WO2004103988A1

WO2004103988A1 - 含硫プロアントシアニジンオリゴマー組成物及びその製造方法

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Publication number: WO2004103988A1
Application number: PCT/JP2004/007448
Authority: WO
Inventors: Gen-Ichiro Nonaka; Buxiang Sun; Lan Yuan; Takashi Nakagawa; Hajime Fujii; Young-Joon Surh
Original assignee: Amino Up Chemical Co., Ltd.; Usaien Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-05-26
Filing date: 2004-05-25
Publication date: 2004-12-02
Also published as: AU2004240219A8; NZ567835A; EP1524270A4; CN102178673B; ATE440829T1; DE602004022758D1; US20110028742A1; KR20060029999A; AU2004240219A1; KR101241534B1; US20110021792A1; JP5004265B2; AU2004240219B8; JPWO2004103988A1; NZ536591A; AU2004240219B2; CA2488394A1; EP1524270A1; CN102178673A; EP1524270B1

Abstract

植物中のプロアントシアニジン類を生体の腸管を通じた吸収が容易な程度に低分子量化した含硫プロアントシアニジンオリゴマーの製造方法を提供し、得られた含硫プロアントシアニジンオリゴマーを有効成分とする活性酸素種の生成等が原因となる各種生活習慣病、脳疾病の治療・予防、老化の予防に有用な健康食品組成物及び医薬品組成物を提供する。

Description

明細書含硫プロアントシァニジンオリゴマー組成物及びその製造方法技術分野

本発明は含硫プロアントシァニジンォリゴマー及びその組成物、それらの製造方法及び用途に関する。さらに詳しく言えば、植物中のプロアントシァ二ジン類を生体の腸管を通じた吸収が容易な程度に低分子量化する含硫プロアントシァ-ジンオリゴマーの製造方法、その方法で得られる含硫プロアントシァ-ジンオリゴマーを有効成分とする、活性酸素種の生成等が原因となる各種生活習慣病、脳疾病の治療 ·予防に有用な健康食品組成物及び医薬品組成物を提供するものである。背景技術

食生活の変化による脂肪摂取の過多や、環境の変化、オゾン層破壌等による紫外線への暴露量の増加、環境汚染物質の増加等により、高脂血症、高コレステロール血症、高血圧、糖尿病、癌等のいわゆる生活習慣病が増加し、さらにアレルギー、痴呆症などの脳疾患の患者も増加しつつある。今後、高齢化社会の進展と共に痴呆、アルツハイマー症候群等の患者の増加も危惧されるが、これらの要因に生体内で生成する活性酸素種の関与が指摘されている（Bioorganic & Medicinal Chemistry, 10 (2002) , 2497 - 2509)。し力ゝし活性酸素種の完全な生成抑制ないし制御技術は開発されていないため、現状では生活習' I 病や脳疾患等に有効 ·確実な予防 ·治療技術は十分に確立されていない。

植物に存在して生理活性を示す天然物質、特にポリフエノール類の化合物に近年関心が集中している。ポリフエノール類は一般に茶、野菜、果実、ハーブ類等に含まれ、食品あるいは嗜好品として長期間の摂取経験のある、副作用のない治療 ·予防剤として期待できるものである。

ポリフユノール化合物は植物の二次代謝産物で、植物界に普遍的、かつ多量に存在し、多彩な生理活性を示すことが知られ、古くは薬学、植物化学等の分野で、近年も健康食品分野で注目を集めている。例えば、茶のポリフエノール、特にカテキン類は、抗菌、抗ウィルス、抗突然変異、抗酸化、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、抗ぅ蝕、抗アレルギー、腸内フローラ改善、消臭など、広範囲の生理活性を有することが知られている。

ポリフエノールの中でもプロアントシァ-ジン類は幅広い植物に含まれるポリフエノールである。プロアントシァニジン類が、前述のような多彩な生理活性を示すには、プロアントシァ-ジン化合物が腸管を通じて生体内に吸収される必要がある。しかしプロアントシァニジン類の分子量は一般に数千乃至数万のオーダーと言われている。このような分子の大きな物質は腸管を通じての吸収は困難で、摂取しても生体に吸収されずに利用されない事が多い。

本発明者らも、ソバ種子から抽出したポリフユノールが脂質代謝改善、脳機能改善等の作用を有することを見出して特許出願しているが（特開平 10- 218786号公報）、その有効成分はプロアントシァ-ジンのポリマーであり、生体への吸収の面では必ずしも十分とは言えなかった。発明の開示

本発明は、腸管を通じて生体に吸収され難いプロアントシァニジン化合物を吸収され易い形に変え、プロアントシァニジン化合物の示す多彩な生理活性効果を十分に発揮させることで生体の抗酸化活性を向上させ、活性酸素種が原因とされる生活習慣病や脳疾病の治療 ·予防に有用な医薬品、健康食品等を提供することにある。本発明者らは、プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物と s

H基含有化合物の反応で得られる低分子の含硫プロアントシァニジンオリゴマーは、容易に腸管を通じて生体に吸収され、経口摂取により各種の生理活性を示すことを知見して本発明を完成した。

すなわち、本発明は医薬品や健康食品組成物として有用な以下の含硫プロアントシァニジンオリゴマーとその組成物、それらの製造方法に関する。 1 . プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物を S H基含有化合物と反応させた反応液を濃縮、乾燥して得られる含硫プロアントシァニジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物。

2 . オリゴマーがプロアントシァニジンの 2〜 5量体である前記 1記載の含硫プロアントシァニジンオリゴマー組成物。

3 . プロアントシァニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ'スパイス類、木材 ·樹皮類の一種以上から選ばれる前記 1に記載の含硫プロアントシァニジンオリゴマ一組成物。

4 . S H基含有化合物が、システィン、シスチン、ダルタチオン、 S H基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも 1種から選択される前記 1記載の含硫プロアントシァニジンオリゴマー組成物。

5 · 生活習慣病の治療及びノまたは予防用の医薬組成物である前記 1乃至 4 のいずれかに記載の a成物。

6 . 老化の予防用の医薬組成物である前記 1乃至 4のいずれかに記載の組成物。

7 . 生活習慣病の改善及び/または予防用の健康食品組成物である前記 1乃至 4のいずれかに記載の組成物。

8 . 老化の予防用の健康贪品組成物である前記 1乃至 4のいずれかに記載の組成物。

9 . プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物を S H基含有化合物と反応させて得られる含硫プロアントシァ-ジンオリゴマーを含む成分を分画して得られる含硫プロアントシァ-ジンオリゴマー。

10. オリゴマーがプロアントシァ-ジンの 2〜 5量体である前記 9記載の含硫プロアントシァ-ジンオリゴマー。

1 1. プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物を SH基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする含硫プロアントシァニジンオリゴマー組成物の製造方法。

12. プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物を SH基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする含硫プロアントシァニジンオリゴマーの製造方法。

13. プロアントシァニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハープ'スパイス類、木材 '樹皮類の一種以上から選ばれる前記 1 1または 12記載の製造方法。

14. SH基含有化合物が、システィン、シスチン、ダルタチオン、 SH基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも 1種から選択される前記 1 1 または 12記載の製造方法。

1 5. 無機酸、有機酸またはこれらの両者を用いて酸性条件とする前記 1 1 または 1 2記載の製造方法。

16. 塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クェン酸、ァスコルビン酸、リンゴ酸から選ばれる少なくとも 1種を使用する前記 1 5記載の製造方法。

1 7. 式（4)

で示さジン化合物。

19. 式（6)

で示されるプロアントシァニジン化合物。 21. 式（8)

で示されるプロアントシァニジン化合物 , 図面の簡単な説明

図 1は本発明の実施例 1による含硫プロアントシァ-ジンオリゴマー組成物（分画前の粉末；物質 1) 及びその原料（ブドウ種子ポリフエノール抽出物：比較物質 1) を投与したマウスの血清中 LPO濃度を示すグラフであり、 (A) は低用量投与群、 (B) は高用量投与群についての結果を示す。

図 2は本発明の実施例 1による含硫プロアントシァェジンオリゴマー組成物（物質 1) 及びその原料（比較物質 1) を投与したマウスの肝臓（A)、腎臓（B) 及び脳 (C) 中の LP O濃度を示すグラフである。

