KR20060011837A

KR20060011837A - 케라티노사이트에 의한 인터루킨 18 생성의 유도 현상을이용한 저해제의 스크리닝 방법, 아토피성 피부염 유사증상의 유도 방법, 및 그 이용

Info

Publication number: KR20060011837A
Application number: KR1020057020134A
Authority: KR
Inventors: 켄지 나카니시; 히토시 미즈타니; 히로코 츠츠이
Original assignee: 재팬 사이언스 앤드 테크놀로지 에이젼시
Priority date: 2003-04-24
Filing date: 2004-04-21
Publication date: 2006-02-03
Also published as: EP1635176A4; KR20080049851A; US20070092448A1; AU2004241513B2; CA2690035A1; JPWO2004104578A1; EP1635176A1; CA2523297C; WO2004104578A1; CA2523297A1; CN1777807B; EP2175270A1; AU2004241513A1; EP1635176B1; CN1777807A; US20100003194A1; US8293212B2; JP4335211B2

Abstract

케라티노사이트(KC)로부터의 인터루킨 18(IL-18)의 생성 유도 현상을 이용하여 아토피성 피부염(AD)이나 그 유사 증상의 발증 기구의 해명이나 치료 약제의 개발에 적합하게 이용할 수 있는 각종 방법과 그 이용 방법을 제공한다. 예를 들면, 황색 포도상 구균 유래의 프로테인 A(SpA)를 마우스 등의 피부에 도포하거나, AD 유사의 염증성 피부 병변이 생긴 피부 조각을 마우스 등에 이식함으로써, AD 유사의 병변에서 생기는 혈청 중의 고 레벨의 IgE 발현을 재현할 수 있다. 이에 의해, 예를 들면 KC에 의한 IL-18 생성 유도의 저해제를 스크리링할 수 있다.

Description

케라티노사이트에 의한 인터루킨 18 생성의 유도 현상을 이용한 저해제의 스크리닝 방법, 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법, 및 그 이용{METHOD OF SCREENING INHIBITOR BY USING INDUCTION OF INTERLEUKIN 18 PRODUCTION BY KERATINOCYTE, METHOD OF INDUCING ATOPIC DERMATITIS-LIKE SYMPTOM AND UTILIZATION OF THE SAME}

본 발명은 케라티노사이트로부터 인터루킨 18 생성의 유도 현상을 이용한 저해제의 스크리닝 방법, 및 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법, 그리고 그 이용에 관한 것으로서, 특히, 아토피성 피부염이나 그 유사 증상의 발증 기전의 해명이나 치료 약제의 개발에 적합하게 이용할 수 있는 스크리닝 방법, 및 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법과 그 이용에 관한 것이다.

피부는 몸에서 가장 큰 기관이고, 생체 방어의 최전선이다. 표피는 케라티노사이트(KC, 각화 세포), 멜라닌 세포, 표피 랑게르한스 세포(LC) 및 상피내 T 세포 등으로 이루어진다.

LC는 미성숙한 수상 세포(DC)이고, 그 기능은 국부적으로 폭로된 단백질 항 원을 포획하여, 획득적 면역 반응이 일반적으로 행하여지는 영역 림프절에 운반하는 것이다. 림프절로 이동하는 동안에 LC는 항원 제시능을 갖는 성숙 DC로 변화한다. 그 결과, LC/DC가 운반하는 항원에 대하여 특이적인 전신성 면역 응답이 야기된다. 이와 같이, 피부의 항원 특이적인 면역 응답은, 동일한 항원에 대한 전신성 면역 응답과 밀접하게 관련된다. 따라서, 피부와 면역 장기는, LC/DC의 순환과 항원 특이적인 면역 세포를 통해 서로 밀접하게 관련되어 있다고 생각된다. 이에 대하여, KC와 멜라닌 세포는 피부에 정주하여 기본적으로는 획득 면역 응답을 받지 못한다.

그러나, KC는 피부 국소에서의 자연 면역 응답과 염증의 유도에 기여하는 가능성이 시사된다. 미생물이 피부에 감염하면, 숙주는 염증 반응, 이어서 획득 면역 반응을 피부 국한성으로 전개한다. 이 때, 피부를 구성하는 KC 및 LC가, 각각의 응답에 깊게 관여한다고 생각된다. 따라서, 미생물이나 화학 시약에 의한 자극에 대하여 다양한 사이토카인을 생성한다고 하는 유니크한 성질에 기초하여, KC는 LC에 영향을 미치고, 그 결과 획득 면역 응답을 변화시키는 가능성이 고려된다(비특허 문헌 1, 2 참조). 이러한 사실을 근거로 하면 KC가 야기한 피부의 염증이 전신성 면역 반응에도 영향을 미치는지를 결정하는 것은 중요하다.

본 발명자는 이전에 KC 특이적으로 카스파제-1(카스파제-1)을 발현하고, 인터루킨 18(IL-18) 및 인터루킨 1β(IL-1β)에 의존하는 방법으로 아토피성 피부염(atopic dermatitis, AD) 유사의 피부염증(소양성 만성염)을 발증하는 카스파제-1-트랜스제닉 마우스(KCASP1Tg 마우스)를 확립하였다(비특허 문헌 3, 4 참조). 또 한, 본 발명자는, IL-1β가, IL-18의 AD 유사의 피부 염증을 유도하는 능력을 증강시키는 것도 나타냈다(비특허 문헌 4 참조). 이러한 결과로부터 KC는 IL-18 및 IL-1β를 포함한 많은 사이토카인의 생성에 의해 전신성 면역 응답에도 기여하는 가능성이 있음이 시사된다.

그런데, 상기 IL-18 및 IL-1β는, 생물학적으로 비활성인 전구체로서 생성되고, 카스파제-1과 같은 적절한 세포내 효소에 의해 절단된 후 활성형으로서 방출된다(비특허 문헌 5∼9 참조).

상기 IL-18은 공존하는 사이토카인의 종류에 따라, 다양한 생리 활성을 나타낸다. 특히, 인터루킨 12(IL-12)의 존재 하에서, IL-18은 강한 염증 유도성의 사이토카인인 IFN-γ를 유도하고, 그 결과 염증 반응을 촉진한다(비특허 문헌 10). 이와는 대조적으로, IL-12가 존재하지 않는 경우, IL-18은 Th2 사이토카인의 생성의 유도를 통해 아토피 응답을 유도한다(비특허 문헌 11∼14 참조).

상기 AD는, 외적 자극에 대한 염증성 피부 병변으로, 만성 반복성이 강한 소양을 수반하는 질환이다. 발증에는 유전적 배경이 있고 환자는 그 혈청 중에 높은 레벨의 IgE를 갖지만, 그 발증 기전에 대해서는 불명인 점이 많다. AD 발증의 메카니즘에 대해서는, 활성화 T 세포, 호염기구, 비만 세포가 깊게 관여한다.

특히, 알레르겐에 의한 비만 세포 또는 호염기구의 활성화 결과, Th2 사이토카인과 케미칼메디에이터의 생성이 일어나고, 그 결과로 AD가 발증한다고 생각되고 있다. 상기 알레르겐에 의한 비만 세포 또는 호염기구의 활성화는, 이들 세포상의 FcεR(호염기구의 IgE 항체에 대한 Fc 수용체(FcR))에 결합한 IgE 분자의 가교에 의한다. 상기 Th2 사이토카인으로서 중요한 것은 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 5(IL-5), 인터루킨 9(IL-9), 인터루킨 13(IL-13) 등을 들 수 있다. 케미칼메디에이터로서 중요한 것으로는 히스타민, 세로토닌, 류코트리엔 등을 들 수 있다.

그런데, 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 감염이 상황에 따라서는 AD 환자의 피부 염증 변화를 악화시키고(비특허 문헌 15, 16 참조), 나아가 일부의 AD 환자에서는 혈청 IL-18 농도가 상승하는(비특허 문헌 17 참조) 것이 알려져 있다. 즉, 황색 포도상 구균의 감염이 AD의 유인 또는 증악 인자인 것은 지금까지 알려져 있다. 그러나, AD의 발증에 황색 포도상 구균이 어떻게 관여하는지에 대해서는 불명인 점이 많다.

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현재로서는, AD의 발증 기구에 관해서는 불명확한 점이 많고, 그리하여 AD의 유효한 치료 약제의 개발에는 많은 어려움이 따르고 있다.

상기한 바와 같이, 표피를 구성하는 각종 세포가 다양한 면역 응답에 관여하는 것이 알려져 있고, 예를 들면 최근 수상 세포가 항원 제시 세포로서 획득 면역 응답을 유도하는 것이 보고되어 있다. 그러나, 표피를 구성하는 가장 주된 세포인 KC에 대해서는 숙주의 면역 응답에 어떻게 관여하는지에 대해서는 밝혀져 있지 않다.

임의의 질환에 대하여 유효한 치료 약제를 개발하는 경우, 그 발증 기구를 해명하고 그것을 이용하여 약리 작용이 있는 물질을 스크리닝하는 것은 중요한 방법의 하나이다. 그러나, AD의 발증에서는 KC의 관여나 황색 포도상 구균의 감염도 포함하여 불명확한 점이 많고, 스크리닝도 포함한 AD의 치료 약제의 개발에 이들을 응용하는 기술에 대해서는 지금까지 거의 알려져 있지 않았다.

본 발명은, 상기 과제를 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 KC로부터 IL-18 생성의 유도 현상을 이용하여, 아토피성 피부염이나 그 유사 증상의 발증 기구 해명이나 치료 약제의 개발에 적합하게 이용하는 것이 가능한 각종 방법과 그 이용 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 예의 검토한 결과, 황색 포도상 구균 유래의 프로테인 A가 KC를 자극하여 IL-18의 생성을 유도하는 것을 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 실증하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 관한 스크리닝 방법은 상기 과제를 해결하기 위해 아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변을 갖는 생물에서 생기는 인터루킨 18의 생성의 유도 현상을 이용한 저해제의 스크리닝 방법으로서, 생체내 또는 시험관 내에서, 자극제에 의한 자극으로 케라티노사이트로부터 인터루킨 18의 생성을 유도하는 환경을 형성하는 환경 형성 단계과, 해당 환경 하에서 후보 물질을 투여하여, 상기 케라티노사이트로부터의 인터루킨 18의 생성 유도를 저해하는 물질을 상기 저해제로서 동정하는 저해제 동정 단계를 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 스크리닝 방법에서는, 상기 자극제로서, 황색 포도상 구균 유래의 프로테인 A, 케라티노사이트를 자극하는 것이 가능한 상기 프로테인 A의 부분 단백질 또는 케라티노사이트를 자극하는 것이 가능한 상기 프로테인 A 또는 그 부분 단백질의 개변체 중 적어도 어느 하나가 이용되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 자극제로서, 프로테인 A에 첨가하여 도데실황산나트륨(SDS)을 병용하는 것이 더 바람직하다.

