Vorrichtung zur Halterung und Detektion von Substanzbibliotheken
Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Halterung und Detektion von Substanzbibliotheken.
Biomedizinische Tests basieren häufig auf dem Nachweis der Wechselwirkung zwischen einem Molekül, das in bekannter Menge und Position vorhanden ist (der molekularen Sonde) und einem nachzuweisenden, unbekanntem Molekül bzw. nachzuweisenden, unbekannten Molekülen (den molekularen Ziel- oder Targetmolekülen). Bei modernen Tests sind die Sonden in Form einer Substanzbibliothek auf Trägern, den so genannten Mikroarrays oder Chips abgelegt, so dass eine Probe parallel an mehreren Sonden gleichzeitig analysiert werden kann (Lockhart et al. (2000) Nature, 405, 827-836). Für die Herstellung der Mikroarrays werden die Sonden dabei üblicherweise in vorgegebener Art und Weise auf einer geeigneten, beispielsweise in WO 00/12575 beschriebenen Matrix immobilisiert (siehe z.B. US 5,412,087, WO 98/36827) bzw. synthetisch erzeugt (siehe z.B. US 5,143,854).
Der Nachweis einer Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Targetmolekül erfolgt dabei folgendermaßen:
Die Sonde bzw. die Sonden werden in vorgegebener Art und Weise an einer bestimmten Matrix in Form eines Mikroarrays fixiert. Die Targets werden dann in einer Lösung mit den Sonden in Kontakt gebracht und unter definierten Bedingungen inkubiert. Infolge der Inkubation findet zwischen der Sonde und dem Target eine spezifische Wechselwirkung statt. Die dabei auftretende Bindung ist deutlich stabiler als die Bindung von Targetmolekülen an Sonden, die für das Targetmolekül nicht spezifisch sind. Zum Entfernen von Targetmolekülen, die nicht spezifisch gebunden worden sind, wird das System mit entsprechenden Lösungen gewaschen oder erwärmt.
Der Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Target und seiner Sonde kann dann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen, die in der Regel von
der Art des Markers abhängt, der vor, während oder nach der Wechselwirkung der Targetmoleküle mit den Sonden in die Targetmoleküle eingebracht worden ist. Typischerweise handelt es sich bei solchen Markern um fluoreszierende Gruppen, so dass spezifische Target-Sonden- Wechselwirkungen mit hoher Orts- Auflösung und im Vergleich zu anderen herkömmlichen Nachweismethoden (v.a. massensensitive Methoden) mit geringem Aufwand fluoreszenz-optisch ausgelesen werden können (Marshall et al. (1998) Nature Biotechnology, 16, 27-31 ;Ramsay (1998) Nature Biotechnology, 16„ 40-44).
Abhängig von der auf dem Mikroarray immobilisierten Substanzbibliothek und der chemischen Natur der Targetmoleküle können anhand dieses Testprinzips Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Nukleinsäuren, zwischen Proteinen und Proteinen sowie zwischen Nukleinsäuren und Proteinen untersucht werden (zur Übersicht siehe Lottspeich et al. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin).
Als Substanzbibliotheken, die als Sonden auf Mikroarrays oder Chips immobilisiert werden können, kommen dabei Antikörper-Bibliotheken, Rezeptor-Bibliotheken, Peptid-Bibliotheken und Nukleinsäure-Bibliotheken in Frage. Die Nukleinsäure- Bibliotheken nehmen die mit Abstand wichtigste Rolle ein.
Es handelt sich dabei um Microarays, auf denen Desoxyribonukleinsäure- (DNA) Moleküle, Ribonukleinsäure- (RNA) Moleküle oder Moleküle von Nukleinsäureanaloga (z.B. PNA) immobilisiert sind. Voraussetzung für die Bindung eines mit einer Fluoreszenzgruppe markierten Targetmoleküls (DNA-Molekül oder RNA-Molekül) an eine Nukleinsäuresonde des Mikroarrays ist, dass sowohl Targetmolekül als auch Sondenmolekül in Form einer einzelsträngigen Nukleinsäure vorliegen.
Nur zwischen solchen Molekülen kann eine effiziente und spezifische Hybridisierung stattfinden. Einzelsträngige Nukleinsäureziel- und Nukleinsäure- sondenmoleküle erhält man in der Regel durch Hitzedenaturierung und optimal zu wählende Parameter (Temperatur, Ionenstärke, Konzentration helixdestabilisierender Moleküle), was gewährleistet, dass nur Sonden mit nahezu perfekt komplementären (einander entsprechenden) Sequenzen mit der Zielsequenz gepaart bleiben (Leitch et al. (1994) In vitro Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Oxford).
Ein typisches Beispiel für die Verwendung von Mikroarrays in biologischen Testverfahren ist der Nachweis von Mikroorganismen in Proben in der biomedizinischen Diagnostik. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze, dass die Gene für ribosomale RNA (rRNA) ubiquitär verbreitet sind und über Sequenzabschnitte verfügen, die für die jeweilige Spezies charakteristisch sind. Diese Spezies-charakteristischen Sequenzen werden in Form von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotidsonden auf ein Mikroarray aufgebracht. Die zu untersuchenden Target-DNA-Moleküle werden zunächst aus der zu untersuchenden Probe isoliert und mit fluoreszierenden Markern versehen. Anschließend werden die markierten Target-DNA-Moleküle in einer Lösung mit den auf dem Mikroarray aufgebrachten Sonden inkubiert, unspezifisch auftretende Wechselwirkungen werden durch entsprechende Waschschritte entfernt und spezifische Wechselwirkungen durch fluoreszenzoptische Auswertung nachgewiesen. Auf diese Art und Weise ist es möglich, mit einem einzigen Test in einer Probe gleichzeitig z.B. mehrere Mikroorganismen nachzuweisen. Die Anzahl der nachweisbaren Mikroorganismen hängt bei diesem Testverfahren theoretisch nur von der Anzahl der spezifischen Sonden ab, die auf dem Mikroarray aufgebracht worden sind.
Ein weiteres Beispiel für eine Anwendung in einem medizinischen Testverfahren ist die Erstellung eines Single Nucleotide Polymorphismus (kurz „SNP") - Profils als Ansatzpunkt für eine individualisierte Therapie.
Die Gesamtheit der genetischen Information eines Lebewesens ist bei allen Lebewesen, mit Ausnahme von eineiigen Mehrungen und Klonen, individuell. Der Grad der Unterschied-lichkeit wird dabei um so größer, je kleiner der biologische Verwandtschaftsgrad zwischen den Individuen ist. Die so genannten Single Nucletide Polymorphismen (SNP's) stellen dabei die häufigste Variation im menschlichen Genom dar. Anhand des jeweiligen SNP-Profils eines. Menschen soll es nun möglich werden zu beurteilen, wer bei einer medikamentösen Therapie auf die jeweiligen Medikamente anspricht oder bei wem mit unerwünschten Nebenwirkungen zu rechnen ist. Zahlen aus der Onkologie zeigen, dass oft nur 20 - 30% der Patienten auf spezielle Wirkstoffe ansprechen. Die restlichen 70% können diese häufig aus offenbar genetischen Gründen nicht verwerten. Auf DNA-Arrays basierende Testsysteme stellen hierbei als Entscheidungshilfe eine hervorragende Methode dar, den Patienten schnell und zuverlässig und durch wenige Handgriffe auf wenige, ausschließlich für eine Krankheit relevante SNP's zu testen. Dadurch können Therapien für Patienten individuell variiert werden.
Bei vielen Tests in der biomedizinischen Diagnostik tritt das Problem auf, dass vor dem eigentlichen Testverfahren die Targetmoleküle zunächst in ausreichender Form vorhanden sein müssen und damit häufig aus der Probe zunächst vervielfältigt werden müssen. Die Vervielfältigung von DNA-Molekülen geschieht durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Für die Vervielfältigung von RNA müssen die RNA-Moleküle durch reverse Transkription in entsprechend komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt werden. Diese cDNA kann dann ebenfalls durch PCR vervielfältigt (amplifiziert) werden. Bei der PCR handelt es sich um eine Labor- Standard-Methode (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Generell sollten Vorrichtungen und Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis so konzipiert sein, dass möglichst wenige Eingriffe seitens eines
Experimentators notwendig sind. Die Vorteile von Verfahren, die eine Vervielfältigung von Nukleinsäuren und deren Nachweis ermöglichen und in deren Verlauf ein Experimentator nur minimal eingreifen muss, liegen auf der Hand. Zum einen werden Kontaminationen vermieden. Zum anderen ist die Reproduzierbarkeit solcher Verfahren wesentlich erhöht, da sie einer Automatisierung zugänglich sind. Dies ist auch im Hinblick auf Zulassung von diagnostischen Verfahren extrem wichtig.
Es gibt gegenwärtig eine Vielzahl von Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis, bei denen zunächst das Target-Material durch PCR-Amplifikation vervielfältigt wird und die Identität bzw. der genetische Zustand der Zielsequenzen anschließend durch Hybridisierung gegen einen Sondenarray bestimmt wird. Die Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure- bzw. Target- Moleküle ist in der Regel notwendig, um ausreichende Mengen für einen qualitativen und quantitativen Nachweis im Rahmen der Hybridisierung zur Verfügung zu haben.
Sowohl die PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren als auch der Nachweis derselben durch Hybridisierung ist einer Reihe von grundlegenden Problemen unterworfen. Dies gilt in gleicher Weise für Verfahren, die eine PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis durch Hybridisierung kombinieren.
Eines der Probleme, das bei Verfahren, die PCR und Hybridisierung kombinieren, auftritt, ist in der Doppelsträngigkeit der Target-Moleküle begründet. Klassische PCR-Amplifikationsreaktionen erzeugen ausgehend von einem doppelsträngigen Template-Molekül üblicherweise doppelsträngige DNA-Moleküle. Diese können nur nach vorhergehender Denaturierung mit den Sonden des Sondenarrays hybridisieren. Während der Hybridisierungsreaktion konkurriert die sehr schnelle Doppelstrangbildung in der Lösung mit der Hybridisierung gegen die immobilisierten Sonden des Sondenarrays. Die Intensität der Hybridisierungssignale und damit die quantitative und qualitative Auswertung der Verfahrensergebnisse werden durch diese Kompetitionsreaktion stark begrenzt.
Hinzu kommen die Probleme, die in der Hybridisierungs-Reaktion an sich bzw. den zur Hybridisierung gebrachten Sonden und Target begründet sind. PCR-Produkte, die als Targets für Array-Hybridisierungs-Reaktionen Verwendung finden, weisen in der Regel eine Länge von mindestens circa 60 Basenpaaren auf. Dies entspricht der Summe der Längen der zur PCR-Reaktion verwendeten forward- und reverse-primer sowie der Region, die durch die PCR amplifiziert wird und Komplementarität zur Sonde auf dem Array aufweist. Einzelsträngige Moleküle dieser Länge liegen in Lösung häufig nicht unstrukturiert, d.h. linear gestreckt vor, sondern weisen mehr oder wenig stabile Sekundärstrukturen, wie z.B. Haarnadeln oder andere helikale Strukturen, auf. Wenn diese Sekundärstrukturen den Bereich des Targets betreffen, der Komplementarität zur Sonde aufweist, verhindert die Ausbildung der genannten Sekundärstrukturen eine effiziente Hybridisierung des Targets an die Sonde. Die Ausbildung von Sekundär Strukturen kann somit ebenfalls eine effiziente Hybridisierung inhibieren und eine quantitative und qualitative Auswertung der Verfahrensergebnisse erschweren, wenn nicht gar verhindern.
Verfahren, bei denen bereits während der PCR-Reaktion ein Einzelstrangüberschuss entsteht, sind allgemein als lineare oder asymmetrische PCR bekannt.
Bei der klassischen linearen PCR-Reaktion wird ein doppelsträngiges Template in einer PCR-Reaktion amplifiziert, der nur ein einzelner Primer zugegeben wurde. Entsprechend wird ausgehend von diesem Primer nur einer der beiden Stränge produziert, der dann im Überschuss vorliegt (Kaltenboeck et al. (1992) Biotechniques, 12(2), 164-166). Die lineare PCR hat allerdings den Nachteil, dass die durch sie amplifizierten Target-Mengen in der Regel nicht für eine effizienten quantitativen und qualitativen Nachweis im Rahmen einer Hybridisierung eines Sondenarrays ausreichen.
Von symmetrischer PCR wird üblicherweise gesprochen, wenn beide Primer in gleichen molaren Mengen vorliegen. Die Amplifikationsrate folgt dann einer exponentiellen Kinetik der Form 2n (n = Anzahl der PCR-Zyklen). Die Kombination aus symmetrischer PCR-Reaktion mit bezüglich des Templates limitierender Primermenge und anschließender Zugabe eines einzelnen Primers im Uberschuss gefolgt von einer linearen Amplifikation wird üblicherweise als zweistufige lineare oder asymmetrische PCR beschrieben. Der Nachteil dieses Verfahrens ist darin zu sehen, dass erst nach der Durchführung der symmetrischen PCR der Primer zur Durchführung der linearen PCR zugegeben wird, was einen zusätzlichen Eingriff ins experimentelle System darstellt.
Die bislang bekannten Verfahren haben den gemeinsamen Nachteil, dass für die Herstellung einzelsträngiger DNA mindestens ein zusätzlicher Reaktionsschritt notwendig ist, der das Eingreifen des Experimentators erfordert. Damit sind diese Verfahren für die Anwendung in geschlossenen Systemen bzw. auf mäandrierenden Kanälen basierenden Flussthermocyclern (Köhler et al. (1998) Micro Channel Reactors for Fast Thermocycling , Proc. 2nd International Conference on Microreaction Technology, New Orleans, 241-247), bei denen eine Zugabe oder ein Abtrennen von Komponenten während der Reaktion nicht möglich ist, nicht geeignet.
Alternative Verfahren gestatten die asymmetrische PCR-Amplifikation in einem Schritt. Zum Beispiel kann durch Zugabe der Primer im asymmetrischen Verhältnis (d.h. einer der Primer ist im molaren Unterschuss vorhanden und wird im Verlauf der Reaktion aufgebraucht) ein Strang im Uberschuss produziert werden. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht aber darin, dass erst nach Erreichen einer bestimmten Konzentration des PCR-Produkts ein Einzelstrangüberschuss erreicht wird. Das Erreichen dieser Konzentration hängt jedoch wiederum in starkem Maße von der Anfangskonzentration des Templates ab, so dass die kritische Konzentration bei Proben mit geringer Template-Menge u.U. gar nicht erreicht wird. Das
Amplifikationsprodukt würde dann nur in doppelsträngiger Form vorliegen und das Signal bei einer Hybridisierungs-basierten Analyse wegen der gering konzentrierten Proben überproportional geschwächt.
Mit den bislang bekannten Verfahren ist eine zufriedenstellende Sensitivität und Spezifität bei der Array-basierten Durchführung von Analysen, die auf einer Amplifikation des Targetmaterials durch PCR und anschließender Analyse des Amplifikationsprodukts durch Hybridisierung gegen Sondenarrays in einem kontinuierlichen Prozess beruhen, nicht gewährleistet. Ferner ist eine parallele Echtzeit-Quantifizierung von Targets durch PCR-Amplifikation und Hybridisierung nicht möglich.
Bisher war davon ausgegangen worden, dass die alleinige Durchführung einer asymmetrischen PCR-Reaktion nicht genügend einzelsträngige Nukleinsäure- moleküle amplifiziert, um diese in anschließenden Nachweisreaktionen wie z.B. einer Hybridisierung mit einer entsprechenden Sonde zu detektieren. Daher war zur Amplifikation von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen bisher im Stand der Technik immer eine zweistufige asymmetrische oder lineare PCR durchgeführt worden, d.h. der asymmetrischen oder linearen PCR-Amplifikation war eine klassische symmetrische PCR-Amplifikation vorgeschaltet, was jedoch ein mehrfaches experimentelles Eingreifen, wie z.B. die Zugabe neuer Primer, im Laufe der Prozessführung bedeutete.
