WO2004106928A1 - Procede de detection et de quantification multiplex d’analyses dans un echantillon a l’aide de microspheres - Google Patents

Procede de detection et de quantification multiplex d’analyses dans un echantillon a l’aide de microspheres Download PDF

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WO2004106928A1
WO2004106928A1 PCT/FR2004/001307 FR2004001307W WO2004106928A1 WO 2004106928 A1 WO2004106928 A1 WO 2004106928A1 FR 2004001307 W FR2004001307 W FR 2004001307W WO 2004106928 A1 WO2004106928 A1 WO 2004106928A1
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microspheres
analytes
compound
beads
sample
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PCT/FR2004/001307
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English (en)
Inventor
Guillaume Haquette
Philippe Poncelet
Maxime Moulard
Michel Canton
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Biocytex SRL
Original Assignee
Biocytex SRL
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and / or multiplex quantification of analytes in a sample using functionalized microspheres, these microspheres being magnetized after the presence of sample in step with these microspheres.
  • the process of the invention is particularly suitable for the detection and quantification of multiplex several analytes by flow cytometry.
  • the subject of the invention is also a kit for the detection and / or the quantification of several analytes for the implementation of the method according to the invention which comprises a suspension of functionalized non-magnetic microspheres, a solution of ferro fluids and a solution of '' at least one conjugate.
  • the international patent applications published under the numbers WO 98/51435, WO 94/09368, W0 90/15666 and the European patent application published under the number EP 180384 describe magnetic or fluorescent particles of particular type, usable in diagnostic methods.
  • Other documents of the prior art propose different protocols for the identification and / or the assay of multiple analytes on microbeads.
  • the international application published under the number WO 90/05305 relates to a method and its corresponding kit for detecting and / or assaying several analytes in a sample by an agglutination method using several subpopulations of fluorescent beads .
  • the fluorescence of the aggregates formed can be measured by flow cytometry, image analysis or a laser scanning system.
  • an antigen assay by flow cytometry using two populations of spheres of different diameter, the largest being covered with a specific antico ⁇ s of the antigen, and the smallest being fluorescent.
  • the assay is performed according to the principle of a sandwich method or a competition based on the ligand bound to the fluorescent spheres (antico ⁇ s or antigen).
  • the international application published under the number WO 97/14028 relates to a method of analysis by flow cytometry for the detection of several analytes of interest, in which a plurality of subpopulations of beads is used, at least one of the Classification parameters for flow cytometry analysis differ from one sub-population to another.
  • Each subpopulation is coupled to a compound which reacts specifically with one of the analytes to be assayed.
  • the subpopulation of beads, and therefore the nature of the compound having reacted with the corresponding analyte, is identified by cytometry, from the analysis of all the classification parameters of each subpopulation.
  • the international application published under the number WO 98/20351 relates to a method for determining the presence of one or more analytes in a sample, in which "test" populations of microparticles are used, each of the populations carrying a ligand specific for a analyte, and reference microparticles not reacting with any of the analytes sought.
  • the assay is carried out by counting the number of free microparticles in each “test” population and comparing it to that of the reference microparticles. The counting is carried out according to different methods, including preferably cytometry.
  • the international application published as WO 96/31777 is a method for detecting microorganisms in a sample using at least one type of detectable particle on a specific ligand of the desired microorganisms.
  • the microorganisms attached to the particles are then revealed with a second ligand with a fluorescent marker.
  • the US patent issued under the number US 6,280,618 relates to a method for individually detecting a plurality of analytes. in which a mixture of populations of magnetic microparticles is used which can be differentiated from each other and each carrying a different ligand. The microparticles of each group are separated from the medium and then suspended in a second liquid medium in which they are analyzed by flow cytometry.
  • the international application published under the number W0 93/02260 relates to a method of flow cytometry to simultaneously detect multiple analytes in a single sample, and the reagent for its implementation.
  • This reagent consists of a mixture of several subpopulations of microspheres, each subpopulation carrying on the surface a particular ligand capable of forming a specific binding pair with one of the analytes sought.
  • the detection of the analytes attached to the microspheres is carried out after the addition of an agent carrying a fluorochrome, capable of binding to the pairs of bonds formed.
  • such a magnetic separation step facilitates dosages in certain complex media where the antigens of interest must be isolated specifically (cytometric analysis may be not feasible in the presence of certain microparticles). This is the case for example for analysis in food processing, paper and sewage treatment are sought where molecules / particles in various liquefied ground materials (pulp, soft, dairy or cheese, juice f ucts, shredded vegetables, fermentation juice etc ...), preparations which cannot be filtered at the risk of losing the analyte to be assayed.
  • the size i) either covers that of the capture beads (1 to 30 ⁇ m) and makes it difficult or even impossible to identify them solely by light scattering parameters, ii) or makes the analysis by clogging of the cytometer incompatible (high risk from 100 ⁇ m ) and which are found concentrated in the liquid after biocollection. In addition, we must also get rid of oily particles (greasy) which are incompatible with the proper functioning of the fluidics of a cytometer.
  • magnetic microspheres in a process for identifying and assaying the analytes contained in a sample can present various industrial constraints, and hinder the handling and homogeneity of sampling of the suspensions.
  • magnetic microspheres of different sizes can have different behaviors during magnetic separation, that is to say more or less long magnetization times. This results in separation of variables yields according to the microbeads in the presence of families, leading to heterogeneity of results or a lengthening of magnetic separation phases.
  • the magnetic microspheres are dense, which poses practical problems settling in storage, resuspension and rapid sédi ⁇ ientation for analysis.
  • the density of magnetic beads is commonly greater than 1.15 and, depending on the rate of magnetite, oscillates between 1.15 and 1.50, leading to very rapid sedimentation rates, in particular for particles of large diameter (> 2 ⁇ m) (cf. European patent application published under the number EP 1248110).
  • US Patent US 5,998,224 (published December 7, 1999, Applicant: ABBOTT LABORATORIES), relates to a method for determining the presence or amount of an analyte in a test sample.
  • this method comprises bringing the test sample into contact with a mobile solid phase and a magnetic reagent to form a reaction mixture in which said analyte binds to said mobile solid phase and said magnetic reagent to form a complex, then applying a magnetic field.
  • the method comprises contacting the analyte with the magnetic reagent to form a first complex, and contacting the magnetic reagent with the strong mobile phase to form a second complex, followed by application of the magnetic field.
  • the analyte binds to the mobile phase to form a first complex and the magnetic reagent binds to the mobile phase to form a second complex, then a magnetic field is applied.
  • the sample containing said analytes is placed in the presence of magnetic particles.
  • EP 230 768 The European patent application published on 5 August 1987. under the number EP 230 768 (Syntex Inc.), relates to a method for separating a substance from a liquid medium. This method implements magnetic particles or non-magnetic.
  • the nonmagnetic particles may be functionalized so as to bind to a member of a specific binding pair or to a magnetic particle.
  • a ferrofluid is described as a magnetic fluid, wherein the suspended particles are ferromagnetic particles.
  • Colloidal magnetic particles of the magnetic fluid can be listed with the protein material such as ferric proteins: albuline, gamma globulin, etc ....
  • the "coating" of the magnetic particles with protein can be accomplished by a physical link, such Pabso ⁇ tion , or a chemical bond.
  • the subject of the present is a process for the detection and / or multiplex quantification of analytes which may be contained in a sample using functionalized non-magnetic microspheres, said analytes possibly being previously marked with a marker, said method being characterized in that it comprises the following steps: a) bringing said sample into contact with a suspension of populations of functionalized non-magnetic microspheres, said microspheres carrying on their surface: for all populations of microspheres, a compound A forming a first member of a binding pair, said compound A also being characterized in that it cannot bind with said analytes, and for each of the populations of microspheres, a compound B, different for each population, capable of form a specific binding pair with one of the said analytes in the sample, b) addition to the medium reaction obtained in step a) of a ferrofluid, which ferrofluid contains magnetic particles which carry on their surface a second binding member capable of forming a specific binding pair with compound A, c).
  • step b) at least one washing step by magnetic separation of the magnetized microspheres in step b), d) if necessary when said analytes are not previously labeled, bringing the suspension of the magnetized microspheres obtained in step c) with a solution of at least one conjugate, said conjugate comprising a compound C capable of recognizing and specifically binding with one of said analytes and a marker, this step d) preferably being followed by at least one step of washing the microspheres by magnetic separation, and, e) detecting and / or the quantification of said marker on the surface of the microspheres.
  • multiplex detection and / or quantification method is intended to denote in the present description a method of detection and / or quantification of several analytes of interest in a single test.
  • sample is intended to denote by sample in the method according to the present invention any sample which may contain several analytes which it is desired to detect and / or quantify in said sample.
  • samples that may contain said analytes according to the present invention there may be mentioned biological samples (particularly whole blood, plasma or serum, cerebrospinal fluid, mucous membranes, etc ..) or chemical from all types of samples, particularly in areas of human or animal health, food or the environment, or even from the chemical industry, which samples are taken to detect and / or quantify several analytes of interest likely to be contained in said sample taken.
  • biological samples particularly whole blood, plasma or serum, cerebrospinal fluid, mucous membranes, etc ..
  • chemical samples are taken to detect and / or quantify several analytes of interest likely to be contained in said sample taken.
  • analyte is meant in the present description any compound of interest capable of being able to be detected and / or quantified according to the present invention.
  • said analytes are of protein and derivative type, or are nucleic acids.
  • protein, polypeptide or peptide are used interchangeably in the present description to denote an amino acid sequence or, for their derivatives, containing an amino acid sequence.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid, containing or not containing unnatural nucleotides, and which may correspond both to a double stranded DNA, single-stranded DNA as transcripts of said DNA.
  • nucleic acids are isolated from their natural environment, and are natural or artificial.
  • such analytes are organic compounds, chemical or biochemical, that may be present either in solution in a liquid or present on the surface of a cell or of a particle in suspension in the sample.
  • a cell or particle capable of carrying said analyte on its surface mention may be made, but is not limited to, eukaryotic cells such as a mammalian cell or a yeast, prokaryotic cells such as for example a bacterium, and particles such as for example a viral particle, a spore or pollen grain, or microorganism, especially a fungus.
  • eukaryotic cells such as a mammalian cell or a yeast
  • prokaryotic cells such as for example a bacterium
  • particles such as for example a viral particle, a spore or pollen grain, or microorganism, especially a fungus.
  • a first embodiment of the invention relates to the identification and / or multiplex assay in a sample of biological agents such as antigens bound to carriers, such as microorganisms of surface antigens, receptors and other membrane structures, or free-form analytes in the sample, such as proteins, enzymes, metabolites, and other secretory products.
  • biological agents such as antigens bound to carriers, such as microorganisms of surface antigens, receptors and other membrane structures, or free-form analytes in the sample, such as proteins, enzymes, metabolites, and other secretory products.
  • analytes of interest mention may be made in particular, but not limited to, of proteins and their derivatives such as glycoproteins or lipoproteins, nucleic acids, carbohydrates, lipid compounds and all natural compounds or may be obtained by chemical synthesis. Mention may also be made, as examples of analytes, of the compounds having a functional particularity such as cytokines, cellular receptors, antibodies, antigens, toxins, allergens, drugs, pesticides or herbicides, or any pollutant, analytes that to be detected and / or quantified in a sample, they are present in solution or if necessary brought to the surface of a cell or of a particle.
  • proteins and their derivatives such as glycoproteins or lipoproteins, nucleic acids, carbohydrates, lipid compounds and all natural compounds or may be obtained by chemical synthesis. Mention may also be made, as examples of analytes, of the compounds having a functional particularity such as cytokines, cellular receptors, antibodies, antigens, toxins, allergens
  • said compounds are protein toxins, or said cell or particle is a microorganism such as a bacterium or a virus.
  • detection and / or quantification of said analyte allows the detection and or quantification of said cells or particles if said chosen analytes are specific for said cells or particles.
  • analytes of interest which may be contained in a sample
  • a biocollector which takes particles from the atmosphere and impacts them in a liquid, generally a buffer such as PB S, or an oil.
  • analytes previously marked with a marker in the method according to the invention means any analyte which it is sought to detect and / or quantify in a sample and which is in marked form before the implementation of said method.
  • analytes mention may be made, but not limited to, of nucleic acids, or PCR products (amplicons), which result from an enzymatic amplification, such as PCR (polmyerase chain reaction), which can be obtained in a labeled form, in particular using fluorescent markers, these nucleic acid labeling techniques being well known to those skilled in the art.
  • non-magnetic microspheres functionalized in the process according to the present invention is intended to denote non-magnetic microspheres carrying on their surface a compound A and a compound B.
  • the compounds A and B can be fixed on the non-magnetic microspheres according to methods known to those skilled in the art, such as coupling by covalent bond, by affinity, by passive or forced adsorption. Such methods are also used for fixing the compound to the surface of the magnetic particles of the ferrofluid. Such methods for functionalizing various supports have been widely described in the literature, for example in the American patents granted under the numbers US 4,181,636 - US 4,264,766 - US 4,419,444 - US 4,775,619, etc. and Legastelois S et al., Latex and diagnosis. 1996, or Le Technoscope. Biofutur, 161: 1-11; Duke Scientific Co ⁇ .. ⁇ atalog, Palo-Alto, CA. Technical Note-013A "Reagent Microspheres-Surface properties and Conjugation Methods".
  • the microspheres used are carriers of chemical groups capable of reacting with another chemical group carried by the compound A or B to form a covalent bond.
  • chemical groups which may be present on the surface of the microspheres, mention may be made, but not limited to, of carboxyl, amino, aldehyde and epoxy groups.
  • one of the chemical groups carried by the non-magnetic microspheres may be capable of reacting specifically with the reactive chemical species of said analytes which one seeks to detect and / or to be quantified, said chemical group thus also ensuring the role of compound B.
  • affinity is generally implemented by two partners of a bond couple with high affinity such as in particular, but not limited to, couples (poly) carbohydrate / lectin, biotin or biotinilated compounds / avidin or sfreptavidin, specific receptor / ligand, antigen or hapten / antico ⁇ s, etc ...
  • the functionalization of the microspheres can also be carried out either directly or by using spacer arms also designated under the terms “linker” or "spacer”.
  • Functionalization by passive or forced adsorption is known to those skilled in the art, and has already been described in the previously cited American patents.
  • BSA-biotin ttle Serum Albumin
  • the non-magnetic microspheres functionalized in the present description may be constituted by any type of material to the extent that it contains no magnetic component.
  • a material inert to the analytes in the sample and to the other analysis reagents, insoluble in the sample and in all the other reaction media used in the process according to the invention and which can be functionalized It may, for example, be a polymer, or a copolymer, or else latex, glass or silica.
  • microspheres are not magnetic, there is no particular constraint as to the choice of the material in which they can be manufactured. Thus, any type of microsphere can be used in a very wide range of non-magnetic latex. Microspheres can also be used in other materials, more or less suitable depending on the analytes to be detected and / or quantified, which are sold in various sizes in non-magnetic form.
  • the method according to the invention may use, for example glass or silica beads, respectively materials preferably used for capture of blood platelets and nucleic acids (see in particular the international application published under the number WO 94/19600 which describes the use of glass beads to capture (and in this case eliminating) aggregated activated platelets).
  • polymers or copolymers are not limited to, divinylbenzene, polystyrene, polyvinylpyridine, styrene-butadiene copolymers, acrylonitrile-butadiene copolymers, polyesters, acetate copolymers vinyl ester acrylate, vinyl ester chloride-acrylate copolymers, polyethers, polyolefins, polyalkylene oxides, polyamides, polyurethanes, polysaccharides, celluloses, and polyisoprenes.
  • Cross-linking is useful for many polymers in order to give structural integrity and rigidity to said microspheres.
  • the method is characterized in that the microspheres are of a material selected from the group consisting of latex, a polymer, copolymer, glass or silica.
  • Non-magnetic polymer or copolymer, latex, glass or silica microspheres are well known to those skilled in the art and are commercially available, such as for example the ranges of microspheres supplied by the companies Spherotech (Libertyville, US), Polysciences (Warrington, US), Merck Eurolab SA (Fontenay-sous-Bois, FR) for the Estapor range, Duke Scientiftc (Palo Alto, US), Seradyn (fridianapolis, US), Dynal Biotech for Dyno Particles (Oslo , NO), etc.
  • Other microspheres ranges may be provided by Bang's Labs (Fishers, US) and Polymer Laboratories Ltd. (Church Stretton, UK).
  • nucleic acid adsorption / deso ⁇ tion procedures on silica beads are described in TechNote # 302, Bang's Labs (Fishers, US) for the capture of nucleic acids.
  • microspheres which sediment less for example non-magnetic latex beads, and which are therefore easier to be used, in particular in automatons.
  • compound A is meant in the present description, for all populations of microspheres, any compound present on the surface of said functionalized non-magnetic microspheres as described above, which compound is capable of specifically binding with another fixed compound on the surface of the magnetic particles of a ferrofluid, said compound A forming the first member of the specific binding pair, and the other compound forming the second member, said compound A also being characterized in that it cannot bind with analytes
  • ferrofluid in the present specification a stable colloidal suspension of magnetic particles in a liquid carrier.
  • the magnetic particles which have an average size of about 100 ⁇ (10 nm), are coated with a stabilizing dispersing agent (surfactant) which prevents agglomeration of the particles even when a strong magnetic field gradient is applied to the ferrofluid.
  • a stabilizing dispersing agent surfactant
  • the magnetic moments of the particles are randomly distributed and the fluid has no clear magnetization.
  • the magnetic particles of the ferrofluid are covered on the surface by said compound forming the second member of the specific binding pair with compound A on the surface of the microparticles.
  • these magnetic particles are capable of coming to be fixed on the surface of the microspheres by means of said bond pair formed, said microspheres being in this way magnetized.
  • the method is characterized in that said pair of connections formed between compound A and the second member fixed to the surface of the ferrofluids, is preferably chosen from the group formed. by specific binding pairs of biotin / avidin or biotin / streptavidin type, enzyme / cofactor, lectin / carbohydrate and antico ⁇ s / hapten.
  • ferrofluid include particularly, but not limited to the FF-SA (ferrofluids-streptavidin) Molecular Probes Europe (Leiden, NL) (Ref. C-21476, lot # 71 Al-1).
  • FF-SA ferrofluids-streptavidin
  • the quantity of magnetizable material (magnetic particles of the ferrofluid) to be placed on each population of microspheres can therefore be easily managed by modifying the quantity of attachment points (formation of bond pairs) per population of microbeads.
  • the sedimentation of ferrofluids is also very limited, which facilitates the handling and homogeneity of sampling suspensions.
  • the magnetization of the microparticles is carried out according to a conventional protocol using a magnet (Ex. DYNAL MPC).
  • compound B is meant in the present description, for each of the populations of microspheres, any compound present on the surface of the microspheres of one of the populations, which non-magnetic microspheres are functionalized as described above, which is compound capable of form a specific bond with one of the analytes that one seeks to detect and / or quantify which are likely to be contained in the sample.
  • compound B include, but without limitation, proteins or their fragments and derived structures, receptors, polyclonal antico ⁇ s or monoclonal or fragments thereof, monovalent antico ⁇ s, nucleic acid single or double-stranded and any fragment or derivative construction, as well as associations of several of these components.
  • nucleotide sequence of the compound B grafted to the surface of the microspheres is then complementary to that of the analyte.
  • compound B is a protein or one of its fragments, capable of recognizing one of said analytes, such as for example a polyclonal or monoclonal antibody or one of its fragments, directed specifically against the analyte that we seek to detect and / or quantify, or vice versa
  • compound B can be a antigen or hapten capable of recognizing an antico ⁇ s which one seeks to detect and / or quantify, or a ligand specific for a receptor, an enzyme specific for a cofactor, or a nucleic acid capable of hybridizing specifically with a nucleic acid which one seeks to detect and / or to quantify.
  • compound B or C is an antico ⁇ s
  • Specific antico ⁇ s can be obtained eg from serum or cell of an animal immunized against specific antigens.
  • antico ⁇ s fragment capable of specifically recognizing antigens in particular is understood to mean fragments antico ⁇ s comprising any fragment of said antico ⁇ s capable of binding specifically to the epitope of said antigen which binds the antico ⁇ s which said fragment is derived .
  • f agments in particular include single chain antico ⁇ s (scFv) or monovalent Fab or Fab 'fragments and divalent fragments such as F (ab') 2, which have the same binding specificity as the antico ⁇ s they are from.
  • fragments antico ⁇ s can be obtained from polyclonal or monoclonal antico ⁇ s by methods such as digestion by enzymes, such as pepsin or papain and / or cleavage of disulf ⁇ res bridges by chemical reduction. In another way, these antico ⁇ s, or their fragments, can also be obtained by genetic recombination (recombinant antico ⁇ s).
  • the method is characterized in that said compound B is selected from the group consisting of proteins and nucleic acids.
  • the compound B present on the surface of the microspheres of each of the populations is an antico ⁇ s and the analytes to be detected and / or to be quantified are antigens.
  • Step d) of the method according to the present invention is implemented only in the case where said analytes which it is sought to identify and / or to quantify have not been previously marked as described above. In this case, said step d) is necessary for the realization of the step after e) detection and / or quantification. It involves a solution comprising at least one conjugate capable of specifically binding to one of said analytes that are to be detected and / or quantified in the sample.
  • Said conjugate of the method according to the present invention comprises a compound C capable of reconnaîfre and specifically binding with one of said analytes and a label associated with it.