또한, 상기 스크리닝 방법에서 상기 환경 형성 단계이 시험관 내에서 실시되는 경우 케라티노사이트 배양 세포의 배양액에 상기 프로테인 A를 첨가하여 배양함으로써 상기 환경의 형성을 실현해도 되고, 상기 환경 형성 단계이 생체 내에서 실시되는 경우 상기 프로테인 A를 숙주 생물의 피부에 도포함으로써 상기 환경의 형성을 실현할 수 있다.

또한, 상기 환경 형성 단계이 생체 내에서 실시되는 경우, 상기 자극제로서 아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변이 생긴 피부 조각을 이용하여 해당 피부 조각을 숙주가 되는 생물에 이식함으로써 상기 환경 형성을 실현할 수 있다.

여기서, 상기 숙주가 되는 생물은 적어도 CD4⁺ T 세포의 발현, stat6의 발현, 및 NK T 세포에서의 IL-18Rα 사슬의 발현이라는 각 형질을 모두 구비하고 있는 것이 바람직하다. 상기 숙주가 되는 생물은, 예를 들면 마우스가 바람직하게 이용된다.

또한, 본 발명에는 상기 클리닝 방법을 이용하여 얻어지는 저해제를 포함하는 면역 질환 치료 약제가 포함된다. 또한, 본 발명에는 아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변을 갖는 생물에서 생기는 혈청 중의 높은 레벨의 IgE 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 스크리닝 방법을 이용하여 얻어지는 저해제 또는 상기 면역 질환 치료 약제를 이용하여 케라티노사이트로부터 생성된 인터루킨 18의 국소적인 집적에 의해 일어나는 항원에의 폭로 없이 야기되는 전신성 IgE 응답을 억제하는 방법도 포함된다.

본 발명에 관한 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법은 모델 생물에 아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변을 발증시키는 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법으로서, 황색 포도상 구균 유래의 프로테인 A를 모델 생물의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 유도 방법에서는 상기 프로테인 A로서 해당 프로테인 A의 완전 단백질, 케라티노사이트를 자극하는 것이 가능한 상기 프로테인 A의 부분 단백질 또는 케라티노사이트를 자극하는 것이 가능한 상기 프로테인 A 또는 그 부분 단백질의 개변체 중 하나 이상을 이용할 수 있다. 또한, 상기 프로테인 A를 모델 생물의 피부에 도포할 때에는 SDS를 병용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에는 상기 유도 방법에 의해 얻어지는 염증성 피부 병변을 발증한 모델 생물이 포함되고 이 모델 생물의 일례로서 마우스를 들 수 있다.

본 발명의 이용 방법으로서는, 예를 들면 상기 스크리닝 방법을 행하기 위한 스크리닝 키트나, 상기 유도 방법을 행하기 위한 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 키트를 들 수 있다.

상기 각 방법에 의하면, 아토피성 피부염(AD) 유사의 염증성 피부 병변에서케라티노사이트로부터 생성된 IL-18의 국소적인 집적이 항원에의 폭로 없이 전신성의 IgE 응답을 야기하는 것을 이용하고 있다. 그러므로, 상기 각 방법은 아토피성 피부염이나 그 유사 증상의 발증 기구의 해명이나 치료 약제의 개발에 적합하게 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 뛰어난 점은 이하에 나타내는 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이점은 첨부 도면을 참조한 다음 설명으로 명백하게 될 것이다.

도 1은 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부를 이식하는 것에 의한 숙주에서의 IgE 유도의 결과를 컨트롤 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 2(A) 내지 도 2(F)는 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부에서의 IL-18의 집적을 컨트롤의 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 3(A) 내지 도 3(F)는 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부에서의 CD4⁺ T 세포의 집적을 컨트롤의 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 4는 병변 피부를 이식받은 숙주에서 Th2 세포의 선택적인 분화가 결실하는 것을 컨트롤 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 5(A) 및 도 5(B)는 IgE 유도를 위한 숙주 CD4⁺ T 세포, 숙주 stat6 및 숙주 IL-18 응답성, 그리고 Th1/Th2 세포의 발생의 결과를 컨트롤의 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 6(A) 내지 도 6(C)는 생체 내에서의 SpA 처리에 의한 IL-18 및 IgE의 유도의 결과를 컨트롤의 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 7(A) 내지 도 7(D)는 SpA에 의한 자극을 받은 KC로부터 IL-12가 아니라 IL-18만이 방출되는 결과를 컨트롤의 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 8(A) 내지 도 8(D)는 4% SDS와 SpA(200㎍/일)의 혼합물을 도포한 NC/Nga 마우스에서의 피부 병변의 결과를 컨트롤 결과와 함께 나타내는 도면이다.

도 9(A) 내지 도 9(D)는 4% SDS와 SpA(200㎍/일)의 혼합물을 도포한 NC/Nga 마우스에서 피부의 시간 경과에 따른 변화를 현미경으로 관찰한 결과를 컨트롤의 결과와 함께 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명자들은 케라티노사이트로부터 생성된 IL-18의 국소적인 집적이 항원에 폭로 없이 전신성의 IgE 응답을 야기하고 이것이 아토피성 피부염 유사 염증성 피부병 병변으로 이어지는 것을 발견하였다. 본 발명에서는 이 사실을 이용하여, 특히 아토피성 피부염이나 그 유사 증상의 발증 기구의 해명 또는 치료 약제의 개발에 적합하게 이용하는 것이 가능한 저해제의 스크리닝 방법, 및 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법, 그리고 그 이용 방법을 실현하였다. 이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

(1) 본 발명의 스크리닝 방법

본 발명에 관한 스크리닝 방법은 생체 내 또는 시험관 내에서 자극제에 의한 자극으로 케라티노사이트(KC)로부터 국소적인 IL-18의 생성을 유도하는 환경을 형성하는 환경 형성 단계과 해당 환경 하에서 후보 물질을 투여하여 상기 KC에 의한 인터루킨 18의 생성 유도를 저해하는 물질을 상기 저해제로서 동정하는 저해제 동 정 단계를 포함하고 있다.

아토피성 피부염(AD) 유사의 염증성 피부 병변에서는 피부의 KC로부터 IL-18이 국소적으로 지나치게 생성되고, 이에 의해 혈청 중에서 고 레벨의 IgE의 발현이 보이는 경우도 있다. 그래서, 상기 환경 형성 단계 및 저해제 동정 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 이용함으로써 IL-18의 분비를 저해하는 물질을 얻는 것이 가능하게 된다. 얻어진 물질(저해제)은, AD의 유효한 치료 약제로 될 수 있다.

또한, 본 발명의 AD 유사 염증성 피부 병변이란 IL-18 의존적으로 발증하는 면역 질환으로, 피부에 염증이 나타나는 증상을 넓게 가리키는 것이며 엄밀하게 AD라고 인식된 소양성 만성염만을 가리키는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 「시험관 내(in vitro)」란 배양 세포에 의해 인공적으로 재현되는 반응계를 가리키는 것이며 「생체 내(in vivo)」란 완전한 개체에서의 반응계를 가리키는 것이다.

또한, 본 발명에서 「저해제」는 KC로부터 IL-18의 분비를 저해하는 물질이면 되고, 그 저해의 구체적인 메카니즘은 특별히 한정되는 것이 아니다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법으로 얻어지는 저해제는 상기 KC로부터 IL-18의 분비의 과정을 가역적으로 저해하는 것이어도 되고 불가역적으로 저해하는 것이어도 된다. 또한, 가역적으로 저해하는 저해제의 경우, 경합형(길항형)의 저해제(길항제)이어도 되고 비경합형의 저해제이어도 된다. 다시 말하면, 본 발명의 스크리닝 방법에서는 길항제를 포함하는 등의 다양한 종류의 저해제를 스크리닝할 수 있다.

<환경 형성 단계>

상기 환경 형성 단계는 자극제에 의한 자극으로 KC로부터의 IL-18의 생성을 유도하는 환경을 형성하는 단계이면 되고 환경 형성에 관한 상세한 조건에 대해서는 특별히 한정되는 것이 아니다. 예를 들면, 상기 IL-18의 생성을 유도할 수 있는 환경을 실현할 수 있다면 생체 내이거나 시험관 내이어도 가능하다.

상기 자극제로는 KC를 자극하는 것이 가능한 각종 단백질(KC 자극 단백질)을 들 수 있다. 해당 KC 자극 단백질로는 KC를 자극하는 것이 가능한 단백질이라면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 대표적인 것으로서 황색 포도상 구균(S. aureus) 유래의 프로테인 A(SpA)를 들 수 있다.

상기한 바와 같이, 황색 포도상 구균의 감염이 AD의 유인 또는 증악 인자인 것은 지금까지 알려져 있고, 또한 본 발명자들에 의해 SpA를 마우스에게 SDS와 함께 도포하면 단기간내에 AD 유사의 소양성 만성 피부염를 유도할 수 있음이 발견되었다(실시예 참조). 따라서, KC 자극 단백질로서 상기 SpA를 특히 바람직하게 이용할 수 있다.

상기 SpA는, 황색 포도상 구균으로부터 얻어지는 완전 단백질(완전한 아미노산 서열을 갖는 단백질)이어도 되지만, 케라티노사이트를 자극하는 것이 가능하다면 SpA의 부분 단백질이나 완전 단백질 또는 부분 단백질의 개변체이어도 된다.