Die deutsche Patentanmeldung DE 102 53 966 beschreibt dem gegenüber ein Verfahren zur effizienten Amplifikation von Nukleinsäuren und deren Nachweis in einem kontinuierlichen Prozess, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die nachzuweisende Nukleinsäure zunächst durch eine PCR im Einzelstrangüberschuss amplifiziert wird, wobei der Reaktion zu Anfang mindestens ein Kompetitor zugesetzt wird, der die Bildung eines der beiden durch die PCR-amplifizierten Template-Stränge inhibiert, und die amplifizierte Nukleinsäure durch Hybridisierung
mit einer komplementären Sonde, insbesondere auf Mikroarrays bzw. Chips, nachgewiesen wird. Es wurde festgestellt, dass durch eine PCR-Reaktion, der zu Anfang ein Kompetitor zugesetzt wurde, der die Amplifizierung eines der beiden Template-Stränge inhibiert, ausreichend einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle im Uberschuss amplifiziert werden, um diese in einem zweiten Schritt durch
Hybridisierung mit einer komplementären Sonde nachzuweisen. Aufgrund des Kompetitors findet zwar eine gedämpfte exponentielle Amplifikation der Template- Stränge statt, die aber eine ausreichend große Menge an Einzelsträngen erzielt, um eine effiziente Hybridisierung zu gewährleisten. Insbesondere wird der Verlust an Menge durch den Einzelstrangüberschuss bei Hybridisierungs-basierten Assays niem¬ als aufgehoben. Es wird somit in DE 102 53 966 dargestellt, dass durch Zugabe von Kompetitoren zu dem PCR-Reaktionsansatz beim Start der Amplifikationsreaktion gleichzeitig eine effiziente Amplifikation der Zielsequenz und ein derart hoher Einzelstrangüberschuss erreicht werden kann, dass ein effizienter, quantitativer und qualitativer Nachweis der amplifizierten Einzelstränge durch Hybridisierung mit entsprechenden Sonden möglich ist.
Die Vervielfältigung von DNA durch PCR ist verhältnismäßig schnell, ermöglicht durch miniaturisierte Verfahren einen hohen Probendurchsatz in geringen Ansatzvolumina und ist durch Automatisierung arbeitseffizient. Eine
Charakterisierung von Nukleinsäuren durch eine alleinige Vervielfältigung ist jedoch nicht möglich. Vielmehr ist es notwendig, nach der Amplifikation Analysemethoden wie Nukleinsäuresequenzbestimmungen oder elektrophoretische Trenn- und Isolationsverfahren zur Charakterisierung der PCR-Produkte einzusetzen.
Somit besteht ein großer Bedarf an Vorrichtungen, die die Durchführung von PCR und Analysereaktion, wie z.B. einer Hybridisierungsreaktion, in einem Reaktionsraum ermöglichen.
Bislang sind folgende Vorrichtungen zur Amplifikation von Target-Molekülen und zur Detektion von Hybridisierungsreaktionen in kombinierter Form bekannt:
In WO 01/02094 ist eine Vorrichtung beschrieben, mit der PCR und Nukleinsäurehybridisierung an einem DNA-Chip als Einkammerreaktion in einer Probenkammer mit integriertem Heizsystem durchgeführt werden. Nachteilig an der dort beschriebenen Vorrichtung ist, dass zur Vermischung der Proben ein kompliziertes Quadropol-System notwendig ist und dass der Aufbau dieser Einheit das Verkleben von Bauteilen erfordert. Ferner ist die Vorrichtung aufgrund ihrer hohen Fertigungskosten als Einwegprodukt unrentabel. Schließlich erfordert die
Handhabung dieser Vorrichtung die Bereitstellung von speziell angepassten Geräten für das Prozessieren, wie z.B. die Befüllung, Waschschritte u. dgl., sowie für das Auslesen des DNA-Chips.
In US 5,856,174 und US 6,168,948 werden die Amplifikation und Hybridisierung von DNA in einem System beschrieben. Aufreinigung, Markierung, Amplifikation und Hybridisierung der Zielsubstanz werden in einzelnen Schritten vorgenommen. Nachteilig an den dort beschriebenen Systemen ist, dass die Reaktionen in getrennten Reaktionskammern stattfinden. Über eine komplexe, mit Druckluft betriebene Vorrichtung wird die Probenlösung von Reaktionskammer zu Reaktionskammer gepumpt, um die jeweiligen Prozessschritte durchzuführen. Bei diesen Systemen handelt es sich somit um kompliziert aufgebaute Kartuschen, die sowohl zum Prozessieren als auch zur Detektion speziell angepasste Geräte erfordern.
Bei dem von der Firma Relab AG beschriebenen Genestick® werden chemisch synthetisierte Oligonukleotide in einem Raster an das Kopfende eines Kunststoffstabes immobilisiert. Der Nachteil dieser Vorrichtung ist, dass ein Stab mit dieser Form und in diesen Abmessungen nicht in 1,5 ml Standard- Laborreaktionsgefäße wie beispielsweise von Herstellern wie Eppendorf (Hamburg, Deutschland) oder BlOplastics (Landgraaf, Niederlande) prozessiert werden kann,
weshalb zu diesem Zweck ein eigens für diesen Genestick® angebotenes Reaktionsgefäß verwendet werden muss. Zum Auslesen einer mit dem Genestick® durchgeführten Analysereaktion ist ferner die Bereitstellung einer eigens angepassten Vorrichtung erforderlich, da durch die Abmessungen des Stabes ein Auslesen in Standard-Konfökalscannern, wie sie zum Auslesen von Substanzbibliotheken im
Objektträgerformat verwendet werden, nicht möglich ist. Ein weiterer Nachteil dieser Vorrichtung ist, dass eine Amplifikation des Probenmaterials mit dem Genestick® nicht vorgesehen und auch nicht durchführbar ist. D.h., das zu analysierende Material muss bereits vor dem Prozessieren aufgereinigt und in ausreichender Menge vorliegen. Schließlich ist die Anzahl der Spots ist auf 1200 begrenzt.
In E. Ermantraut et al. (Building highly diverse arrayed substance libraries by micro offset printing, Micro Total Analysis Systems '98 Workshop, 13. bis 16. Oktober 1998, Banff, Kanada) ist ein Kamm zu Aufnahme von 8 DNA-Mikroarrays beschrieben. Diese Vorrichtung ist für den Einsatz in Mikrotiterplatten konstruiert und besitzt für jeden DNA-Array einen eigenen Verschluss für den Reaktionsraum. Nachteilig an dieser Vorrichtung ist, dass durch die integrierte Verschlusskappe ein Einsatz in Standard-Reaktionsgeräten wie beispielsweise einem Thermocycler nicht möglich ist, da die Verschlusskappe bei einem Einsatz in einem Standard- Thermocycler das Schließen des Gerätedeckels verhindern würde. Die Vorrichtung ist also ausschließlich auf den Einsatz in Mikrotiterplatten beschränkt. Ein weiterer Nachteil dieser Vorrichtung ist die fehlende Integrationsmöglichkeit zum Auslesen der prozessierten Arrays in Standard-Konfokalscannern, wie sie zum Auslesen von Substanzbibliotheken im Objektträgerformat verwendet werden. Zur Detektion ist somit ein eigens angepasstes Geräteformat erforderlich.
Anhand des vorstehend beschriebenen Standes der Technik wird deutlich, dass ein großer Bedarf an Vorrichtungen besteht, die zum einen auf einfache und kostengünstige Weise bereitgestellt werden können und zum anderen eine einfache Durchführung von auf Mikroarrays basierenden Tests ermöglichen, die insbesondere
der Erforschung bzw. Erkennung von genetischen Defekten und Variationen dienen. Allgemein besteht ein Bedarf an Vorrichtungen zur Durchführung von auf Mikroarrays basierenden Tests, die sich durch eine einfache Konstruktion, eine leichte Handhabbarkeit, das Vermeiden von Kontaminationsquellen, eine reprodu- zierbare Durchführbarkeit der Tests und niedrige Herstellungskosten auszeichnen.
Der vorliegende Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die die parameterregulierte Durchführung von auf Mikroarrays basierenden Tests erlaubt.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchführung von Verfahren zum Nachweis von Zielmolekülen mit Hilfe von Substanzbibliotheken zur Verfügung zu stellen, die sich durch einfache Konstruktion, leichte Handhabbarkeit und kostengünstige Herstellung auszeichnet.
Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die die Durchführung einer PCR in Anwesenheit von Substanzbibliotheken erlaubt. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die die Durchführung von Mikroarray-basierten Tests und insbesondere die gleichzeitige Durchführung von PCR und Mikroarray-basierten Tests in einem Ein-Kammer-System, d.h. einem Reaktionsraum mit möglichst geringem Arbeitsaufwand und unter Vermeidung von Kontaminationsquellen erlaubt.
Schließlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die eine schnelle Detektion der Hybridisierungssignale erlaubt und die Vergleichbarkeit verschiedener Mikroarray-basierter Tests erhöht.
Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstände gelöst. Bevorzugte Ausfuhrungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Haltevorrichtung für
Substanzbibliotheken, die insbesondere zum Nachweis von Zielmolekülen mit Hilfe von Substanzbibliotheken eingesetzt werden kann, mit:
(i) einer Halterung (101 ) für einen Substanzbibliothekentrager; (ii) einem Substanzbibliothekentrager (104), der an der Halterung (101) fixierbar ist;
(iii) einer auf dem Substanzbibliothekentrager (104) aufgebrachten
Detektionsflache (107), auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist; wobei mindestens der Substanzbibliothekentrager (104) in ein Laborreaktionsgefäß (Tube) einbringbar ist.
Die erfindungsgemäße Haltervorrichtung für Substanzbibliotheken bietet den wesentlichen Vorteil, dass für den Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen die typischen im Laboralltag verwendeten und somit üblicherweise bereits in den Laboren vorhandenen Geräte und Instrumente, wie beispielsweise Tischzentrifugen und Pipetten, zum Einsatz kommen können. Somit wird durch einen in ein herkömmliches Laborreaktionsgefäß einbringbaren Substanzbibliothekentrager die Kompatibilität mit üblicherweise in Laboren verwendeten Geräten gewährleistet. Folglich ist insbesondere die Prozessierung, insbesondere PCR und/oder Mikroarray-basierte Tests, unter Verwendung eines Substanzbibliothekenträgers der erfindungsgemäßen Haltevorrichtung in einem Laborreaktionsgefäß (Tube) durchführbar.
Insbesondere ist es ein Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung, dass als Inkubationskammer bzw. Hybridisierungskammer für die Nachweisreaktion und ggf.
für Reaktionen zur Vervielfältigung der Zielmoleküle ein Laborreaktionsgefäß typischer Form und Größe eingesetzt werden kann. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist, dass eine getrennte Inkubationskammer überflüssig ist, da das Laborreaktionsgefäß auch als Hybridisierungskammer dient. Zusätzlich wird die Oberfläche des Trägers mit den darauf immobilisierten Sondenmolekülen, d.h. die Detektionsflache, durch die für herkömmliche Laborreaktionsgefäße typische Deckelverriegelung, beispielsweise die Safe-Lock- Deckelverriegelung bei Eppendorf-Reaktionsgefäßen, vor Kontaminationen und anderen nachteiligen äußeren Einflüssen während der Nachweisreaktion geschützt.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Trägersystem für die Detektion von Wechselwirkungen zwischen Zielmolekülen und Substanzbibliotheken, zur Verfügung gestellt, das folgenden Module umfasst: a) eine Haltevorrichtung für Substanzbibliotheken, enthaltend: (i) eine Halterung ( 101 ) für einen Substanzbibliothekentrager;
(ii) einen Substanzbibliothekentrager (104), der an der Halterung (101) fixierbar ist;
(iii) eine auf dem Substanzbibliothekentrager (104) aufgebrachte
Detektionsflache (107), auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist; und b) einen Detektionsadapter (207), auf den mindestens der Substanzbibliothekentrager (104) aufbringbar ist; wobei der Detektionsadapter die äußeren Abmessungen eines Objektträgers für Mikroskope aufweist.
Ein Objektträger bzw. Standard-Objektträger bzw. Slide, der im Folgenden auch als Mikroskop-Objektträger bezeichnet wird, weist in der Standardausführung, z.B. von Herstellern wie Quantifoil (Jena, Deutschland) oder Eppendorf (Hamburg, Deutschland), als äußere Abmessungen eine Länge von etwa 76 mm, eine Breite von etwa 25 mm sowie eine Höhe von etwa 1 mm auf. Objektträger können allerdings in
speziellen Ausgestaltungen auch die folgenden äußeren Abmessungen aufweisen: eine Länge im Bereich von 30 mm bis 150 mm, vorzugsweise von 50 mm bis 100 mm, besonders bevorzugt von 60 mm bis 80 mm und am meisten bevorzugt im Bereich von 74 mm bis 78 mm; eine Breite von 10 bis 50 mm, vorzugsweise von 15 mm bis 40 mm, besonders bevorzugt von 20 mm bis 30 mm and am meisten bevorzugt von 23 mm bis 27 mm; sowie eine Höhe von 0,2 mm bis 2,0 mm, vorzugsweise 0,5 mm bis 1,5 mm, besonders bevorzugt 0,75 mm bis 1,25 mm und am meisten bevorzugt von 0,9 mm bis 1,1 mm.
Der Adapter bzw. Detektionsadapter ist wie ein Standard-Objektträger mit herkömmlichen Detektions- bzw. Auslesegeräten und insbesondere mit Standard- Fluoreszenzscannern kompatibel und dient zur Aufnahme des Substanzbibliothekenträgers für das Auslesen der Detektionsflache. Dadurch, dass die äußeren Abmessungen des Adapters jenen eines Standard-Objektträgers für Mikroskope entsprechen, kann jedes Standard-Detektionsgerät wie z.B. ein Standard- Fluoreszenzmikroskop oder ein Standard-Konfokalscanner eingesetzt werden. Die Verwendung des erfindungsgemäßen Trägersystems bei der Detektion von spezifischen Wechselwirkungen zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen bzw. Substanzbibliotheken bietet den wesentlichen Vorteil, dass die Anschaffung von zusätzlichen und speziell angepassten Geräten bzw. einer zusätzlichen Ausstattung für die Detektion nicht erforderlich ist.
Als Adapter können somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Adapter eingesetzt werden, die aufgrund ihrer äußeren Abmessungen die Aufnahme einer Halterung für einen Substanzbibliothekentrager bzw. eines Substanzbibliothekenträgers gewährleisten sowie mit dem auf den Adapter aufgebrachten Substanzbibliothekentrager bzw. der auf den Adapter aufgebrachten Halterung mit dem Substanzbibliothekentrager wie ein Standard-Objektträger in einem Standard- Konfokalscanner bzw. Standard-Fluoreszenzscanner, wie z.B. Scanarray 4000 (GSI Lumonics/Packard), Gen Tac LS (Perkin Eimer) oder Standard-Fluoreszenzscannem
von Genefix (UnionCity, CA, USA), Genescan Europe (Freiburg, Deutschland) und Affymetrix (Santa Clara, CA, USA), ausgelesen werden können.
Die erfindungsgemäßen Haltervorrichtungen und Trägersysteme zeichnen sich durch eine einfache Konstruktion und kostengünstige Herstellung aus und ermöglichen durch die Verwendung von üblicherweise in Laboren vorhandenen Geräten und Instrumenten eine leichte Handhabung.
Unter Laborreaktionsgefäßen (Tubes) werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Laborreaktionsgefäße mit einer typischen Form und Größe verstanden. Laborreaktionsgefäße mit einer typischen Form und Größe sind Reaktionsgefäße, die als Einweg-Reaktionsgefäße, in der Standardausführung 1,5 ml oder - für die Durchführung von PCR-Reaktionen - 0,5 ml fassend, in, insbesondere biologischen bzw. molekularbiologischen, Laboratorien üblicherweise verwendet werden. Derartige Laborreaktionsgefäße werden auch als Tubes und, nach dem bedeutendsten Hersteller, insbesondere als Eppendorf-Tubes oder "Eppis" (Hamburg, Deutschland) bezeichnet. So werden Laborreaktionsgefäße mit einer typischen Form und Größe von Eppendorf als Standard-Reaktionsgefäße oder Safe-Lock-Reaktionsgefäße angeboten. Selbstverständlich können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Reaktionsgefäße von Herstellern wie Greiner (Frickenhausen, Deutschland),
Millipore (Eschborn, Deutschland), Heraeus (Hanau, Deutschland) und BlOplastics (Landgraaf, Niederlande) sowie anderen Herstellern eingesetzt werden, die eine Form und Größe aufweisen, wie sie für Laborreaktionsgefäße insbesondere von Eppendorf typisch ist. Beispiele für Laborreaktionsgefäße mit einer typischen Form und Größe sind in Abbildung 13 gezeigt.
Füllvolumina für Laborreaktionsgefäße typischer Größe liegen im Bereich von 100 μl bis 2,5 ml, können aber bei speziellen Ausgestaltungen auch höher oder niedriger sein. Besonders bevorzugt hat das Laborreaktionsgefäß ein für ein Standard-PCR-
Tube übliches Füllvolumen von bis zu 0,5 ml. Weitere typische Füllvolumina sind bis 0,3 ml, bis 0,4 ml, bis 0,7 ml, bis 1,0 ml, bis 1,5 ml oder bis 2,0 ml.
