DE60122513T2

DE60122513T2 - Caspase 1-transgenes tier

Info

Publication number: DE60122513T2
Application number: DE60122513T
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Tsu-shi MIZUTANI
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2021-06-16
Also published as: JP4469551B2; ATE336888T1; EP1290939B1; EP1290939A4; EP1290939A1; US7067712B2; WO2001095710A1; US20030159163A1; DE60122513D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein transgenes Tier, das als Tiermodell für atopische Dermatitis geeignet ist.
Stand der Technik
Atopische Erkrankungen, einschließlich atopischer Dermatitis, Asthma, allergischer Rhinitis und allergischer Konjunktivitis, sind pathologische Zustände, die das eigene Immunsystem einer Person zerstören können, und Organstörungen als Ergebnis von Hyperreaktionen auf in der Umgebung befindliche Antigene, gegenüber denen gesunde Personen üblicherweise keine Reaktion zeigen, verursachen. Ein vorstellbarer Mechanismus der Entwicklung dieser Erkrankungen umfasst einen Beitrag von Th2-Cytokin, das allergische Reaktionen fördert. Der Induktionsmechanismus und der regulatorische Mechanismus, die aus physiologischen und pharmakologischen Standpunkten kritisch sind, wurden noch nicht vollständig ermittelt.
Zur Zeit umfassen gemeinsame Behandlungen atopischer Erkrankungen die Vermeidung von Antigenen; die Verabreichung von Antihistaminika, die als Antagonisten gegen das Binden eines Mediators, wie z.B. Histamin, an einen Rezeptor dienen; und die Verabreichung von entzündungshemmenden Steroiden. Die Entwicklung verbesserter Therapien, die spezifischer auf den Wirkungsmechanismus abzielen, verbleibt jedoch gehindert, weil keine geeigneten Versuchstiere bereitgestellt wurden.
Nach konventionellen Verfahren muss, um eine allergische Reaktion von einem Testtier zu erhalten, das Tier zuerst durch wiederholte vorherige Immunisierung eines Antigens oder eines Allergens sensibilisiert werden, und dann mit dem gleichen Typ des Antigens oder des Allergens herausgefordert werden. Ein solches Verfahren erfordert nicht nur eine beträchtliche Arbeitsbelastung für das gleichzeitige Sensibilisierung zahlreicher Tiere, sondern ergibt auch eine Nichtgleichmäßigkeit zwischen Tieren im Hinblick auf die Reaktivität, was potentielle Probleme der Reproduzierbarkeit des Tests mit sich bringt.
In den letzten Jahren haben NC/Nga-Mäuse zu ihrer potentiellen Verwendung als Tiermodell für atopische Dermatitis Aufmerksamkeit erregt. Diese Dermatitis wird jedoch nur in dem Fall entwickelt, bei dem die Wirtsmaus Milben aufweist, und außerdem ist der Prozentsatz des Ausbruchs inkonsistent und die Symptome entwickeln sich in verschiedener Form.
Tests unter Verwendung von Tieren sind für die Entwicklung von Arzneimitteln für atopische Erkrankungen unverzichtbar, und es besteht insbesondere ein Bedürfnis für Tiermodelle für atopische Dermatitis. Bis jetzt waren jedoch keine solchen Tiermodelle für atopische Dermatitis, die einen festen erblichen Hintergrund und eine aufgeklärte immunologische Belastung aufweisen und für die Forschung und Ent wicklung von Arzneimitteln und Pharmazeutika unter Bedingungen verfügbar sind, aus denen spezifische pathogene Mikroorganismen eliminiert sind, weder vorhanden noch wurden sie in der Praxis verwendet. Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Erzeugung eines Tiers, das als Modell für atopische Dermatitis geeignet ist.
