WO2004104578A1 - ケラチノサイトによるインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用 - Google Patents

ケラチノサイトによるインターロイキン１８の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法、およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、並びにその利用 Download PDF

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Kenji Nakanishi
Hitoshi Mizutani
Hiroko Tsutsui
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    • G01N2333/54—Interleukins [IL]

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening for an inhibitor using the phenomenon of inducing the production of interleukin 18 from keratinocytes, a method for inducing arthropathic dermatitis-like symptoms, and use thereof.
  • the present invention relates to a screening method which can be suitably used for elucidation of the onset mechanism of atopic dermatitis and its similar symptoms and for the development of therapeutic drugs, a method for inducing atopic dermatitis-like symptoms, and use thereof.
  • the epidermis consists of keratinocytes (KC, keratinocytes), melanocytes, epidermal Langerhans cells (LC), and intraepithelial T cells.
  • KC keratinocytes
  • melanocytes melanocytes
  • LC epidermal Langerhans cells
  • intraepithelial T cells intraepithelial T cells.
  • LCs are immature dendritic cells (DCs) whose function is to capture locally exposed protein antigens and deliver them to regional lymph nodes where an adaptive immune response typically occurs. is there.
  • DCs dendritic cells
  • L C changes to mature D C, which has the ability to present antigen.
  • the result is a specific systemic immune response to the antigens carried by the LCZDC.
  • the antigen-specific immune response of the skin is closely related to the systemic immune response to the same antigen.
  • skin and immune organs are likely to be closely related to each other through the LC / DC circulation and antigen-specific immune cells.
  • KC and melanocytes settle in the skin and basically do not participate in the acquired immune response.
  • KC may contribute to the induction of innate immune responses and inflammation in local skin.
  • the host responds with an inflammatory response, The resulting immune response develops in a localized skin area.
  • KC and LC constituting the skin are considered to be deeply involved in each response. Therefore, based on the unique property of producing various cytokines in response to stimulation by microorganisms and chemical reagents, KC may affect LC and consequently alter the acquired immune response (Non-patent Document 1). ⁇ See 2). Given these facts, it is important to determine whether KC-induced skin inflammation also affects the systemic immune response.
  • KC caspase-1
  • atopic dermatitis atopic dermatitis (atopic dermatitis) dermatitis, AD
  • atopic dermatitis atopic dermatitis (atopic dermatitis) dermatitis, AD
  • IL-11] 3 enhances the ability of IL-18 to induce AD-like skin inflammation
  • Non-Patent Document 4 KC may also contribute to the systemic immune response by producing many cytokines, including IL-18 and IL_1.
  • IL-18 and IL-1 are produced as biologically inactive precursors, released after being cleaved by an appropriate intracellular enzyme such as caspase-1, and released as active forms. (See Non-Patent Documents 5 to 9).
  • IL-18 exhibits various physiological activities depending on the type of coexisting cytokine.
  • IL-12 interleukin 12
  • IFN- ⁇ a strong inflammation-causing cytokine
  • IL-18 induces an atopic response through induction of Th2 cytokine production (see Non-Patent Documents 11 to 14).
  • AD is an inflammatory skin lesion caused by external stimuli, and is a disease with chronic repetitive strong pruritus.
  • the onset has a genetic background, and patients have high levels of IgE in their serum, but the mechanisms of their onset are largely unknown.
  • Activated T cells, basophils, and mast cells are deeply involved in the mechanism of AD development.
  • activation of mast cells or basophils by allergens is thought to result in the production of Th2 cytokines and chemical mediators, resulting in AD.
  • Activation of mast cells or basophils by the above allergens is caused by the cross-linking of IgE molecules bound to FceR (Fc receptor (FcR) for IgE antibodies of basophils) on these cells. by.
  • Th2 site force input are interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin 9 (IL-9), and interleukin 13 (IL-1). 3) and the like.
  • IL-4 interleukin 4
  • IL-5 interleukin 5
  • IL-9 interleukin 9
  • IL-13 interleukin 13
  • chemical mediator include histamine, serotonin, leukotoluene and the like.
  • Staphylococcus aureus infection may worsen inflammatory changes in the skin of AD patients in some situations (see Non-Patent Documents 15 and 16). It is known that serum IL-18 levels increase (see Non-Patent Document 17). That is, it has been known that Staphylococcus aureus infection is a factor that induces or exacerbates AD. However, much remains unknown about how Staphylococcus aureus is involved in the pathogenesis of AD.
  • Non-Patent Document 3 (Non-Patent Document 3)
  • Non-patent document 4 (Non-patent document 4)
  • IL-18 contributes to the spontaneous d evelopment of atopic dermatitis-like inflammatory skin lesion independently of IgE / stat6 under specific pathogen-free conditions.Proc. Natl.Ac ad.Sci. USA. 99: 11340.
  • Non-Patent Document 5 (Non-Patent Document 5)
  • Non-Patent Document 6 (Non-Patent Document 6)
  • Non-Patent Document 7 (Non-Patent Document 7)
  • Non-Patent Document 8 (Non-Patent Document 8)
  • Non-Patent Document 9 (Non-Patent Document 9)
  • Non-patent document 10 Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, T., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimo to, T., Torigoe, K., Okura, T., Nukada, Y., Hattori, K. , Akita, H., Namba, M., Tanabe, F., Konishi, K., Fukuda, S., and Kurimoto, M. 1995 Cloning g of a new cytokine that induces INF-y production by T cells. Nature 37 8: 88.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to utilize the phenomenon of inducing the production of IL-18 from the body to develop the mechanism of onset of arthritis dermatitis and similar symptoms.
  • An object of the present invention is to provide various methods that can be suitably used for elucidation and development of therapeutic drugs and methods of using the same. Disclosure of the invention
  • the screening method according to the present invention provides a screening method for an inhibitor utilizing an induction phenomenon of interleukin 18 production that occurs in an organism having an atopic dermatitis-like inflammatory skin lesion in order to solve the above problems.
  • the stimulant may be the protein A derived from Staphylococcus aureus, the partial protein of the protein A capable of stimulating keratinocytes, or the protein A capable of stimulating keratinocytes. It is preferable to use at least one of variants of the partial protein. Further, it is more preferable to use sodium dodecyl sulfate (SDS) in addition to protein A as the stimulant.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the above-mentioned environment forming step is performed at an in-vitro mouth
  • the above-mentioned environment is realized by adding the above-mentioned protein A to a culture solution of keratinocyte cultured cells and culturing the same.
  • the environment forming step is performed in vivo
  • the above environment may be formed by applying the protein A to the skin of a host organism.
  • a skin piece having an atopic dermatitis-like inflammatory skin lesion is used as the stimulant, and the skin piece is transplanted to a host organism. Thereby, the formation of the environment may be realized.
  • the host organism has at least all of the following traits: CD4 + T cell expression, stat6 expression, and IL-18R ⁇ chain expression in NKT cells.
  • a mouse is preferably used as the host organism.
  • the present invention also includes a therapeutic drug for an immunological disease containing an inhibitor obtained by using the above-described cleaning method. Furthermore, the present invention relates to a method for suppressing high-level IgE expression in serum produced in an organism having an atopic dermatitis-like inflammatory skin lesion. No exposure to antigens caused by local accumulation of interleukin 18 produced from keratinocytes using the inhibitor obtained using the above screening method or the above-mentioned drug for treating an immune disease. It also includes a method of suppressing the systemic IgE response caused by E. coli.
  • the method for inducing an atopic dermatitis-like symptom according to the present invention is a method for inducing an atopic dermatitis-like symptom that causes an atopic dermatitis-like inflammatory skin lesion in a model organism. It is characterized by applying Protein A to the skin of a model organism.
  • the protein A may be a complete protein of the protein A, a partial protein of the protein A capable of stimulating keratinocytes, or the protein A capable of stimulating keratinocytes. Can use at least one of variants of the partial protein. Furthermore, when applying the protein A to the skin of a model organism, it is preferable to use SDS together.
  • the present invention includes a model organism that has developed an inflammatory skin lesion obtained by the above-described induction method, and a mouse can be mentioned as an example of the model organism.
  • Screening kit II for performing the screening method, and kit for inducing arthritis-like dermatitis-like symptoms for performing the above-described induction method can be mentioned.
  • each of the above methods in inflammatory skin lesions such as atopic dermatitis (AD), local accumulation of IL-18 produced from keratinocytes increases systemic IgE without exposure to antigen. Utilizes triggering a response. Therefore, each of the above methods can be suitably used for elucidating the onset mechanism of atopic dermatitis and its similar symptoms and for developing therapeutic drugs.
  • AD atopic dermatitis
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of induction of IgE in a host by transplantation of lesion skin of a KCAS P1 Tg mouse together with the results of a control.
  • FIGS. 2A to 2F are diagrams showing the accumulation of IL_18 in the lesion skin of KCAS P1 Tg mice together with the control results.
  • FIGS. 3A to 3F are diagrams showing the accumulation of CD4 + T cells in lesional skin of KCAS P1 Tg mice together with the results of controls.
  • FIG. 4 is a diagram showing the loss of selective differentiation of Th2 cells in a host transplanted with diseased skin, together with the results of a control.
  • a and B in Figure 5 show the control of host CD4 + T cells, host stat6 and host IL-18 response to IgE induction, and the development of Th1 / Th2 cells. It is a figure shown with the result of.
  • 6A to 6C are diagrams showing the results of induction of IL-18 and IgE by treatment with SpA in vivo, together with the results of controls.
  • a to D in FIG. 7 are not 11 ⁇ _12 but 1
  • FIG. 3 is a diagram showing the result of releasing only L-18, together with the result of control.
  • FIGS. 8A to 8D are diagrams showing the results of skin lesions in NC / Nga mice to which a mixture of 4% SDS and SpA (200 / day) was applied, together with the results of controls.
  • a to D in Fig. 9 were coated with a mixture of 4% SDS and SpA (200 ⁇ 8 / day).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of microscopic observation of changes over time in skin in NC / Nga mice, together with the results of control.
  • the screening method according to the present invention comprises, in vivo or in vitro, an environment forming step of forming an environment for inducing local IL_18 production from keratinocytes (KC) by stimulation with a stimulant; Administering a candidate substance under an environment to identify a substance that inhibits the above-described induction of interleukin 18 production by KC as the inhibitor.
  • an environment forming step of forming an environment for inducing local IL_18 production from keratinocytes (KC) by stimulation with a stimulant Administering a candidate substance under an environment to identify a substance that inhibits the above-described induction of interleukin 18 production by KC as the inhibitor.
  • IL-18 is locally excessively produced from skin KC, which results in high levels of IgE expression in serum There is also. Therefore, by using a screening method including the above-mentioned environment formation step and inhibitor identification step, it is possible to obtain a substance that inhibits IL-18 secretion.
  • the resulting substance (inhibitor) can be an effective therapeutic agent for AD.
  • AD-like inflammatory skin lesion is an immune disease that develops in a IL-18-dependent manner and broadly refers to a condition in which inflammation appears on the skin, and is strictly recognized as AD. It does not mean only pruritic chronic inflammation.
  • in vitro refers to a reaction system artificially reproduced by cultured cells
  • in vivo refers to a reaction system in a complete individual.
  • the “inhibitor” in the present invention may be any substance that inhibits secretion of IL-18 from KC, and the specific mechanism of the inhibition is not particularly limited. Therefore, the inhibitor obtained by the screening method according to the present invention may reversibly or irreversibly inhibit the secretion process of IL-18 from KC. Is also good. In the case of an inhibitor that inhibits reversibly, it may be a competitive (antagonistic) inhibitor (antagonist) or a non-competitive inhibitor. In other words, in the screening method according to the present invention, various types of inhibitors such as those containing an antagonist can be screened.
  • the above-mentioned environment forming step may be any step as long as it forms an environment that induces the production of IL-18 from KC by stimulation with a stimulant, and the detailed conditions for forming the environment are not particularly limited. . In other words, as long as an environment capable of inducing the production of IL-18 can be realized, it may be in vivo or in vitro.
  • the stimulant examples include various proteins capable of stimulating K C (K C stimulating protein).
  • K C stimulating protein The KC stimulating protein is not particularly limited as long as it is a protein capable of stimulating KC.
  • protein A protein A derived from S. aureus is exemplified. ).
  • Staphylococcus aureus infection has been known to be a trigger or exacerbation factor of AD.Furthermore, according to the present inventors, when SpA is applied to mice together with SDS, it is short-term. Among them, it was found that AD-like chronic dermatitis can be induced (see Examples). Therefore, the above SpA can be particularly preferably used as the KC stimulating protein.
  • the above SpA may be a complete protein (a protein having a complete amino acid sequence) obtained from Staphylococcus aureus, but if it can stimulate keratinocytes, a partial protein of SpA or It may be a variant of a complete protein or a partial protein.
  • the above-mentioned variant comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added to a known amino acid sequence of SpA, and a B7-2 molecule Refers to a protein that negatively regulates expression on the cell surface.
  • the above-mentioned “one or several amino acids have been substituted, deleted, inserted, and Z or added” means that substitution or deletion is performed by a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis. Substitutions, deletions, insertions, and / or additions to the extent that amino acids can be lost, inserted, and / or added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and still more preferably 5 or less) Means that.
  • the above-mentioned variant is a mutant protein of the above SpA, and the term "mutation" as used herein mainly refers to a mutation artificially introduced by a known method for producing a mutant protein. Alternatively, the same naturally occurring mutant protein may be isolated and purified. Also The variant of SpA may include an additional polypeptide. It is more preferable to use SDS in addition to SpA as the stimulant. Combined use of SDS and protein A can induce more severe AD-like chronic pruritic dermatitis (see Examples).
  • the method of using 3 and 303 in combination is not particularly limited, but prepare a SpA-SDS solution in which SDS is added to a solvent that dissolves SpA, and apply it to the skin of a model organism. I just need to.
  • the method of stimulating KC by the KC stimulating protein is not particularly limited, and any method can be used as long as it can stimulate KC to induce the production of IL-18.
  • the above-mentioned environment forming step is performed in vitro, the above-mentioned SpA may be added to the culture solution of the cultured cells of KC and cultured.
  • the KC cultured cells used at this time are not particularly limited, and known cultured cells can be suitably used. For example, in Example 6 described below, PAM212 cells are used.
  • the culture conditions of the above KC culture cells that is, the culture solution, the culture temperature, the method of adding SpA, and the like are not particularly limited, and if appropriate conditions are set according to the type of culture cells used. Good.
  • the SpA may be applied to the skin of a host organism.
  • the conditions for applying SpA are not particularly limited, and any method may be used as long as it does not hinder the stimulation of KC by SpA.
  • SpA is used as a PBS solution of 50% glycerol.
  • the present invention is not limited to this.
  • a SpA-SDS solution obtained by adding SDS to SpA may be prepared and applied to the skin of a host organism.
  • the application conditions such as the application method and the site to be applied to the host organism are not particularly limited.
  • the host organism used at this time is not particularly limited, but usually, mammals generally used in various experiments may be used. Specific examples include experimental animals such as mice, rats, rabbits, pigs, and monkeys. An example For example, in Examples described later, a mouse is used as a host organism. In particular, mice have been widely used as experimental animals, and they have a track record of being able to obtain various mutant strains easily. It is preferred because of its advantages.
  • the stimulant may be other than KC stimulating protein such as SpA.
  • skin with AD-like inflammatory skin lesions can be used.
  • An environment in which IL-18 production can be induced can also be realized by transplanting the skin piece of the lesioned skin into a host organism.
