CN1777807B - 利用角质形成细胞产生白介素18诱导现象阻碍剂的筛选方法及筛选试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供利用由角质形成细胞(KC)产生白介素18(IL-18)的诱导现象，并可以适用于特异性皮炎(AD)及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发的各种方法及其利用方法。例如通过将来自于金黄色葡萄球菌的蛋白质A(SpA)涂敷于小鼠等的皮肤，或将产生AD样的炎症性皮肤病变的皮肤片移植至小鼠等，从而可以再现AD样的病变中形成的血清中高水平的IgE表达。由此，例如可以筛选诱导KC所导致的IL-18的产生的阻碍剂。

Description

利用角质形成细胞产生白介素18诱导现象阻碍剂的筛选方法及筛选试剂盒

技术领域

本发明涉及利用由角质形成细胞产生白介素18的诱导现象的阻碍剂的筛选方法、特异性皮炎样症状的诱导方法及其利用。特别是涉及可以适用于特异性皮炎及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发的筛选方法、特异性皮炎样症状的诱导方法及其利用。 

背景技术

皮肤是身体中最大的器官，是生物体防御的最前线。表皮由角质形成细胞(KC、角化细胞)、黑素细胞、表皮郎格汉斯细胞(LC)及上皮内T细胞等组成。 

LC是未成熟的树枝状突起细胞(DC)，它的机能是捕获局部性接触的蛋白质抗原并将抗原传递给进行获得性免疫反应的淋巴结。在向淋巴结移动期间，LC转变成具有能提示抗原的成熟DC。其结果是LC/DC对运送的抗原引起特异性全身性免疫应答。这样，皮肤的抗原特异性免疫应答与对同一抗原的全身性免疫应答紧密关联。因此可以认为皮肤和免疫器官是通过LC/DC循环和抗原特异性免疫细胞而相互紧密地关联。与此相对，KC和黑素细胞定住于皮肤，基本上不参与获得性免疫应答。 

但是KC显示有助于皮肤局部的自然免疫应答和炎症诱导的可能性。皮肤感染了微生物时，炎症反应以及获得性免疫反应在宿主皮肤感染局部展开。这时构成皮肤的KC和LC紧密地参与各自的应答。因此根据对微生物或化学试剂的刺激而产生各种细胞活素的独特的性质，KC对LC施加影响，其结果可以使获得性免疫应答发生变化(参照非专利文献1和2)。根 据这些事实，决定KC所引起的皮肤的炎症是否也对全身性免疫反应有影响是很重要的。 

本发明人以前发现了KC特异性caspase-1，利用依赖于白介素18(IL-18)和白介素1β(IL-1β)的方法使特异性皮炎(atopicdermatitis，AD)样皮肤炎症(瘙痒性慢性炎)发病，并确立了caspase-1-转基因小鼠(KCASP1Tg小鼠)(参照非专利文献3和4)。另外本发明人还提出IL-1β能增强IL-18诱导AD样皮肤炎症的能力(参照非专利文献4)。由这些结果可知，KC可以通过含有IL-18和IL-1β的多种细胞活素的产生而有助于全身性免疫应答。 

但是，上述IL-18和IL-1β作为生物学上非活性的前体而产生，通过被caspase-1这样适当的细胞内酶切断后作为活性型而被放出(参照非专利文献5-9)。 

上述IL-18按照和它共存的其它种类的细胞活素的不同而显示多样的生理活性。特别是在白介素12(IL-12)的存在下，IL-18诱导强的炎症诱导性的细胞活素IFN-γ，其结果促进炎症反应(非专利文献10)。与此相对照，IL-12不存在时，IL-18通过Th2细胞活素的产生的诱导来诱导特异性应答(参照非专利文献11-14)。 

上述AD是对外在刺激的炎症性皮肤病变，是伴有慢性反复性剧烈瘙痒的疾病。它的发病，有遗传的背景，患者血清中具有高水平的IgE，但关于其发病机理不清楚的地方很多。关于AD发病的机理，活性化T细胞、嗜碱细胞和肥大细胞紧密相关。 

特别是由变态反应原导致的肥大细胞或嗜碱细胞的活性化的结果引起Th2细胞活素和化学传递的产生，从而AD发病。上述由变态反应原导致的肥大细胞或嗜碱细胞的活性化是通过结合于这些细胞上的FcεR(相对于嗜碱细胞的IgE抗体的Fc受体(FcR))的IgE分子的桥连而成的。作为上述Th2细胞活素的重要物可以列举出白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素9(IL-9)、白介素13(IL-13)等。作为化学传递的重要物可以列举出组胺、血清素和白三烯等。 

但是，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染根据情况会使AD患者皮肤的炎症状态恶化(参照非专利文献15和16)。另外已知一部分AD患者的血清IL-18浓度上升(参照非专利文献17)。即现已知金黄色葡萄球菌的感染是AD的诱因或恶化因子。但是，关于金黄色葡萄球菌对AD的发病是怎样参与的还有很多不清楚的地方。 

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现在关于AD的发病机理有很多不清楚的地方，所以在AD的有效治疗药物的开发中伴随着许多困难。 

如上所述，构成表皮的各种细胞参与各种各样的免疫反应，例如近年有报告说树枝状突起细胞作为抗原提示细胞而诱导获得性免疫应答。但是关于构成表皮的最主要细胞的KC是如何参与宿主的免疫应答还不清楚。 

在开发任何一种疾病的有效治疗药物时，阐明其发病机理并利用此来筛选具有药理作用的物质是重要的手法之一。但是，对于AD的发病有关KC的参与和金黄色葡萄球菌的感染，有很多不清楚的地方，因此包括筛选在内的AD治疗药物的开发中关于应用这些的技术到目前为止几乎不知道。 

本发明鉴于上述课题，其目的是利用由KC产生IL-18的诱导现象提供可以适用于特异性皮炎及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发的各种方法及其利用方法。 

发明内容

本发明人鉴于上述课题进行了锐意研究，结果在体内和体外系统实证了来自于金黄色葡萄球菌的蛋白质A刺激KC并诱导IL-18的产生，从而完成了本发明。 

即本发明的筛选方法是利用在患有特异性皮炎样的炎症性皮肤病变的生物体内产生的白介素18诱导现象的阻碍剂的筛选方法以解决上述课题，其特征是包含下述步骤：在体外或在体内通过刺激剂刺激角质形成细胞诱导形成白介素18的产生环境既环境形成步骤，以及在该环境下加入候选物，并将阻碍上述由角质形成细胞产生的白介素18的诱导的物质作为上述阻碍剂而鉴定的阻碍剂鉴定步骤。 

在上述筛选方法中，作为上述刺激剂，优选使用来自于金黄色葡萄球 菌的蛋白质A、能刺激角质形成细胞的上述蛋白质A的部分蛋白质或能刺激角质形成细胞的上述蛋白质A或其部分蛋白质的变构体的至少任意一种。作为上述刺激剂，更优选并用蛋白质A和十二烷基硫酸钠(SDS)。 

在上述筛选方法中，上述环境形成步骤在体外实施时，可以通过在角质形成细胞的培养细胞的培养液中添加上述蛋白质A来培养，从而实现上述环境的形成，上述环境形成步骤在体内实施时，可以通过将上述蛋白质A涂敷于成为宿主的生物的皮肤来实现上述环境的形成。 