Laborreaktionsgefäße typischer Form weisen eine rotationssymmetrische Form, insbesondere eine zylindrische bzw. im Wesentlichen zylindrische Form auf. Von den für herkömmliche Laborreaktionsgefäße typischen Formen ist ferner eine von der zylindrischen Grundform abweichende konische Form umfasst. Typische Formen sind ferner Kombinationen von zylindrischen bzw. im Wesentlichen zylindrischen Bereichen und konischen Bereichen (siehe u.a. Abbildungen 7 und 13).
Laborreaktionsgefäße typischer Form und Größe sind insbesondere mit üblichen Tischzentrifugen wie beispielsweise von Herstellern wie Eppendorf oder Heraeus kompatibel. Übliche maximale Außendurchmesser für Standard-Laborreaktionsgefäße liegen im Bereich von 0,5 cm bis 2 cm, vorzugsweise 1,0 cm bis 1,5 cm und besonders bevorzugt 1,1 cm bis 1,3 cm. Weitere bevorzugte Außendurchmesser sind bis 0,9 cm, bis 1,2 cm, bis 1,4 cm, bis 1,6 cm und bis 1,7 cm. Die Höhe des Laborreaktionsgefäßes beträgt üblicherweise 1,0 cm bis 5,0 cm, vorzugsweise 2,0 cm bis 4,0 cm, besonders bevorzugt 2,5 cm bis 3,5 cm, und am meisten bevorzugt 2,8 cm bis 3,2 cm. Weitere bevorzugte Höhen sind bis 2,6 cm, bis 2,7 cm, bis 2,9 cm, bis 3,0 cm, bis 3,1 cm, bis 3,3 cm und bis 3,4 cm. In speziellen Ausgestaltungen kann die Höhe auch 0,8 cm oder mehr betragen. Das Laborreaktionsgefäß kann beispielsweise in herkömmlichen Tischzentrifugen wie einer Standard-Tisch- zentrifuge mit Standard-Rotor von Eppendorf sowie auch in üblichen Racks und Haltern für Reaktionsgefäße wie beispielsweise einem Tube-Rack von Eppendorf eingesetzt werden. Zum Einbringen der zu untersuchenden Probe sowie anderer zur Durchführung der Nachweisreaktion erforderlicher Reagenzien in das Laborreaktionsgefäß können übliche Pipetten oder Spritzen wie beispielsweise variable und Fixvolumen-Pipetten von Eppendorf verwendet werden.
Unter Laborreaktionsgefäßen typischer Form und Größe werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere nicht Rundkolben oder andere Kolben wie Erlenmeyerkolben, Bechergläser oder Messzylinder verstanden.
Unter einem Objektträger bzw. Mikroskop-Objektträger bzw. Standard-Objektträger bzw. Slide wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Glasscheibe verstanden, auf der bei mikroskopischen Untersuchungen das zu untersuchende Objekt aufgetragen wird. Ein Standard-Objektträger weist als äußere Abmessungen üblicherweise eine Länge von etwa 76 mm, eine Breite von etwa 25 mm und eine Dicke von etwa 1 mm auf. Eine Übersicht über derartige Standard- Substanzbibliothekenträger im Objektträgerformat findet sich in M. Schena, Microarray Biochip Technology, Technology Standards for Microarray Research, Eaton Publishing BioTechniques Books Division, Natrick, Ma, USA, 2000).
Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden femer unter anderem folgende Definitionen verwendet:
Unter einer Sonde bzw. einem Sondenmolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das zum Nachweis anderer Moleküle durch ein bestimmtes, charakteristisches Bindungsverhalten bzw. eine bestimmte Reaktivität verwendet wird. Für die auf dem Array angeordneten Sonden kommt jede Art von Molekülen in Frage, die sich an feste Oberflächen koppeln lassen und eine spezifische Affinität aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Biopolymere aus den Klassen der Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und/oder deren Analoga. Besonders bevorzugt sind die Sonden Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga.
Als Sonde werden insbesondere Nukleinsäuremoleküle definierter und bekannter Sequenz bezeichnet, die benutzt werden, um in Hybridisierungsverfahren Target- Moleküle nachzuweisen. Als Nukleinsäuren können sowohl DNA- als auch RNA-
Moleküle verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei den Oligonukleotidsonden um Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 100 Basen, vorzugsweise 15 bis 50 Basen und besonders bevorzugt von 20 bis 30 Basen Länge handeln. Typischerweise handelt es sich erfindungsgemäß bei Sonden um einzel- strängige Nukleinsäuremoleküle oder Moleküle von Nukleinsäureanaloga, bevorzugt einzelsträngige DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, die mindestens über einen Sequenzbereich verfügen, der zu einem Sequenzbereich der Target-Moleküle komplementär ist. Je nach Nachweisverfahren und Anwendung können die Sonden auf einem festen Trägersubstrat, z.B. in Form eines Mikroarrays immobilisiert sein. Darüber hinaus können sie j e nach Nachweisverfahren radioaktiv oder nichtradioaktiv markiert sein, so dass sie über die im Stand der Technik übliche Nachweisreaktion nachgewiesen werden können.
Unter einem Target bzw. einem Targetmolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das mit einer molekularen Sonde nachzuweisende Molekül verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den zu detektierenden Targets um Nukleinsäuren. Der erfindungsgemäße Sonden- Array kann jedoch analog zum Nachweis von Protein/Sonden- Wechselwirkungen, Antikörper/Sonden- Wechselwirkungen, usw. eingesetzt werden.
Falls es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei den Targets um Nukleinsäuremoleküle handelt, die durch eine Hybridisierung gegen auf einem Sondenarray angeordnete Sonden nachgewiesen werden, umfassen diese Target- Moleküle in der Regel Sequenzen von 40 bis 10000 Basen Länge, bevorzugt von 60 bis 2000 Basen Länge, ebenfalls bevorzugt von 60 bis 1000 Basen Länge, insbesondere bevorzugt von 60 bis 500 Basen Länge und am meisten bevorzugt von 60 bis 150 Basen Länge. Ihre Sequenz beinhaltet gegebenenfalls die Sequenzen von Primem, sowie die durch die Primer definierten Sequenzbereiche des Templates. Bei den Target-Molekülen kann es sich insbesondere um einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle handeln, von denen ein oder beide Stränge radioaktiv oder
nicht-radioaktiv markiert sind, so dass sie in einem der im Stand der Technik üblichen Nachweisverfahren nachgewiesen werden können.
Als Target-Sequenz wird erfindungsgemäß der Sequenzbereich des Targets bezeichnet, der durch Hybridisierung mit der Sonde nachgewiesen wird.
Erfindungsgemäß wird auch davon gesprochen, dass dieser Bereich durch die Sonde adressiert wird.
Unter einer Substanzbibliothek wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von unterschiedlichen Molekülen verstanden, vorzugsweise mindestens 100 unterschiedliche Moleküle, besonders bevorzugt mindestens 1000 unterschiedliche Moleküle und am meisten bevorzugt mindestens 10000 unterschiedliche Moleküle. Bei speziellen Ausgestaltungen kann eine Substanzbibliothek auch nur mindestens 50 oder weniger oder mindestens 30000 unterschiedliche Moleküle umfassen.
Unter einem Sonden- Array wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anordnung von molekularen Sonden bzw. einer Substanzbibliothek auf einem Träger verstanden, wobei die Position einer jeden Sonde separat bestimmt ist. Vorzugsweise umfasst der Array definierte Stellen bzw. vorbestimmte Bereiche, so genannte Array-Elemente, die besonders bevorzugt in einem bestimmten Muster angeordnet sind, wobei jedes Array-Element üblicherweise nur eine Spezies an Sonden beinhaltet. Die Anordnung der Moleküle bzw. Sonden auf dem Träger kann dabei durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erzeugt werden. Eine Position innerhalb der Anordnung, d.h. des Arrays, wird üblicherweise als Spot bezeichnet. Der Sonden-Array bildet somit die Detektionsflache.
Unter einem Array-Element bzw. einem vorbestimmten Bereich bzw. einem Spot wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein für die Deposition einer molekularen Sonde bestimmtes Areal auf einer Oberfläche verstanden, die Summe aller belegten Array-Elemente ist das Sonden-Array.
Unter einem Trägerelement bzw. Träger bzw. Substanzbibliothekentrager wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Festkörper verstanden, auf dem das Sonden- Array aufgebaut ist. Bei dem Träger, der üblicherweise auch als Substrat oder Matrix bezeichnet wird, kann es sich z.B. um Objektträger oder Wafer handeln. Die
Gesamtheit aus in Array- Anordnung abgelegten Molekülen und Träger wird häufig auch als "Chip", "Mikroarray", "DNA-Chip", Sondenarray" etc. bezeichnet.
Herkömmliche Mikroarrays im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen etwa 50 bis etwa 80000, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 65000, besonders bevorzugt etwa 1000 bis etwa 10000 unterschiedliche Spezies von Sondenmolekülen auf einer
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Fläche von mehreren mm bis mehreren cm , vorzugsweise etwa 1 mm bis 10 cm ,
9 9 9 besonders bevorzugt 2 mm bis 1 cm und am meisten bevorzugt etwa 4 mm bis 6,25 mm2. Beispielsweise weist ein herkömmliches Mikroarray von 100 bis 65000 unterschiedliche Spezies von Sondenmolekülen auf einer Fläche von 2 mm x 2 mm auf.
Unter einer Mikrotiterplatte wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anordnung von Reaktionsgefäßen in einem bestimmten Raster verstanden, die die automatisierte Durchführung einer Vielzahl von biologischen, chemischen und labormedizinischen Tests gestattet.
Unter einem Adapter bzw. Detektionsadapter wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Modul bzw. ein Bauteil verstanden, auf das das zu untersuchende Objekt, d.h. mindestens der Substanzbibliothekentrager mit der darauf immobilisierten Substanzbibliothek und gegebenenfalls die Halterung mit dem daran fixierten Substanzbibliothekentrager, aufgebracht wird, um dessen Untersuchung mit einem Detektionsgerät zu ermöglichen. Ein Detektionsadapter im Sinne der vorliegenden Erfindung hat somit eine dem Objektträger bei mikroskopischen
Untersuchungen entsprechende Funktion. Insbesondere ist der Adapter eine zum Auslesen eines Mikroarrays entwickelte Aufnahme.
Eine Markierung bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine detektierbare Einheit, beispielsweise ein Fluorophor oder eine Ankergruppe, an die eine detektierbare Einheit gekoppelt werden kann.
Als Primer wird üblicherweise ein kurzes DNA- oder RNA-Oligonukleotid (circa 12 bis 30 Basen) bezeichnet, das komplementär zu einem Abschnitt eines größeren DNA- oder RNA-Moleküls ist und über eine freie 3-OH-Gruppe an seinem 3 '-Ende verfügt. Aufgrund dieser freien OH-Gruppe kann der Primer als Substrat für beliebige DNA- oder RNA-Polymerasen dienen, die in 5 '-3 '-Richtung Nukleotide an den Primer synthetisieren. Die Sequenz der neu synthetisierten Nukleotide ist dabei durch die Sequenz des mit dem Primer hybridisierten Templates vorgegeben, die jenseits der freien 3 '-OH-Gruppe des Primers liegt. Primer üblicher Länge umfassen zwischen 12 bis 50 Nukleotide, bevorzugt zwischen 15 und 30 Nukleotide. Als Template oder Template-Strang werden üblicherweise ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül oder ein Nukleinsäurestrang bezeichnet, die als Vorlage zur Synthese von komplementären Nukleinsäuresträngen dienen.
Als Hybridisierung wird die Bildung von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen oder Duplexmolekülen aus komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen bezeichnet. Im Rahmen einer Hybridisierung können z.B. DNA-DNA- Duplexes, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Duplexes gebildet werden. Durch eine Hybridisierung können auch Duplexes mit Nukleinsäureanaloga gebildet werden, wie z.B. DNA-PNA-Duplexes, RNA-PNA-Duplexes, DNA-LNA-Duplexes und RNA-LNA-Duplexes. Hybridisierungsexperimente werden üblicherweise benutzt, um die Sequenzkomplementarität und damit die Identität zwischen zwei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen nachzuweisen.
Unter Prozessierung werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere Aufreinigungs-, Markierungs-, Amplifikations-, Hybridisierungs- und/oder Wasch- und Spülschritte, sowie weitere beim Nachweis von Targets mit Hilfe von Substanzbibliotheken durchgeführte Verfahrensschritte bezeichnet.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Haltevorrichtung, die (i) eine Halterung für einen Substanzbibliothekentrager; (ii) einen Substanzbibliothekentrager, der an der Halterung fixierbar ist; und (iii) eine auf dem Substanzbibliothekentrager aufgebrachte Detektionsflache, auf der eine Substanzbibliothek immobilisiert ist; umfasst, wobei mindestens der Substanzbibliothekentrager in ein Laborreaktionsgefäß bzw. Tube einbringbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die gesamte erfindungsgemäße Vorrichtung, d.h. die, üblicherweise stabförmige, Halterung mit dem daran fixierten Substanzbibliothekentrager in das Laborreaktionsgefäß einbringbar. Der Substanzbibliothekentrager kann somit alleine oder an eine Halterung befestigt in herkömmliche Standard-Laborreaktionsgefäße wie z.B. ein Eppendorf-Tube eingebracht werden. In diesen Laborreaktionsgefäßen können diverse Verfahrensschritte wie z.B. die Vervielfältigung von Zielmolekülen, die Durchführung der Hybridisierungsreaktionen, Wasch- und Spülschritte und weitere üblicherweise beim Nachweis von Zielmolekülen mit Hilfe von Substanzbibliotheken durchgeführte Verfahrensschritte auf einfache Weise durchgeführt werden. Insbesondere können PCR und Mikroarray-basierte Tests mit Hilfe der erfindungsgemäßen Haltevorrichtung, insbesondere gleichzeitig, in einem Laborreaktionsgefäß durchgeführt werden.
Bevorzugt ist der Substanzbibliothekentrager lösbar und/oder reversibel an die Halterung fixiert. Dadurch wird gewährleistet, dass der Substanzbibliothekentrager ggf. auch ohne die Halterung in ein Laborreaktionsgefäß eingebracht werden kann
sowie auch ohne die Halterung über einen im weiteren detailliert beschriebenen Adapter nach der Nachweisreaktion ausgelesen werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Substanzbibliothekentrager auf der Halterung fixiert. In dieser Ausführungsform ist die Halterung vorzugsweise ein Trägerstreifen, an den der Substanzbibliothekentrager beispielsweise über eine Klebeverbindung fixiert ist. Bevorzugte Materialien für derartige Trägerstreifen sind Kunststoffe wie Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat und/oder Papier. Eine derartige Vorrichtung, umfassend einen Trägerstreifen wie z.B. einem Kunststoffstreifen, an den ein Substanzbibliothekentrager durch eine einfache Klebeverbindung fixiert ist, stellt ein kostengünstiges Werkzeug zur Analyse von Probenmaterial auf genetischer Basis dar.
Die Halterung (101) enthält femer insbesondere an seiner der Detektions Vorrichtung beim Auslesen des Mikroarrays zugewandten Seite vorzugsweise nicht bzw. nur gering fluoreszierendes Material wie z.B. Glas, Topas, Zeonex (Zeon Chemicals L.P., Loisville, KY, USA) und/oder Silizium.
Vorzugsweise ist die Halterung, insbesondere der Trägerstreifen, mit einem Durchbruch in senkrechter Projektion der Detektionsflache auf die Halterung versehen. Dadurch wird gewährleistet, dass die zu detektierende Fläche sowohl mit Durchlicht-, z.B. durch ein Zeiss Axioscope-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland), als auch im Auflichtverfahren, z.B. durch ein Scanarray 4000-Gerät (GSI Lumonics/Packard) oder Gen Tac LS-Gerät (Perkin Eimer), ausgelesen werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Halterung eine Öffnung auf, in die der Substanzbibliothekentrager eingreift. Das Eingreifen erfolgt vorzugsweise formschlüssig. Besonders bevorzugt weist die Halterung zwei Flansche auf, die den Substanzbibliotheken-träger ober- und unterseitig greifen.
Bei einer Ausführui gsform der vorliegenden Erfindung ist der Substanzbibliothekentrager durch Kleben, beispielsweise über seine Stirnseite, an die Halterung fixiert. Beispiele für geeignete Klebstoffe sind Ein-Komponenten-Silikon wie z.B. Elastosil E43 (Wacker-Chemie GmbH, München, Deutschland), Zwei-Komponenten-Silikon wie z.B. Sylgard 182 und 184 (Dow Corning Corporation, Wiesbaden, Deutschland); Polyurethanharz wie z.B. Wepuran VT 3402 KK (Lackwerke Peters GmbH & Co. KG, Kempen, Deutschland); Epoxidharze wie z.B. SK 201 (SurA Chemicals GmbH, Jena, Deutschland); und/oder Acrylate wie z.B. Scotch-Weld DP 8005 (3M Deutschland GmbH, Hilden, Deutschland).