  • the method according to the invention is characterized in that the compound C of said conjugate used in step d) is a compound chosen from the group consisting of proteins and nucleic acids, when said analytes that the it is sought to detect and / or to quantify in the sample are proteins or nucleic acids respectively.
  • step d) of the process according to the invention is implemented, this is preferably followed by at least one washing step by magnetic separation, which step is necessary to separate the marked magnetized microspheres from those carrying their surface only said analytes.
  • Step e) of the process according to the present invention may be embodied in any electronic or optical automated method of detecting and counting particles. Flow cytometry is particularly suitable for this type of analysis.
  • This method allows very high sensitivity light intensity measurements to be carried out on microspheres suspended in a reaction medium. These measurements are made individually on each microsphere, at high speed (several hundred to several thousand microspheres analyzed / interrogated per second), which allows in a few tens of seconds to perform these measurements on a large number of microspheres.
  • CMF flow cytometry
  • fluorescence parameter (s) can be used, in addition to the size / structure parameters, for grouping individuals belonging to the same type of microspheres (multiplex assay).
  • fluorescence parameter (s) can serve as a developer, the intensity of which is directly proportional to the quantity of analytes present on the type of microsphere considered.
  • step e An example of flow cytometry which can be used in step e) is the FACS (flluorescence-activated cell sorter) technique, which consists of an electronic system for separating microspheres according to their size and the intensity of fluorescence that they emit after various markings.
  • the apparatus prepares microdrops from the suspension of microspheres which are diluted so as to contain only one microsphere.
  • the microdrop passes in front of a laser beam of light and the microspheres are analyzed (histogram) and separated on the basis of their fluorescence and / or their size.
  • fluorescent markers are preferred such as in particular, but without being limited to , fluorescein and its derivatives, such as fluorescein isothiocyanate (FITC), or allophycocyanin (APC), phycoerythrin-cyanine 5 (PC5) and phycoerythrin (PE), R-phycoerythrin (R-PE ), or rhoda ine and its derivatives, coumarin and its derivatives, luciferase and its derivatives, chromomycin, mithramycin, GFP (GFP for "Green Fluorescent Protein"), eGFP (eGFP for "Enhanced Green Fluorescent Protein”), RFP (RFP for "Red Fluorescent Protein”), BFP (BFP for "Blue Fluorescent Protein”), eBFP (eBFP for "Enhanced Blue Fluorescent Protein”),
  • fluorescein and its derivatives such as fluorescein isothiocyanate (FITC), or allophycocyanin (APC), phy
  • the method according to the invention is characterized in that the marker or markers used are fluorescent.
  • the method according to the invention is characterized in that the detection and / or quantification of said marker in step e) of the method is carried out by flow cytometry.
  • a range of . markers which can be detected and / or quantified simultaneously in a specific manner preferably fluorescent markers.
  • flow cytometry will be used for the detection and / or the direct and simultaneous quantification of said range of fluorescent markers.
  • the suspension of populations of microspheres may comprise a first population ni of which the microspheres composing it will each have compound Bi attached to their surface, a second population n of which the microspheres composing it will each have compound B attached to their surface, a third population n 3 whose microspheres composing it will each have compound B 3 attached to their surface, and so on.
  • the analyte- . will be recognized by compound B- .
  • Analyte 2 will be recognized by the compound B
  • the analyte 3 will be recognized by the compound B 3, and so on.
  • the method according to the invention is characterized in that at least two of said populations further have at least one intrinsic physical characteristic for the differentiation between them.
  • a person skilled in the art can have populations of microspheres having intrinsic physical characteristics making it possible to differentiate them from each other, thus making it possible to increase the number of different analytes to be detected and / or quantified in a sample, said physical characteristics intrinsic which can be differentiated by their size and / or their optical properties (specific fluorescence for each population).
  • the intrinsic physical characteristic of the microspheres of the method according to the present invention making it possible to differentiate the at least two populations of microspheres is the size and / or an optical property of said microspheres.
  • the method according to the invention is characterized in that the microspheres have a size of between 0.3 and 100 ⁇ m.
  • the method according to the invention is characterized in that the microspheres have a size between 1 and 20 ⁇ m.
  • These size ranges best correspond to the size analysis domain of current flow cytometers. In these diameter ranges and provided they do not pose additional constraints too rigid (magnetism, fluorescence), it is easy to find distinguishable balls apart by their single parameter size, measured by the parameter called forward light scatter (FS or FLS), to form several distinct groups (e.g. 1, 3, 5; 8; 10 and 15 ⁇ m). Some of these diameters are also available in a fluorescent version, or even with several different levels of intensity.
  • FS forward light scatter
  • the method according to the invention is characterized in that the optical property is the emission wavelength and / or the intensity of the fluorescence of said microspheres.
  • QuanfrimPlex TM ranges supplied by Bang's Labs
  • the method according to the invention allows the rapid detection and / or quantification of at least 6 different analytes.
  • the specificity required for the population of conjugates used depends on the complexity of step e) detection and / or quantification of the type and number of analytes. It is thus possible to use only one population of conjugate comprising a single type of marker, said conjugate then having a ubiquitous developer function. In this case, the specificity is provided solely by the selectivity of each catch ball. Conversely, it is also possible to use as many populations of different conjugates as analytes to be assayed. Depending on the test to be performed, the skilled person can of course choose the suitable alternatives in between variants.
  • the method according to the invention is characterized in that said analytes are nucleic acids and in that in step a), compound B is a nucleic acid capable of hybridizing specifically with one of said analytes preferably, said analytes are PCR products.
  • PCR products are obtained labeled.
  • PCR products where appropriate labeled, have been described previously.
  • the functionalized non-magnetic microspheres used in this embodiment carry on their surface a compound B of oligonucleotide type, which compound B is complementary to one of the amplification products sought.
  • step d) of bringing the magnetized microspheres into contact with conjugates is not necessary.
  • the labeling on the surface of the microspheres is provided by the marker carried by the PCR products that the microspheres have captured.
  • the method according to the invention is characterized in that the compound C of said conjugate used in step d) is a nucleic acid capable of hybridizing specifically with one of said analytes.
  • a type of conjugate can be used for example to detect and / or quantify several analytes such as in particular genomic material not previously amplified, or derivatives not previously amplified, such as fragments generated by enzymatic cleavage using enzymes restriction of this genomic material.
  • the signal amplification step can then be performed by the ligation (or ligation) step between compound B of the microspheres and compound C of the conjugates.
  • the invention also relates to the use of the method according to the invention for the detection and / or quantification of multiplex SNPs (Single Nucleotide Polymo ⁇ hisms).
  • the method of the invention is preferably used in combination with the technique for OLA "Oligonucleotide Ligation Assay" (test ligation of oligonucleotides) based on the action of a ligase which connects two adjacent oligonuléotides d covalently only on condition that they are perfectly complementary to the template DNA strand (Landegren et al Proc. Natl. Acad. Sci. US 1990; 87: 8923-8927; patent US4988617).
  • the template DNA strand can be either an amplicon (fragment amplified by PCR / Polymerase Chain Reaction or other enzymatic amplification reaction), or genomic material not previously amplified or its derivatives not previously amplified, for example fragments generated by enzymatic cleavage using restriction enzymes from this genomic material.
  • the use according to the invention is characterized in that the detection and / or the multiplex quantification of SNPs is carried out by the OLA method.
  • the conjugate within the meaning of the general definition above is a revelation probe (compound C) carrying a fluorescent label.
  • the ligation step constitutes an additional step between step d) and step e) of said method.
  • FIG. 1 illustrates the general principle of the invention.
  • This embodiment relates to the detection of three different antigens.
  • numerous variants could be envisaged by those skilled in the art, depending on the nature and the number of different analytes to be detected and or quantified, the sensitivity of the test, the speed of execution, the equipment used, etc.
  • variants may for example relate to the number and / or the size and / or the optical properties of the functionalized microspheres, the number of ligands specific for the desired analyte attached to their surface (compounds B), the magnetization step which can be repeated several times alternately with successive washes, the nature of the marker linked to the conjugate which may be the same for all the conjugates in the mixture or be different depending on the specificity of the conjugates, etc.
  • Populations of functionalized microspheres are placed in the presence of the sample that we want to test. For simplicity and clarity, it is considered in this description that there are three populations of latex microspheres (three analytes to detect and / or quantify) of different sizes. Each of the populations carries on its surface a compound B which is an antico ⁇ s of specific capture of one of the three analytes sought.
  • the compounds A are biotin molecules which are grafted to the surface of the microspheres to allow attachment of the magnetic particles of the ferrofluid by means of a biotin-sfreptavidine. When the microspheres are mixed with the sample, each of the analytes sought will bind to the population carrying the specific antibody.
  • the magnetic particles of the ferrofluid coupled to the sfreptavidine are then added to the medium and will bind to the surface of the microspheres.
  • the microspheres thus rendered magnetizable can be separated from the other interfering products of the medium by one or more stages of magnetization alternately with one or more stages of washing with an appropriate buffer.
  • the populations of microspheres are then placed in the presence of a mixture of three types of conjugates, each type of conjugate being represented in this scheme by a compound C which is a specific antico ⁇ s carrying a fluorescent marker.
  • the microspheres associated with fluorochrome can be analyzed. In the present case, these are analyzed by flow cytometry according to their size.
  • the conjugates are generally used in excess so as to ensure best labeling of the analytes fixed to the microspheres. Therefore, before proceeding with the analysis of the microspheres, it is best to isolate them from the medium containing excess conjugates remained in suspension. This separation is advantageously carried out again by one or more series (s) of magnetization and washing (s).
  • an advantageous variant of the method according to the invention aims to detect and / or quantify n nucleic acids.
  • this variant proceeds according to the following protocol, schematically in Figure 2.
  • the analysis relates to three fluorescent PCR products using beads of different sizes.
  • Each of the populations of functionalized microspheres is covered by a compound B which is an oligonucleotide complementary to one of the PCR products (capture probe) and no longer by a specific antico ⁇ s.
  • the steps of mixing and magnetizing the microspheres are identical to those described in the previous embodiment. After steps magnetization ,, and washing the microspheres having captured fluorescent products on their surfaces are analyzed by flow cytometry.
  • the present invention also relates to a kit for the multiplex detection and / or quantification of analytes likely to be contained in a sample, characterized in that it comprises a suspension of populations of functionalized non-magnetic microspheres, said microspheres carrying on their surface: a) a reagent 1 comprising:
  • the kit according to the invention further comprises:
  • the kit of the invention further comprises:
  • reagent 5 composed of a dilution buffer
  • reagent 6 composed of a wash buffer.
  • the kit according to the invention further comprises:
  • reagent 7 comprising a buffer for neutralizing the aggregation of the different microspheres.
  • Said buffers are for example buffers based on PBS, such as for example PBS / Tween 20.
  • Reagent 7 will be more particularly used in the case where compound A on the surface of the microspheres is a compound of biotin type.
  • Said neutralization buffer makes it possible to avoid aggregation of the various microspheres covered with compound A during the magnetization.
  • the neutralization buffer consists for example of an aqueous solution of biotin.
  • Figure 1 Diagram of the principle of the detection and / or quantification method (multiplex assay) according to the invention applied to the detection and or the quantification of three antigens using beads of different sizes.
  • Figure 2 Diagram of the principle of the method according to the invention applied to the multiplex assay of three fluorescent PCR products using beads of different sizes.
  • Figure 3 Scheme of the principle of the multiplex assay method of the invention applied - in molecular genetics to the search SNPs.
  • Figure 4 Diagram illustrating the same principle as the previous, wherein an additional degree of specificity is achieved at the level of grafting of the disclosure probe.
  • Figures 5 A, 5B, 5C FCM analysis of a mixture of beads of 3-8 -10 and 15 microns depending on the size.
  • R2 and R6 Estapor 3 microns
  • R3 and R7 Polymer Laboratories 8 ⁇ m
  • R4 and R8 Dynal Particles 10 ⁇ m
  • R5 and R9 Polymer Laboratories 15 ⁇ m
  • Figures 6 A, 6B, 6C and 6D Analysis in CMF of a mixture of beads of 3 - 4.4 - 8 - 10 and 15 ⁇ m as a function of the size and of a fluorescence.
  • R4 and R8 Dynal Particles 10 ⁇ m
  • R5 and R9 Polymer Laboratories 15 ⁇ m
  • RIO
  • Figures 7A and 7B Analysis in CMF of a mixture of beads of 4.4 - 8 - 10 and 15 ⁇ m initially non-magnetic.
  • Figure 8 Evolution of the FS LOG distribution of the different populations of biotin beads during the fixing of the FF-SA.
  • Figure 9 Determination of B. globigii on a 15 ⁇ m anti-B. globigii microsphere.
  • Figures 10A and 10B Ovalbumin Assay on microsphere 4.4 .mu.m QuantumPlex # 3 anti-ovalbumin.
  • the 2 types of beads are distinguished by their size in double scatter analysis, ⁇ S-FN
  • the balls are placed in the presence of two O. ⁇ . representing the two genes simultaneously.
  • Fig 12 shows the fluorescence levels as a function of size, ⁇ S-FN (region
  • FIG. 14 shows, in superposition, the respective green fluorescence histograms of each type of beads, solid curve for the ⁇ S-FN ball and empty curve for the ⁇ S-FII ball. The average intensities of green fluorescence (MFI) are measured in each of the windows M1 and M2.
  • Figures 14 and 15 Analysis of CMF duplex mixture; negative control: The beads placed in the presence of the two ONs simultaneously are dehybridized by heat, showing the marking of non-specific background noise.
  • Fig 14 shows the fluorescence levels as a function of size, ⁇ S-FN (region R4) and ⁇ S-FII (region R3).
  • FIG. 15 shows, in superposition, the respective green fluorescence histograms of each type of bead, full curve for the ⁇ S-FN bead and empty curve for the ⁇ S-FII bead.
  • the MFIs are measured in each of the windows M1 and M2.
  • Figures 16 and 17 CMF analysis on duplex mixture of a simple positive test for FN: The beads are placed in the presence of a single O. ⁇ ., corresponding to the FN.
  • Fig 16 shows the fluorescence levels as a function of size, ⁇ S-FN (region R4) and ⁇ S-FII (region R3).
  • Fig 17 shows, in superposition, the respective green fluorescence histograms of each type of beads, full curve for the ⁇ S-FN ball and empty curve for the ⁇ S-FII ball.
  • the MFIs are measured in each of the windows M1 and M2.
  • Figures 18 and 19 CMF analysis on duplex mixture of a simple positive test for Fil: The beads are placed in the presence of a single O. ⁇ ., corresponding to the Fil.
  • Fig 18 shows the fluorescence levels as a function of size, ⁇ S-FN (region R4) and ⁇ S-FII (region R3).
  • Fig 19 shows, in superposition, the respective green fluorescence histograms of each type of bead, full curve for the ⁇ S-FN bead and empty curve for the ⁇ S-FII bead.
  • the MFIs are measured in each of the windows M1 and M2.
  • Figure 20 The critical base (specificity S ⁇ P) is carried by each of the exposure probes, allele-specific and each carrying a different fluorochrome (or hapten / tag which can be revealed by an anti-tag mAb fluorescent).
  • This system takes advantage of multi-color analyzes achievable in CMF.
  • Each type of ball allows differential detection of a mutation.
  • Figure 21 The critical base (specificity of S ⁇ P) is carried by each of the capture probes, allele specific, and each coupled to a different type of bead (differentiated for example by size). This system requires, for the analysis of the signal in CMF, only one fluorescence allowing either to use a simpler and less expensive apparatus, or to take advantage of other colors to differentiate the families of beads between them, in multi-color analyzes.
  • Figure 22 CMF analysis on duplex mixture:
  • the two types of beads are distinguished by their size duplicate analysis scatter ⁇ S-FNwt (diameter 6.7 .mu.m, conditioned on the region RI) and ⁇ S-FNmut (diameter 9.6 .mu.m, conditioned on the region R2). This selective analysis based on size (FS) and grain size (S S) is repeated in all the figures which follow.
  • FIG 23 and 24 Analysis of CMF duplex mixture of a negative control: The balls are placed in the presence of non-specific amplicons of the studied mutation that serve as negative control in the presence of PCR mixture "Amp Mix.”
  • Fig 23 shows the fluorescence levels as a function of size, ⁇ S-FNwt (region R4) and ⁇ S-FNmut (region R3).
  • Figure 24 shows, in supe ⁇ osition, the respective green fluorescence histograms of each type of beads, solid curve for the ball ⁇ S- FNwt and empty curve for the ball- ⁇ S FVmut. The mean fluorescence intensities (MFI), measured in the windows M1 and M2, are indicated for each type of bead.
  • Figures 25 to 28 CMF analysis on duplex mixture of a simple positive test on wild allele:
  • Figure 25 shows the fluorescence levels depending on the size ⁇ S-FNwt (region R4) and FN ⁇ S- C (R3 region).
  • Figure 26 shows, in supe ⁇ osition, the respective green fluorescence histograms of each type of beads, solid curve for the ball ⁇ S- FNwt and empty curve for the ball- ⁇ S FVmut.
  • Fig 27 shows, on ⁇ S-FNwt, the histograms of the test (curve on the right) and of the LF (curve on the left, taken from Fig 24).
  • Fig 28 shows, on ⁇ S-FNmut the histograms of the test (curve on the right) and of the LF (curve on the left, taken from Fig 24).
  • Figures 29 to 32 CMF analysis on duplex mixture of a simple positive test on mutant allele:
  • Fig. 29 shows the fluorescence levels as a function of size, ⁇ S-FNwt (region R4) and ⁇ S-FNmut (region R3).
  • Fig. 30 shows, in superposition, the respective green fluorescence histograms of each type of bead, full curve for the ⁇ S-FNwt bead and empty curve for the ⁇ S-Fvmut bead.
  • Figure 31 shows, on ⁇ S-FNwt, test histograms (right curve) and BF
  • Fig 32 shows, on ⁇ S-FNmut the histograms of the test (curve on the right) and of the LF
  • the beads are placed in the presence of amplicons from the two alleles simultaneously.
  • Figure 34 shows the levels. of fluorescence as a function of the size, ⁇ S-FNwt (region R4) and ⁇ S-FNmut (region R3).
  • Figure 34 shows, in supe ⁇ osition, the respective green fluorescence histograms of each type of beads, solid curve for the ball ⁇ S- FNwt curve and vacuum to the ⁇ S-FNmut ball.
  • Fig 35 shows, on ⁇ S-FNwt, the histograms of the test (curve on the right) and of the LF
  • Fig 36 shows, on ⁇ S-FNmut the histograms of the test (curve on the right) and of the BF
  • the critical base (specificity S ⁇ P) is carried by each of the probes, capture, allele-specific, and each coupled to a different type of ball (differentiated by size).
  • This system requires, for the analysis of the signal in CMF, only an analysis by counting the balls on the basis of the parameters of size and structure, allowing either to use an apparatus devoid of a fluorescence detector and therefore less expensive, or to take advantage of other sizes to differentiate the families of logs between them.
  • the two types of beads are distinguished by their size duplicate analysis scatter ⁇ S-FNwt (diameter 6.7 .mu.m, conditioned on the region RI) and ⁇ S-FNmut (diameter 9.6 .mu.m, conditioned on the region R2). This selective analysis based on size (FS) and grain size (SS) is repeated in all the figures which follow.
  • the beads are placed in the presence of non-specific amplicons of the mutation studied which serve as a negative control in the presence of the PCR mixture "Ampli-Mix".
  • Figure 40 shows, in supe ⁇ osition, histograms of number of respective ⁇ S of each type of beads. The number of ⁇ S, measured in windows Ml and M2, are indicated for each type of ball.
  • Figures 41 and 42 Analysis of CMF mixture duplex with a single positive test on wild allele: The balls are placed in the presence of amplicons of a single allele (FNwt).
  • Fig 41 shows the levels of the number of ⁇ S as a function of size, ⁇ S-FNwt (region RI) and ⁇ S-FNmut (region R2).
  • Fig 42 shows, in superposition, the histograms of the number of respective ⁇ S of each type of beads. The number of ⁇ S, measured in windows Ml and M2, are indicated for each type of ball.
  • Figures 43 and 44 CMF analysis on duplex mixture of a simple positive test on mutant allele:
  • Fig 43 shows the levels of the number of ⁇ S as a function of size, ⁇ S-FNwt (region RI) and ⁇ S-FNmut (region R2).
  • Fig 44 shows, in supe ⁇ osition, the histograms of the number of respective ⁇ S of each type of beads. The number of ⁇ S, measured in windows Ml and M2, are indicated for each type of ball.
  • Example 1 Recognition of families of microspheres ( ⁇ S) as a function of size by CMF
  • microspheres listed below were mixed in similar proportions and the mixture analyzed on a flow cytometer of the EPICS XL type (Coulter) ( Figure 5).
  • the parameters are measured after logarithmic amplification (FS log / log SS) (SS for Forward light scatter; SS Side light scatter). List of the 6 populations of microspheres used
  • Example 2 Differentiation of multiple (6) families of microspheres by CMF as a function of combined size and fluorescence
  • Microspheres of 4.4 microns carrying a red fluorescence (measured on the FL4 detector has been added to the mixture of Example 1.
  • the combination, the mixture described above, of 4.4 .mu.m microspheres allows recognition of 2 additional families unlike axial scatter (log FS) between the microspheres of 3 .mu.m and 4.4 .mu.m those still too low for easy discrimination (Fig 5A and B)
  • Fig 5A and B Adding the parameter FL4. associated allows complete discrimination microspheres of 4.4 .mu.m vis-à-vis all other (3 microns in particular) and to the microspheres 2 groups 4.4 .mu.m them ( Figure 6).