상기 개변체란 공지의 SpA의 아미노산 서열에서 1개 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 B7-2 분자의 세포 표면에서의 발현을 마이너스로 제어하는 단백질을 가리키는 것으로 한 다. 또한, 상기 「1개 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된」이란, 부위 특이적 돌연변이 유도법 등의 공지의 변이 단백질 제조법에 의해 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가할 수 있는 정도의 수(바람직하게는 10개 이하, 더 바람직하게는 7개 이하, 더욱 바람직하게는 5개 이하)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되는 것을 의미한다. 이와 같이, 상기 개변체는 상기 SpA의 변이 단백질이고, 여기서 말하는 「변이」는, 주로 공지의 변이 단백질 제조법에 의해 인위적으로 도입된 변이를 의미하지만, 천연에 존재하는 것과 마찬가지의 변이 단백질을 단리 정제한 것이어도 된다. 또한, 상기 SpA의 개변체는 부가적인 폴리펩티드를 포함하는 것이어도 된다.

또한, 상기 자극제로는 SpA에 첨가하여 SDS를 병용하는 것이 더 바람직하다. SDS와 프로테인 A를 병용함으로써 더 심한 AD 유사의 소양성 만성 피부염을 유도할 수 있다(실시예 참조). SpA와 SDS의 병용 방법에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, SpA를 용해하는 용매에 SDS를 첨가한 SpA-SDS 용액을 조제하고, 이것을 모델 생물의 피부에 도포하면 된다.

<KC의 자극 방법>

상기 KC 자극 단백질에 의한 KC의 자극 방법에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니며, KC를 자극하여 IL-18의 생성을 유도할 수 있는 방법이면 된다. 구체적으로는, 예를 들면 상기 환경 형성 단계이 시험관 내에서 실시되는 경우, KC 배양 세포의 배양액에 상기 SpA를 첨가하여 배양하면 된다. 이 때 이용되는 KC의 배양 세포에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니며 공지의 배양 세포를 바람직하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 실시예 6에서는 PAM212 세포를 이용하고 있다.

상기 KC의 배양 세포의 배양 조건, 즉 배양액이나 배양 온도, SpA의 첨가의 방법 등에 대해서도 특별히 한정되는 것은 아니며 이용되는 배양 세포의 종류에 따라 적당한 조건을 설정하면 된다.

한편, 상기 환경 형성 단계이 생체 내에서 실시되는 경우, 상기 SpA를 숙주로 되는 생물의 피부에 도포하면 된다. SpA를 도포하는 조건은 특별히 한정되는 것은 아니며 SpA에 의한 KC의 자극을 방해하지 않는 방법이면 된다. 예를 들면, 후술하는 실시예에서는 SpA를 50% 글리세롤의 PBS 용액으로 이용하고 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것이 아니다. 또한, 상기한 바와 같이 SpA에 SDS를 첨가한 SpA-SDS 용액을 제조하고 이것을 숙주 생물의 피부에 도포해도 된다. 또한, 도포 조건, 예를 들면 도포 방법이나 숙주 생물에 도포하는 부위에 대해서도 특별히 한정되는 것이 아니다.

이때 이용되는 숙주 생물로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로 각종 실험에 이용되고 있는 포유동물을 이용하면 된다. 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 원숭이 등의 실험 동물을 들 수 있다. 예를 들면, 후술하는 실시예에서는 숙주 생물로서 마우스를 이용하고 있다. 특히, 마우스는 실험 동물로서 널리 이용되고 있고, 여러 가지 돌연 변이체의 계통이 입수 용이한 등의 실적이 있으며, 개체가 작기 때문에 사육용 공간을 비교적 작게 할 수 있는 등의 이점이 있 기 때문에 바람직하다.

<피부 조각의 이식>

상기 환경 형성 단계이 생체 내에서 실시되는 경우, 상기 자극제로서 SpA 등의 KC 자극 단백질 이외의 것을 이용할 수 있다. 대표적인 것으로서 AD 유사의 염증성 피부 병변이 생긴 피부(병변 피부)를 이용할 수 있다. 이 병변 피부의 피부 조각을 숙주 생물에 이식함으로써 IL-18의 생성을 유도할 수 있는 환경을 실현할 수 있다.

상기 병변 피부는 AD 유사의 염증성 피부 병변이 생긴 피부라면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 이식의 관계에서 숙주 생물과 동종 생물의 피부인 것이 매우 바람직하다. 이종 생물의 경우, 거절 반응과 같은 AD 유사의 염증성 피부 병변 이외의 원인으로 면역 반응이 생기기 때문에 바람직하지 못하다. 상기 숙주 생물로는 KC 자극 단백질에 관한 설명에서도 기술한 바와 같이, 각종 실험 동물을 들 수 있지만, 예를 들면 숙주 생물로서 마우스를 이용하는 경우, 이식되는 병변 피부의 피부 조각도 마우스 유래인 것이 매우 바람직하다(후술하는 실시예 참조).

여기서, 상기 숙주 생물은 적어도 (ⅰ) CD4⁺ T 세포의 발현, (ⅱ) stat6의 발현, 및 (ⅲ) NK T 세포에서의 IL-18Rα쇄의 발현이라는 각 형질을 모두 구비하고 있을 필요가 있다. 후술하는 실시예 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, CD4 결실 마우스, stat6 결실 마우스, IL-18Rα쇄 결실 마우스는 모두 KCASP1Tg 마우스 로부터 얻어지는 병변 피부의 피부 조각을 이식해도 IgE의 생성이 유도되지 않았다. 즉, IL-18의 생성을 유도할 수 있는 환경을 실현하기 위해서는 상기 (ⅰ) 내지 (ⅲ)의 각 형질이 필요 조건으로 된다.

또한, 상기 CD4⁺ T 세포는 항원 CD4(핼퍼 세포의 세포막 당단백질의 하나)를 발현하는 T 세포를 나타낸다. CD4의 발현의 유무에 대해서는, 오른쪽 위에 붙은 플러스 또는 마이너스로 나타낸다. 그러므로, CD4에 대해서는 발현하고 있는 경우에는 「CD4⁺」로 나타내고, 발현하고 있지 않은 경우에는 「CD4^-」로 나타낸다. 또한, 상기 stat6(STAT6)은 사이토카인의 작용 기구에 관여하는 세포내 시그널 전달 분자로서 IL-4에서 특이적으로 활성화되며 상기 IL-18Rα 쇄는 T 세포에 발현하여 IL-18의 응답에 관여하는 구조이다.

<저해제 동정 단계>

상기 저해제 동정 단계에서는 상기 환경 형성 단계에서 형성된 IL-18의 생성을 유도할 수 있는 환경 하에서 후보 물질을 투여하여 상기 케라티노사이트에 의한 인터루킨 18의 생성 유도를 저해하는 물질을 동정하는 단계이라면 특별히 한정되는 것이 아니다. 이 단계에서 동정된 물질이 IL-18의 분비의 유도를 저해하는 저해제로 될 수 있다.

상기 후보 물질을 투여하는 수법은 특별히 한정되는 것이 아니다. 예를 들면, 시험관 내이면 KC의 배양 세포를 배양하고 있는 배양액에 후보 물질을 투여하 면 된다. 또한, 생체 내이면 숙주 생물에서의 염증 부위에 후보 물질을 도포해도 되고, 숙주 생물에 후보 물질을 내복시켜도 된다. 또한, 상기 저해제를 동정하는 수법도 특별히 한정되지 않고, KC에 의한 IL-18의 생성 유도가 저해되어 있는 것을 확실히 확인할 수 있는 방법이면 된다. IL-18의 생성을 유도할 수 있는 환경이 시험관 내이거나 또는 생체 내에서도 ELISA를 이용한 cell-free system 등을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법은 상기한 환경 형성 단계 및 저해제 동정 단계를 포함하고 있으면 그 구체적인 수법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 물론 그 밖의 단계를 포함하고 있어도 된다.

<면역 질환 치료 약제, 고 레벨 IgE 발현의 억제 방법>

또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법을 이용하여 얻어지는 저해제를 포함하는 면역 질환 치료 약제가 포함된다. 이 면역 질환 치료 약제의 구체적인 조성등에 대해서는 특별히 한정되는 것이 아니며, 스크리닝된 저해제의 종류와 투여 대상으로 되는 생물(인간도 포함함)의 상태에 따라 적절한 버퍼나 첨가제를 포함하고 있으면 된다.

또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법을 이용하여 얻어지는 저해제 또는 상기 면역 질환 치료 약제를 이용한 고 레벨 IgE 발현의 억제 방법도 포함된다.

이 방법에서는, 상기 저해제 또는 면역 질환 치료 약제를 이용함으로써 KC로부터 생성된 IL-18의 국소적인 집적에 의해 항원에의 폭로 없이 야기되는 전신성의 IgE 반응을 억제한다. 그 결과, 아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변에서 생기는 혈청 중의 고 레벨의 IgE 발현이라는 현상을 억제 또는 저해할 수 있다.

KC로부터 IL-18의 생성 유도는 직접적으로 AD의 발증으로 이어지는 경우도 있고, 고 레벨의 IgE 발현을 유도하여 AD의 발증으로 이어지는 경우도 있다. 본 발명에서는, 상기 어느 경우이든 AD의 병상을 유효하게 치료 또는 완화할 수 있다.

(2) 본 발명의 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법

상기 (1)에서는 본 발명 중 AD나 그 유사 증상의 치료 약제를 후보 물질로부터 스크리닝하는 방법에 대하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것이 아니며, AD나 그 유사 증상의 발증 기구를 해명하는 목적에서 모델 생물에 AD 유사의 염증성 피부 병변을 발증시키는 AD 유사 증상의 유도 방법도 포함된다.

본 발명의 AD 유사 증상의 유도 방법은, 상기 (1)의 환경 형성 단계에서, KC 자극 단백질을 자극제로서 이용한 경우에 대하여 설명한 바와 같이, 황색 포도상 구균 유래의 프로테인 A를 숙주 생물의 피부에 도포하는 방법이면 된다. 이 때의 도포 조건 등에 대해서도 상기 (1)과 마찬가지로 특별히 한정되는 것이 아니다.

또한, 상기 프로테인 A로는 상기 (1)에서도 설명한 바와 같이, 해당 프로테인 A의 완전 단백질, 케라티노사이트를 자극하는 것이 가능한 상기 프로테인 A의 부분 단백질 또는 케라티노사이트를 자극하는 것이 가능한 상기 프로테인 A 또는 그 부분 단백질의 개변체 중 적어도 어느 하나이면 된다.