Beschreibung der Erfindung
Im Hinblick auf die vorstehenden Ausführungen haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung ihre Forschungstätigkeit auf Interleukin 18 (IL-18) fokussiert. IL-18 wird, wenn es durch eine Caspase 1 (IL-1β-converging enzyme) bezeichnete Protease einem Processing unterliegt, von seiner Vorläuferform in die reife Form transformiert. Es ist bekannt, dass die Funktionen von reifem IL-18 umfassen: (1) Induktion der Produktion von IFN-γ, (2) Promotion von Fas-mediierter Apoptosis durch erleichterte Expression eines Fas-Liganden, (3) Induktion von GM-CSF und (4) Inhibierung der IgE-Produktion bei gleichzeitiger Gegenwart von IL-12. IL-18 wird nicht nur im Immungewebe exprimiert, sondern auch in einer Vielzahl von Geweben, die Osteoblasten ähnliche Stromalzellen, Keratinozyten, Epithelzellen des Dünndarms, Nebennierenrindenzellen und Hypophysezellen umfassen, und ihre physiologischen Rollen wurden energisch untersucht (siehe z.B. Immunology, 1997-98, veröffentlicht von Nakayama Shoten, 62-72; und Clinical Immunology, 30(2), 191-198, 1998). Neuerdings haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung festgestellt, dass eine Überexpression von IL-18, wenn sie allein auftritt, die Produktion von IL-4 und IL-13 fördert und die Produktion von IgE bewirkt. Dies zeigt eine enge Beziehung zwischen IL-18 und Th2-Cytokin, das mit dem Ausbruch atopischer Erkrankungen in Verbindung steht. Die Erfinder haben deshalb in Betracht gezogen, dass, wenn ein Tiermodell mit einer erhöhten Fähigkeit zur Sekretion von Caspase 1, das IL-18 in seine reife Form überführt, erzeugt werden kann, ein solches Tier zur Erforschung des Ausbruchsmechanismus von atopischen Erkrankungen und zur Entwicklung therapeutischer Methoden dafür geeignet sein würde. Da Caspase 1 jedoch ein Apoptose-induzierendes Enzym ist, ist die einfache Übertragung eines Caspase 1-Gens zur Expression in einem lebenden Körper für den Wirt tödlich. Um zu verursachen, dass ein Wirt reifes IL-18 sekretiert, ist außerdem die Expression von Caspase 1 in Zellen, die pro-IL-18 produzieren, erforderlich. Die Erfinder haben deshalb in Betracht gezogen, dass, wenn rekombinante DNA so konstruiert ist, dass sie Caspase 1-Gen, das zur Produktion von pro-IL-18 fähig ist, spezifisch in der Haut exprimiert, auf Tierzellen übertragen wird, das Wirtstier kontinuierlich reifes IL-18 im Blut sekretiert, und wenn ein solches Tier unter Bedingungen, die frei sind von spezifischen pathogenen Mikroorganismen, wie z.B. Milben und Schimmel, gezüchtet wird, transgene Tiere, die Symptome atopischer Dermatitis zeigen, erzeugt werden können, was zur Vervollständigung der Erfindung führte. In diesem Zusammenhang untersuchten die Erfinder der vorliegenden Anmeldung vorher durch Caspase 1 hervorgerufene Apoptosis und Entzündung durch direkte Injektion von Caspase 1-Gen in eine gesunde Maus und nicht in ein befruchtetes Ei davon (J. Dermatol. Sci. 21 (1999): 49-58). Diese Maus entwickelte jedoch keine spontane Entzündung und unterscheidet sich deshalb vollständig vom erfindungsgemäßen Tier.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein transgenes nicht-menschliches Säugetier oder seine Nachkommenschaft bereit, umfassend eine DNA, die so konstruiert ist, dass sie exogenes Caspase 1-Gen in einer solchen Weise enthält, dass es spezifisch in der Haut exprimiert wird, und ein Verfahren zur Erzeugung eines solchen Tiers.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Screenen prophylaktischer und/oder therapeutischer Substanzen für atopische Dermatitis bereit, das gekennzeichnet ist durch das Verabreichen einer Testsubstanz an das erwähnte transgene Tier und Untersuchen des verbessernden Effekts der Substanz auf atopische Dermatitis; und die Verwendung des Screeningverfahrens zur Bereitstellung eines prophylaktischen oder therapeutischen Arzneimittels für atopische Dermatitis, das einen verbessernden Effekt auf atopische Dermatitis zeigen soll.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt schematisch die Anordnung von Komponenten der im Gentransfer verwendeten rekombinanten DNA;
2 zeigt die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse betreffend die Expression von mRNA aus hpro-CASP1 in verschiedenen Geweben von KCASP1Tg;
3 zeigt die Ergebnisse des Immuno-Blotting unter Verwendung von anti-hCASP1-Antikörper zur Expression von hCASP1-Protein in der Haut von KCASP1Tg;
4 zeigt die Konzentrationen von IL-18, IL-1β und IL-1α in Seren von KCASP1Tg;
5 zeigt die Häufigkeit des Hautkratzverhaltens von KCASP1Tg und gesunden Mäusen;
6 zeigt die Veränderungen im Blut-IgE und den Histaminspiegeln von KCASP1Tg während der Zeit; und
7 zeigt die Blut-IgE-Spiegel von 14 Wochen alten KCASP1Tg und gesunden Mäusen.
Beste Art zur Durchführung der Erfindung
Die Körperzellen und die Keimzellen des erfindungsgemäßen transgenen Tiers enthalten DNA, in der exogene Caspase 1(CASP1)-Gen so integriert ist, dass das Gen hautspezifisch exprimiert wird. Das exogene Caspase 1-Gen ist vorzugsweise von Menschen oder Mäusen abgeleitet, und Beispiele umfassen menschliches Procaspase 1(hproCASP1)-Gen, Mäuse-Procaspase 1(mproCASP1)-Gen, menschliches Caspase 1(hCASP1)-Gen und Mäuse-Caspase 1(mCASP1)-Gen, wobei 1,4 kb cDNA mit einer vollständigen Kodierungsregion von hproCASP1 besonders bevorzugt ist.