上述环境形成步骤在体内实施时，可以使用特异性皮炎样炎症性皮肤病变的皮肤片作为上述刺激剂，通过将该皮肤片移植于做为宿主的生物体上实现上述环境的形成。 

在此上述的成为宿主的生物至少具备CD4⁺T细胞的表达、stat6的表达和NKT细胞的IL-18Rα链的表达的表现形哪一个都是可优选的。上述的成为宿主的生物例如优选使用小鼠。 

本发明中含有使用上述筛选方法而得到的包括阻碍剂的免疫疾病的治疗药物。本发明还含有下述部分：抑制患有特异性皮炎样的炎症性皮肤病变的生物所生成的血清中高水平的IgE表达的方法；使用由上述筛选方法而得到的阻碍剂或上述免疫疾病治疗药物，通过由角质形成细胞产生的白介素18的局部性集聚，不接触抗原抑制被引起的全身性IgE应答。 

本发明的特异性皮炎样症状的诱导方法是对生物模型使特异性皮炎样的炎症性皮肤病变发病的特异性皮炎样症状的诱导方法，其特征是将来自于金黄色葡萄球菌的蛋白质A涂敷于生物模型的皮肤。 

在上述诱导方法中，作为上述蛋白质A，可以使用该蛋白质A的完全蛋白质、能刺激角质形成细胞的上述蛋白质A的部分蛋白质或可以刺激角质形成细胞的上述蛋白质A或其部分蛋白质的变构体的至少任意一种。在将上述蛋白质A涂敷于生物模型的皮肤时，优选并用SDS。 

本发明中包含通过上述诱导方法而得的炎症性皮肤病变发病的生物模型在内，作为该生物模型的一个例子可以列举出小鼠。 

作为本发明的使用方法，可以列举出例如用于进行上述筛选方法的筛 选试剂盒和用于进行上述诱导方法的特异性皮炎样症状的诱导试剂盒。 

通过上述各方法，在特异性皮炎(AD)样的炎症性皮肤病变中，利用由角质形成细胞产生的IL-18的局部性集聚不暴露于抗原而引起全身性IgE应答。因此上述各方法可以适用于特异性皮炎及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发。 

本发明的其他目的、特征和优点通过以下所述可以充分明白。本发明的利益通过参照附图的以下说明变得清楚。 

附图说明

图1表示通过移植KCASP1Tg小鼠的病变皮肤而导致的宿主的IgE诱导的结果和对照的结果。 

图2的A-F表示KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的IL-18的集聚和对照的结果。 

图3的A-F表示KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的CD4⁺T细胞的集聚和对照的结果。 

图4表示移植病变皮肤的宿主的Th2细胞选择性分化缺失和对照的结果。 

图5的A和B表示用于IgE诱导的宿主CD4⁺T细胞、宿主stat6和宿主IL-18的应答性以及Th1/Th2细胞的表达的结果和对照的结果。 

图6的A-C表示通过体内的SpA处理而导致的IL-18和IgE的诱导的结果和对照的结果。 

图7的A-D表示由受到SpA刺激的KC不放出IL-12而只放出IL-18的结果和对照的结果。 

图8的A-D表示涂敷4％SDS和SpA(200μg/天)的混合物于NC/Nga小鼠的皮肤病变的结果和对照的结果。 

图9的A-D表示涂敷4％SDS和SpA(200μg/天)的混合物于NC/Nga小鼠的皮肤的随时间的变化在显微镜下观察的结果和对照的结果。 

具体实施方式

本发明人发现了由角质形成细胞产生的IL-18的局部性集聚不接触抗原的状态下引起的全身性IgE应答，这与特异性皮炎样的炎症性皮肤病变相关联。本发明利用上述见识，特别是解决了适用于特异性皮炎及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发的阻碍剂的筛选方法、特异性皮炎样症状的诱导方法及其利用方法。以下就本发明进行具体的说明。 

(1)本发明的筛选方法 

本发明的筛选方法包含下述步骤：在体内或在体外形成通过刺激剂刺激从角质形成细胞(KC)诱导局部性的IL-18的产生的环境的环境形成步骤，以及在该环境下加入候选物，并将阻碍由上述的KC导致的白介素18的诱导的物质作为认定的上述阻碍剂的阻碍剂鉴定步骤。 

在特异性皮炎(AD)样的炎症性皮肤病变中，有来自于皮肤的KC的IL-18局部性过剩产生，由此也可以看到血清中高水平的IgE的表达情况。因此通过使用包含上述环境形成步骤和阻碍剂鉴定步骤的筛选方法，可以得到阻碍IL-18分泌的物质，所得到的物质(阻碍剂)可以成为AD的有效治疗药物。 

本发明所说的AD样的炎症性皮肤病变是指IL-18依赖性发病的免疫疾病，是泛指皮肤出现炎症的症状的疾病，不单单是指严密的AD所被认为的瘙痒性慢性炎。 

本发明的体外试验是指通过培养细胞而人为再现的反应系统，“体内试验”是指完整的个体的反应系统。 

另外，本发明所说的“阻碍剂”只要是阻碍由KC诱导的IL-18分泌的物质即可，其阻碍的具体机理并没有特别的限定。因此，本发明的通过筛选方法得到的阻碍剂可以是可逆性阻碍来自于上述KC的IL-18分泌的过程的物质，也可以是不可逆性阻碍的物质。在可逆性阻碍下的阻碍剂，可以是竞争型(拮抗型)的阻碍剂(拮抗剂)，也可以是非竞争型的阻碍剂。换而言之，通过本发明的筛选方法可以筛选出包括拮抗剂等在内的各种各样的阻碍剂。 

(环境形成步骤) 

上述环境形成步骤是形成通过刺激剂刺激由KC诱导IL-18的产生的环境的步骤，关于环境形成涉及的详细条件并没有特别的限定。也就是说，只要实现可以诱导上述IL-18产生的环境，体外体内都可以。 

作为上述的刺激剂，可列举出能刺激KC的各种蛋白质(KC激动蛋白质)。作为该KC激动蛋白质，只要是可以刺激KC的蛋白质就可以，并没有特别的限定，作为代表性物质，可以列举出来自于金黄色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白质A(SpA)。 

如上所述，已知金黄色葡萄球菌的感染是AD的诱因或恶化因子。而且本发明人们指出将SpA和SDS一起涂敷于小鼠，短时间内就可以诱导AD样的瘙痒性慢性皮炎(参照实施例)。因此，作为KC激动蛋白特别优选上述SpA。 

上述SpA可以是由金黄色葡萄球菌得到的完全蛋白质(具有完全氨基酸排列的蛋白质)，如果可以刺激角质形成细胞，也可以是SpA的部分蛋白质、完全蛋白质或部分蛋白质的变构体。 