또한, 상기 숙주 생물로도, 상기한 바와 같이, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 원숭이 등의 실험 동물, 특히 마우스 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 다시 말하면, 본 발명은 상기 유도 방법에 의해 얻어진 염증성 피부 병변을 발증하는 모델 생물이 포함된다.

(3) 본 발명의 이용

본 발명의 스크리닝 방법 및 AD 유사 증상의 유도 방법은 상기한 바와 같이 AD나 그 유사 증상의 발증 기구의 해명이나 치료 약제의 개발에 적합하게 이용할 수 있다. 여기서, 본 발명의 상기 각 방법은 키트에 의해 실현되어도 된다. 즉, 본 발명은 상기 스크리닝 방법을 실시하기 위한 스크리닝 키트 또는 상기 AD 유사 증상의 유도 방법을 실시하기 위한 유도 키트가 포함될 수 있다.

상기 스크리닝 키트의 구체적인 구성은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 적어도 자극제(특히 KC 자극 단백질, 촉진 물질)와 저해제 동정 단계에서 이용되는 각종 물질류(예를 들면 SpA의 결합 단백질과 시그널 전달 분자 등)를 포함하는 구성을 들 수 있다. 마찬가지로, AD 유사 증상의 유도 키트의 구체적인 구성도 특별히 한정되는 것은 아니지만, SpA 용액과 SpA를 효율적으로 도포할 수 있도록 하는 도포 수단을 포함하는 구성을 들 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법은 AD 유사의 염증성 피부 병변을 치료하는 면역 질환 치료 약제의 스크리닝에 적합하게 이용된다. 또한, 본 발명의 AD 유사 증상의 유도 방법은 AD 유사 증상을 모델 동물에게 인공적으로 발증시킴으로써, AD 유사 증상의 발증 기구의 해명에 이용하는 것이 가능하지만, 나아가 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어진 저해제의 효과를 검증하기 위해 이용할 수도 있다.

예를 들면, 본 발명의 스크리닝 방법으로서 환경 형성 단계를 시험관 내에서 실현하는 수법에 의해 어떤 저해제(예를 들면, 물질 X라 함)가 얻어졌다고 한다. 이 경우, KC의 배양 세포에서의 물질 X의 효과를 보고 있는 것으로 된다. 그래서, 본 발명의 AD 유사 증상의 유도 방법을 이용하여 AD 유사 증상이 발증한 마우스를 제작하고, 이것을 이용하여 물질 X의 효과를 in vivo에서 검증할 수 있다.

또한, 본 발명의 이용 방법은 상기한 예에 한정되는 것이 아니라, 다른 다양한 용도에도 이용하는 것이 가능한 것은 말할 필요도 없다.

이와 같이, 본 실시 형태에서는 구체적인 예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 형태만에 한정되는 것이 아니며, 본 발명은 그 취지를 일탈하지 않은 범위 내에서 당업자가 갖는 지식에 기초하여 다양한 개량, 변경, 수정을 가한 태양으로 실시할 수 있다.

이하, 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것이 아니다. 또, 실시예에서 이용된 마우스 및 시약, 그리고 구체적인 실험 방법의 상세 내용을 다음에 나타낸다.

[마우스]

암컷의 C57BL/6(B6) 야생형 마우스(6-10주)는 CLEA(Japan)사로부터 구입하였다. B6 배경 CD4 결실 마우스(암컷, 6-10주)는 동경대학의 Taniguchi 박사의 호의에 의해 제공받았다. B6 배경 stat6 결실 마우스(암컷, 6-10주)는 오사카대학의 Takeda 박사의 호의에 의해 제공받았다(Takeda, K., Tanaka, T., Shi, W., Matsumoto, M., Minami, M., Kashiwamura, S., Nakanishi, K., Yoshida, N., Kishimoto, T. and Akira. S., 1996. Essential role of STAT6 in IL-4 signaling. Nature 380:627 참조).

B6 마우스와 F10 마우스(암컷, 6-10주)를 교배한 IL-18Rα 결실 마우스는, 오사카대학의 Hoshino 박사로부터 제공받았다(Hoshino, K., Tsutsui, H., Kawai, T., Takeda, K., Nakanishi, K., Takeda, Y. and Akira, S. 1999. Generation of IL-18 receptor-deficient mice: evidence for IL-1 receptor-related protein as an essential IL-18 binding receptor. J. Immunol. 162:5041 참조).

피부 이식 조각의 도너로는 높은 혈청 중 IgE 농도(10-12㎍/㎖) 및 IL-18 농도(5-7ng/㎖)를 갖는 만성 피부 질환을 앓는 암컷 마우스를 선택하여 이용하였다. 카스파제-1 결실 마우스를 B6 야생형 마우스와 교배하여 얻어진 F6 마우스(암컷, 6-10주)를 이용하였다(Seki, E., Tsutsui, H., Tsuji, N. M., Hayashi, N., Adachi, K., Nakano, H., Futatsugi-Yumikura, S., Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S., Fujimoto, J. and Nakanishi, K. 2002. Critical roles of myeloid differentiation factor 88-dependent proin flammatory cytokine release in early phase clearance of Listeria monocytogenes in mice. J. Immunol. 169:3863 참조). B6/129 배경의 골수 분화 팩터 88(MyD88) 결실 마우스, Toll 유사 리셉터(TLR)2 결실 마우스의 F4 마우스(암컷)는 오사카대학의 Akira 박사로부터 제공받았다(Seki et al 참조). 모든 마우스는 무균 상태 하에 두었다.

[시약]

황색 포도상 구균 Cowan1로부터 정제한 SpA는 Calbiochem사로부터 구입하였다. 대장균(055;B5)의 리포다당류(LPS)는 Difco사로부터 구입하였다. Murine Fas 리간드 트랜스팩턴트(mFasL)에 대해서는 비특허 문헌 6을 참조. 넓은 범위에서 활성을 저해하는 카스파제 저해제인 z-VAD-FMK(ZVAD)와 카스파제-1의 특이적인 저해제인 Ac-YCAD-CMK(YVAD)는 Peptide Institute사로부터 구입하였다. 본 실시예에서는, 10% FCS, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50μM 2-메르캅토에탄올 및 2mM L-글루타민을 포함하는 RPMI1640을 통상의 배양액으로서 이용하였다. 마우스의 케라티노사이트 세포주 PAM212는, 동경 대학의 Tamaki 박사로부터 제공받았다.

[피부 이식]

피부 표본(1㎠)은 야생형 B6 마우스의 정상 피부 또는 KCASP1Tg 마우스의 병변을 발증한 피부(병변 피부) 또는 발증하지 않은 피부(비병변 피부)로부터 얻은 후에, 야생형 B6 마우스, CD4 결실 마우스, stat6 결실 마우스, 또는 IL-18Rα 결실 B6 마우스의 등에 이식하였다. 피부 표본으는 KCASP1Tg의 병변 피부 또는 비병변 피부에 대해서는 2조각의 이식 조각을 얻었다.

피부 이식 후, 레시피엔트는 가능한 모든 감염을 막기 위해서 1㎎/㎖의 황산네오마이신(Sigma사 제조) 및 1000U/㎖의 황산 polymixinB(Sigma사 제조)를 첨가한 음료수를 주었다. 적당히, IgE 농도를 결정하기 위해 혈청을 샘플링하였다.

이식된 각각의 숙주에서의 이식 피부의 생착률은 48일째까지 관찰하였다. 조직학적인 연구를 위해 헤마톡시린과 에오진으로 피부 표본을 염색하였다(비특허 문헌 3, 4 참조).

[피부 용해물]

피부 표본(1㎠)은 야생형의 B6 마우스 또는 KCASP1Tg 마우스로부터 얻은 후에 해당 피부 표본으로부터 조제한 표피 시트는 PBS(인산 완충 정리 식염수)에서 4℃로 동질화하여 여과하였다. 각각의 용해물 중에 포함되는 각종 사이토카인 및 단백질의 농도를 사이토카인용 시약 및 단백질 평가 시약(Pierce사 제조)을 이용하여 ELISA 키트에 의해 측정하였다.

[Th1/Th2 분화]

비장의 CD4⁺ T 세포는, AutoMACS(Miltenyi Biotec사 제조)를 이용하여 다양한 수법으로 처리한 마우스로부터 단리하였다. 새롭게 단리한 비장 세포는 항CD4 비즈(Miltenyi Biotec사 제조)와 함께 항온처리하였다. CD4⁺ T 세포의 순도는 98% 초과였다. 세포(1×10⁶/㎖)는, 고상화된 항CD3ε(PharMingen사 제조)과 함께 48시간 항온처리하고, 각각의 상등액의 IFN-γ 및 IL-4의 농도를 ELISA법에 의해 결정하였다.

[사이토카인 및 IgE의 평가]

IL-18 농도는 MBL사 제조 ELISA 키트에 의해 결정하였다. IL-4, IFN-γ 및 IL-1β는, Genzyme사 제조 ELISA 키트에 의해 결정하였다. IL-5의 ELISA 키트는, Endogen사로부터 구입하였다. 혈청 IgE 농도는, PharMingen사 제조 ELISA 키트에 의해 결정하였다. IL-18의 IFN-γ 유도능은, LNK 시리즈라 명명된 IL-18 응답성의 마우스 NK 세포 클론을 이용하여 바이오 분석에 의해 결정하였다(비특허 문헌 6 외 참조).

구체적으로는, LNK5E6 세포는, LNK5E3 세포보다, IFN-γ 생성에 관해서는 IL-18 자극에 대하여 더 높은 응답성을 갖고 있고(비특허 문헌 6 참조), 이 세포를 각종 샘플 및 100pg/㎖의 IL-12와 함께, 항IL-18 항체(50㎍/㎖)의 존재 하 또는 부존재 하에서 48시간 항온처리하였다. IL-18의 활성도는, 다음 식에 나타내는 바와 같이, IL-18에 대한 응답에 있어서, 세포에 의해 생성되는 IFN-γ의 농도로서 정의된다(비특허 문헌 6 참조).