Vorzugsweise ist der Substanzbibliothekentrager durch Klemmen in die Öffnung an die Halterung fixiert. Diese klebstofffreie Fixierung des Substanzbibliothekenträgers wird üblicherweise dadurch erreicht, dass das Material der Halterung erwärmt wird. Durch die Erwärmung des Materials wird die Öffnung, beispielsweise zwischen den Flanschen, bedingt durch den Längenausdehnungskoeffizienten des Materials breiter. Dann wird der Substanzbibliothekentrager zwischen die Flansche gelegt. Durch Abkühlen der Halterung und das dadurch resultierende Schrumpfen des Materials wird der Substanzbibliothekentrager fixiert. Somit enthalten bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Halterung und insbesondere die Flansche Material mit einem hohen Längenausdehnungskoeffizienten, insbesondere im Temperaturbereich von 20°C bis 100°C, besonders bevorzugt im Temperaturbereich von 25°C bis 80°C, besonders bevorzugt mit einem Längenausdehnungskoeffizienten im Bereich von 0,1 • 10"4K_1 bis 1,5 • lO^K"1 und am meisten bevorzugt von 0,5 • 10"4K" x bis 1,0 - 10"4 K"1. Bei speziellen Ausgestaltungen können auch Materialien mit einem Längenausdehnungskoeffizienten von 0,05 • 10"4K_1 oder mehr bzw. von 2,0 • 10'4K_1 oder mehr eingesetzt werden. Beispiele für besonders geeignete Materialien mit hohem Längenausdehnungskoeffizienten sind Phenylmethylmethacrylat mit einem Längenausdehnungskoeffizienten von 0,85 • 10"4 K"1 im Bereich von 25°C bis
80°C und/oder Polycarbonat mit einem Längenausdehnungskoeffizienten von 0,7
10"4K_1 im Bereich von 25°C bis 80°C.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Substanzbibliothekentrager (104) magnetisch an die Halterung fixiert. Zu diesem Zweck sind die Kontaktflächen zwischen Halterung und Substanzbibliothekentrager bildende Flächen magnetisch ausgestaltet. Eine derartige Ausfuhrungsform ermöglicht insbesondere eine reversible Fixierung des Substanzbibliothekenträgers an der Halterung der erfindungsgemäßen Haltevorrichtung.
Ausführungsformen, bei denen der Substanzbibliothekentrager wie vorstehend beschrieben ohne Einsatz von Klebstoffen an die Halterung fixiert ist, weisen den Vorteil auf, dass dadurch eine Hemmung oder gar vollständige Inhibierung von biochemischen Reaktionen des Probenmaterials durch Klebstoffe vermieden wird.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst die Halterung einen Hohlkörper, in dem ein Schaft geführt ist. Der Hohlkörper ist vorzugsweise ein Rohr, besonders bevorzugt ein Rundrohr. Der Schaft ist vorzugsweise ein Vollzylinder. Femer ist es bevorzugt, dass der Schaft an seinem Kopfende einen Griff aufweist.
Des weiteren ist es bevorzugt, dass das Fußende des Schafts sowie eine Seite des Substanzbibliothekenträgers magnetisch ausgestaltet sind, so dass die Fixierung des Substanzbibliothekenträgers an den Schaft über magnetischen Schluss erfolgen kann. Besonders bevorzugt ist die Vorrichtung derart ausgestattet, dass durch Herausziehen des Schafts an seinem Kopfende aus dem Hohlkörper der mit dem Schaft magnetisch verbundene Substanzbibliothekentrager von der Stirnfläche des Hohlkörpers zurückgehalten wird und so von der Halterung gelöst wird.
Bei einer alternativen Ausführungsform ist die Stirnfläche des Hohlkörpers sowie eine Seite des Substanzbibliothekenträgers magnetisch ausgestaltet. In dieser
Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, dass die Vorrichtung derart ausgestaltet ist, dass durch Drücken des Schafts (602) an seinem Kopfende in den Hohlkörper (601) der mit der Stirnfläche (604) des Hohlkörpers (601) magnetisch verbundene Substanzbibliothekentrager (104) von der Halterung (600) gelöst wird.
Mit den vorstehend beschriebenen Vorrichtungen umfassend eine Halterung bzw. ein Handhabungsmodul mit einem Hohlzylinder und einem Schaft, z.B. einem Voll- zylinder kann der Substanzbibliothekentrager auf einfache Weise z.B. zwischen verschiedenen Reaktionsgefäßen, z.B. nach einer PCR und dem darauffolgenden Spülregime, bei der der Substanzbibliothekentrager zwischen mit verschiedenen Lösungen bzw. Spülpuffem gefüllten Standard-Reaktionsgefäßen gewechselt wird, oder in Detektionsvorrichtungen überführt werden. Zur Lösung des magnetischen Schlusses wird der Schaft z.B. durch Ziehen am Griff bzw. Bediener-Button im Hohlkörper heraufgezogen bzw. in diesen hineingedrückt. Der Substanzbibliotheken- träger wird auf diese Weise j eweils vom Handhabungsmodul gelöst.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die der Detektionsflache gegenüberliegende Fläche, die im Folgenden auch als Unterseite des Substanzbibliothekenträgers bezeichnet wird, Material, das magnetische Eigenschaften aufweist. Dies ermöglicht die magnetische Fixierang des Substanzbibliothekenträgers nach dem Prozessieren mit dafür vorgesehenen, ebenfalls magnetisch ausgestalteten Detektionsadaptem, die nachstehend detailliert beschrieben sind.
Die Unterseite kann über die gesamte Fläche des Substanzbibliothekenträgers magnetisch ausgestaltet sein. Vorzugsweise ist die Unterseite nur an den Rändern des Substanzbibliothekenträgers, insbesondere nicht in jenen Bereichen der Fläche, die innerhalb der senkrechten Projektion der Detektionsflache auf die Unterseite liegen, magnetisch ausgestaltet. Dadurch wird eine Auslesen der Substanzbibliothek bzw. der Nachweisreaktion in Durchlicht- oder Auflichtverfahren ermöglicht.
Der Substanzbibliothekträger enthält wie die Halterung insbesondere an seiner der Detektionsvorrichtung beim Auslesen des Mikroarrays zugewandten Seite vorzugsweise nicht bzw. nur gering fluoreszierendes Material wie z.B. Glas, Topas, Zeonex (Zeon Chemicals L.P., Loisville, KY, USA) und/oder Silizium, am meisten bevorzugt Glas.
Die magnetische Ausgestaltung im Rahmen der vorliegenden Erfindung, z.B. der Kontaktflächen zwischen Halterung und Substanzbibliothekentrager, des Schafts an seinem Fußende bzw. des Hohlkörpers an seiner Stirnseite bzw. des Substanzbiblio- thekenträgers an seiner Stirnseite bzw. seiner Unterseite, erfolgt beispielsweise durch Befestigen eines Magnets oder eines magnetischen Werkstoffs, wobei die Befestigung insbesondere durch Verkleben erfolgt. Alternativ kann die magnetisch auszugestaltende Fläche bzw. Seite durch geeignete Verfahren wie z.B. Sputtem oder mittels einer Magnetfolie oder durch andere Verfahren der Dünn-/Dickfilm- technologie magnetisch ausgestaltet werden. Eine Übersicht über geeignete
Verfahren zur magnetischen Ausgestaltung von Oberflächen findet sich z.B. in M. Madou; Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington D.C., USA, 1997.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Halterung über eine Datenmatrix individuell gekennzeichnet. Dazu wird bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ein Datensatz in einer Datenbank gespeichert, welcher Informationen über die Substanzbibliothek, die Durchführung der Nachweisreaktion und dergleichen enthält. So kann er insbesondere Informationen über die Anordnung der Sonden auf dem Array sowie Informationen darüber enthalten, wie die
Auswertung am vorteilhaftesten zu erfolgen hat. Der Datensatz bzw. die Datenmatrix kann femer Informationen über das Temperatur-Zeit-Regime einer ggf. durchzuführenden PCR zur Vervielfältigung der Zielmoleküle enthalten. Der so erstellte Datensatz erhält vorzugsweise eine Nummer, die in Form der Datenmatrix auf der Halterung angebracht wird. Über die in der Datenmatrix verzeichnete
Nummer kann dann ggf. beim Auslesen der Substanzbibliothek der angelegte Datensatz aufgerufen werden.
Substanzbibliotheken, die auf den Mikroarrays oder Chips immobilisiert sind, sind insbesondere Proteinbibliotheken wie Antikörper-, Rezeptorprotein- oder Membranproteinbibliotheken, Peptidbibliotheken wie Rezeptorligandenbibliotheken, Bibliotheken pharmakologisch aktiver Peptide oder Bibliotheken von Peptidhormonen, und Nukleinsäurebibliotheken wie DNA- oder RNA- Molekülbibliotheken. Besonders bevorzugt sind es Nukleinsäurebibliotheken.
Wie bereits vorstehend erwähnt, ist die Substanzbibliothek vorzugsweise in Form eines Mikroarrays, besonders bevorzugt mit einer Dichte von wenigen 100 bis mehreren 10000 Array-Spots pro cm2, auf dem Substanzbibliothekentrager bzw. der Detektionsflache immobilisiert.
Femer ist bei sämtlichen vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Vorarnplifikation des zu analysierenden Materials nicht erforderlich. Von dem aus Bakterien, Blut oder anderen Zellen extrahiertes Probenmaterial können gezielte Teilbereiche mit Hilfe einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) insbesondere in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. des Substanzbibliothekenträgers wie in DE 102 53 966 beschrieben amplifiziert und an den Träger hybridisiert werden. Dies stellt eine wesentliche Vereinfachung des Arbeitsaufwands dar.
Die erfindungsgemäße Haltevorrichtung ist somit insbesondere zur Verwendung bei der parallelen Durchführung von Amplifikation der zu analysierenden Zielmoleküle durch PCR und Nachweis durch Hybridisierung der Zielmoleküle mit dem Substanzbibliothekentrager geeignet. Dabei wird die nachzuweisende Nukleinsäure zunächst durch eine PCR amplifiziert, wobei der Reaktion zu Anfang mindestens ein Kompetitor zugesetzt wird, der die Bildung eines der beiden durch die PCR
amplifizierten Template-Stränge inhibiert. Insbesondere wird bei der PCR ein DNA- Molekül zugesetzt wird, das mit einem der zur PCR-Amplifikation des Templates verwendeten Primer um die Bindung an das Template konkurriert, und nicht enzymatisch verlängert werden kann. Die durch die PCR amplifizierten einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküle werden dann durch Hybridisierung mit einer komplementären Sonde nachgewiesen. Alternativ wird die nachzuweisende Nukleinsäure zunächst im Einzelstrangüberschuss durch eine PCR amplifiziert und durch eine anschließende Hybridisierung mit einer komplementären Sonde nachgewiesen, wobei der PCR-Reaktion zu Anfang ein Kompetitor zugesetzt wird, bei dem es sich um ein DNA-Molekül oder ein Molekül eines Nukleinsäure-
Analogons handelt, das an einen der beiden Stränge des Templates hybridisieren kann, aber nicht an den Bereich, der durch die Sonden-Hybridisierung nachgewiesen wird, und das enzymatisch nicht verlängerbar ist.
Als Kompetitor in der PCR kann jedes Molekül eingesetzt werden, das eine bevorzugte Amplifikation nur eines der beiden in der PCR-Reaktion vorhandenen Template-Stränge bewirkt. Bei Kompetitoren kann es sich daher erfindungsgemäß um Proteine, um Peptide, um DNA-Liganden, um Interkalatoren, um Nukleinsäuren oder deren Analoga handeln. Als Kompetitoren werden bevorzugt Proteine bzw. Peptide eingesetzt, die in der Lage sind, einzelsträngige Nukleinsäuren mit Sequenz- Spezifität zu binden und über die oben definierten Eigenschaften verfügen. Besonders bevorzugt werden als Sekundärstrukturbrecher Nukleinsäuremoleküle und Nukleinsäure- Analoga-Moleküle eingesetzt.
Durch anfängliche Zugabe des Kompetitors zur PCR während der Amplifikation wird die Bildung eines der beiden Template-Stränge im Wesentlichen inhibiert. "Im Wesentlichen inhibiert" bedeutet, dass im Rahmen der PCR ein ausreichender Einzelstrangüberschuss und eine ausreichende Menge des anderen Template-Strangs hergestellt werden, um einen effizienten Nachweis des amplifizierten Strangs durch die Hybridisierung zu gewährleisten. Die Amplifikation erfolgt damit nicht einer
exponentiellen Kinetik der Form 2n (mit n = Anzahl der Zyklen), sondern einer gedämpften Amplifikationskinetik der Form <2n.
Der durch die PCR erzielte Einzelstrangüberschuss beträgt gegenüber dem nicht- amplifizierten Strang den Faktor 1,1 bis 1000, bevorzugt den Faktor 1, 1 bis 300, ebenfalls bevorzugt den Faktor 1,1 bis 100, besonders bevorzugt den Faktor 1,5 bis 100, ebenfalls besonders bevorzugt den Faktor 1,5 bis 50, insbesondere bevorzugt den Faktor 1,5 bis 20 und am meisten bevorzugt den Faktor 1 bis 10.
Typischerweise wird die Funktion eines Kompetitors darin bestehen, dass er selektiv an einen der beiden Template-Stränge bindet und damit die Amplifikation des entsprechenden komplementären Stranges behindert. Als Kompetitoren kommen daher einzelsträngige DNA- oder RNA-bindende Proteine mit Spezifität für einen der beiden in einer PCR zur amplifizierenden Template-Stränge in Frage. Ebenso kann es sich um Aptamere handeln, die Sequenz-spezifisch nur an bestimmte Bereiche eines der beiden zu amplifizierenden Template-Stränge binden.
Bevorzugt werden Nukleinsäuren oder Nukleinsäure- Analoga als Kompetitoren eingesetzt. Üblicherweise werden die Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäure- Analoga dadurch als Kompetitor der PCR wirken, dass sie entweder mit einem der zur PCR verwendeten Primer um die Primer-Bindungsstelle konkurrieren oder, aufgrund einer Sequenz-Komplementarität mit einem Bereich eines nachzuweisenden Template- Strangs hybridisieren können. Bei diesem Bereich handelt es sich nicht um die Sequenz, die durch die Sonde nachgewiesen wird. Solche Nukleinsäure- Kompetitoren sind enzymatisch nicht verlängerbar.
Bei den Nukleinsäure-Analoga kann es sich z.B. um so genannte Peptid- Nukleinsäuren (peptide nucleic acids, PNA) handeln. Bei Nukleinsäure-Analoga kann es sich aber auch um Nukleinsäuremoleküle handeln, bei denen die Nukleotide über eine Phosphothioat-Bindung anstelle einer Phosphat-Bindung miteinander
verknüpft sind. Ebenso kann es sich um Nukleinsäure-Analoga handeln, bei denen die natürlich vorkommenden Zuckerbausteine Ribose bzw. Deoxyribose gegen alternative Zucker wie z.B. Arabinose oder Trehalose etc. ausgetauscht wurden. Weiterhin kann es sich bei dem Nukleinsäurederivat um „locked nucleic acid" (LNA) handeln. Weitere übliche Nukleinsäure-Analoga sind dem Fachmann bekannt.
Bevorzugt werden als Kompetitoren DNA- oder RNA-Moleküle, insbesondere bevorzugt DNA- oder RNA-Oligonukleotide bzw. deren Analoga eingesetzt.
Abhängig von der Sequenz der als Kompetitoren eingesetzten Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleinsäure-Analoga beruht die Inhibierung der Amplifikation eines der beiden Template-Stränge im Rahmen der PCR-Reaktion auf unterschiedlichen Mechanismen. Dies wird im Folgenden beispielhaft anhand eines DNA-Moleküls diskutiert.
Wenn als Kompetitor z.B. ein DNA-Molekül verwendet wird, kann dies eine Sequenz aufweisen, die mit der Sequenz eines der zu PCR verwendeten Primer zumindest teilweise derart identisch ist, dass eine spezifische Hybridisierung des DNA-Kompetitor-Moleküls mit dem entsprechenden Template-Strang unter stringenten Bedingungen möglich ist. Da das zur Kompetition verwendete DNA- Molekül in diesem Fall nicht durch eine DNA-Polymerase verlängerbar ist, kompetiert das DNA-Molekül mit dem jeweiligen Primer während der PCR- Reaktion um die Bindung an das Template. Je nach Mengenverhältnis des DNA- Kompetitor-Moleküls zum Primer kann auf diese Weise die Amplifikation des durch den Primer definierten Template-Strangs derart inhibiert werden, dass die Herstellung dieses Template-Strangs deutlich reduziert ist. Die PCR verläuft dabei nach einer exponentiellen Kinetik, die höher ist, als bei den verwendeten Kompetitor-Mengen zu erwarten wäre. Auf diese Weise entsteht ein
Einzelstrangüberschuss in einer Menge, die ausreichend für einen effizienten Nachweis der amplifizierten Target-Moleküle durch Hybridisierung ist.