  • the BSA-biotin (Sigma, Ref. A-8549) was diluted in PBS buffer at 500 ⁇ g / ml in a volume of 1 ml and placed at 4 ° C for 30 min.
  • the loaded beads were saturated by incubation 2 hours in 2 ml of PBS / BSA 2% buffer. Two washes in PBS buffer were carried out before taking up the beads . 1 ml of PBS / BA. The suspensions obtained were numbered and their concentrations adjusted to 2.5.10 4 / ⁇ l.
  • the anti-ONA and anti-Ricin Ab were covalently coupled after activation of the -COOH beads (protocol adapted from the Bang's Labs procedure, Tech ⁇ ote Ref # 205: "Covalent Coupling”).
  • the carbo-diimide used for the activation of the beads is l-enyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide-HCl (EDC, Pierce - Breb restaurants, FR -, Ref. 1853160).
  • the anti ONA IgGs were diluted in PBS buffer to a concentration of 200 ⁇ g / ml in a volume of 1 ml.
  • the mixtures were centrifuged for 10 min at 1900 g. After removal of the supernatant, the loaded beads were biotinylated by an overnight incubation at 4 ° C. in 2 ml of PBS / BSA-0.05% biotin / 30 mM glycine.
  • the beads were centrifuged for 10 min at 1900 g. After removing the supernatant, the loaded beads were saturated by incubation for 30 min in 2 ml of PBS / 2% BSA. Washing in PBS buffer was carried out before resuming the beads with 1 ml of PBS / BA. The suspensions obtained were numbered and their concentrations adjusted to 2.5 ⁇ 10 4 beads / ⁇ l.
  • Example 5 Magnetic isolation and differential recognition of microspheres 4.4 ⁇ m, 8, 10 and 15 ⁇ m initially non-magnetic. l. Goal
  • IMS tube introduce 790 ⁇ l of PBS / 0.1% Tween (IMS tube) or 490 ⁇ l of PBS / 0.1% BSA / 0.09% NaN3 (PBS / BA) (reference tube).
  • a square region A of the composite population of counting beads (5.1 microns.
  • the magnetic separation is compatible with the implementation of a multiplex assay (no overlap of different types of microspheres).
  • Example 6 Example of kit model according to the invention
  • Reagent 1 - Functionalized microspheres mixture of biotinylated microspheres coated with specific Ag Ab to measure. Concentration in beads: 2500 microspheres of each specificity / ⁇ l (following table).
  • Reagent 2 - Ferrofluids-Streptavidin streptavidin, captofate ferrofluid conjugate (Molecular Probes, Ref. C-21476).
  • Reagent 3 - revelation reagent mixture of specific fluorescent conjugated Ag to be assayed (according to Table).
  • a series of dilutions of this reagent is to be prepared immediately (dilution in Reagent 1). Treated in the same conditions as the test sample, the range (number of points to be determined) allows quantification of Ag present in the sample.
  • Reagent 6 Wash Buffer: To be determined (PBS / BSA 0, l% / NaN 3 0.09% or PBS / 0.1% Tween 20 or other).
  • Reagent 7 Neutralization buffer: d-biotin solution at 200 ⁇ g / ml in distilled water.
  • D-biotin prevents the aggregation of the different biotinylated microspheres during magnetization (microsphere / biotin aggregation - SA FF / SA - biotin / microspheres avoided by neutralizing SA FF / SA with biotin to give biotin-SA / FF / SA- biotin which cannot bridge between the different microspheres-biotin).
  • Example 8 Detection and determination of a bacterium on 15 ⁇ m microspheres after magnetic isolation.
  • Aim Detect and determine the concentration of B. globigii on 15 ⁇ m biotinylated beads loaded with anti-B. globigii PABs.
  • Example 9 Determination of ovalbumin on multiplex fluorescent microspheres 4.4 .mu.m after magnetic isolation.
  • Example 10 Analysis multiplex cytometric flow applied molecular genetics to the search SNPs
  • OLA type test 1 An oligonucleotide capture probe, of a size generally between 5 and 100 bases, specific for a gene, is fixed by chemical methods on a microthere of biotinylated latex (Iannone MA et al 2000; Cytometry 39: 131-140). The biotinylation step of the latex microsphere can also be carried out after the coupling of the capture probe to the microsphere. In a single tube, the latex beads are incubated in the presence of sfreptavidin ferrofluids (FF-SA), revelation probes (A1 and A2 in the example in FIG.
  • FF-SA sfreptavidin ferrofluids
  • Probes Al and A2 can be either different fluorescent probes (for example Cy3 and Cy5) or separate haptens allowing a subsequent immunological reaction (for example with two antico ⁇ s labeled with dissimilar fluorochromes [FITC vs PE]). Multiplexing is achieved by variation of the latex bead system which can either be of varying sizes and / or endowed with different fluorescent characteristics.
  • a test can be developed by adding an additional degree of specificity at the level of the grafting of the capture probe on the latex microsphere.
  • This grafting can be carried out by means of a specific antigen-antico ⁇ s couple, a specific hapten-antico ⁇ s couple or an oligonucleotide probe rich in G + C (Guanine, Cytosine).
  • G + C Guard, Cytosine
  • the Tm (Melting Temperature) of the nucleotide anchoring sequence will ideally be greater than 60 ° C. and / or composed of a polymer of at least 15 guanine or cytosine residues or a mixture of the two nucleotide bases. Under these conditions, hybridizations and dehybridizations (generally carried out between 15 ° C and 40 ° C) of the genomic material or captured amplicons are possible without dehybridizing the probe that captures the microsphere.
  • PCR products are made fluorescent using labeled nucleotides.
  • the technical approach proposed by the invention which implements washing steps by magnetic separation of non-magnetic beads originally, could be applied to the differential detection of labeled PCR products, according to the principle schematized in the Figures 11 and 19 and which relates to 3 different specificities.
  • the 2 capture probes are constructed with an amino group (-NH 2 ) in - 5 ', with a view to covalent coupling on carboxylated beads ( ⁇ S-COOH). They contain a spacer arm (or spacer for the English term “spacer”) formed of
  • the biotin group on the surface of the beads necessary for the system of the invention in the examples which follow, is provided using a poly- (T) 30 oligonucleotide (denoted polyT-biot), marked in -3 'by biotin and carrier in -5' of a NH 2 spacer (C 6 ). It is constructed according to the structure below: NH 2 (C 6 ) TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-biotin (SEQ ID No. 3) and coupled in the same way and simultaneously with each capture probe.
  • the oligonucleotides complementary to the capture probes are constructed according to the structures below and are marked by fluorescein (Fluor-) in -5 ': for FV: Fluor-g Agg AAT AcA ggT ATT TTg Tcc (SEQ ID N ° 4 ) for Wire: Fluor-g age etc aat gct ecc agt gct att (SEQ ID N ° 5)
  • EDAC N- (diméifrylarninopro ⁇ yl) -N'- ethylcarbodiimide HC1, Sigma
  • the beads are incubated with intermittent shaking (vortex) for 2 hours at RT (room temperature) in a glass tube. After coupling, the activated carboxyl groups are neutralized by adding 400 ⁇ l of 0.2M ethanolamine, and by incubating for 16 h at 4 ° C.
  • the buffers are the same as those used in the following example (Example 12), where the detection effectively concerns double-stranded DNA.
  • These optimal pH buffers, astringents or not and respectively to i) dehybridization of matched amplicons and ii) neutralization under conditions favorable for at least partial reannealing ( ⁇ ) (see note of Part 2 (hardware) of example 12) on the immobilized capture probes, are all from the kit GENECOLOR TM FV Leiden (BioCytex, Marseille, F) under the respective names of "hybridization buffer” / hybridization buffer "Ligation buffer” / noted here neutralization buffer.
  • the beads (5 ⁇ l test or 100,000 ⁇ S / test for each type) and the complementary oligonucleotide (ON) (5 ⁇ l or 3 pmol / test for each of the ONs for the maximum doses or 1/10 dilution according to indications) are incubated in PCR tubes (Simport, Quebec, C) for 15 min at RT in hybridization buffer then 15 min at RT in neutralization buffer to obtain hybridization of the complementary strands. After hybridization, the O.N. not attached to the beads are washed by magnetic separation.
  • the tubes are heated near the melting point (T) of the probes to maintain only specific hybridizations (corresponding to the total complementarity of the sequences ie 100%) and to dissociate the non-specific hybridizations (corresponding to complementarities partial sequences ie ⁇ 35%).
  • T melting point
  • the tubes are incubated at 54 ° C in PBS / Tween20 ® 0.1%, a condition which permits selective detachment of the fluorescent probes and FV wire their non-complementary sequence, "wire” and "VF", respectively.
  • the tubes are kept in the water bath for 5 min at the indicated temperature and then immediately analyzed in CMF.
  • the tubes are heated well beyond the melting point (Tm), in practice for 10 min at 80 ° C.
  • FIGS. 11 to 19 illustrate the differential detection of the labeled oligonucleotide fragments representative of the FV and Fil genes respectively, in duplex cytometric analyzes.
  • the FV specificity capture beads ⁇ S-FV
  • wire specificity capture beads ⁇ S-FII
  • diameter 9.6. ⁇ m are identified in the region R2.
  • SNP point mutations
  • the CMF allows simultaneous measurement of fluorescence intensities of very different levels (from background noise to ++++ marking) on groups of beads which can be differentiated on the basis of another parameter (size or fluorescence of length of wave different).
  • Detection of point mutations requires the use of two types of ⁇ S for differential detection.
  • the ⁇ S used here are loaded with the ad hoc capture probes as illustrated in example 11 and are such that:
  • ⁇ S-FVwt wild Factor V capture probe
  • ⁇ S-FVmut NH 2 (C 6 ) TTT TTT TTT TTT AAT ggA cAA Ace TGT ATT CCT T (SEQ ID NO: 6)
  • the biotin group on the surface of beads required by the system of the invention in the following examples is provided as in Paragraph A with an oligonucleotide poly (T) 30 and allows the specific binding of streptavidin ferrofluide- (Captivate TM, Molecular Probes, Eugene, OR, USA).
  • the probe contiguous to the capture probe allowing the revelation of the ligation carries a phosphate group in 5 'and a fluorescein labeling in 3'; it has been specially synthesized by Proligo (Paris, F) and has the following sequence: PO 4 2 "-gcc tgt cca ggg ATc TgcTcc fluo (SEQ ID NO: 7).
  • the amplicons allowing the formation of the ternary complex result from the PCR amplification of a fragment of the wild Factor V gene and / or mutant from genomic DNA or specific plasmids, PCR carried out in the presence of a mixture for PCR reactive "amp Mix" available in the kit GENECOLOR TM
  • the ligase solution allowing the formation of a covalent bond between the capture probe and the signal probe is the reagent called "Ligation solution”, or ligation solution, that is to say a T4 Ligase in its special buffer, called “Ligation buffer”, as used in GENECOLOR TM FV Leiden kits, (BioCytex, Marseille,
  • the buffers used below are of optimal pH, astringent or not, and respectively allow i) the dehybridization of the paired amplicons and their partial rehybridization ( ⁇ ) (cf. note of part 2 (material) of Example 12) on immobilized capture probes, ii) the action of the ligase and finally iii) the dehybridization of the unlicensed amplicons and probes after ligation.
  • the dilution buffer for flow cytometry analysis is PBS-Tween 20® 0.1%.
  • the stoichiometry conditions are previously optimized (excess amplicons, excess signal probe) to obtain rehybridization of a significant fraction of one of the 2 strands of DNA on the immobilized capture probes rather than on its complementary strand.
  • the beads of the 2 types are mixed in equivalent quantities and diluted in hybridization buffer at a rate of 40,000 ⁇ S / ⁇ l in total.
  • 5 ⁇ l of bead suspension i.e. 100,000 ⁇ S / test for each type
  • the amplicons 3.75 ⁇ l / test
  • probe FV revelation (1 pmole under, 25 ⁇ l of hybridization buffer).
  • the reaction medium is homogenized (vortex) and incubated for 30 min at room temperature (RT).
  • the ligation step is then carried out by incubation for one hour after addition of 100 .mu.l of ligation solution.
  • the washing solution allows selective detachment of the products associated with the beads only by non-covalent interaction (hybridization without ligation) but not that of the covalently linked probes or that of the SA-FF. This washing is repeated a second time.
  • the beads are finally diluted in 1 ml of dilution buffer (PBS-Tween 20 ® ), transferred to a tube for cytometry (4 ml) and analyzed in CMF.
  • dilution buffer PBS-Tween 20 ®
  • the ⁇ S-FVmut beads show a marking clearly different from BF, corresponding at positive maximum signal possible with available equipment .
  • the ⁇ S-FVwt beads give a weak marking compared to the maximum positive signal (14.8 versus 313 ua or ⁇ 2% of the maximum amplitude of variation), although different from their intrinsic background noise, which suggests the existence of weak but real non-specific labeling on these beads in the presence of FN mut amplicons.
  • FV wt from 15 to 300 u.a.
  • FV mut from 17 to 43 u.a.
  • the first using only fluorescence for the measurement, makes it possible to detect as many different alleles as can be differentiated from families of beads simultaneously,
  • the major advantage provided by the invention is that the choice of beads for multiplex analysis places no limiting condition on their intrinsic magnetic properties.
  • Example 13 Differential detection of an SNP mutation 1.
  • Principle of Figure 37 In Fig. 37, as in FIG. 21, the critical base (specificity of SNP) is carried by each of the capture probes, specific for alleles, and each coupled to a different type of bead (differentiated by size). This system requires, for the analysis of the signal in CMF, only an analysis by counting the balls on the basis of the parameters of size and structure, allowing either to use an apparatus devoid of a fluorescence detector and therefore less expensive, or to take advantage of other sizes to differentiate the families of logs between them. 2.
  • Material Materials:
  • Detection of point mutations requires the use of two types of ⁇ S for differential detection.
  • the ⁇ S used here are loaded with the ad hoc capture probes as illustrated in paragraph A and are such that:
  • FVwt constructed according to the structure below, indicated from the 5 'to 3' end: ⁇ S-FVwt: NH 2 (C 6 ) TTT TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Ace TgT ATT ccT c (SEQ ID No.1)
  • ⁇ S FVmut mutant Factor V capture probe constructed according to the structure below, indicated from the 5 ′ to 3 ′ end: ⁇ S-FVmut: NH 2 (C 6 ) TTT TTT TTT TTT AAT ggA cAA Ace TGT ATT CCT T (SEQ ID NO: 6)
  • the probe adjacent to the capture probe for the revelation of the ligation carries a phosphate group at the 5 'biotin moiety and a 3'; it has been specially synthesized by Proligo (Paris, F) and has the following sequence: PO 2_ -gec TgT ccA ggg ATc TgcTcc TTT TTT TTT TTT TTT-Biotin (SEQ ID N ° 8)
  • biotin group on the capture probe necessary for the system of the invention in the examples which follow allows the specific binding of ferrofluide-streptavidin (Captivate TM, Molecular Probes, Euzzo, OR, USA).
  • the amplicons allowing the formation of the ternary complex result from the PCR amplification of a fragment of the wild Factor V gene and / or mutant from genomic DNA or specific plasmids, PCR carried out in the presence of a mixture for PCR , “Ampli-Mix” reagent available in the GENECOLOR TM FV Leiden kit, (BioCytex, Marseille, F).
  • the ligase solution allowing the formation of a covalent bond between the capture probe and the signal probe is the reagent called "Ligation solution” / Ligation solution ie a T4 Ligase in its special buffer, called “Ligation buffer”, such as 'used in GENECOLOR TM FV Leiden kits (BioCytex, Marseille, F).
  • the buffers used below are of optimal pH, astringent or not, and respectively allow i) the dehybridization of the paired amplicons and their partial rehybridization ( ⁇ ) (see below) on the immobilized capture probes, ii) the action of the ligase and finally iii) the dehybridization of the unlicensed amplicons and probes after ligation.
  • the dilution buffer for flow cytometry analysis is PBS-Tween 20 ® 0.1%
  • Protocol The beads of the 2 types ( ⁇ S-FVwt and ⁇ S-FVmut) are mixed in equivalent quantities and diluted in hybridization buffer at a rate of 40,000 ⁇ S / ⁇ l in total.
  • PCR T 320-IN, Simport, Quebec, C 5 ⁇ l of bead suspension (i.e. 100,000 ⁇ S / test for each type) are distributed, the amplicons (3.75 ⁇ l / test ) and the FV revelation probe (1 pmole under 1.25 ⁇ l of hybridization buffer).
  • the reaction medium is homogenized (vortex) and incubated for 30 min at room temperature (RT).
  • the ligation step is then carried out by incubation for one hour after addition of 100 .mu.l of ligation solution.
  • SA-FF ferrofluid suspension
  • the washing solution allows the selective release of the products associated with the beads only by non-covalent interaction (hybridization without ligation) but not that of the covalently linked probes or that of the SA-FF. This washing is repeated a second time.
  • the beads are finally diluted in 1 ml of dilution buffer (PBS-Tween 20 ® ), transferred to a tube for cytometry (4 ml) and analyzed in CMF.
  • dilution buffer PBS-Tween 20 ®

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de détection et/ou de quantification multiplex d'analytes dans un échantillon à l'aide de microsphères fonctionnalisées, ces microsphères étant magnétisées après l'étape de mise en présence de l'échantillon avec ces microsphères. Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la quantification multiplex de plusieurs analytes par cytométrie de flux. L'invention à également pour objet un kit pour la détection et/ou la quantification de plusieurs analytes pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention qui comprend une suspension de microsphères non magnétiques fonctionnylisées, une solution de ferrrofluides et une solution d'au moins un conjugué.

Description

PROCEDE DE DETECTION ET DE QUANTIFICATION MULTIPLEX D'ANALYTES DANS UN ECHANTILLON A L'AIDE DE MICROSPHERES
La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification multiplex d' analytes dans un échantillon à l'aide de microsphères fonctionnalisées, ces microspheres étant magnétisées après l'étape de mise en présence de l'échantillon avec ces microsphères. Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la quantification multiplex de plusieurs analytes par cytométrie de flux. L'invention a également pour objet un kit pour la détection et/ou la quantification de plusieurs analytes pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention qui comprend une suspension de microspheres non magnétiques fonctionnalisées, une solution de ferro fluides et une solution d'au moins un conjugué.
Le développement et la diversification du diagnostic in vitro demandent de plus en plus la mise en place de moyens pour la détection et l'identification rapides de composés et microorganismes divers. Ce besoin concerne à la fois le domaine de la santé humaine ou animale, par exemple pour la recherche et le dosage d'antigènes ou agents pathogènes particuliers, le domaine de l'agro-alimentaire, tel par exemple le contrôle de la qualité et le dépistage de contaminants éventuels dans des produits destinés à l'alimentation, ou le domaine de l'environnement lorsqu'il s'agit par exemple de prévention de tout risque biologique, ou de détection d'impuretés, pesticides ou agents polluants divers. L'utilisation de tests immunologiques sur microbilles associés à des systèmes d'analyse de type cytométrie de flux, constitue l'une des voies technologiques les mieux adaptées à ces besoins et de nombreuses approches basées sur ce principe ont été proposées dans l'état de l'art.
Par exemple, les demandes de brevet internationales publiées sous les numéros WO 98/51435, WO 94/09368, W0 90/15666 et la demande de brevet européenne publiée sous le numéro EP 180384 décrivent des particules magnétiques ou fluorescentes de type particulier, utilisables dans des méthodes de diagnostic. D'autres documents de l'art antérieur proposent différents protocoles pour l'identification et/ou le dosage d'analytes multiples sur microbilles. Ainsi à titre d'exemple, la demande internationale publiée sous le numéro WO 90/05305 concerne un procédé et son kit correspondant pour détecter et/ou doser plusieurs analytes dans un échantillon par une méthode d'agglutination utilisant plusieurs sous-populations de billes fluorescentes. La fluorescence des agrégats formés peut être mesurée par cytométrie de flux, analyse d'image ou système à balayage laser.
Le brevet américain délivré sous le numéro US 4,665,020 concerne un procédé
• de dosage d'un antigène par cytométrie de flux utilisant deux populations de sphères de diamètre différent, les plus grosses étant recouvertes d'un anticoφs spécifique de l'antigène, et les plus petites étant fluorescentes. Le dosage est réalisé selon le principe d'une méthode sandwich ou de compétition en fonction du ligand fixé sur les sphères fluorescentes (anticoφs ou antigène).
La demande internationale publiée sous le numéro WO 97/14028 concerne une méthode d'analyse par cytométrie de flux pour la détection de plusieurs analytes d'intérêt, dans laquelle on utilise une pluralité de sous-populations de billes dont au moins l'un des paramètres de classification pour l'analyse en cytométrie de flux diffère d'une sous-population à l'autre. Chaque sous-population est couplée à un composé réagissant spécifiquement avec l'un des analytes à doser. La sous-population de billes, et donc la nature du composé ayant réagi avec l'analyte correspondant, est identifiée par cytométrie, à partir de l'analyse de l'ensemble des paramètres de classification de chaque sous-population.