上述变构体，众所周知是在SpA的氨基酸序列中由置换、缺失、插入及/或附加一个或数个氨基酸的氨基酸序列所组成，并且指出B7-2分子在细胞表面的表达是负控制蛋白。另外上述“置换、缺失、插入及/或附加一个或多个氨基酸”是指根据部位特异性的突变诱导法等众所周知的变异蛋白质制作法，置换、缺失、插入及/或可能附加的氨基酸数目(理想的是10个以下，更理想的是7个以下，最理想的是5个以下)是被置换、缺失、插入及/或附加的意思。这样，上述变构体是上述SpA的变异蛋白质，这里所谓的“变异”主要是指通过众所周知的变异蛋白质制作法来人为地导入的变异，也可以是分离精制天然存在的同样的变异蛋白质的物质。上述SpA的变构体也可以是含有附加的多肽的物质。作为上述刺激剂，优选并用SpA和SDS。通过并用SDS和蛋白质A可以诱导更严重的AD样瘙痒性慢性皮炎(参照实施例)。关于SpA和SDS的并用方法并没有特别的限定，可以在溶解SpA的溶剂中加入SDS，制备SpA-SDS溶液，并将此涂敷于生物模型的皮肤。 

(KC的刺激手法) 

关于上述KC激动蛋白导致的KC的刺激手法并没有特别的限定，只要是可以刺激KC并诱导IL-18产生的手法就可以。具体地说，例如在体外实施上述环境形成步骤时，可以在KC培养细胞的培养液中添加上述SpA来培养。关于这时使用的KC的培养细胞并没有特别的限定，可以适用公知的培养细胞。例如在后述的实施例6中使用PAM212细胞。 

关于上述KC的培养细胞的培养条件、即培养液或培养温度、SpA的添加方法等也没有特别的限定，可以根据所使用的培养细胞的种类来设定适当的条件。 

另一方面在体内实施上述环境形成步骤时，可以将上述SpA涂敷于成为宿主的动物的皮肤。涂敷SpA的条件并没有特别的限定，只要是不妨碍SpA导致的KC的刺激就可以。例如在后述的实施例中将SpA用作50％甘油的PBS溶液，当然本发明并不限定于此。另外，如上所述，可以在SpA中加入SDS来制备SpA-SDS溶液，并将此涂敷于宿主生物的皮肤。关于涂敷条件，例如涂敷方法或涂敷于宿主生物的部位也没有特别的限定。 

作为这时使用的宿主生物并没有特别的限定，通常可以使用一般的各种实验中所用的哺乳动物，具体的可以列举出小鼠、大鼠、兔子、猪、猴等实验动物。例如在后述实施例中使用小鼠作为宿主生物。特别是小鼠作为实验动物而被广泛使用，因为其具有各种突变体的系统容易得到等的实际成绩和个体小使得饲养用的空间比较小等的优点，故优选。 

(皮肤片的移植) 

在体内实施上述环境形成步骤时，可以使用SpA等KC激动蛋白以外的物质作为上述刺激剂。作为代表性物质，可以使用形成AD样炎症性皮肤病变的皮肤(病变皮肤)。也可以通过将该病变皮肤的皮肤片移植至宿主生物来实现能诱导IL-18产生的环境。 

上述病变皮肤只要是形成AD样炎症性皮肤病变的皮肤就可以，并没有特别的限定。由于移植的关系，特别优选与宿主生物同种的生物的皮肤。异种生物的情况下，因像排斥反应一样的AD样炎症性皮肤病变以外的原 因而产生免疫应答，故不优选。作为上述宿主生物，正如在KC激动蛋白的相关说明中所述，可以列举出各种实验动物。例如在将小鼠用作宿主生物时，特别优选所移植的病变皮肤的皮肤片也来自于小鼠(参照后述实施例)。 

在此，上述宿主生物必须至少具备(i)CD4⁺T细胞的表达、(ii)stat6的表达及(iii)NKT细胞的IL-18Rα链的表达的各表现形中任何一种。由后述实施例4的结果已经清楚，缺失CD4的小鼠、缺失stat6的小鼠和缺失IL-18Rα链的小鼠即使移植由KCASP1Tg小鼠得到的病变皮肤的皮肤片，也都不诱导IgE的产生。即为了实现可以诱导IL-18产生的环境，上述(i)-(iii)的各表现形是必要的条件。 

上述CD4⁺T细胞是T细胞中表达抗原CD4(辅助细胞的细胞膜糖蛋白质的一种)的T细胞。关于CD4表达的有无，通过右上角的正或负来表示。因此，关于CD4，有表达的情况下用“CD4⁺”来表示，没有表达的情况下用“CD4^- ”来表示。上述stat6(STAT6)是参与细胞活素作用机理的细胞内信号传递分子，是被IL-4特异性活性化的物质。上述IL-18Rα链是在T细胞中表达具有参与IL-18的应答的结构。 

(阻碍剂鉴定步骤) 

上述阻碍剂鉴定步骤只要是在上述环境形成步骤所形成的可以诱导IL-18产生的环境下加入候选物，并认定阻碍诱导上述角质形成细胞导致的白介素18的产生的物质的步骤就可以，并没有特别的限定。在该步骤被认定的物质成为阻碍诱导IL-18分泌的阻碍剂。 

加入上述候选物的方法并没有特别的限定。例如如果是在体外，可以在培养KC的培养细胞的培养液中加入候选物，如果是在体内，可以将候选物涂敷于宿主生物的炎症部位，也可以将候选物内服于宿主生物。鉴定上述阻碍剂的手法也没有特别的限定，只要是可以确认KC导致的IL-18生成诱导被阻碍的方法就可以。可以诱导IL-18产生的环境无论是在体外还是在体内，都可以使用利用ELISA的非细胞体系等。 

本发明的筛选方法，只要是含有上述环境形成步骤和阻碍剂鉴定步骤 就可以，具体的方法并没有特别的限定，当然也可以含有其他的步骤。 

(免疫疾病的治疗药物和高水平IgE表达的抑制方法) 

本发明还包括使用上述筛选方法而得到的阻碍剂在内的免疫疾病治疗药物。关于该免疫疾病治疗药物的具体组成等并没有特别的限定。根据所筛选的阻碍剂的种类和成为投药对象的生物(也包括人)的状态，可以含有适当的缓冲剂或添加剂。 

本发明还包括使用由上述筛选方法而得到的阻碍剂或用了上述免疫疾病治疗药物的高水平Ige表达的抑制方法。在该方法中通过使用上述阻碍剂或免疫疾病治疗药物，抑制由KC产生的IL-18的局部性集聚而引起的不暴露于抗原的全身性IgE应答，其结果是可以抑制或阻碍特异性皮炎样的炎症性皮肤病变中形成的血清中高水平的IgE表达的现象。 

由KC诱导产生IL-18的有时直接与AD发病有关，有时是引起高水平的IgE表达而与AD的发病有关。本发明中无论是上述哪一种情况，都可以有效的治疗或缓解AD的病情。 

(2)本发明有关特异性皮炎样症状的诱导方法 

在上述(1)中就本发明中的由候选物筛选AD及其类似症状的治疗药物的方法进行了详细的说明，但本发明并不限定于此。为了阐明AD及其类似症状的发病机理，还包括对生物模型使AD样的炎症性皮肤病变发病的AD样症状的诱导方法。 

本发明有关AD样症状的诱导方法，如同上述(1)的环境形成步骤中关于将KC激动蛋白用作刺激剂的情况所说明的一样，可以将来自于金黄色葡萄球菌的蛋白质A涂敷于宿主生物的皮肤。关于这时的涂敷条件等也与上述(1)一样没有特别的限定。 

