
ネオマイシン存在下に生育した E Sクローンをプールし、 それらからゲノム D NAを単離した。 クローンは相同組み換えが起こったかどうかを確認するため、 サザンプロッ トハイブリダイゼーション法によってスクリ一ユングした。
(ステップ 7) CD 81遺伝子欠損マウスの作出と遺伝子型解析
CD 81遺伝子欠損マウスを CD 9と同様の方法により作出した。 作出された C D 8 1遺伝子欠損マウスの仔において、 ヘテロ接合体は健康で繁殖能力も有して いた。 ヘテロ接合体同士の交配で得られたマウスにおいて、 相同組み換えされた ァレルを持つかどうかを尻尾から単離された DN Aを使用した P CRにてスク リ 一-ングを行った。 P CR反応はプライマーは以下の配列番号 6〜 9のものを用 いた。
P 1 ： 5，- TGTGAGGTGGCTGCAGGCATCTGG- 3 ' (配列番号 6 )
P 2 ： 5，- TCTCATGGAAAGTCTTCACCACAG- 3， （配列番号 7 )
P 3 ： 5， - GTATCCATCATGGCTGATGCAA- 3， （配列番号 8 )
P 4 ： 5，- AGCTCCACCCCTACATCCCAC- 3 ' (配列番号 9 )
配列番号 6と配列番号 7は野生型ァリル、 配列番号 8と配列番号 9は欠損した 2004/008261 ァリルを検出するために使用した。
なお、 CD 8 1のノックアウトマウスの作成は、 非特許文献 1で挙げた 「Maecke r HT, Levy S. J Exp Med. 1997 Apr 21 ; 185 (8) : 1505- 10. Normal lymphocyte development but delayed humoral immune response in CD81 - null mice.」 や 、 「Tsitsikov EN, Gutierrez-Ramos JC, Geha RS. Proc Natl Acad Sci U S A . 1997 Sep 30 ;94 (20)： 10844-9. Impaired CD19 expression and signaling, e nhanced antibody response to type II T independent antigen and reduction of B-l cells in CD81— deficient mice.」 ίこも記載されてレヽる。
(ステップ 8) CD 9 /CD 8 1遺伝子 2重欠損マウスの作出
CD 9遺伝子欠損マウス （ヘテロ接合体） と CD 8 1遺伝子欠損マウス （へテ 口接合体） を交配させることにより、 CD 9 /CD 8 1遺伝子 2重欠損マウスへ テロ接合体を作出した。 更に、 CD 9/CD 8 1遺伝子 2重欠損マウスへテロ接 合体雌雄を交配させることにより、 CD 9/CD 8 1遺伝子 2重欠損マウスホモ 接合体を作出した。
(実施例 2)
3 0週令マウスの骨 X線撮影を行なった。 X線撮影は、 マウスを麻酔した後、 m i c r o - FX I O O O (Fuji Film, Inc. )を使用して行った。 全身骨格の X線 像を図 6、 大腿骨の X線像を図 7、 脊椎の X線像を図 8に示す。 CD 9ZCD 8 1二重欠損 （DKO) マウスでは野生型 （w i l d t y e) マウスに比べ骨 '格が小さく、 脊椎の後弯が認められた。 また、 骨の X線透過性が亢進しており、 骨非薄化が観察された。 なお、 本実施例および以下の実施例において、 CD 9Z CD 8 1二重欠損マウスは、 ホモ接合体を用いた。
(実施例 3)
8週令マゥスにて脛骨近位部の組織学的検討を行った。
8週令の野生型と CD 9ZCD 8 1二重欠損マウスの脛骨を 90%エタノール で固定し、 非脱灰標本をグリコメタクリレートに包埋した。 脛骨近位部 3 mm幅 のセクションをトルイジンブルー染色または T R A P染色した。
トルイジンプル一による染色結果を図 9上段に、 TRAPによる染色結果を図 08261
9下段に示す。 図の左側が野生型、 右側が CD 9ZCD 81二重欠損マウスであ り、 図 9上段において、 B a r = 250 、 図 9下段において B a r = 1 00 μ mである。
図 9上段において、 矢頭は皮質骨を示し、 CD 9ZCD 8 1二重欠損マウスで は、 野生型に比べ皮質骨が菲薄化していた。 また、 TRAP染色では、 濃く （実 際の写真では赤く） 染まっているのが破骨細胞である。
(実施例 4)