La demande internationale publiée sous le numéro WO 98/20351 concerne une méthode pour détemiiner la présence d'un ou plusieurs analytes dans un échantillon, dans laquelle on utilise des populations "test" de microparticules, chacune des populations portant un ligand spécifique d'un analyte, et des microparticules de référence ne réagissant avec aucun des analytes recherchés. Le dosage est réalisé en comptant le nombre de microparficules libres dans chaque population "test" et en le comparant à celui des microparticules de référence. Le comptage est réalisé selon différentes méthodes, dont préférentiellement la cytométrie.
La demande internationale publiée sous le numéro WO 96/31777 vise une méthode de détection de microorganismes dans un échantillon utilisant au moins un type de particule détectable portant un ligand spécifique des microorganismes recherchés. Les microorganismes fixés aux particules sont ensuite révélés à l'aide d'un second ligand portant un marqueur fluorescent.
Le brevet américain délivré sous le numéro US 6,280,618 concerne une méthode pour détecter individuellement une pluralité d'analytes . dans laquelle on utilise un mélange de populations de microparticules magnétiques pouvant être différenciées les unes des autres et portant chacune un ligand différent. Les microparticules de chaque groupe sont séparées du milieu et mises ensuite en suspension dans un second milieu liquide dans lequel elles sont analysées par cytométrie de flux. La demande internationale publiée sous le numéro W0 93/02260 concerne une méthode de cytométrie de flux pour détecter simultanément plusieurs analytes dans un même échantillon, et le réactif pour sa mise en œuvre. Ce réactif est constitué par un mélange de plusieurs sous-populations de microsphères, chaque sous-population portant à la surface un ligand particulier capable de former une paire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés. La détection des analytes fixés aux microsphères est réalisée après addition d'un agent portant un fluorochrome, capable de se fixer sur les paires de liaisons formées.
Ces procédés de détection simultanée de plusieurs analytes dans un même échantillon peuvent également comporter une ou plusieurs étapes de séparation magnétique.
En effet, une telle étape de séparation magnétique permet de faciliter les dosages dans certains milieux complexes où les antigènes d'intérêt doivent être isolés de façon spécifique (une analyse cytométrique pouvant s'avérer non réalisable en présence de certaines microparticules). C'est le cas par exemple pour des analyses en agro- alimentaire, papeterie et traitement des eaux usées où sont recherchées des molécules / particules présentes dans des broyats liquéfiés divers (pulpes, mous, produits laitiers voire fromagers, jus de f uits, broyats de légumes, jus de fermentation etc....), préparations qui ne peuvent être filtrées au risque de perdre l'analyte à doser.
C'est le cas aussi pour des analyses en sciences de l'environnement et santé humaine où le contenu particulaire d'un grand volume d'air est concentré dans un liquide grâce à un bio-collecteur. Dans ce cas aussi il est impératif d'éliminer toutes les particules, poussières, micro-fibres, pollens etc.. en suspension dans l'air, dont la taille i) soit couvre celle des billes de capture (1 à 30 μm) et rend difficile voire impossible leur identification par les seuls paramètres de diffusion lumineuse, ii) soit rend incompatible l'analyse par bouchage du cytomètre (risque élevé à partir de 100 μm) et qui sont retrouvées concentrées dans le liquide après biocollection. De plus, on doit aussi se débarrasser des particules huileuses (graisseuses) qui sont incompatibles avec le bon fonctionnement de la fluidique d'un cytomètre.
En outre, l'utilisation d'une séparation magnétique permet également de concentrer rapidement les agents à doser et évite de devoir utiliser des étapes de centrifugation pour laver les billes de capture. Une telle association entre une étape de capture spécifique, sur des microbilles et une étape de séparation magnétique a déjà été décrite dans l'état de l'art, notamment dans le brevet délivré sous le numéro US 6,280,618.
Toutefois, l'utilisation de microspheres magnétiques dans un procédé d'identification et de dosage d'analytes contenus dans un échantillon, peut présenter différentes contraintes industrielles, et gêner la manipulation et l'homogénéité de prélèvement des suspensions. En effet, des microsphères magnétiques de tailles différentes (et souvent de contenus différents en matériel aimantable) peuvent avoir des comportements différents au cours de la séparation magnétique, c'est-à-dire des temps d'aimantation plus ou moins longs. Il en résulte des rendements de séparation variables selon les familles de microbilles en présence, d'où une hétérogénéité des résultats ou un allongement des phases de séparation magnétique. Pour pallier ce problème, il est nécessaire de disposer de microsphères magnétiques dont le contenu en matériel aimantable est adapté en fonction de la taille. Ceci crée bien évidemment des contraintes industrielles en terme de fabrication ou d'approvisionnement. De plus, les microsphères magnétiques sont denses, ce qui pose des problèmes pratiques de sédimentation au stockage, remise en suspension et sédiήientation rapide à l'analyse. En effet, la densité des billes magnétiques est couramment supérieure à 1,15 et, selon le taux de magnétite, oscille entre 1,15 et 1,50, amenant à des vitesses de sédimentation très rapides, en particulier pour des particules de grand diamètre (> 2 μm) (cf. demande de brevet européen publiée sous le numéro EP 1248110).
Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de développer un nouveau procédé spécifique d'identification et de dosage de plusieurs analytes contenus dans un échantillon liquide et qui comprend une ou plusieurs étapes de séparation magnétique, ledit procédé étant capable de contourner de tels inconvénients liés à l'utilisation de microsphères magnétiques.
Le brevet américain US 5,998,224 (publié le 7 décembre 1999, déposant : ABBOTT LABORATORIES), a pour objet une méthode de détermination de la présence ou de la quantité d'un analyte dans un échantillon test.
Selon un premier mode de réalisation, cette méthode comprend la mise en contact de l'échantillon test avec une phase solide mobile et un réactif magnétique pour former un mélange réactionnel dans lequel ledit analyte se lie à ladite phase solide mobile et ledit réactif magnétique pour former un complexe, puis à l'application d'un champ magnétique.
Selon un second mode de réalisation, la méthode comprend la mise en contact de l'analyte avec le réactif magnétique pour former un premier complexe, et la mise en contact du réactif magnétique avec la phase mobile solide pour former un second complexe, suivi de l'application du champ magnétique.
Selon une alternative de ce second mode de réalisation, l'analyte se lie à la phase mobile pour former un premier complexe et le réactif magnétique se lie à la phase mobile pour former un second complexe, puis un champ magnétique est appliqué.
La demande de brevet américain, publiée le 27 décembre 2001 sous le numéro US 2001/0054580 (BIO-RAD LABORATORIES, INC, liée à EP 1248110) a pour objet un test multiplex permettant de différencier plusieurs analytes dans un échantillon. Ce test met en œuvre des particules magnétiques en tant que phase solide et engendre un résultat individuel pour chaque analyte. Les particules magnétiques peuvent être distinguées entre elles par des caractéristiques qui permettent de les différencier en groupes, chaque groupe portant un réactif lié à la surface de la particule qui est différent des réactifs présents sur les particules des autres groupes.
Dans ce test multiplex, l'échantillon contenant lesdits analytes est mis en présence de particules magnétiques.
La demande de brevet européen publiée le 5 août 1987. sous le numéro EP 230 768 (SYNTEX INC), a pour objet une méthode de séparation d'une substance d'un milieu liquide. Cette méthode met en œuvre des particules magnétiques ou non magnétiques. Les particules non magnétiques peuvent être fonctionnalisées de manière à se lier à un membre d'une paire de liaison spécifique ou à une particule magnétique.
Un ferrofluide est décrit en tant que fluide magnétique, dans lequel les particules en suspension sont des particules ferromagnétiques. Les particules magnétiques colloïdales du fluide magnétique peuvent être cotées avec du matériel protéique tel que des protéines ferriques : albuline, gammaglobuline, etc.... Le « coating » des particules magnétiques avec des protéines peut être accompli par une liaison physique, par exemple Pabsoφtion, ou une liaison chimique.
La présente a pour objet, un procédé de détection et/ou de quantification multiplex d' analytes susceptibles d'êtres contenus dans un échantillon à l'aide de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdits analytes pouvant être le cas échéant préalablement marqués par un marqueur, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en présence dμdit échantillon avec une suspension de populations de microspheres non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microspheres portant à leur surface : pour toutes les populations de microsphères, un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison, ledit composé A étant également caractérisé en ce qu'il ne peut pas se lier avec lesdits analytes, et pour chacune des populations de microsphères, un composé B, différent pour chaque population, capable de former une paire de liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, b) l'addition au milieu réactionnel obtenu à l'étape a) d'un ferrofluide, lequel ferrofluide contient des particules magnétiques qui portent à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec le composé A, c). au moins une étape de lavage par séparation magnétique des microsphères magnétisées à l'étape b), d) le cas échéant lorsque lesdits analytes ne sont pas préalablement marqués, la mise en présence de la suspension des microspheres magnétisées obtenues à l'étape c) avec une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de reconnaître et de se lier spécifiquement avec l'un desdits analytes et un marqueur, cette étape d) étant suivie de préférence d'au moins une étape de lavage des microsphères par séparation magnétiqμe, et, e) la détection et/ou la quantification dudit marqueur à la surface des microsphères.
On entend désigner par procédé de détection et/ou de quantification multiplex dans la présente description un procédé de détection et/ou de quantification de plusieurs analytes d'intérêt en un seul test. On entend désigner par échantillon dans le procédé selon la présente invention tout échantillon pouvant contenir plusieurs analytes que l'on souhaite détecter et/ou quantifier dans ledit échantillon.
Parmi les échantillons susceptibles de contenir lesdits analytes selon la présente invention, on peut citer notamment les échantillons biologiques (notamment sang total, plasma ou sérum, liquide cephalorachidien, muqueuses, etc..) ou chimiques issus de tous types de prélèvements, notamment dans les domaines de la santé humaine ou animale, de l'agro-alimentaire ou de l'environnement, ou encore issus de l'industrie chimique, lesquels prélèvements sont effectués afin de détecter et/ou quantifier plusieurs analytes d'intérêt susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon prélevé. Par analyte, on entend désigner dans la présente description tout composé d'intérêt susceptible de pouvoir être détecté et/ou quantifié selon la présente invention.
De préférence, lesdits analytes sont de type protéique et dérivés, ou sont des acides nucléiques.
Les termes protéine, polypeptide ou peptide sont utilisés indifféremment dans la présente description pour désigner une séquence d'acides aminés ou, pour leurs dérivés, contenant une séquence d'acides aminés.
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel, et sont naturels ou artificiels.
Selon un mode de réalisation particulier, de tels analytes sont des composés organiques, chimiques ou biochimiques, pouvant être présents soit en solution dans un liquide, soit présents à la surface d'une cellule ou d'une particule en suspension dans l'échantillon.
Comme exemple de cellule ou de particule pouvant porter à sa surface ledit analyte on peut citer, mais sans s'y limiter, les cellules eucaryotes telles qu'une cellule de mammifère ou une levure, les cellules procaryotes telles que par exemple une bactérie, et les particules telles que par exemple une particule virale, une spore ou un grain de pollen, ou tout micro-organisme, notamment un champignon.
Un premier mode de réalisation de l'invention concerne l'identification et/ou le dosage multiplex dans un échantillon d'agents biologiques tels que des antigènes liés à des supports, comme les antigènes de surface de microorganismes, les récepteurs et autres structures membranaires, ou des analytes à l'état libre dans l'échantillon, tels que des protéines, enzymes, métabolites, et autres produits de sécrétion.
Comme exemple d'analytes d'intérêt, on peut citer notamment, mais sans s'y limiter, les protéines et leurs dérivés tels que les glycoprotéines ou les lipoprotéines, les acide nucléiques, les hydrates de carbone, les composés de nature lipidique et tous les composés naturels ou pouvant être obtenus par synthèse chimique. On peut également citer comme exemples d'analytes les composés présentant une particularité fonctionnelle tels que les cytokines, les récepteurs cellulaires, les anticoφs, les antigènes, les toxines, les allergènes, les drogues, les pesticides ou herbicides, ou tout polluant, analytes que l'on souhaite détecter et/ou quantifier dans un échantillon, qu'ils soient présents en solution ou le cas échéant portés à la surface d'une cellule ou d'une particule.
De manière particulièrement préférée, lesdits composés sont des toxines protéiques, ou bien ladite cellule ou particule est un microorganisme, tel qu'une bactérie ou un virus. Lorsque les analytes sont présents à la surface d'une cellule ou d'une particule, la détection et/ou la quantification desdits analytes permet la détection et ou la quantification desdites cellules ou particules si lesdits analytes choisis sont spécifiques de ces dites cellules ou particules.
Comme autre exemple d'analytes d'intérêt pouvant être contenus dans un échantillon on peut citer les composés présents dans l'atmosphère, de façon naturelle ou accidentelle, qui peuvent être collectés dans un liquide, tel que par exemple au moyen d'un biocollecteur, qui prélève les particules présentes dans l'atmosphère et les impacte dans un liquide, généralement un tampon tel que du PB S, ou une huile.
Un exemple typique de bio-collecteur est décrit dans la documentation commerciale du BioSampler® de SKC Inc., PA, ainsi que dans les brevets US 5902385 et US 5904752 et dans des publications techniques telles que: Buttner et al. : Sampling and analysis of airborne microorganisms, in Manual of environmental Microbiology,
ASM Press, Wash.DC, 1997, pp. 629-640, Improved aérosol collection by combined impaction and centrifugal motion. Willeke K et al. , Aérosol Sci. Tech., 28:439-456
(1998) US 6468330 Irving et al. On entend par analytes préalablement marqués par un marqueur dans le procédé selon l'invention tout analyte que l'on cherche à détecter et/ou quantifier dans un échantillon et qui se présente sous forme marquée avant la mise en œuvre dudit procédé. Comme exemple d'analytes préalablement marqués on peut citer, mais sans s'y limiter, les acides nucléiques, ou produits PCR (amplicons), qui résultent d'une amplification enzymatique, telle que la PCR (réaction en chaîne à la polmyérase), qui peuvent être obtenus sous une forme marquée, notamment à l'aide de marqueurs fluorescents, ces techniques de marquage d'acides nucléiques étant bien connues de l'homme de l'art.
On entend désigner par microsphères non magnétiques fonctionnalisées dans le procédé selon la présente invention des microsphères non magnétiques portant à leur surface un composé A et un composé B.
Les composés A et B peuvent être fixés sur les microsphères non magnétiques selon des méthodes connues de l'homme de l'art, telles que le couplage par liaison covalente, par affinité, par adsoφtion passive ou forcée. De telles méthodes sont également utilisées pour la fixation du composé à la surface des particules magnétiques du ferrofluide. De tels procédés de fonctionnalisation de divers supports ont été largement décrits dans la littérature, par exemple dans les brevets américains délivrés sous les numéros US 4,181,636 - US 4,264,766 - US 4,419,444 - US 4,775,619, etc. et dans Legastelois S et al., Latex et diagnostic. 1996, ou Le Technoscope . Biofutur, 161 :1-11; Duke Scientific Coφ.. Çatalog, Palo-Alto, CA. Technical Note-013A « Reagent Microspheres-Surface properties and Conjugation Methods ».
Dans le cas d'un couplage par liaison covalente, les microsphères utilisées sont porteuses de groupements chimiques capables de réagir avec un autre groupement chimique porté par le composé A ou B pour former une liaison covalente. Comme exemple de groupements chimiques pouvant être présents à la surface des microsphères on peut citer, mais sans s'y limiter, les groupements carboxyle, amino, aldéhyde et époxy. Dans le cas particulier où les analytes que l'on cherche à caractériser sont des espèces chimiques réactives, un des groupements chimiques portés par les microsphères non magnétiques peut être capable de réagir spécifiquement avec les espèces chimiques réactives desdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier, ledit groupement chimique assurant ainsi également le rôle du composé B.
Pour la fonctionnalisation des microsphères, on peut également utiliser l'interaction par affinité, qui est généralement mise en œuvre par deux partenaires d'un couple de liaison à haute affinité tels que notamment, mais sans s'y limiter, les couples (poly) carbohydrate/lectine, biotine ou composés biotinilés/avidine ou sfreptavidine, récepteur /ligand spécifique, antigène ou haptène/anticoφs, etc...
La fonctionnalisation des microsphères peut également être réalisée soit directement, soit en utilisant des bras espaceurs encore désignés sous les termes "linker" ou "spacer". La fonctionnalisation par adsoφtion passive ou forcée est connue de l'homme de l'art, et a déjà été décrite dans les brevets américains précédemment cités. Pour la fonctionnalisation par adsoφtion passive on pourra utiliser par exemple la BSA-biotine (Bovin Sérum Albumin) (Sigma, Lyon, FR - Réf. A-8549).
Les microsphères non magnétiques fonctionnalisées dans la présente description peuvent être constituées par n'importe quel type de matériau dans la mesure où celui-ci né contient aucun constituant magnétique. On choisira de préférence un matériau inerte aux analytes de l'échantillon et aux autres réactifs d'analyse, insoluble dans l'échantillon et dans tous lés autres milieux réactionnels utilisés dans le procédé selon l'invention et qui peut être fonctionnalisé. Il peut s'agir par exemple d'un polymère, ou d'un copolymère, ou encore de latex, de verre ou de silice.
Dans la mesure où ces microsphères ne sont pas magnétiques, il n'existe aucune contrainte particulière quant au choix du matériau dans lequel elles peuvent être fabriquées. Ainsi, on peut utiliser n'importe quel type de microsphère dans une gamme très large de latex non magnétique. On peut également utiliser des microsphères dans d'autres matériaux, plus ou moins appropriés en fonction des analytes à détecter et/ou à quantifier, qui sont commercialisées dans diverses tailles sous forme non magnétique. Ainsi, le procédé selon l'invention peut par exemple utiliser des microbilles de verre ou de silice, matériaux respectivement utilisés de préférence pour une capture de plaquettes sanguines et d'acides nucléiques (voir notamment la demande internationale publiée sous le numéro WO 94/19600 qui décrit l'utilisation de microbilles de verre pour capturer (et dans ce cas précis éliminer) des plaquettes agrégées activées). On peut citer comme exemples de polymères ou de copolymères, mais sans s'y limiter, le divinylbenzène, le polystyrène, le polyvinylpyridine, les copolymères de styrène-butadiène, les copolymères d'acrylonitrile-butadiène, les polyesters, les copolymères d'acétate-acrylate ester de vinyl, les copolymères de chlorure-acrylate ester de vinyl, les polyéthers, les polyoléfines, les oxydes de polyalkylène, les polyamides, les polyuréthanes, les polysaccharides, les celluloses, et les polyisoprènes. La réticulatiori est utile pour de nombreux polymères afin de donner une intégrité et une rigidité structurales auxdites .microsphères.
Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que les microsphères sont dans un matériau choisi au sein du groupe constitué par le latex, un polymère, un copolymère, le verre ou la silice.
Les microsphères non magnétiques en polymère ou copolymère, en latex, en verre ou en silice sont bien connues de l'homme de l'art et sont disponibles dans le commerce, comme par exemple les gammes de microsphères fournies par les sociétés Spherotech (Libertyville, US), Polysciences (Warrington, US), Merck Eurolab SA (Fontenay-sous-Bois, FR) pour la gamme Estapor, Duke Scientiftc (Palo Alto, US), Seradyn (fridianapolis, US), Dynal Biotech pour Dyno Particles (Oslo, NO), etc. D'autres gammes de microsphères pourront être fournies par Bang's Labs (Fishers, US) et Polymer Laboratories Ltd (Church Stretton, UK).
De même, des procédures d' adsoφtion / désoφtion d'acides nucléiques sur billes de silice sont décrites dans TechNote #302, Bang's Labs (Fishers, US) pour la • capture d'acides nucléiques.
Par ailleurs, grâce à l'étendue du choix du matériau des microsphères utilisables dans le procédé selon la présente invention, il est possible d'utiliser des microsphères qui sédimentent moins, par exemple des billes de latex non magnétiques, et qui sont donc plus faciles à utiliser, en particulier dans les automates. Par composé A, on entend désigner dans la présente description, pour toutes les populations de microsphères, tout composé présent à la surface desdites microsphères non magnétiques fonctionnalisées telles que décrites précédemment, lequel composé est capable de se lier de manière spécifique avec un autre composé fixé à la surface des particules magnétiques d'un ferrofluide, ledit composé A formant le premier membre de la paire de liaison spécifique, et l'autre composé formant le second membre, ledit composé A étant également caractérisé en ce qu'il ne peut pas se lier avec les analytes
On entend désigner par ferrofluide dans la présente description une suspension colloïdale stable de particules magnétiques dans un porteur liquide. Les particules magnétiques, qui ont une taille moyenne environ de 100 Â (10 nm), sont enduites d'un agent de dispersion stabilisant (agent tensio-actif) qui empêche l'agglomération des particules même lorsqu'un gradient de champ magnétique fort est appliqué au ferrofluide. En l'absence d'un champ magnétique, les moments magnétiques des particules sont aléatoirement distribués et le fluide n'a aucune magnétisation nette.
Les particules magnétiques du ferrofluide sont recouvertes en surface par ledit composé formant le second membre de la paire de liaison spécifique avec le composé A à la surface des microparticules. Ainsi, ces particules magnétiques sont capables de venir se fixer à la surface des microsphères grâce à ladite paire de liaison formée, lesdites microsphères étant de cette manière magnétisées.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que ladite paire de liaison formée entre le composé A et le second membre fixé à la surface des ferrofluides, est de préférence choisie au sein du groupe constitué. par les paires de liaison spécifique de type biotine/avidine ou biotine/streptavidine, enzyme/cofacteur, lectine/carbohydrate et anticoφs/haptène.