図 3 (A) は LP O濃度初期値正常者、（B) は LP O濃度初期値異常者について、各々実施例 1の本発明組成物（物質 1) 及び実施例 1の原料（比較物質 1) を投与したヒトの血清中の LP O濃度を示す。

図 4 (A) は SOD濃度初期値正常者、（B) は SOD濃度初期値異常者について、各々実施例 1の本発明組成物（物質 1) 及び実施例 1の原料（比較物質 1) を投与したヒトの血清中の SOD活性濃度を示す。

図 5は実施例 1における本発明物質 1及び比較物質 1のベータアミロイドによる PC— 12細胞死に対する抑制効果を示すグラフである。

図 6 (A) 及び（B) は、実施例 1における本発明物質 1及び比較物質 1 のベータアミロイドによるミトコンドリア膜電位の低下に対する抑制効果を示す写真及ぴグラフである。

図 7 (A) 及ぴ（B) は、本発明物質 1及び比較物質 1のベータアミロイドによる PC— 12細胞内への活性酸素種蓄積に対する減少効果を示す写真及びグラフである。

図 8は本明物質 1及び比較物質 1の細胞内抗酸化活性効果を示すグラフである。図 9は本発明物質 1及び比較物質 1のベータァミロイドによる細胞膜過酸化抑制効果を示すグラフである。

図 1 0は本発明物質 1及び比較物質 1の S T Z誘発糖尿病マウスに対する空腹時血糖値の低減効果を示すグラフである。

図 1 1は本発明物質 1及び比較物質 1の S T Z誘発糖尿病マウスに対する尿糖値の低減効果を示すグラフである。

図 1 2は本発明物質 1及び比較物質 1の S T Z誘発糖尿病マウスに対する尿タンパク値の低減効果を示すグラフである。

図 1 3は本発明物質 1及び比較物質 1の S T Z誘発糖尿病マゥスに対する血中 P L O値の低減効果を示すグラフである。

図 1 4は本発明物質 1及び比較物質 1の S T Z誘発糖尿病マウスに対する血中 T E A C値（抗酸化能）の上昇効果を示すグラフである。

図 1 5は本発明物質 1の臭素酸力リゥム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中ポリフヱノール濃度の上昇効果を示すグラフである。

図 1 6は本発明物質 1の臭素酸力リゥム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中抗酸化能（T E A C ) の上昇効果を示すグラフである。

図 1 7は本発明物質 1の臭素酸力リゥム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中過酸化脂質濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。

図 1 8は本発明物質 1の臭素酸力リゥム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中尿素窒素濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。

図 1 9は本発明物質 1の臭素酸力リゥム誘発ラット急性腎障害モデルに対する血中クレアチニン濃度の上昇抑制効果を示すグラフである。発明の詳細な説明

本発明の含硫オリゴマーは通常、プロアントシァニジンの²量体から⁵量体程度であり、分子量は通常 1500以下である。プロアントシァ-ジン類を含む植物またはその抽出物と S H基含有化合物との反応は酸性条件下で行うのが好ましい。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸類、あるいは酢酸、クェン酸、ァスコルビン酸、リンゴ酸等の有機酸類から選ばれる適宜の酸が 0. 1N〜1. ON程度、好ましくは 0. 5Nの濃度で用いられる。

なお、本明細書において、プロアントシァニジンとはカテキン重合体を指し、具体的には、カテキン、ェピカテキン、ェピガロカテキン、ェピガロカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレートまたはこれらを構成単位とするものが含まれる。

プロアントシァ-ジン類を含む植物には、カキ、ナシ、ブドウ、イチゴ、バナナ、アボカド、コケモモ、レンコン、ソバ等の果菜類、緑茶、紅茶、ゥ一ロン茶等の茶類一般、ハープ ·スパイス類、木材■マツ樹皮等広範■多種に！:る植物が含まれる。これらのプロアントシァニジン類を含む植物やその抽出物（搾汁、果汁、野菜汁を含む）が好適に用いられる。

本発明で用いられる S H基含有化合物としては、システィン、シスチン、ダルタチオン、 S H含有ペプチドまたはこれらの塩類等が挙げられるが、その他にィォゥを含むネギ、ニンニク等の天然物も挙げられる。メルカプタン類も使用可能ではあるが、本発明の含硫プロアントシァニジンオリゴマーが食品、医薬品組成物に利用される点を考慮すると、 S H基含有化合物としては食品、医薬品に使用が許されている物質が好ましい。

プロアントシァ-ジン類を含む植物またはその抽出物と S H基含有化合物との反応は、室温〜 8 0 °C、好ましくは 4 0〜 6 0 °Cで数時間乃至 1週間、好ましくは 2 4〜4 β時間行われる。

反応溶媒には、水、メタノール、エタノール等の 1種類または²種以上の混合物が用いられるが、食品、医薬品等の用途を考慮すれば、水、エタノーが好ましい。反応後は残渣をろ別して、ろ液を濃縮した後、常法により精製する。

すなわち、濃縮液の精製は抽出エキスを膜処理（限外ろ過、逆浸透等）、吸着剤で処理することにより行なうことができる。吸着剤としては、スチレンージビュルベンゼン系吸着剤、メタクリル酸系吸着剤、親水性ビュルポリマー、修飾デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、逆相系シリ力ゲル、イオン交換樹脂等が用いられる。これらの吸着剤を用いる場合には、これに吸着する画分（以下、吸着画分という。）に S H基含有化合物と反応し低分子量化したポリフエノール化合物（含硫プロアントシァニジンオリゴマー）が含まれている。この吸着画分を含水アルコール、アルコール、アセトン等で溶出させることにより種々の分子量の成分を得ることができる。

このようにして得られる含硫プロアントシァ-ジンオリゴマ一は、順相 H P L C及び NMR測定値から、下記一般式（9 ) に示されるプロアントシァ二ジンの 2量体から 5量体であることが確認されている。

nは 0または 1〜 3の整数であり、 R ¹は水素原子または下記式

で示されるガロイル基を表し、 R ²および R ³はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を表し、 R ⁴はシスティン、シスチン、ダルタチオンまたは S H 基含有べプチド残基を表す。

含硫プロアントシァニジンオリゴマーは分子量 1500 以下の低分子のため腸管を通じて生体に容易に吸収され、後述の試験例で示されるように、強い D P P Hラジカル消去作用、 S O D様活性増加作用、 P 4 5 0系脂質過酸ィヒ抑制作用、 F N T酸ィヒストレスに対する保護作用、ベータアミロイドに誘導される酸化的細胞死に対する神経細胞保護作用、 Streptozotocin STZ)誘発糖尿病に対する予防作用等を示し、他のポリフエノール素材と比較して高い抗酸化能を有する。またヒトに対する抗酸化指標のモニター試験で、抗酸化効果に基くと判断されるデータも得られている。

従って、本発明の含硫プロアントシァニジンオリゴマーを有効成分とする組成物は、生体の過酸化脂質生成抑制作用を有するだけでなく、活性酸素により起こる酸ィヒ障害に起因する疾病に効果を有するので、過酸化脂質あるいは活性酸素生成に起因する各種臓器の障害、老化の防止効果を有し、それにより生ずる各種疾病の治療及び防止に有効である。また脳の老化が原因と考えられる痴呆等の脳機能障害の抑制■防止 ·治療にも有効と考えられる。同時に脳機能の改善により、学習機能の向上、イライラ感の減少、不眠症解消、落着き回復等の効果も期待出来る。このため、本発明の含硫プロアントシァ二ジンオリゴマーを有効成分とする組成物は、医薬組成物ならびに健康食品組成物として利用することが出来る。本発明の含硫プロアントシァニジンオリゴマーを有効成分とする糸且成物には毒性は全く認められず、十分安全に使用できる。これら組成物は経口または非経口で用いられるが、経口的に使用される場合の投与量は、年齢、体重、症状、目的とする治療効果、投与方法等により異なるが、通常、成人一人当り、一回につき、 1 0 0から 2000m gの範囲である。本発明組成物を経口投与する際には、経口投与として一般に錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等、非経口投与として注射剤、塗布剤等として用いられる。造粒、錠剤化あるいはシロップ剤とする際には、必要により適宜の捕助資材 (澱粉類、デキストリン、甘味剤類、色素、香料等）を使用することもできる。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の含硫プロアントシァニジンオリゴマー組成物の実施例、試験例を挙げて、発明を具体的に説明するが、本明はこれらの範囲内に限定されるものではない。実施例 1 ：ブドウ種子由来含硫プロアントシァニジンオリゴマーの製造