  • the lesion skin is not particularly limited as long as the skin has AD-like inflammatory skin lesions, but it is highly preferable that the skin is of the same kind of organism as the host organism from the viewpoint of transplantation. . Heterogeneous organisms are not preferred because they cause an immune response other than AD-like inflammatory skin lesions such as rejection.
  • As the host organism various experimental animals can be mentioned as described in the description of the KC stimulating protein. It is highly preferred that this is the case (see Examples described later).
  • the host organism has at least the following characteristics: (i) expression of CD4 + T cells, (ii) expression of stat6, and (iii) expression of IL-18R ⁇ chain in NKT cells. Both must be provided.
  • the CD4 deficient mouse, stat6 deficient mouse, and IL-18 Ro; chain deficient mouse all used skin pieces of lesion skin obtained from KCAS PIT g mice. Implantation did not induce IgE production. That is, in order to realize an environment capable of inducing the production of IL-18, the above-mentioned traits (i) to (iiii) are necessary conditions.
  • the CD4 + T cells are T cells that express the antigen CD4 (one of the cell membrane glycoproteins of helper cells). The presence or absence of CD4 expression is indicated by a plus or minus sign at the upper right. Therefore, CD4 is expressed In this case, it is indicated by “CD4 + ", and when not expressed, it is indicated by "CD4—”.
  • stat6 STAT6 is an intracellular signal transduction molecule involved in the mechanism of action of cytodynamic force, and is specifically activated by IL-14. It is a structure expressed in T cells and involved in the response of IL-18.
  • the candidate substance is administered in an environment capable of inducing the production of IL-18 formed in the environment formation step, and the induction of the production of interleukin-18 by the keratinocytes is inhibited.
  • the step of identifying a substance can be an inhibitor that inhibits the induction of IL-18 secretion.
  • the method of administering the candidate substance is not particularly limited.
  • a candidate substance may be administered to a culture solution in which cultured cells of KC are cultured.
  • a scavenger substance may be applied to an inflamed site in the host organism, or the host organism may receive the candidate substance.
  • the method for identifying the inhibitor is not particularly limited, and any method may be used as long as it can reliably confirm that induction of IL_18 production by KC is inhibited. Regardless of whether the environment capable of inducing IL-18 production is in vitro or in vivo, a cell-free system using ELISA can be used.
  • the specific method of the screening method according to the present invention is not particularly limited as long as it includes the above-described environment forming step and the step of identifying the inhibitor, and of course includes other steps. Is also good.
  • the present invention includes a therapeutic drug for an immunological disease containing an inhibitor obtained by using the above-mentioned screening method.
  • the specific composition of the therapeutic drug for immunological diseases is not particularly limited, and appropriate compositions may be selected depending on the type of the screened inhibitor and the state of the organism to be administered (including humans). It only needs to contain a buffer and additives.
  • the present invention also includes an inhibitor obtained by using the above-described screening method, and a method for suppressing high-level IgE expression using the above-mentioned drug for treating an immune disease.
  • the present method by using the above-mentioned inhibitors or therapeutic agents for immunological diseases, the local accumulation of IL-18 produced from KC can be used to reduce the systemic IgE response caused without exposure to antigen. Suppress. As a result, it is possible to suppress or inhibit the phenomenon of high-level expression of IgE in serum, which occurs in inflammatory skin diseases such as atopic dermatitis.
  • AD condition can be effectively treated or alleviated.
  • a model organism also includes a method for inducing AD-like symptoms that cause AD-like inflammatory skin lesions.
  • the method for inducing an AD-like symptom according to the present invention comprises the steps of:
  • the C stimulating protein is used as the stimulant
  • any method may be used as long as protein A derived from Staphylococcus aureus is applied to the skin of the host organism.
  • the application conditions and the like at this time are not particularly limited as in the above (1).
  • the protein A may be a complete protein of the protein A, a partial protein of the protein A capable of stimulating keratinocytes, or stimulating keratinocytes. It is sufficient if at least one of the above-mentioned variants of protein A or its partial protein is available.
  • the present invention includes a model organism that has developed an inflammatory skin lesion obtained by the above induction method.
  • the present invention can be suitably used for elucidating the onset mechanism of AD and its similar symptoms and for developing therapeutic drugs.
  • each of the above methods according to the present invention may be realized by a kit. That is, the present invention may include a screening kit for performing the above-described screening method or an induction kit for performing the above-described method for inducing AD-like symptoms.
  • the specific configuration of the screening kit is not particularly limited.
  • a stimulant especially a KC stimulating protein and an accelerating substance
  • various materials used in the inhibitor identification step for example, Sp A (A binding protein and a signal transfer molecule, etc.
  • the specific configuration of the AD-like symptom induction kit is not particularly limited, but may include a configuration including 3 solutions and an application means capable of applying 3 efficiently.
  • the screening method according to the present invention is suitably used for screening a therapeutic drug for an immunological disease for treating AD-like inflammatory skin lesions.
  • the method for inducing AD-like symptoms according to the present invention can be used for elucidating the onset mechanism of AD-like symptoms by artificially causing AD-like symptoms in model animals. It can also be used to verify the effect of the inhibitor obtained by the screening method according to the present invention.
  • a certain inhibitor for example, substance X
  • substance X a certain inhibitor obtained as a screening method according to the present invention by a method of realizing an environment forming step in vitro.
  • a mouse having AD-like symptoms has been produced using the method for inducing AD-like symptoms according to the present invention, and the effect of substance X can be verified in vivo using the mice.
  • the method of using the present invention is not limited to the above example, and it goes without saying that it can be used for various other purposes.
  • the present invention has been described in detail with reference to specific examples.
  • the present invention is not limited to only the above embodiment, and the present invention departs from the gist thereof.
  • the present invention can be implemented in various modified, changed, and modified modes based on the knowledge of those skilled in the art without departing from the scope of the present invention.
  • mice and reagents used in the examples and the details of specific experimental methods are shown below.
  • mice Female C57BL / 6 (B6) wild-type mice (6-10 weeks) were purchased from CLEA Japan.
  • B6 background CD4 deficient mice female, 6-10 weeks) were kindly provided by Dr. Taniguchi of the University of Tokyo.
  • B6 background Stat6-deficient mice female, 6-10 weeks were kindly provided by Dr. Takeda of Osaka University (Takeda, K., Tanaka, T., Shi, W., Matsumoto, M. , Minami, M., Kashiwamura, S., Nakanishi, K., Yoshida, N., Kishimoto, T. and Akira. S., 1996. Essential role of STAT 6 in IL-4 signaling. Nature 380: 627) .
  • Fasp mice female mice suffering from chronic skin diseases with high serum IgE (10--12 ⁇ gZm1) and IL-18 (5-7 ngZm1) were used. Selected and used. Fasp mice (female, 6-10 weeks) obtained by mating caspase-1 deficient mice with B6 wild type mice were used (Seki, ⁇ ⁇ , Tsutsui, H., Tsuji, NM, Hayashi, N., Adachi, K., Nakano, H., Futatsugi-Yumikura, S., Takeuchi, 0., Hoshino, K., Akira, S., Fujimoto, J. and Nakanishi, K. 2
  • myeloid differentiation factor 88-dependent proin f lammatory cytokine release in early phase clearance of Listeria monocytogenes in mice. J. Immunol. 169: 3863).
  • B6 / 129 background myeloid differentiation factor 88 (My D88) deficient mice and Toll-like receptor (TLR) 2 deficient mice F4 mice (females) were provided by Dr. Akira of Osaka University. (See Seki et al). All mice were under sterile conditions.
  • ⁇ reagent ⁇ SpA purified from Staphylococcus aureus Cowan 1 was purchased from Calbiochem.
  • Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli (055; B5) was purchased from Difco. See Non-Patent Document 6 for Murine Fas ligand transfectant (mF as L).
  • the caspase inhibitor z—VAD—F MK (Z VAD), which inhibits a wide range of activities, and the caspase-1 specific inhibitor A c—YCAD—CM K (YVAD) are available from Peptide Institute. Purchased from.
  • RPMI 1640 containing 10% FCS, 100 UZm 1 penicillin, 100 g 1 streptomycin, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 2 mM L-glutamine was used as a normal culture solution.
  • the mouse keratinocyte cell line PAM212 was provided by Dr. Tamaki of the University of Tokyo.
  • Skin specimens (1 cm 2 ) were obtained from normal skin of wild-type B6 mice or skin with lesions (lesion skin) or non-lesioned skin (non-lesioned skin) of KCAS P1 Tg mice. Then, they were transplanted into the back of wild-type B6 mice, CD4-deficient mice, stat6-deleted mice, or IL-18R-deficient B6 mice. As skin specimens, two grafts were obtained for lesional skin or non-lesional skin of KCAS P1Tg.
  • mice After skin transplantation, recipients should drink lmg / ml neomycin sulfate (Sigma) and 1 000 U / m1 polymixin B sulfate (Sigma) to prevent all possible infections. I gave water. Serum was sampled as appropriate to determine IgE concentration.
  • Skin specimens (1 cm 2 ) were obtained from wild-type B6 mice or KC ASP 1 Tg mice, and sheets of epidermis prepared from the skin specimens were in PBS (phosphate buffered saline). , Homogenized at 4 ° C and filtered. The concentration of various cytokines and proteins contained in each lysate was determined by the Using an ELI SA kit, a protein evaluation reagent ( Pierce ) was used.
  • Spleen CD4 + T cells were isolated from mice treated with various methods using AutoMAC S (Miltenyi Biotec). Freshly isolated spleen cells were incubated with anti-CD4 beads (Miltenyi Biotec). The purity of CD4 + T cells is 98 ° /. It was super. The cells (1 ⁇ 10 6 / m 1) were incubated with immobilized anti-CD3 ⁇ (PharMingen) for 48 hours, and the concentration of IFN_T / and IL-14 in each supernatant was measured. It was determined by ELISA.
  • the IL-18 concentration was determined using an MBLI ELISA kit. I L—4, I
  • FN-y and IL_lJ3 were determined using the Genzyme ELISA kit.
  • the ILI-5 ELISA kit was purchased from Endogen.
  • the serum IgE concentration was determined using a PharmMingen ELISA kit.
  • the IFN- ⁇ -inducing ability of IL-18 was determined by bioassay using an IL-18-responsive mouse ⁇ cell clone named LNK series (see Non-Patent Document 6 and others).
  • LNK5E6 cells have higher responsiveness to IL-18 stimulation with respect to IFN- ⁇ production than LNK5E3 cells (see Non-Patent Document 6).
  • the cells were incubated for 48 hours in the presence or absence of an anti-IL-18 antibody (50 / g / m1) with various samples and 100 pgZm1 of IL_12. .
  • the activity of IL-18 is defined as the concentration of IFN- ⁇ produced by cells in response to IL-18 as shown in the following formula (see Non-Patent Document 6).
  • IL-18 activity (IFN-y in supernatant in the absence of anti-IL-18 antibody)-(IFN- in supernatant in the presence of anti-IL-18 antibody).
  • SpA solution Various amounts of SpA were dissolved in 5 ⁇ l of a solvent (50% glycerol in PBS) to prepare (SpA solution), and this SpA solution was transferred to the skin of a wild-type ear. Was applied daily for 14 days. As a control, 5 ⁇ 1 solvent containing no SpA was used. Mice were placed in individual cages to avoid the effects of other mice. [: Preparation of KC]
  • KC is based on the method described by Dr. Tamaki et al. (Vestergaard, C., Yoneyama, H., Murai, M., Nakamura, K., Tamaki, K., Terashima, Y., Imai, T., Yoshie, 0., Irimura, T., Mizutani, H., et al. 1999. Overproduction of Th2-specific chemokine in NC / Nga mice exhibiting atopic dermatitis-like lesions. J. Clin. Invest.
  • KC (5 ⁇ 10 5 , m 1) or PAM 2 12 cells (2 ⁇ 10 5 / m 1) contain various amounts of SpA and 1 g / m 1 of LPS or mF as Incubated with L (1 ⁇ 10 6 / m 1) for 24 hours.
  • the concentration of IL-118 and the activity in each supernatant were determined by ELISA and Bioassay, respectively.
  • KC was incubated with 500 g / m 1 of Sp A for 4 hours to extract total RNA and RT—PCR (Tsutsui, H., Matsui, ⁇ ⁇ , Kawada , N., Hyodo, Y., Hayashi, ⁇ ., Okamura, H., Higashino, K. and Nakanishi, K. 19 97.IL-18 accounts for both TNF--and Fas ligand-mediated hepatotoxic pathways in endotoxin— induced liver injury in mice. J. Immunol. 159: 3961). See Tsutsui et al., Above, for primers for IL-18, IL-12p35, IL-12p40 or j3_actin and PCR for each cytokine.
  • Kupffer cells Preparation of Kupffer cells (Kupper cells) was performed according to Non-Patent Document 6.
  • K upff er cells (1 X 1 0 6 / m 1) is provided with a 1 ⁇ g / m 1 of LPS (lipopolysaccharide) and After incubation for 4 hours, the expression of IL-18, IL-12p35, IL-12p40 and j3-actin was determined as mRNA concentration by RT-PCR.
  • Non-Patent Document 6 an anti-CD 1 1 c antibody conjugated with Fikoeri Trinh ( ⁇ ) (Phar Mingen Co.) full O receptacle in isothiocyanate Xia sulfonates anti I one (FI TC) linked to a b antibody anti CD bound to (PharMingen, Inc.), or anti-CD 4 antibodies conjugated to PE and (Pharm ingen Co.) FITC After incubation with 8 antibodies (PharMingen), determination was made by two-color flow cytometry analysis.
  • Example 1 IgE by transplantation of skin graft from KCAS P1 Tg mouse
  • the possibility of inducing an increase in serum IgE concentration was examined. Specifically, to standardize skin graft conditions for each transplant, chronic dermatitis develops in the ears, face and torso and constant serum IL-18 and IgE concentrations KC AS P 1 Tg mice having the bacterium were selected as donors. Lesioned or non-lesioned skin pieces of KCAS PITg mice were transplanted into normal B6 mice, and the serum IgE concentration of the host was measured. Figure 1 shows the results.
  • FIG. 1 the filled circle in the graph and the photograph above the right side show the results of transplanting the lesion skin of the KCAS P1 Tg mouse into a normal B6 mouse, and the shaded circle and The middle photo on the right shows the results of transplanting the non-lesioned skin of KCAS P1Tg mice, and the square in the graph and the lower photo on the right show the results of transplanting normal skin of wild-type mice. Show.
  • serum was sampled for IgE measurement by ELISA, and the engrafted skin was engrafted. The rate was observed (upper part of FIG. 1: engraftment rate of transplanted skin).
  • the data show the mean and standard deviation of three mice in each experimental group. The survival rate of the transplanted skin is shown in the upper panel.
  • B6 mice implanted with unlesioned skin showed a delayed, weak IgE response, whereas mice implanted with lesioned skin showed IgE in their serum. Concentrations rose early. Control B6 mice transplanted with skin grafts of wild-type mice did not show elevated IgE. B6 mice transplanted with diseased skin show high serum IgE concentrations, but fall off after graft removal. On the other hand, B6 mice transplanted with non-lesional skin maintain low IgE concentrations. In addition, B6 mice transplanted with diseased skin begin to increase serum IgE levels again, even after rejection of the diseased skin.
  • Figures 2A-F the filled bars show the results of lesion skin specimens sampled from two KCAS P1T g mice, and the shaded bars show samples from two KCAS PIT g mice The results for the non-lesioned skin specimens shown are shown, and the open bar graph shows the results for the control skin specimens sampled from three wild-type mice.