Comme exemple de ferrofluide, on peut citer notamment, mais sans s'y limiter le FF-SA (ferrofluides-streptavidine) de Molecular Probes Europe (Leiden, NL) (Réf. C- 21476, lot #71 Al-1).
La quantité de matériel aimantable (particules magnétiques du ferrofluide) à mettre sur chaque population de microsphères peut donc être facilement gérée en modifiant la quantité des points d'accroché (formation des paires de liaisons) par population de microbilles. De plus, la sédimentation des ferrofluides est aussi très limitée, ce qui facilite la manipulation et l'homogénéité de prélèvement des suspensions.
L'aimantation des microparticules est réalisée selon un protocole classique à l'aide d'un aimant (Ex. DYNAL MPC).
Par composé B, on entend désigner dans la présente description, pour chacune des populations de microspheres, tout composé présent à la surface des microsphères de l'une des populations, lesquelles microsphères non magnétiques fonctionnalisées sont telles que décrites précédemment, lequel composé est capable de former une liaison spécifique avec l'un des analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier qui sont susceptibles d'être contenus dans l'échantillon. Comme exemple de composé B on peut citer, mais sans toutefois s'y limiter, les protéines ou leurs fragments et structures dérivées, les récepteurs, les anticoφs polyclonaux ou monoclonaux ou leurs fragments, les anticoφs monovalents, les acides nucléiques mono ou double brin et tout fragment ou construction dérivée, ainsi que des associations de plusieurs de ces composants. On peut citer comme exemples de liaison spécifique entre le composé B et un analyte le couplage antigène-anticorps ou ligand- récepteur membranaire, ou une hybridation entre acide nucléiques, la séquence nucléotidique du composé B greffé à la surface des microsphères étant alors complémentaire de celle de l'analyte.
De préférence, le composé B est une protéine ou l'un de ses fragments, capable de reconnaîfre l'un desdits analytes, telle que par exemple un anticoφs polyclonal ou monoclonal ou l'un de ses fragments, dirigé spécifiquement contre l'analyte que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier, ou inversement, le composé B peut être un antigène ou haptène capable de reconnaître un anticoφs que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier, ou encore un ligand spécifique d'un récepteur, un enzyme spécifique d'un cofacteur, ou un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec un acide nucléique que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier . Dans le cas où le composé B ou C est un anticoφs, on pourra se référer, pour la préparation d'anticoφs polyclonaux, monoclonaux, ou leurs fragments, ou encore recombinants, aux techniques bien connues de l'homme de l'art, techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et al. (Kôhler et Milstein. Nature, 256: 495-497, 1975). Des anticoφs spécifiques peuvent être obtenus par exemple à partir de sérum ou de cellule d'un animal immunisé spécifiquement contre des antigènes.
Par fragment d'anticoφs capable de reconnaître spécifiquement des antigènes, on entend désigner en particulier les fragments d'anticoφs comprenant tout fragment dudit anticoφs capable de se fixer spécifiquement sur l'épitope dudit antigène sur lequel se fixe l'anticoφs dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels f agments incluent en particulier des anticoφs simple chaîne (scFv) ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticoφs dont ils sont issus. Ces fragments d'anticoφs peuvent être obtenus à partir des anticoφs polyclonaux ou monoclonaux par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfύres par réduction chimique. D'une autre manière ces anticoφs, ou leurs fragments, pourront également être obtenus par recombinaison génétique (anticoφs recombinants).
Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que ledit composé B est choisi au sein du groupe constitué par les protéines et les acides nucléiques.
Selon un mode particulier de réalisation, le composé B présent à la surface des microsphères de chacune des populations est un anticoφs et les analytes à détecter et/ou à quantifier sont des antigènes. L'étape d) du procédé selon la présente invention est mise en œuvre uniquement dans le cas où lesdits analytes que l'on cherche à identifier et/ou à quantifier n'ont pas été préalablement marqués comme il a été décrit précédemment. Dans ce cas, ladite étape d) est nécessaire pour la réalisation de l'étape postérieure e) de détection et/ou de quantification. Elle fait intervenir une solution comprenant au moins un conjugué capable de se lier spécifiquement à l'un desdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier dans l'échantillon.
Ledit conjugué du procédé selon la présente invention comprend un composé C capable de reconnaîfre et de se lier spécifiquement avec l'un desdits analytes, et un marqueur qui lui est associé.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le composé C dudit conjugué utilisé à l'étape d) est un composé choisi au sein du groupe constitué par les protéines et les acides nucléiques, lorsque lesdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier dans l'échantillon sont respectivement des protéines ou des acides nucléiques.
Lorsque l'étape d) du procédé selon l'invention est mise en œuvre, celle-ci est suivie de préférence d'au moins une étape de lavage par séparation magnétique, laquelle étape est nécessaire pour séparer les microsphères magnétisées marquées de celles portant à leur surface uniquement lesdits analytes. L'étape e) du procédé selon la présente invention peut être réalisée selon toute méthode automatisée électronique ou optique de détection et de comptage de particules. La cytométrie de flux est particulièrement adaptée pour ce type d'analyse.
Cette méthode, largement utilisée aujourd'hui, permet de réaliser des mesures d'intensité lumineuse d'une très grande sensibilité sur des microsphères en suspension dans un milieu réactionnel. Ces mesures sont faites individuellement sur chaque microsphère, à haute cadence (plusieurs centaines à plusieurs milliers de microspheres analysées / interrogées par seconde), ce qui permet en quelques dizaines de secondes de réaliser ces mesures sur un grand nombre de microsphères. Plusieurs paramètres de lumière sont mesurables simultanément sur chacune des microspheres : i) des paramètres de diffusion / diffraction de lumière laser pour en caractériser/évaluer la taille et la structure (granularité, compacité) d'une part et ii) d'autre part plusieurs paramètres de fluorescence, différentiables par leurs longueurs d'onde et généralement associés à la présence de fluorochromes, ou marqueurs fluorescents, présents intrinsèquement dans la microsphère, ou associés à la fixation spécifique de conjugués. En pratique, la cytométrie en flux (CMF) consiste à faire défiler une à une devant un rayon laser focalisé les microsphères en suspension dans un liquide, et de mesurer, sur chaque microsphère, individuellement, d'une part la diffusion / diffraction de lumière laser et d'autre part les signaux de fluorescence associés. Toutes ces informations sont présentées à l'utilisateur sous forme de distributions de fréquences (histogrammes) dans lesquelles ce dernier repère aisément des sous-populations homogènes sur un ou plusieurs des paramètres considérés (par exemple la taille ou une fluorescence). Un (ou plusieurs), paramètre(s) de fluorescence peu(ven)t servir, en plus des paramètres de taille/structure, au regroupement des individus appartenant à un même type de microsphères (dosage multiplex). Un (ou plusieurs) autre(s) paramètre(s) de fluorescence peu(ven)t servir de révélateur, dont l'intensité est directement proportionnelle à la quantité d'analytes présent sur le type de microsphère considéré .
Un exemple de cytométrie de flux qui peut être utilisée à l'étape e) est la technique FACS (flluorescence-activated cell sorter), qui consiste en un système électronique pour séparer les microsphères selon leur taille et l'intensité de la fluorescence qu'elles émettent après divers marquages. L'appareil prépare des microgouttes de la suspension de microsphères qui sont diluées de façon à ne contenir qu'une seule microsphère. La microgoutte passe devant un faisceau lumineux à rayon laser et les microsphères sont analysées (histogramme) et séparées sur la base de leur fluorescence et/ou de leur taille. Parmi les marqueurs pouvant être utilisés pour le marquage du composé C ou pour le marquage desdits analytes que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier dans l'échantillon, on préfère les marqueurs fluorescents tels que notamment, mais sans s'y limiter, la fluorescéine et ses dérivés, tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), ou encore l'allophycocyanine (APC), la phycoérythrine-cyanine 5 (PC5) et la phycoéryfrrine (PE), la R-phycoérythrine (R-PE), ou encore la rhoda ine et ses dérivés, la coumarine et ses dérivés, la luciférase et ses dérivés, la chromomycine, la mithramycine, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), la eGFP (eGFP pour « Enhanced Green Fluorescent Protein »), la RFP (RFP pour « Red Fluorescent Protein »), la BFP (BFP pour « Blue Fluorescent Protein »), la eBFP (eBFP pour « Enhanced Blue Fluorescent Protein »), la YFP (YFP pour « Yellow Fluorescent Protein »), la eYFP (eYFP pour « Enhanced Yellow Fluorescent Protein ») le dansyl, l'umbelliférone, le bromure d'éthydium, l'acridine orange, le thiazole orange, le iodure de propidium (PI) etc.
Ainsi, de manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le ou les marqueurs utilisés sont fluorescents.
De manière plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la détection et/ou la quantification dudit marqueur à l'étape e) du procédé est réalisée par cytométrie de flux.
Les techniques permettant de coupler ces marqueurs sont bien connues de l'homme du métier et ne seront pas développées dans la présente description. Néanmoins, pour certains analytes, on peut trouver dans le commerce des conjugués comprenant de tels marqueurs fluorescents dirigés contre l'analyte que l'on cherche à détecter et/ou à quantifier.
Dans un tel procédé de détection et/ou de quantification multiplex de plusieurs analytes, on préfère utiliser une gamme de. marqueurs pouvant être détectés et/ou quantifiés simultanément de manière spécifique, de préférence des marqueurs fluorescents. De manière particulièrement préférée, on utilisera la cytométrie de flux pour la détection et/ou la quantification directe et simultanée de ladite gamme de marqueurs fluorescents
Ainsi, la suspension de populations de microsphères pourra comprendre une première population ni dont les microsphères la composant auront chacune le composé Bi fixé à leur surface, une deuxième population n dont les microsphères la composant auront chacune le composé B fixé à leur surface, une troisième population n3 dont les microsphères la composant auront chacune le composé B3 fixé à leur surface, et ainsi de suite. Ainsi, l'analyte-. sera reconnu par le composé B-., l'analyte2 sera reconnu par le composé B , Panalyte3 sera reconnu par le composé B3, et ainsi de suite. Selon un mode particulier de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que deux au moins desdites populations possèdent en outre au moins une caractéristique physique intrinsèque permettant de les différencier entre elles. L'homme du métier peut disposer de populations de microsphères présentant des caractéristiques physiques intrinsèques permettant de les différencier les unes des autres, permettant ainsi d'augmenter le nombre d'analytes différents à détecter et/ou à quantifier dans un échantillon, lesdites caractéristiques physiques intrinsèques pouvant être différentiables par leur taille et/ou leurs propriétés optiques (fluorescence spécifique pour chaque population).
Ainsi, de manière préférée, la caractéristique physique intrinsèque des microsphères du procédé selon la présente invention permettant de différencier les au moins deux populations de microsphères est la taille et/ou une propriété optique desdites microsphères.
De manière plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les microsphères ont une taille comprise entre 0,3 et 100 μm.
De manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les microspheres ont une taille comprise entre 1 et 20 μm. Ces gammes de taille correspondent le mieux au domaine d'analyse de taille des cytomètres en flux courants. Dans ces gammes de diamètres et à condition de ne pas poser de contraintes supplémentaires trop rigides (magnétisme, fluorescence), il est facile de trouver des billes distinguables les unes des autres par leur seul paramètre de taille, mesuré par le paramètre nommé forward light scatter (FS ou FLS), pour former plusieurs groupes distincts (ex. 1, 3, 5 ; 8 ; 10 et 15 μm). Certains de ces diamètres sont aussi disponibles en version fluorescente, voire avec plusieurs niveaux d'intensité différentiables.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la propriété optique est la longueur d'onde d'émission et/ou l'intensité de la fluorescence desdites microsphères.
Ainsi, il est possible de différencier les n populations de microsphères de ladite suspension entre elles.
Ainsi par exemple, les gammes QuanfrimPlex™ fournies par Bang's Labs
(Fishers, US) et CytoPlex™ fournies par Duke Scientifiç (Palo Alto, US) permettent , d'accéder, pour une taille donnée, à des sous-familles de billes différentiables par leur niveaux d'intensité en fluorescence rouge, jusqu'à 10 niveaux pour des billes de 4 μm
(CytoPlex) ou 2 x 5 niveaux pour des billes de 4.4 et 5.5 μm (QuantumPlex). En supposant disponibles les billes ad hoc dans les diamètres sus-cités et avec chacune 5 niveaux d'intensité de fluorescence rouge, la détection multiplex possible selon l'invention s'élève à 6 x 5 = 30 analytes.
Avantageusement, le procédé selon l'invention permet la détection et/ou la quantification rapide d'au moins 6 analytes différents.
La spécificité requise pour les populations de conjugués utilisés est fonction de la complexité de l'étape e) de détection et/ou de quantification, du type et du nombre d'analytes recherchés. Il est ainsi possible de n'utiliser qu'une seule population de conjugué comprenant un seul type de marqueur, ledit conjugué ayant alors une fonction de révélateur ubiquitaire. Dans ce cas, la spécificité est apportée uniquement par la sélectivité de chaque bille de capture. Inversement, il est également possible d'utiliser autant de populations de conjugués différentes que d'analytes à doser. En fonction du test à réaliser, l'homme du métier pourra bien entendu choisir les alternatives convenables entre ces deux variantes extrêmes.
Selon un mode de . réalisation avantageux le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que lesdits analytes sont des acides nucléiques et en ce qu'à l'étape a), le composé B est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes De manière préférée, lesdits analytes sont des produits PCR.
De manière plus préférée, lesdits produits PCR sont obtenus marqués. De tels produits PCR, le cas échéant marqués, ont été décrits précédemment. Les microsphères non magnétiques fonctionnalisées utilisées dans ce mode de réalisation portent à leur surface un composé B de type oligonucléotide, lequel composé B est complémentaire de l'un des produits d'amplification recherchés. Lorsque les produits sont préalablement marqués, l'étape d) de mise en présence des microsphères magnétisées avec des conjugués n'est pas nécessaire. Le marquage à la surface des microsphères est fourni par le marqueur porté par les produits PCR que les microsphères ont capturé.
De manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le composé C dudit conjugué utilisé à l'étape d) est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes. Un tel type de conjugué pourra être utilisé par exemple pour détecter et/ou quantifier plusieurs analytes tels que notamment du matériel génomique non préalablement amplifié, ou des dérivés non préalablement amplifiés, tels que des fragments générés par clivage enzymatique à l'aide d'enzymes de restriction de ce matériel génomique.
L'étape d'amplification du signal peut être alors assurée par l'étape de ligation (ou ligature) entre le composé B des microsphères et le composé C des conjugués.
Ainsi, l'invention a également pour objet l'utilisation du procédé selon l'invention pour la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs (Single Nucleotide Polymoφhisms).
Dans ce cas, la méthode de l'invention est de préférence utilisée en association avec la technique OLA pour « Oligonucléotide Ligation Assay » (test de ligation d'oligonucléotides) basée sur l'action d'une ligase qui ne relie deux oligonuléotides adjacents d'une façon covalente qu'à la condition qu'ils soient parfaitement complémentaires du brin d'ADN matrice (Landegren et al Proc. Natl. Acad. Sci. US 1990;87:8923-8927; brevetUS4988617). Comme indiqué précédemment, le brin d'ADN matrice peut être soit un amplicon (fragment amplifié par PCR/Polymerase Chain Reaction ou autre réaction d'amplification enzymatique), soit du matériel génomique non préalablement amplifié ou ses dérivés non préalablement amplifiés par exemple des fragments générés par clivage enzymatique à l'aide d'enzymes de restriction de ce matériel génomique.
Ainsi, de manière préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs est réalisée par la méthode OLA.
Dans cette variante, le conjugué au sens de la définition générale ci-dessus est une sonde de révélation (composé C) portant un marqueur fluorescent. L'étape de ligation constitue une étape supplémentaire entre l'étape d) et l'étape e) dudit procédé.
Le protocole décrit ci-après et schématisé sur la figure 1 illustre le principe général de l'invention. Ce mode de réalisation porte sur la détection de trois antigènes différents. Bien entendu, sur cette base, de nombreuses variantes pourront être envisagées par l'homme de l'art, selon la nature et le nombre d'analytes différents à détecter et ou à quantifier, la sensibilité du test, la vitesse de réalisation, le matériel utilisé, etc. Ces variantes peuvent par exemple concerner le nombre et/ou la taille et/ou les propriétés optiques des microsphères fonctionnalisées, le nombre de ligands spécifiques de l'analyte recherché fixé à leur surface (composés B), l'étape d'aimantation qui peut être répétée plusieurs fois en alternance avec des lavages successifs, la nature du marqueur lié au conjugué qui peut être le même pour tous les conjugués du mélange ou être différent selon la spécificité des conjugués, etc.
Des populations de microsphères fonctionnalisées sont mises en présence de l'échantillon que l'on veut tester. Par mesure de simplification et de clarté, on considère dans ce descriptif que l'on dispose de trois populations de microsphères de latex (trois analytes à détecter et/ou à quantifier) de tailles différentes. Chacune des populations porte à sa surface un composé B qui est un anticoφs de capture spécifique de l'un des trois analytes recherchés. Dans cette illustration, on considère également que les composés A sont des molécules de biotine qui sont greffées à la surface des microsphères pour permettre la fixation des particules magnétiques du ferrofluide par l'intermédiaire d'une liaison biotine-sfreptavidine. Lorsque les microspheres sont mélangées à l'échantillon, chacun des analytes recherchés va se lier à la population portant l'anticoφs spécifique. Les particules magnétiques du ferrofluide couplés à de la sfreptavidine sont alors ajoutés au milieu et vont se fixer à la surface des microsphères. Les microsphères rendues ainsi magnétisables peuvent être séparées des autres produits interférents du milieu par une ou plusieurs étapes d'aimantation en alternance avec une ou plusieurs étapes de lavage avec un tampon approprié.
Les populations de microsphères sont ensuite mises en présence d'un mélange de trois types de conjugués, chaque type de conjugué étant représenté dans ce schéma par un composé C qui est un anticoφs spécifique portant un marqueur fluorescent. Après une phase d'incubation des microsphères avec la solution de conjugués suffisante pour permettre la fixation desdits conjugués sur leur analyte spécifique, lui- même retenu à la surface des microsphères, les microsphères associées au fluorochrome, peuvent être analysées. Dans le cas présent, celles-ci sont analysées en cytométrie de flux en fonction de leur taille. Les conjugués sont généralement utilisés en excès de façon à s'assurer un marquage optimal des analytes fixés sur les microsphères. De ce fait, avant de procéder à l'analyse des microsphères, il est préférable d'isoler celles-ci du milieu contenant des conjugués en excès restés en suspension. Cette séparation est avantageusement réalisée à nouveau par une ou plusieurs série(s) d'aimantation et de lavage(s).
Comme cela a déjà été indiqué, une variante avantageuse du procédé selon l'invention vise la détection et/ou la quantification de n acides nucléiques. Dans sa réalisation la plus simple, cette variante se déroule selon le protocole ci-après, schématisé dans la figure 2.
Dans ce cas, l'analyse porte sur trois produits de PCR fluorescents à l'aide de billes de tailles différentes. Chacune des populations de microsphères fonctionnalisées est recouverte par un composé B qui est un oligonucléotide complémentaire de l'un des produits de PCR (sonde de capture) et non plus par un anticoφs spécifique. Les- étapes de mélange et d'aimantation des microspheres sont identiques à celles décrites dans le mode de réalisation précédent. Après les étapes d'aimantation et de lavage,, les microsphères ayant capturé des produits fluorescents à leur surface sont analysées en cytométrie de flux.
La présente invention a également pour objet un kit pour la détection et/ou la quantification multiplex d'analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend une suspension de populations de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microsphères portant à leur surface : a) un réactif 1 comprenant une:
- un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison ;
- un composé B capable de former une liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, et b) un réactif 2 comprenant un ferrofluide qui contient des particules magnétiques portant à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec ledit composé A ; et c) un réactif 3 comprenant une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de réagir spécifiquement avec lesdits analytes et un marqueur capable d'être détecté. De manière encore préférée, le kit selon l'invention comprend en outre :
- un réactif 4 comprenant lesdits analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon. De manière encore plus préférée, le kit selon l'invention comprend en outre :
- un réactif 5 composé d'un tampon de dilution ; et
- un réactif 6 composé d'un tampon de lavage.
Enfin, selon un autre mode de réalisation encore plus préféré, le kit selon l'invention comprend en outre :
- un réactif 7 comprenant un tampon de neutralisation de l'agrégation des différentes microsphères.
Lesdits tampons sont par exemple des tampons à base de PBS, tels que par exemple le PBS/Tween 20. Le réactif 7 sera plus particulièrement utilisé dans le cas ou le composé A à la surface des microsphères est un composé de type biotine. Ledit tampon de neutralisation permet d'éviter une agrégation des différentes microsphères recouvertes de composé A lors de l'aimantation. Dans ce cas où il s'agit de microsphères biotinylées, le tampon de neutralisation est par exemple constitué d'une solution aqueuse de biotine. Comme cela a déjà été indiqué, et ainsi qu'il en ressortira à la lecture des exemples ci-après, la méthode de l'invention permet de réaliser en des temps relativement rapides l'identification simultanée de plusieurs agents dans un échantillon.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Schéma du principe du procédé de détection et/ou de quantification (dosage multiplex) selon l'invention appliqué à la détection et ou la quantification de trois antigènes à l'aide de billes de tailles différentes.