( 1 ) ブドウ種子ポリフエノールの抽出

乾燥ブドウ種子 8 k gを 8 0 %メタノール（ 3 0 L ) で 3日間室温で抽出し、残渣をろ過してろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。

[精製条件]

全量を DIAION HP- 20 (三菱化学） 2 0 0 mm φ X 3 0 c m (約 2 5 L ) にチャージし、水 1 0 0 Lで洗浄した。メタノール 5 0 Lで溶出させたものを減圧濃縮し、凍結乾燥して 4 5 6 gの粉末状組成物を回収した。

( 2 ) システィンとの低分子化反応上記（ 1 ) の方法で得たブドウ種子ポリフエノール 400 g、 L一システイン（和光純薬工業（株）製） 400 g、ァスコルビン酸（純正化学（株）製） 4 g、クェン酸（和光純薬工業（株）製） 0.8k g、水 4 Lを混合し、

40°Cで 48時間反応させた。反応夜を直径 20 Omm 高さ 80 Ommの DIAION HP-20 (三菱化学（株）製）を担体として充填したカラム（容量約 2

5 L) にチャージし、非吸着画分を水 100 Lで洗浄した後、 40%ェタノール 50 Lで溶出する画分を回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、水、メタノール、エタノールに易溶の赤褐色粉末（収量 408 g) を得た。この粉末を Sephadex LH- 20 (フアルマシア（株）製）を担体として充填したカラム (直径 50mm、高さ 500mm、容積約 1 L) により、エタノール一水混合液で分画し、分画物のオリゴマー組成を野中らの方法（Chem. Pharm. Bull. , 34(2), 633-642 (1986)) により分析した結果、組成は次のとおりであった。

システィン結合ェピカテキン単畺体画分 19 %

システィン結合ェピカテキン 2量体画分 21%

システィン結合ェピカテキン 3量体画分 1 1 %

システィン結合ェピカテキン 4〜 6量体画分 16 %

(3) システィン結合ェピカテキン単量体

得られたシスティン結合ェピカテキン単量体画分をェンヒドリンー酢酸試液の噴霧加熱によつて桃褐色に呈色するスポットを対象として Sephadex LH- 20ゲルを用いたカラムクロマトグラフィー (水一メタノール一アセトン）によって精製して、下記（1) 〜（3) 式で示される化合物（以下化合物 1〜 3と略記することがある）を単離した。

式（ 1 ) の化合物（化合物 1 ) は HR- FAB- MS (High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy：高分解能高速原子衝擊法質量スぺクトル) の測定で分子ィオンピーク [M+H] + {m z) 410.0925 を示し、分子式 C_lsH₂₀O₈NSに相当する計算値 410.0910 と 3.6ppm (l O p pm 以内）の誤差で一致した。したがって、化合物1は分子式。₁₈«：₁₉0₈ 3 を有すると推定され、カテキンまたはェピカテキンに L一システィンのィォゥ原子が結合した化学構造が考えられる。また、化合物 1の¹ H— NMR (水素核磁気共鳴スぺクトル、表 1参照）測定において、カテキンまたはェピカテキンに共通する芳香環上の 5個のプロトンシグナルの他に、酸素原子またはィォゥ原子を付け根に有するシグナル群が δ 5.09 (br. s)、 δ 4.07 (m) および S 3.86(d，J¾Hz)に各々プロトン 1個分として認められた。前者はェピカテキンの立体配置を有することを示唆している。 δ 3.86 (d， =2Hz)のプ口トンシグナルは 4 α配置に帰属され、ィォゥ原子が 4 βに配置するチオリシス生成物のシグナルに相当する。その他、 δ 4.13(lH，dd， =9，4Ηζ)ならびに δ 2.95(1H， dd， =15, 9Hz)および δ 3.43 (1H， dd， J=15, 4Hz)に AB X型のシグナル群が認められ、システィンのメチン基にメチレン基が隣接する部分構造を示唆している。これらの情報に基づき、化合物 1の化学構造を式 ( 1 ) に示す 4|3- L- cysteinyl)- (-) - epicatechin と推定した。化合物 1 の¹³ C— NMR (炭素一 1 3核磁気共鳴スペクトル、表 2参照）（DE P T 法）において認められた各炭素級数を含めて 1 8個の炭素シグナルもこの構造を支持した。

式（2) の化合物（化合物 2) の¹ H— NMR (表 1参照）において酸素原子またはィォゥ原子を付け根に有するシグナル群が S 4.86 (1H, d, J=9, 6Hz)、 δ 4.22 (1Η， dd, J=9.6, 4.3Ηζ)および δ 4.23 (1Η， d,

に各々プロトン 1 個分として認められた。前 2者は各々カテキンの 2 、 3 /3配置、 δ 4.23(1 _</=4.3¾)は4ひ配置に帰属され、ィォゥ原子が 4 /3に配置するチオリシス生成物のシグナルに相当する。したがって、化合物 1と化合物 2は 3位の立体配置のみが異なると考えられ、化合物 2の化学構造を式（2) に示す 4/3-(5-L-cysteinyl)-(+)-catechinと推定した。

式（3) の化合物（化合物 3) は HR— FAB— MSの測定で分子イオンピーク [M+H] ⁺ m z) 426.0844 を示し、化合物 1よりも酸素原子が 1個多ぃ分子式C₁₈H₂。O₉NSに相当する計算値 426.0859と 3.5p pmの誤差で一致した。また¹ H— NMR (表 1参照）の測定で、芳香環領域の δ 6.57 (2Η, s)に 2'および 6'位の水素が等価シグナルとして認められた他は、化合物 1と対応、類似していた。表 2に示す¹³ C— NMRのシグナル帰属と考え併せ、化合物 3の構造を式（3) に示す 4|3- ( - L- cysteinyl)- (-) - epigallocatechinと推疋.し 7こ。

化合物 1、 2および 3の¹ H— NMRシグナル帰属（δ in ppm)

注）ィヒ合物 1は acetone— c ₆— D₂0、

化合物 2および 3は C D ₃ O D中で各々測定した。

化合物 1および 3の¹³ C— NMRシグナル帰属

、 δ in ppm)

注 1) ィ匕合物 1は acetone— ^ ₆ - D₂0

化合物 3は C D ₃ O D中で各々測定した。

注 2) 同カラム内の a) b)を右肩に付した値は交換し得る。

(4) システィン結合ェピカテキン 2量体

システィン結合ェピカテキン 2量体画分粉末を同様に精製して下記式 (4) で示される化合物（以下、化合物 4と略記することがある。）を単離し

化合物 4は F A B— M Sの測定で、分子イオンピーク [M+ H] + m z) 698 を示し、化合物 1よりもカテキンユニットが 1個多い構造が考えられた。 T L Cおよび H P L Cにおいて各々単一挙動を示したにも拘わらず、化合物 4の¹ H— NMRはブロードなシグナル群にシャープなシグナルが混在したスぺクト /レを示した。この特徴的な¹ H— NMRシグナル分布から、縮合の結合位置は、 4→6または 4→8のうち、強く回転障害を生じる後者が考えられた。 4→8結合に直結する各べンゾピラン由来シグナル群はブ口ードに変形して認、められた。すなわち、 δ 4. 22、 S 4. 54、 δ 4. 96 (each 1H, br. m, C- 3， - 4， - 2, respectively)は上端ユニットに、よりシャープな δ 3. 83、 δ 3. 90 (each 1H， s, C—4'，— 3' , respectively) , 5. 20 (1H, br. m， C—2' )はィォゥ原子と結合しているユニット（下端）に各々帰属された。分子模型による考察からも、下端ュニットは上端に比較して回転障害を免れていることが伺えた。 S 5. 92 の芳香環領域には C一 6、一 8、一 6 'に帰属されるプロトン 3個分のシグナルが envelopeとして認められた。 δ 6. 60から δ 7. 09にかけて両ュ-ット Β環上のプロトン群が認められ、その中の結合定数 8. 3Hz のシャープな doubletシグナルは回転障害を免れている下端ュニットの 5位に帰属されると考えられた。残されたシグナル 5 2. 95、 5 3. 44 (each 1H, br. m, cys-C- 3)、 0 4. 14 (1H, dd, J=9, 4Hz, cys- C-2)は各々システィン残基由来と推定された。化合物 4の¹³ C— NMR (表 3参照）は化合物 1に相当するシグナル群が認められ、式（4) に示される化合物 4の構造を支持している。したがって、化合物 4 の構造を 4 ;3 (i'-L-cysteinyl)- (-) - epicatechin- (4 β→8) - (.-) -epicatechinと ¾定した。化合物 4の¹³ C— NMRシグナル帰属 ( δ in ppm)