Vorzugsweise ist die DNA, in der das exogene Caspase 1-Gen so integriert wurde, dass das Gen hautspezifisch exprimiert wird, eine rekombinante DNA, die ein exogenes Caspase 1-Gen und einen Promotor für ein hautspezifisches Protein enthält. Beispiele für den Promotor für ein hautspezifisches Protein umfassen Promotoren für Proteine, die spezifisch in der Haut gefunden werden, und spezifische Beispiele umfassen Promotoren für Keratin 14, Keratin 5, Keratin 1, Keratin 10 und Involcrin, wobei Keratin-Promotoren besonders bevorzugt sind. Das exogene Caspase 1-Gen ist stromabwärts vom Promotor des hautspezifischen Proteins gebunden, und zur Verbesserung der Expressionseffizienz des Gens ist vorzugsweise ein Intron, wie z.B. β-Globin-Intron, ebenfalls gebunden.
Vorzugsweise enthält die vorstehend genannte DNA eine Sequenz von PolyA (üblicherweise als Terminator bezeichnet) zur Terminierung der Transkription von Messenger-RNA von Interesse in einem trans genen Säuger, um eine Manipulation der Genexpression durch Verwendung von z.B. von Viren und Säugern abgeleiteten Gensequenzen zu ermöglichen. Vorzugsweise wird PolyA des vorstehend erwähnten hautspezifischen Proteins verwendet, und insbesondere PolyA von Keratin. Zusätzlich kann, um eine erhöhte Expression im Gen von Interesse zu erzielen, ein Spleißsignal oder eine Enhancer-Region des Gens oder ein Teil eines Introns eines eukaryotischen Gens an das 5'-stromaufwärtige Ende der Promotorregion, zwischen der Promotorregion und der Translationsregion, oder dem 3'-stromabwärtigen Ende der Translationsregion, abhängig vom Erfordernis, ligiert sein.
Beispiele von nicht-menschlichen Säugern zur Übertragung der so erhaltenen rekombinanten DNA umfassen Kühe, Schweine, Schafe, Ziegen, Kaninchen, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Ratten und Mäuse. Von diesen Säugern sind Kaninchen, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Hamster, Mäuse und Ratten bevorzugt. Nager, insbesondere Mäuse, sind besonders bevorzugt.
Das erfindungsgemäße transgene Tier wird erzeugt durch Übertragen von DNA, in der das vorstehend erwähnte exogene Caspase 1-Gen integriert wurde, damit das Gen spezifisch in der Haut exprimiert wird, in z.B. ein befruchtetes Ei eines nicht-menschlichen Säugers, und dann wird das Ei in ein weibliches Wesen des Säugetiers implantiert. Vorzugsweise befindet sich das so verwendete befruchtete Ei in der Periode des männlichen Pronucleus (ca. 12 Stunden nach Befruchtung). Beispiele für Verfahren zur Übertragung der rekombinanten DNA umfassen die Calciumphosphat-Methode, die elektrische Pulsapplikation, Lipofektion, Agglutination, Mikroinjektion, die Teilchen-Spritzmethode (particle gun method) und die DEAE-Dextran-Methode, wobei die Mikroinjektion besonders bevorzugt ist.
Das befruchtete Ei, in das die rekombinante DNA eingebaut wurde, wird in ein weibliches Tier der gleichen Tierspezies, von der das Ei erhalten wurde, implantiert. Vorzugsweise wird die Implantation künstlich durchgeführt, d.h., durch Transplantation und Implantation in den Eileiter eines pseudo-schwangeren weiblichen Tiers. Aus der durch das Tier mit dem implantierten befruchteten Ei erzeugten Nachkommenschaft werden Individuen, die das Gen von Interesse exprimieren, selektiert, und die selektierten Individuen können über Generationen reproduziert werden.
Ob das erhaltene transgene Tier das Gen von Interesse trägt oder nicht, kann bestimmt werden durch Sammeln von DNA aus einer Hautprobe und Unterwerfen der Probe einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Southern-Blotting zur Analyse des übertragenen Gens.
Das so erhaltene erfindungsgemäße transgene Tier exprimiert exogenes Caspase 1-Gen in der Haut und zeigt Symptome von atopischer Dermatitis, selbst bei Abwesenheit eines spezifischen pathogenen Mikroorganismus. Ein anderes charakteristisches Merkmal des erfindungsgemäßen Tiers ist seine verlängerte Lebensdauer.