Figure 2 : Schéma du principe du procédé selon l'invention appliqué au dosage multiplex de trois produits de PCR fluorescents à l'aide de billes de tailles différentes. Figure 3 : Schéma du principe du procédé de dosage multiplex selon l'invention appliqué - à la génétique moléculaire pour la recherche de SNPs. Figure 4 : Schéma illustrant le même principe que le précédent, dans lequel un degré de spécificité supplémentaire est obtenu au niveau du greffage de la sonde de révélation. Figures 5 A, 5B, 5C : Analyse en CMF d'un mélange de billes de 3 - 8 -10 et 15 μm en fonction de la taille.
RI : Estapor 3 μm + Polymer Laboratories 8 et 15 μm + Dynal Particles 10 μm ;
R2 et R6 : Estapor 3 μm ; R3 et R7 : Polymer Laboratories 8 μm ; R4 et R8 : Dynal Particles 10 μm ; R5 et R9 : Polymer Laboratories 15 μm
Figures 6 A, 6B, 6C et 6D : Analyse en CMF d'un mélange de billes de 3 - 4,4 - 8 -10 et 15 μm en fonction de la taille et d'une fluorescence.
RI : Estapor 3 μm + Bangs QuantumPlex 4,4 μm + Polymer Laboratories 8 et 15 μm +
Dynal Particles 10 μm ; R2 et 6 : Estapor 3 μm + Bangs QuantumPlex 4,4 μm ; R3 et R7 : Polymer Laboratories 8 μm ;
R4 et R8 : Dynal Particles 10 μm ; R5 et R9 : Polymer Laboratories 15 μm ; RIO :
Estapor 3 μm ; Rl l : Bangs QuantumPlex #3 ; R12 : Bangs QuantumPle #5 (RIO, RI 1 et R12 sont contenues à l'intérieur de R2).
Figures 7A et 7B : Analyse en CMF d'un mélange de billes de 4,4 - 8 -10 et 15 μm initialement non magnétiques.
Figure 8 : Evolution de la distribution en FS LOG des différentes populations de billes- biotine lors de la fixation des FF-SA.
Figure 9 : Dosage de B. globigii sur microsphère 15μm anti- B. globigii.
Figures 10A et 10B : Dosage d'Ovalbumine sur microsphère 4,4 μm QuantumPlex #3 anti-ovalbumine.
Figure 11 : Analyse CMF sur mélange duplex:
Les 2 types de billes sont distingués par leur taille en analyse double scatter , μS-FN
(diamètre 6,7 μm), conditionnées sur la région RI) et μS-FII (diamètre 9,6 μm), conditionnées sur la région R2. Cette analyse sélective basée sur la taille est répétée dans toutes les figures qui suivent.
Figures 12 et 13 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test doublement positif :
Les billes sont mises en présence des deux O.Ν. représentant les 2 gènes simultanément.
La Fig 12 montre les niveaux de fluorescence en fonction de la taille, μS-FN (région
R4) et μS-FII (région R3). La Fig 13 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS-FN et courbe vide pour la bille μS-FII. Les intensités moyennes de fluorescence verte (MFI) sont mesurées dans chacune des fenêtres Ml et M2. Figures 14 et 15 : Analyse CMF sur mélange duplex ; contrôle négatif : Les billes mises en présence des deux O.N. simultanément sont déshybridées par la chaleur, montrant le marquage de bruit de fond non spécifique. La Fig 14 montre les niveaux de fluorescence en fonction de la taille, μS-FN (région R4) et μS-FII (région R3). La Fig 15 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS-FN et courbe vide pour la bille μS-FII. Les MFI sont mesurées dans chacune des fenêtres Ml et M2. Figures 16 et 17 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test simple positif pour FN: Les billes sont mises en présence d'un seul O.Ν., correspondant au FN . La Fig 16 montre les niveaux de fluorescence en fonction de la taille, μS-FN (région R4) et μS- FII (région R3). La Fig 17 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS-FN et courbe vide pour la bille μS-FII. Les MFI sont mesurées dans chacune des fenêtres Ml et M2. Figures 18 et 19 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test simple positif pour Fil: Les billes sont mises en présence d'un seul O.Ν., correspondant au Fil . La Fig 18 montre les niveaux de fluorescence en fonction de la taille, μS-FN (région R4) et μS-FII (région R3). La Fig 19 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS-FN et courbe vide pour la bille μS-FII. Les MFI sont mesurées dans chacune des fenêtres Ml et M2.
Figure 20 : La base critique (spécificité de SΝP) est portée par chacune des sondes de révélation, spécifiques d'allèle et porteuses chacune d'un fluorochrome différent (ou d'un haptène/tag qui peut être révélé par un AcM anti-tag fluorescent). Ce système tire profit d'analyses multi-couleur réalisables en CMF. Chaque type de bille permet la détection différentielle d'une mutation.
Figure 21 : La base critique (spécificité de SΝP) est portée par chacune des sondes de capture, spécifiques d'allèle, et couplée chacune à un type de bille différent (différenciés par exemple par la taille). Ce système ne réclame, pour l'analyse du signal en CMF, qu'une seule fluorescence permettant soit d'utiliser un appareillage plus simple et moins coûteux, soit de tirer parti d'autres couleurs pour différencier les familles de billes entre elles, dans des analyses multi-couleurs. Figure 22 : Analyse CMF sur mélange duplex :
Les 2 types de billes sont distingués par leur taille en analyse double scatter , μS-FNwt (diamètre 6,7 μm, conditionnées sur la région RI) et μS-FNmut (diamètre 9,6 μm, conditionnées sur la région R2). Cette analyse sélective basée sur la taille (FS) et la granulosité (S S) estrépétée dans toutes les figures qui suivent.
Figures 23 et 24 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un contrôle négatif : Les billes sont mises en présence d'amplicons non spécifiques de la mutation étudiée qui servent de contrôle négatif en présence du mélange de PCR « Ampli-Mix ». La Fig 23 montre les niveaux de fluorescence en fonction de la taille, μS-FNwt (région R4) et μS-FNmut (région R3). La Fig 24 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS- FNwt et courbe vide pour la bille μS-Fvmut. Les intensités moyennes de fluorescence (MFI), mesurées dans les fenêtres Ml et M2, sont indiquées pour chaque type de billes. Figures 25 à 28 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test simple positif sur allèle sauvage :
Les billes sont mises en présence d'amplicons d'un seul allèle (FNwt). La Fig 25 montre les niveaux de fluorescence en fonction de la taille, μS-FNwt (région R4) et μS- FN ut (région R3). La Fig 26 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS- FNwt et courbe vide pour la bille μS-Fvmut.
La Fig 27 montre, sur μS-FNwt, les histogrammes du test (courbe à droite) et du BF (courbe à gauche, reprise de Fig 24).
La Fig 28 montre, sur μS-FNmut les histogrammes du test (courbe à droite) et du BF (courbe à gauche, reprise de Fig 24). Figures 29 à 32 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test simple positif sur allèle mutant :
Les billes sont mises en présence d'amplicons d'un seul allèle, ici le FN mut . La Fig 29 montre les niveaux de fluorescence en fonction de la taille, μS-FNwt (région R4) et μS- FNmut (région R3). La Fig 30 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS- FNwt et courbe vide pour la bille μS-Fvmut. La Fig 31 montre, sur μS-FNwt, les histogrammes du test (courbe à droite) et du BF
(courbe à gauche, reprise de Fig 24).
La Fig 32 montre, sur μS-FNmut les histogrammes du test (courbe à droite) et du BF
(courbe à gauche, reprise de Fig 24). Figures 33 à 36 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test double positif :
Les billes sont mises en présence d'amplicons des deux allèles simultanément. La Fig
33 montre les niveaux. de fluorescence en fonction de la taille, μS-FNwt (région R4) et μS-FNmut (région R3). La Fig 34 montre, en supeφosition, les histogrammes de fluorescence verte respectifs de chaque type de billes, courbe pleine pour la bille μS- FNwt et courbe vide pour la bille μS-FNmut.
La Fig 35 montre, sur μS-FNwt, les histogrammes du test (courbe à droite) et du BF
(courbe à gauche, reprise de Fig 24).
La Fig 36 montre, sur μS-FNmut les histogrammes du test (courbe à droite) et du BF
(courbe à gauche, reprise de Fig 24) Figure 37 :
Dans la Fig. 37, comme dans la figure 21, la base critique (spécificité de SΝP) est portée par chacune des sondes, de capture, spécifiques d'allèle, et couplée chacune à un type de bille différent (différenciés par la taille). Ce système ne réclame, pour l'analyse du signal en CMF, qu'une analyse par comptage des billes sur la base des paramètres de taille et de structure, permettant soit d'utiliser un appareillage dépourvu d'un détecteur de fluorescence et donc moins coûteux, soit de tirer parti d'autres tailles pour différencier les familles de billes entre elles.
Figure 38 : Analyse CMF sur mélange duplex :
Les 2 types de billes sont distingués par leur taille en analyse double scatter, μS-FNwt (diamètre 6,7 μm, conditionnées sur la région RI) et μS-FNmut (diamètre 9,6 μm, conditionnées sur la région R2). Cette analyse sélective basée sur la taille (FS) et la granulosité (SS) est répétée dans toutes les figures qui suivent.
Figures 39 et 40 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un contrôle négatif :
Les billes sont mises en présence d'amplicons non spécifiques de la mutation étudiée qui servent de contrôle négatif en présence du mélange de PCR « Ampli-Mix ». La Fig
39 montre les niveaux du nombre de μS en fonction de la taille, μS-FNwt (région RI) et μS-FNmut (région R2). La Fig 40 montre, en supeφosition, les histogrammes du nombre de μS respectifs de chaque type de billes. Les nombre de μS, mesurées dans les fenêtres Ml et M2, sont indiquées pour chaque type de billes.
Figures 41 et 42 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test simple positif sur allèle sauvage : Les billes sont mises en présence d'amplicons d'un seul allèle (FNwt). La Fig 41 montre les niveaux du nombre de μS en fonction de la taille, μS-FNwt (région RI) et μS-FNmut (région R2). La Fig 42 montre, en supeφosition, les histogrammes du nombre de μS respectifs de chaque type de billes. Les nombre de μS, mesurées dans les fenêtres Ml et M2, sont indiquées pour chaque type de billes. Figures 43 et 44 : Analyse CMF sur mélange duplex d'un test simple positif sur allèle mutant :
Les billes sont mises en présence d'amplicons d'un seul allèle, ici le FNmut. La Fig 43 montre les niveaux du nombre de μS en fonction de la taille, μS-FNwt (région RI) et μS-FNmut (région R2). La Fig 44 montre, en supeφosition, les histogrammes du nombre de μS respectifs de chaque type de billes. Les nombre de μS, mesurées dans les fenêtres Ml et M2, sont indiquées pour chaque type de billes.
EXEMPLES
Exemple 1 : Reconnaissance de familles de microsphères (μS) en fonction de la taille par CMF
Les microsphères listées ci-dessous ont été mélangées dans des proportions similaires et le mélange analysé sur un cytomètre en flux de type EPICS XL (Coulter) (Figure 5). • L'analyse par cytométrie en flux d'un mélange de 6 populations de billes de tailles 2 - 3,1 - 6 - 7,6 - 10,2 et 15,1 μm a montré que les singlets des différentes populations de billes étaient différentiables en analyse double scatter. Les paramètres sont mesurés après amplification logarithmique (FS log/SS log) (FS pour Forward light Scatter ; S S pour Side light Scatter). Liste des 6 populations de microspheres utilisées
Figure imgf000031_0001
• L'analyse par cytométrie en flux d'un mélange de 4 populations de billes de tailles approximatives 3, 8, 10 et 15 μm a montré que les singlets des différentes populations de billes étaient aisément différentiables en FS log/SS log et que les multiplets éventuels ne représentaient pas une gêne.
Liste des 4 populations de microsphères utilisées
Figure imgf000032_0001
Voir figures 5 A à 5C
Exemple 2 : Différenciation de multiples (6) familles de microsphères par CMF en fonction combinée de la taille et d'une fluorescence
Des microsphères de 4,4 μm porteuses d'une fluorescence rouge (mesurée sur le détecteur FL4 ont été ajoutées au mélange de l'exemple 1. La combinaison, au mélange précédemment décrit, de microsphères de 4,4 μm permet la reconnaissance de 2 familles supplémentaires ; la différence de scatter axial (log FS) entre les microsphères de 3 μm et celles de 4,4 μm reste trop faible pour une discrimination facile (cf. Fig 5 A et B). L'apport de la FL4 en paramètre associé permet une discrimination complète des microsphères de 4,4 μm vis-à-vis de toutes les autres (3 μm en particulier) et pour les 2 groupes de microsphères 4,4 μm entre eux (Figure 6).
Exemple 3 : Fonctionnalisation de microsphères 8, 10 et 15 μm par adsorption passive
Purification des IgG:
Des séru s polyclonaux de lapins immunisés contre les bactéries modèles B. globigii, B. pseudomallei ou Y. pestis ou contre les antigènes solùbles modèles ovalbumine (ONA) et chaîne A de la ricine (Ricine) ont été générés. Les jLmmunoglobulines G (IgG) de lapin ont été purifiées par chromatographie d'affinité sur protéine G.
En bref, 50 ml de sérum dilué ont été déposés sur une colonne contenant 5 ml de protéine G Sepharose 4 fast flow (Pharmacia) préalablement équilibrée en tampon
Νa2HPO4 pH=7. Les IgG accrochées ont ensuite été éluées en tampon Glycine/HCl 0,1
M pH=2,7 puis immédiatement neutralisées par du tampon Tris/HCl pH=9.
Les éluats ont été dialyses contre du tampon PBS 150 mM pH=7,2 à 4°C puis concentrés par osmose inverse. Les concentrations en IgG ont été estimées par lecture d'absorbance à 280 nm (εo,ι% à 280 nm = 1,41).
Préparation des billes 8. 10 et 15 μm :
1 ml de billes de latex à 10% de solide (soit 100 mg de latex) de diamètres 8 μm
(Polymer Laboratories), 10 μm (Dynal Particles) ou 15 μm (Polymer Laboratories), ont été centrifugés 10 mn à 500 g. Après élimination de 600 μl de surnageant, 2 ml de tampon PBS/Triton X-100 0,25%/NaN3 0,09% (PBS/Triton) ont été ajoutés. Les billes ont été incubées 10 mn à température ambiante, lavées par 2,4 ml de tampon PBS puis remises en suspension dans un volume final de 6 ml de ce même tampon et placées à
4°C pendant 30 mn.
Préparation des anticoφs (Ac) : Les Ac ont été dilués en tampon PBS à une concentration de 200 μg/ml dans un volume de 1 ml et placés à 4°C pendant 30 mn. Deux tubes contenant 1 ml de PBS 150 mM / BSA 0,1 %/ NaN3 0,09 % (PBS/BSA) ont également été prévus afin d'obtenir des billes non chargées.
La BSA-biotine (Sigma, Réf. A-8549) a été diluée en tampon PBS à 500 μg/ml dans un volume de 1 ml et placée à 4°C pendant 30 mn.
Charge des billes :
1 ml de billes (8, 10 ou 15 μm) a été ajouté aux différentes solutions d'anticoφs maintenues sous forte agitation (vortex). Les différents mélanges ont alors été placés 12 heures à 4°C sous agitation rotative. Après cette incubation, les mélanges ont été centrifugés 10 mn à 500 g. Après élunination du surnageant, les billes chargées ont été biotinylées par une incubation de 3 heures à 4°C dans 2 ml de BSA-biotine à 500 μg/ml.
Après élimination du surnageant, les billes chargées ont été saturées par une incubation de 2 heures dans 2 ml de tampon PBS/BSA 2 %. Deux lavages en tampon PBS ont été réalisés avant de reprendre les billes par.1 ml de PBS/BA. Les suspensions obtenues ont été numérées et leurs concentrations ajustées à 2,5.104/μl.
Exemple 4 : Fonctionnalisation de microsphères 4,4 μm par couplage covalent
Les Ac anti-ONA et anti-Ricine ont été couplés de manière covalente après activation des billes -COOH (protocole adapté de la procédure Bang's Labs, Réf. TechΝote #205 : "Covalent Coupling"). Le carbo-diimide utilisé pour l'activation des billes est le l-é1nyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide-HCl (EDC, Pierce - Brebières, FR - , Réf. 1853160). Préparation des Ac :
Les IgG anti ONA (respectivement anti Ricine) ont été diluées en tampon PBS à une concentration de 200 μg/ml dans un volume de 1 ml. Activation des billes': 1 ml de billes de latex Bang's Labs QuantumPlex #5 et #3, diamètre 4,4 μm, ont été centrifugées 10 mn à 1900 g. Après élimination du surnageant, 2 ml de tampon MES 0,1 M pH=5,5 ont été ajoutés. Après répétition de cette opération, 500 μl de tampon MES 0,1 M/EDC 10 mg/ml pH=5,5 ont été ajoutés. Les mélanges ainsi obtenus ont été mis sous agitation rotative pendant 15 mn, lavés deux fois par 2 ml de tampon PBS puis repris dans un volume de 1 ml de ce même tampon. Couplage des Ac aux billes :
1 ml de billes QuantumPlex #5 a été ajouté à la solution d'IgG anti Ricine maintenue sous forte agitation (vortex). La même opération a été réalisée en mélangeant les billes QuantumPlex #3 à la solution d'IgG anti ONA précédemment préparée. Les différents mélanges ont alors été placés 4h à température ambiante sous agitation rotative. Biotinylation des billes :
Les mélanges ont été centrifugés 10 mn à 1900 g. Après élimination du surnageant, les billes chargées ont été biotinylées par une incubation d'une nuit à 4°C dans 2 ml de PBS/BSA-biotine O,05 %/Glycine 30 mM.
La charge des billes à la biotine a été vérifiée par la suite en CMF après marquage par de la Streptavidine-PE (Sigma, Réf. S-3402). Saturation des billes :
Suite à cette incubation, les billes ont été centrifugées 10 mn à 1900 g. Après élimination du surnageant, les billes chargées ont été saturées par une incubation de 30 mn dans 2 ml de tampon PBS/BSA 2 %. Un lavage en tampon PBS a été réalisé avant de reprendre les billes par 1 ml de PBS/BA. Les suspensions obtenues ont été numérées et leurs concentrations ajustées à 2,5.104 billes/μl.
Exemple 5 : Isolement magnétique et reconnaissance différentielle de microspheres 4,4 μm, 8, 10 et 15 μm initialement non magnétiques. l. But
• Démontrer la possibilité d'isoler par aimantation des billes de latex, non magnétiques initialement, mais qui le deviennent lors de la fixation des particules magnétiques d'un ferrofluide par l'intermédiaire d'une liaison streptavidine/biotine. • Montrer que cette fixation n'entraîne pas de recouvrement des différentes catégories de billes en FS LOG/SS LOG.
• Montrer que les rendements de récupération des billes sont suffisamment importants pour permettre une analyse cytométrique.
2. Matériel - Mélange de billes fonctionnalisées (5000 billes/μl de chaque spécificité) composé de :
Billes 4,4 μm QuantumPlex # 3 / Ac anti-ONA/ BSA-biotine (lot # 682).
Billes 4,4 μm QuantumPlex # 5 / Ac anti-Ricine/ BSA-biotine (lot #
681).
Billes 8 μm Polymer Laboratories / Ac anti Y. pestis I BSA-biotine (lot # 041).
Billes 10 μm Dyno /Ac anti B. pseudomallei I BSA-biotine (lot # 042).
Billes 15 μm Polymer Laboratories / Ac anti B. globigii I BSA-biotine
(lot # 043).
- Ferrofluides-streptavidine (FF-SA) Molecular Probes (Réf. C-21476) à 0,5 mg Fe/ml (lot #71 Al -1).
- d-biotine à 200 μg/ml en eau distillée. - Tampon PBS/Tween 0,1 %.
- Tampon PBS/BA. - Tube IMS l ml.
- Aimant Dynal.
- Billes 5, 1 μm Duke XPR green (lot # 1938).
3. Protocole
En tube IMS de 1 ml, introduire 790 μl de PBS/Tween 0,1 % (tube IMS) ou 490 μl de PBS/BSA 0, 1 %/NaN3 0,09% (PBS/BA) (tube référence).
Ajouter 10 μl de mélange de billes fonctionnalisées (soit 50 000 billes de chaque catégorie).
Vortexer.
Ajouter 30 μl de FF-SA.
Vortexer.
Mettre 5' sous agitation rotative.
Ajouter 100 μl de biotine à 200 μg/ml.
Incuber 1 min.
Vortexer.
Aimanter le tube pendant 2 min30.
Eliminer le tampon.
Ajouter 800 μl de PBS/BA.
Aimanter le tube pendant 2min30.
Eliminer le tampon.
Ajouter 500 μl de PBS/BA.
Figure imgf000036_0001
Ajouter 15 μl de billes Duke XPR diluées au 1/50 en PBS/Tween 0,1 % (billes de référence permettant de standardiser le nombre d'événements comptés lors de l'analyse cytométrique).
Analyser les deux tubes sur cytomètre Coulter EPICS XL comme indiqué ci- dessous Créer un histogramme FS LOG/SS LOG. Sur cet histogramme, créer 4 régions d'analyse (A, B, C et D) (Figure 7A).
Placer les régions B, C et D sur les billes de 8, 10 et 15 μm respectivement.