IL-18 활성도=(항IL-18 항체의 부존재 하에서의 상등액 중의 IFN-γ)-(항IL-18 항체의 존재 하에서의 상등액 중의 IFN-γ).

[SpA의 도포]

여러 가지 양의 SpA를, 5㎕의 용매(50% 글리세롤의 PBS 용액)에 녹인 것(SpA 용액)을 조제하고, 이 SpA 용액을 야생형의 귀 피부에, 14일간 매일 도포하였다. 컨트롤로서, SpA를 포함하지 않은 5㎕의 용매를 이용하였다. 다른 마우스의 영향을 피하기 위해, 마우스를 개별 케이지에 넣었다.

[KC의 조제]

KC는, Dr. Tamaki 등에 의해 나타내진 방법(Vestergaard, C., Yoneyama, H., Murai, M., Nakamura, K., Tamaki, K., Terashima, Y., Imai, T., Yoshie, O., Irimura, T., Mizutani, H., et al. 1999. Overproduction of Th2-specific chemokine in NC/Nga mice exhibiting atopic dermatitis-like lesions. J. Clin. Invest. 104:1097, 또는, Tamaki, K., Stingl, G., Gullino, M., Sachs, D. H. and Katz, S. I. 1979. la antigens in mouse skin are predominantly expressed on Langerhans cell. J. Immunol. 123:784 참조)에 따라서, 각종 유전자형의 마우스로부터 조제하고, 표면 분자의 발현을 정상으로 회복시키기 위해, 하룻밤 배양액 속에서 항온처리하였다. DC를 제거하기 위해, KC를 CD11c 마이크로비즈(Miltenyi Biotec사 제조)와 함께 항온처리한 후, CD11c⁺ 세포는 AutoMACS를 이용하여 제거하였다.

KC(5×10⁵/㎖) 또는 PAM212 세포(2×10⁵/㎖)는, 여러 가지 양의 SpA와, 1㎍/㎖의 LPS 또는 mFasL(1×10⁶/㎖)과 함께 24시간 항온처리하였다. 일부의 실시예에서는, 야생형의 KC를, 20μM의 ZVAD 또는 YVAD의 존재 하에서, 100㎍/㎖의 SpA와 함께 24시간 항온처리하였다. 각각의 상등액에서의 IL-18 농도 및 그 활성도는, ELISA와 바이오 분석에 의해 각각 결정하였다. 일부의 실시예에서는, KC는 500㎍/㎖의 SpA와 함께 4시간 항온처리하고, 총 RNA를 추출하여, RT-PCR(Tsutsui, H., Matsui, K., Kawada, N., Hyodo, Y., Hayashi, N., Okamura, H., Higashino, K. and Nakanishi, K. 1997. IL-18 accounts for both TNF-α- and Fas ligand-mediated hepatotoxic pathways in endotoxin-induced liver injury in mice. J. Immunol. 159:3961 참조)을 행하였다. IL-18, IL-12p35, IL-12p40 또는β-악틴을 위한 프라이머 및 각각의 사이토카인에 대한 PCR의 조건에 대해서는, 상기 Tsutsui et al.을 참조.

[Kupffer 세포의 조제]

Kupffer 세포(쿠퍼 세포)의 조제는, 비특허 문헌 6에 따라서 행하였다. Kupffer 세포(1×10⁶/㎖)는, 1㎍/㎖의 LPS(리포다당류)와 함께 4시간 항온처리하고, 이들의 IL-18, IL-12p35, IL-12p40 및 β-악틴의 발현을 RT-PCR에 의해, mRNA 농도로서 결정하였다.

[FACS(형광 표시식 세포 분취기) 분석]

DC, CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포의 비율은, 비특허 문헌 6에 따라서 조제한 KC를, 피코에리트린(PE)를 결합한 항CD11c 항체(PharMingen사 제조)와 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC)를 결합한 항I-A^b 항체(PharMingen사 제조)와, 또는 PE를 결합한 항CD4 항체(PharMingen사 제조)와 FITC를 결합한 항CD8 항체(PharMingen사 제조)와 항온처리한 후, 이색 플로사이토메트리 분석에 의해 결정하였다.

[통계량]

모든 데이터는 3개 세트의 평균과 표준 편차로서 나타냈다. 대조군과 처치군 사이의 유의성은, 독립한 스튜던트 테스트에 의해 행하였다. P<0.05가 유의하다고 하였다.

실시예 1 KCASP1Tg 마우스로부터의 피부 이식 조각의 이식에 의한 IgE 의 유도

먼저, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부가 동 계통의 정상인 야생형 마우스에게 이식되면 혈청 IgE 농도의 상승을 유도할 가능성을 조사하였다. 구체적으로는, 각각의 이식에서의 피부 이식 조각의 조건을 표준화하기 위해 귀, 얼굴 및 몸체에 만성 피부염를 일으키고, 혈청 중에 일정한 IL-18 및 IgE 농도를 갖는 KCASP1Tg 마우스를 도너로서 선택하였다. KCASP1Tg 마우스의 병변 피부 조각 또는 비병변 피부 조각을 정상인 B6 마우스에게 이식하고 숙주의 혈청 IgE 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1에서 그래프 중의 검은색 원 및 오른쪽 위의 사진은 정상 B6 마우스에게 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부를 이식한 결과를 나타내고, 그래프 중의 사선을 그은 원 및 오른쪽 중앙의 사진은 KCASP1Tg 마우스의 비병변 피부를 이식한 결과를 나타내며 그래프 중의 정사각형 및 오른쪽 아래의 사진은 야생형 마우스의 정상인 피부를 이식한 결과를 나타낸다. 그래프에 나타난 시점에서 ELISA에 의한 IgE 측정를 위해 혈청을 샘플링함과 동시에 이식한 피부의 생착률을 관찰하였다(도 1의 상방:이식 피부의 생착률). 데이터는 각각의 실험군에서의 3마리의 마우스의 평균과 표준 편차를 나타낸다. 이식한 피부의 생착률은 상방의 패널에 나타낸다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 비병변 피부를 이식한 B6 마우스가 지연된 약한 IgE 응답을 나타낸 데 비하여 병변 피부를 이식한 마우스의 경우는 그 혈청 중의 IgE 농도는 조기에 상승하였다. 야생형 마우스의 피부 이식 조각을 이식한 컨트롤의 B6 마우스에서는 IgE의 상승은 보이지 않았다. 병변 피부를 이식한 B6 마우스는 높은 혈청 IgE 농도를 나타내지만, 이식 조각을 떼어낸 후에는 농도가 저하한 다. 한편, 비병변 피부를 이식한 B6 마우스는 낮은 IgE 농도를 유지한다. 또한, 병변 피부를 이식한 B6 마우스는 병변 피부의 거부 반응 후에도 혈청 IgE 농도는 다시 상승한다.

데이터는 나타내지 않았지만, 혈청 IL-18 농도는 어떤 타입의 피부 이식 조각에 의한 자극 후에도 상승하지 않았다. 마찬가지로 데이터는 나타내지 않았지만, 혈청 IL-4 또는 IL-6 농도는 시판의 ELISA 키트에서는 검출되지 않았다. 이들 결과로부터 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부는 정상인 B6 마우스에게 이식되었을 때에 전신성의 IgE 상승을 지속적으로 유도하는 것이 나타난다. 이는, IL-18의 투여를 정지시킨 후에 즉시 정지하는 외인성 IL-18 의존성의 IgE 생성(미공개 데이터)과 대조적이다.

실시예 2 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부에서의 IL-18- 및 Th2 - 관련 사이토카인의 집적

병변 피부의 이식만이 숙주에서의 IgE 응답을 효과적으로 유도하는 메카니즘을 해명하기 때문에, 병변 피부의 이식 조각과 비병변 피부의 이식 조각에서의 IL-18 농도를 비교하였다. 각 피부의 이식 조각은 각각 전술한 바와 같이 용해물로 한 후 IL-18의 농도를 측정하였다. 그 결과를 도 2(A) 내지 도 2(F)에 나타내었다.

도 2(A) 내지 도 2(F)에서는 검은색의 막대그래프가 2마리의 KCASP1Tg 마우스로부터 샘플링된 병변 피부의 표본의 결과를 나타내고, 사선을 그은 막대그래프 가 2마리의 KCASP1Tg 마우스로부터 샘플링된 비병변 피부의 표본의 결과를 나타내고, 흰색의 막대그래프가 3마리의 야생형 마우스로부터 샘플링한 컨트롤로서의 피부 표본 결과를 나타낸다. 또한, 도 2(A)는 상기 각 피부 표본의 용해물 중에서의 IL-18의 농도를 나타내고, 마찬가지로 도 2(B)는 IL-18의 활성도(IL-18 응답성의 LNK5E6 세포에 의한 IFN-γ 생성)를 나타내고, 도 2(C)는 IL-1β의 농도를 나타내고, 도 2(D)는 IFN-γ의 농도를 나타내고, 도 2(E)는 IL-4의 농도를 나타내고, 도 2(F)는 IL-5의 농도를 나타낸다. 각 결과는 각각의 샘플에서의 3개의 독립한 실험 결과의 평균과 표준 편차를 나타낸다. 또, ND는 검출되지 않았음을 나타낸다.

도 2(A)에 나타낸 바와 같이, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부의 용해물은 ELISA에서 높은 IL-18 농도를 나타내고, IL-18의 전구체 및 성숙형의 양쪽이 검출되었다. 한편, KCASP1Tg 마우스의 비병변 피부의 용해물에서는 낮은 IL-18 농도만 나타나고, 야생형 마우스 피부의 용해물에서는, IL-18의 농도는 가장 낮았다.

여기서, IL-18에 대한 면역 블롯 분석으로부터 KCASP1Tg 마우스 피부의 병변 부위는 생리 활성을 갖는 18 kDa의 IL-18과 24 kDa의 IL-18 전구체의 쌍방을 발현하고 야생형 마우스의 피부 및 KCASP1Tg 마우스의 비병변 피부는 24 kDa의 IL-18 전구체만을 발현하는 것이 알려져 있다. 그래서, 이를 확인하기 위해, IL-18에 대한 바이오 분석을 행하였다. 그 결과, 도 2(B)에 나타낸 바와 같이, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부는 IL-18에 의한 IFN-γ 유도 활성도의 역가가 높은 것을 나타냈다. 한편, 비병변 피부는 거의 활성을 나타내지 않았다. 또한, B6 마우스의 정상 피부에는 그와 같은 생리 활성을 갖는 IL-18은 존재하지 않는다.