作为上述蛋白质A，如在上述(1)中所述，可以是该蛋白质A的完全蛋白质、可以刺激角质形成细胞的上述蛋白质A的部分蛋白质和可以刺激角质形成细胞的上述蛋白质A或其部分蛋白质的变构体的至少任意一种。 

作为上述宿主生物，也如上所述，可以适用小鼠、大鼠、兔子、猪、猴等实验动物，特别适用小鼠等。换而言之，本发明包括发病由上述诱导 方法而得到的炎症性皮肤病变的生物模型。 

(3)本发明的利用 

与本发明有关的筛选方法和AD样症状的诱导方法，如上所述，可以适用于AD及其类似症状的发病机理的阐明和治疗药物的开发。在此，本发明的上述各方法可以用试剂盒来实现。即本发明中可以包括用于实施上述筛选方法的筛选试剂盒或用于实施上述AD样症状的诱导方法的诱导试剂盒。 

上述筛选试剂盒的具体组成并没有特别的限定，例如至少由刺激剂(特别是KC激动蛋白和激活物)和阻碍剂鉴定步骤中所使用的各种物质(例如SpA的结合蛋白质和信号传递分子等)组成。同样地，AD样症状的诱导试剂盒的具体组成也没有特别的限定，涂敷由SpA溶液和能够有效地涂敷SpA的涂敷方法组成。 

与本发明有关的筛选方法可以适用于治疗AD样炎症性皮肤病变的免疫疾病治疗药物的筛选。与本发明有关的AD样症状的诱导方法人为地使动物模型发病AD样症状，从而可以用于AD样症状的发病机理的阐明。而且，也可以用于检验由本发明的筛选方法所得到的阻碍剂的效果。 

例如，作为与本发明有关的筛选方法，通过在体外实现环境形成步骤的方法可以得到某种阻碍剂(例如为物质X)，这时在KC的培养细胞中可观察到物质X的效果。这样，可以使用与本发明有关的AD样症状的诱导方法来制备AD样症状发病的小鼠，并用此在体内检验物质X的效果。 

本发明的利用方法并不限定于上述例子，当然也可以用于其他各种用途。 

这样在本实施方式中列举具体的例子来详细的说明本发明。但本发明并不仅仅限定于上述实施方式，本发明在不脱离其宗旨的范围内，根据本领域的技术人员具有的知识，可以通过各种改良、变更、修改的方式来实施。 

下面，通过实施例和比较例，更详细的说明本发明。但本发明并不限定于这些。实施例中所使用的小鼠和试剂以及具体的实验方法的详细内容 如下所示。 

(小鼠) 

雌性C57BL/6(B6)野生型小鼠(6-10周)由CLEA Japan公司购入。B6背景缺失CD4的小鼠(雌性，6-10周)由东京大学的Taniguchi博士友情提供。B6背景缺失stat6的小鼠(雌性，6-10周)由大阪大学的Takeda博士友情提供(参照Takeda，K.，Tanaka，T.，Shi，W.，Matsumoto，M.，Minami，M.，Kashiwamura，S.，Nakanishi，K.，Yoshida，N.，Kishimoto，T.and Akira.S.，1996.Essential role of STAT6in IL-4 signaling.Nature 380：627)。 

将B6小鼠和F10小鼠(雌性，6-10周)交配而得的缺失IL-18Rα的小鼠由大阪大学的Hoshino博士提供(参照Hoshino，K.，Tsutsui，H.，Kawai，T.，Takeda，K.，Nakanishi，K.，Takeda，Y.and Akira，S.1999.Generation of IL-18 receptor-deficient mice：evidence for IL-1receptor-related protein as an essential IL-18 binding receptor.J.Immunol.162：5041)。 

作为皮肤移植片的供体，选择使用患有具有高血清中IgE浓度(10-12μg/ml)及IL-18浓度(5-7ng/ml)的慢性皮肤疾病的雌性小鼠，使用将缺失caspase-1的小鼠和B6野生型小鼠交配而得的F6小鼠(雌性，6-10周)(参照Seki，E.，Tsutsui，H.，Tsuji，N.M.，Hayashi，N.，Adachi，K.，Nakano，H.，Futatsugi-Yumikura，S.，Takeuchi，O.，Hoshino，K.，Akira，S.，Fujimoto，J.and Nakanishi，K.2002.Criticalroles of myeloid differentiation factor 88-dependent proinflammatory cytokine release in early phase clearance of Listeriamonocytogenes in mice.J.Immunol.169：3863)。B6/129背景的骨髓分化因子-88(MyD88)缺失的小鼠和Toll样受体(TLR)2缺失的小鼠的F4小鼠(雌性)由大阪大学的Akira博士提供(参照Seki et al)。全部小鼠都处于无菌状态下。 

(试剂) 

由金黄色葡萄球菌Cowan 1精制的SpA由Calbiochem公司购入。来自于大肠杆菌(055；B5)的脂多糖类(LPS)由Difco公司购入。关于MurineFas配位体转染体(mFasL)参照非专利文献6。广泛范围内阻碍活性的caspase阻碍剂z-VAD-FMK(ZVAD)和caspase-1的特异性阻碍剂Ac-YCAD-CMK(YVAD)由Peptide Institute公司购入。本实施例中将含有10％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μM的2-巯基乙醇以及2mM的L-谷氨酰胺的RPMI1640用作通常的培养液。小鼠的细胞活素细胞株PAM212由东京大学的Tamaki博士提供。 

(皮肤移植) 

皮肤标本(1cm²)由野生型B6小鼠的正常皮肤和KCASP1Tg小鼠发病的皮肤(病变皮肤)或没有发病的皮肤(非病变皮肤)所得，并移植至野生型B6小鼠、缺失CD4的小鼠、缺失stat6的小鼠和缺失IL-18Rα的B6小鼠的背中。作为皮肤标本，对于KCASP1Tg的病变皮肤或非病变皮肤得到2片移植片。 

皮肤移植后，为了防止可能的全部感染，对受体提供添加了1mg/ml的硫酸新霉素(Sigma公司制)和1000U/ml的硫酸多粘菌素B(Sigma公司制)的饮用水。为了决定适宜的IgE浓度，采样了血清。 

观察被移植的各自宿主的移植皮肤的生长率观察48天。为了组织学的研究，用苏木精和曙红将皮肤标本染色(参照非专利文献3和4)。 

(皮肤溶解物) 

皮肤标本(1cm²)由野生型B6小鼠和KCASP1Tg小鼠所得，由该皮肤标本制备的表皮切片在PBS中，在4℃下均质并滤过。使用细胞活素用试剂和蛋白质评价试剂(Pierce公司制)，通过ELISA试剂盒来测定各自溶解物中所含有的各种细胞活素和蛋白质的浓度。 

(Th1/Th2分化) 

脾脏的CD4⁺T细胞是使用AutoMACS(Miltenyi Biotec公司制)，通过各种手法处理的小鼠脾脏中分离的。新分离的脾脏细胞与抗CD4珠(Miltenyi Biotec公司制)一起培养。CD4⁺T细胞的纯度超过98％。细胞 (1×10⁶/ml)与被固相化的抗CD3ε(PharMingen公司制)一起培养48小时，通过ELISA法来决定各自上清液的IFN-γ和IL-4的浓度。 