注 1 ) 各試料は acetone— ₆— D ₂ O中で測定した。

注 2) 右肩に a)、 b) および c) を付した化学シフト値

は各々交換し得る。

(5) システィン結合ェピカテキン 3量体

システィン結合ェピカテキン単量体画分粉末を同様に精製して下記式 (5) で示される化合物（以下、化合物 5と略記することがある。）を単離した。

化合物 5は H R— E S I -MSの測定で、分子イオンピークを [M一 H] + {m/ z) 984.1956 に示し、分子式 C ₄₈ H₄₂ O ₂₀ N Sに相当する計算値 984.2011 と 5.5p pmの誤差で一致した。したがって、化合物 5は分子式 C ₄₈ H₄₃O₂₀N Sを有すると推定され、カテキンまたはェピカテキンから構成される 3分子縮合体に L一システィンが結合した化学構造が考えられた。また、化合物 5の¹ H— NMRシグナルは全体としてブロードであり、 3ュニットはいずれも 4→ 8結合に直鎖状に縮合、 L一システィンが下端ュ-ットに結合していることが示唆された。芳香環上のシグナルとして δ 5.98に認められたシングレットから Α環一 6 - Η、 - 8— Η、 Α '環 6— Η、 Α "環一 6 - Hと帰属される。より低磁場に認められるシグナル群（S 6.04, s; δ 6.91, 7.01, s; δ 7.11, s) は、高さ比が約 3 : 2 : 1 ： 3であり、 B環 -、 B'環-、 B"環上の 2—H由来シグナルに帰属され、 δ 6, 91 および δ 7.01 (2 ： 1) のシグナルは中間に位置する B'— 2— Ηが最も回転障害を受けているために分裂して現れたと考えられた。これらの情報に基づいて、化合物 5の平面構造を暫定的に式（5) と推定した。実施例 2 ：ブドウ種子由来含硫プロアントシァニジンオリゴマーの製造実施例 1と同じ原料、条件でブドウ種子ポリフエノールを抽出し、実施例 1と同じ条件で精製した。この精製物を以下の条件でグルタチオンと反応させ、低分子化した。

すなわち、得たプドウ種子ポリフエノール 1.0g、グルタチオン（和光純薬工業（株）製） 3.0g、ァスコルビン酸（純正化学（株）製） 0.5g、 I N 塩酸 50.0m Lを混合し、 4 0 °Cで 4 8時間反応させた。この反応液を DIAION HP- 20 (三菱化学（株）製）、 MCIgel CHP-20 (三菱化学（株）製）、 Sephadex LH - 20 (フアルマシア（株）製）等により精製し、減圧濃縮し、凍結乾燥して赤褐色粉末を得た（収量 1 2 Omg)。

1) グルタチオン結合モノマー

得られた赤褐色粉末をポリスチレンゲル、 Sephadex LH- 20ゲル、および O D S系シリカゲルを担体に、水とメタノールの混合液を移動相とした力ラムクロマトグラフィーを繰り返して精製し式（6) で示される化合物（化合物 6) を得た。

化合物 6 は H R — E S I — M S ( High Resolution Electro-Spray Ionization Mass Spectroscopy：高分角早能エレクトロスプレー ·ィオン化質量スぺクトル）の測定で、分子イオンピーク [M+ H] + {m/ z) 596.1550を示し、分子式C₂₅H₃₀O₁₂N₃ Sに相当する計算値 5⁹6.15⁵l と 0.17p pmの誤差で一致した。したがって、化合物 6はカテキンまたはェピカテキンにダルタチオンの L一システィン由来ィォゥ原子が結合した化学構造が考えられた。化合物 6の¹ H— NMRにおいて、カテキンまたはェピカテキンに共通する芳香環上の 5個のプロトンシグナル群（δ 5.84， 5.96, 6.91 (each 1H， 8~, 6 -， 2'— H， respect i very)； δ 6.73-6.78 (2Η, ra， 5' -， 6'-H)) の他に、酸素原子またはィォゥ原子を付け根に有するシグナル群が S 3.90， 3.91， 5.15 (each 1H, 3-, 4一， 5 - H, respectively)に認められ、化合物 1と同様にェピカテキンの 4位にィォゥ原子が 4 βに配置する構造が類推された。その他、システィン部分（S 3.63 (1H, br.t, /=9, 4Hz, cys - 2 - H), 3.72， 3.80 (each 1H， d, 17.6 Hz, cys - 3 - H₂) )、グ /レタミン酸部分 ( 81.72 (2Η, m， glu— 4 - ¾)， 1.78 (2H, m， glu-3- H₂), 3.05 (1H, br. ά, J=5.4 Hz, glu-2-Η) ) およびグリシン部分（S 3.20(2H， s, gly-2-H₂) ) に相当するシグナル群が認められた。この構造は化合物 6の^{1 3} C— NMR (表 4参照）の測定における 2 5個の炭素シグナルが観測からも支持された。

したがって、化合物 6の構造を、グルタチオン分子のシスティン部分に由来するィォゥ原子がェピカテキンの 4 /3に結合した式（6) で示される 4|3- (glutathionyl) - (-) -epicatechinと推疋'し 7こ。

表 4 化合物 6の¹³ C— NMRシグナル帰属（ δ in ppm)

注 1) 試料は CD ₃ ODに溶解して測定した。

注 2) 右肩に *を付した化学シフト値は各々交換し得る。

実施例 3 ：松樹由来含硫プロアントシァニジンオリゴマーの製造

( 1) パインバークポリフエノールの抽出

トドマツ樹皮 400 gを 80%メタノーノレ 1.5Lにより室温で 3日間抽出し、残渣をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。

[精製条件]

濃縮液の全量を DIAION HP- 20 (三菱化学（株）製） 50 mm φ X 30 c m (約 600mL) にチャージし、 2500m Lの水で洗浄した。メタノール 1200 mL溶出させたものを減圧濃縮し、凍結乾燥して 18.4 gの粉末状組成物を回収した。

(2) システィンとの低分子化反応上記 (1) の方法で得たパインバーグポリフエノール 1.0 g、 L一システイン（和光純薬（株）製） 1.7g、ァスコルビン酸（純正化学（株）製） 0.25 g、 1 N塩酸 20.0m Lを混合し、 40 °Cで 48時間反応させ、反応液を直径 25 mm, 高さ 15 Ommの DIAION HP-20 (三菱化学（株）製）を担体として充填したカラム（容積約 l O OmL) にチャージし、非吸着画分を水 40 OmLで洗浄した後、メタノール 400 m Lで溶出する画分を回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して、赤褐色粉末（収量 0.95 g) を得た。

プロアントシァニジンは試験管内（in vitro) では強い抗酸化活性を示す、経口的摂取では必ずしも生体内（in vivo) で+分な効果を発揮しない。その理由は、高分子のプロアントシァニジンは腸管で吸収され難いためと考えられる。これに対し、本発明の SH基含有物質により低分子化した含硫プ口アントシァニジンオリゴマーは、インビトロ（in vitro) では高分子のプ口アントシァニジンと同等の抗酸化活性を示し、インビポ（in vivo) でも高分子のプロアントシァニジンより優れた抗酸化活性を示す。実施例 4 ：ャマモモ由来含硫プロアントシァニジンオリゴマーの製造

(1) ャマモモポリフエノールの抽出

ャマモモ樹皮（揚梅皮） 400 gを 80%メタノールの 1.5Lにより室温で 3日間抽出し、残渣をろ過した後、ろ液を減圧濃縮して得た濃縮液を下記条件により精製に供した。

[精製条件]

濃縮液の全量を DIAION HP-20 (三菱化学（株）製） 50 mm X 30 cm (約 600mL) にチャージし、 250 OmLの水で非吸着画分を洗浄した後、メタノール 1 20 OmLで溶出させたものを回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して 38.0 gの粉末状組成物を回収した。