8週令の野生型マウス、 CD 9/CD 81二重欠損マウス、 CD 9欠損マウス および CD 81欠損マウスについて、 大腿骨幹部を p QCT (peripheral quant itative computed tomography) 解析により解析した。 p QCT解析は、 マウス 大腿骨を 1 0 %ホルマリンで固定した後、 X C T r e s e a r c h S A (Str atec Medizintechnik) を用いて測定を行った。 骨幹部輪郭を p Q C Tソフ トゥ エアアルゴリズムによる自動解析にて決定した。 解析結果を図 1 0 A〜Cに表す
CD 9 /CD 8 1二重欠損 （WKO) マウスでは野生型マウス、 C D 9欠損 （ KO) マウスおょぴ CD 8 1欠損 （KO) マウスに比べ、 骨量の低下、 骨強度の 低下を認めた。
以上実施例 2および 4の結果から、 CD 9ZCD 8 1二重欠損マウスでは骨密度 が低下していることがわかった。
(実施例 5)
8週令マゥスの脛骨近位部の形態計測を行なつた。
8週令の野生型 （W i I d) 、 CD 9欠損 （CD 9 KO) マウス、 CD 8 1欠損 (CD 81 KO) マウス、 CD 9 /CD 8 1ダブルへテロ （CD 9/CD 8 1 D HO) マウスおょぴ CD 9ノ CD 81二重欠損 （ C D 9 / C D 8 1 D K O ) マウ ス、 各々 3サンプルの脛骨近位部の組織形態計測を O s t e o p 1 a n I I (Z eiss) セミオートメーションシステムにより行なった。
測定結果を図 1 1 A〜Hに表す。
単位骨量、 骨梁幅、 骨梁数については、 CD 9 CD 8 1二重欠損マウスでは 、 減少は見られず、 海綿骨の減少は認めなかった （図 9、 図 1 1 A〜C) 。
しかし、 類骨厚、 類骨面、 骨芽細胞面については、 CD 9ZCD 81二重欠損 マウスでは野生型マウス、 CD 9欠損マウスおよび CD 8 1欠損マウスに比べ 、 有意な減少が認められ、 骨芽細胞のマ トリ ックス形成の低下が示唆された （図 1 1 D〜F) 。
また、 破骨細胞数の增加を認めたが、 破骨細胞面の有意な減少はなく、 破骨細 胞の機能低下の可能性が示唆された （図 9下段、 図 1 1 Gおよび H) 。
(実施例 6)
次に骨形成と石灰化における骨芽細胞の機能を、 8週令マウスにカルセィンを 腹腔内注入して検討した。
カルセィンァッセィは、 カルセィンが骨形成の過程で骨に取り込まれることを 利用して、 骨芽細胞による骨形成を測定するときに慣用される確立した手法であ る。
マウス腹腔内に力ルセインを 4日間隔で 2回注射し、 大腿骨の非脱灰標本を作 成し石灰化先端部を蛍光顕微鏡にて計測した。 蛍光顕微鏡による写真と、 O s t e o p l a n I I (Zeiss) セミオートメーションシステムにより算出した骨形 成率を図 1 2 A及ぴ Bに表す。
CD 9/CD 8 1二重欠損 （DKO) マウスでは、 野生型 （w i 1 d) マウス に比べ 2本のバンド間の距離が縮小しており、 骨形成率の低下が認められた。 C D 9/CD 81二重欠損マウスの骨形成率は、 野生型の約 60%に低下していた
CD 9/CD 8 1二重欠損マウスは膜タンパクの欠損マウスであり、 老化に見 られる低回転型の骨粗鬆症と似かよった病態を示す。 このことから低回転型骨粗 鬆症の動物モデルとなることが確認された。
(実施例 7 )
生殖細胞にのみ発現する CD 9遺伝子を有する CD 9 CD 8 1二重欠損マウ スの製造
卵細胞特異的に発現する遺伝子である Z P 3を分離し、 この遺伝子のプロモー PC霞 004趣 261 ターを含む約 6 k bの断片の下流に E c o RV部位を人工的に挿入し、 この E c o RV部位に平滑末端化した CD 9構造遺伝子を揷入したベクターを作成し、 こ の遺伝子を持つトランスジエニックマウス （TG P z p 3 : ： CD 9) を作成し た。
次に、 TG P z p 3 : : CD 9と CD 9遺伝子欠損マウスを交配させ、 CD 9 遺伝子は持たないが P z p 3 ： ： CD 9遺伝子を持つマウスを作成したところ、 得られたマウスは、 卵細胞においては CD 9を発現し、 ホモ接合体雌雄間での交 配が可能で子孫を作ることができた。
このようにして得られた P z p 3 ： ： CD 9遺伝子を有する CD 9欠損マウス と通常の方法により得られた CD 8 1欠損マウスとを交配させ、 生殖細胞も体細 胞も新たに導入された CD 9 (TG P z p 3 ： ： CD 9) を有しているが、 体細 胞においては通常の状態で CD 9を発現しない CD 9 /CO 8 1二重欠損マウス を作成した。
(実施例 8 )
マウス肺の形態学的解析