(细胞活素和IgE的评价) 

IL-18浓度通过MBL公司制的ELISA试剂盒来决定。IL-4、IFN-γ和IL-1β通过Genzyme公司制的ELISA试剂盒来决定。IL-5的ELISA试剂盒由Endogen公司购入。血清IgE浓度通过PharMingen公司制ELISA试剂盒来决定。IL-18的IFN-γ诱导能使用命名为LNK系列的IL-18应答性的小鼠NK细胞纯株，通过生物鉴定来决定(参照非专利文献6)。 

具体地，涉及IFN-γ产生，对IL-18的刺激，LNK5E6细胞比LNK5E3细胞具有更高的应答性(参照非专利文献6)，将该细胞与各种样品及100pg/ml的IL-12一起在抗IL-18抗体(50μg/ml)的存在下或不存在下培养48小时。IL-18的活性度如下式所示，在对IL-18的应答中，作为由细胞所产生的IFN-γ的浓度而被定义(参照非专利文献6)。 

IL-18活性度＝(抗IL-18抗体不存在下的上清液中的IFN-γ)-(抗IL-18抗体存在下的上清液中的IFN-γ)。 

(SpA的涂敷) 

制备将各种量的SpA溶解于5μl的溶剂(50％甘油的PBS溶液)所得的溶液，将该SpA溶液每天涂敷于野生型的耳部皮肤，涂敷14天。作为对照，使用不含SpA的5μl溶剂。为了避免其它小鼠的影响，将小鼠放至单独的笼子中。 

(KC的制备) 

KC是按照Tamaki博士之外所示的方法(参照Vestergaard，C.，Yoneyama，H.，Murai，M.，Nakamura，K.，Tamaki，K.，Terashima，Y.，Imai，T.，Yos hie，O.，Irimura，T.，Mizutani，H.，et al.1999.Overproduction of Th2-specific chemokine in NC/Nga mice exhibitingatopic dermatitis-like lesions.J.Clin.Invest.104：1097，或Tamaki，K.，Stingl，G.，Gullino，M.，Sachs，D.H.and Katz，S.I.1979.la antigens in mouse skin are predominantly expressed on Langerhans cell.J.Immunol.123：784)，由各种基因型的小鼠制备，并且为了使表面分子的表达回复到正常，在培养液中培养一晚。为了除去DC，将KC与CD11c微珠(Miltenyi Biotec公司制)一起培养后，使用AutoMACS来除去CD11c⁺细胞。 

KC(5×10⁵/ml)或PAM212细胞(2×10⁵/ml)与各种量的SpA和lμg/ml的LPS或mFasL(1×10⁶/ml)一起培养24小时。在一部分的实施例中，将野生型的KC在20μM的ZVAD或YVAD的存在下与100μg/ml的SpA一起培养24小时。各自的上清液的IL-18的浓度及其活性度通过ELISA和生物鉴定来分别决定。在一部分的实施例中，KC与500μg/ml的SpA一起培养4小时，并提取总RNA，进行RT-PCR(参照Tsutsui，H.，Matsui，K.，Kawada，N.，Hyodo，Y.，Hayashi，N.，Okamura，H.，Higashino，K.andNakanishi，K.1997.IL-18 accounts for both TNF-α-and Fasligand-mediated hepatotoxic pathways in endotoxin-induced liverinjury in mice.J.Immunol.159：3961)。关于用于IL-18、IL-12p35、IL-12p40或β-肌动蛋白的引物和各自的细胞活素的PCR的条件参照上述Tsutsui et al.。 

(Kupffer细胞的制备) 

Kupffer细胞(库普费尔细胞)的制备按照非专利文献6进行。Kupffer细胞(1×10⁶/ml)与1μg/ml的LPS(脂多糖类)一起培养4小时，其IL-18、IL-12p35、IL-12p40和β-肌动蛋白的表达通过RT-PCR，作为mRNA浓度而决定。 

(FACS(荧光显示型细胞分类仪)分析) 

将按照非专利文献6制备的KC与结合了藻红蛋白(PE)的抗CD11c抗体(PharMingen公司制)和结合了异硫氰酸荧光素(FITC)的抗I-A^b 抗体(PharMingen公司制)一起培养，或者与结合了PE的抗CD4抗体(PharMingen公司制)和结合了FITC的抗CD8抗体(PharMingen公司制)一起培养后，通过二色流式细胞测量法分析来决定DC、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的比率。 

(统计量) 

所有的数据表示为3组的平均和标准偏差。对照组和处置组之间的显著性差异通过独立t检验来进行。P＜0.05时有显著性差异。 

(实施例1：由移植来自于KCASP1Tg小鼠的皮肤移植片所导致的IgE诱导) 

首先调查KCASP1Tg小鼠的病变皮肤移植至同系的正常野生型小鼠时，是否有诱导血清IgE浓度上升的可能性。具体地，为了标准化各自移植的皮肤移植片的条件，将在耳部、面部及身体发生慢性皮炎，并在血清中具有一定的IL-18和IgE浓度的KCASP1Tg小鼠选作受体。将KCASP1Tg小鼠的病变皮肤片或非病变皮肤片移植至正常B6小鼠，并测定宿主的血清IgE浓度。其结果如图1所示。 

在图1中，图中的涂黑的圆和右侧上方的照片表示正常的B6小鼠中移植KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的结果，图中画斜线的圆和右侧中央的照片表示移植KCASP1Tg小鼠的非病变皮肤的结果，图中的正方形和右侧下方的照片表示移植野生型小鼠的正常皮肤的结果。在图中所示的时间点，为了通过ELISA测定IgE，采样血清的同时观察移植皮肤的生长率(图1的上方：移植皮肤的生长率)。数据表示为各自试验组的3只小鼠的平均和标准偏差。移植皮肤的生长率如上方的画面所示。 

如图1所示，移植非病变皮肤的B6小鼠显示延迟的弱的IgE应答，与此相对，移植病变皮肤的小鼠的情况下，其血清中的IgE浓度早期是上升的。做为对照组，B6小鼠移植野生型小鼠的皮肤移植切片并没有看到IgE的上升。移植病变皮肤的B6小鼠显示高的血清IgE浓度，但脱离移植片后浓度下降。另一方面，移植非病变皮肤的B6小鼠维持低的IgE浓度。另外，移植病变皮肤的B6小鼠即使在病变皮肤的排斥反应后血清IgE浓度再度开始上升。 

数据虽未显示，但血清IL-18浓度无论哪一种皮肤移植切片导致的刺激后都不上升。同样地数据没有显示，但是血清IL-4和IL-6的浓度通过市售的ELISA试剂盒都没有检出。由这些结果可知，KCASP1Tg小鼠的病变皮肤移植至正常的B6小鼠时持续性诱导全身性的IgE上升。这与停止IL-18给药后立即停止的外因性IL-18依赖性的IgE产生(未公开数据)相对照。

(实施例2：KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的IL-18和Th2-关联细胞活素的集聚) 

为了阐明有效地诱导宿主的IgE应答的机理，只移植病变皮肤，并将病变皮肤的移植片和非病变皮肤的移植片的IL-18浓度进行比较。各皮肤的移植片分别如前所述作成溶解物并测定IL-18的浓度。其结果如图2的A-F所示。 