  • Figure 2A shows the dissolution of each of the above skin specimens.
  • Figure 2B shows the IL-18 activity (IFN_y production by IL-18 responsive LNK5E6 cells), and
  • Figure 2C shows the IL-18 concentration in FIG. 2D shows the concentration of IFN- ⁇ , FIG. 2 ⁇ shows the concentration of IL-14, and
  • FIG. 2F shows the concentration of IL-5.
  • Each result represents the mean and standard deviation of the results of three independent experiments in each sample. Note that ND indicates that it is not detected.
  • the lysate from the lesion skin of the KCA SP 1 Tg mouse showed a high IL-18 concentration in ELISA, and both the precursor and mature forms of IL-18 were detected.
  • the lysate of non-lesioned skin of KCAS P1Tg mouse showed only a low IL-18 concentration, and the lysate of wild-type mouse skin had the lowest concentration of IL-18.
  • the lesion site on the skin of KCA SP l Tg mice was found to be bioactive 18 kDa IL-18 and 24 kDa IL-18 precursor. It is known that the skin of wild-type mice and the unlesioned skin of KCA SPIT g mice express only the 24 kDa IL-18 precursor. Therefore, in order to confirm this, we performed a PIOA assay for IL-18. As a result, as shown in FIG. 2B, the lesion skin of the KCA SP1Tg mouse showed a high titer of the activity of IFN-T / induction by IL-18. On the other hand, non-lesional skin showed little activity. Further, IL-18 having such a physiological activity is not present in normal skin of B6 mice.
  • IL-1 was also concentrated in KC only in the lesion skin. It is known that in addition to IL-18 and IL-1 jS, other caspase-1 products are also concentrated in KC only in the lesioned skin. Thus, the IgE concentration in the host corresponds to the concentrations of IL18 and IL_1j3 in the transplanted graft.
  • the concentrations of IFN- ⁇ , IL-14 and IL-5 in the lysate of the lesion skin of KCA SP1 Tg mice were measured.
  • the concentrations of IFN-T, IL-4 and IL-15 in the lysate of lesional skin of KCAS P1 Tg mice Dissolution of non-lesional skin of KCA SP 1 Tg mouse All were higher than the demolition.
  • grafts of diseased skin accumulate large amounts of IL-18, IL-lj3, IFN- ⁇ , IL-15 and IL-4.
  • FIG. 3 A ⁇ D is normal skin wild-type mice
  • E is uninvolved skin of KCAS P l Tg mice
  • F were obtained from lesional skin of KCAS P 1 T g mice The results of the obtained KC samples are shown.
  • Figures 3A-C show the results of incubation of each KC specimen with an anti-CD4 antibody conjugated with PE and an anti-CD8 antibody conjugated with FITC
  • Figures 3D-F show the results of incubation with each KC specimen and PE. shows the results of incubation of anti-I- a b antibody conjugated with anti-CD 1 1 c antibody and FI TC bound to.
  • FIGS. 3A to 3F the ratio of CD4 + T cells and CD8 + T cells, and the ratio of CD11 c + DC and I— Ab + DC are shown. Each result represents only one of the three mice in each experimental group.
  • the number of CD4 + T cells was substantially increased in the diseased skin as compared to the wild-type mice. Also, there was no difference in the ratio of CD8 + T cells or DC between these three types of recipients.
  • CD4 + T cells in the host differentiate into Th2 cells after transplantation of the lesioned skin.
  • normal and non-lesioned skin of KCAS P1 Tg mice were compared to normal B6 mice. After transplantation of normal skin from skin or wild-type mice, 21 days later, spleen CD4 + T cells were incubated with immobilized anti-CD3 for 48 hours, and IL-14 concentration in the supernatant (solid bar graph). ) And IFN- ⁇ concentration (open bar graph) were determined by ELISA.
  • Fig. 4 shows the results.
  • the IL-14 concentration is shown as a solid bar graph, and the IFN- ⁇ concentration is shown as a white bar graph.
  • Each data represents the mean and standard deviation of triplicate. Similar results were obtained from three independent experiments. NS indicates no significance.
  • CD4 + T cells of spleen in the host on day 21 were normal host transplanted with normal B6 mouse skin
  • both IL-4 and IFN- ⁇ were produced in large amounts in response to immobilized anti-CD3.
  • CD4 + T cells in the spleen were ⁇ 6 with IL-4 levels comparable to those in recipients transplanted with skin from wild-type mice. IFN- ⁇ was produced (response to plate-bound anti-CD3).
  • CD4 + T cells from recipients transplanted with diseased or non-lesioned skin of KCAS PlTg mouse were converted to normal skin from wild-type mice. Secreted only a similar amount of IL-4 and IFN- ⁇ as CD4 + T cells of the control recipients transplanted with the same.
  • CD4 + ⁇ ⁇ cells require 2-3 weeks from stimulation by transplantation of lesional skin grafts to differentiate into Th1 / Th2 cells.
  • Example 4 Induction of IgE depending on IL-18, CD4 and stat6
  • the mechanism of induction of IgE in lesional skin of KCASP1 Tg mice was analyzed at a cell level.
  • mice excluding CD4 + T cells show no increase in serum IgE concentration even when IL-18 is administered. Therefore, whether host-derived CD4 + T cells are originally required, or donor T cells that produce IL-14 infiltrated into the affected skin (see Fig. 2E). We checked whether the conditions were met.
  • mice wild-type mice, CD4-deficient mice, stat6-deficient mice or IL
  • the lesion skin of a KCAS AS1Tg mouse was transplanted to an 18R ⁇ -deficient mouse.
  • serum was sampled for IgE measurement.
  • the results are shown in FIG. 5A.
  • the open bar graph is the result on day 0, and the solid bar graph is the result on day 21.
  • Each data represents the mean and standard deviation of three mice in each experimental group.
  • CD4 deficient mice did not produce IgE even after transplanting the lesioned skin of KCAS PITg mice, as shown in Figure 5A. These results indicate that IL-4 producing cells or IL-18 in grafts of lesion skin of KCA SPIT g mice induce a systemic increase in Ig E without host CD4 + T cells Suggests that you cannot do that.
  • stat6 is indispensable for IL-14 signal transduction
  • stat6 activation is critical for IgE induction.
  • Deficient mice do not show any increase in IgE after transplantation of diseased skin. This result suggests that the IgE response induced by the lesional skin graft is dependent on host-derived CD4 + T cells and stat6.
  • transplantation of normal skin from B6 mice also did not induce Ig E production in hosts lacking CD4 + T cells or stat6.
  • induction of IgE by skin transplantation occurs only when the host has intact CD4 + T cells and stat6.
  • mice transplanted with diseased skin were used to express CD4 + T cells (Fig. 4), the differentiation into Th1 / Th2 cells was also dependent on IL-18 present in the graft of lesioned skin. I checked what to do.
  • mice normal skin of ⁇ 6 wild-type mice or lesion skin of KCAS ⁇ 1 Tg mice were transplanted into IL-118R ⁇ -deficient mice. 2 On day 1, spleen CD4 + T cells were isolated from the recipient, stimulated with immobilized anti-CD3, and the produced IL-4 and IFN-y were measured by ELISA. The results are shown in FIG. 5B.
  • the open bar graph is the result of IFN—, and the solid bar graph is the result of IL-14.
  • Each data represents the mean and standard deviation of three mice in each experimental group. NS indicates no significance.
  • CD4 + T cells from IL-18Ra-depleted mice transplanted with grafts of diseased skin were transformed into IL-18R cells from normal skin of wild-type mice. No differences were observed in the production of IL-14 or IFN-0 compared to CD4 + ⁇ cells of the deficient mice. This result indicates that the differentiation of Th1 / Th2 cells through the graft of the diseased skin may be dependent on IL-18 released from the graft.
  • Example 5 Induction of IL-18 and IgE by SpA in vivo Infection with Staphylococcus aureus exacerbates inflammatory changes in the skin, sometimes in AD patients, and in some AD patients It is known that IL-18 concentration increases. Therefore, it was investigated whether the product of S. aureus could cause a systemic increase in IL-18 in normal B6 mice.
  • mice were applied once daily at various doses of SpA or solvent alone for two weeks. Thereafter, on day 14, serum spleens were sampled to determine the concentration of IL-18 or IgE.
  • spleen CD4 + T cells from mice spiked with solvent or SpA 100 gZ days were incubated with plate-bound anti-CD3 for 48 hours, and IFN- ⁇ and IL-14 concentrations in each supernatant was measured by ELIS II. The results are shown in Figs.
  • FIG. 6A shows the result of IL-18
  • FIG. 6B shows the result of IgE.
  • Figure The open bar graph at 6 C shows the results for IFN- ⁇
  • the solid bar daraf shows the results for IL-4.
  • Fig. 6 The data in ⁇ and ⁇ show the mean and standard deviation of three mice in each group.
  • the data in FIG. 6C shows the mean and standard deviation of the three samples, showing data for one of the three mice in each group.
  • ND indicates no detection and NS indicates no significance.
  • the level of IL-18 in serum was It increased in a dependent manner, but not in the mice to which only the solvent was applied.
  • mice coated with SpA or solvent were not detected by ELISA.
  • the IgE level also increased in a dose-dependent manner.
  • mice treated with SpA did not show Th2 cell predominant differentiation.
  • IL-18 can induce IgE without IL-12, and inhibits IgE induction when IL-12 is present. So far, it has been known that stimulants including LPS (lipopolysaccharide) which induce secretion of IL-18 always cause production of IL-12. It is then necessary to determine which cell types secrete IL-18 in response to SpA and that these cells secrete IL-18 without producing IL-12. Examined.
  • LPS lipopolysaccharide
  • PAM2 12 cells (a mouse KC culture) were incubated with or without SpA for 24 hours, and the IL-18 concentration and IL-18 in each supernatant were incubated.
  • the biological activity of inducing IFN- ⁇ was measured by ELISA and bioassay, respectively.
  • FIG. 7A the left side shows the concentration of IL-18, and the right side shows the activity of inducing IFN- ⁇ .
  • the data in FIG. 7A shows the average and standard deviation of the three values. Also, ND is not detected It indicates that.
  • PAM2 12 cells secrete an active form of IL-18, which can induce IFN- ⁇ production.
  • wild-type B6 mouse KCs were incubated with various doses of SpA for 24 hours to demonstrate whether newly isolated KCs secreted IL-18 in response to SpA. .
  • FIG. 7B KC prepared from the skin of wild-type B6 mice is shown as a solid bar graph, CD11. The ratio of 1: cells excluding + cells is shown by an outline bar graph.
  • KC As shown on the left side of FIG. 7B, freshly isolated KC released IL-18 in a dose-dependent manner in response to SpA. Since LCZDC can release IL-18, CD11c + cells were removed from KC specimens and they were incubated with SpA. Even after removing the CD11c + cells, KC secreted IL-18 upon stimulation with SpA, as shown on the right side of FIG. 7B. Note that the data in FIG. 7B shows the average and standard deviation of the three values. Also, ND indicates that it is not detected.
  • caspase-1 is required for IL-18 secretion by LPS (lipopolysaccharide) induction.
  • LPS lipopolysaccharide
  • KC was prepared from wild-type mice, caspase-1 deficient mice, TLR2-deleted mice, or MyD88-deleted mice, and KC of wild-type mice was 20 / ⁇ Z VAD, 2 Incubated with 500 ⁇ g / ml SpA for 24 hours in the presence of 0 MYVAD or the same volume of DMS O (Veh). At the same time, KC of each of the above mutants was incubated with 500 ⁇ g / ml SpA for 24 hours. Was. IL-18 in each supernatant was measured by ELISA. The results are shown in Figure 7C.
  • WT indicates wild-type mice
  • KO indicates mice of the above mutants (knockout type)
  • open bars indicate caspase-1 deficient mice
  • shaded bars indicate TLR2 deficient mice.
  • the hatched bar indicates the MyD88 deletion mouse.
  • the KC of wild-type mice incubated with 500 ⁇ g / m1 SpA without DMSO was 28.4 ⁇ 3.53 / 1111. 1 1 ⁇ — 1 8 was produced.
  • the KC of caspase_l-deficient mice secretes IL-18 at a level comparable to that of wild-type mice. This suggests caspase-1-independent secretion of IL-18 for SpA stimulation.
  • the data in Fig. 7C shows the average and standard deviation of the three values.
  • YVAD a caspase-1 inhibitor, and ZVAD, which inhibits a wide range of caspases, potently stimulate IL-18 secretion from Kupffer cells, liver tissue macrophages stimulated by LPS or membrane-bound Fas ligand. Inhibit. Therefore, it was examined whether the secretion of IL-18 was affected by YVAD or Z VAD in KC stimulated with SpA. As shown in FIG. 7C, these two caspase inhibitors did not inhibit IL-18 secretion from the wild-type mice stimulated with SpA. This result indicates that ca spase is not required for IL-18 secretion from KC stimulated by SpA. Data are not shown, but the same can be said for Kasp with caspase-1 deletion mouse.
  • KC is an essential adapter molecule shared by TLR2, a signal receptor for Gram-positive bacteria, or by all TLR members We examined whether it secretes IL-118 depending on My D88. As shown in Fig. 7C, both TLR2 and MyD88 are not required for IL-18 secretion from KC induced by SpA stimulation. The induction of secretion of 8 suggests IL-18 secretion independent of TLRs.
  • Kupffer cells respond to stimulation with LPS or Fas ligand with a membrane phenotype.
  • KC 5 ⁇ 10 5 / m 1
  • KC 500 ⁇ g m 1 Sp A, 1 ⁇ g ⁇ 1 LPS, or 1 ⁇ 1 O
  • m1 as mF as L was measured by ELISA. The results are shown in Table 1.
  • total RNA was obtained from KC incubated with SpA for 4 hours, and RT-PCR was performed using this.
  • KC of wild-type B6 mice and Kupffer cells were cultured in the presence or absence of SpA at 5 OO ⁇ g / m1 and in the presence of 1 ⁇ g / 1 LPS. Alternatively, each was incubated for 4 hours in the absence.
  • the expression levels of mRNA of IL-18, IL-12p40, IL-12p35 and; 3-actin in the extracted total RNA were measured by RT-PCR. The result is shown in FIG. 7D.
  • KC neither IL-12p35 nor IL-12p40 was detected.
  • RT-PCR against IL-12 was performed using total RNA from KC incubated with SpA for 8 or 16 hours, but none of them was detected.
  • IL-12 was also measured with ELISA, but the supernatant of KC stimulated with SpA after 24 hours of incubation contained IL-12p40 or IL-1 2 p 7 ⁇ was not detected.
  • Kpf in Kupffer cells constitutively expressed 'IL-18, and the level of expression did not change after stimulation with SpA'. Also, although no data are shown, Kupffer cells did not secrete IL-112 or IL-18 in response to SpA.
  • Example 7 Skin lesions in NCZNga mice coated with a mixture of SDS and SpA]
  • NC / Nga mice are atopic dermatitis-prone mice that do not develop in SPF but develop when they are moved to a conventional environment.
  • SDS or SpA 200 g / day alone was applied to NC / N ga mice alone, the disease did not develop, but when both were mixed and applied to the shaved back of NC / N ga mice, AD Similar skin lesions are observed.
  • FIGS. 8A to 8D show the results of skin lesions in NC / Nga mice to which a mixture of 4% SDS and SpA (200 g / day) was applied, together with the results of controls. As shown in Fig. 8C, no onset was observed after 28 days when only 4% SDS was applied, but when a mixture of 4% SDS and S pA (200 ⁇ ⁇ day) was applied, As shown in FIGS. 8B and 8D, AD-like skin lesions were observed 14 days and 28 days later.