マウス肺は 2 5 c m水柱圧下で 1 0 %ホルマリン固定を行い、 パラフィン包埋し た後、 5 μ m幅のセクションをへマトキシリン 'ェォジン染色した。 肺胞腔の大 きさは R a y ( J Clin Invest 10:2501- 2511, 1997) らの方法に従い、 1 0視野 以上の肺組織像を N I H画像プログラムで解析し、 C h o r d l e n g t hの 平均値を算出した。 1視野につき 2 0 0回以上の測定を行い、 また野生型 （W i I d) と CD 9/CD 8 1二重欠損マウス （DKO) それぞれ 3匹以上解析した 。 弾性線維と杯細胞の観察には、 それぞれ O r c e i nによる染色と p e r i o d i e a c i d-S c h i f f (PA S) 染色を行った。
へマトキシリン .ェォジン染色の結果から、 CD 9 /CD 8 1二重欠損マウス (DKO) の肺を野生型 （W i l d) と比較すると、 3週令 （3W) では大きな 差は認められないが、 1 0週令 （1 0W) マウスでは肺胞腔の拡大 （肺胞構造の 破壌） と単核球主体の炎症細胞浸潤を認め、 気腫性変化を呈した（図 1 3)。 これ らの変化は、 同令の CD 9ノックアウト マウス、 CD 8 1ノックマウスではほ とんど認めないか、 あっても軽度であった（データ掲載せず）。
画像プログラムを用いて組織標本から Chord length (肺胞腔径）を算出したと ころ、 加齢とともに肺胞腔の拡大が亢進することが確認された （図 14)。
さらに、 O r c e i n染色により弾性線維の断裂像を認め、 PAS染色により 粘液産生能を持つ杯細胞 （赤色に染色されている） の過形成像が観察され、 これ らは CO PDで見られる病理組織に類似していた （図 1 5)。
これら結果から、 CD 9ZCD 8 1二重欠損マウス （DKO) 肺はヒ ト COP D類似の病態を示すことが組織学的に確認された。
(実施例 9 )
MM P活性の測定
無作為に選んだ 1 0週令の CD 9/CD 81二重欠損マウスと野生型マウスから 気管支肺胞洗浄液を回収し、 ゲラチンザィモグラムにて MMP活性を検討した 気管支肺胞洗浄
マウス肺を 1 mlの 0.1 % BSAを含む PBSで 3回洗浄し回収した。 洗浄液中の細胞を サイ トスビンスライ ド上に遠沈し、 Wr i g h t染色した後、 検鏡にて総細胞数 、 マクロファージ、 リンパ球の数を算出した。 野生型と CD 9 ZCD 8 1二重欠 損マウスそれぞれ 3匹以上解析した。 （図 1 7)
ゲラチンザィモグラム
10週令の野生型おょぴ CD 9/CD 8 1二重欠損マウスから無作為に選んだそ れぞれ 4匹から気管支肺胞洗浄液上清を回収し C e n t r i c o n 10にて 1 0倍濃縮した。 濃縮液を 10 %ゲラチンザィモグラムゲルに注入し非還元条件下 に電気泳動を行った。 クマシ一ブルーで染色後、 脱染し MM Pのゲラチン溶解 活性を検出した。
この結果、 CD 9/CD 8 1二重欠損マウス （DKO) では、 野生型 （W i 1 d) に比べ MMP- 2と MMP- 9活性が亢進していた（図 1 6)。 また、 CD 9/ CD 81二重欠損マウスでは、 野生型に比べ気管支肺胞洗浄により回収される B AL F中の総細胞数（T C C、 Total cell count)が増加しており、 その大部分は マクロファージ （Ma c r o p h a g e) であった（図 1 7)これらのことから、 CD 9ZCD 8 1二重欠損マウス肺では、 MMP活性が亢進し、 マクロファージ が増加していることが分かった。 この結果は、 MM P- 2活性、 MM P- 9活性、 または、 マクロファージ增加と、 CO PDとの関連を示唆するものであり、 本発 明の CD 9ZCD 8 1二重欠損マウスにおいて、 肺の MMP- 2活性、 MMP- 9 活性またはマクロファージ増加が、 COPDとの関連においてひとつの指標とな り得ることを示している。
以上の実施例から、 CD 9 /CD 8 1二重欠損マウスは肺気腫と共に粘液産生 細胞の過形成を認め、 ヒ トでの COPDの病理像に合致する肺病変を有する。 さ らに CO PD患者に高率に合併する骨粗鬆症をも示すことから、 これまでに報告 された遣伝子操作マウスよりも COPDの病態をより忠実に反映する疾患モデル と考えられ、 骨粗鬆症モデル動物としては勿論のこと、 COPDモデル動物とし ても、 治療薬のスクリーニング等に有効である。
発明の効果
本発明によると、 骨粗鬆症および CO PDの病態をよく表しモデル動物として 利用できる CD 9 /CD 81二重欠損非ヒ ト動物、 並びに、 該非ヒ ト動物を骨粗 鬆症モデル動物おょぴ C O P Dモデル動物の少なく ともいずれかとして使用する 方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1. 少なくとも体細胞において、 CD 9をコードする遺伝子および CD 8 1を コードする遺伝子の機能が欠損することを特徴とする CD 9 /CD 8 1二重欠損 非ヒ ト動物。