Bei dieser Ausführungsform dürfen die zur Kompetition verwendeten Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleinsäureanaloga enzymatisch nicht verlängerbar sein. "Enzymatisch nicht verlängerbar" bedeutet, dass die zur Amplifikation verwendete DNA- oder RNA-Polymerase den Nukleinsäure-Kompetitor nicht als Primer verwenden kann, d.h. nicht in der Lage ist, 3' von der durch den Kompetitor definierten Sequenz den jeweiligen Gegenstrang zum Template zu synthetisieren.
Alternativ zu der oben dargestellten Möglichkeit kann das DNA-Kompetitor- Molekül auch über eine Sequenz verfügen, die zu einem Bereich des nachzuweisenden Template- Strangs komplementär ist, der nicht durch eine der Primer-Sequenzen adressiert wird, und die enzymatisch nicht verlängerbar ist. Im Rahmen der PCR wird das DNA-Kompetitor-Molekül dann an diesem Template- Strang hybridisieren und die Amplifikation dieses Stranges entsprechend blockieren.
Dem Fachmann ist bekannt, dass die Sequenzen von DNA-Kompetitor-Molekülen oder allgemein Nukleinsäure-Kompetitor-Molekülen entsprechend gewählt werden können. Wenn die Nukleinsäure-Kompetitor-Moleküle eine Sequenz aufweisen, die nicht mit der Sequenz eines der zur PCR verwendeten Primer im Wesentlichen identisch, sondern zu einem anderen Bereich des nachzuweisenden Template-Strangs komplementär ist, ist diese Sequenz so zu wählen, dass sie nicht in den Bereich der Template-Sequenz fällt, der im Rahmen der Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen wird. Dies ist deswegen notwendig, da zwischen der PCR und der Hybridisierungsreaktion keine Aufarbeitungsreaktion stattfinden muss. Würde als Kompetitor ein Nukleinsäuremolekül verwendet, das in den nachzuweisenden Bereich fällt, würde dies mit dem einzelsträngigen Target-Molekül um die Bindung an die Sonde kompetieren.
Bevorzugt hybridisieren solche Kompetitoren in der Nähe der Template-Sequenz, die durch die Sonde nachgewiesen wird. Die Positionsangabe "in der Nähe" ist dabei so zu verstehen, wie sie für Sekundärstrakturbrecher angegeben ist. Allerdings können die Kompetitoren auch in unmittelbarer Nachbarschaft der nachzuweisenden Sequenz hybridisieren, d.h. exakt ein Nukleotid von der nachzuweisenden Target- Sequenz entfernt.
Wenn als kompetierende Moleküle enzymatisch nicht verlängerbare Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Analoga verwendet werden, sind diese hinsichtlich ihrer Sequenz oder Struktur so zu wählen, dass sie nicht enzymatisch durch DNA- oder RNA- Polymerasen verlängert werden können. Bevorzugt ist das 3 '-Ende eines Nukleinsäure-Kompetitors so ausgelegt, dass es keine Komplementarität zum Template aufweist und/oder anstelle der 3 -OH-Gruppe am 3 '-Ende einen anderen Substituenten trägt.
Weist das 3 '-Ende des Nukleinsäure-Kompetitors keine Komplementarität zum Template auf, unabhängig davon, ob der Nukleinsäure-Kompetitor an eine der Primer-Bindungsstellen des Templates oder an eine der durch die PCR zu amplifizierenden Sequenzen des Templates bindet, kann der Nukleinsäure- Kompetitor wegen der fehlenden Basen-Komplementarität am 3'-Ende nicht durch die gängigen DNA-Polymerasen verlängert werden. Diese Art der Nicht- Verlängerbarkeit von Nukleinsäure-Kompetitoren durch DNA-Polymerasen ist dem Fachmann bekannt. Bevorzugt weist der Nukleinsäure-Kompetitor an seinem 3'- Ende bezüglich der letzten 4 Basen, besonders bevorzugt bezüglich der letzten 3 Basen, insbesondere bevorzugt bezüglich der letzten 2 Basen und am meisten bevorzugt bezüglich der letzten Base keine Komplementarität zu seiner Zielsequenz auf. Solche Kompetitoren können an den genannten Positionen auch nicht-natürliche Basen aufweisen, die keine Hybridisierung erlauben.
Nukleinsäure-Kompetitoren, die enzymatisch nicht verlängerbar sind, können auch eine 100%-ige Komplementarität zu ihrer Zielsequenz aufweisen, wenn sie in ihrem Rückgrat oder an ihrem 3'-Ende derart modifiziert sind, dass sie enzymatisch nicht verlängerbar sind.
Weist der Nukleinsäure-Kompetitor an seinem 3'-Ende eine andere Gruppe als die OH-Gruppe auf, handelt es sich bei diesen Substituenten bevorzugt um eine Phosphat-Gruppe, um ein Wasserstoff-Atom (Dideoxynukleotid), eine Biotingrappe oder eine Aminograppe. Diese Gruppen können durch die gängigen Polymerasen nicht verlängert werden.
Besonders bevorzugt wird bei einem derartigen Verfahren als Kompetitor ein DNA- Molekül verwendet, das mit einem der beiden zur PCR verwendeten Primer um die Bindung an das Template kompetiert und welches am 3'-Ende während der chemischen Synthese mit einem Aminolink versehen wurde. Solche Kompetitoren können 100%-ige Komplementarität zu ihrer Zielsequenz haben.
Nukleinsäure- Analoga-Kompetitoren wie z.B. PNAs müssen dagegen nicht über eine blockierte 3'-OH-Grappe oder eine nicht-komplementäre Base an ihrem 3'-Ende verfügen, da sie aufgrund des durch die Peptid-Bindung veränderten Rückgrats nicht durch die DNA-Polymerasen erkannt und somit auch nicht verlängert werden. Entsprechende andere Modifikationen der Phosphatgruppe, die durch die DNA- Polymerasen nicht erkannt werden, sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören u.a. Nukleinsäuren mit Rückgratmodifikationen wie z.B. 2' -5' Amid-Bindungen (Chan et al. (1999) J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 315-320), Sulfid-Bindungen (Kawai et al. (1993) Nucleic Acids Res., 1 (6), 1473-1479), LNA (Sorensen et al. (2002) J. Am. Chem. Soc, 124 (10), 2164-2176) und TNA (Schoning et al. (2000) Science, 290 (5495), 1347-1351).
Es können auch mehrere Kompetitoren, die an unterschiedliche Bereiche des Templates (z.B. u.a. die Primer-Bindungsstelle) hybridisieren, gleichzeitig in einer PCR eingesetzt werden. Wenn die Kompetitoren über Sekundärstrukturbrechereigenschaften verfügen, kann dadurch die Effizienz der Hybridisierang zusätzlich gesteigert werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann das DNA-Kompetitor-Molekül über eine zu einem der Primer komplementäre Sequenz verfügen. Solche z.B. Antisense-DNA- Kompetitor-Moleküle können dann je nach Mengenverhältnis zwischen Antisense- DNA-Kompetitor-Molekül und Primer dazu verwendet werden, den Primer in der PCR-Reaktion zu titrieren, so dass dieser nicht mehr mit dem jeweiligen Template- Strang hybridisiert und entsprechend nur der durch den anderen Primer definierte Template-Strang amplifiziert wird. Dem Fachmann ist bewusst, dass bei dieser Ausführungsform der Erfindung der Nukleinsäure-Kompetitor enzymatisch verlängerbar sein kann, aber nicht muss.
Wenn im Rahmen dieser Erfindung von Nukleinsäure-Kompetitoren gesprochen wird, schließt dies Nukleinsäure-Analoga-Kompetitoren mit ein, wenn sich nicht aus dem Kontext etwas anderes ergibt. Der Nukleinsäure-Kompetitor kann an den entsprechenden Strang des Templates reversibel oder irreversibel binden. Die
Bindung kann durch kovalente bzw. nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen.
Bevorzugt erfolgt die Bindung des Nukleinsäure-Kompetitors über nicht-kovalente Wechselwirkungen und ist reversibel. Insbesondere bevorzugt erfolgt die Bindung an das Template durch Ausbildung von Watson-Crick Basenpaarangen.
Die Sequenzen der Nukleinsäure-Kompetitoren richten sich in der Regel nach der Sequenz des Template-Strangs, der nachgewiesen werden soll. Bei Antisense- Primem dagegen nach den zu titrierenden Primer-Sequenzen, die aber wiederum durch die Template-Sequenzen definiert sind.
Bei der PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren handelt es sich um eine Labor- Standardmethode, mit deren vielfältigen Variations- und Ausgestaltungsmöglichkeiten der Fachmann vertraut ist. Prinzipiell ist eine PCR dadurch charakterisiert, dass das doppelsträngige Nukleinsäure-Template, üblicherweise ein doppelsträngiges DNA-Molekül, zuerst einer Hitze-Denaturierung für 5 Minuten bei 95°C unterworfen wird, wodurch die beiden Stränge voneinander getrennt werden. Nach einer Abkühlung auf die so genannte "annealing"-Temperatur (definiert durch den Primer mit der niedrigeren Schmelztemperatur) lagern sich die in der Reaktionslösung vorhandenen "forward"- und "reverse"-Primer an die zu ihrer Sequenz komplementären Stellen in den jeweiligen Template-Strängen an. Die "annealing"-Temperatur der Primer richtet sich dabei nach der Länge und Basenzusammensetzung der Primer. Sie kann aufgrund theoretischer Überlegungen kalkuliert werden. Angaben zur Kalkulation von "annealing"-Temperaturen finden sich z.B. in Sambrook et al. (vide supra).
Nach dem Annealen der Primer, das typischerweise in einem Temperaturbereich von 40-75°C, bevorzugt von 45-72°C und insbesondere bevorzugt von 50-72°C erfolgt, folgt ein Elongationsschritt, bei dem durch die Aktivität der in der Reaktionslösung vorhandenen DNA-Polymerase Desoxyribonukleotide mit dem 3'-Ende der Primer verknüpft werden . Die Identität der eingefügten dNTPs richtet sich dabei nach der Sequenz des mit dem Primer hybridisierten Template-Strangs. Da in der Regel thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt werden, läuft der Elongationsschritt üblicherweise zwischen 68-72°C ab.
Bei der symmetrischen PCR wird durch eine Wiederholung dieses beschriebenen Zyklus aus Denaturierung, Annealing der Primer und Elongation der Primer eine exponentielle Vermehrung des durch die Primersequenzen definierten Nukleinsäureabschnitts des Targets erreicht. Hinsichtlich der Pufferbedingungen bei der PCR, der verwendbaren DNA-Polymerasen, der Herstellung von
doppelsträngigen DNA-Templates, des Designs von Primem, der Wahl der Annealing-Temperatur und Variationen der klassischen PCR steht dem Fachmann zahlreiche Literatur zur Verfügung.
Dem Fachmann ist geläufig, dass als Template auch z.B. einzelsträngige RNA, wie z.B. mRNA, eingesetzt werden kann. Diese wird in der Regel vorher durch eine Reverse Transkription in eine doppelsträngige cDNA überführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Polymerase eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taq-DNA-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland sowie Qiagen, Hilden, Deutschland), Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA), Tth-DNA-Polymerase (Biozym Epicenter Technol., Madison, USA), Vent-DNA-Polymerase, Dee Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, USA), Expand-DNA-Polymerase (Röche, Mannheim, Deutschland) verwendet.
Die Verwendung von Polymerasen, die aus natürlich vorkommenden Polymerasen durch gezielte oder evolutive Veränderang optimiert worden sind, ist ebenfalls bevorzugt. Bei der Durchführung der PCR in Gegenwart des Substanzbibliothekenträgers ist insbesondere die Verwendung der Taq-Polymerase der Firma Eppendorf (Deutschland) bzw. des Advantage-cDNA-Polymerase-Mix von Clontech (Palo Alto, CA, USA) bevorzugt.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Trägersystem bereitgestellt, das insbesondere zur Detektion von Wechselwirkung zwischen Zielmolekülen und Substanzbibliotheken verwendet werden kann, wobei das System folgende Module aufweist:
a) eine Haltevorrichtung für Substanzbibliotheken, enthaltend: (i) eine Halterung für einen Substanzbibliothekentrager;
(ii) einen Substanzbibliothekentrager, der an der Halterung fixierbar ist; (iii) eine auf dem Substanzbibliothekentrager aufgebrachte
Detektionsflache, auf dem eine Substanzbibliothek immobilisiert ist; b) einen Detektionsadapter, auf den mindestens der Substanzbibliothekentrager (104) aufbringbar ist; wobei der Adapter die äußeren Abmessungen eines Mikroskop-Objektträgers aufweist.
Die äußeren Abmessungen des Detektionsadapters der erfindungsgemäßen Vorrichtung gleichen den Abmessungen eines Standard-Substanzbibliothekenträgers im Objektträgerformat. Als Detektionsgeräte können somit Standard-Fluoreszenz- Mikroskope, wie z.B. das Zeiss Axioscope-Fluoreszenz-Mikroskop (Zeiss), oder Standard-Konfokalscanner, wie z.B. Scanarray 4000 (GSI Lumonics/Packard) oder Gen Tac LS (Perkin Eimer), die üblicherweise zum Auslesen von Substanzbibliothekenträgern im Objektträgerformat benutzt werden, verwendet werden.
Die Haltevorrichtung a) des erfindungsgemäßen Trägersystems ist vorzugsweise wie die vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Haltevorrichtung für Substanzbibliotheken ausgestaltet.
Vorzugsweise ist die gesamte Halterung mit dem daran fixierten Substanzbiblio- thekenträger auf den Adapter aufbringbar.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist der Adapater Aussparungen auf, in die die Halterang mit dem Substanzbibliothekentrager oder nur der Substanzbibliothekentrager aufnehmbar sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Halterung mit dem Substanzbibliothekentrager und/oder der Substanzbibliothekentrager auf den Adapter lösbar aufgebracht. Dies kann insbesondere dadurch erfolgen, dass die Auflagefläche für die Halterang mit dem Substanzbibliothekentrager und/oder den Substanzbibliothekentrager des zum Auslesen des Substanzbibliothekenträgers angepassten Detektionsadapters und/oder das Gegenstück, d.h. die Halterung mit dem Substanzbibliothekentrager und/oder der Substanzbibliothekentrager, durch wie vorstehend beschriebene geeignete Verfahren magnetisch ausgestaltet sind. Besonders bevorzugt ist, dass die Grundflächen bzw. Aufnahmeflächen von zur Aufnahme der Halterung mit dem Substanzbibliothekentrager und/oder des
Substanzbibliothekenträgers gebildeten Aussparungen magnetisch ausgestaltet sind.
Die magnetische Ausgestaltung der Auflagefläche des Adapters kann wiederum über den gesamten Bereich der Auflagefläche oder nur an den Rändern der Auflagefläche erfolgen. Wenn Bereiche der Auflagefläche, die innerhalb der senkrechten Projektion der Detektionsflache auf die Auflagefläche liegen, nicht magnetisch ausgestaltet sind, ermöglicht dies die Detektion in Durchlicht- oder Auflichtverfahren.
Bei alternativen Ausführungsformen ist die Halterung mit dem Substanzbiblio- thekenträger und/oder der Substanzbibliothekentrager auf den Adapter auf andere Weise lösbar bzw. reversibel aufgebracht. So beruht eine derartige Ausführungsform auf der Adhäsion zwischen Glas und Silikon, wie z.B. Sylgard 184 (Dow Coming, Michigan, USA). Beispielsweise kann zu diesem Zweck die Auflagefläche für die Halterung mit dem Substanzbibliothekentrager und/oder den Substanzbibliotheken- träger des zum Auslesen des Substanzbibliothekenträgers angepassten
Detektionsadapters mit einer Silikonschicht versehen sein, wenn eine Halterung aus Glas bzw. ein Substanzbibliothekentrager aus Glas eingesetzt wird.