  • a to D in FIG. 9 show the time course of the skin in NCZN ga mice coated with a mixture of 4% SDS and SpA (200 ig / day) together with the results of the control.
  • a to C in FIG. 9 show the results of observing AD-like lesion skin stained with hematoxylin and eosin with a light microscope.
  • FIG. 9A shows the observation result at 25 ⁇ magnification
  • FIG. 9B shows the observation result at 50 ⁇ magnification
  • FIG. 9C shows the observation result at 100 ⁇ magnification.
  • Figure 9D shows the results of observation of AD-like lesion skin stained with Alcian blue using an optical microscope. As shown in FIG.
  • IL-118 from KC causes a systemic IgE response without exposure to antigen, and this is caused by the serum produced in AD-like inflammatory skin lesions.
  • a screening method realized based on the knowledge that it leads to the phenomenon of high-level IgE expression, a method of inducing Aatby dermatitis-like symptoms, and use thereof.
  • the present invention demonstrates the importance of IL-18 production from KC induced by microbial stimulation and provides new insights into mechanisms that may be involved in the pathogenesis of allergic diseases with unknown antigens In addition, it can be effectively used for the development of therapeutic drugs for AD.
  • the present invention can be suitably used not only in various pharmaceutical industries and research reagent industries, but also in the medical field. Therefore, the present invention demonstrates the importance of IL-18 production from microbial stimulation and provides new insights into the mechanisms that may be involved in the pathogenesis of allergic diseases due to unknown antigens. It can be used effectively for the development of therapeutic agents for AD.

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Abstract

　ケラチノサイト（ＫＣ）からのインターロイキン１８（ＩＬ−１８）の産生の誘導現象を利用して、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能な各種方法とその利用方法とを提供する。例えば、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ（ＳｐＡ）をマウス等の皮膚に塗布したり、ＡＤ様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片をマウス等に移植したりすることで、ＡＤ様の病変において生ずる血清中の高レベルのＩｇＥ発現を再現することができる。これにより、例えば、ＫＣによるＩＬ−１８産生誘導の阻害剤をスクリーニングすることが可能になる。

Description

明 細 書 ケラチノサイトによるインターロイキン 1 8の産生の誘導現象を利用した阻害剤 のスクリーニング方法、 およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、 並びにその 利用 技術分野
本発明は、 ケラチノサイトからのインターロイキン 1 8の産生の誘導現象を利 用した阻害剤のスクリーニング方法、 およぴァトビー性皮膚炎様症状の誘導方法、 並びにその利用に関するものであり、 特に、 アトピー性皮膚炎やその類似症状の 発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能なスクリーニング方 法、 およびアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法、 並びにその利用に関するもので ある。 背景技術
皮膚は体のなかで最も大きな器官であり、 生体防御の最前線である。 表皮はケ ラチノサイ ト （K C、 角化細胞） 、 メラニン細胞、 表皮ランゲルハンス細胞 （L C ) および上皮内 T細胞等からなる。
L Cは未成熟な樹状細胞 （D C ) であり、 その機能は局部的に暴露されたタン パク質抗原を捕獲して、 獲得的免疫反応が一般的に行われる領域リンパ節に運搬 することである。 リンパ節への移動の間に、 L Cは抗原提示能を有する成熟 D C に変化する。 その結果、 L C ZD Cが運ぶ抗原に対して特異的な全身性免疫応答 が引き起こされる。 このように、 皮膚の抗原特異的な免疫応答は、 同じ抗原に対 する全身性免疫応答と密接に関連する。 したがって、 皮膚と免疫臓器は、 L C / D Cの循環と抗原特異的な免疫細胞を通して相互に密接に関連していると考えら れる。 これに対して、 K Cとメラニン細胞は皮膚に定住し、 基本的には獲得免疫 応答にあずからない。
しかしながら、 K Cは皮膚局所における自然免疫応答と炎症の誘導に寄与する 可能性が示唆される。 微生物が皮膚に感染すると、 ホストは炎症反応、 ついで獲 得免疫反応を皮膚限局性に展開する。 その際、 皮膚を構成する KCおよび LCが 、 それぞれの応答に深く関与すると考えられる。 したがって、 微生物や化学試薬 による刺激に対してさまざまなサイトカインを産生するというユニークな性質に 基づき、 KCは LCに影響を与え、 その結果獲得免疫応答を変化させる可能性が 考えられる （非特許文献 1 · 2参照） 。 これらの事実を踏まえると、 KCが引き 起こした皮膚の炎症が全身性免疫反応にも影響するかを決定することは重要であ る。
本発明者は、 以前に、 KC特異的に caspase- 1を発現し、 インターロイキン 1 8 ( I L— 1 8) およびインターロイキン 1 ( I L— l jS) に依存する方法で アトピー性皮膚炎 （atopic dermatitis, AD) 様の皮膚炎症 （搔痒性慢性炎） を発症する、 caspase-l—トランスジエニックマウス （KCAS P l T gマウス ) を確立している （非特許文献 3 · 4参照） 。 また、 本発明者は、 I L一 1 ]3が 、 I L一 1 8の AD様の皮膚炎症を誘導する能力を増強させることも示している (非特許文献 4参照） 。 これらの結果から、 KCは I L— 1 8および I L_ 1 を含めた多くのサイ トカインの産生により全身性免疫応答にも寄与する可能性が あることが示唆される。
ところで、 上記 I L一 1 8および I L— 1 は、 生物学的に不活性な前駆体と して産生され、 caspase - 1のような適切な細胞内酵素により切断された後活性型 として放出される （非特許文献 5〜 9参照） 。
上記 I L— 1 8は共存するサイトカインの種類に応じて、 多様な生理活性を示 す。 特に、 インターロイキン 1 2 ( I L— 1 2) の存在下で、 I L— 1 8は強い 炎症誘導性のサイ トカインである I FN— γを誘導し、 その結果炎症反応を促進 する （非特許文献 1 0) 。 これとは対照的に、 I L— 1 2が存在しない場合、 I L一 1 8は、 Th 2サイトカインの産生の誘導を通してァトピー応答を誘導する (非特許文献 1 1〜 14参照） 。
上記 ADは、 外的刺激に対する炎症性皮膚病変で、 慢性反復性の強い搔痒を伴 う疾患である。 発症には、 遺伝的背景があり、 患者はその血清中に高いレベルの I g Eを有するが、 その発症機序については不明な点が多い。 AD発症のメカ- ズムについては、 活性化 T細胞、 好塩基球、 肥満細胞が深く関与する。 特に、 アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球の活性化の結果、 T h 2サイ トカインとケミカルメディエーターの産生が起こり、 その結果、 A Dが発症する と考えられている。 上記アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球の活性化は、 これら細胞上の F c e R (好塩基球の I g E抗体に対する F c受容体 （F c R ) ) に結合した I g E分子の架橋による。 上記 T h 2サイト力インとして重要なも のは、 インターロイキン 4 ( I L - 4 ) 、 インターロイキン 5 ( I L - 5 ) 、 ィ ンターロイキン 9 ( I L - 9 ) 、 インターロイキン 1 3 ( I L - 1 3 ) 等が挙げ られる。 ケミカルメディエーターとして重要なものとしては、 ヒスタミン、 セロ トニン、 ロイコ トルエン等が挙げられる。
ところで、 黄色プドウ球菌 （Staphylococcus aureus) 感染が、 状況によつ ては A D患者の皮膚の炎症変化を悪化させること （非特許文献 1 5 · 1 6参照） 、 さらには、 一部の A D患者では血清 I L— 1 8濃度が上昇する （非特許文献 1 7参照） ことが知られている。 すなわち、 黄色ブドウ球菌の感染が、 A Dの誘引 あるいは増悪因子であることはこれまで知られている。 しかしながら、 A Dの発 症に黄色ブドウ球菌がどのように関与するのかについては不明な点が多い。
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現状では、 A Dの発症機構については不明な点が多く、 それゆえ、 A Dの有効 な治療薬剤の開発には、 多くの困難が伴っている。
上記のように、 表皮を構成する各種細胞が、 様々な免疫応答に関与することが 知られており、 例えば、 近年、 榭状細胞が抗原提示細胞として獲得免疫応答を誘 導することが報告されている。 しかしながら、 表皮を構成する最も主たる細胞で ある K Cについては、 ホストの免疫応答にどのように関与するかについては明ら かになつていない。
任意の疾患について有効な治療薬剤を開発する場合、 その発症機構を解明し、 それを利用して薬理作用のある物質をスクリ一ユングすることは重要な手法の一 つである。 しかしがなら、 A Dの発症においては、 K Cの関与や黄色ブドウ球菌 の感染も含めて不明な点が多く、 それゆえ、 スクリーニングも含めた A Dの治療 薬剤の開発にこれらを応用する技術については、 これまでほとんど知られていな かった。
本発明は、 上記の課題に鑑みなされたものであって、 その目的は、 じからの I L一 1 8の産生の誘導現象を利用して、 ァトビー性皮膚炎やその類似症状の発 症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用いることが可能な各種方法とその利用 方法とを提供することにある。 発明の開示
本発明者は、 上記課題に鑑み鋭意検討した結果、 黄色ブドウ球菌由来のプロテ イン Aが K Cを刺激して I L _ 1 8の産生を誘導することを、 インビトロ （in vitro) およびインビボ （in vivo) の系で実証し、 本発明を完成させるに至った。 すなわち、 本発明にかかるスクリーニング方法は、 上記の課題を解決するため に、 ァトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずるインター ロイキン 1 8の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリーニング方法であって 、 in vivoまたは in vitroにて、 刺激剤による刺激でケラチノサイトからのイン ターロイキン 1 8の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、 当該環境の 下にて候補物質を投与して、 上記ケラチノサイ トからのインターロイキン 1 8の 産生誘導を阻害する物質を、 上記阻害剤として同定する阻害剤同定工程とを含む ことを特徴としている。
上記スクリーニング方法においては、 上記刺激剤として、 黄色ブドウ球菌由来 のプロテイン A、 ケラチノサイ トを刺激することが可能な上記プロテイン Aの部 分タンパク質、 または、 ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテイン Aまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることが好 ましい。 さらに、 上記刺激剤として、 プロティン Aに加えてドデシル硫酸ナトリ ゥム （S D S ) を併用することがより好ましい。
また、 上記スクリーニング方法において、 上記環境形成工程がインビト口にて 実施される場合、 ケラチノサイ トの培養細胞の培養液に上記プロテイン Aを添加 して培養することにより、 上記環境の形成を実現してもよいし、 上記環境形成ェ 程がインビボにて実施される場合、 上記プロテイン Aをホストとなる生物の皮膚 に塗布することで、 上記環境の形成を実現してもよい。
さらに、 上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、 上記刺激剤として 、 アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片を用い、 当該皮膚片をホ ストとなる生物に移植することで、 上記環境の形成を実現してもよい。
ここで、 上記ホストとなる生物は、 少なくとも、 C D 4 +T細胞の発現、 stat6 の発現、 および N K T細胞における I L一 1 8 R α鎖の発現という各形質を何れ も具備していることが好ましい。 上記ホストとなる生物は、 例えばマウスが好ま しく用いられる。
また、 本発明には、 上記クリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含む免疫 疾患治療薬剤が含まれる。 さらに、 本発明には、 アトピー性皮膚炎様の炎症性皮 膚病変を有する生物において生ずる血清中の高レベルの I g E発現を抑制する方 法であって、 上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、 または、 上記免 疫疾患治療薬剤を用いて、 ケラチノサイトから産生されたインターロイキン 1 8 の局所的な集積によっておこる、 抗原への暴露なしに引き起こされる全身性の I g E応答を抑制する方法も含まれる。
本発明にかかるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法は、 モデル生物に、 アトピ 一性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を発症させるァトピー性皮膚炎様症状の誘導方法 であって、 黄色ブドウ球菌由来のプロティン Aをモデル生物の皮膚に塗布するこ とを特徴としている。
上記誘導方法においては、 上記プロテイン Aとして、 当該プロテイン Aの完全 タンパク質、 ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテイン Aの部分タ ンパク質、 または、 ケラチノサイトを刺激することが可能な上記プロテイン Aま たはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかを用いることができる。 さ らに、 上記プロテイン Aをモデル生物の皮膚に塗布するときには、 S D Sを併用 することが好ましい。
また、 本発明には、 上記誘導方法により得られる、 炎症性皮膚病変を発症した モデル生物が含まれ、 このモデル生物の一例としてマウスを挙げることができる 本発明の利用方法としては、 例えば、 上記スクリーニング方法を行うためのス クリーニングキットゃ、 上記誘導方法を行うためのァトビー性皮膚炎様症状の誘 導キットを挙げることができる。