(2) システィンとの低分子化反応上記 (1) の方法で得たャマモモポリフエノール 1.0g、 L一システィン (和光純薬（株）製） 1.7g、ァスコルビン酸（純正化学（株）製） 0.25g、 I N塩酸 20.0mLを混合し、 4 0°Cで 4 8時間反応させ、反応液を DIAI0N HP - 20 (三菱化学（株）製） 2 δτητΐΐφ X 1 5 Omm (約 1 0 OmL) にチヤージし、 4 0 OmLの水で非吸着画分を洗浄した後、メタノール 4 0 Om Lで溶出させたものを回収し、減圧濃縮し、凍結乾燥して赤褐色粉末 0.95 g を得た。

(3) 楊梅皮ポリフエノールと L—システィンの結合体について

1 ) L一システィン結合ェピガロカテキンガレ一ト ·モノマー

前記（2) で得られた赤褐色粉末をポリスチレンゲル、 Sephadex LH- 20ゲノレ、および OD S系シリカゲルを担体に、水、メタノール、アセトンの任意の混合液を移動相としたカラムクロマトグラフィーを繰り返して精製し、ェピカテキンガレート（epigallocatechin gallate)、ェピガロカテキンガレート（epigallocatechin gallate) ( 4 j3→ 8 )ェピガロカテキンガレート (epigallocatechin gallate) および前記化合物 3の他、以下の式（7) および（8) に示す化合物（化合物 7およびィヒ合物 8) を単離した。

化合物 7は、 E S I— MSの測定で、分子イオンピーク [M— H] + ( / z) 5 7 5を示した。また、ェ11一 NMR (表 5参照）の測定結果は化合物 1および化合物 3と類似していたが、約 1.3p p m低磁場シフトした 3— j3 H (1H, 5.29, s)、ならびに芳香環領域の A環上 6、 8位の他、 6.68 と 6.96 に各プロトン 2個分の鋭い 2組の鋭い等価なシングレツト ·シグナル (1 , 3, 4， 5置換ベンゼン上の 2と 6位水素由来）が認められた。これらのシグナルはェピガロカテキンのガレートであることを示唆している。これらの情報と表 6に示す¹³ C—NMRシグナル群の帰属とを併せて、化合物 7の構造を式（7) で示される 4/3-(5- L- cysteinyl)- (-) -epicatechin gallateと推定した。

2) L一システィン結合ェピガロカテキンガレート ·ダイマー

化合物 8は HR— E S I —MSの測定で分子イオンピーク [M - H] + {MXZ) 1032.1517 を示し、分子式 C ₂₅ H₃₀ O ₂ N ₃ Sに相当する計算値 1032.1503 と L 4 p p mの誤差で一致した。したがって、化合物 7よりもェピカテキンガレート ·ユニットが 1個多い構造が考えられた。化合物 8の¹ H— NMRは化合物 4と同様ブロードなシグナル群にシャープなシグナルが混在したスペクトルを示し、 4→8縮合型であると考えられた。および¹ ³ C— NMRのシグナル群は化合物 4と同様に帰属され（各々表 5および 6)、化合物 8 の構造を式（ 8 ) に示される 4 IS (i'-L-cysteinyl)- (-) - epicatechin gal late- (4 β→8)- ^_)^_epicatechin gallateと推定した。化合物 7および 8の ¹ H— NMRシグナル帰属（ δ in ppm)

注）化合物 7は 25°C、

化合物 8は 40°Cで acetone— dら - D₂0中で各々測定した。

化合物 7および 8の¹³ C— NMRシグナル帰属 ( in ppm)

注 1) ィ匕合物 1は acetone— d₆ - D₂0、

化合物 3は C D ₃ O D中で各々測定した。

注 2) a) および b) を右肩に付した化学シフト値は各々交換し得る。

試験例 1 ： D P P Hラジカル消去作用

実施例 1の分画前の粉末（物質 1)、物質 1を分画して得た単量体画分 (物質 2 )、物質 1を分画して得た 2量体及び 3量体画分（物質 3 )、物質 1 を分画して得た 4〜 6量体画分（物質 4)、実施例 1の原料（ブドウ種子ポリフエノール抽出物）（比較物質 1) 及び市販カテキン（和光純薬（株）製） (比較物質 2) について、 1， 1 - diphenyl— 2 -picrylhydrazyl (D P P H) ラジカルの消去作用を次の方法で測定した。

9 6穴のマイクロプレートに 1 0 0 μ Lの D Ρ ΡΗ溶液 (6 0 μΜェタノール溶液）を入れ、試験試料のエタノール溶液 1 00 ^ L、またはコント口ールとしてのエタノール 1 0 μ Lをそれぞれ加え、静かに混合して室温で 3 0分間放置した後、 5 2 0 nmの吸光度を測定し、 D P PHラジカル消去能を下記の式で算出した。段階的に希釈した試験試料の D P P Hラジカル消去能と濃度から 5 0%有効濃度（E C₅₀) を算出した。

DPPHラジカル消去能（％) = [ (1一試験試料の吸光度） Zコントロールの吸光度]

X 1 00 各試料の段階的な濃度の D P P Hラジカル消去能から 5 0 %有効濃度（E C₅。）を算出した。結果を表 7に示す。

DP PHラジカル消去能は、低濃度では物質 4が比較的高かった。それ以外の試料は同様な活性を示し、高濃度では各試料とも高い活性を示した。表 7

D P P Hラジカル消去における E C 50

(β g/mL)

物質 1 1.62

物質 2 2.78

物質 3 1.45

物質 4 0.77

比較物質 1 1.55

比較物質 2 1.71

試験例 2 ·.活性酸素除去酵素（S OD) 様活性試験例 1と同じ物質 1〜 4、比較物質 1〜 2について、血中 S OD活性測定キット（S ODテストヮコ一：和光純薬（株）製）を用いて S OD様活性を測定した。下式で SOD様活性を算出し、試験試料の濃度との関係から 5 0%有効濃度 (EC₅₀) を算出した。

SOD様活性（％)

= [ (1一試験試料の吸光度） /コントロールの吸光度] X I 00 各試料の段階的な濃度における S OD様活性から EC ₅。を算出して、結果を表 8に示した。物質 2〜4の各分画物は、比較物質 1〜 2に比べ高い S O D様活性を示した。

表 8

S O D様活性における E C 50

(β g /m L)

物質 1 69.7

物質 2 84.8

物質 3 74.6

物質 4 75.5

比較物質 1 70.9

比較物質 2 62.0

試験例 3 ：亜急性 F e NT A誘導多臓器障害モデルに対する効果

生体に投与すると大量の活性酸素を発生し、多臓器障害を誘発するィンビボ（in vivo) 酸化モデルとして知られる F e NTA (硝酸鉄（F e (NO J J と二トリ口三酢酸ナトリウム（NTA₃N a ) の混合物）を用いて試験した。

すなわち、硝酸鉄九水和物（関東化学（株）製） 2 40mgを 4 0mLの冷水に溶解したものと、二トリ口三酢酸ナトリゥム一水和物 3 9 Omgを 4 OmLの冷水に溶解したものを氷冷下で混合し、 1N塩酸により pHを ⁷.5 に調整して 100 m Lに定溶したものを F e N T A溶液とする。調製後 10 分以内に F eとして体重 k g当り 22.5mgの F eNT A溶液を、雄性 d d Y 系マウス 7週齢（平均体重 30 g) に 1日おきに腹腔内投与した。物質 1及び比較物質 1をそれぞれ体重 K g当り 25 m g (低用量投与群）、または 5 Omg (高用量投与群）を毎日強制経口投与した。対照群には水道水を摂取させ、 F eNT A投与しない陰性対照群と、 F eNT A投与する陽性対照群を設けた。飲料水、食餌は自由摂取とした。投与開始から 7、 14、 21、 28日目に採血し、血清中の過酸化脂質（LPO) 濃度を測定した。投与開始から 28日目に角?剖し、肝臓、腎臓、脳を摘出して各臓器のホモジナイズの LPO濃度を測定した。

[試験結果]

(1) 血清中の LPO濃度を図 1 (A) 及ぴ（B) に示す。低用量投与群では物質 1は 21日目で血清中 L P O濃度は、比較物質 1及び陽性対照群に対して有意に低下した（図 1 (A))。高用量投与群でも物質 1は、投与開始から 21日目以降に有意に低下した（図 1 (B))。比較物質 1も 213目に低値を示したが、本発明の物質の方が高い効果を示した。