Der Detektionsadapter besteht vorzugsweise aus optisch durchlässigen und/oder nicht fluoreszierenden Materialien. Bei diesen Materialien handelt es sich z.B. um
Glas, Borofloat 33 (Schott, Zwiesel, Deutschland), Quarzglas, einkristallines CaF2 (Schott), einkristallines Silizium, Zeonex, Phenylmethylmethacrylat und/oder Polycarbonat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Auflagefläche des Adapters für die Halterang mit dem Substanzbibliothekentrager und/oder den Substanzbibliothekentrager parallel zu der Detektionsflache bzw. zur Fokussierebene des Detektionsgeräts ausgerichtet.
Dies kann beispielsweise wie folgt gewährleistet werden: So können Flansche an der Halterung zur parallelen Ausrichtung des Substanzbibliothekenträgers mit der Halterung und seiner für das Aufbringen in den Detektionsadapter bestimmten Auflagefläche dienen. Die im Detektionsadapter für die Halterung vorgesehene Auflagefläche ist parallel mit der Fokussierebene des Detektionsgeräts ausgerichtet. Dadurch wird beim Aufbringen der Halterung und/oder des Substanzbibliothekenträgers auf bzw. beim Einlegen in den Detektionsadapter eine ebene Ausrichtung der Detektionsflache in Bezug auf die Fokussierebene erreicht. Durch die parallele Anordnung der Auflagefläche des Detektionsadapters mit der zu detektierenden Fläche des Substanzbibliothekenträgers wird ein Verkippen der auszulesenden Fläche in Bezug auf die Fokussierebene vermieden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mehrere Halterungen und/oder Substanzbibliothekentrager, vorzugsweise mehr als vier, besonders bevorzugt mindestens acht und bis zu zehn oder mehr Halterungen und/oder Substanz- bibliothekenträger auf dem Adapter aufbringbar. Besonders bevorzugt können auf dem Adapter Substanzbibliothekentrager unterschiedlicher Geometrien, wie z.B. rechteckige oder runde Substanzbibliothekentrager, aufgebracht werden. Somit kann die innere Form des Detektionsadapters, insbesondere zur Aufnahme der Halterung und/oder des Substanzbibliothekenträgers vorgesehene Aussparungen, an
unterschiedliche Geometrien bzw. Formate von Substanzbibliothekenträgem angepasst werden.
Eine lösbare, vorzugsweise magnetische Fixierang des Substanzbibliothekenträgers an die Halterang ermöglicht das Aufbringen lediglich des Substanzbibliothekenträgers auf dem Adapter. Dadurch werden der räumliche Ansprach für die auszulesenden Substanzbibliothekentrager minimiert und räumliche Limitierungen wie z.B. beim Auslesen von Substanzbibliothekenträgem in Konfokalscanner- Geräten umgangen. Somit können femer mehrere Substanzbibliothekentrager gleichzeitig, d.h. in einem Arbeitsschritt, durch Aufbringen auf einen
Detektionsadapter detektiert werden. Das gleichzeitige Auslesen von z.B. mehreren unterschiedlich prozessierten Substanzbibliothekenträgem in einem Detektionsadapter ermöglicht eine Verbesserung der Vergleichbarkeit der erhaltenen Ergebnisse.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Substanzbibliothekentrager auf einem wie vorstehend beschriebenen Trägerstreifen fixiert, insbesondere geklebt. Um das Auslesen der zu detektierenden Fläche sowohl im Durchlicht- als auch im Auflichtverfahren zu ermöglichen, ist der Trägerstreifen unter der Detektionsflache mit einem Durchbruch versehen. Bei dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Trägerstreifen einschließlich des auf ihm fixierten Substanzbibliothekenträgers auf dem Detektionsadapter aufbringbar. Nach der Prozessierang, insbesondere der Durchführung der Nachweisreaktion sowie ggf. einer PCR sowie diversen Waschschritten, wird die Halterang bzw. der Trägerstreifen mit dem Substanzbibliothekentrager getrocknet und anschließend auf die dafür vorgesehene Auflagefläche des Detektionsadapters gelegt. Das Auslesen der Substanzbibliothek erfolgt in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben. Die äußeren Abmessungen des Detektionsadapters gleichen auch bei dieser Ausführangsform den Abmessungen eines Standard-Substanzbibliothekenträgers im Objektträgerformat.
Die vorstehend beschriebenen Vorrichtungen werden erfindungsgemäß zur Durchführung von Mikroarray-basierten Tests, insbesondere zur Durchführung von Hybridisierungstests, aber auch zur Durchführung einer PCR, einer LCR oder einer LDR verwendet. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Vorrichtungen zur gleichzeitigen Durchführung eines Mikroarray-basierten Tests und einer PCR verwendet werden.
Im Folgenden wird die Erfindung an konkreten Beispielen erläutert. Diese sind nicht in einschränkender Weise auszulegen.
Ausführungsbeispiele:
Ausführungsbeispiel 1:
Vergleichende Hybridisierang von durch symmetrische PCR und durch erfindungsgemäße asymmtrische PCR mit abgestuften Kompetitor- Anteilen erzeugten PCR-Produkten gegen immobilisierte Sonden.
Amplifikationskinetik der asymmetrischen PCR:
In einem initialen Experiment wurde zunächst untersucht, in welchem Ausmaß die Produktbildung bei der PCR vom Kompetitor-Anteil abhängt. Dazu wurden zunächst PCR-Reaktionen mit identischen Primer-Konzentrationen, aber unterschiedlichem Kompetitor-Anteil durchgeführt.
Bei dem Kompetitor handelte es sich um ein DNA-Oligonukleotid, das die gleiche Sequenz wie der reverse-Primer der PCR aufwies, an der 3 '-OH-Gruppe am 3 '-Ende jedoch mit einer NH2-Gruppe modifiziert war. Die Amino-Modifaktion wurde
während der chemischen Synthese des Oligonukleotids in das Molekül integriert (3'- Amino-Modifier C7, Glen Research Corp., Sterling, VA, USA).
PCR-Reaktionen:
Der forward-Primer 16sfDlCy3 wies folgende Sequenz auf und war am 5'-Ende mit Cy3 markiert.
5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
Der reverse-Primer wies folgende Sequenz auf:
5 '-TACCGTC ACCATAAGGCTTCGTCCCTA-3 '
Es wurden PCR- Ansätze mit unterschiedlichen Kompetitor- Anteilen hergestellt. Dabei wies jeder PCR- Ansatz folgende Zusammensetzung und Endkonzentrationen auf.
1 x PCR-Reaktionspuffer (Eppendorf Hamburg, Deutschland) 200 nM forward-Primer 16sfD 1 Cy3 , am 5 ' -Ende mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Cy3 markiert (Amersham-Pharmacia,
Freiburg, Deutschland) 200 μM dNTPs
0,05 U/μl Taq-Polymerase (Eppendorf Hamburg, Deutschland)
2 ng/μl cliromosomale DNA Corynebacterium glutamicum
zusätzlich enthielten:
Reaktion 1: 200 nM reverse Primer 16s Ra (entsprechend 0 % Kompetitor, symmetrischePCR)
Reaktion 2: 0 nM reverse Primer 16s Ra
200 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 100 %
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 3: 10 nM reverse Primer 16s Ra
190 nM Kompetitor 16s Ra 3 ' NH2 (entsprechend 95 %
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 4: 20 nM reverse Primer 16s Ra 180 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 90 %
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 5: 40 nM reverse Primer 16s Ra 160 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 80 %
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 6: 60 nM reverse Primer 16s Ra 140 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 70 %
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 7: 100 nM reverse Primer 16s Ra
100 nM Kompetitor 16s Ra 3 ' NH2 (entsprechend 50 %
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 8: 140 nM reverse Primer 16s Ra
60 nM Kompetitor 16s Ra 3 ' NH2 (entsprechend 30 %
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Das Gesamtvolumen jedes PCR- Ansatzes betrag 25 μl. Die Reaktionen wurden nach folgendem Temperaturregime durchgeführt:
Initiale Denaturierang: 2 min 95°C
25 Zyklen: 30 sec 95°C
30 sec 60°C
30 sec 72°C
Terminale Elongation: 7 min 72°C
Die Reaktionsansätze wurden in LightCycler-Küvetten (Röche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) gefüllt und die PCR-Reaktion im Light Cycler (Röche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Die Produktbildungskinetik wurde nach den Herstellerangaben aufgenommen.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 14 (Abb. 14) dargestellt. Die Menge an gebildetem PCR-Produkt ist dabei als Light cycler units in Abhängigkeit von der Zyklenzahl angegeben.
Es ist deutlich zu erkennen, dass mit steigendem Kompetitor-Anteil die Effizienz der PCR und entsprechend die Produkt- Ausbeute sinkt.
Vergleich der Hybridisierungssignale in Abhängigkeit vom Kompetitor-Anteil:
Im Folgenden wurde die Produktbildung und das Hybridisierangssignal bei symmetrischer und asymmetrischer PCR-Amplifikation mit unterschiedlichen Kompetitor- Anteilen zu einem bestimmten Zeitpunkt (Abschluss der Reaktion nach 25 Zyklen) verglichen.
Es wurden die gleichen Primer bzw. Kompetitoren wie oben angegeben eingesetzt.
PCR-Reaktionen:
Es wurden PCR-Ansätze mit unterschiedlichen Kompetitor- Anteilen hergestellt. Dabei wies jeder PCR- Ansatz folgende Zusammensetzung und Endkonzentrationen auf.
lx PCR-Reaktionspuffer (Eppendorf Hamburg, Deutschland)
200 nM forward-Primer 16sfD 1 Cy3 , am 5 ' -Ende mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Cy3 markiert (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) 16sfDlCy3 200 μM dNTPs
0,05 U/μl Taq-Polymerase (Eppendorf Hamburg, Deutschland) 2 ng/μl chromosomale DNA Corynebacterium glutamicum
zusätzlich enthielten:
Reaktion 1 : 200 nM reverse Primer 16s Ra (entsprechend 0% Kompetitor, symmetrischePCR)
Reaktion 2: 80 nM reverse Primer 16s Ra
120 nM Kompetitor 16s Ra 3 ' NH2 (entsprechend 60%
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 3: 40 nM reverse Primer 16s Ra 160 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 80%
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 4: 20 nM reverse Primer 16s Ra 180 nM Kompetitor 16s Ra 3 ' NH2 (entsprechend 90%
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Die Reaktionen wurden nach dem gleichen Temperaturprotokoll wie oben durchgeführt:
Das Gesamtvolumen jeder PCR betrag 25 μl. Jeweils 5μl der PCR- Ansätze wurden auf einem 2% Agarosegel analysiert (Abb. 15). Man erkennt, dass mit steigendem Kompetitor-Anteil die Menge an doppelsträngiger DNA ab- und an einzelsträngiger DNA zunimmt.
Anschließend wurden die restlichen 20 μl der PCR-Reaktionen mittels Quiaquick PCR-Purification-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben gereinigt. Die Elution der PCR-Fragmente erfolgte jeweils in 50 μl Wasser. Das Eluat wurde im Vakuum auf 10 μl eingeengt.
Immobilisierung der Hybridisierungssonden:
Auf mit einem Epoxid beschichteten Glasflächen der Größe 3x3 mm („Chip") wurde an zwei definierten Stellen („Spot") ein Amino-modifiziertes Oligonukleotid mit
einer Länge von 18 Nukleotiden der Sequenz 5 '-NH2- GTTTCCCAGGCTTATCCC-3') kovalent immobilisiert.
Dazu wurden 0,1 μl einer 5 μM Lösung des Oligonukleotids in 0,5 M Phosphatpuffer auf der Glasfläche abgelegt und schließlich bei 37°C eingetrocknet. Die kovalente Verknüpfung der abgelegten Oligonukleotide mit den Epoxid-Gruppen auf der Glasoberfläche erfolgte durch 30-minütiges Backen der Chips bei 60°C. Anschließend wurden die Chips kräftig mit destilliertem Wasser gespült und danach 30 min in 100 mM KC1 gewaschen. Nach weiterem kurzen Spülen in 100 mM KC1 und anschließend destilliertem Wasser wurden die Chips 10 min bei 37°C getrocknet.
Hybridisierung:
2 μl der gereinigten PCR-Aliquotes wurden in 50 μl 6x SSPE, 0,1% SDS aufgenommen (Sambrook et al., vide supra). Zu jeder Hybridisierangslösung wurde ein Chip gegeben. Die Reaktion wurde 5 min bei 95 °C denaturiert und anschließend für 1 h bei 50°C inkubiert. Im Anschluß erfolgten 3 aufeinander folgende 5-minütige Waschschritte bei 30°C in 2x SSC, 0,1% SDS, bei 30°C in 2x SSC und bei 20°C in 0,2x SSC (Sambrook et al. vide supra). Die Chips wurden anschließend im Vakuum getrocknet.
Detektion der Hybridisierungssignale:
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte unter einem Zeiss
Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit betrug 2000 ms. (Abb. 15)
Ergebnisse:
Es zeigte sich, dass die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten PCR- Produkte trotz deutlich geringerer Produktmenge deutlich erhöhte Hybridisierungssignale zeigen.
Bei Zunahme der Kompetitorkonzentration im Bereich von 0-90%» Kompetitoranteil ist eine Zunahme des Hybridisierungssignales zu beobachten, obwohl die Gesamtmenge des Produktes abnimmt. Überraschenderweise wurden die besten Signale beim höchsten Kompetitor-Anteil (90%) und damit der geringsten Menge an einzelsträngiger DNA erzielt.
Ausführungsbeispiel 2:
Es wurde eine quantitative Analyse des Hybridisierungssignals in Abhängigkeit vom Kompetitor-Anteil durchgeführt. Für die PCR wurden die gleichen forward- und reverse-Primer und der gleiche Kompetitor wie in Beispiel 1 verwendet.
Es wurden PCR- Ansätze mit folgender Zusammensetzung und Endkonzentrationen hergestellt:
alle Reaktionen enthielten:
lx PCR-Reaktionspuffer (Eppendorf Hamburg, Deutschland)
200 nM forward-Primer 16sfD 1 Cy3 , am 5 ' -Ende mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Cy3 markiert (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) 200 μM dNTPs 0,05 U/μl Taq-Polymerase (Eppendorf Hamburg, Deutschland)
2ng/μl chromosomale DNA Corynebacterium glutamicum
zusätzlich enthielten:
Reaktion 1: 266 nM reverse-Primer 16s Ra, kein Kompetitor (symmetrische PCR)
Reaktion 2: 133 nM reverse-Primer 16s Ra
133 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 50%
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 3: 40 nM reverse-Primer lös Ra 160nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 75%
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Reaktion 4: 33 nM reverse Primer 16s Ra 233 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2 (entsprechend 87,5%
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Die Reaktionen wurden jeweils in Aliquots von 25 μl aufgeteilt. Das
Temperaturprotokoll war identisch zu Beispiel 1. Jeweils ein Aliquot von Reaktion 1-4 wurde nach 15, 20, 25, 30 bzw. 35 PCR-Zyklen entnommen.
Jeweils 5 μl jedes Aliquots wurden auf einem 2% Agarosegel analysiert. Die Gelanalyse zeigte, dass bei geringer Zyklenzahl bei symmetrischer PCR deutlich mehr PCR-Produkt gebildet wurde als bei der asymmetrischen PCR-Reaktion
Abbildung 16 (Abb. 16) zeigt ein Agarosegel, auf dem parallel 5 μl-Proben von Reaktionen mit einem Kompetitor-Anteil von 50%) bzw. 87,5%> analysiert wurden.
Die Reaktionen waren jeweils nach der angegebenen Zyklenzahl gestoppt worden. Man erkennt, dass bei 87,5% Kompetitor-Anteil weniger Produkt erzeugt wird.
Immobilisierung der Hybridisierungssonden:
Auf mit einem Epoxid beschichteten Glasflächen der Größe 3x3 mm („Chip") wurde an zwei definierten Stellen („Spot") ein aminomodifiziertes Oligonukleotid mit einer Länge von 18 Nukleotiden der Sequenz 5'-NH2- GTTTCCCAGGCTTATCCC-3 ') kovalent immobilisiert.
Dazu wurden 0,1 μl einer 5 μM Lösung des Oligonukleotids in 0,5 M Phosphatpuffer auf der Glasfläche abgelegt und schließlich bei 37°C eingetrocknet. Die kovalente Verknüpfung der abgelegten Oligonukleotide mit den Epoxid-Grappen auf der Glasoberfläche erfolgte durch 30-minütiges Backen der Chips bei 60°C. Anschließend wurden die Chips kräftig mit destilliertem Wasser gespült und danach 30 min in 100 mM KC1 gewaschen. Nach weiterem kurzen Spülen in 100 mM KC1 und anschließend destilliertem Wasser wurden die Chips 10 min bei 37°C getrocknet.