上記各方法によれば、 アトピー性皮膚炎 （A D ) 様の炎症性皮膚病変において、 ケラチノサイトから産生された I L— 1 8の局所的な集積が、 抗原への暴露なし に全身性の I g E応答を引き起こすことを利用している。 それゆえ、 上記各方法 は、 アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適 に用いることが可能となる。
本発明のさらに他の目的、 特徴、 および優れた点は、 以下に示す記载によって 十分わかるであろう。 また、 本発明の利益は、 添付図面を参照した次の説明で明 白になるであろう。 図面の簡単な説明
図 1は、 KC AS P 1 T gマウスの病変皮膚を移植することによる、 ホストで の I g E誘導の結果をコントロールの結果とともに示す図である。
図 2の A〜Fは、 KC AS P 1 T gマウスの病変皮膚における I L_ 1 8の集 積を、 コントロールの結果とともに示す図である。
図 3の A〜Fは、 KCAS P 1 T gマウスの病変皮膚における C D 4 +T細胞 の集積を、 コントロールの結果とともに示す図である。
図 4は、 病変皮膚を移植されたホストにおいて Th 2細胞の選択的な分化が欠 失することを、 コントロールの結果とともに示す図である。
図 5の Aおよび Bは、 I g E誘導のためのホス ト C D 4+T細胞、 ホス ト stat6 およびホスト I L— 1 8応答性、 並びに Th 1 /T h 2細胞の発生の結果 を、 コントロールの結果とともに示す図である。
図 6の A〜Cは、 in vivo での S p A処理による I L— 1 8および I g Eの誘 導の結果を、 コントロールの結果とともに示す図である。
図 7の A〜Dは、 S p Aによる刺激を受けた じから、 11^_ 1 2ではなく 1
L- 1 8のみが放出される結果を、 コントロールの結果とともに示す図である。 図 8の A〜Dは、 4%SDSと S pA (200 /日） の混合物を塗布した NC/N g aマウスにおける皮膚病変の結果を、 コントロールの結果とともに示 す図である。
図 9の A〜Dは、 4%SDSと S pA (200 μ 8/日） の混合物を塗布した
NC/Ng aマウスにおける皮膚の経時変化を顕微鏡で観察した結果を、 コント ロールの結果とともに示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 ケラチノサイトから産生された I L一 1 8の局所的な集積が、 抗原への暴露なしに全身性の I g E応答を引き起こし、 これがアトピー性皮膚炎 様の炎症性皮膚病変につながることを見出した。 本発明では、 上記知見を利用し て、 特に、 アトピー性皮膚炎やその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発 に好適に用いることが可能な阻害剤のスクリーニング方法、 およびァトビー性皮 膚炎様症状の誘導方法、 並びにその利用方法を実現した。 以下、 本発明について 具体的に説明する。
( 1 ) 本発明にかかるスクリーニング方法
本発明にかかるスクリーニング方法は、 in vivo または in vitro にて、 刺激 剤による刺激でケラチノサイ ト （K C ) からの局所的な I L _ 1 8の産生を誘導 する環境を形成する環境形成工程と、 当該環境の下にて候補物質を投与して、 上 記 K Cによるインターロイキン 1 8の産生誘導を阻害する物質を、 上記阻害剤と して同定する阻害剤同定工程とを含んでいる。
アトピー性皮膚炎 （A D ) 様の炎症性皮膚病変では、 皮膚の K Cから I L一 1 8が局所的に過剰に産生され、 これにより血清中において高レベルの I g Eの発 現が見られる場合もある。 そこで、 上記環境形成工程および阻害剤同定工程を含 むスクリーニング方法を用いることにより、 I L— 1 8の分泌を阻害する物質を 得ることが可能になる。 得られた物質 （阻害剤） は、 A Dの有効な治療薬剤とな り得る。
なお、 本発明でいうところの A D様の炎症性皮膚病変とは、 I L— 1 8依存的 に発症する免疫疾患で、 皮膚に炎症が現れる症状を広く指すものとし、 厳密に A Dと認識される搔痒性慢性炎のみを指すものではなレ、。
また、 本発明における 「in vitro (インビトロ） 」 とは、 培養細胞により人工 的に再現される反応系を指すものとし、 「in vivo (インビボ） 」 とは、 完全な 個体における反応系を指すものとする。
さらに、 本発明でいうところの 「阻害剤」 は、 K Cからの I L— 1 8の分泌を 阻害する物質であればよく、 その阻害の具体的なメカニズムは特に限定されるも のではない。 したがって、 本発明にかかるスクリーニング方法で得られる阻害剤 は、 上記 K Cからの I L一 1 8の分泌の過程を可逆的に阻害するものであっても よいし、 不可逆的に阻害するものであってもよい。 また、 可逆的に阻害する阻害 剤の場合、 競合型 （拮抗型） の阻害剤 （拮抗剤） であってもよいし、 非競合型の 阻害剤であってもよい。 換言すれば、 本発明にかかるスクリーニング方法では、 拮抗剤を含む等の様々な種類の阻害剤をスクリーニングすることができる。 ぐ環境形成工程 > 上記環境形成工程は、 刺激剤による刺激で K Cからの I L一 1 8の産生を誘導 する環境を形成する工程であればよく、 環境形成に闋する詳細な条件については 特に限定されるものではない。 つまり、 上記 I L一 1 8の産生を誘導できる環境 を実現できれば、 in vivoであっても in vitroであってもよい。
上記刺激剤としては、 K Cを刺激することが可能な各種タンパク質 （K C刺激 タンパク質） を挙げることができる。 当該 K C刺激タンパク質としては、 K Cを 刺激することが可能なタンパク質であれば特に限定されるものではないが、 代表 的なものとして、 黄色ブドウ球菌 （S. aureus) 由来のプロテイン A ( S p A) が挙げられる。
前述したように、 黄色ブドウ球菌の感染が、 A Dの誘引あるいは増悪因子であ ることはこれまで知られており、 さらに、 本発明者らによって、 S p Aをマウス に S D Sとともに塗布すると短期間のうちに A D様の搔痒性慢性皮膚炎を誘導で きることが見出された （実施例参照） 。 したがって、 K C刺激タンパク質として 、 上記 S p Aを特に好ましく用いることができる。
上記 S p Aは、 黄色プドウ球菌から得られる完全タンパク質 （完全なアミノ酸 配列を有するタンパク質） であってもよいが、 ケラチノサイ トを刺激することが 可能であれば、 S p Aの部分タンパク質や、 完全タンパク質または部分タンパク 質の改変体であってもよい。
上記改変体とは、 公知の S p Aのアミノ酸配列において、 1個または数個のァ ミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 およびノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 B7 - 2分子の細胞表面における発現を負に制御するタンパク質を指すものと する。 また、 上記 「1個又は数個のアミノ酸が置換、 欠失、 揷入、 および Zまた は付加された」 とは、 部位特異的突然変異誘導法等の公知の変異タンパク質作製 法により置換、 欠失、 挿入、 および/または付加できる程度の数 （好ましくは 1 0個以下、 より好ましくは 7個以下、 さらに好ましくは 5個以下） のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加されることを意味する。 このように、 上 記改変体は、 上記 S p Aの変異タンパク質であり、 ここにいう 「変異」 は、 主と して公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味ずるが、 天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。 また 、 上記 S p Aの改変体は、 付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。 また、 上記刺激剤としては、 S p Aに加えて SDSを併用することがより好ま しい。 SDSとプロテイン Aとを併用することにより、 より激しい AD様の搔痒 性慢性皮膚炎を誘導することができる （実施例参照） 。 3 と 303との併用 方法については特に限定されるものではないが、 S p Aを溶解する溶媒に SDS を加えた、 S p A—SDS溶液を調製し、 これをモデル生物の皮膚に塗布すれば よい。
<KCの刺激手法 >
上記 K C刺激タンパク質による K Cの刺激手法については特に限定されるもの ではなく、 KCを刺激して I L— 1 8の産生を誘導できる手法であればよい。 具 体的には、 例えば、 上記環境形成工程が in vitroにて実施される場合、 KCの培 養細胞の培養液に上記 S p Aを添加して培養すればよい。 このとき用いられる K Cの培養細胞については特に限定されるものではなく、 公知の培養細胞を好適に 用いることができる。 例えば、 後述する実施例 6では、 PAM2 1 2細胞を用い ている。
上記 KCの培養細胞の培養条件、 すなわち培養液や培養温度、 S pAの添加の 仕方等についても特に限定されるものではなく、 用いられる培養細胞の種類に応 じて適当な条件を設定すればよい。
一方、 上記環境形成工程が in vivoにて実施される場合、 上記 S pAをホスト となる生物の皮膚に塗布すればよい。 S p Aを塗布する条件は特に限定されるも のではなく、 S p Aによる KCの刺激を妨げない方法であればよい。 例えば、 後 述する実施例では、 S p Aを 50 %グリセロールの P B S溶液として用いている 力 もちろん、 本発明はこれに限定されるものではない。 また、 上述したように 、 S p Aに S D Sを加えた S p A— S D S溶液を調製し、 これをホスト生物の皮 膚に塗布してもよい。 なお、 塗布条件、 例えば塗布方法やホスト生物に塗布する 部位についても特に限定されるものではない。
このとき用いられるホスト生物としては、 特に限定されるものではないが、 通 常は、 一般的に各種実験に用いられている哺乳動物を用いればよい。 具体的には 、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ、 サル等の実験動物を挙げることができる。 例 えば、 後述する実施例では、 ホスト生物としてマウスを用いている。 特に、 マウ スは実験動物として広く用いられており、 種々の突然変異体の系統が入手容易で ある等の実績があること、 個体が小さいために飼育用のスペースを比較的小さく できること、 等の利点があるため好ましい。
<皮膚片の移植 >
上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、 上記刺激剤として S pA等 の KC刺激タンパク質以外のものを用いることができる。 代表的なものとして、 AD様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚 （病変皮膚） を用いることができる。 この 病変皮膚の皮膚片をホスト生物に移植することによつても、 I L— 1 8の産生を 誘導できる環境を実現することができる。
上記病変皮膚は、 AD様の炎症性皮膚病変が生じている皮膚であれば特に限定 されるものではないが、 移植の関係から、 ホス ト生物と同種の生物の皮膚である ことが非常に好ましい。 異種の生物の場合、 拒絶反応のような AD様の炎症性皮 膚病変以外の原因で免疫応答が生じるため好ましくない。 上記ホスト生物として は、 KC刺激タンパク質に関する説明でも述べたように、 各種実験動物を挙げる ことができるが、 例えば、 ホス ト生物としてマウスを用いる場合、 移植される病 変皮膚の皮膚片もマウス由来であることが非常に好ましい （後述する実施例参照 ) 。
ここで、 上記ホスト生物は、 少なく とも、 （ i ) CD 4+T細胞の発現、 （ i i ) stat6の発現、 および （ i i i ) N K T細胞における I L一 1 8 R α鎖の発 現という各形質を何れも具備している必要がある。 後述する実施例 4の結果から 明らかなように、 CD4欠失マウス、 stat6欠失マウス、 I L一 1 8 Ro;鎖欠失 マウスは、 何れも KCAS P I T gマウスから得られる病変皮膚の皮膚片を移植 しても I g Eの産生が誘導されなかった。 すなわち、 I L一 1 8の産生を誘導で きる環境を実現するためには、 上記 （ i ) 〜 （ i i i ) の各形質が必要な条件と なる。
なお、 上記 CD 4+T細胞とは、 抗原 CD 4 (ヘルパー細胞の細胞膜糖タンパ ク質の一つ） を発現する T細胞を示す。 CD 4の発現の有無については、 右上付 きのプラスまたはマイナスで示す。 それゆえ、 CD4については、 発現している 場合には 「C D 4 +」 で示し、 発現していない場合には 「C D 4—」 で示す。 また 、 上記 stat6 (STAT6) は、 サイト力インの作用機構に関与する細胞内シグナル伝 達分子で、 I L一 4で特異的に活性化されるものであり、 上記 I L一 1 8 R «鎖 は、 T細胞に発現し I L _ l 8の応答に関与する構造である。
く阻害剤同定工程 >
上記阻害剤同定工程では、 上記環境形成工程で形成された I L一 1 8の産生を 誘導できる環境の下にて候補物質を投与して、 上記ケラチノサイトによるインタ 一ロイキン 1 8の産生誘導を阻害する物質を同定する工程であれば特に限定され るものではない。 この工程で同定された物質が、 I L— 1 8の分泌の誘導を阻害 する阻害剤となり得る。
上記候補物質を投与する手法は特に限定されるものではない。 例えば、 in vit roであれば、 K Cの培養細胞を培養している培養液に候補物質を投与すればよい 。 また、 in vivoであれば、 ホスト生物における炎症部位に候捕物質を塗布して もよいし、 ホスト生物に候補物質を内服させてもよい。 また、 上記阻害剤を同定 する手法も特に限定されるものではなく、 K Cによる I L _ 1 8の産生誘導が阻 害されていることが確実に確認できるような方法であればよい。 I L一 1 8の産 生を誘導できる環境が in vitroであっても in vivoであっても、 E L I S Aを用 いた cell - free system等を用いることができる。
なお、 本発明にかかるスクリーニング方法は、 上述した環境形成工程おょぴ阻 害剤同定工程を含んでいればその具体的な手法は特に限定されるものではなく、 もちろんその他の工程を含んでいてもよい。
<免疫疾患治療薬剤 ·高レベル I g E発現の抑制方法 >
さらに、 本発明には、 上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤を含む 免疫疾患治療薬剤が含まれる。 この免疫疾患治療薬剤の具体的な組成等について は特に限定されるものではなく、 スクリーニングされた阻害剤の種類と、 投与対 象となる生物 （ヒ トも含む） の状態に応じて、 適切なバッファーや添加剤を含ん でいればよい。
さらに、 本発明には、 上記スクリーニング方法を用いて得られる阻害剤、 また は、 上記免疫疾患治療薬剤を用いた高レベル I g E発現の抑制方法も含まれる。 この方法では、 上記阻害剤または免疫疾患治療薬剤を用いることで、 K Cから産 生された I L一 1 8の局所的な集積により、 抗原への暴露なしに引き起こされる 全身性の I g E応答を抑制する。 その結果、 アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病 変において生ずる血清中の高レベルの I g E発現という現象を抑制または阻害す ることができる。
K Cからの I L一 1 8の産生誘導は、 ダイレクトに A Dの発症につながる場合 もあれば、 高レベルの I g E発現を導いて A Dの発症につながる場合もある。 本 発明では、 上記何れの場合であっても、 A Dの病状を有効に治療または緩和する ことができる。
( 2 ) 本発明にかかるアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法
上記 （1 ) では、 本発明のうち、 A Dやその類似症状の治療薬剤を候補物質か らスクリーニングする方法について詳細に説明したが、 本発明はこれに限定され るものではなく、 A Dやその類似症状の発症機構を解明する目的で、 モデル生物 に、 A D様の炎症性皮膚病変を発症させる A D様症状の誘導方法も含まれる。 本発明にかかる A D様症状の誘導方法は、 上記 （1 ) の環境形成工程にて、 K
C刺激タンパク質を刺激剤として用いた場合について説明したように、 黄色ブド ゥ球菌由来のプロテイン Aをホスト生物の皮膚に塗布する方法であればよい。 こ のときの塗布条件等についても上記 （1 ) と同様特に限定されるものではない。 さらに、 上記プロテイン Aとしては、 上記 （1 ) でも述べたように、 当該プロ ティン Aの完全タンパク質、 ケラチノサイ トを刺激することが可能な上記プロテ イン Aの部分タンパク質、 または、 ケラチノサイトを刺激することが可能な上記 プロティン Aまたはその部分タンパク質の改変体の少なくとも何れかであればよ い。