또한, 도 2(C)에 나타낸 바와 같이, IL-1β도 병변 피부에서만 KC에 농축되어 있었다. 또, IL-18, IL-1β에 추가하여 다른 카스파제-1 생성물도 병변 피부에서만 KC에 농축되는 것이 알려져 있다. 이와 같이 숙주 중의 IgE 농도는, 이식된 이식 조각에서의 IL-18 및 IL-1β의 농도와 대응하고 있다.

다음으로, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부의 용해물 중에서의 IFN-γ, IL-4 및 IL-5의 농도를 측정하였다. 그 결과, 도 2(D) 내지 도 2(F)에 나타낸 바와 같이, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부의 용해물 중에서는 IFN-γ, IL-4 및 IL-5의 농도는 야생형 마우스나 KCASP1Tg 마우스의 비병변 피부의 용해물과 비교하더라도 전부 상승하였다. 이와 같이, 병변 피부의 이식 조각은 대량의 IL-18, IL-1β, IFN-γ, IL-5 및 IL-4을 축적하고 있다.

KCASP1Tg 마우스의 병변 피부에는 어떤 타입의 세포가 집적하고 있는지를 조사하기 위해, FACS에 의해, KC 표본 중의 CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, 수상 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 도 3(A) 내지 도 3(F)에 나타낸다.

도 3(A) 도 3(D)는, 야생형 마우스의 정상 피부, 도 3(B) 도 3(E)는, KCASP1Tg 마우스의 비병변 피부, 도 3(C), 도 3(F)는, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부로부터 얻어진 KC 표본의 결과를 나타낸다.

도 3(A) 내지 도 3(C)는, 각 KC 표본과 PE를 결합한 항CD4 항체 및 FITC를 결합한 항CD8 항체를 항온처리한 결과이고, 도 3(D) 내지 도 3(F)는, 각 KC 표본과 PE를 결합한 항CD11c 항체와 FITC를 결합한 항I-A^b 항체를 항온처리한 결과를 나타 낸다. 또한, 도 3(A)내지 도 3(F)의 각각에서는 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포의 비율과 CD11c⁺ DC 및 I-A^b ⁺ DC의 비율을 나타낸다. 각 결과는 각각의 실험군에서의 3마리의 마우스 중 1마리의 결과만을 나타낸다.

도 3(A) 내지 도 3(F)에 나타낸 바와 같이, 병변 피부에서는 야생형 마우스와 비교하여 CD4⁺ T 세포의 수가 실질적으로 상승했다. 또한, 이들 3 타입의 레시피엔트의 사이에서는 CD8⁺ T 세포 또는 DC의 비율에는 차이가 없었다.

데이터는 나타내지 않았지만, 비만 세포의 수는 야생형 마우스와 비교하여 KCASP1Tg 마우스에서는 병변 피부에서 현저히 상승하고, 비병변 피부에서는 상승하지 않았다. 이 결과는, 본 발명자들에 의한 이전의 보고(비특허 문헌 4)와 일치한다. 이와 같이, CD4⁺ T 세포는 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부에서 우선적으로 집적된다. 또한, 병변 피부에는 비만 세포도 다수 집적하고 있다.

실시예 3 병변 피부를 이식받은 마우스에서의 Th1 세포 및 Th2 세포의 유도

IgE 응답은 통상 Th2 세포의 활성화를 필요로 하기 때문에, 다음으로, 병변 피부의 이식 후에 숙주 중의 CD4⁺ T 세포가 Th2 세포로 분화하는지를 조사하였다. 구체적으로는, 정상 B6 마우스에 대하여 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부, 비병변 피부 또는 야생형 마우스의 정상인 피부를 이식하고, 21일 후에 비장의 CD4⁺ T 세포를 고상화된 항CD3와 함께 48시간 항온처리하고, 상등액에서의 IL-4 농도(검은색 막대그래프)와 IFN-γ 농도(흰색 막대그래프)를 ELISA로 결정하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.

도 4에서는, IL-4 농도를 검은색의 막대그래프로 나타내고, IFN-γ 농도를 흰색의 막대그래프로 나타낸다. 각각의 데이터는, 3개의 세트의 평균과 표준 편차를 나타낸다. 3개의 독립적인 실험으로부터 유사한 결과가 얻어졌다. 또, NS는 유의성이 없음을 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부를 이식한 후, 21일째의 숙주에서의 비장의 CD4⁺ T 세포는, 정상인 B6 마우스의 피부를 이식한 숙주와 비교하여, 고상화된 항CD3에 응답하여 IL-4 및 IFN-γ의 쌍방을 다량으로 생성하였다.

이에 대하여, 비병변 피부를 이식한 레시피엔트에서는, 비장의 CD4⁺ T 세포는, B6 야생형 마우스의 피부를 이식한 레시피엔트의 것에 필적하는 정도의 양의 IL-4와 IFN-γ를 생성하였다(플레이트 결합 항CD3에 대한 응답). 그러나, 데이터는 나타내지 않지만, 이식 후 7일째에서는, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부 또는 비병변 피부를 이식한 레시피엔트의 CD4⁺ T 세포는, 야생형 마우스의 정상인 피부를 이식한 컨트롤의 레시피엔트의 CD4⁺ T 세포와 같은 정도의 양의 IL-4와 I FN-γ만 분비하였다.

이들 결과는, CD4⁺ T 세포가 Th1/Th2 세포로 분화하기 위해서는, 병변 피부의 이식 조각의 이식에 의한 자극으로부터 2-3주간이 필요함을 나타낸다.

실시예 4 IL-18, CD4 및 stat6 에 의존하는 IgE 의 유도

KCASP1Tg 마우스의 병변 피부가, IgE를 유도하는 메카니즘을 세포 레벨로 분석하였다. 그런데, CD4⁺ T 세포를 제외한 마우스는 IL-18을 투여받더라도 혈청 IgE 농도의 상승이 보이지 않는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 숙주 유래의 CD4⁺ T 세포가 본래 필요로 되는 것인지, 또는, 병변 피부에 침윤한 IL-4를 생성하는 도너 T 세포(도 2(E) 참조)가, IgE 유도에 필요한 조건을 구비하고 있는지를 조사하였다.

구체적으로는, 야생형 마우스, CD4 결실 마우스, stat6 결실 마우스 또는 IL-18Rα 결실 마우스에게, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부를 이식하였다. 0일째와 21일째에, IgE 측정를 위해 혈청을 샘플링하였다. 그 결과를 도 5(A)에 나타낸다. 흰색의 막대그래프가 0일째의 결과이고, 검은색의 막대그래프가 21일째의 결과를 나타낸다. 각 데이터는 각각의 실험군에서의 3마리의 마우스의 평균과 표준 편차를 나타낸다.

우선, CD4 결실 마우스는, 도 5(A)에 나타낸 바와 같이, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부를 이식한 후까지조차도 IgE를 생성하지 않았다. 이 결과로부터, KCASP1Tg 마우스의 병변 피부의 이식 조각 중의 IL-4 생성 세포 또는 IL-18은, 숙 주의 CD4⁺ T 세포 없이는 IgE의 전신성의 상승을 유도할 수 없음을 시사하고 있다.

또한, stat6이 IL-4의 시그널 전달에 불가결한 점에서, 다음으로, 숙주의 stat6의 활성화가 IgE 유도에 결정적인지를 분석한 결과, 도 5(A)에 나타낸 바와 같이, stat6 결실 마우스는, 병변 피부를 이식한 후, 어떠한 IgE의 상승도 나타내지 않는다. 이 결과는, 병변 피부의 이식 조각에 의해 유도된 IgE 응답은, 숙주 유래의 CD4⁺ T 세포 및 stat6에 의존적인 것을 시사하고 있다. 데이터는 나타내지 않지만, B6 마우스의 정상인 피부의 이식도 CD4⁺ T 세포 또는 stat6이 결실한 숙주에서, IgE 생성을 유도하지 않았다. 따라서, 피부 이식에 의한 IgE의 유도는, 숙주가 완전한 CD4⁺ T 세포 및 stat6을 이용하고 있을 때에만 일어난다.

또한, 이식 조각 중의 IL-18이, 숙주 중에서 IgE의 유도를 야기하는지의 여부를 조사하였다. 이 목적을 위해, 숙주로서, IL-18에 응답할 수 없는 IL-18Rα 결실 마우스를 이용하였다. 도 5(A)에 나타낸 바와 같이, IL-18Rα 결실 마우스에서는, IgE의 상승은 보이지 않았다. 또한, 데이터는 나타내지 않지만, B6 마우스의 정상인 피부를 이식한 IL-18Rα 결실 마우스는 IgE의 상승을 나타내지 않았다.

결론적으로, 이들 결과는 피부의 병변 부위에서의 소량의 IL-18의 지속적인 집적은, 숙주 유래의 CD4⁺ T 세포 및 stat6에 의존적인, 전신성의 IgE의 상승을 유도한다.

또한, 병변 피부를 이식받은 야생형 마우스가, CD4⁺ T 세포의 Th1 세포 및 Th2 세포에의 분화를 수반하는 IgE 응답을 나타낸 점에서(도 4 참조), 이 Th1/Th2 세포에의 분화도, 병변 피부의 이식 조각에 존재하는 IL-18에 의존하는지를 조사하였다.

구체적으로는, IL-18Rα 결실 마우스에게, B6 야생형 마우스의 정상인 피부 또는 KCASP1Tg 마우스의 병변 피부를 이식하였다. 21일째에 레시피엔트로부터 비장의 CD4⁺ T 세포를 단리하고, 고정화된 항CD3로 자극하여, 생성된 IL-4와 IFN-γ를 ELISA로 측정하였다. 그 결과를 도 5(B)에 나타냈다.

흰색의 막대그래프가 IFN-γ의 결과이고, 검은색의 막대그래프가 IL-4의 결과이다. 각 데이터는 각각의 실험군에서의 3마리의 마우스의 평균과 표준 편차를 나타낸다. 또, NS는 유의성이 없음을 나타낸다.