在图2的A-F中，涂黑的柱状图表示采样自2只KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的结果，画斜线的柱状图表示采样自2只KCASP1Tg小鼠的非病变皮肤的结果，空白的柱状图表示采样自3只野生型小鼠的皮肤作为对照的结果。图2A表示上述各皮肤标本的溶解物的IL-18的浓度，同样地，图2B表示IL-18的活性度(IL-18应答性的LNK5E6细胞所导致的IFN-γ产生)，图2C表示IL-1β的浓度，图2D表示IFN-γ的浓度，图2E表示IL-4的浓度，图2F表示IL-5的浓度。各结果表示为各自样品的3个独立的实验结果的平均和标准偏差。还有，ND表示未检出。 

如图2A所示，KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的溶解物通过ELISA显示高的IL-18浓度，IL-18的前体和成熟型都被检出。另一方面，KCASP1Tg小鼠的非病变皮肤的溶解物中仅显示低的IL-18浓度，野生型小鼠的皮肤溶解物中，IL-18的浓度最低。 

在此，由对于IL-18的免疫印迹法分析可知，KCASP1Tg小鼠的皮肤的病变部位表达了具有生理活性的18kDa的IL-18和24kDa的IL-18前体，野生型小鼠的皮肤和KCASP1Tg小鼠的非病变皮肤只表达24kDa的IL-18前体。这样，为了确认此事，进行了对于IL-18的生物鉴定。其结果如图2B所示，KCASP1Tg小鼠的病变皮肤显示出由IL-18导致的IFN-γ诱导的活性度的效价很高。另一方面，非病变皮肤几乎不显示活性。B6小鼠的正常 皮肤中不存在那种具有生理活性的IL-18。 

如图2C所示，IL-1β也是只在病变皮肤浓缩为KC。已知除了IL-18和IL-1β，其他的caspase-1产生物也只在病变皮肤浓缩为KC。这样宿主中的IgE浓度与被移植的移植片的IL-18和IL-1β的浓度相对应。 

下面测定KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的溶解物中IFN-γ、IL-4和IL-5的浓度。其结果如图2D-F所示。KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的溶解物中，IFN-γ、IL-4和IL-5的浓度与野生型小鼠和KCASP1Tg小鼠的非病变皮肤的溶解物比较，也全部都上升。这样，病变皮肤的移植片蓄积了大量的IL-18、IL-1β、IFN-γ、IL-5和IL-4。 

为了调查KCASP1Tg小鼠的病变皮肤中集聚着哪种细胞，通过FACS来测定KC标本中的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和树枝状突起细胞的比率。其结果如图3A-F所示。 

图3A和D是表示由野生型小鼠的正常皮肤所得的KC标本的结果，图3B和E是表示由KCASP1Tg小鼠的非病变皮肤所得的KC标本的结果，图3C和F是表示由KCASP1Tg小鼠的病变皮肤所得的KC标本的结果。 

图3A-C表示将各KC标本与结合了PE的抗CD4抗体和结合了FITC的抗CD8抗体培养的结果，图3D-F表示将各KC标本与结合了PE的抗CD11c抗体和结合了FITC的抗I-A^b抗体培养的结果。在图3A-F的各自图中表示了CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的比率以及CD11c⁺DC和I-A^b+DC的比率。各结果只表示各自实验组的3只小鼠中1只的结果。 

如图3A-F所示，病变皮肤与野生型小鼠比较，CD4⁺T细胞的数目实质性上升，这3种受体之间，CD8⁺T细胞和DC的比率没有差别。 

数据虽未显示，但是肥大细胞的数目与野生型小鼠比较，KCASP1Tg小鼠的病变皮肤中显著上升，在非病变皮肤中没有上升。该结果与本发明人以前的报告(非专利文献4)一致。这样，CD4⁺T细胞在KCASP1Tg小鼠的病变皮肤优先集聚，病变皮肤中也有很多肥大细胞集聚。 

(实施例3：移植病变皮肤的小鼠的Th1细胞和Th2细胞的诱导) 

IgE应答通常必需Th2细胞的活性化，所以下面调查病变皮肤移植后宿主中的CD4⁺T细胞是否分化成Th2细胞。具体地，对于正常的B6小鼠移植KCASP1Tg小鼠的病变皮肤、非病变皮肤和野生型小鼠的正常皮肤，21天后将脾脏的CD4⁺T细胞与被固相化的抗CD3一起培养48小时，通过ELISA决定上清液的IL-4浓度(涂黑的柱状图)和IFN-γ浓度(空白的柱状图)。其结果如图4所示。 

图4中，将IL-4浓度表示为涂黑的柱状图，将IFN-γ浓度表示为空白的柱状图。各自的数据表示为3个组的平均和标准偏差。由3个独立的实验得到类似的结果。NS表示没有显著性差异。 

如图4所示，移植KCASP1Tg小鼠的病变皮肤后，第21天的宿主的脾脏的CD4⁺T细胞与移植正常的B6小鼠的皮肤的宿主比较，对被固相化的抗CD3应答，并大量产生了IL-4和IFN-γ。 

与此相对，移植非病变皮肤的受体中，脾脏的CD4⁺T细胞产生了与移植B6野生型小鼠的皮肤的受体相等量的IL-4和IFN-γ(对平皿(plate)结合抗CD3的应答)。但是，数据虽未显示，移植后第7天，移植KCASP1Tg小鼠的病变皮肤和非病变皮肤的受体的CD4⁺T细胞只分泌了与移植了野生型小鼠的正常皮肤的对照的受体的CD4⁺T细胞等量的IL-4和IFN-γ。 

由这些结果可知，CD4⁺T细胞为了分化为Th1/Th2细胞，由移植病变皮肤的移植片所导致的刺激开始需要2-3周的时间。 

(实施例4：依赖于IL-18、CD4和stat6的IgE的诱导) 

KCASP1Tg小鼠的病变皮肤诱导IgE的机理在细胞水平上进行了分析。但是，除去CD4⁺T细胞的小鼠即使给药IL-18，也看不到血清IgE浓度的上升。因此，来自于宿主的CD4⁺T细胞本来是否是必需的，或者是病变皮肤中产生浸润性IL-4的供体T细胞；调查何是诱导IgE的必需条件。 

具体地将KCASP1Tg小鼠的病变皮肤移植至野生型小鼠、缺失CD4的小鼠，缺失stat6的小鼠和缺失IL-18Rα的小鼠，在第0天和第21天采样血清以测定IgE。其结果如图5所示。空白的柱状图表示第0天的结果， 涂黑的柱状图表示第21天的结果。各数据表示为各自的实验组的3只小鼠的平均和标准偏差。 

首先，如图5A所示，缺失CD4的小鼠即使移植KCASP1Tg小鼠的病变皮肤后也不产生IgE。由此结果可知，KCASP1Tg小鼠的病变皮肤的移植切片中的IL-4产生细胞或IL-18没有宿主的CD4⁺T细胞就不能诱导IgE的全身性上升。 