また、 上記ホス ト生物としても、 上述したように、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ、 サル等の実験動物、 特にマウス等を好適に用いることができる。 換言すれ ば、 本発明には、 上記誘導方法により得られた炎症性皮膚病変を発症したモデル 生物が含まれる。
( 3 ) 本発明の利用
本発明にかかるスクリーニング方法、 および A D様症状の誘導方法は、 上述し たように、 A Dやその類似症状の発症機構の解明や治療薬剤の開発に好適に用い ることができる。 ここで、 本発明にかかる上記各方法は、 キットにより実現され てもよい。 すなわち、 本発明には、 上記スク リーニング方法を実施するためのス クリ一ニングキットまたは上記 A D様症状の誘導方法を実施するための誘導キッ トが含まれていてもよい。
上記スクリーニングキットの具体的な構成は特に限定されるものではないが、 例えば、 少なくとも、 刺激剤 （特に K C刺激タンパク質、 促進物質） と、 阻害剤 同定工程で用いられる各種マテリアル類 （例えば S p Aの結合タンパク質とシグ ナル伝達分子等） を含む構成を挙げることができる。 同じく、 A D様症状の誘導 キットの具体的な構成も特に限定されるものではないが、 3 溶液と 3 を 効率的に塗布できるような塗布手段とを含む構成を挙げることができる。
本発明にかかるスクリーニング方法は、 A D様の炎症性皮膚病変を治療する免 疫疾患治療薬剤のスクリーニングに好適に用いられる。 また、 本発明にかかる A D様症状の誘導方法は、 A D様症状をモデル動物に人工的に発症させることで、 A D様症状の発症機構の解明に用いることが可能であるが、 さらには、 本発明に かかるスクリーニング方法により得られた阻害剤の効果を検証するために用いる こともできる。
例えば、 本発明にかかるスクリーニング方法として、 環境形成工程を in vitro で実現する手法により、 ある阻害剤 （例えば、 物質 Xとする） が得られたとする 。 この場合では、 K Cの培養細胞における物質 Xの効果を見ていることになる。 そこで、 本発明にかかる A D様症状の誘導方法を用いて A D様症状が発症したマ ウスを作製し、 これを用いて物質 Xの効果を in vivoで検証することができる。 なお、 本発明の利用方法は、 上記の例に限定されるものではなく、 他の種々の 用途にも用いることが可能であることはいうまでもない。
このように、 本実施の形態では、 具体的な例を挙げて本発明を詳細に説明した 力 本発明は上記実施の形態のみに限定されるものではなく、 本発明は、 その趣 旨を逸脱しない範囲内で、 当業者が有する知識に基づいて、 種々の改良、 変更、 修正を加えた態様で実施することができる。
以下、 実施例および比較例により、 本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明 はこれに限定されるものではない。 なお、 実施例において用いられたマウスおよ び試薬、 並びに、 具体的な実験方法の詳細を次に示す。
〔マウス〕
メスの C 5 7 BL/6 (B 6) 野生型マウス （6— 1 0週） は CLEA Japan社か ら購入した。 B 6背景 CD 4欠失マウス （メス、 6— 1 0週） は東京大学の Dr. Taniguchiの好意により提供を受けた。 B 6背景 stat 6欠失マウス （メス、 6— 1 0週） は大阪大学の Dr. Takedaの好意により提供された （Takeda, K. , Tanaka ， T. , Shi, W.， Matsumoto, M.， Minami, M. , Kashiwamura, S.， Nakanishi, K. ， Yoshida, N.， Kishimoto, T. and Akira. S. , 1996. Essential role of STAT 6 in IL-4 signaling. Nature 380 :627参照） 。
B 6マウスと F 10マウス （メス、 6— 1 0週） とを交配した I L— 1 8 R α 欠失マウスは、 大阪大学の Dr. Hoshinoより提供を受けた （Hoshino, K. , Tsutsu
1, H. , Kawai, T.， Takeda, K. , Nakanishi, Κ. , Takeda, Υ. and Akira, S. 19 99. Generation of IL-18 receptor-deficient mice: evidence for IL-1 recep tor-related protein as an essential IL-18 binding receptor. J. Immunol. 162 :5041参照) 。
皮膚移植片のドナーとしては、 高い血清中 I g E濃度 （1 0— 1 2 μ gZm 1 ) 及び I L一 1 8濃度 （5— 7 n gZm 1 ) を有する慢性皮膚疾患を患うメスの マウスを選択して用いた。 caspase- 1欠失マウスを B 6野生型マウスと交配して 得られた F 6マウス （メス、 6— 1 0週） を用いた （Seki， Ε·， Tsutsui, H.， T suji, N. M.， Hayashi, N.， Adachi, K. , Nakano, H. , Futatsugi-Yumikura, S. , Takeuchi, 0., Hoshino, K. , Akira, S. , Fujimoto, J. and Nakanishi, K. 2
002. Critical roles of myeloid differentiation factor 88 - dependent proin f lammatory cytokine release in early phase clearance of Listeria monocyt ogenes in mice. J. Immunol. 169:3863参照） 。 B 6 / 1 29背景の骨髄分化フ アクター 88 (My D 88) 欠失マウス、 Toll様レセプター （TLR) 2欠失マ ウスの F 4マウス （メス） は、 大阪大学の Dr. Akiraから提供を受けた （Seki et al参照） 。 全てのマウスは無菌状態の下においた。
〔試薬〕 黄色プドウ球菌 Cowan 1から精製した S p Aは、 Calbiochem社より購入した。 大腸菌 （0 5 5 ; B 5) からのリポ多糖類 （L P S) は、 Dif co社より購入した 。 Murine Fasリガンドトランスフエクタント （mF a s L) については、 非特許 文献 6を参照。 広い範囲で活性を阻害する caspase阻害剤である z— VAD— F MK (Z VAD) と、 caspase- 1の特異的な阻害剤である A c— YCAD— CM K (YVAD) は、 Peptide Institute社から購入した。 本実施例では、 1 0% F C S、 1 00 UZm 1ペニシリン、 1 00 g 1ス トレプトマイシン、 5 0 μΜ 2—メルカプトエタノール及び 2mM L—グルタミンを含む R P M I 1 640を通常の培養液として用いた。 マウスのケラチノサイ ト細胞株 P AM 2 1 2は、 東京大学の Dr. Tamakiから提供された。
〔皮膚移植〕
皮膚標本 （1 cm2) は、 野生型 B 6マウスの正常皮膚または KCAS P 1 T gマウスの病変を発症した皮膚 （病変皮膚） あるいは発症していない皮膚 （非病 変皮膚） から得た上で、 野生型 B 6マウス、 CD 4欠失マウス、 stat 6欠失マウ ス、 または I L— 1 8 Rひ欠失 B 6マウスの背中に移植した。 皮膚標本としては 、 KC AS P 1 T gの病変皮膚あるいは非病変皮膚については、 2片の移植片を 得た。
皮膚移植の後、 レシピエントは、 可能なすべての感染を防ぐために、 lmg/ m 1の硫酸ネオマイシン （Sigma社製） および 1 000 U/m 1の硫酸 polymixin B (Sigma社製） を加えた飲用水を与えた。 適宜、 I g E濃度を決定するために 血清をサンプリングした。
移植されたそれぞれのホストにおける移植皮膚の生着率は 48日目まで観察し た。 組織学的な研究のために、 へマトキシリンとェォジンで皮膚標本を染色した (非特許文献 3 · 4参照） 。
〔皮膚溶解物〕
皮膚標本 （1 c m 2) は、 野生型の B 6マウスまたは KC A S P 1 T gマウス から得た上で、 当該皮膚標本から調製した表皮のシートは PB S (リン酸緩衝整 理食塩水） 中、 4 °Cでホモジナイズし、 濾過した。 それぞれの溶解物中に含まれ る各種サイ トカインおよびタンパク質の濃度を、 サイ トカイン用試薬およびタン パク質評価試薬 （Pierce社製） を用い、 E L I SAキットにより測定した。
[Th 1/Th 2分化〕
脾臓の CD 4+T細胞は、 Au t oMAC S (Miltenyi Biotec社製） を用いて 様々な手法で処理したマウスから単離した。 新たに単離した脾臓細胞は抗 CD 4 ビーズ （Miltenyi Biotec社製） とともにインキュベートした。 CD 4+T細胞の 純度は 9 8 °/。超であった。 細胞 ( 1 X 1 06/m 1 ) は、 固相化された抗 CD 3 ε (PharMingen社製） とともに 4 8時間ィンキュベートし、 それぞれの上清の I F N_ T /および I L一 4の濃度を E L I S A法により決定した。
〔サイ トカインおよび I g Eの評価〕
I L— 1 8濃度は MB L社製 E L I S Aキットにより決定した。 I L— 4、 I
FN— yおよび I L_ l J3は、 Genzyme社製 E L I S Aキットにより決定した。 I L— 5の E L I SAキットは、 Endogen社から購入した。 血清 I g E濃度は、 P harMingen社製 E L I S Aキットにより決定した。 I L— 1 8の I FN— γ誘導 能は、 L NKシリーズと名づけられた I L _ 1 8応答性のマウス ΝΚ細胞クロー ンを用いてバイオアツセィにより決定した （非特許文献 6他参照） 。
具体的には、 LNK 5 E 6細胞は、 LNK 5 E 3細胞よりも、 I F N— γ産生 に関しては I L一 1 8刺激に対してより高い応答性を有しており （非特許文献 6 参照） 、 この細胞を各種サンプルおよび 1 0 0 p gZm 1の I L_ 1 2とともに 、 抗 I L一 1 8抗体 （5 0 / g/m 1 ) の存在下または不存在下で 4 8時間ィン キュペートした。 I L一 1 8の活性度は、 次式に示すように、 I L— 1 8に対す る応答において、 細胞によって産生される I FN— γの濃度として定義される （ 非特許文献 6参照） 。
I L一 1 8活性度 = (抗 I L一 1 8抗体の不存在下における上清中の I FN— y ) - (抗 I L— 1 8抗体の存在下における上清中の I FN— 。
〔S p Aの塗布〕
種々の量の S p Aを、 5 μ 1の溶媒 （5 0%グリセロールの P B S溶液） に溶 かしたもの （S p A溶液） を調製し、 この S p A溶液を野生型の耳の皮膚に、 1 4日間毎日塗布した。 コントロールとして、 S p Aを含まない 5 ^ 1の溶媒を用 いた。 他のマウスの影響を避けるため、 マウスを個別のケージに入れた。 〔： KCの調製〕
KCは、 Dr. Tamaki他により示された方法 （Vestergaard, C.， Yoneyama, H.， Murai, M.， Nakamura, K. , Tamaki, K.， Terashima, Y.， Imai, T.， Yoshie, 0 .， Irimura, T.， Mizutani, H. , et al. 1999. Overproduction of Th2- specif i c chemokine in NC/Nga mice exhibiting atopic dermatitis-like lesions. J. Clin. Invest. 104:1097， または， Tamaki, K. , Stingl, G. , Gullino, M. , Sa chs, D. H. and Katz, S. I. 1979. la antigens in mouse skin are predomina ntly expressed on Langerhans cell. J. Immunol. 123 :784参照) にしたカつて 、 各種遺伝子型のマウスから調製し、 表面分子の発現を正常に回復させるために 、 一晚培養液中でインキュベートした。 DCを除去するために、 KCを CD 1 1 cマイクロビーズ （Miltenyi Biotec社製） とともにインキュベートした後、 C D 1 1 0 +細胞は 1 t oMAC Sを用いて除去した。
KC (5 X 1 05,m 1 ) または P AM 2 1 2細胞 （2 X 1 05/m 1 ) は、 様 々な量の S p Aと、 1 g /m 1 の L P Sまたは mF a s L ( 1 X 1 06/m 1 ) とともに 24時間インキュベートした。 一部の実施例では、 野生型の KCを、 2 0 iuMのZVADまたはYVADの存在下で、 1 0 0 μ g/m 1の S p Aとと もに 24時間ィンキュベートした。 それぞれの上清における I L一 1 8濃度およ びその活性度は、 E L I S Aとバイオアツセィによりそれぞれ決定した。 一部の 実施例では、 KCは 5 0 0 g/m 1の S p Aとともに 4時間ィンキュベートし 、 総 RN Aを抽出して、 RT— P CR (Tsutsui, H. , Matsui, Κ·， Kawada, N. , Hyodo, Y. , Hayashi, Ν.， Okamura, H.， Higashino, K. and Nakanishi, K. 19 97. IL-18 accounts for both TNF- - and Fas ligand - mediated hepatotoxic pathways in endotoxin— induced liver injury in mice. J. Immunol. 159:3961 参照） を行った。 I L— 1 8、 I L一 1 2 p 3 5、 I L— 1 2 p 40または j3 _ ァクチンのためのプライマー及びそれぞれのサイ トカインについての P CRの条 件については、 上記 Tsutsui et al.を参照。
〔Kupffer細胞の調製〕
Kupffer細胞 （クッパー細胞） の調製は、 非特許文献 6にしたがって行った。 K upff er細胞 （1 X 1 06/m 1 ) は、 1 μ g /m 1 の L P S (リポ多糖類） とと もに 4時間インキュベートし、 それらの I L— 1 8、 I L— 1 2 p 3 5、 I L— 1 2 p 40および j3—ァクチンの発現を RT— P CRにより、 mRNA濃度とし て決定した。
[FACS (蛍光表示式細胞分取器） 分析〕
DC、 CD 4+T細胞及ぴ CD 8+T細胞の比率は、 非特許文献 6にしたがって 調製した KCを、 フィコエリ トリン （ΡΕ) を結合した抗 CD 1 1 c抗体 （Phar Mingen社製） とフルォレセインイソチオシァネート （F I TC) を結合した抗 I 一 Ab抗体 （PharMingen社製） と、 あるいは P Eを結合した抗 C D 4抗体 （PharM ingen社製） と F I T Cを結合した抗 C D 8抗体 （PharMingen社製） とインキュ ペートした後、 二色フローサイトメ トリー分析により決定した。
〔統計量〕
全てのデータは 3個の組の平均と標準偏差として示した。 対照群と処置群の間 の有意性は、 独立したスチューデントテストにより行った。 P< 0. 05が有意 であるとした。
〔実施例 1 ： KCAS P 1 T gマウスからの皮膚移植片の移植による I g Eの 最初に、 KC AS P 1 T gマウスの病変皮膚が同系統の正常な野生型マウスに 移植されると、 血清 I g E濃度の上昇を誘導する可能性を有するかを調べた。 具 体的には、 それぞれの移植における皮膚移植片の条件を標準化するために、 耳、 顔および胴体に慢性皮膚炎を発症し、 血清中に一定の I L一 1 8および I g E濃 度を有する KC AS P 1 T gマウスをドナーとして選択した。 KCAS P l T g マウスの病変皮膚片または非病変皮膚片を、 正常な B 6マウスに移植し、 宿主の 血清 I g E濃度を測定した。 その結果を図 1に示す。
図 1では、 グラフ中の塗りつぶされた円および右側の上の写真が、 正常な B 6 マウスに KCAS P 1 T gマウスの病変皮膚を移植した結果を示し、 グラフ中の 斜線を引いた円および右側の中央の写真が、 KCAS P 1 T gマウスの非病変皮 膚を移植した結果を示し、 グラフ中の正方形および右側の下の写真が、 野生型マ ウスの正常な皮膚を移植した結果を示す。 グラフに示された時点で E L I SAに よる I g E測定のために血清をサンプリングするとともに、 移植した皮膚の生着 率を観察した （図 1の上方：移植皮膚の生着率） 。 データはそれぞれの実験群に おける 3匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。 移植した皮膚の生着率は上方の パネルに示す。