Das erfindungsgemäße transgene Tier weist das exogene Caspase 1-Gen nur in der Haut auf. Mit anderen Worten ist das exogene Caspase 1-Gen nicht in anderen Geweben, z.B. der Leber, den Nieren, den Lungen, des Gehirns oder der Milz, enthalten. Die Haut des erfindungsgemäßen transgenen Tiers enthält somit reifes IL-18 und reifes IL-1β. Darüber hinaus enthält das Blut des erfindungsgemäßen transgenen Tiers reife IL-18 und reife IL-1β im Vergleich zu gesunden Tieren in größeren Mengen, wobei der Gehalt an reifem IL-18 relativ zu reifem IL-1β höher ist.
Das erfindungsgemäße transgene Tier entwickelt Symptome von atopischer Dermatitis – z.B. Dermatitis rodens, erosiver Dermatitis, Hautulkus und Erosion – ab einem Alter von ca. 8 Wochen. Ab dem Alter von ca. 10 Wochen ergibt die Beobachtung von Hautgewebe unter einem optischen Mikroskop Psoriasisähnliche Veränderungen, die Parakeratose oder andere Veränderungen, wie z.B. Acanthose-verdickte epiderme Umfangsteile um Ulzeration begleiten, und das Corium des ulzerativen Teils ist mit Monozyten und Mastzellen infiltriert. Die Keratinozyten der Läsion zeigen acidophile Necrose, die Pycnose begleitet, was eine Apoptosis von Keratinozyten anzeigt. Darüber hinaus kratzt das erfindungsgemäß erzeugte transgene Tier seine Haut viel häufiger als gesunde entsprechende Tiere, was ein starkes Jucken bestätigt, das für atopische Dermatitis unikal ist. Die erfindungsgemäßen trangenen Tiere zeigen ein für atopische Dermatitis charakteristisches Symptom, d.h. einen hohen Bluthistaminspiegel und hohen IgE-Spiegel.
Da, wie vorstehend beschrieben, die erfindungsgemäßen transgenen Tiere Symptome atopischer Dermatitis in Abwesenheit spezifischer pathogener Mikroorganismen zeigen, sind sie als Tiermodell für atopische Dermatitis geeignet. Das heißt, die Verabreichung einer Testsubstanz an das erfindungsgemäße transgene Tier oder seine Nachkommenschaft und die Bestätigung eines verbessernden Effekts auf atopische Dermatitis ermöglicht das Screenen von prophylaktischen und/oder therapeutischen Substanzen für atopische Dermatitis. Der verbessernde Effekt auf atopische Dermatitis kann verifiziert werden durch Messen des Blutspiegels von reifem IL-18, Bestimmen des reifen IL-18 in der Haut, durch visuelle Beobachtung, oder durch Beobachtung des Hautgewebes unter einem Mikroskop, allein oder in geeigneter Kombination. Testsubstanzen, deren Effekt zur Verbesserung atopischer Dermatitis durch Screenen bestätigt wurde, sind als prophylaktische und/oder therapeutische Arzneimittel für atopische Dermatitis geeignet.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird als nächstes detaillierter durch Beispiele beschrieben, die nicht als die Erfindung beschränkend anzusehen sind.
Die in den nachstehenden Beispielen verwendeten Testmethoden und Materialien sind die folgenden:
(1) Northern-Blotting
Mäuse-Caspase 1(mCASP1)-cDNA (Cell, 75, 653-660 (1993)) wurde von Osaka University (Dr. Miura) erhalten. Die totale RNA in ihrer Gesamtheit wurde durch Extraktion unter Verwendung eines Isogen-Reagens (Produkt von Nippon Gene Co., Ltd.) aus Geweben von CASP1-transgenen Mäusen (KCASP1Tg) (in dem nachstehend beschriebenen Beispiel 1 erhalten) und Kontroll-Mäusen erhalten. Bei der Northern-Blotting-Analyse wurden 10 μg gesamte RNA durch Elektrophorese an 2% Formaldehyd/Agarose-Gelen größenfraktioniert. RNA wurde auf eine Nylonmembran (Immobilon-N, Produkt von Millipore Co.) übertragen und mit³²P-markierten cDNAs, die menschlichem und Mäuse-CASP1 (bezüglich menschlicher CASP1-cDNA, siehe J. Dermatol. Sci., 21 (1994), 49-58) untersucht. RNA und cDNA wurden auf der Membran hybridisiert. Danach wurden die Blots auf der Membran zweimal mit 1 × SSC/0,1% SDS bei 42°C und zweimal mit 2 × SSC/0,1% SDS gewaschen und dann auf einem Röntgenfilm bei –70°C belichtet.