(2) 各臓器中の LP O濃度

肝臓、腎臓及び脳中の LP O濃度を図 2 (A) 〜（C) に示す。

肝臓では F e NT A投与による L P O濃度の有意な上昇は認められず、各投与群でも変化は認められなかった。腎臓と脳では、 F eNTA投与によりホモジナイズ中の L P O濃度は上昇した。物質 1及び比較物質 1の投与で、 LPO濃度は低下した。腎臓、脳ともに物質 1高用量投与群で、最も低い値を示した。特に脳では、比較物質 1投与でも低値を示したが、物質 1高用量投与群では他の群に比べ有意に低い値を示した。

[結果のまとめ] F e NT Aの投与は、血清中の LP O濃度を上昇させた。物質 1は比較物質 1に比べ、低用量、短期間に効果を発揮した。このことから、低分子化されたことにより、物質 1は経口的摂取で腸管から吸収され易く、そのため低用量、短期間で効果を発揮したと考えられる。特に、物質 1は腎臓及び脳で強レ、抗酸化活性を示すことが明らかとなった。試験例 4 ：ヒトに対するモニター試験

[試験方法]

健康な男女 34名（平均年齢 41.2歳、男性 21名、女性 1 3名）を表 9 に示すように 2群に分け、物質 1及び比較物質 1を 1曰当り 500mgをそれぞれ 28日間投与した。投与開始前、投与 28日後に採血し、血清中の L PO濃度、 SOD様活性を測定した。

9 投与群平均年齢男女比 LPO初期値 ·高 SOD初期値 ·低物質 1 41.9 才男 10女 7 7人 7人比較物質 1 40.5 才男 1 1女 6 11人 8人

投与前後の L P O濃度及び SOD様活性を図 3及ぴ図 4に示す。図 3 (A) は初期値が正常者について LP O濃度、図 3 (B) は初期値異常者について LP O濃度を示し、図 4 (A) は初期値正常者について SOD様活性、図 4 (B) は初期値異常者について SOD様活性についての結果を示す。比較物質 1及び物質 1の 28日間の投与で L P O濃度は低下し、 S O D様活性は上昇の傾向が認められた。被験者中の初期値異常者で LP O濃度の初期値が比較的高かった者（LPO濃度 8.0以上）及ぴ SOD様活性が比較的低かった者（SOD様活性が 12.0以下）について見ると、物質 1を投与した群で統計的に有意な LP O濃度の低下が見られた（図 3 (B))。同様に、 S OD様活性も物質 1を投与した群で統計的に有意な上昇が認められた（図 4 (B))。このことから、物質 1は同量の比較物質 1よりも、生体の酸化状態の改善に有効であることが確認された。試験例 5 ：ベータアミロイドに誘導される酸化的細胞死に対する神経細胞保護効果

神経の再生異常による病気であるアルツハイマー病はベータアミロイドを蓄積した老人斑を形成することを特徴とする。ベータアミロイドは活性酸素種を生成し、神経細胞への細胞毒性によりァルツハイマー病の発症と進行において重要な役割を担っている物質である。神経細胞毒性の実験に広く用いられる P C— 1 2細胞に対するアポトーシス誘導による細胞傷害活性における低分子化ポリフエノール（以下、 G SMと略記することがある。）の神経細胞保護効果を調べた。

[試験方法]

P C- 1 2細胞は 1 0。/。熱不活化馬血清及び 5 %牛胎児血清を含む DME M培地で 1 0 %二酸化炭素雰囲気下にて培養した。 4 X 1 0⁴細胞 / 3 0 0 μ Lに細胞密度を調整して 24時間予備培養したのち、血淸不含の Ν— 2培地中に G SMあるいはプドウ種子ポリフヱノール（以下、 G S Pと略記することがある。）を 1、 1.5、 5、 1 0 / g/mLの濃度で加え、 4 8穴のプレートに培養した。

(1)細胞生存度試験：

処理後、細胞は終濃度 1 m g /m Lの MT T溶液で処理し、深青色のホルマザン産物を緩衝液に溶解して 5 40〜 5 9 5 nmの吸光度により測定した。結果は無処理の対照細胞の吸光度との比率（％) で示した。 GSMは濃度依存的にベータアミロイドによる PC— 1 2細胞死を抑制することが、 MTT試験により明らかとなった。その効果は特に 1及び 1. /mLの低濃度域において GSPよりも高かった（図 5)。

(2)ミトコンドリァ膜電位測定試験：

ミトコンドリァ膜電位の測定には脂溶性陽ィオン探索子である TMR Eを使用した。 GSMまたは GS P存在下あるいは非存在下で PC— 1 2細胞 (1 X 10⁴cell/mL) を 25 Mのベータアミロイド処理したのち、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し 37 °Cで 30分間 TMR E (150 i M) 処理した。ミトコンドリアの膜電位に依存してミトコンドリア内に蓄積した TMR Eを、励起波長 488 n m、発光波長 590 n mの蛍光で検出した。

[結果]

ミトコンドリアは細胞死の徴候に先んじて膜の完全性に変調を来す。この変化はミトコンドリアの内膜および外膜の両方で起こり、最終的にチトクローム Cのような可溶性膜間タンパクを放出する膜貫通電位の放散と膜透過性の変化を導く。 PC— 12細胞はベータアミロイドに曝露されるとミトコンドリア膜貫通電位を急速に低下させ、それは電位依存型色素である TMR E を用いた赤色の蛍光で現わされる（図 6 (A))。ベータアミロイドによる膜貫通電位の低下は G SMによる前処理で有意に抑制され、その効果は G S P よりも高かった（図 6 (A)及ぴ（B))。

(3)細胞内への活性酸素種の蓄積の測定：

活性酸素種の細胞内への蓄積量を観察するために蛍光探索子 D CF-DA (2，， 7， -ジクロロジヒドロフルォレセイン-ジアセテート) を用いた。 G SMまたは G S P存在下あるいは非存在下で P C— 1 2細胞（1 X 1 0 ⁶cell/3mL) を 25 μ Mのベータアミロイド処理したのち、クレプス - リンゲル液で洗浄し、の DCF— DAを加えた。 37。で 15分間培養したのちアルゴンレーザーによる共焦点レーザー顕微鏡を用いて励起波長 488 nm、発光波長 5 30 nmで観察した。

[結果]

ベータアミロイドによる P C— 1 2細胞の細胞死における酸化ストレスを解明するために、細胞内での活性酸素種の蓄積を、細胞膜を透過できる D C F— D Aにより測定した。細胞内では DC F—： D Aは細胞のエステラーゼ活性により D C Fに加水分解され過酸化物と反応して蛍光物質を生成する。ベータアミロイド処理された PC— 1 2細胞は DCF色素により染色されて表示される（図 7 (A))。ベータアミロイドによる細胞内への活性酸素種蓄積は GSMにより減少し、その効果は G S Pよりも高かった（図 7 (A)及び (B))。

(4)細胞内グタチオン濃度：

細胞内グルタチオン濃度は市販のキット（ BIOXYTECH GSH-400： 0XIS Research社製、米国）を使用して測定した。 G SMまたは G S Pの存在下 Z 非存在下で培養したベータアミロイド処理された PC— 1 2細胞を回収してメタリン酸溶液中でホモジナイズし、遠心分離した上清に色素原塩酸溶液を加え、撹拌後 30 %水酸化ナトリゥム溶液を加え 2 5でで 1 0分間培養した。さらに遠心分離し澄明な上清の 400 nmにおける吸光度を測定した。 B C Aタンパク質測定キットによりタンパク質含有量を測定しタンパク質の単位重量当たりのグルタチオン濃度を無処理の対照と比較した。

[結果]

ベータアミロイドによる細胞死には酸化ダメージが関与している。ベータアミロイド処理された細胞では細胞内ダルタチオン濃度が低下する。 G S P 処理された細胞では正常レベルまで細胞内ダルタチオン濃度が回復していた力 GSMでは正常レベルを上回る細胞内ダルタチオン濃度を示し、細胞内で高い抗酸ィ匕活性を示した（図 8)。