Stat6对IL-4的信号传递是必不可少的，下面分析宿主的stat6的活性化是否决定IgE诱导，如图5A所示，缺失stat6的小鼠移植病变皮肤后不显示任何IgE的上升。由此结果可知，通过病变皮肤的移植片所诱导的IgE应答依赖于来自于宿主的CD4⁺T细胞和stat6。数据虽未显示，但B6小鼠的正常皮肤的移植在缺失CD4⁺T细胞或stat6的宿主也不诱导IgE产生。因此，通过皮肤移植所导致的IgE的诱导只发生在宿主提供完全的CD4⁺T细胞和stat6的时候。 

进一步调查移植切片中的IL-18是否引起宿主中的IgE诱导。为此使用不能应答IL-18的缺失IL-18Rα的小鼠作为宿主。如图5A所示，在缺失IL-18Rα的小鼠没有看到IgE的上升。数据虽未显示，但移植了B6小鼠正常皮肤的缺失IL-18Rα的小鼠没有显示IgE的上升。 

综上所述，结果是皮肤的病变部位的少量的IL-18的持续性集聚可以诱导依赖于来自于宿主的CD4⁺T细胞和stat6的全身性的IgE的上升。 

移植了病变皮肤的野生型小鼠显示了伴有CD4⁺T细胞向Th1细胞和Th2细胞的分化的IgE应答(参照图4)，因此调查这种向Th1/Th2细胞的分化是否也依赖于病变皮肤的移植切片中存在的IL-18。 

具体地将B6野生型小鼠的正常皮肤和KCASP1Tg小鼠的病变皮肤移植至缺失IL-18Rα的小鼠。在第21天从受体分离脾脏的CD4⁺T细胞，通过被固化的抗CD3进行刺激，并通过ELISA测定产生的IL-4和IFN-γ。其结果如图5B所示。 

空白的柱状图是IFN-γ的结果，涂黑的柱状图是IL-4的结果。各数据表示为各自的实验组的3只小鼠的平均和标准偏差。NS表示没有显著性差 异。 

如图5B所示，移植了病变皮肤的移植片的缺失IL-18Rα的小鼠的CD4⁺T细胞与移植了野生型小鼠正常皮肤的缺失IL-18Rα的小鼠的CD4⁺T细胞相比较，关于其IL-4或IFN-γ的产生量并没有差别。由此结果显示了通过病变皮肤的移植片的Th1/Th2细胞的分化依赖于从移植片被放出的IL-18的可能性。 

(实施例5：通过体内的SpA所导致的IL-18和IgE的诱导) 

已知金黄色葡萄球菌的感染有时使AD患者的皮肤的炎症恶化，已知一些AD患者的血清IL-18浓度上升。因此调查金黄色葡萄球菌的产物是否能引起正常B6小鼠的IL-18的全身性上升。 

具体地将各种用量的SpA和仅将溶剂每天1次涂敷于正常B6小鼠的耳部皮肤，并涂敷2周。之后在第14天采样血清和脾脏以测定IL-18和IgE的浓度。再将溶剂和SpA(100μg/天)与平皿(plate)结合涂敷小鼠的脾脏的CD4⁺T细胞的抗CD3一起培养48小时，通过ELISA来测定各自的上清液的IFN-γ和IL-4的浓度。其结果如图6A-C所示。 

图6A表示IL-18的结果，图6B表示IgE的结果，图6C的空白柱状图表示IFN-γ的结果，涂黑的柱状图表示IL-4的结果。图6A和B的数据表示为各自的组中3只小鼠的平均和标准偏差。图6C的数据表示为3组供试品的平均和标准偏差，表示各自组中3只小鼠中1只的数据。ND表示未检出，NS表示没有显著性差异。 

如图6A所示，涂敷SpA的小鼠的血清中IL-18水平随给药量增加而上升，只涂敷溶剂的小鼠没有上升。数据虽未显示，但在涂敷SpA和溶剂的小鼠中通过ELISA没有检出IL-12p40和IL-12p70。如图6B所示，IgE水平也随给药量增加而上升。另外，如图6C所示，通过SpA被处理的小鼠没有显示Th2细胞的优势分化。这些结果显示与IL-18同样，SpA没有Th1/Th2细胞的任何一方优势分化而诱导全身性IgE的可能性。 

(实施例6：应答于SpA，且KC分泌IL-18而不分泌IL-12) 

IL-18如果没有IL-12就能诱导IgE，如果有IL-12反而会阻碍IgE诱导。现在已知含有诱导IL-18分泌的LPS(脂多糖类)的刺激剂通常引起IL-12的产生。因此，下面调查应答于SpA，哪种细胞分泌IL-18，且这些细胞分泌IL-18而不伴有IL-12的产生。 

具体地将PAM212细胞(小鼠的KC培养株)与SpA一起、以及在没有SpA下培养24小时，通过ELISA和生物鉴定来分别测定各自上清液中的IL-18浓度和IL-18的诱导IFN-γ的生物活性。其结果如图7A所示。图7A中，左侧表示IL-18的浓度，右侧表示诱导IFN-γ的活性度。图7A的数据表示为3组值的平均和标准偏差。ND表示未检出。 

由图7A可知，在SpA导致的刺激后，PAM212细胞分泌可以诱导IFN-γ产生的活性型IL-18。 

为了验证新分离的KC是否应答于SpA且分泌IL-18，将野生型B6小鼠的KC与各种用量的SpA一起培养24小时。 

具体地关于由野生型B6小鼠的皮肤制备的KC和除去CD11⁺细胞的KC，通过流式细胞测量法分析CD11c和MHC类II(I-A^b)的表达。这些细胞在SpA存在下和没有SpA的状态下培养24小时，并通过ELISA来测定上清液的IL-18浓度。其结果如图7B所示。在图7B中，用涂黑的柱状图表示由野生型B6小鼠的皮肤制备的KC，用空白的柱状图表示除去CD11c⁺细胞的KC。 

如图7B的左侧所示，新分离的KC应答于SpA，并随用量增多而放出IL-18。因为LC/DC可以放出IL-18，将CD11c⁺细胞从KC标本除去并将其与SpA一起培养。如图7B的右侧所示，即使在除去CD11c⁺细胞后，KC受到SpA的刺激时就分泌IL-18。图7B的数据表示为3组值的平均和标准偏差。ND表示未检出。 

下面为了阐明由被SpA诱导的KC而分泌IL-18的分子学机理，因为caspase-1对由LPS(脂多糖类)的诱导所导致的IL-18分泌是必不可少的，所以调查来自于受到SpA导致的刺激的缺失caspase-1的KC的IL-18 分泌。 

具体地从野生型小鼠、缺失caspase-1的小鼠、缺失TLR2的小鼠和缺失MyD88的小鼠来制备KC，野生型小鼠的KC在20μM的ZVAD、20μM的MYVAD和同体积的DMSO(Veh)的存在下，与500μg/ml的SpA一起培养24小时，同时，将上述各突变体的KC与500μg/ml的SpA一起培养24小时，通过ELISA来测定各自上清液中的IL-18。其结果如图7C所示。 

在图7C中，WT表示野生型小鼠，KO表示上述各突变体(人工破坏特定基因类型)的小鼠，空白的柱状图表示缺失caspase-1的小鼠，网状的柱状图表示缺失TLR2的小鼠，画斜线的柱状图表示缺失MyD88的小鼠。 