(2) Cytokine, Cytokin-Assays und Antikörper
Rekombinantes Mäuse-IL-1β (rmIL-1β) wurde von R&D System bezogen. Menschliches pro-IL-1β (hproIL-1β) wurde gemäß der in J. Exp. Med. 174: 821 (1991) beschriebenen Methode hergestellt. Rekombinantes menschliches IL-1β (rhIL-1β) und anti-menschlicher IL-1β-Antikörper wurden von Otsuka Pharmaceuticals bereitgestellt. Der IL-1α-Spiegel wurde unter Verwendung eines ELISA-Kits (Produkt von Endogen) gemessen, und die IL-1β- und IFN-γ-Spiegel wurden unter Verwendung eines von R&D System hergestellten Kits gemessen. Die biologischen Aktivitäten von IL-18 wurden durch Messung der IFN-γ-induzierenden Aktivitäten unter Verwendung von IL-18-reaktiven Mäuse-NK-Zellen bestimmt. Rekombinantes Mäuse-IL-18 (rmIL-18), Kaninchen-neutralisierender Anti-Mäuse-IL-18-Antikörper und Mäuse-IL-18-ELISA-Kits wurden von Hayashibara Biochemical Laboratories hergestellt. Die Verwendung des Mäuse-IL-18-ELISA-Kits erlaubte die Bestimmung von IL-18 innerhalb eines Bereichs von 10 bis 1.000 pg/ml.
(3) Immunohistochemie
Aus transgenen Mäusen und Wildtyp-Mäusen erhaltene Biopsieproben wurden mit Phosphat-gepuffertem Formalin 2 Stunden lang fixiert. Danach wurden die Proben für ein Schneiden von Paraffinschnitten präpariert. Die Proben wurden sofort in OCT-Verbindung (Produkt von Miles), die ein einbettendes Material für gefrorene Gewebe ist, eingefroren und bei –70°C gelagert. Cryostatschnitte (5 μm) wurden mit Aceton 5 Minuten bei 4°C fixiert. Ein geeignet verdünnter primärer Antikörper wurde zu den Proben zur Inkubation während 1 Stunde zugegeben. Nach Waschen der Proben wurden die primären Antikörper, die gebunden wurden, unter Verwendung eines Vectastein-Elite-Kits (Produkt von Vector Laboratories) mit AEC (Produkt von Dako Japan) als Substrat sichtbar gemacht.
(4) Terminale Deoxynucleotidyltransferase-mediierte dUTP-Biotin-Nickenden-Markierung (TUNEL)
DNA-Fragmentierung von Hautbiopsieproben in Paraffinschnitten wurde mittels TUNEL-Anfärbung gemäß der in Arch. Dermatol., 133: 845 (1997), beschriebenen Methode untersucht.
(5) Immunoblotting
Immunoblotting wurde gemäß der in J. Clin. Invest. 87: 1066 (1991), beschriebenen Methode durchgeführt. DNA und RNA wurden unter Verwendung eines Isogen-Kits entfernt. Aus transgenen Mäusen und Kontrollmäusen hergestellte epidermale Zelllysate wurden individuell in SDS-Probepuffer unter reduzierenden Bedingungen suspendiert. Dann wurden die elektrophoresierten Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran (Produkt von Scheicher & Schuell) unter Verwendung eines halbtrockenen Blotters (Produkt von Bio-Rad) übertragen. Zur Membran wurde ein primärer Antikörper zur Inkubation während 1 Stunde zugegeben. Danach wurde alkalisches Phosphatase-markiertes Anti-Mäuse-IgG oder Anti-Kaninchen-IgG zur Membran für eine zweite Inkubation zugegeben. Schließlich wurde es den Proben ermöglicht, mit einem Western-Blue-Substrat (Produkt von Promega) eine Farbe zu entwickeln.
(6) Pro-IL-1β(proIL-1β)-Processingaktivität
Rekombinantes menschliches Pro-IL-1β (rhproIL-1β) wurde zusammen mit frischem epidermalen Lysat 10 bis 30 Minuten lang inkubiert. SDS-Probenpuffer wurde zugegeben, und die Mischung wurde sofort gekocht. Die resultierenden Proben wurden mittels Immunoblotting unter Verwendung eines antimenschlichen IL-1β-Antikörpers und eines Western-Blue-Detection-Kits (Produkt von Promega) analysiert.
Beispiel 1
(1) DNA-Konstrukt und Erzeugung einer transgenen Maus
1,4 kb cDNA, die die gesamte Kodierregion von hproCASP1 kodierte, wurde in menschlichem Keratin 14-Promotor (freundlicherweise von Dr. E. Fuchs, Chicago Universität, bereitgestellt; Nature, 374, 159-162 (1995)) und Kaninchen-β-Globin-Intron (freundlicherweise von Dr. Tanaka, Kyoto Universität, bereitgestellt; Nature, 374, 159-162 (1995), durch Blunt-End-Ligation ligiert (in 1 beziehen sich "K14-Promotor", "β-Glob.-Int.", "1,4 kb-hproCASP1" und "K14-PolyA" auf menschlischen Keratin-14-Promotor, Kaninchen-β-Globin-Intron, 1,4 kb menschliche Procaspase 1-cDNA bzw. menschliches Keratin-14-PolyA). Das so erhaltene DNA-Fragment wurde in befruchtete Eier von C57BL/L6-Mäusen (Charles River Japan, Inc.) durch Mikroinjektion gemäß der in Dev. Growth Differ., 39: 257 (1997), beschriebenen Methode injiziert.