図 1に示すように、 非病変皮膚を移植した B 6マウスが、 遅延した弱い I g E 応答を示したのに対して、 病変皮膚を移植したマウスの場合は、 その血清中の I g E濃度は早期に上昇した。 野生型マゥスの皮膚移植片を移植したコントロール の B 6マウスでは、 I g Eの上昇は見られなかった。 病変皮膚を移植した B 6マ ウスは、 高い血清 I g E濃度を示すが、 移植片を脱離した後には濃度が低下する 。 一方、 非病変皮膚を移植した B 6マウスは、 低い I g E濃度を維持する。 さら に、 病変皮膚を移植した B 6マウスは、 病変皮膚の拒否反応後であっても血清 I g E濃度は再度上昇を始める。
なお、 データは示さないが、 血清 I L一 1 8濃度はどのタイプの皮膚移植片に よる刺激の後も上昇しなかった。 同じくデータは示さないが、 血清 I L— 4また は I L—6濃度は、 市販の E L I S Aキットでは検出されなかった。 これらの結 果から、 KCAS P 1 T gマウスの病変皮膚は、 正常な B 6マウスに移植された ときに、 全身性の I g E上昇を持続的に誘導することが示される。 これは、 I L — 1 8の投与を停止した後に直ちに停止する、 外因性の I L_ l 8依存性の I g E産生 （未公開データ） と対照的である。
〔実施例 2 ： KCAS P I T gマウスの病変皮膚における I L— 1 8—及び T h 2—関連サイト力インの集積〕
病変皮膚の移植のみが、 ホストにおける I g E応答を効果的に誘導するメカ二 ズムを解明するために、 病変皮膚の移植片と非病変皮膚の移植片とにおける I L 一 1 8濃度を比較した。 各皮膚の移植片は、 それぞれ前述したように溶解物とし た上で、 I L一 1 8の濃度を測定した。 その結果を図 2 A〜Fに示す。
図 2A〜Fでは、 塗りつぶした棒グラフが、 2匹の KCAS P 1 T gマウスか らサンプリングされた病変皮膚の標本の結果を示し、 斜線を引いた棒グラフが、 2匹の KCAS P I T gマウスからサンプリングされた非病変皮膚の標本の結果 を示し、 白抜きの棒グラフが、 3匹の野生型マウスからサンプリングしたコント ロールとしての皮膚標本の結果を示す。 また、 図 2 Aは、 上記各皮膚標本の溶解 物中における I L— 1 8の濃度を示し、 同じく図 2 Bは、 I L一 1 8の活性度 （ I L_ 1 8応答性の LNK 5 E 6細胞による I FN_y産生） を示し、 図 2 Cは I L_ 1 ]3の濃度を示し、 図 2Dは I FN— γの濃度を示し、 図 2 Εは I L一 4 の濃度を示し、 図 2 Fは I L— 5の濃度を示す。 各結果は、 それぞれのサンプル における 3つの独立した実験結果の平均と標準偏差とを示す。 なお、 NDは検出 されないことを示す。
図 2 Αに示すように、 KCA S P 1 T gマウスの病変皮膚の溶解物は E L I S Aで高い I L— 1 8濃度を示し、 I L— 1 8の前駆体および成熟型の両方が検出 された。 一方、 KCAS P 1 T gマウスの非病変皮膚の溶解物では、 低い I L— 1 8濃度しか示さず、 野生型マウスの皮膚の溶解物においては、 I L— 1 8の濃 度は最も低かった。
ここで、 I L— 1 8に対する免疫プロット分析から、 KCA S P l T gマウス の皮膚の病変部位は、 生理活性を有する 1 8 kD aの I L— 1 8と 24 kD aの I L一 1 8前駆体との双方を発現し、 野生型マウスの皮膚および KCA S P I T gマウスの非病変皮膚は 24 kD aの I L一 1 8前駆体のみを発現することが知 られている。 そこで、 これを確かめるために、 I L一 1 8に対するパイオアッセ ィを行った。 その結果、 図 2 Bに示すように、 KCA S P 1 T gマウスの病変皮 膚は I L一 1 8による I FN— T/誘導の活性度の力価が高いことを示した。 一方 、 非病変皮膚はほとんど活性を示さなかった。 また、 B 6マウスの正常な皮膚に は、 そのような生理活性を有する I L— 1 8は存在しない。
また、 図 2 Cに示すように、 I L— 1 も病変皮膚においてのみ KCに濃縮さ れていた。 なお、 I L_ 1 8、 I L_ 1 jSに加えて、 他の caspase- 1産生物も、 病変皮膚においてのみ KCに濃縮されることが知られている。 このようにホスト 中の I g E濃度は、 移植された移植片における I L一 1 8および I L_ 1 j3の濃 度と対応している。
次に、 KCA S P 1 T gマウスの病変皮膚の溶解物中における I F N— γ、 I L一 4および I L— 5の濃度を測定した。 その結果、 図 2 D〜Fに示すように、 KC AS P 1 T gマウスの病変皮膚の溶解物中では、 I F N—T 、 I L— 4およ び I L一 5の濃度は、 野生型マウスや KCA S P 1 T gマウスの非病変皮膚の溶 解物と比較しても、 すべて上昇していた。 このように、 病変皮膚の移植片は大量 の I L一 18、 I L— l j3、 I FN— γ、 I L一 5および I L— 4を蓄積してい る。
KCAS P I T gマウスの病変皮膚にはどのタイプの細胞が集積しているのか を調べるために、 F ACSにより、 KC標本中の CD 4+T細胞、 CD 8+T細胞 、 樹状細胞の比率を測定した。 その結果を図 3 A〜Fに示す。
図 3 A · Dは、 野生型マウスの正常な皮膚、 図 3 B . Eは、 KCAS P l Tg マウスの非病変皮膚、 図 3 c . Fは、 KCAS P 1 T gマウスの病変皮膚から得 られた KC標本の結果を示す。
図 3A〜Cは、 各 KC標本と P Eを結合した抗 CD 4抗体おょぴ F I TCを結 合した抗 CD 8抗体とをインキュベートした結果であり、 図 3D〜Fは、 各 KC 標本と P Eを結合した抗 CD 1 1 c抗体と F I TCを結合した抗 I— Ab抗体と をインキュベートした結果を示す。 また、 図 3 A〜Fのそれぞれにおいては、 C D4+T細胞および CD 8+T細胞の比率と、 CD 1 1 c+DCおよび I—Ab +DC の比率を示す。 各結果は、 それぞれの実験群における 3匹のマウスのうち、 1匹 の結果のみを示す。
図 3A〜Fに示すように、 病変皮膚では、 野生型マウスと比較して、 CD4 + T細胞の数が実質的に上昇していた。 また、 これら 3タイプのレシピエントの間 では、 CD 8+T細胞または D Cの比率には違いがなかった。
データは示さないが、 肥満細胞の数は、 野生型マウスと比較して、 KCAS P l Tgマウスでは、 病変皮膚において顕著に上昇し、 非病変皮膚でにおいては上 昇しなかった。 この結果は、 本発明者らによる以前の報告 （非特許文献 4) と一 致する。 このように、 CD4+T細胞は、 KC AS P 1 T gマウスの病変皮膚に おいて優先的に集積される。 また、 病変皮膚には肥満細胞も多数集積している。
〔実施例 3 ：病変皮膚を移植されたマウスにおける Th 1細胞および Th 2細 胞の誘導〕
I g E応答は通常 T h 2細胞の活性化を必要とするため、 次に、 病変皮膚の移 植後にホスト中の CD 4+T細胞が T h 2細胞に分化するかを調べた。 具体的に は、 正常な B 6マウスに対して、 KC AS P 1 T gマウスの病変皮膚、 非病変皮 膚または野生型マウスの正常な皮膚を移植し、 2 1 日後に脾臓の CD 4+T細胞 を固相化された抗 CD 3とともに 48時間ィンキュベートし、 上清における I L 一 4濃度 (塗りつぶした棒グラフ） と I FN— γ濃度 （白抜きの棒グラフ） とを EL I S Αで決定した。 その結果を図 4に示す。
図 4では、 I L一 4濃度を塗りつぶした棒グラフに示し、 I FN— γ濃度を白 抜きの棒グラフに示す。 それぞれのデータは、 3個の組の平均と標準偏差とを示 す。 3の独立した実験から類似の結果が得られた。 なお、 NSは有意性なしを示 す。
図 4に示すように、 KCAS Ρ 1 T gマウスの病変皮膚を移植した後、 2 1日 目のホス トにおける脾臓の CD 4+T細胞は、 正常な B 6マウスの皮膚を移植し たホストと比較して、 固相化された抗 CD 3に応答して I L— 4および I FN— γの双方を多量に産生した。
これに対して、 非病変皮膚を移植したレシピエントでは、 脾臓の CD 4+T細 胞は、 Β 6野生型マウスの皮膚を移植したレシピエントのものに匹敵する程度の 量の I L— 4と I FN— γを産生した （プレート結合抗 CD 3に対する応答） 。 しかしながら、 データは示さないが、 移植後 7日目では、 KCAS P l T gマウ スの病変皮膚または非病変皮膚を移植したレシピエントの CD 4+T細胞は、 野 生型マウスの正常な皮膚を移植したコントロールのレシピエントの CD 4+T細 胞と同程度の量の I L— 4と I FN— γしか分泌しなかった。
これらの結果は、 CD 4+Τ細胞が T h 1 /T h 2細胞に分化するためには、 . 病変皮膚の移植片の移植による刺激から 2— 3週間必要であることを示す。
〔実施例 4 ： I L_ 1 8、 CD 4および stat6に依存する I g Eの誘導〕 KC AS P 1 T gマウスの病変皮膚が、 I g Eを誘導するメカニズムを細胞レ ベルで分析した。 ところで、 CD 4+T細胞を除いたマウスは I L— 1 8を投与 されても血清 I g E濃度の上昇が見られないことが知られている。 そのため、 ホ ス ト由来の CD 4+T細胞が本来必要とされるのか、 あるいは、 病変皮膚に浸潤 した I L一 4を産生するドナー T細胞 （図 2 E参照） 力 I g E誘導に必要な条 件を備えているのかを調べた。
具体的には、 野生型マウス、 CD 4欠失マウス、 stat6欠失マウスまたは I L — 1 8 R α欠失マウスに、 KC AS Ρ 1 T gマウスの病変皮膚を移植した。 0日 目と 2 1日目に、 I g E測定のために血清をサンプリングした。 その結果を図 5 Aに示す。 白抜きの棒グラフが 0日目の結果であり、 塗りつぶした棒グラフが 2 1日目の結果を示す。 各データはそれぞれの実験群における 3匹のマウスの平均 と標準偏差とを示す。
まず、 CD4欠失マウスは、 図 5Aに示すように、 KCAS P l T gマウスの 病変皮膚を移植した後でさえも I g Eを産生しなかった。 この結果から、 KCA S P I T gマウスの病変皮膚の移植片中の I L— 4産生細胞あるいは I L一 1 8 は、 ホス トの CD 4+T細胞なしには I g Eの全身性の上昇を誘導することがで きないことを示唆している。
また、 stat6が I L一 4のシグナル伝達に不可欠であることから、 次に、 ホス トの stat6の活性化が I g E誘導に決定的かを分析したところ、 図 5 Aに示すよ うに、 stat6欠失マウスは、 病変皮膚を移植した後、 いかなる I g Eの上昇も示 さない。 この結果は、 病変皮膚の移植片により誘導された I g E応答は、 ホス ト 由来の CD 4+T細胞および stat6に依存的であることを示唆している。 データは 示さないが、 B 6マウスの正常な皮膚の移植も CD 4+T細胞または stat6が欠失 レた宿主において、 I g E産生を誘導しなかった。 したがって、 皮膚移植による I g Eの誘導は、 ホストが完全な CD 4 + T細胞および stat6を供えているときだ けに起こる。
さらに、 移植片中の I L— 1 8力 ホスト中で I g Eの誘導を引き起こすか否 かを調べた。 この目的のために、 ホストとして、 I L一 1 8に応答することがで きない I L一 1 8 R α欠失マウスを用いた。 図 5Aに示すように、 I L— 1 8 R α欠失マウスでは、 I g Εの上昇は見られなかった。 また、 データは示さないが 、 B 6マウスの正常な皮膚を移植した I L_ 1 8 R α欠失マウスは I g Εの上昇 を示さなかった。
総合すると、 これらの結果は、 皮膚の病変部位における少量の I L一 1 8の持 続的な集積は、 ホス ト由来の CD 4+T細胞おょぴ stat6に依存的な、 全身性の I g Eの上昇を誘導する。
また、 病変皮膚を移植された野生型マウスが、 CD 4+T細胞の T h 1細胞お よび Th 2細胞への分化を伴う I g E応答を示したことから （図 4参照） 、 この Th 1/Th 2細胞への分化も、 病変皮膚の移植片に存在する I L一 1 8に依存 するかを調べた。
具体的には、 I L一 18 R α欠失マウスに、 Β 6野生型マウスの正常な皮膚ま たは KCAS Ρ 1 T gマウスの病変皮膚を移植した。 2 1日目にレシピエントか ら脾臓の CD 4+T細胞を単離し、 固定化された抗 CD 3で刺激し、 産生された I L— 4と I FN— yとを EL I S Aで測定した。 その結果を図 5 Bに示す。 白抜きの棒グラフが I FN— の結果であり、 塗りつぶした棒グラフが I L一 4の結果である。 各データはそれぞれの実験群における 3匹のマウスの平均と標 準偏差とを示す。 なお、 NSは有意性がないことを示す。
図 5 Βに示すように、 病変皮膚の移植片を移植された I L一 1 8Ra欠失マウ スの CD 4+T細胞は、 野生型マウスの正常な皮膚を移植された I L_ 1 8 Rひ 欠失マウスの CD 4+Τ細胞と比較して、 その I L一 4あるいは I FN— 0 の産 生量に関して相違を認めなかった。 この結果から、 病変皮膚の移植片を介した T h 1/Th 2細胞の分化は、 移植片から放出された I L_ 1 8に依存している可 能性が示される。
〔実施例 5 ： in vivoにおける S p Aによる I L— 1 8および I g Eの誘導〕 黄色ブドウ球菌の感染は、 時には ADの患者において、 皮膚の炎症変化を悪化 させ、 いくらかの AD患者では血清 I L一 1 8濃度が上昇することが知られてい る。 そのため、 黄色ブドウ球菌の産生物が、 正常な B 6マウスにおける I L一 1 8の全身的な上昇を引き起こすことができるかを調べた。
具体的には、 正常な B 6マウスの耳の皮膚に、 1日 1回様々な用量の S p Aま たは溶媒のみを 2週間塗布した。 その後、 14日目に I L一 1 8または I g Eの 濃度を測定するために血清おょぴ脾臓をサンプリングした。 さらに、 溶媒または S pA (1 00 gZ日） を塗布したマウスの脾臓の CD 4+T細胞をプレート 結合抗 CD 3とともに 48時間インキュベートし、 それぞれの上清における I F N— γおよび I L一 4の濃度を E L I S Αで測定した。 その結果を図 6 A〜Cに 示す。
図 6 Aは I L— 1 8の結果を示し、 図 6 Bは I g Eの結果を示す。 さらに、 図 6 Cにおける白抜きの棒グラフは I FN— γの結果を示し、 塗りつぶした棒ダラ フは I L— 4の結果を示す。 図 6 Α · Βのデータは、 それぞれの群において、 3 匹のマウスの平均と標準偏差とを示す。 図 6 Cのデータは 3つのサンプルの平均 と標準偏差とを示し、 それぞれの群における 3匹のマウスのうち、 1匹のデータ を示す。 なお、 NDは検出されないことを示し、 NSは有意性がないことを示す 図 6 Αに示すように、 S p Aを塗布したマウスでは、 血清中の I L一 1 8のレ ベルは、 投与量依存的に上昇したが、 溶媒のみを塗布したマウスでは上昇しなか つた。 データは示さないが、 S p Aまたは溶媒を塗布したマウスにおける血清中 の I L— 1 2 p 40、 I L— 1 2 p 70は、 E L I S Aでは検出されなかった。 また、 図 6 Bに示すように、 I g Eレベルも投与量依存的に上昇した。 加えて、 図 6 Cに示すように、 S p Aで処理されたマウスは、 Th 2細胞優位な分化を示 さなかった。 これらの結果は、 I L一 1 8処理と同様に、 3 が丁1 1 丁11 2細胞どちらかの優先的な分化なしに、 全身性の I g Eを誘導する可能性を示す 。
〔実施例 6 ： S p Aに応答して KCは I L— 1 8を分泌するが、 I L一 1 2は 分泌しない〕
I L— 1 8は、 I L— 1 2がなければ I g Eを誘導することができ、 I L— 1 2があれば逆に I g E誘導を阻害する。 これまで、 I L— 1 8の分泌を誘導する LP S (リポ多糖類） を含めた刺激剤は常に I L— 1 2の産生を引き起こすこと が知られている。 そこで、 次に、 S p Aに応答して、 どのタイプの細胞が I L— 1 8を分泌し、 これらの細胞が I L— 1 2の産生を伴わずに I L一 1 8を分泌す るかを調べた。