Placer la région A sur la population composée des billes de comptage (5,1 μm.
Duke XPR) et des billes de capture de 4,4 μm.
Créer un histogramme F S LOG/FL4 LOG conditionné sur la fenêtre A (Figure 7b). Créer 3 régions d'analyse (E, F et G).
Placer les régions E et F sur les populations de billes 4,4 μm QuantumPlex #3 et #5 respectivement. Placer la région G sur la population de billes de comptage (Duke XPR).
Créer un histogramme mono-paramétrique conditionné sur la région G. Placer un stop automatique d'analyse à 10 000 événements sur cet histogramme.
Relever le nombre d'événements comptés dans les régions B, C, D, E et F. Calculer les rendements de récupération de chaque catégorie de billes en divisant le nombre d'événements comptés sur le tube IMS par celui compté sur le tube référence.
4. Résultats 4.1. Evolution de la distribution en FS LOG des différentes populations de billes-biotine lors de la fixation des FF-SA (Figure 8).
La fixation des FF-SA sur les billes/BSA-biotine entraîne une légère diminution du FS. Cette évolution n'entraîne pas de recouvrement des différentes populations de billes. 4.2. Rendements de récupération
Les rendements de récupération (% de billes récupérées) obtenus lors de 3 essais différents, dans les conditions exposées au paragraphe 3, sont exposés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000038_0001
Des rendements de récupération compris entre 50 et 95 % ont été obtenus.
5. Conclusion • La faisabilité de l'isolement par aimantation de billes de latex biotinylées rendues magnétiques par la fixation de FF-SA est acquise (rendements de récupération suffisants). •
• Cette séparation magnétique est compatible avec la mise en œuvre d'un dosage multiplex (pas de recouvrement des différentes catégories de microsphères).
. Cet exemple illustre parfaitement la flexibilité du système .
L'utilisation disjointe de microsphères de multiplexage et de nanosphères de séparation élargit le champ de disponibilité des microsphères de qualités requises (taille, auto-fluorescence, densité, matériau, chimie de surface...). En effet les latex non magnétiques sont très facilement accessibles dans toutes les gammes des caractéristiques pré-citées, alors que la gamme de microsphères magnétiques est très réduite (< 1% des références- catalogues). Le choix peut imposer par exemple des fournisseurs différents pour créer une série de familles de multiplexage significative ou des réalisations spéciales (et donc coûteuses). Au contraire, avec le système proposé, on peut utiliser n'importe quelle microsphère de multiplexage, dans la gamme très large des latex non magnétiques.
Exemple 6 : Exemple de modèle de kit selon l'invention
. Réactif 1 - Microsphères fonctionnalisées : mélange de microsphères biotinylées et coatées par des Ac spécifiques des Ag à doser. Concentration en billes : 2500 microsphères de chaque spécificité/μl (Tableau suivant).
Figure imgf000039_0001
Réactif 2 - Ferrofluides-Streptavidine : streptavidin, captivate ferrofluid conjύgate (Molecular Probes, Réf. C-21476).
Réactif 3 - Réactif de révélation : mélange de conjugués fluorescents spécifiques des Ag à doser (Tableau suivant).
Figure imgf000040_0001
Réactif 4 - Standards : mélange concentré (concentration à définir) des 6 Ag à doser.
Une série de dilutions de ce réactif est à préparer extemporanément (dilution en Réactif 1). Traitée dans les mêmes conditions que l'échantillon à analyser, cette gamme (nombre de points à déterminer) permet la quantification des Ag présents dans l'échantillon.
Réactif 5 - Tampon de dilution : tampon PBS/Tween20 0,1% pH=7,2. Réactif 6 - Tampon de lavage : A déterminer (PBS/BSA 0,l%/NaN3 0,09% ou PBS/Tween 20 0,1% ou autre). Réactif 7 - Tampon de neutralisation : solution de d-biotine à 200 μg/ml en eau distillée.
La d-biotine empêche l'agrégation des différentes microsphères biotinylées lors de l'aimantation (agrégation microsphères/biotine - SA FF/SA - biotine/microsphères évitée en neutralisant SA FF/SA par de la biotine pour donner biotine-SA/FF/SA- biotine qui ne peut pas réaliser de pontage entre les différentes microsphères-biotine). Matériel nécessaire non fourni : Aimant Dynal MPC Exemple 7 : Modèle de protocole opératoire du dosage multiplex de 3 bactéries et 3 protéines
1. Préparer une gamme d'étalonnage en mélangeant les réactifs 4 et 5 comme indiqué ci-dessous
Figure imgf000041_0001
2. En tubes de 1 ml, introduire 800 μl d'échantillon à analyser ou 800 μl de standard (tube T0 à Tn).
3. Ajouter 20 μl de réactif 1. 4. Vortexer les tubes.
5. Placer les tubes 8 minutes sous agitation rotative (possibilité de réduire ce temps à 5 minutes à l'étude).
6. Ajouter 30 μl de réactif 2.
7. Vortexer les tubes. 8. Placer les tubes 5 minutes sous agitation rotative.
9. Introduire 100 μl de réactif 7.
10. Vortexer les tubes.
11. Incuber 1 minute à température ambiante (cette incubation d'1 minute n'est . pas forcément nécessaire) 12. Placer les tubes sur l'aimant pendant 2 minutes 30 secondes (possibilité de réduire ce temps à 2 minutes à l'étude).
13. Eliminer le milieu.
14. Ajouter 200 μl de réactif 3. 15. Vortexer les tubes.
16. Incuber 10 minutes à température ambiante.
17. Ajouter 600 μl de réactif 6.
18. Placer les tubes sur l'aimant pendant 2 minutes 30 secondes (possibilité de réduire ce temps à 2 minutes à l'étude).
19. Eliminer le milieu.
20. Ajouter 500 μl de réactif 6.
21. Analyser en CMF.
Exemple 8 : Détection et dosage d'une bactérie sur microsphères 15 μm après isolement magnétique.
But : Détecter et déterminer la concentration en B. globigii sur billes 15 μm biotinylées et chargées par des AcP anti B. globigii.
Matériel et protocole : Ceux-ci correspondent aux exemples 6 et 7. Echantillons analysés : dilutions de spores de B. globigii en réactif 1.
Concentrations en Ag de 160 000 - 80 000 - 40 000 - 20 000 - 10 000 et 5 000 spores/ml.
Résultats :
Figure imgf000042_0001
Voir Figure 9. Exemple 9 : Dosage multiplex d'ovalbumine sur microsphères 4,4 μm fluorescentes après isolement magnétique.
But : Détecter et déterminer la concentration en ovalbumine sur billes 4,4 μm fluorescentes biotinylées et chargés par des AcP anti Ovalbumine.
Matériel et Protocole : le matériel et le protocole employés sont décrits dans les exemples 6 et 7.
Echantillons analysés : dilutions d'Ovalbumine en réactif 1. Concenfration en Ovalbumine de 1,6 - 0,8 - 0,4 - 0,2 - 0,1 et 0,05 ng/ml.
Résultats :
Figure imgf000043_0001
Exemple 10 : Analyse multiplex par cytométrie en flux appliquée à la génétique moléculaire pour la recherche de SNPs
Test type OLA 1) Une sonde oligonucléotidique de capture, d'une taille comprise généralement entre 5 et 100 bases, spécifique pour un gène, est fixée par les méthodes chimiques sur une microphère de latex biotinylée (Iannone MA et al 2000; Cytometry 39:131-140). L'étape de biotinylation de la microphère de latex peut aussi être réalisée après le couplage de la sonde de capture sur la microsphère. Dans un tube unique, les billes de latex sont incubées en présence des ferrofluides sfreptavidine (FF-SA), des sondes de révélation (Al et A2 dans l'exemple de la Figure 3) et des amplicons ou de l'ADN génomique extrait d'un échantillon biologique non amplifié préalablement par PCR ou des fragments dérivés de cet ADN non amplifiés préalablement par PCR. Les sondes Al et A2 peuvent être soit des sondes fluorescentes différentes (par exemple Cy3 et Cy5) ou des haptènes distincts permettant une réaction immunologique ultérieure (par exemple avec deux anticoφs marqués par des fluorochromes dissemblables [FITC vs PE]). Le multiplexage est obtenu par déclinaison du système de billes de latex qui peuvent être soit de tailles variables ou/et douées de caractéristiques de fluorescence distinctes.
2) Avec le même principe que celui énoncé dansl), un test peut être développé en ajoutant un degré de spécificité supplémentaire au niveau du greffage de la sonde de capture sur la microsphère de latex. Ce greffage peut être réalisé par l'intermédiaire d'un couple antigène-anticoφs spécifique, d'un couple haptène-anticoφs spécifique ou d'une sonde oligonucléotidique riche en G+C (Guanine, Cytosine). Dans ce troisième cas, une séquence oligonucléotidique riche en G+C fixée de manière covalente à la microsphère s'hybride avec une séquence complémentaire ajoutée en 5' de la sonde de capture (Figure 4). De plus dans le cas de l'hybridation nucléotidique, le Tm (Melting Température) de la séquence nucléotidique d'ancrage sera idéalement supérieur à 60°C et/ou composé d'un polymère d'au moins 15 résidus de guanine ou de cytosine ou d'un mélange des deux bases nucléotidiques. Dans ces conditions, les hybridations et déshybridations (réalisées généralement entre 15°C et 40°C) du matériel génomique ou des amplicons capturés sont possibles sans pour autant déshybrider la sonde capture de la microsphère.
Exemple 11 : Détection différentielle de fragments de PCR marqués
1. Matériel
Dans certaines approches de réalisation de la PCR, les produits de PCR sont rendus fluorescents à l'aide de nucléotides marqués. L'approche technique proposée par l'invention, qui met en œuvre des étapes de lavage par séparation magnétique de billes non magnétiques à l'origine, pourrait s'appliquer à la détection différentielle de produits de PCR marqués, selon le principe schématisé dans les Figures 11 et 19 et qui porte sur 3 spécificités différentes. La faisabilité de l'analyse Multiplex en CMF après lavage des microsphères
(μS) par des ferrofluides est illustrée dans l'exemple ci-dessous et porte sur 2 spécificités différentes. Les produits de PCR marqués sont ici modélisés à l'aide d'oligonucléotides (O.N.) marqués par la fluorescéine dont les séquences sont complémentaires à celles des sondes de captures respectives, préalablement coupiées à la surface des billes. En pratique : .
• les billes de diamètre 6,7 μm ( Sphero™ Carboxyl-polystyrene particles, CP-60- 10, Spherotech, Libertyville, IL) portent une sonde de capture Facteur V construite selon la structure ci-dessous, indiquée de l'extrémité 5' vers 3' : μS-FV : NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Ace TgT ATT ccT c (SEQ ID
N°l)
• les billes de diamètre 9,6 μm (PL-Microspheres SuperCarboxyl White lOμm, Polymer Laboratories, UK) portent une sonde de capture Facteur II construite selon la structure ci-dessous : μS-FII : NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT aat age act ggg age att gag gct c (SEQ LD N°2)
Les 2 sondes de capture sont construites avec un groupement aminé (-NH2) en - 5', en vue d'un couplage covalent sur des billes carboxylées (μS-COOH). Elles contiennent un bras d' entretoise (ou espaceur pour le terme anglais «spacer ») formé de
6 carbones (C6) et de 12 thymidines (T). Tous les oligonucléotides cités ont été synthétisés spécialement par Proligo (Paris, F).
• Le groupement biotine à la surface des billes, nécessaire au système de l'invention dans les exemples qui suivent, est apporté à l'aide d'un oligonucléotide poly-(T) 30 (noté polyT-biot), marqué en -3' par la biotine et porteur en -5' d'une entretoise NH2 (C6). Il est construit selon la structure ci-dessous : NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-biotine (SEQ ID N° 3) et couplé de la même façon et simultanément avec chaque sonde de capture.
• Les oligonucléotides complémentaires aux sondes de capture sont construits selon les structures ci-dessous et sont marqués par la fluorescéine (Fluor-) en -5': pour FV : Fluor-g Agg AAT AcA ggT ATT TTg Tcc (SEQ ID N°4) pour Fil : Fluor-g age etc aat gct ecc agt gct att (SEQ ID N°5) Le couplage des sondes de capture sur les billes carboxylées de diamètre correspondant est réalisé après activation par l'EDAC ( N-(diméifrylarninoproρyl)-N'- éthylcarbodiimide HC1, Sigma ) comme suit :
Pour chaque type de bille, 10 millions de billes sont lavées en tampon PBS par centrifαgation et adaptées à une concentration de 5 x 106 μS/ml. L' activation des billes est réalisée en ajoutant 0,8mg d'EDAC (80μl à 10 g/ml) et en incubant pendant 30 min. Les sondes sont ensuite mises en présence des billes activées. Afin de réaliser simultanément le couplage de la sonde spécifique et de la sonde porteuse de biotine, un mélange équimolaire d' oligonucléotide de capture et de sonde polyT-biot est mis en contact avec les billes activées (à 17 nmoles/ml en final soit ~ 250 pmoles de chaque O.N. au total)
Les billes sont incubées avec agitation intermittente (vortex) pendant 2 heures à TA (température ambiante) en tube de verre. Après le couplage, les groupements carboxyles activés sont neutralisés en ajoutant 400μl d'éthanolamine 0,2M, et en incubant pendant 16 h à 4°C.
Enfin, les sites d'interaction hydrophobe des billes sont aussi saturés par incubation l/2h sous agitation en PBS-BSA 2%.
Pour les essais d'hybridation des O.N. sur billes décrits ci-après, les tampons sont les mêmes que ceux utilisés dans l'exemple suivant (exemple 12), où la détection concerne effectivement des ADN doubles brins. Ces tampons de pH optimaux, astringents ou non et permettant respectivement i) la déshybridation d'amplicons appariés et ii) la neutralisation dans des conditions favorables à une réhybridation au moins partielle (§) (cf. note de la partie 2 (matériel) de l'exemple 12) sur les sondes de capture immobilisées, sont tous issus de la trousse GENECOLOR™ FV Leiden (BioCytex, Marseille, F) , sous les dénominations respectives de « Hybridization buffer » / tampon d'hybridation, « Ligation buffer »/ noté ici tampon de neutralisation .
Le tampon de lavage/dilution pour analyse en cytométrie. de flux, est du PBS- Tween20® 0,l%
(§) cf. note dans exemple suivant, (cf. note de la partie 2 (matériel) de l'exemple 12) 2. Méthode
Les billes (5 μl test soit 100 000 μS/test pour chaque type) et l'oligonucléotide (O.N.) complémentaire (5 μl soit 3 pmoles/test pour chacun des O.N. pour les doses maximales ou dilution au 1/10 selon indications) sont incubées en tubes PCR (Simport, Québec, C) pendant 15 min à TA en tampon d'hybridation puis 15 min à TA en tampon de neutralisation pour obtenir l'hybridation des brins complémentaires. Après l'hybridation, les O.N. non fixés aux billes sont lavés par séparation magnétique. Pour cela, on ajoute au mélange réactionnel 10 μl de Captivate™ , ferrofluides chargés de Sfreptavidine (notés SA-FF, Molecular Probes, Eugène, Oregon, USA), on incube 10 min, on transfère le contenu du tube PCR dans un tube pour CMF, on ajoute 1 ml de tampon de lavage (PBS-Tween20® 0,1%), et on place les tubes contre un aimant puissant (MPC-L, Dynal F, Compiègne, F) durant 5 min. Les billes aimantées restant collées contre la paroi du tube, on élimine la phase liquide et on resuspend les billes dans 2 ml de tampon de lavage pour la phase suivante (déshybridation sélective).
Pour la déshybridation sélective, les tubes sont chauffés à proximité du point de fusion (T ) des sondes pour ne maintenir que les hybridations spécifiques (correspondant à la complémentarité totale des séquences i.e. 100%) et dissocier les hybridations non spécifiques (correspondant à des complémentarités partielles des séquences i.e. < 35 % ). Pour cela , les tubes sont incubés à 54 °C en tampon PBS/Tween20® 0,1%, condition qui permet le décrochage sélectif des sondes fluorescentes FV et Fil de leur séquence non complémentaire, « Fil » et « FV » respectivement. Les tubes sont maintenus dans le bain-marie pendant 5 min à la température indiquée puis immédiatement analysés en CMF. Pour la déshybridation complète, les tubes sont chauffés bien au-delà du point de fusion (Tm), en pratique pendant 10 min à 80°C.
3. Résultats
Les figures 11 à 19 illustrent la détection différentielle des fragments oligonucléotidiques marqués représentatifs des gènes de FV et Fil respectivement, dans des analyses cytométriques duplex. Dans tous les cas, les billes de capture de spécificité FV (μS-FV) et de diamètre 6,7 μm sont repérées dans la région RI pour analyse de leur fluorescence. Les billes de capture de spécificité Fil (μS-FII) et de diamètre 9,6. μm sont repérées dans la région R2.
a) En présence simultanément des 2 oligonucléotides marqués, un marquage maximum de chaque type de bille est observé (Fig. 12 et 13) , correspondant à des intensités moyennes maximales de respectivement :
• 831 unités arbitraires (u.a.) pour μS-FV • 247 unités arbitraires (u.a.) pour μS-FII
b) Lorsque les mêmes billes sont soumises à une déshybridation totale par chauffage 10 min à 80°C (Fig. 14 et 15), un marquage minimum de chaque type de bille est observé (Fig. 14 et 15) , correspondant à des intensités moyennes, minimales de : • 6 u.a. pour μS-FV
• 18 u.a. pour μS-FII
Ces résultats correspondent donc à 2 gammes de travail d'amplitudes maximales de, respectivement :
• 6 à 840 u.a (μS-FV) • 18 à 250 u.a (μS-FÏÏ)
c) En présence d'une dose réduite (1/10 de la dose maxi) d'un seul des 2 oligonucléotides marqués (FV). un marquage fort est observé sur μS-FV (Fig. 16 et 17 ; 266 u.a. soit ~25% de l'amplitude maximale possible) alors que pour μS-FII le signal reste proche du BF de 18 u.a. vu en fig. 15. ( 21 u.a. soit < 2% de l'amplitude maximale possible).
d) En sens inverse, en présence d'une dose réduite (1/10 de la dose maxi) d'un seul des 2 oligonucléotides marqués (Fil), un marquage positif est observé sur μS- Fil (77 u.a. soit ~30% de l'amplitude maximale possible) alors que pour μS-FV le signal reste faible ( 11 u.a. soit < 2% de l'amplitude maximale possible) mais cependant supérieur au BF de 6 u.a. vu en fig. 15, ce qui suggère l'existence d'un léger marquage non spécifique résiduel. Le tableau ci-dessous fait la synthèse des résultats sur l'analyse en CMF duplex des O.N. représentatifs des gènes Facteur II et Facteur V et montre que la détection de fragments d'ADN marqués en fluorescence est simple et réalisable sur un seul tube.
Figure imgf000049_0001
Exemple 12 : Détection différentielle d'une mutation SNP
1. Principe La détection de mutations ponctuelles (SNP) est basée sur la technique OLA
(Landegren, Science 1988, 241 : 1077-80). Cette technique passe par :
• la formation d'un complexe ternaire entre la sonde de capture (immobilisée ici sur une famille de billes), le brin d'ADN monocaténaire complémentaire issu des amplicons du gène correspondant et une sonde de révélation contigue à la sonde de capture.
• Le couplage covalent de la sonde de capture et de la sonde de révélation - hybridées avec le brin complémentaire - par l'action spécifique d'une ligase qui ne raboute que les brins exactement contigus et parfaitement hybrides. L'absence de complémentarité sur la seule base portant la mutation suffit à empêcher ce couplage (noté ici ligature).
• Une dissociation en conditions astringentes des doubles brins d'ADN. Dans le cas où la ligase a trouvé les conditions de spécificité requises pour son action, et seulement dans ce cas, la sonde de révélation reste associée (couplage covalent) à la sonde de capture et donc au support correspondant (ici une bille).
L'application de ce principe dans le cadre de l'invention est illustrée par les i Figures 20 et 21.
Remarque : La CMF permet de mesurer simultanément des intensités de fluorescence de niveaux très différents (du bruit de fond au marquage ++++) sur des groupes de billes différentiables sur la base d'un autre paramètre (taille ou fluorescence de longueur d'onde différente).
2. Matériel
La détection de mutations ponctuelles (SNP), dont le principe est illustré par la Fig. 21, nécessite l'utilisation de deux types de μS pour une détection différentielle. Les μS utilisées ici sont chargées des sondes de capture ad hoc comme illustré dans l'exemple 11 et sont telles que :
• les billes de diamèfre 6,7 μm portent une sonde de capture Facteur V sauvage (μS-FVwt) construite selon la structure ci-dessous, indiquée de l'extrémité 5' vers 3' : μS-FVwt : NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Ace TgT ATT ccT c (SEQ ID N°l)
• les billes de diamètre 9,6 μm portent une sonde de capture Facteur V mutant (μS-FVmut) construite selon la structure ci-dessous, indiquée de l'extrémité 5' vers 3' : μS-FVmut : NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AÀT Ace TgT ATT ccT T (SEQ ID N°6)
Le groupement biotine à la surface des billes, nécessaire au système de l'invention dans les exemples qui suivent est apporté comme dans le paragraphe A par un oligonucléotide poly-(T)30 et permet la fixation spécifique de ferrofluide- streptavidine (Captivate™, Molecular Probes , Eugène, OR, USA). La sonde contiguë à la sonde de capture permettant la révélation de la ligation porte un groupement phosphate en 5' et un marquage fluorescéine en 3' ; elle a été spécialement synthétisée par Proligo (Paris, F) et possède la séquence suivante : PO4 2" -gcc TgT ccA ggg ATc TgcTcc-fluo (SEQ ID N°7).