Hybridisierung:
Weitere 5 μl der Reaktion wurden mit 50 μl 6x SSPE, 0,1 %> SDS gemischt und in Hybridisierungsexperimenten eingesetzt (Sambrook et al. vide supr ). Zu jeder Hybridisierungslösung wurde ein Chip gegeben. Die Reaktion wurde 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend für 1 h bei 50°C inkubiert. Im Anschluss erfolgten 3 aufeinander folgende 5 minütige Waschschritte bei 30°C in 2x SSC, 0,1% SDS, bei 30°C in 2x SSC und bei 20°C in 0,2x SSC. Die Chips wurden anschließend im Vakuum getrocknet.
Detektion der Hybridisierungssignale:
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte unter einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit betrug 2000 ms.
Die Intensität der Hybridisierungssignale wurde gemessen, indem die Signalstärke (gemessene Graustufe) über den gesamten Bereich der Spots gemittelt wurde. Von diesem Wert wurde der über den Spot-freien Bereich (Hintergrund) gemittelte Grauwert abgezogen. Die so errechneten Signalintensitäten wurden normiert (höchster Wert = 100%o) und gegen die Zyklenzahl aufgetragen (Abb. 17).
Ergebnisse:
Abb. 17 zeigt, dass mit PCR-Produkten aus asymmetrischen PCR-Reaktionen über den gesamten untersuchten Bereich von 15 bis 35 Zyklen ein stärkeres Hybridisierungssignal erreicht wird, obwohl die Gelanalyse (Abb. 16) für diese Reaktionen eine geringere Produktmenge insbesondere nach 15 und 20 Zyklen zeigte.
Das stärkste Signal wurde überraschenderweise mit dem höchsten Kompetitor-Anteil erreicht, obwohl hier die geringste Menge an einzelsträngigen Target-Molekülen vorhanden war. Die Hybridisierung von PCR-Produkten, die durch asymmetrische PCR mit unterschiedlichem Kompetitor-Anteil hergestellt wurden, zeigten somit ein bis zu 20-fach höheres Hybridisierungssignal über den gesamten messbaren Bereich der Amplifikation.
Ausführangsbeispiel 3:
Nachweis des Bildung eines Einzelstrangüberschusses bei asymmetrischer PCR
Es wurden zwei PCR- Ansätze (je 150 μl) folgender Zusammensetzung und Endkonzentrationen hergestellt.
Der forward- und reverse-Primer sowie der Kompetitor hatten die gleichen Sequenzen wie in Beispiel 1. Allerdings war der forward-Primer am 5 '-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff IRD 800 markiert.
Beide Reaktionen enthielten:
lx PCR-Reaktionspuffer (Eppendorf Hamburg, Deutschland)
200nM forward-Primer 16sfDlIRD, am 5 '-Ende mit dem
Fluoreszenzfarbstoff IRD 800 markiert (MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) 160 μM dNTPs 0,1 U/μl Taq-Polymerase (Eppendorf Hamburg, Deutschland)
2 ng/μl chromosomale DNA Corynebacterium glutamicum ATCC
13032
zusätzlich enthielten:
Reakion 1 : 200 nM reverse Primer 16s Ra, kein Kompetitor (symmetrische
PCR)
Reaktion 2: 20 nM reverse Primer 16s Ra
180 nM Kompetitor 16s Ra 3 ' NH2 (entsprechend 90%
Kompetitor, asymmetrische PCR)
Die Reaktionen wurden in 6 Aliquots von 25μl aufgeteilt (1/a - 1/f bzw. 2/a - 2/f) und nach folgendem Temperaturprtokoll inkubiert:
Initiale Denaturierang 2 min 95°C
35 Zyklen 30 sec 95°C
30 sec 50-70°C entspricht für: Reaktion a: 50°C Reaktion b: 54°C Reaktion c: 60 °C Reaktion d: 63 °C Reaktion e: 67°C Reaktion f: 70°C
30 sec 72°C
Terminale Extension 7 min 72°C
Dabei waren die annealing-Temperaturen für die Reaktionen e und f so gewählt, dass ein Annealing des Kompetitors bzw. des reverse-Primers nicht stattfinden sollte, da sie über der Schmelztemperatur dieser Oligonukleotide lag.
Jeweils 2 μl einer 1:10- Verdümiung jedes Aliquots wurden auf einem 3,5%-igen nativen Polyacrylamidgel in einem IΛCOR-Sequencer (Typ, Firma) analysiert. Das Gel hatte eine Stärke von 1 mm. Die Elektrophorese erfolgte bei Begrenzung der Spannung auf 200 V, und der Leistung auf 5 W. Es erfolgte weder eine aktive Erwärmung noch eine aktive Kühlung des Gels (Die Regelgröße für die Temperatur wurde auf 15°C gesetzt).
Die Datenaufhahme erfolgte mit einer Tiefe von 16 Bit, Scan Speed 1 und Signal Filter 3.
Während der PCR-Amplifikation wird nur einer der beiden Stränge mit dem IRD- Farbstoff markiert. Nur dieser ist bei der Gelanalyse im LICOR-Sequenzer sichtbar. Da ein natives Gel verwendet wurde, werden die PCR-Produkte nicht nur nach Länge, sondern auch nach strukturellen Eigenschaften getrennt.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in Abb. 18 gezeigt. Bei der Gelanalyse der symmetrischen Reaktionen wird erwartungsgemäß für alle Reaktionen, in denen eine Amplifikation erfolgte, nur ein dominierendes Produkt nachgewiesen. Dabei handelt es sich um das doppelsträngige PCR-Produkt. Im Gegensatz dazu werden bei allen detektierbaren asymmetrischen Reaktionen 3 dominierende Produkte nachgewiesen. Neben der dem doppelsträngigen Template werden zwei weitere Banden erhalten, die verschiedenen Strukturen des markierten Einzelstranges entsprechen. Die Gelanalyse zeigt damit, dass die asymmetrische Amplifikation zu einem Einzelstrangüberschuss führt.
Ausführungsbeispiel 4:
Erhöhung des Hybridisierungssignals durch Zugabe von Sekundär Strukturbrechern
Es wurde eine asymmetrische Multiplex-PCR-Reaktion durchgeführt, die folgende Zusammensetzung und Endkonzentrationen aufwies. Als Template wurde genomische DNA verwendet, die das humane cyp2D6 Gen enthielt und deren Genotyp bekannt war:
1 μl cyp2D6-Fusionsprimer Mix bestehend aus:
0,5 μM uniA_cyp2D6_l/2f
(5'GGAGCACGCTATCCCGTTAGACCAGAGGAGCCCATTTGGTAGTGAGG CAGGT3')
1 μM uniA_cyp2D6_l/2f _F2
(5 'GGAGCACGCTATCCCGTTAGACTGGACGCCGGTGGTCGTGCTCAA3 ')
1,5 μM uniA_cyp2D6_3/4f (5 'GGAGCACGCTATCCCGTTAGACCACGCGCACGTGCCCGTCCCA3 ')
1 μM uniA_cyp2D6_5/6f_kF
(5 ' GGAGCACGCTATCCCGTTAGACCGCTGGCTGGCAAGGTCCTACGC3 ') 0,8 μM uniA_cyp2D6_8/9f_kF
(5'GGAGCACGCTATCCCGTTAGACGCCCCGGCCCAGCCACCAT3')
1 μM uniB_cyp2D6_l/2r (5'CGCTGCCAACTACCGCACATGGGTCCCACGGAAATCTGTCTCTGT3')
0,5 μM uniB_cyp2D6_l/2r_Fl
(5 ' CGCTGCCAACTACCGCACATGCCTCTGCCGCCCTCCAGGACCTC3 ')
1,5 μM uniB_cyp2D6_3/4r (5'CGCTGCCAACTACCGCACATGCTCTCGCTCCGCACCTCGCGCAGA3')
1 μM uniB_cyp2D6_5/6r
(5'CGCTGCCAACTACCGCACATGCCCTCGGCCCCTGCACTGTTTCCCAGA
3')
0,8 μM uniB_cyp2D6_8/9r_kF
(5 'CGCTGCCAACTACCGCACATGTGGCTAGGGAGCAGGCTGGGGACT3 ')
200 μM dNTPs lx Advantage PCR Reaction buffer (Clontech, Palo Alto, USA)
0,1 U/μl Advantage DNA Polymerase (Clontech, Palo Alto, USA)
1 μl humane DNA-Probe KDL 36 (0,71 μg/μl) (Urs Meyer,
Biozentram Basel) Genotyp: homozygot cyp2D6 C2938T
Das Gesamtvolumen der PCR betrag 25 μl. In der nun folgenden ersten Phase der zweiphasigen Amplifikationsreaktion erfolgte die Inkubation unter folgenden Bedingungen:
Initiale Denaturierung: 95°C 10 min
25 Zyklen: 95°C 35 sec
65°C 50 sec
72°C 70 sec
Kühlen auf 4°C
Im Verlauf der Reaktion wurden die Primer aufgebraucht und alle Fragmente der Multiplex-PCR auf ein einheitliches molares Niveau amplifiziert. In dieser ersten Phase erfolgte die Amplifikation mit Primem, deren 3 '-Ende Spezifität für die Targetfragmente aufwiesen, deren 5 '-Enden hingegen für alle forward-Primer und für alle reverse-Primem eine einheitliche Sequenz besaßen.
In der nun folgenden zweiten Phase der Reaktion wurden Primer zugegeben, die komplementär zu den einheitlichen Sequenzen waren. Gleichzeitig wurde ein Kompetitor zugegeben, der die gleiche Sequenz wie der jetzt eingesetzte reverse- Primer besaß, aber eine NH2-Modifikation an der 3 '-OH-Gruppe am 3 '-Ende aufwies. Dadurch erfolgte die Reaktion in der zweiten Phase asymmetrisch.
Der universelle forward-Primer uniB hatte folgende Sequenz und war mit einer Cy3- Gruppe am 5 '-Ende markiert:
5'-GGAGCACGCTATCCCGTTAGAC-3'
Der universelle reverse-Primer uniA hatte folgende Sequenz:
5'-CGCTGCCAACTACCGCACATG-3'
Die zweite Phase wurde mit der Zugabe von 25 μl folgenden Reaktionsmixes gestartet:
240 nM Primer uniA 560 nM Kompetitor uniA 3 'NH2
800 nM Primer uniB 5'Cy3 (Amersham-Pharmacia, Freiburg,
Deutschland) lx Advantage PCR Reaction buffer (Clontech, Palo Alto,
USA) 0,4 U/μl Advantage DNA Polymerase (Clontech, Palo Alto,
USA) 400 μM dNTPs
Das Gesamtvolumen der PCR-Reaktion betrag 25 μl. Die Reaktion wurde in der zweiten Phase folgendermaßen inkubiert:
Initiale Denaturierang: 95°C 30 sec
20 Zyklen: 95°C 35 sec
65°C 50 sec
72°C 90 sec terminale Elongation : 72°C 7 min
Array-Belegung
Es wurde ein Sondenarray durch in situ-Synthese nach dem micro-wet-Printing- Verfahren (Clondiag Chip Technologies) hergestellt. Das Array bestand aus 1024 Sonden-Elementen von 64x64 μm Größe. Diese Spots repräsentierten zwei unterschiedliche Oligonukleotide: C2938T 5 ' AATGATGAGAACCTGTGC ATAGTGGTG 3 ' C2938 WT 5' AATGATGAGAACCTGCGCATAGTGGTG 3'
Die Sonden wurden nach dem in Abbildung 19 dargestellten Muster angeordnet. Schwarze Felder entsprechen der Sonde C2938T, graue Felder entsprechen der Sonde C2938 WT.
Hybridisierung:
Es wurden 5 Hybridisierungsansätze angefertigt, indem jeweils 5 μl der Multiplex- PCR-Reaktionen in 60 μl SSPE, 0,1% SDS aufgenommen wurden. Es wurden die Strukturbrecher
C2938TBL3 (5 '-GGCTGACCTGTTCTCTGCCG-3 ') und C2938TBL5 (5 ' -GGAACCCTGAGAGC AGCTTC-3 ')
in verschiedenen molaren Konzentrationen zugegeben:
Reaktion 1 keine Strukturbrecher Reaktion 2 je 1,5 nM Strukturbrecher Reaktion 3 je 15 nM Strukturbrecher Reaktion 4 je 150 nM Strukturbrecher
Reaktion 5 je 1,5 μM Strukturbrecher
Zu jeder Reaktion wurde ein Array mit dem oben beschriebenen Layout gegeben. Die Hybridisierungsreaktionen wurden für 5 min bei 95 °C denaturiert und anschließend für 1 h bei 50°C inkubiert. Im Anschluss erfolgten drei aufeinander folgende 5-minütige Waschschritte bei 30°C in 2x SSC, 0,1% SDS, bei 30°C in 2x SSC und bei 20°C in 0,2x SSC. Die Chips wurden entnommen und anschließend im Vakuum getrocknet.
Detektion der Hybridisierungssignale:
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte unter einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit betrug 5000 ms. (Abb. 20)
Ergebnisse:
Die Hybridisierungsergebnisse zeigen folgendes Muster: Die Sonden für die Mutation C2938T zeigen starke Signale, während die Wildtyp-Sonden sowie die Deletionsvarianten deutlich geringere Signale zeigen. Dies entspricht den Erwartungen. Auffällig ist, dass die Signale durch Zugabe der Strukturbrecher weiter verstärkt werden. Damit ist eine Kombination von Kompetitor und Sekundär Strukturbrecher besonders nützlich, um gute Signalstärken zu erreichen.
Ausführungsbeispiel 5:
Zugabe eines Sekundärstrukturbrechers, der in Nachbarschaft mit zu den Sonden komplementären Sequenzabschnitten des Targets hybridisiert.
Es wurde eine asymmetrische Multiplex-PCR-Reaktion durchgeführt, die identisch zu der des Beispiels 4 war. Es fanden Arrays mit dem gleichen Layout wie im vorangehenden Beispiel 4 beschrieben Verwendung.
Hybridisierung:
Es wurden 4 Hybridisierungsansätze angefertigt, indem jeweils 5 μl der Multiplex- PCR-Reaktionen in 60 μl SSPE, 0,1% SDS aufgenommen wurden. Die Hybridisierungsansätze unterschieden sich hinsichtlich der Zugabe der Strakturbrecher
C2938TBL3 (5'-GGCTGACCTGTTCTCTGCCG-3') bzw. C2938TBL5 (5'-GGAACCCTGAGAGCAGCTTC-3').
Reaktion 1 : keine Strukturbrecher
Reaktion 2 : 1 ,5 μM Strukturbrecher C2938TBL3
Reaktion 3 : 1 ,5 μM Strukturbrecher C2938BL5
Reaktion 4: je 1,5 μM Strukturbrecher C2938TBL3 und C2938TBL5
Zu jeder Reaktion wurde ein Array mit dem oben beschriebenen Layout gegeben. Die Hybridisierungsreaktionen wurden für 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend für 1 h bei 50°C inkubiert. Im Anschluss erfolgten drei aufeinander folgende 5-minütige Waschschritte bei 30°C in 2x SSC, 0,1% SDS, bei 30°C in 2x SSC und bei 20°C in 0,2x SSC. Die Chips wurden entnommen und anschließend im Vakuum getrocknet.
Detektion der Hybridisierungssignale:
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte unter einem Zeiss
Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit betrag 10000 ms (Abb. 21)
Ergebnisse:
Die Hybridisierungsergebnisse zeigen folgendes Muster: Die Sonden für die Mutation C2938T zeigen starke Signale, während die Wildtyp-Sonden sowie die Deletionsvarianten deutlich geringere Signale zeigen. Dies entspricht den
Erwartungen. Auffällig ist, dass bereits bei Zugabe eines der beiden Strukturbrecher deutlich erhöhte Signalen erzielt werden.
Ausführungsbeispiel 6:
Einfluss von Strukturbrechern auf die Match-Mismatch-Diskriminierung
Sekundärstrukturbrecher sind im vorliegenden Beispiel Oligonukleotide, welche bei der Hybridisierung einer doppelsträngigen Nukleinsäure in der Nähe zur eigentlichen Hybridisierangssonde binden. Vermutlich wird der Doppelstrang der Nukleinsäure an der betreffenden Stelle aufgelöst und die Hybridisierangssonde kann besser binden. Wie im nachfolgenden Anwendungsbeispiel gezeigt wird, kommt es dadurch zu einer Verstärkung des Hybridisierungssignals um den Faktor 3-5 ohne Beeinflussung der Spezifität der Reaktion.
Vorbereitung des Array s:
Auf einem epoxidierten Glaswafer der Firma Schott wurden 397 DNA-Sondenarrays mit je 15 Oligonukleotidsonden unterschiedlicher Sequenz und Länge mittels des micro wet printing-Verfahrens (Clondiag Chip Technologies, Jena, Deutschland) synthetisch erzeugt. Alle Sonden waren komplementär zu einer Teilsequenz des Exons 5/6 des humanen cyp2D6-Gens und unterschieden sich lediglich im mittleren Sondenbereich durch Einfügung einiger verschiedener Mutationen.