如图7C所示，不加DMSO而与500μg/ml的SpA培养的野生型小鼠的KC产生28.4±3.5pg/ml的IL-18。缺失caspase-1的小鼠的KC分泌与野生型小鼠的KC相等水平的IL-18。所以可知对SpA的刺激不依赖于caspase-1的IL-18的分泌。图7C的数据表示为3组值的平均和标准偏差。 

caspase-1阻碍剂YVAD和阻碍广泛范围的caspase的ZVAD强烈阻碍来自于LPS或膜结合型的Fas配位体刺激所导致的肝脏组织巨噬细胞的Kupffer细胞的IL-18分泌。因此，关于受到SpA刺激的KC，也调查IL-18的分泌是否被YVAD或ZVAD所影响。如图7C所示，这两种caspase阻碍剂没有阻碍来自于受到SpA刺激的野生型小鼠的KC的IL-18分泌。该结果显示对来自于受到SpA刺激的KC的IL-18分泌，caspase是不必要的。数据虽未显示，但可以说关于缺失caspase-1的小鼠的KC的情况也是同样的。 

因为许多微生物刺激TLR/MyD88信号路线，所以调查KC是否依赖于通过革兰氏阳性菌的信号受体的TLR2或全部的TLR成员而共享的必不可少的接头分子的MyD88而分泌IL-18。如图7C所示，TLR2和MyD88两者对于来自于SpA刺激所诱导的KC的IL-18分泌是不必要的，因此通过SpA的IL-18的分泌诱导是不依赖于TLR的IL-18分泌。 

因为Kupffer细胞应答于LPS或膜表现型的Fas配位体所导致的刺激而分泌IL-18，所以调查这些刺激剂是否诱导来自于KC的IL-18分泌。具 体地将来自于野生型B6小鼠的KC(5×10⁵/ml)与500μg/ml的SpA、1μg/ml的LPS或1×10⁶/ml的mFasL一起培养24小时，所得的上清液中所含有的IL-18通过ELISA来测定。其结果如表1所示。 

[表1] 

由表1的结果可知，与Kupffer细胞相反，KC受到LPS或Fas配位体的刺激后也不分泌IL-18。表1中ND表示未检出。 

下面调查受到SpA的刺激的KC是否同时分泌IL-12。为了确认微量的IL-12，从与SpA培养4小时的KC得到总RNA，并用此进行RT-PCR。具体地将野生型B6小鼠的KC和Kupffer细胞在500μg/ml的SpA存在和不存在下，以及1μg/ml的LPS存在和不存在下，分别培养4小时。提取的总RNA中的IL-18、IL-12p40、IL-12p35和β-肌动蛋白的mRNA的表达水平通过RT-PCR来测定。其结果如图7D所示。 

如图7D所示，LPS所刺激的Kupffer细胞表达了IL-12p35和IL-12p40，与此相对，受到SpA刺激的KC没有检出IL-12p35和IL-12p40。从与SpA培养8小时或16小时的KC中得到总RNA，用此进行对IL-12的RT-PCR，但这些中都没有检出IL-12。数据虽未显示，通过ELISA也测定IL-12，但受到培养24小时后的SpA的刺激的KC的上清液中没有检出IL-12p40和IL-12p70。 

与此相对，Kupffer细胞的KC恒定地表达IL-18，在受到SpA导致的刺激后表达的水平也没改变。数据虽未显示，但Kupffer细胞作为对SpA的应答，没有分泌IL-12和IL-18。 

由这些结果可知，通过涂敷于皮肤的SpA的刺激，局部性KC分泌IL-18，但不分泌IL-12，这与IgE的诱导相关联。 

(实施例7：涂敷了SDS和SpA的混合物的NC/Nga小鼠的皮肤病变) 

NC/Nga小鼠是易发特异性皮炎的小鼠，在SPF下不发病，但移至常规环境下时就发病。即使将4％的SDS或SpA(200μg/天)单独涂敷于NC/Nga小鼠也不发病，但将两者混合并涂敷于NC/Nga小鼠的剃过毛的背部时观察到AD样的皮肤病变。 

图8的A-D将涂敷4％SDS和SpA(200μg/天)的混合物的NC/Nga小鼠的皮肤病变的结果与对照的结果共同表示的图。如图8C所示，只涂敷4％SDS时28天后也看不到发病，但涂敷4％SDS和SpA(200μg/天)的混合物时，如图8B和图8D所示，14天后、28天后观察到AD样的皮肤病变。 

图9的A-D是将涂敷4％SDS和SpA(200μg/天)的混合物的NC/Nga小鼠的皮肤随时间的变化与对照的结果共同表示的图。图9的A-C表示用苏木精或曙红(HE)染色的AD样病变皮肤在光学显微镜下进行观察的结果。图9A表示倍率为25倍的观察结果，图9B表示倍率为50倍的观察结果，图9C表示倍率为100倍的观察结果。图9D是用Alucan-blue染色的AD样病变皮肤在光学显微镜下进行观察的结果。如图9D所示，在组织学上，病变部位的表皮明显增厚，证明有Alucan-blue着色的肥大细胞的浸润。 

在实施发明的最佳方式项所实施的具体方式和实施例都使本发明的技术内容变得清楚，但不能狭义的理解为仅仅限定于这些具体例，在本发明的精神和下述权利要求的范围内，可以进行各种改变从而实施。 

(产业上利用的可能性) 

综上所述，本发明是根据来自于KC的IL-18的局部性集聚引起不接触于抗原的全身性IgE应答，从而导致AD样炎症性皮肤病变中生成的血清高水平IgE表达的现象为依据所实现的筛选方法和特异性皮炎样症状的诱导方法及其利用。 

因此，本发明显示出由微生物刺激所诱导的KC的IL-18产生的重要性，并提供与未知抗原导致的变态反应疾病的病因相关联的机理中新的见解，同时可以有效利用于AD的治疗药物等的开发。 

因此，本发明不仅可以适用于各种药品产业和研究用试剂产业，也可以应用于医疗领域。所以本发明显示来自于微生物刺激所诱导的KC的 IL-18产生的重要性，并提供与未知抗原导致的变态反应疾病的病因相关联的机理中新的见解，同时可以有效利用于AD的治疗药物等的开发。 

Claims (4)

1.一种筛选方法，其是利用患有特异性皮炎样的炎症性皮肤病变的生物产生白介素18的诱导现象的阻碍剂的筛选方法，其特征在于：含有下述步骤：

在体外形成由刺激剂刺激角质形成细胞诱导白介素18产生的环境的环境形成步骤；

以及在该环境下加入候选物，并将阻碍来自于所述角质形成细胞的白介素18的产生诱导的物质作为所述阻碍剂而鉴定的阻碍剂鉴定步骤；

其中，作为所述刺激剂使用来自于金黄色葡萄球菌的蛋白质A、刺激角质形成细胞的上述蛋白质A的部分蛋白质或刺激角质形成细胞的上述蛋白质A或其部分蛋白质的变构体中的至少任意一种。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，作为所述刺激剂，除了蛋白质A可以并用SDS。

3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，在体外实施所述环境形成步骤时，可以通过在角质形成细胞的培养细胞的培养液中添加所述蛋白质A并培养来实现所述环境的形成。

4.一种筛选试剂盒，是作为用于进行权利要求1-3中任意一项所述的筛选方法的筛选试剂盒，至少由刺激剂和阻碍剂鉴定步骤中所使用的各种物质组成。

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