2. 非ヒ ト動物が齧歯類動物である請求の範囲第 1項に記載の CD 9ZCD 8 1二重欠損非ヒ ト動物。
3. 齧歯類動物がマウスである請求の範囲第 2項に記載の CD 9/CD 8 1二 重欠損非ヒ ト動物。
4. CD 9をコードする遺伝子が下記（a )および（b )のいずれかであり、 CD 8 1をコードする遺伝子が下記（c)および（d)のいずれかである請求の範囲第 1 項から第 3項のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物。
( a )配列番号 1に記載の塩基配列からなる D N A
(b)配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAに相補的な DNAとストリンジ ェントな条件下でハイプリダイズする DNA
( c )配列番号 2に記載の塩基配列からなる D N A
(d)配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNAに相捕的な DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダイズする D N A
5. 生殖細胞においても、 CD 9をコードする遺伝子および CD 8 1をコード する遺伝子の機能が欠損する請求の範囲第 1項から第 4項のいずれかに記載の C D 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物。
6. 生殖細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターの下流に CD 9をコード する遺伝子および CD 81をコードする遺伝子の少なくともいずれかが導入され 、 生殖細胞において CD 9をコードする遺伝子おょぴ CD 8 1をコードする遣伝 子の少なくともいずれかの機能が欠損しない請求の範囲第 1項から第 4項のいず れかに記載の CD 9/CD 81二重欠損非ヒ ト動物。
7. 骨形成が阻害された表現形質および慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の少 なくともいずれかを有する請求の範囲第 1項から第 6項のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物。
8. 骨粗鬆症モデル動物おょぴ慢性閉塞性肺疾患モデル動物の少なく ともいず れかである請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二 重欠損非ヒ ト動物。
9. 請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の CD 9 ZCD 8 1二重欠 損非ヒ ト動物の骨形成阻害の程度を測定する工程を含んでなることを特徴とする 、 該 CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物を骨粗鬆症モデル動物として使用する 方法。
1 0. 請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重 欠損非ヒ ト動物に被験物質に投与し、 該被験物質が骨形成阻害を抑制する効果を 有するかどうか検定する骨粗鬆症治療薬スクリ一二ング方法である請求の範囲第 9項に記載の方法。
1 1. 請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重 欠損非ヒ ト動物の慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の程度を測定する工程を含ん でなることを特徴とする、 該 CD 9ZCD 8 1二重欠損非ヒ ト動物を慢性閉塞性 肺疾患モデル動物として使用する方法。
12. 請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の CD 9/CD 8 1二重 欠損非ヒ ト動物に被験物質に投与し、 該被験物質が慢性閉塞性肺疾患を表す表現 形質を抑制する効果を有するかどうか検定する慢性閉塞性肺疾患治療薬スクリ一 ユング方法である請求の範囲第 1 1項に記載の方法。
1 3. 請求の範囲第 1項に記載の CD 9/CD 8 1二重欠損非ヒ ト動物の、 骨 粗鬆症モデル動物および慢性閉塞性肺疾患モデル動物の少なくともいずれかを製 造するための使用。
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