도 5(B)에 나타낸 바와 같이, 병변 피부의 이식 조각을 이식받은 IL-18Rα 결실 마우스의 CD4⁺ T 세포는, 야생형 마우스의 정상인 피부를 이식받은 IL-18Rα 결실 마우스의 CD4⁺ T 세포와 비교하여, 그 IL-4 또는 IFN-γ의 생성량에 관하여 차이를 보이지 않았다. 이 결과로부터, 병변 피부의 이식 조각을 통한 Th1/Th2 세포의 분화는, 이식 조각로부터 방출된 IL-18에 의존하고 있을 가능성이 나타난다.

실시예 5 invivo 에서의 SpA 에 의한 IL-18 및 IgE 의 유도

황색 포도상 구균의 감염은, 때로는 AD 환자에서, 피부의 염증 변화를 악화시켜, 약간의 AD 환자에서는 혈청 IL-18 농도가 상승하는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 황색 포도상 구균의 생성물이, 정상인 B6 마우스에서의 IL-18의 전신적인 상승을 야기할 수 있는지를 조사하였다.

구체적으로는, 정상인 B6 마우스의 귀 피부에, 1일 1회 여러 가지 용량의 SpA 또는 용매만을 2주간 도포하였다. 그 후, 14일째에 IL-18 또는 IgE의 농도를 측정하기 위해 혈청 및 비장을 샘플링하였다. 또한, 용매 또는 SpA(100㎍/일)를 도포한 마우스의 비장의 CD4⁺ T 세포를 플레이트 결합 항CD3와 함께 48시간 항온처리하고, 각각의 상등액에서의 IFN-γ 및 IL-4의 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과를 도 6(A)∼도 6(C)에 나타낸다.

도 6(A)는 IL-18의 결과를 나타내고, 도 6(B)는 IgE의 결과를 나타낸다. 또한, 도 6(C)에서의 흰색의 막대그래프는 IFN-γ의 결과를 나타내고, 검은색의 막대그래프는 IL-4의 결과를 나타낸다. 도 6(A), 도 6(B)의 데이터는, 각각의 군에서, 3마리의 마우스의 평균과 표준 편차를 나타낸다. 도 6(C)의 데이터는 3개의 샘플의 평균과 표준 편차를 나타내고, 각각의 군에서의 3마리의 마우스 중, 1마리의 데이터를 나타낸다. 또, ND는 검출되지 않았음을 나타내고, NS는 유의성이 없음을 나타낸다.

도 6(A)에 나타낸 바와 같이, SpA를 도포한 마우스에서는, 혈청 중의 IL-18의 레벨은, 투여량 의존적으로 상승하였지만, 용매만을 도포한 마우스에서는 상승 하지 않았다. 데이터는 나타내지 않지만, SpA 또는 용매를 도포한 마우스에서의 혈청 중의 IL-12p40, IL-12p70은, ELISA에서는 검출되지 않았다. 또한, 도 6(B)에 나타낸 바와 같이, IgE 레벨도 투여량 의존적으로 상승하였다. 추가로, 도 6(C)에 나타낸 바와 같이, SpA로 처리된 마우스는, Th2 세포 우위인 분화를 나타내지 않았다. 이들 결과는, IL-18 처리와 마찬가지로, SpA가 Th1/Th2 세포 어느 쪽인가의 우선적인 분화 없이, 전신성의 IgE를 유도하는 가능성을 나타낸다.

실시예 6 SpA 에 응답하여 KC 는 IL-18을 분비하지만, IL-12는 분비하지 않는다.

IL-18은, IL-12가 없으면 IgE를 유도할 수 있고, IL-12가 있으면 반대로 IgE 유도를 저해한다. 지금까지, IL-18의 분비를 유도하는 LPS(리포다당류)를 포함한 자극제는 항상 IL-12의 생성을 야기하는 것이 알려져 있다. 이에, 다음으로 SpA에 응답하여, 어떤 타입의 세포가 IL-18을 분비하고, 이들 세포가 IL-12의 생성을 수반하지 않고 IL-18을 분비하는지를 조사하였다.

구체적으로는, PAM212 세포(마우스의 KC의 배양주)를 SpA와 함께, 또는 SpA 없이 24시간 항온처리하고, 각각의 상등액 중의 IL-18 농도와 IL-18의 IFN-γ를 유도하는 생물 활성을 ELISA와 바이오 분석으로 각각 측정하였다. 그 결과를 도 7(A)에 나타낸다. 도 7(A)에서는, 좌측이 IL-18의 농도를 나타내고, 우측이 IFN-γ를 유도하는 활성도를 나타낸다. 또, 도 7(A)의 데이터는, 3개의 값의 평균과 표준 편차를 나타내고 있다. 또한, ND는 검출되지 않았음을 나타낸다.

도 7(A)에서 알 수 있는 바와 같이, SpA에 의한 자극 후, PAM212세포는, IFN-γ 생성을 유도할 수 있는 활성형의 IL-18을 분비하고 있다.

또한, 새롭게 단리한 KC가 SpA에 응답하여 IL-18을 분비하는지 실증하기 위해, 야생형 B6 마우스의 KC를 여러 가지 용량의 SpA와 24시간 항온처리하였다.

구체적으로는, 야생형 B6 마우스의 피부로부터 조제한 KC 또는 CD11⁺ 세포를 제외한 KC에 대하여, CD11c와 MHC 클래스 Ⅱ(1-A^b)의 발현을 플로사이토메트리로 분석하였다. 이들 세포는 SpA 존재 하, 또는 SpA가 없는 상태에서 24시간 항온처리하고, 상등액의 IL-18 농도를 ELISA로 측정하였다. 그 결과를 도 7(B)에 나타낸다. 도 7(B)에서는, 야생형 B6 마우스의 피부로부터 조제한 KC를 검은색의 막대그래프로 나타내고, CD11c⁺ 세포를 제외한 KC를 흰색의 막대그래프로 나타낸다.

도 7(B)의 좌측에 나타낸 바와 같이, 새롭게 단리된 KC는 SpA에 응답하여 용량 의존적으로 IL-18을 방출하였다. LC/DC는 IL-18을 방출할 수 있기 때문에, CD11c⁺ 세포를 KC 표본으로부터 제외하고, 이들을 SpA와 항온처리하였다. CD11c⁺ 세포를 제거한 후라도, 도 7(B)의 우측에 나타낸 바와 같이, KC는 SpA의 자극을 받으면 IL-18을 분비하였다. 또, 도 7(B)의 데이터는, 3개의 값의 평균과 표준 편차를 나타내고 있다. 또한, ND는 검출되지 않았음을 나타낸다.

다음으로, SpA에 유도되는 KC로부터의 IL-18 분비의 분자적인 메카니즘을 해명하기 위해, 카스파제-1이 LPS(리포다당류)의 유도에 의한 IL-18 분비에 필요한 점에서, SpA에 의한 자극을 받은 카스파제-1 결실 KC로부터의 IL-18 분비를 조사하였다.

구체적으로, KC는, 야생형 마우스, 카스파제-1 결실 마우스, TLR2 결실 마우스, 또는 MyD88 결실 마우스로부터 조제하고, 야생형 마우스의 KC는 20μMZVAD, 20μMYVAD 또는 같은 부피의 DMSO(Veh)의 존재 하, 500㎍/㎖의 SpA와 함께 24시간항온처리하였다. 동시에, 상기 각 돌연 변이체의 KC를 500㎍/㎖의 SpA와 함께 24시간 항온처리하였다. 각각의 상등액 중의 IL-18을 ELISA로 측정하였다. 그 결과를 도 7(C)에 나타낸다.

도 7(C)에서는, WT가 야생형 마우스를, KO가 상기 각 돌연 변이체(녹아웃 타입)의 마우스를 나타내고, 흰색의 막대그래프가 카스파제-1 결실 마우스를, 음영 처리된 막대그래프가 TLR2 결실 마우스를, 사선으로 나타낸 막대그래프가 MyD88 결실 마우스를 나타낸다.

도 7(C)에 나타낸 바와 같이, DMSO를 첨가하지 않고 500㎍/㎖의 SpA와 항온처리한 야생형 마우스의 KC는, 28.4±3.5pg/㎖의 IL-18을 생성하였다. 또한, 카스파제-1 결실 마우스의 KC는 야생형 마우스의 KC에 필적하는 레벨의 IL-18을 분비한다. 그 때문에, SpA의 자극에 대한 카스파제-1에 의존하지 않는 IL-18의 분비를 시사하고 있다. 또, 도 7(C)의 데이터는, 3개의 값의 평균과 표준 편차를 나타내고 있다.

카스파제-1 저해제인 YVAD나, 넓은 범위의 카스파제를 저해하는 ZVAD는, LPS 또는 막 결합형의 Fas 리간드 자극에 의한 간장의 조직 매크로파지인 Kupffer 세포 로부터의 IL-18 분비를 강력하게 저해한다. 그래서, SpA의 자극을 받은 KC에 대해서도, IL-18의 분비가 YVAD 또는 ZVAD로 영향을 받는지를 조사하였다. 도 7(c)에 나타낸 바와 같이, 이들 2종류의 카스파제 저해제는 SpA의 자극을 받은 야생형 마우스의 KC로부터의 IL-18 분비를 저해하지 않았다. 이 결과는, SpA의 자극을 받은 KC로부터의 IL-18 분비에서, 카스파제는 불필요함을 나타낸다. 데이터는 나타내지 않지만, 이는 카스파제-1 결실 마우스의 KC의 경우에 대해서도 마찬가지의 것을 말할 수 있다.

또한, 많은 미생물이 TLR/MyD88 시그널 경로를 자극하는 점에서, KC가, 그람 양성균에 대한 신호 리셉터인 TLR2 또는 모든 TLR 멤버에 의해 공유되는 불가결한 어댑터 분자인 MyD88에 의존하여 IL-18을 분비하는 것인지를 조사하였다. 도 7(c)에 나타낸 바와 같이, TLR2와 MyD88의 양자 모두, SpA 자극으로 유도되는 KC로부터의 IL-18 분비에 불필요한 점에서, SpA에 의한 IL-18의 분비 유도는, TLR에 의존하지 않는 IL-18 분비인 것을 시사하고 있다.