(5)過酸化脂質濃度：過酸化脂質濃度は市販のキット（BIOXYTECH LP0-586： OXIS Research社製、米国）を使用して測定した。 G SMまたは G S Pの存在下 Z非存在下で培養したベータアミロイド処理された PC— 1 2細胞を回収して 0.5mMのブチル化ヒドロキシトルエンを含む 20 mMトリス塩酸緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離した上清に 10.3mMの N—メチノレー 2—フエ二ルインドールのァセトニトリル溶液に希釈し混合する。 37 %塩酸を加えて 45 °Cで 60分培養した。冷却後、遠心分離し、澄明な上清の 590 nmの吸光度を測定した。 BCAタンパク質測定キットによりタンパク質含有量を測定しタンパク質の単位重量当たりの過酸化脂質濃度を無処理の対照と比較した。

[結果]

ベータアミロイド処理によって生じる細胞膜の過酸化は過酸化脂質から生じるマロンジアルデヒド（MDA) によって示される。 GSMまたは GSP の前処理によってベータアミロイドによる脂質の過酸化を抑制し、その効果は GSMで高く、無処理対照レベル以下に過酸化脂質を抑えていた（図 9)。

[結果のまとめ]

GSMは神経細胞のモデル細胞株である PC— 12細胞において、神経細胞内への活性酸素種の蓄積を減少させることで、ベータアミロイド毒性による神経細胞死を抑制した。その効果は GS Pよりも高かった。ベータアミ口ィド毒性による神経細胞死は細胞に対する酸化ダメージが関与しているが、 G SMは細胞に対する酸化ダメージを抑え、その効果は G S Pよりも高かつた。

GSMがアルツハイマー病の発症、進行に深く関与するベータアミロイドによる神経細胞死をその抗酸化作用により抑制したことは、 G S Mによりァノレツハイマー病の発症、進行を抑えることができることを示している。試験例 6 ： Streptozotocin(STZ)誘亮糖尿病に対する予防効果物質 1の S T Ζ誘発糖尿病マウスに対する予防効果を検討するため、 S Τ Ζを低用量頻回（multiple low dose : ML D) 投与することにより誘発される糖尿病の初期に相当する病態モデレを用いた。

[方法]

J l a : d d yマウス（雄性、 7週齢）の体重、血糖値及び血中 LP O値を測定し、各群が均等になるように以下の通り群分けした。

(1)陰性対照群： STZ (—）（n = 5、 1ケージ)、

(2)陽性対照群： STZ (+) (n = 1 5、 3ケージ)、

(3)物質 1群： STZ (+) +物質 1 (n=10、 2ケジ）、

(4)比較物質 1群： STZ (+) +比較物質 1 (n= 10、 2ケージ)。

20mgZk g用量の STZを 4日間連続腹腔内投与 (これを 2クール）後、 4 Omg/k g用量の STZを 4日間連続腹腔内投与した。物質 1または比較物質 1を各 0.06%粉末食餌に混ぜ自由摂取させた（ 1日あたりの食餌摂取量から、 1日の物質 1または比較物質 1の摂取量は約 10 OmgZk g となる）。また、投与期間は、 STZ投与開始日の 5日前から 65日目までとした。

投与期間中血液及び尿を採取し、血糖、尿糖、尿タンパク、血中尿素窒素 ( B U N) , 血中 L P OZT E A C (Trolox equivalent antioxidant capacity)を測定した。これらの測定結果を図 10〜 14に示す。

[結果のまとめ]

(1) 空腹時血糖値

糖尿病では、図 10に示すように空腹時において血糖値が高値を示すが、 S T Z投与後 35日、 49日及び 66日目において、陽性対照群は陰性対照群に比べ有意に血糖値が高く、 STZを低用量頻回投与することにより、軽度糖尿病モデルが作成されたことが確認された。物質 1群、比較物質 1群において血糖値は陽性対照群に比べ有意に低い値を示し、血糖値低減効果は物質 1の方が比較物質 1に比べ強い傾向を示した。

(2) 尿糖値

糖尿病においては、尿中への糖排泄量が増加する。 STZ処理により尿中への糖の排泄量が大幅に増加し、マウスが糖尿病を誘発していることが捕捉できる。図 1 1に示すように、物質 1群及び比較物質 1群には、 STZにより増加する尿糖値の改善効果が観察され、 49日目においては陽性対照群との間にそれぞれ有意差が確認された。また、物質 1の方が比較物質 1に比較して若干低い値を示した。

(3) 尿タンパク値

糖尿病では尿中へのタンパク質の排泄量が増加する。図 12に示すように、物質 1及び比較物質 1は、 S T Zによる尿中へのタンパク質の漏出を抑制することができ、 S T Z投与後 49日目においては両物質共に陽性対照群に比ベ有意にタンパク量を低減した。また、物質 1の方が比較物質 1に比べ、本病態モデレの早期から効果が発現することが予測される。

(4) 抗酸化指標

(4- 1) 血中 L PO値

図 13に示すように、物質 1群では陽性対照群及び比較物質 1群に対して低値傾向が認められた。

(4-2) 血中 TEAC値

T E A C Jrolox equivalent antioxidant capacity) 、法は、ある ^/ [匕合物が有する抗酸化活性をアルファ一トコフロール（a- Tocopherol) 誘導体であるトロロックス（Trolox) の抗酸化能に換算して抗酸化強度を相対評価する方法で、抗酸ィヒ指標として一般的に広く使用されている。図 14に示すように、血中の抗酸化活性は、 49日目及び 66日目共に比較物質 1と陽性対照は、ほぼ同程度の抗酸化能であったのに対し、物質 1投与群では高値を示し、抗酸化能が最も高かった。 [まとめ]

S T Zの低用量頻回投与モデルは、マウスに軽度糖尿病を誘発することができ、高用量単回投与モデルと比較して血糖値における個体間の差も少ないため、糖尿病の予防効果を検討するには利便性の高いモデルであると考えられる。物質 1は本糖尿病モデルにおいて、病態進行に伴う血糖値や尿糖値の上昇を抑制することができ、糖尿病予防効果を有することが示された。

S T Zによる糖尿病では、脖 fl 細胞内に特異的にラジカルを発生させ、このラジカルにより細胞が傷害を受け死に至ることにより、糖尿病が誘導される。物質 1及び比較物質 1を S T Z投与 5日前から与えることにより、体内の抗酸ィ匕活性をあらかじめ高めることができ、 S T Zによる細胞に対する傷害を軽減することができたと推察される。

血中 L P Oおよび T E A Cの結果から物質 1は血中の抗酸化能を有意に上昇させることが明らかとなった。一酸化窒素や活性酸素等のラジカルがィンスリン依存性糖尿病における滕ランゲルハンス島の破壊に関与することは周知の事実であり、これらフリーラジカルの細胞傷害を抑制すると糖尿病が改善されること力ヒト介入試験により判明されつつある。したがって、物質

1は糖尿病予備軍といわれる健常人に対する予防効果、更には初期糖尿病患者に対する病態進展抑制効果を有することが示された。試験例 7 ：臭素酸力リゥム誘発ラット急性腎障害モデルにおける比較試験物質 1が他の抗酸化ポリフエノール素材と比較してどの程度の抗酸化能を有しているかを明らかにするために、臭素酸力リゥム誘発ラット急性腎障害モデルにおける比較試験を行つた。

[方法]

Wistarラット（雄性、 1 2週齢）を以下のように群分けした。

陰性対照群：臭素酸力リウム（一）（n=5)、陽性対照群：臭素酸カリウム（+ ) (n=5)、

物質 1群（ブドウ種子由来）：臭素酸カリウム（+) +物質 i(_n-5)、物質 5群（松樹皮由来）：臭素酸カリウム（+) +物質 5(n=5)、

比較物質 2群（カテキン）：臭素酸カリウム（+) +比較物質 2(n=5)、比較物質 3群（イチヨウ葉抽出物）：臭素酸カリウム（+ ) +比較物質 3 (n=5)、

比較物質 4群（松樹皮抽出物）：臭素酸カリウム（+ ) +比較物質 4(_n=5)、比較物質 5群（ココア抽出物）：臭素酸カリウム（+) +比較物質 5(n=5)。臭素酸カリゥムは 65mg/k g体重を腹腔内に単回投与した。物質 1、物質 5及び各比較物質は臭素酸力リゥム投与開始日（0日目）の一週間前 (一 7日目）から翌日まで l OmgZk g体重の用量で毎日一回経口投与した。臭素酸力リゥム投与日は臭素酸力リゥム投与の前後 30分に投与を行つた。一 7日目、 0日目及び 2日目に頸静脈より採血を行い、血中のポリフエノール濃度、過酸化脂質濃度、 TEAC、尿素窒素及びクレアチニン濃度を測定した。物質 1及び各比較物質の臭素酸力リゥム誘発急性腎障害に対する効果は抗酸化作用によるものであることから、抗酸化の指標として血中ポリフエノール濃度、血中抗酸化能（TEAC)、血中過酸化脂質濃度を、腎障害の病態の指標として血中尿素窒素濃度、血中クレアチュン濃度を調べた。これらの測定結果を図 15〜 19に示す。