Les amplicons permettant la formation du complexe ternaire sont issus de l'amplification par PCR d'un fragment du gène Facteur V sauvage et/ou mutant à partir d'ADN génomique ou de plasmides spécifiques, PCR réalisée en présence d'un mélange pour PCR, réactif « Ampli-Mix » disponible dans la trousse GENECOLOR™
FV Leiden, (BioCytex , Marseille, F).
La solution de ligase permettant la formation d'une liaison covalente entre la sonde de capture et la sonde signal est le réactif dit « Ligation solution », ou solution de ligature, c'est-à-dire une T4 Ligase dans son tampon spécial, dit « Ligation buffer », telle qu'utilisée dans les trousses GENECOLOR™ FV Leiden, (BioCytex, Marseille,
F).
Les tampons utilisés ci-après sont de pH optimaux, astringents ou non, et permettent respectivement i) la déshybridation des amplicons appariés et leur réhybridation partielle (§) (cf. note de la partie 2 (matériel) de l'exemple 12) sur les sondes de capture immobilisées, ii) l'action de la ligase et enfin iii) la déshybridation des amplicons et sondes non couplées après ligation.
Ils sont aussi tous issus de la trousse GENECOLOR™ FVLeiden, sous les dénominations respectives de « Hybridization buffer » / tampon d'hybridation, « Ligation buffer »/ Tampon de ligature (aussi noté Tampon de neutralisation dans l'exemple 11, et « Washing solution» / Solution de lavage.
Le tampon de dilution pour analyse en cytométrie de flux est du PBS-Tween 20® 0,1%. (§) Les conditions de stœchiométrie sont préalablement optimisées (excès d'amplicons, excès de sonde signal) pour obtenir la réhybridation d'une fraction significative de l'un des 2 brins d'ADN sur les sondes de capture immobilisées plutôt que sur son brin complémentaire.
3. Protocole
Les billes des 2 types (μS-FVwt et μS-FVmut) sont mélangées en quantités équivalentes et diluées en tampon d'hybridation à raison de 40 000 μS/μl au total. Dans un micro-tube spécial PCR (PCR T 320-1N, Simport , Québec, C), sont distribués 5 μl de suspension de billes (soit 100 000 μS/test pour chaque type), les amplicons (3,75 μl/test) et la sonde de révélation FV (1 pmole sous l,25μl de tampon d'hybridation). Le milieu réactionnel est homogénéisé (vortex) et incubé pendant 30 min à température ambiante (TA).
L'étape de ligature est ensuite assurée par une incubation pendant une heure après ajout de 100 μl de solution de ligation.
Après la ligation, l'excès d'amplicons et de sonde signal non impliqués dans le complexe ternaire est éliminé par séparation magnétique. Pour cela, le mélange réactionnel (Vt = HOμl) reçoit 10 μl de suspension de ferrofluides (SA-FF). Après une agitation (vortex) et une incubation de 10 min, le mélange est transféré en tube de 1 ml (tubes Ringer) et on procède à l'aimantation pendant 5 min avec un aimant puissant (MPC-S, Dynal , Compiègne, F). Les billes, collées contre la paroi du tube, sont asséchées par aspiration du liquide et remises en suspension avec 100 μl de Solution de lavage. La solution de lavage, de caractéristiques appropriées, permet le décrochage sélectif des produits associés aux billes uniquement par interaction non covalente (hybridation sans ligation) mais pas celui des sondes liées par covalence ni celui des SA-FF. Ce lavage est répété une deuxième fois.
Les billes sont finalement diluées dans 1 ml de tampon de dilution (PBS-Tween 20®), transférées en tube pour cytométrie (4 ml) et analysées en CMF.
4. Résultats a) En présence de produits de PCR non reconnaissables par le système (ici produits issus de l'amplification du gène P2Y12, allèle sauvage, générée avec les réactifs de la trousse GENECOLOR™ P2Y12 G52T, BioCytex, Marseille, F), chacune des 2 billes donne un marquage proche de son bruit de fond (BF) intrinsèque, en pratique (Figures 23 et 24) :
• μS-FVwt : 6,0 u.a.
• μS-FV mut : 15,3 u.a. b) En présence de produits de PCR correspondant à l' allèle sauvage du gène
Facteur V (FVwt, PCR générée avec les réactifs de la trousse GENECOLOR™ Facteur V Leiden, BioCytex, Marseille, F), les billes μS-FVwt montrent un marquage nettement positif alors que les billes μS-FVmut donnent un marquage proche de leur bruit de fond intrinsèque, en pratique (Figures 25 à 28):
• μS-FVwt : 313 u.a. (versus BF à 6,0 u.a.) .• μS-FV mut : 17,4 u.a. . (versus BF à 15,3 u.a.)
Le signal de chaque bille dans le test est supeφosé à son BF non spécifique (μS- FVwt : Fig 27 ; μS-FVmut : Fig 28 ). Ceci suggère une gamme de travail large pour la spécificité FNwt (de 6 à plus de 300 u.a.) et un marquage non spécifique quasiment nul sur la bille FNmut, en absence de son ligand spécifique (amplicons FNmut ). c) En présence de produits de PCR correspondant à F allèle muté du gène
Facteur N (FNmut, PCR générée avec les réactifs de la trousse GENECOLOR™ FV Leiden, BioCytex, Marseille, F), les billes μS-FVmut montrent un marquage nettement différent du BF, correspondant au niveau de signal positif maximum possible avec le matériel disponible. Les billes μS-FVwt donnent un marquage faible par rapport au signal positif maximum (14,8 versus 313 u.a. soit < 2% de l'amplitude maximum de variation), bien que différent de leur bruit de fond intrinsèque, ce qui suggère l'existence d'un marquage non spécifique faible mais réel sur ces billes en présence d'amplicons FN mut.
En pratique (Figures 29 à 32) : • μS-FNwt : 14,8 u.a. (versus BF à 6,0 u.a.)
• μS-FV mut : 43,4 u.a. (versus BF à 15,3 u.a.)
Pour la détection de cette mutation FN, en présence éventuellement de l'autre allèle, les amplitudes (gammes) de travail respectives sont donc, au mieux :
FV wt : de 15 à 300 u.a. FV mut : de 17 à 43 u.a.
Le décalage observé sur l'intensité maximale (300 u.a. versus 43 u.a.) est attribuàble à une efficacité de coating moins bonne pour les billes μS~FVmut ; comme dans l'exemple n°ll, ces billes de 9,7 μm donnent un moins bon niveau de coating. A noter que, grâce au principe de l'invention, d'autres lots, types, origines et diamètres de billes peuvent être utilisés à volonté pour obtenir les caractéristiques optimales de capacité de charge et ou de BF intrinsèque, sans se soucier de leurs propriétés magnétiques, ce qui étend le choix de fourniture de façon significative. d) En présence des produits de PCR correspondant aux 2 allèles du gène Facteur V simultanément (FVmut et FV wt, PCR générée avec les réactifs de la trousse GENECOLOR™ Facteur V Leiden, BioCytex, Marseille, F), les billes μS-FVmut ainsi que les billes μS-FVwt montrent un marquage nettement positif, bien qu'à des niveaux d'intensité plus faibles que ceux observés avec les amplicons spécifiques d'un seul allèle utilisés seuls, en pratique (Fig. 33 à 36) :
• μS-FVwt : 187 u.a. (soit ~2/3 de l'amplitude maximum de marquage spécifique : [187-15] / [300-15] )
• μS-FVmut : 33 u.a. (soit ~2/3 de l'amplitude maximum de marquage spécifique : [33-17] / [43-17] )
Le tableau ci-dessous fait la synthèse des résultats sur l'analyse en CMF duplex de la mutation Leiden du Facteur V et montre que la définition du génotype FV est simple et réalisable sur un seul tube.
Figure imgf000054_0001
5. Extensions
Les exemples précédents, en particulier les n°s 1, 2 et 5 ont déjà illustré, dans le cadre de détections immunologiques, la possibilité d'utiliser un plus grand nombre de familles de billes aisément différentiables par leurs tailles et ou un niveau variable d'une seconde fluorescence différente de celle qui sert à la mesure. Il ressort de la mise en concordance de tous ces exemples qu'une analyse Multiplex des 2 allèles des gènes FV et FII en un tube unique serait très facile, en utilisant par exemple :
• les mêmes billes carboxylées qu'illustrées dans l'exemple 12 (FV mut diamètre 9,6μm et FVwt diamètre 6,7 μm) ainsi que les billes carboxylées de 4,4 μm et porteuses de 2 niveaux différents de fluorescence rouge telles qu'illustrées dans les exemples 4 et 5, pour porter les deux sondes spécifiques des allèles sauvage et mutant du FIL
• Deux fluorescences différentes pour la mesure selon le principe de la Fig. 20, qui ne requiert qu'un seul type de bille par mutation. On peut généraliser ces 2 approches en considérant que :
• la première, utilisant seulement une fluorescence pour la mesure, permet de détecter autant d'allèles différents que l'on peut différencier de familles de billes simultanément ,
• la seconde, utilisant 2 fluorescences différentes pour la mesure, permet de génotyper autant de gènes que l'on peut différencier de familles de billes simultanément .
Dans tous les cas, l'avantage majeur apporté par l'invention est que le choix des billes pour l'analyse Multiplex n'impose aucune condition limitante sur leur propriétés magnétiques intrinsèques.
Exemple 13 : Détection différentielle d'une mutation SNP 1. Principe de la Figure 37: Dans la Fig. 37, comme dans la figure 21, la base critique (spécificité de SNP) est portée par chacune des sondes de capture, spécifiques d'allèle, et couplée chacune à un type de bille différent (différenciés par la taille). Ce système ne réclame, pour l'analyse du signal en CMF, qu'une analyse par comptage des billes sur la base des paramètres de taille et de structure, permettant soit d'utiliser un appareillage dépourvu d'un détecteur de fluorescence et donc moins coûteux, soit de tirer parti d'autres tailles pour différencier les familles de billes entre elles. 2. Matériel :
La détection de mutations ponctuelles (SNP), dont le principe est illustré par la Fig. 37, nécessite l'utilisation de deux types de μS pour une détection différentielle. Les μS utilisées ici sont chargées des sondes de capture ad hoc comme illustré dans le paragraphe A et sont telles que :
• les billes de diamètre 6,7 μm portent une sonde de capture Facteur V sauvage (μS-
FVwt) construite selon la structure ci-dessous, indiquée de l'extrémité 5' vers 3' : μS-FVwt : NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Ace TgT ATT ccT c (SEQ ID N°l)
• les billes de diamètre 9,6 μm portent une sonde de capture Facteur V mutant (μS FVmut) construite selon la structure ci-dessous, indiquée de l'extrémité 5' vers 3' : μS-FVmut : NH2 (C6) TTT TTT TTT TTT ggA cAA AAT Ace TgT ATT ccT T (SEQ ID N°6)
La sonde contiguë à la sonde de capture permettant la révélation de la ligation porte un groupement phosphate en 5' et un groupement biotine en 3' ; elle a été spécialement synthétisée par Proligo (Paris, F) et possède la séquence suivante : PO 2_ -gec TgT ccA ggg ATc TgcTcc TTT TTT TTT TTT TTT TTT-Biotine (SEQ ID N°8)
Le groupement biotine sur la sonde de capture, nécessaire au système de l'invention dans les exemples qui suivent permet la fixation spécifique de ferrofluide- streptavidine (Captivate™, Molecular Probes , Eugène, OR, USA).
Les amplicons permettant la formation du complexe ternaire sont issus de l'amplification par PCR d'un fragment du gène Facteur V sauvage et/ou mutant à partir d'ADN génomique ou de plasmides spécifiques, PCR réalisée en présence d'un mélange pour PCR, réactif « Ampli-Mix » disponible dans la trousse GENECOLOR™ FV Leiden, (BioCytex , Marseille, F).
La solution de ligase permettant la formation d'une liaison covalente entre la sonde de capture et la sonde signal est le réactif dit « Ligation solution »/ Solution de ligation i.e. une T4 Ligase dans son tampon spécial, dit « Ligation buffer », telle qu'utilisée dans les trousses GENECOLOR™ FV Leiden, (BioCytex, Marseille, F). Les tampons utilisés ci-après sont de pH optimaux, astringents ou non, et permettent respectivement i) la déshybridation des amplicons appariés et leur réhybridation partielle (§) (cf. ci-dessous) sur les sondes de capture immobilisées, ii) l'action de la ligase et enfin iii) la déshybridation des amplicons et sondes non couplées après ligation.
Ils sont aussi tous issus de la trousse GENECOLOR™ FVLeiden, sous les dénominations respectives de « Hybridization buffer » / tampon d'hybridation, « Ligation buffer »/ Tampon de ligation (aussi noté Tampon de neufralisation dans l'exemple A, et « Washing solution» / Solution de lavage.
Le tampon de dilution pour analyse en cytométrie de flux est du PBS-Tween 20® 0,1%
(§) Les conditions de stœchiométries sont préalablement optimisées (excès d'amplicons, excès de sonde signal) pour obtenir la réhybridation d'une fraction significative de l'un des 2 brins d'ADN sur les sondes de capture immobilisées plutôt que sur son brin complémentaire.
3. Protocole: Les billes des 2 types (μS-FVwt et μS-FVmut) sont mélangées en quantités équivalentes et diluées en tampon d'hybridation à raison de 40 000 μS/μl au total. Dans un micro-tube spécial PCR (PCR T 320- IN, Simport , Québec, C), sont distribués 5 μl de suspension de billes (soit 100 000 μS/test pour chaque type), les amplicons (3,75 μl/test) et la sonde de révélation FV (1 pmole sous l,25μl de tampon d'hybridation). Le milieu réactionnel est homogénéisé (vortex) et incubé pendant 30 min à température ambiante (TA).
L'étape de ligature est ensuite assurée par une incubation pendant une heure après ajout de 100 μl de solution de ligation.
Après la ligation, l'excès d'amplicons et de sonde signal non impliqués dans le complexe ternaire est éliminé par séparation magnétique. Pour cela, le mélange réactionnel (Vt = HOμl) reçoit 10 μl de suspension de ferrofluides (SA-FF). Après une agitation (vortex) et une incubation de 10 min, le mélange est transféré en tube de 1 ml (tubes Ringer) et on procède à l'aimantation pendant 5 min avec un aimant puissant (MPC-S, Dynal , Compiègne, F). Les billes, collées contre la paroi du tube, sont asséchées par aspiration du liquide et remises en suspension avec 100 μl de Solution de lavage. La Solution de lavage, de caractéristiques appropriées, permet le décrochage sélectif des produits associés aux billes uniquement par interaction non covalente (hybridation sans ligation) mais pas celui des sondes liées par covalence ni celui des SA-FF. Ce lavage est répété une deuxième fois.
Les billes sont finalement diluées dans 1 ml de tampon de dilution (PBS-Tween 20®), transférées en tube pour cytométrie (4 ml) et analysées en CMF.
4. Résultats: a) En présence de produits de PCR non reconnaissables par le système (ici produits issus de l'amplification du gène P2Y12, allèle sauvage, générée avec les réactifs de la trousse GENECOLOR™ P2Y12 G52T, BioCytex, Marseille, F), chacune des 2 billes donne un marquage proche de son bruit de fond (BF) mtrinsèque, en pratique (Fig. 40): • Nombre de μS-FVwt : 125
• Nombre de μS-FVmut : 15 b) En présence de produits de PCR correspondant à l' allèle sauvage du gène Facteur
V (FVwt, PCR générée avec les réactifs de la frousse GENECOLOR™ Facteur V Leiden, BioCytex, Marseille, F), les billes μS-FVwt montrent un marquage nettement positif alors que les billes μS-FVmut donnent un marquage proche de leur bruit de fond intrinsèque, en pratique (Fig. 41 et 42):
• Nombre de μS-FVwt : 2222
• Nombre de μS-FVmut : 294 c) En présence de produits de PCR correspondant à Pallèle muté du gène Facteur V
(FVmut, PCR générée avec les réactifs de la trousse GENECOLOR™ FV Leiden, BioCytex, Marseille, F), les billes μS-FVmut montrent un marquage nettement différent du BF, correspondant au niveau de signal positif maximum possible avec le matériel disponible positif alors que les billes μS-FVwt donnent un marquage proche de leur bruit de fond intrinsèque. En pratique (Fig. 43 et 44) :
• Nombre de μS-FVwt : 32
• Nombre de μS-FVmut : 600 Le tableau ci-dessous fait la synthèse des résultats sur l'analyse en CMF duplex de la mutation Leiden du Facteur V et montre que la définition du génotype FV est simple et réalisable sur un seul tube.
Figure imgf000059_0001

Claims

Revendications
1. Procédé de détection et/ou de quantification multiplex d'analytes susceptibles d'êtres contenus dans un échantillon à l'aide de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdits analytes pouvant être le cas échéant préalablement marqués par un marqueur, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la mise en présence dudit échantillon avec une suspension de populations de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microsphères portant à leur surface : pour toutes les populations de microsphères, un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison, ledit composé A étant également caractérisé en ce qu'il ne peut pas se lier avec lesdits analytes, et pour chacune des populations de microspheres, un composé B, différent pour chaque population, capable de former une paire de liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, b) l'addition au milieu réactionnel obtenu à l'étape a) d'un ferrofluide, lequel ferrofluide contient des particules magnétiques qui portent à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec le composé A, c) au moins une étape de lavage par séparation magnétique des microsphères magnétisées à l'étape b), d) le cas échéant lorsque lesdits analytes ne sont pas préalablement marqués, la mise en présence de la suspension des microspheres magnétisées obtenues à l'étape c) avec une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de reconnaître et de se lier spécifiquement avec l'un desdits analytes et un marqueur, cette étape d) étant suivie de préférence d'au moins une étape de lavage des microsphères par séparation magnétique, et, e) la détection et/ou la quantification dudit marqueur à la surface des microsphères.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que deux au moins desdites populations de microsphères possèdent en outre au moins une caractéristique physique intrinsèque permettant de les différencier entre elles.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite paire de liaison formée entre le composé A et le second membre fixé à la surface des ferrofluides, est de préférence choisie au sein du groupe constitué par les paires de liaison spécifique de type biotine/avidine ou biotine/streptavidine, enzyme/cofacteur, lectine/carbohydrate et anticoφs/haptène.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les microsphères sont dans un matériau choisi au sein du groupe constitué par le latex, un polymère, un copolymère, le verre ou la silice.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le ou les marqueurs utilisés sont fluorescents.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la détection et/ou la quantification dudit marqueur à l'étape e) du procédé est réalisée par cytométrie de flux.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite caractéristique physique mtrinsèque permettant de différencier les au moins 2 populations de microsphères est la taille et/ou une propriété optique desdites microsphères.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les microsphères ont une taille comprise entre 0,3 et 100 μm de diamètre.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la propriété optique est la longueur d'onde d'émission et/ou l'intensité de la fluorescence desdites microsphères.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que lesdits analytes sont de type protéique et dérivés, ou sont des acides nucléiques.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que lesdits analytes sont des composés pouvant être présents soit en solution dans un liquide, soit présents à la surface d'une cellule ou d'une particule en suspension dans l'échantillon.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que lesdits composés sont des toxines protéiques, ou en ce que ladite cellule ou particule est un microorganisme, tel qu'une bactérie ou un virus.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que ledit composé B est choisi au sein du groupe constitué par les protéines et les acides nucléiques.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que ledit composé C dudit conjugué utilisé à l'étape d) est choisi au sein du groupe constitué par les protéines et les acides nucléiques.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que lesdits analytes sont des acides nucléiques et en ce qu'à l'étape a), le composé B est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdits analytes sont des produits PCR.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que lesdits produits PCR sont obtenus marqués.
18. Procédé selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ledit composé C dudit conjugué est un acide nucléique capable de s'hybrider spécifiquement avec l'un desdits analytes.
19. Utilisation du procédé selon la revendication 18 pour la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs.
20. Utilisation du procédé selon la revendication 19, caractérisée en ce que la détection et/ou la quantification multiplex de SNPs est réalisée par la méthode OLA.
21. Kit pour la détection et/ou la quantification multiplex d'analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un réactif 1 comprenant une suspension de populations de microsphères non magnétiques fonctionnalisées, lesdites microsphères portant à leur surface:
- un composé A formant un premier membre d'une paire de liaison ;
- un composé B capable de former une liaison spécifique avec l'un desdits analytes de l'échantillon, et b) un réactif 2 comprenant un ferrofluide qui contient des particules magnétiques portant à leur surface un second membre de liaison capable de former une paire de liaison spécifique avec ledit composé A ; et c) un réactif 3 comprenant une solution d'au moins un conjugué, ledit conjugué comprenant un composé C capable de réagir spécifiquement avec lesdits analytes et un marqueur capable d'être détecté.
22. Kit selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : - un réactif 4 comprenant lesdits analytes susceptibles d'être contenus dans un échantillon.
23. Kit selon la revendication 21 ou 22, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :
- un réactif.5 composé d'un tampon de dilution ; et
- un réactif 6 composé d'un tampon de lavage.
24. Kit selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :
- un réactif 7 comprenant un tampon de neutralisation de l'agrégation des différentes microsphères.
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