(2) Bestätigung von Überexpression von hCASP1 in der Haut von transgenen Mäusen
Die Nachkommenschaft-Mäuse wurden auf den Einbau des Transgens durch PCR und Southern-Blotting unter Verwendung von DNA aus der Schwanzhaut gescreent. Von einer Gesamtzahl von 96 neugeborenen Mäusen waren 4 Mäuse (männlich 3, weiblich 1) hCASP1-transgen (nachstehend werden diese Mäuse mit KCASP1Tg abgekürzt). Die KCASP1Tg waren bei der Geburt gesund und wuchsen danach normal auf. Vor dem Alter von 8 Wochen waren sie jedoch kleiner als ihre Wildtyp-Wurfgenossen. Nach diesem Zeitpunkt zeigten KCASP1Tg chronische aktive Dermatitis. Von den drei männlichen KCASP1Tg wurde eines mit Wildtyp-Weibchen gepaart und bildete KCASP1Tg- und Wildtyp-Nachkommen in einem Verhältnis männlich:weiblich = 1:1. Alle Versuche wurden auf der im Vergleich mit nicht-transgenen oder Wildtyp-Wurfgenossen heterozygoten Linie für transgene Wurfgenossen durchgeführt.
(3) Hautkonditionen
Unter Konditionen, in denen keine speziellen Pathogene bestimmt wurden, begannen vom Alter von 8 Wochen an die KCASP1Tg klar eine Dermatitis rodens mittleren Grades in peripheren Bereichen ihrer Augen zu zeigen, die sich rasch zu einer schweren erosiven Dermatitis entwickelte. Von Zeit zu Zeit wurde Hautulkus beobachtet. Innerhalb von 1 bis 2 Wochen danach entwickelten sich diese Symptome im Gesicht, an den Ohren, am Hals, dem Torso und den Beinen. Danach trat Reepithelisierung auf, und lichenoide Dermatitis wurde lokal entwickelt, mit Wiederauftreten von Erosion und Ulkus. Nach 16 Wochen wurde eine Vielzahl von Herden einer Hauterkrankung gebildet, und die Ohren und Augenlider waren deformiert. Das Haar auf dem Gesicht und den Extremitäten verschwand, und es verblieb nur eine mit vielen Narben begleitete Haut.
Unter einem optischen Mikroskop zeigte die Epidermis von KCASP1Tg keine besonderen histologischen Veränderungen bis zu einem Alter von 6 Wochen. Die dicke Epidermis, die die ulzerativen Läsionen von KCASP1Tg mit einem Alter von 10 Wochen umgab, zeigten Psoriasis-ähnliche Veränderungen, die Parakeratose und Dermatitis, teilweise mit Acanthose assoziiert, begleiteten. Das Corium der ulzerativen Stellen war mit zahlreichen Monozyten infiltriert. Die Keratinozyten in den Läsionsstellen zeigten eosinophile Necrose mit nuclearer Kondensation, was für Apoptose von Keratinozyten bezeichnend ist. Tatsächlich wurden die Kerne der in den Hautläsionsstellen vorhandenen Zellen, die viele Keratinozyten enthielten, mittels TUNEL-Anfärbung, die zur Identifizierung bei der DNA-Fragmentierung verwendet wird, positiv gefärbt. Im Gegensatz dazu wurden in den Hautproben von Kontroll-Wurfgenossen keine TUNEL-positiven Keratinozyten beobachtet.
In dicken epidermalen Gewebeproben von KCASP1Tg wurden hohe hCASP1-Gehalte festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigten Proben von Kontrollmäusen negative Tests. Um zu untersuchen, ob eine Ulzeration dem funktionellen Fas-Ligand (Fas-L), induziert durch reifes IL-18, verarbeitet aus endogenem pro-IL-18 durch exogenes hCASP1 zuzuschreiben ist, wurde Fas-L-neutralisierender Antikörper an KCASP1Tg verabreicht, bevor sie Veränderungen in der Haut entwickelten. Spezifischerweise wurde gemäß der in J. Exp. Med., 182: 1777 (1995), beschriebenen Methode Fas-L-neutralisierender Antikörper (1 mg; MFL1, freundlicherweise von Dr. Higaki, Juntendo Universität, bereitgestellt) intraperitoneal jeder KCASP1Tg von der 5. Woche bis zur 9. Woche jede Woche injiziert, und Konditionen der Haut-Ulzeration wurden beobachtet. Eine intensive Behandlung mit anti-Fas-L-neutralisierendem Antikörper war jedoch nutzlos und ermöglichte die Entwicklung von Hautulkus. Deshalb wird angenommen, dass Apoptose von Keratinozyten unabhängig von der Wirkung des Fas/Fas-L-Wegs induziert wird. IL-18-induzierte Apoptose in vielen Proben der getesteten Zelllinien und getesteten primären Kulturzellen nicht. Außerdem zeigten Keratinozyten-spezifische IL-1α-transgene Mäuse keinen Apoptose-bezogenen Hautulkus. Das legt nahe, dass IL-1β nicht an der Apoptose von Hautzellen von KCASP1Tg beteiligt ist, obwohl IL-1β die gleichen Funktionen wie IL-1α aufweist.