(1) 抗酸化指標

(1-1) 血中ポリフエノール濃度

図 15に示すように、臭素酸カリウム投与前の血中のポリフエノール濃度の初期値は各群とも一定であつたが、物質 1及び各比較物質を 7日間投与した後の臭素酸カリゥム投与 0日目では物質 1群で最も高値を示し、ついで比較物質 2群であった。物質 1の投与が血中のポリフエノーノレ濃度を上昇させ、その上昇率は各比較物質に比べて有意に高いことが確認された。

(1-2) 血中抗酸化能（TEAC)

図 16に示すように、物質 1及ぴ各比較物質の一週間の前投与により血中の抗酸化能は上昇傾向を示し、物質 1の投与による抗酸化能の上昇は各比較物質投与群に対して有意であった。

(1-3) 血中過酸化脂質濃度

物質 1及び各比較物質の一週間の前投与は臭素酸力リゥム投与による血中過酸化脂質濃度の上昇を抑制した。図 17に示すように、その効果は物質 1 群で最も高く、各比較物質に対して有意に低い値を示した。

(2) 病態指標

(2-1) 血中尿素窒素濃度

図 18に示すように、臭素酸カリゥムの投与により血中の尿素窒素濃度は無処理に比べ有意に上昇した。物質 1及び各比較物質の投与は臭素酸力リゥム投与による血中の尿素窒素濃度の上昇を抑制し、物質 1の投与による血中尿素窒素濃度の上昇抑制は各比較物質投与群に対して有意であった。

(2-2) 血中クレアチュン濃度

図 19に示すように、臭素酸力リゥムの投与により血中のクレアチニン濃度は無処理に比べ有意に上昇した。物質 1及び各比較物質の投与は臭素酸力リウム投与による血中のクレアチニン濃度の上昇を抑制し、物質 1の投与による血中クレアチニン濃度の上昇抑制は各比較物質投与群に対して有意であつた _D

[まとめ]

比較物質 3、比較物質 4及び比較物質 5はプロアントシァ-ジンのポリマ一（高分子）が豊富な素材であり、試験管內では高い抗酸化活性を示すが、生体内に摂取された際の抗酸化活性は低分子化された物質 1の方が高かった。比較物質 2は単量体（カテキン）であるが、やはり物質 1の方が活性は高く、血中のポリフエノール量からみても物質 1は低分子化されているため生体への吸収に優れ、生体内における抗酸化活性も高いことが示された。物質 1の前投与は血中の抗酸化能を高め、抗酸化活性を発揮する。その結果、臭素酸力リゥムの投与による血中の過酸化脂質濃度の上昇を抑制し、腎障害を抑制し、血中への尿素窒素、クレアチニンの漏出を抑制した。その効果は各比較物質に比べ有意に高く、これまでに知られている高分子ポリフエノール主体のポリフエノール素材及び単量体（カテキン）よりも生体に摂取された際の抗酸化性に優れることが明らカとなつた。

[本発明の物質の安全性]

単回投与毒性試験により、安全性を評価した。すなわち、物質 1を体重 k g当り 2.5、 5.0、 7.5、 10.0gの投与量で、それぞれ 8、 7、 3、 1 8匹の d dY系マウス（9週齢、雄性）に強制経口投与した。投与後の行動変化、死亡例を観察して L C 50を算出した。その結果、物質 1の 50 %致死濃度 (LC 50) は 5.0 gZk g体重であった（95%信頼限界 3.5〜6.4g/k g体重)。また、投与後の行動の異常や、試験終了時の解剖所見の異常は認められなかった。従って、物質 1は食品として極めて安全性の高い物質であることが確認された。

前述の試験例 4 (ヒトに対するモニター試験）で、アンケート方式で被験者のコメントを収集した。そのうち、睡眠に関するものを表 10に、疲労感、頭の冴え、胃の調子について 5段階評価による結果を表 1 1に示す。表 10 群年齢性別使用感のコメント物質 1 49 男寝起きが良くなつた。

物質 1 43 男睡眠の質が良くなった。

物質 1 57 男朝の目覚めが良くなつた。比較物質 1 27 女朝の起床時に疲労感。

比較物質 1 34 男眠くて朝の起床がつらい。比較物質 1 43 男朝の寝起きが悪くなつた。

表

1 1

5段階評価 {'こよるアンケートのスコア疲労感頭の冴え胃の調子比較物質 1 2.8 (3.2) 3.7 (3.3) 3.9 (3.5) 物質 1 3.2 (2.9) 3.7 (3.3) 3.8 (3.5)

(数値が大きいほど、良好な状態、カツコ内は投与前の数値)

Claims

請求の範囲

1 . プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物を S H基含有化合物と反応させた反応液を濃縮、乾燥して得られる含硫プロアントシァ-ジンオリゴマーを主要成分として含有する組成物。

2 . オリゴマーがプロアントシァニジンの 2〜 5量体である請求の範囲 1記載の含硫プロアントシァ-ジンオリゴマー,袓成物。

3 . プロアントシァニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハープ'スパイス類、木材 ·樹皮類の一種以上から選ばれる請求の範囲 1に記載の含硫プロアントシァニジンォ Vゴマ一組成物。

4 . S H基含有化合物が、システィン、シスチン、グルタチオン、 S H基含有ぺプチドおよびこれらの塩類の少なくとも 1種から選択される請求の範囲 1記載の含硫プロアントシァニジンォリゴマー組成物。

5 . 生活習慣病の治療及びノまたは予防用の医薬組成物である請求の範囲 1 乃至 4のいずれかに記載の組成物。

6 . 老化の予防用の医薬 a成物である請求の範囲 1乃至 4のいずれかに記載の組成物。

7 . 生活習慣病の改善及び/または予防用の健康食品組成物である請求の範囲 1乃至 4のいずれかに記載の組成物。

8 . 老化の予防用の健康食品 a成物である請求の範囲 1乃至 4のいずれかに記載の組成物。

9 . 請求の範囲 1に記載のプロアントシァ-ジン類を含む植物またはその抽出物を S H基含有化合物と反応させて得られる含硫プ口アントシァニジンォリゴマーを含む成分を分画して得られる含硫プロアントシァ-ジンオリゴマ一

1 0 . オリゴマーがプロアントシァェジンの 2 ~ 5量体である請求の範囲 9 記載の含硫プロアントシァ-ジンオリゴマー。

1 1 . プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物を S H基含有化合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮、乾燥することを特徴とする含硫プロアントシァニジンオリゴマー組成物の製造方法。

1 2 . プロアントシァニジン類を含む植物またはその抽出物を S H基含有ィ匕合物と酸性条件下で反応させ、反応液を濃縮し、分画処理することを特徴とする含硫プロアントシァ-ジンオリゴマーの製造方法。

1 3 . プロアントシァニジン類を含む植物が、果菜類、茶類、ハーブ' スパイス類、木材 ·樹皮類の一種以上から選ばれる請求の範囲 1 1または 1 2記載の製造方法。

1 4 . S H基含有化合物が、システィン、シスチン、ダルタチオン、 S H基含有ペプチドおよびこれらの塩類の少なくとも 1種から選択される請求の範囲 1 1または 1 2記載の製造方法。

15. 無機酸、有機酸またはこれらの両者を用いて酸性条件とする請求の範囲 1 1または 12記載の製造方法。

16. 塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クェン酸、ァスコルビン酸、リンゴ酸から選ばれる少なくとも 1種を使用する請求の範囲 15記載の製造方法。

17. 式（4)

で示されるプロアントシァニジン化合物。

18. 式 (5)

で示されるプロアントシァニジン化合物。

19. 式（6)

で示されるプロアントシァニジン化合物。

20. 式 (7) 2004/103988

で示されるプロアントシァニジン化合物。

21. 式（8)

で示されるプロアントシァェジン化合物。