具体的には、 PAM2 1 2細胞 （マウスの KCの培養株） を S p Aとともに、 または S p Aなしで 24時間インキュベートし、 それぞれの上清中の I L一 1 8 濃度と I L— 1 8の I FN—γを誘導する生物活性を EL I S Aとバイオアツセ ィでそれぞれ測定した。 その結果を図 7 Aに示す。 図 7 Aでは、 左側が I L— 1 8の濃度を示し、 右側が I FN—γを誘導する活性度を示す。 なお、 図 7 Aのデ ータは、 3つの値の平均と標準偏差とを示している。 また、 NDは検出されない ことを示す。
図 7 Aから明らかなように、 S p Aによる刺激の後、 PAM2 1 2細胞は、 I FN— γ産生を誘導することができる活性型の I L— 1 8を分泌している。
さらに、 新たに単離した KCが S p Aに応答して I L一 1 8を分泌するか実証 するために、 野生型 B 6マウスの KCをいろいろな用量の S p Aと 24時間イン キュベートした。
具体的には、 野生型 B 6マウスの皮膚から調製した KCまたは CD 1 1 +細胞 を除いた KCについて、 CD 1 1 cと MHCクラス II (1— Ab) の発現をフロ 一サイ トメ トリーで分析した。 これらの細胞は S p A存在下、 または S p Aのな い状態で 24時間ィンキュベートし、 上清の I L一 1 8濃度を E L I S Aで測定 した。 その結果を図 7 Bに示す。 図 7 Bでは、 野生型 B 6マウスの皮膚から調製 した KCを塗りつぶした棒グラフで示し、 CD 1 1 。+細胞を除ぃた1：〇を白抜 きの棒グラフで示す。
図 7 Bの左側に示すように、 新たに単離された KCは S p Aに応答して用量依 存的に I L_ 1 8を放出した。 LCZDCは I L— 1 8を放出することができる ので、 CD 1 1 c+細胞を KC標本から除いて、 それらを S p Aとインキュベー トした。 CD 1 1 c+細胞を除去した後であっても、 図 7 Bの右側に示すように 、 KCは S p Aの刺激を受けると I L— 1 8を分泌した。 なお、 図 7 Bのデータ は、 3つの値の平均と標準偏差とを示している。 また、 NDは検出されないこと を示す。
次に、 S p Aに誘導される からの I L一 1 8分泌の分子的なメカニズムを 解明するため、 caspase- 1が L P S (リポ多糖類） の誘導による I L一 1 8分泌 に必要であることから、 S p Aによる刺激を受けた caspase - 1欠失 じからの I L一 1 8分泌を調べた。
具体的には、 KCは、 野生型マウス、 caspase- 1欠失マウス、 T L R 2欠失マ ウス、 または My D 88欠失マウスから調製し、 野生型マウスの KCは 20 /ζΜ Z VAD、 2 0 MYVADまたは同じ体積の DMS O (Veh) の存在下、 5 0 0 μ g/m 1の S pAとともに 24時間インキュベートした。 同時に、 上記各突 然変異体の KCを 500 μ g/m 1の S pAとともに 24時間ィンキュベートし た。 それぞれの上清中の I L一 1 8を E L I S Aで測定した。 その結果を図 7 C に示す。
図 7 Cでは、 WTが野生型マウスを、 KOが上記各突然変異体 （ノックアウト タイプ） のマウスを示し、 白抜きの棒グラフが caspase- 1欠失マウスを、 網掛け の棒グラフが TLR 2欠失マウスを、 斜線で示す棒グラフが My D 8 8欠失マウ スを示す。
図 7 Cに示すように、 DM S Oを加えずに 5 0 0 μ g/m 1の S p Aとインキ ュペートした野生型マウスの KCは、 2 8. 4 ± 3. 5 3 /111 1の 1 1^— 1 8 を産生した。 また、 caspase_l欠失マウスの KCは野生型マウスの KCに匹敵す るレベルの I L一 1 8を分泌する。 そのため、 S p Aの刺激に対する caspase- 1 に依存しない I L— 1 8の分泌を示唆している。 なお、 図 7 Cのデータは、 3つ の値の平均と標準偏差とを示している。
caspase- 1阻害剤である YVADや、 広い範囲の caspaseを阻害する Z VADは 、 L P Sまたは膜結合型の F a sリガンド刺激による肝臓の組織マクロファージ である Kupffer細胞からの I L一 1 8分泌を強力に阻害する。 そこで、 S p Aの 刺激を受けた KCについても、 I L— 1 8の分泌が YVADまたは Z VADで影 響されるかを調べた。 図 7 Cに示すように、 これらの 2種類の caspase阻害剤は S p Aの刺激を受けた野生型マウスの じからの I L— 1 8分泌を阻害しなかつ た。 この結果は、 S p Aの刺激を受けた KCからの I L— 1 8分泌において、 ca spaseは不必要であることを示す。 データは示さないが、 これは caspase- 1欠失マ ウスの KCの場合についても同様のことが言える。
さらに、 多くの微生物が TLR/My D 8 8シグナル経路を刺激することから 、 KCが、 グラム陽性菌に対する信号レセプターである T LR 2または全ての T LRメンバーによってシェアされる不可欠なアダプター分子である My D 8 8に 依存して I L一 1 8を分泌するのかを調べた。 図 7 Cに示すように、 TLR 2と My D 8 8の両者ともに、 S p A刺激で誘導される K Cからの I L一 1 8分泌に 不必要であることから、 S p Aによる I L— 1 8の分泌誘導は、 TLRに依存し ない I L— 1 8分泌であることを示唆している。
また、 Kupffer細胞が L P Sまたは膜表現型の F a s リガンドによる刺激に応 答して I L一 1 8を分泌することから、 これらの刺激剤が じからの I L一 1 8 分泌を誘導するかを調べた。 具体的には、 野生型 B 6マウスからの KC (5 X 1 05/m 1 ) を、 5 0 0 μ g m 1の S p A、 1 μ g Ζπι 1の L P S、 または 1 X 1 O m 1の mF a s Lとともに 2 4時間ィンキュベートした。 得られた上 清に含まれる I L一 1 8は、 E L I S Aで測定した。 その結果を表 1に示す。
〔表 1 〕 刺激剤
培養液のみ S p A L P S m F a s し
I L- 18 (pg/ml) N D 31.5±3.2 N D N D 表 1の結果から明らかなように、 Kupffer細胞とは反対に、 KCは L P Sまた は F a sリガンドによる刺激を受けた後も I L一 1 8を分泌しなかった。 なお、 表 1では、 NDは検出されなかったことを示す。
次に、 S p Aによる刺激を受けた KCが同時に I L_ 1 2を分泌するかを調べ た。 微量の I L_ 1 2を確認するために、 S p Aと 4時間インキュベートした K Cから総 RNAを得、 これを用いて RT— P CRを行った。 具体的には、 野生型 の B 6マウスの KCと Kupffer細胞とを 5 O O ^ g/m 1の S p Aの存在下また は非存在下、 並びに、 1 μ g/ 1の L P Sの存在下または非存在下で、 それぞ れ 4時間ィンキュベートした。 抽出した総 RN A中の I L— 1 8、 I L- 1 2 p 4 0、 I L— 1 2 p 3 5および ;3—ァクチンの mR N Aの発現レベルを R T— P CRで測定した。 その結果を図 7 Dに示す。
図 7 Dに示すように、 L P Sで刺激された Kupffer細胞が I L一 1 2 p 3 5と I L- 1 2 p 4 0との双方を発現したのに対し、 S p Aによる刺激を受けた KC では、 I L一 1 2 p 3 5も I L— 1 2 p 4 0も検出されなかった。 8時間または 1 6時間 S p Aとインキュベートした KCから得た、 総 RNAを用いて I L一 1 2に対する RT— P CRを行ったが、 それらの中には I L— 1 2の何れも検出さ れなかった。 データは示さないが、 E L I SAでも I L一 1 2を測定したが、 2 4時間インキュベートした後の S p Aによる刺激を受けた KCの上清には I L— 1 2 p 4 0または I L— 1 2 p 7◦は検出されなかった。 これに対して、 Kupffer細胞の KCは、' I L一 1 8を恒常的に発現し、 S pA による刺激を受けた後も発現のレベルは変わら'なかった。 また、 データは示さな いが、 Kupffer細胞は S p Aに対する応答として I L一 1 2または I L— 1 8を 分泌しなかった。
これらの結果から、 皮膚に塗布された S p Aの刺激により、 局部的に KCが I
L一 1 8を分泌するが、 I L一 1 2は分泌せず、 これが I g Eの誘導につながる ことが示される。
〔実施例 7 ： S D Sと S p Aの混合物を塗布した NCZN g aマウスにおける 皮膚病変〕
NC/N g aマウスは、 アトピー性皮膚炎好発マウスで、 S P Fでは発症しな いが、 コンベンショナルな環境下に移すと発症する。 NC/N g aマウスに 4% の SDSあるいは S pA (200 g/日） を単独で塗布しても発症しないが、 両者を混合して NC/N g aマウスの剃毛した背部に塗布すると、 AD様の皮膚 病変が観察される。
図 8の Aないし Dは、 4%SDSと S pA (200 g/日） の混合物を塗布 した NC/N g aマウスにおける皮膚病変の結果を、 コントロールの結果ととも に示す図である。 図 8 Cに示すように、 4%SD Sのみを塗布した場合は 28日 後でも発症は見られないが、 4%SDSと S pA (200 μ §Ζ日） の混合物を 塗布した場合は、 図 8 B、 図 8 Dに示すように、 14日後、 28日後に AD様の 皮膚病変が観察された。
図 9の Aないし Dは、 は 4%SDSと S pA (200 i g/日） の混合物を塗 布した NCZN g aマウスにおける皮膚の経時変化をコントロールの結果ととも に示したものである。 図 9の Aないし Cは、 へマトキシリン 'ェォジンで染色し た A D様の病変皮膚を光学顕微鏡で観察した結果を示すものである。 図 9 Aは倍 率 25倍、 図 9 Bは倍率 50倍、 図 9 Cは倍率 1 00倍の観察結果を表す。 図 9 Dはアルシアン ·ブルーで染色した AD様の病変皮膚を光学顕微鏡で観察した結 果である。 図 9 Dに示したように、 組織学的には、 病変部において表皮の肥厚が 著明となり、 アルシアン ·ブルーで染色される肥満細胞の浸潤が認められるよう になる。 尚、 発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様ま たは実施例は、 あくまでも、 本発明の技術内容を明らかにするものであって、 そ のような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、 本発明の精 神と次に記載する特許請求の範囲内で、 いろいろと変更して実施することができ るものである。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明では、 K Cからの I L一 1 8の局所的な集積が、 抗原へ の暴露なしに全身性の I g E応答を引き起こし、 これが A D様の炎症性皮膚病変 において生ずる血清中の高レベルの I g E発現という現象を導くという知見に基 づいて実現されたスクリーニング方法、 およびァトビー性皮膚炎様症状の誘導方 法、 並びにその利用である。
それゆえ、 本発明は、 微生物刺激で誘導される K Cからの I L一 1 8産生の重 要性を示し、 未知の抗原によるアレルギー疾患の病因に関連するであろうメカ二 ズムに新しい見識を提供するとともに、 A Dの治療薬剤等の開発に有効に利用す ることができる。
したがって、 本発明は、 各種医薬品産業や研究用試薬産業に好適に利用できる だけでなく、 医療分野にも応用することができる。 それゆえ、 本発明は、 微生物 刺激で起こる じからの I L— 1 8産生の重要性を示し、 未知の抗原によるァレ ルギー疾患の病因に関連するであろうメカニズムに新しい見識を提供するととも に、 A Dの治療薬剤等の開発に有効に利用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずるィンター ロイキン 1 8の産生の誘導現象を利用した阻害剤のスクリ一-ング方法であって 、
インビボまたはインビト口にて、 刺激剤による刺激でケラチノサイトからのィ ンターロイキン 1 8の産生を誘導する環境を形成する環境形成工程と、
当該環境の下にて候補物質を投与して、 上記ケラチノサイトからのインター口 ィキン 1 8の産生誘導を阻害する物質を、 上記阻害剤として同定する阻害剤同定 工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
2 . 上記刺激剤として、 黄色ブドウ球菌由来のプロテイン A、 ケラチノサイ トを 刺激することが可能な上記プロテイン Aの部分タンパク質、 または、 ケラチノサ ィトを刺激することが可能な上記プロティン Aまたはその部分タンパク質の改変 体の少なくとも何れかが用レ、られることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の スクリーエング方法。
3 . 上記刺激剤として、 プロテイン Aに加えて S D Sを併用することを特徴とす る請求の範囲第 1項または第 2項に記載のスクリ一ユング方法。
4 . 上記環境形成工程がインビト口にて実施される場合、 ケラチノサイ トの培養 細胞の培養液に上記プロティン Aを添加して培養することにより、 上記環境の形 成を実現することを特徴とする請求の範囲第 2項または第.3項に記載のスクリ一 ニング方法。
5 . 上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、 上記プロテイン Aをホス トとなる生物の皮膚に塗布することで、 上記環境の形成を実現することを特徴と する請求の範囲第 2項または第 3項に記載のスクリーニング方法。
6 . 上記環境形成工程がインビボにて実施される場合、 上記刺激剤として、 アト ピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変が生じた皮膚片を用い、 当該皮膚片をホストと なる生物に移植することで、 上記環境の形成を実現することを特徴とする請求の 範囲第 1項に記载のスク リ一ユング方法。
7 . 上記ホス トとなる生物は、 少なく とも、 C D 4 + T細胞が正常に存在し、 stat6 も発現しており、 N K T細胞が構成的に I L— 1 8 R α鎖を発現するとい う各形質を何れも具備していることを特徴とする請求の範囲第 5項または第 6項 に記載のスクリーユング方法。
8 . 上記ホストとなる生物として、 マウスが用いられることを特徴とする請求の 範囲第 5項、 第 6項または第 7項に記載のスクリーニング方法。
9 . 請求の範囲第 1項〜第 8項の何れか 1項に記載のスクリーニング方法を用い て得られる阻害剤を含むことを特徴とする免疫疾患治療薬剤。
1 0 . アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を有する生物において生ずる血清中 の高レベルの I g E発現を抑制する方法であって、
請求の範囲第 1項〜第 8項の何れか 1項に記載のスクリーユング方法を用いて 得られる阻害剤、 または、 請求の範囲第 9項に記載の免疫疾患治療薬剤を用いて、 ケラチノサイ トからのインターロイキン 1 8の局所的な集積により、 抗原への暴 露なしに引き起こされる全身性の I g E応答を抑制することを特徵とする高レべ ル I g E発現の抑制方法。
1 1 . モデル生物に、 ァトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変を発症させるァトピ 一性皮膚炎様症状の誘導方法であって、
黄色ブドウ球菌由来のプロティン Aをモデル生物の皮膚に塗布することを特徴 とするアトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
1 2 . 上記プロテイン Aとしては、 当該プロテイン Aの完全タンパク質、 ケラチ ノサイトを刺激することが可能な上記プロテイン Aの部分タンパク質、 または、 ケラチノサイ トを刺激することが可能な上記プロティン Aまたはその部分タンパ ク質の改変体の少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求の範囲第 1 1項に記載のァトピー性皮膚炎様症状の誘導方法。
1 3 . プロテイン Aをモデル生物の皮膚に塗布するときに、 さらに S D Sを併用 することを特徴とする請求の範囲第 1 1項または第 1 2項に記載のァトビー性皮 膚炎様症状の誘導方法。
1 4 . 請求の範囲第 1 1項、 第 1 2項または第 1 3項に記載のアトピー性皮膚炎 様症状の誘導方法により得られる、 炎症性皮膚病変を発症したモデル生物。
1 5 . 上記モデル生物がマウスであることを特徴とする請求の範囲第 1 4項に記 載のモデル生物。
1 6 . 請求の範囲第 1項〜第 8項に記載のスクリーニング方法を行うためのスク リ一ニングキット。
1 7 . 請求の範囲第 1 1項、 第 1 2項または第 1 3項に記載の誘導方法を行うた めのァトビー性皮膚炎様症状の誘導キット。
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