(4) Bestimmung von reifem hCASP1 in Haut
Die Gegenwart von hproCASP1-mRNA in Zellen von Ohrepidermis, Rückenepidermis, Leber, Niere, Darm, Lunge, Hirn und Milz von KCASP1Tg wurde durch Northern-Blotting bestimmt (2). Als Ergebnis wurde 1,4 kb hproCASP1-mRNA nur in epidermalen Zellen des Ohrs und des Rückens von KCASP1Tg gefunden, aber nicht in anderen Geweben (Leber, Niere, Darm, Lunge, Hirn und Milz von KCASP1Tg). Die 2 zeigt die Ergebnisse des Northern-Blotting: Spur 1: eine aus nicht transgenen Wurfgenossen erhaltene Probe, Spuren 2-9: hproCASP1-mRNA im epidermalen Ohrgewebe, epidermalen Rückengewebe, Leber, Niere, Darm, Lunge, Hirn und Milz von KCASP1Tg.
Damit Caspase ihre biologischen Wirksamkeiten zeigt, ist im allgemeinen ein geeignetes Processing erforderlich. Es wurde berichtet, dass Pro-CASP1 einer Autoproteolyse in vitro unterliegt, um dadurch reifes CASP1 zu bilden (Molecular Cell, 1:319 (1998); J. Biol. Chem., 271:13273 (1996)). Die Berichte legen nahe, dass KCASP1Tg hCASP1 enthält, das spontan in der Haut aktiviert wurde. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde die Größe von hCASP1-Protein in KCASP1Tg-Hautlysat unter Verwendung von Anti-hCASP1-Antikörper durch Immunoblotting gemessen (J. Biol. Chem., 271:13273 (1996)). Wie in 3 gezeigt, enthielt das Hautlysat zwei aktivierte Komponente von hCASP1 (p20 und p10) und einen Vorläufer von p45, während das Hautlysat von Wildtyp-Wurfgenossen keine solche wie vorstehend beschriebene Komponente enthielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass hCASP1 in KCASP1Tg-Haut spontan in die reife Form gespalten wurde. In 3 bedeuten: Spur 1: positive Kontroll-THP-1-Zellen, Spur 2: rekombinantes p20/p10-hCASP1, Spur 3: KCASP1Tg-Hautlysat, Spur 4: Wildtyp-Hautlysat.
Die Processing-Aktivität von hCASP1 in der Haut von KCASP1Tg wurde unter Verwendung von Pro-IL-1β als Substrat in vitro gemessen. Es wurde gefunden, dass KCASP1Tg-epidermales Zelllysat 17 kD reife Fragmente durch Spaltung von 31 kD rekombinantem hproIL-1β erzeugt hatte. Diese Spaltung wurde durch einen synthetisierten CASP1-Inhibitor und Iodacetamid inhibiert.
Zusätzlich wurde eine Messung durchgeführt, um zu sehen, ob hCASP1 in der Haut von KCASP1Tg biologische Wirkungen in vitro zeigt oder nicht. Da durch Versuche unter Verwendung von mRNA gefunden wurde, dass IL-1β und IL-18 konstant in Keratinozyten exprimiert werden, wurde die Größe jedes Cytokins am Protein-Niveau der Haut gemessen. Hautlysat von KCASP1Tg enthielt reifes IL-18 und reifes IL-1β, während Hautlysat vom Wildtyp keine solche Komponente enthielt. Dies deshalb, weil transfektiertes hCASP1 spontan endogenes Vorläufertyp-IL-1β und Vorläufertyp-IL-18 durch spontane Aktivierung spaltet.
(5) IL-18-Spiegel im Blut
Es wurden Messungen durchgeführt, um festzustellen, ob eine lokale Aktivierung von IL-18 und IL-1β durch exogenes hCASP1 eine systemische Akkumulierung individueller reifer Cytokine induziert. Die 4 zeigt einen hohen Serum-IL-18-Spiegel in KCASP1Tg mit einem Alter von 4 Wochen, was statistisch bedeutsam ist. Der Serum-IL-18-Spiegel in Wildtyp-Wurfgenossen verblieb während ihrer Lebensperiode gering (0,1 ng/ml oder weniger). Die Serum-Konzentration an IL-18 in KCASP1Tg erhöhte sich mit dem Wachstum allmählich. Nur eine kleine Menge von IL-1β im KCASP1Tg-Serum wurde in einem Alter von 12 Wochen festgestellt, während kein IL-1β im Wildtyp festgestellt wurde. Eine Überexpression von hCASP1 in Keratinozyten erhöhte selektiv die Serum-Konzentration von IL-18, aber nicht von IL-1β.