또한, Kupffer 세포가 LPS 또는 막 표현형의 Fas 리간드에 의한 자극에 응답하여 IL-18을 분비하는 점에서, 이들 자극제가 KC로부터의 IL-18 분비를 유도하는 가를 조사하였다. 구체적으로는, 야생형 B6 마우스로부터의 KC(5×10⁵/㎖)를, 500㎍/㎖의 SpA, 1㎍/㎖의 LPS, 또는 1×10⁶/㎖의 mFasL과 함께 24시간 항온처리하였다. 얻어진 상등액에 포함되는 IL-18은, ELISA로 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

	자극제
	배양액만	SpA	LPS	mFasL
IL-18(pg/㎖)	ND	31.5±3.2	ND	ND

표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, Kupffer 세포와는 반대로, KC는 LPS 또는 Fas 리간드에 의한 자극을 받은 후에도 IL-18을 분비하지 않았다. 또한, 표 1에서는, ND는 검출되지 않았음을 나타낸다.

다음으로, SpA에 의한 자극을 받은 KC가 동시에 IL-12를 분비하는지를 조사하였다. 미량의 IL-12를 확인하기 위해, SpA와 4시간 항온처리한 KC로부터 전체 RNA를 얻고, 이것을 이용하여 RT-PCR을 행하였다. 구체적으로는, 야생형의 B6 마우스의 KC와 Kupffer 세포를 500㎍/㎖의 SpA의 존재 하 또는 비존재 하, 그리고, 1㎍/㎖의 LPS의 존재 하 또는 비존재 하에서, 각각 4시간 항온처리하였다. 추출한 전체 RNA 중의 IL-18, IL-12p40, IL-12p35 및 β-악틴의 mRNA의 발현 레벨을 RT-PCR로 측정하였다. 그 결과를 도 7(D)에 나타낸다.

도 7(D)에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극된 Kupffer 세포가 IL-12p35와 IL-12p40의 쌍방을 발현한 것에 대하여, SpA에 의한 자극을 받은 KC에서는, IL-12p35도 IL-12p40도 검출되지 않았다. 8시간 또는 16시간 SpA와 항온처리한 KC로부터 얻은, 전체 RNA를 이용하여 IL-12에 대한 RT-PCR을 행하였지만, 이들 중에는 IL-12의 어느 것도 검출되지 않았다. 데이터는 나타내지 않지만, ELISA로도 IL-12를 측정하였지만, 24시간 항온처리한 후의 SpA에 의한 자극을 받은 KC의 상등액에는 IL-12p40 또는 IL-12p70은 검출되지 않았다.

이에 대하여, Kupffer 세포의 KC는, IL-18을 항상적으로 발현하고, SpA에 의한 자극을 받은 후에도 발현의 레벨은 변하지 않았다. 또한, 데이터는 나타내지 않지만, Kupffer 세포는 SpA에 대한 응답으로서 IL-12 또는 IL-18을 분비하지 않았다.

이들 결과로부터, 피부에 도포된 SpA의 자극에 의해, 국부적으로 KC가 IL-18을 분비하지만, IL-12는 분비하지 않고, 이것이 IgE의 유도로 이어지는 것이 나타난다.

실시예 7 SDS와 SpA 의 혼합물을 도포한 NC/ Nga 마우스에서의 피부 병변

NC/Nga 마우스는, 아토피성 피부염 호발 마우스로 SPF에서는 발증하지 않지만, 통상적 환경으로 옮기면 발증한다. NC/Nga 마우스에게 4%의 SDS 또는 SpA(200㎍/일)를 단독으로 도포하더라도 발증하지 않지만, 양자를 혼합하여 NC/Nga 마우스의 털을 깍은 등부에 도포하면, AD 유사의 피부 병변이 관찰된다.

도 8(A) 내지 도8(D)는 4% SDS와 SpA(200㎍/일)의 혼합물을 도포한 NC/Nga 마우스에서의 피부 병변 결과를 컨트롤의 결과와 함께 나타내는 도면이다. 도 8(C)에 나타낸 바와 같이, 4% SDS만을 도포한 경우는 28일 후에도 발증은 보이지 않지만, 4% SDS와 SpA(200㎍/일)의 혼합물을 도포한 경우는, 도 8(B), 도 8(D)에 나타낸 바와 같이, 14일 후, 28일 후에 AD 유사의 피부 병변이 관찰되었다.

도 9(A) 내지 도 9(D)는, 4% SDS와 SpA(200㎍/일)의 혼합물을 도포한 NC/Nga 마우스에서의 피부의 시간 경과에 따른 변화를 컨트롤의 결과와 함께 나타낸 것이다. 도 9(A) 내지 도 9(C)는, 헤마톡시린-에오진으로 염색한 AD 유사의 병변 피부를 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 9(A)는 배율 25배, 도 9(b)는 배율 50배, 도 9(C)는 배율 100배의 관찰 결과를 나타낸다. 도 9(D)는 알시안 블루로 염색한 AD 유사의 병변 피부를 광학 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 9(d)에 나타낸 바와 같이, 조직학적으로는, 병변부에서 표피의 비후가 저명해지고, 알시안 블루로 염색되는 비만 세포의 침윤이 인정되게 된다.

또, 발명을 실시하기 위한 최선의 형태의 항에서 이룬 구체적인 실시 태양 또는 실시예는, 어디까지나도, 본 발명의 기술 내용을 분명히 하는 것으로서, 그와 같은 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어서는 안되며, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 특허 청구의 범위 내에서 다양하게 변경하여 실시할 수 있는 것이다.

이상과 같이, 본 발명은 KC로부터의 IL-18의 국소적인 집적이 항원에의 폭로 없이 전신성 IgE 응답을 야기하고, 이것이 AD 유사의 염증성 피부 병변에서 생기는 혈청 중의 높은 레벨의 IgE 발현이라는 현상을 유도한다는 사실에 기초하여 실현된 스크리닝 방법 및 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법, 그리고 그 이용이다.

그러므로, 본 발명은 미생물 자극으로 유도되는 KC로부터의 IL-18 생성의 중요성을 나타내고, 미지의 항원에 의한 알러지 질환의 병인에 관련되어 있는 메카니즘에 새로운 사실을 제공함과 아울러 AD의 치료 약제 등의 개발에 유효하게 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 각종 의약품 산업이나 연구용 시약 산업에 적합하게 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 의료 분야에도 응용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 미생물 자극으로 일어나는 KC로부터의 IL-18 생성의 중요성을 나타내고 미지의 항원에 의한 알러지 질환의 병인에 관련된 메카니즘에 새로운 사실을 제공함과 아울러 AD의 치료 약제 등의 개발에 유효하게 이용될 수 있다.

Claims

아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변을 갖는 생물에서 발생하는 인터루킨 18의 생성의 유도 현상을 이용한 저해제의 스크리닝 방법으로서,

생체 내 또는 시험관 내에서 자극제에 의한 자극으로 케라티노사이트로부터의 인터루킨 18의 생성을 유도하는 환경을 형성하는 환경 형성 단계와,

해당 환경 하에서 후보 물질을 투여하여 상기 케라티노사이트로부터의 인터루킨 18의 생성 유도를 저해하는 물질을 상기 저해제로서 동정하는 저해제 동정 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 자극제로서 황색 포도상 구균 유래의 프로테인 A, 케라티노사이트를 자극할 수 있는 상기 프로테인 A의 부분 단백질 또는 케라티노사이트를 자극할 수 있는 상기 프로테인 A 또는 그 부분 단백질의 개변체 중 하나 이상을 이용하여서 되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 자극제로서 프로테인 A에 첨가하여 SDS를 병용하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 환경 형성 단계가 시험관 내에서 실시되는 경우 케라티노사이트의 배양 세포의 배양액에 상기 프로테인 A를 첨가하여 배양 함으로써 상기 환경의 형성을 실현하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 환경 형성 단계가 생체 내에서 실시되는 경우, 상기 프로테인 A를 숙주가 되는 생물의 피부에 도포함으로써 상기 환경의 형성을 실현하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 환경 형성 단계가 생체 내에서 실시되는 경우, 상기 자극제로서 아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변이 생긴 피부 조각을 이용하여 해당 피부 조각을 숙주가 되는 생물에 이식함으로써 상기 환경의 형성을 실현하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 숙주가 되는 생물은 적어도 CD4⁺ T 세포가 정상으로 존재하고, stat6도 발현하고 있고, NK T 세포가 구성적으로 IL-18Rα쇄를 발현하고 있는 각 형질을 모두 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 5항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주가 되는 생물로 마우스가 이용되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 스크리닝 방법을 이용하여 얻어지는 저해제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 질환 치료 약제.
아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변을 갖는 생물에서 생기는 혈청 중의 고 레벨의 IgE 발현을 억제하는 방법으로서,

제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 스크리닝 방법을 이용하여 얻어지는 저해제, 또는, 제 9항의 면역 질환 치료 약제를 이용하여 케라티노사이트로부터의 인터루킨 18의 국소적인 집적에 의해 항원에의 폭로 없이 야기되는 전신성 IgE 응답을 억제하는 것을 특징으로 하는 고 레벨 IgE 발현의 억제 방법.
모델 생물에 아토피성 피부염 유사의 염증성 피부 병변을 발증시키는 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법으로서,

황색 포도상 구균 유래의 프로테인 A를 모델 생물의 피부에 도포하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법.
제 11항에 있어서, 상기 프로테인 A로는 해당 프로테인 A의 완전 단백질, 케라티노사이트를 자극할 수 있는 상기 프로테인 A의 부분 단백질 또는 케라티노사이트를 자극할 수 있는 상기 프로테인 A 또는 그 부분 단백질의 개변체 중 하나 이상을 이용하여서 되는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 프로테인 A를 모델 생물의 피부에 도포할 때에 추가로 SDS를 병용하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 방법에 의해 얻어지는, 염증성 피부 병변을 발증한 모델 생물.
제 14항에 있어서, 상기 모델 생물이 마우스인 것을 특징으로 하는 모델 생물.
제 1항 내지 제 8항의 스크리닝 방법을 실시하기 위한 스크리닝 키트.
제 11항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 유도 방법을 실시하기 위한 아토피성 피부염 유사 증상의 유도 키트.