Um zu verifizieren, dass das Serum-IL-18 von KCASP1Tg reifes IL-18 ist, wurden die biologischen Aktivitäten von KCASP1Tg-Serum-IL-18 untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, dass Serum von KCASP1Tg die Fähigkeit aufweist, IL-18-reaktive geklonte natürliche Killerzellen zu stimulieren, um IFN-γ zu produzieren. Außerdem wurde die Fähigkeit, IFN-γ zu induzieren, durch Anti-IL-18-Antikörper (neutralisierender Antikörper) vollständig gehemmt. Dies zeigt, dass das Serum von KCASP1Tg aktives IL-18 enthält. IFN-γ wurde jedoch im Serum von KCASP1Tg im normalen Zustand nicht gefunden. KCASP1Tg sekretiert somit kontinuierlich reifes IL-18 in zirkulierendes Blut.
(6) Hautkratzverhalten transgener Mäuse
Das Auftreten eines Hautkratzverhaltens von KCASP1Tg und gesunder Mäuse (C57BL/L6-Mäuse) wurde 40 Minuten lang durch visuelle Beobachtung bestimmt.
Als Ergebnis kratzten, wie in 5 gezeigt, gesunde Mäuse ihre Haut 50 Mal oder weniger pro 10 Minuten, während KCASP1Tg 200 Mal oder öfter pro 10 Minuten kratzten, was die Ausbildung von mit schweren Hautausschlägen verbundenem Jucken zeigt.
(7) Blut-IgE-Spiegel und Bluthistamin-Spiegel
Blut-IgE-Spiegel (RIA-Methode) und Bluthistamin-Spiegel (ELISA-Methode) wurden von KCASP1Tg im Laufe der Zeit gemessen. Die Ergebnisse sind in 6 angegeben. Blut-IgE-Spiegel von KCASP1Tg (14 Wochen alt) und von gesunden Mäusen wurde gemessen, und die Ergebnisse werden in 7 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Bluthistamin-Spiegel transgener Mäuse der vorliegenden Erfindung auf so hoch wie 2.000 nM in einem Alter von 13 bis 14 Wochen erhöht war, während der Blut-IgE-Spiegel ebenfalls extrem erhöht war, d.h., auf nicht weniger als 50 μg/mm im Alter von 16 Wochen.
Industrielle Anwendbarkeit
Das die erfindungsgemäßen transgenen nicht-menschlichen Säuger spontan atopische Dermatitis in Abwesenheit spezifischer pathogener Mikroorganismen entwickeln, sind sie als Modelltiere für die Erkrankung geeignet. Die Verwendung von erfindungsgemäßen transgenen Tieren ermöglicht die Entwicklung prophylaktischer/therapeutischer Arzneimittel für atopische Dermatitis auf der Basis einer natürlichen Immunität, und die Erforschung des dem Ausbruch atopischer Erkrankungen zugrundeliegenden Mechanismus.

Claims

Transgenes nicht-menschliches Säugetier oder seine Nachkommenschaft, umfassend eine DNA mit darin integriertem exogenem Caspase 1-Gen, damit das Gen hautspezifisch exprimiert wird.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier oder seine Nachkommenschaft nach Anspruch 1, worin die DNA, die exogenes Caspase 1-Gen darin integriert aufweist, damit das Gen hautspezifisch exprimiert wird, exogenes Caspase 1-Gen und einen Promotor für ein hautspezifisches Protein umfasst.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier oder seine Nachkommenschaft nach Anspruch 2, worin der Promotor für hautspezifisches Protein ein Keratin-Promotor ist.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier oder seine Nachkommenschaft nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das kontinuierlich atopische Dermatitis ausbildet.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier oder seine Nachkommenschaft nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das kontinuierlich reifes IL-18 in Blut sekretiert.
Verfahren zum Screenen prophylaktischer und/oder therapeutischer Substanzen, umfassend das Verabreichen einer Testsubstanz an ein Tier oder seine Nachkommenschaft nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Untersuchung des verbessernden Effekts auf atopische Dermatitis.
Verfahren zur Erzeugung eines Tieres oder seiner Nachkommenschaft nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend den Einbau von DNA, in die exogenes Caspase 1-Gen übertragen wurde, damit das Gen hautspezifisch exprimiert wird, in ein befruchtetes Ei eines nicht-menschlichen Säugetiers, und Implantieren des befruchteten Eis in ein weibliches Wesen des Säugetiers.