Nach der Synthese wurde der Wafer in 3,4 x 3,4 mm große Chips zersägt, wobei jeder dieser Chips ein Sondenarray mit allen 15 Oligonukleotiden in unterschiedlichen Redundanzen enthielt. Insgesamt bestand jedes Array aus 256 Spots. Diese waren in 16 identischen Feldern von 16 Spots angeordnet. In den einzelnen Spots wurden folgende Sequenzen aufgebaut.
C2938T AATGATGAGAACCTGTGCATAGTGGTG
C2938TC AATGATGAGAACCTGTCGCATAGTGGTG
C2938GT AATGATGAGAACCTGGTGCATAGTGGTG
C2938GTC AATGATGAGAACCTGGTCGCATAGTGGTG
C2938G AATGATGAGAACCTGGGCATAGTGGTG
C2938GC AATGATGAGAACCTGGCGCATAGTGGTG
C2938d AATGATGAGAACCTGGCATAGTGGTG
C2938CT AATGATGAGAACCTGGTGCATAGTGGTG
C2938CTC AATGATGAGAACCTGCTCGCATAGTGGTG
C2938 AATGATGAGAACCTGCGCATAGTGGTG
C2938CC AATGATGAGAACCTGGCGCATAGTGGTG
C2938AT AATGATGAGAACCTGATGCATAGTGGTG
C2938ATC AATGATGAGAACCTGATCGCATAGTGGTG
C2938A AATGATGAGAACCTGAGCATAGTGGTG
C2938AC AATGATGAGAACCTGACGCATAGTGGTG
Die Anordnung der Sonden auf dem Array erfolgte wie in Abbildung 22 gezeigt. Jedes der 16 stark umrandeten Quadrate enthielt 16 Array-Elemente, die mit den für das Quadrat im unteren linken Bereich der Abbildung gezeigten Sonden bestückt waren.
Vorbereitung der zu hybridisierenden DNA-Probe:
Zur Amplifikation des Targets für die Hybridisierung wurde eine asymmetrische PCR mit einer klinischen DNA-Probe als template (KDL 31, freundlicherweise zur Verfügung gestellt durch Prof. U. Meyer, Biozentrum Basel). Durch die PCR wurde eine Teilsequenz des Exons 5/6 des humanen cyp2D6-Gens amplifiziert. In der PCR wurde ein Kompetitor eingesetzt, dessen Sequenz zum forward-Primer identisch war, jedoch an der 3 '-OH-Gruppe am 3 '-Ende mit einer NH2-Grappe modifiziert war. Der reverse-Primer war am 5 '-Ende mit Cy3 markiert.
Dazu wurde nach folgendem Schema ein PCR- Ansatz mit folgenden Endkonzentrationen angesetzt:
20 nM forward-Primer: cyp2D6_5/6f (5 'GGACTCTGTACCTCCTATCCACGTCA3 ')
180 nM Kompetitor: cyp2D6_5/6f_3NH2
(5'GGACTCTGTACCTCCTATCCACGTCA-NH2-3'> 200 nM reverse-Primer: cyp2D6_5/6r_5Cy3
(5 '-Cy3-CCCTCGGCCCCTGCACTGTTTCCCAGA3 ') 200 μM dNTPs lx 1 Ox Taq Reaction Buffer (Eppendorf AG, Hamburg,
Deutschland)
5 U MasterTaq DNA-Polymerase (Eppendorf AG, Hamburg,
Deutschland), 1 ng/μl template-DNA (KDL 31), Konzentration 50 ng/μl)
Das Gesamtvolumen der PCR betrag 50 μl.
Dieser Ansatz wurde nach folgendem Temperaturprotokoll inkubiert: Initiale Denaturierung: 10 min 95°C
30 Zyklen: 30 sec 95°C
50 sec 62°C
90 sec 72°C terminale Elongation 7 min 72°C
Die Reaktionsprodukte wurden nach Herstellerprotokoll über Säulen (PCR Purification Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt und anschließend quantifiziert.
Hybridisierung:
Um den Einfluss der Sekundärstrukturbrecher auf die Hybridisierang zu untersuchen, wurden zwei verschiedene Hybridisierungsansätze durchgeführt: Zum ersten Ansatz wurden die entsprechenden Sekundärstrukurbrecher zugegeben, der zweite Ansatz diente als Kontrolle ohne Sekundärstrukurbrecher.
Dazu wurde die Cy3-markierte asymmetrische PCR in einer Endkonzentration von 25 nM in 50 μl 6x SSPE, 0,1% SDS aufgenommen. Zum Ansatz 1 wurden zusätzlich die Straktur-brecher
2938BL5 (5 '-GGAACCCTGAGAGCAGCTTC-3 ') und 2938BL3 (5 '-GGCTGACCTGTTCTCTGCCG-3 ')
zu einer Endkonzentration von je lμM zugegeben.
Nach Zugabe eines Chips in jeden Hybridisierungsansatz wurden diese für 5 min bei 95°C denaturiert und danach 1 h bei 45°C inkubiert. Anschließend wurden die Chips unter Schütteln je 10 min bei 30°C in 2x SSC, 0,2%SDS, bei 30°C in 2x SSC und bei 20°C in 0,2x SSC (Sambrook et al., vide supra) gewaschen und mit Druckluft trockengeblasen.
Detektion der Hybridisierung:
Die hybridisierten und gewaschenen Chips wurden in einem Slidescanner (Scanarray4000, GSI Lumonics) ausgelesen. Dabei wurden die Chips jeweils mit einer Scannereinstellung aufgenommen, die einen möglichst dynamischen Bereich bei der vorhandenen Signalintensität bot. Für die spätere Normierung der Daten wurde zusätzlich ein Fluoreszenzstandard (Fluoris®I, Clondiag Chip Technologies) bei den gewählten Messeinstellungen aufgenommen (Abb. 23).
Ergebnisse:
Die Ergebnisse der Hybridisierang sind in Abb. 23 dargestellt. Abb. 23a zeigt die Fluoreszenzsignale nach Hybridisierang einer PCR unter Zugabe von Strakturbrechem. Die Aufnahme erfolgte in dem Slidescanner mit Laser-Power 70 und Photomultiplier 80. Abb. 23b zeigt dagegen die Negativkontrolle ohne Zugabe der entsprechenden Strakturbrecher. Die Scannereinstellungen waren Laser-Power 100 und Photomultiplier 75. Zu beachten ist, dass Abb. 23b somit bei deutlich höherer Laser- und Photomultiplierleistung des Scanners aufgenommen wurde. Daher sind die Signale auf diesem Chip nur scheinbar stärker.
Die aufgenommenen Bilder wurden mit der Bildauswertungs-Software Iconoclust® (Clondiag Chip Technologies) ausgewertet und die gewonnenen Daten mit Hilfe der Daten des Fluoreszenzstandards normalisiert. Die so erhaltenen Messdaten sind im Diagramm in Abb. 24 aufgetragen.
In Abb. 24 ist zu erkennen, dass bei Zugabe von Strakturbrechem eine Steigerung des Fluoreszenzsignals um den Faktor 3,5 bis 5,5 erfolgt. Wie aus dem Verhältnis der Hybridisierungssignale mit und ohne Sekundärstrukturbrecher-Oligonukleotid zu
ersehen ist, wird die Spezifität der Hybridisierang unabhängig von der untersuchten Mutation im Rahmen der Fehlergrenzen nicht beeinflusst.
Ausführungsbeispiel 7:
Durchführung einer kontinuierlichen asymmetrischen PCR-Amplifikations- und Hybridisierungsreaktion unter Zugabe von Strukturbrecher-Olgonukleotiden zu Beginn der PCR-Reaktion.
PCR-Amplifikation und Hybridisierung
Als Target für die Hybridisierang diente eine asymmetrische Cy3-markierte PCR mit einer klinischen DNA-Probe als template (KDL31, U. Meyer, Biozentrum Basel). Es wurden die gleichen forward- und reverse-Primer sowie der gleiche Kompetitor wie im Beispiel 6 verwendet. Hinsichtlich der Sequenz wurden ebenfalls die gleichen Strukturbrecher eingesetzt. Allerdings tragen diese am 3 '-Ende eine Amino- Modifikation (NH2-Modifikation).
Der PCR-Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung und Endkonzentration:
70nM forward-Primer: cyp2D6_5/6f
(5'-GGACTCTGTACCTCCTATCCACGTCA-3')
130 nM Kompetitor: cyp2D6_5/6f_3NH2
(5 '-GGACTCTGTACCTCCTATCCACGTCA-NH2-3 ')
200 nM reverse Primer: cyp2D6_5/6r_5Cy3
(5'-Cy3-CCCTCGGCCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3')
20 nM Strukturbrecher 2938BL5
(5'GGAACCCTGAGAGCAGCTTC- NH2-3')
20 nM Strakturbrecher 2938BL3
(5'GGCTGACCTGTTCTCTGCCG-NH2-3')
200 μM dNTPs lx Puffer lOx cDNA-Reaction Buffer (Clontech, Palo Alto, USA), 70 mM K-acetat 15 U MasterTaq DNA-Polymerase (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland), 1 ng/μl template-DNA (humane genomische DNA KDL 31 (Urs Meyer, Biozentram Basel)
Das Volumen der PCR betrug 50 μl. Ein Parallelansatz hatte die identische Zusammensetzung für alle Komponenten mit Ausnahme der Strakturbrecher- Oligonukleotide. Letztere wurden nicht zugegeben.
Beide Ansätze wurden mit je einem Array desselben Layouts wie in Beispiel 6 versehen und nach folgendem Temperaturprotokoll inkubiert:
Initiale Denaturierung: 10min 95°C
30 Zyklen: 30s 95°C
50s 62°C
90s 72°C
Terminale Elongation: 7min 72°C
Die Hybridisierang erfolgte folgendermaßen:
Denaturierung: 5min 95°C
Hybridisierang 60min 40°C
Im Anschluss an die Hybridisierung wurden die Chips unter Schütteln je 10min bei 30°C in 2x SSC, 0,2% SDS, bei 30°C in 2x SSC und bei 20°C in 0,2xSSC (Sambrook et al., vide supra) gewaschen und mit Druckluft getrocknet.
Nachweis der Hybridisierung und Auswertung
Die hybridisierten und gewaschenen Chips wurden in einem Slidescanner (Scanarray4000, GSI Lumonics) ausgelesen. Beide Arrays wurden mit den identischen Scannereinstellungen (Laser-Power 70 und Photomultiplier 80) aufgenommen. Abbildung 25 (Abb.25) zeigt die entsprechenden Scanneraufnahmen. Abb. 25a zeigt die Fluoreszenzsignale nach Hybridisierang einer PCR unter Zugabe von Strakturbrechem, Abb. 25b dagegen die Reaktion ohne Zugabe der entsprechenden Strukturbrecher.
Ergebnisse
Es wird deutlich, dass die Zugabe der Strakturbrecher am Beginn der PCR-Reaktion keinen negativen Einfluss auf das Ergebnis der Reaktion hatte. Vielmehr war eine sensitivere Detektion der Hybridisierungssignale bei Zugabe der Strukturbrecher- Oligonukleotide möglich.
Ausführungsbeispiel 8:
Vergleich von asymmetrischer und symmetrischer Amplifkation in einer kontinuierlichen PCR-Amplifkations- und Hybridisierungsreaktion.
Es wurde eine Target-Sequenz aus Corynebacterium glutamicum und durch Hybridisierang gegen einen Sondenarray auf Vorhandensein von Insertionen oder Deletionen untersucht.
Array
Es wurde ein DNA-Array durch ortsspezifische situ-Synthese von Oligonukleotiden mittels micro wet printing (Clondiag Chip Technologies) hergestellt. Das Array enthielt insgesamt 64 Array-Elemente mit einer Größe von 256x256 μm. Jedes Array-Element enthielt eine der folgenden Sonden.
Insertion: 5'-GTTTCCCAGGGCTTATCCC-3' Deletion: 5 ' -GTTTCCC AGCTTATCCC-3 ' Match: 5' -GTTTCCC AGGCTTATCCC-3'
Die Zuordnung der einzelnen Sonden auf die Array-Elemente ist in Abbildung 26 (Abb. 26) widergegeben. Mit der Match-Sonde belegte Array-Elemente sind weiß, mit der Deletions-Sonde belegte Array-Elemente sind schwarz und mit der Insertions-Sonde belegte Sondenelemente sind grau dargestellt.
Kontinuierliche PCR und Hybridisierungsreaktion
Der forward-Primer 16sfD15'Cy3 hatte folgende Sequenz und war am 5 '-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) markiert:
5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
Der reverse-Primer 16sRa und der Kompetitor 16sRa3'NH2 hatte folgende Sequenz:
5 '-TACCGTC ACCATAAGGCTTCGTCCCTA-3 '
Der Kompetitor trag am 3 '-Ende eine Amino-Modifikation (NH2), die während der chemischen Synthese des Oligonukleotids in das Molekül integriert wurde. Es wurden jeweils 5 symmetrische und 5 asymmetrische Reaktionsansätze mit folgender Zusammensetzung hergestellt. In den Klammem sind jeweils die Konzentrationen der Stock-Lösungen angegeben.
Asymmetrische Reaktionen:
0,5 μl reverse-Primer 16sRa (10 μM)
1 μl Kompetitor 16SRa3 'NH2 (10 μM)
1,5 μl 16SfD15'Cy3 (10 μM)
0,75 μl dNTP Mix (20 mM) 0,75 μl chromosomale DNA Corynebacterium glutamicum
(lOng/μl)
0,75 μl 1 OxClontech cDNA Puffer
54,5 μl PCR-Grade Water
3 μl Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) (5 U/μl)
5 μl IM Kaliumacetat
Symmetrische Reaktionen:
1,5 μl reverse-Primer 16SRa (10 μM)
1,5 μl 16SfD15'Cy3 (10 μM)
0,75 μl dNTP Mix (20 mM)
0,75 μl chromosomale DNA Corynebacterium glutamicum (lOng/μl)
0,75 μl 1 OxClontech cDNA Puffer
54,5 μl PCR-Grade Water
3 μl Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) (5 U/μl)
5 μl IM Kaliumacetat
Zu den Reaktionsansätzen in (0,2 ml PCR-Tubes) wurde jeweils ein Array gegeben. Die Reaktionsgemische einschließlich Array wurden folgendem Temperaturprotokoll zur PCR- Amplifkation und Hybridisierang unterworfen:
PCR:
Initiale Denaturierang 2 min 95°C
10-30 PCR-Zyklen 30 sec 95°C
30 sec 62°C
Extension 30 sec 72°C
Die PCR- Amplifkation wurde für jeweils einen symmetrischen und einen asymmetrischen Reaktionsansatz nach 10, 15, 20, 25 bzw. 30 Zyklen beendet. Danach folgte sofort die Hybridisierang.
Hybridisierung:
Denaturieren 30 sec 95°C
Hybridisieren 60min 42°C
Auswertung der Hybridisierung
Nach Abschluss der Hybridisierung wurden die Arrays ein Mal kurz in 0,2x SSC bei Raumtemperatur gewaschen. Nach Entfernen der Flüssigkeit wurden die Arrays getrocknet und in einem Fluoreszenzscanner (Scanarray4000, GSI Lumonics) ausgelesen. Die Einstellungen von Laser und PMT variierten in Abhängigkeit von der Intensität der Hybridisierungssignale.
Ergebnisse
Es zeigte sich, dass die asymmetrische Reaktion gegenüber der symmetrischen Reaktion stets zu einem stärkeren Hybridisierungssignal führte, unabhängig davon, über wie viele Zyklen die Amplifikation erfolgte. Als Beispiel sind in Abbildung 27 (Abb. 27) die Hybridisierungs-signale der nach 10 bzw. 30 Zyklen abgestoppten Reaktion zu sehen.
Ausführungsbeispiel 9:
PCR mit anschließender Hybridisierang in einem 0,5 ml-Standard Reaktionsgefäß (Eppendorf Hamburg, Deutschland)
Es wurde je eine Halterang (101, 302, 701) entsprechend den Abbildungen 1 bis 7 bereitgestellt. Femer wurde drei 50 μl-Reaktionsansätze für eine asymmetrische PCR wie folgt hergestellt:
0,1 μl Primer 1 16SRa (lOpmol/μl)
(5'TACCGTCACCATAAGGCTTCGTCCCTA3')
0,9 μl Primer2 16Ra3'NH2 (lOpmol/μl)
(5 'TACCGTCACCATAAGGCTTCGTCCCTA3 'NH2)
1 μl Primer3 16SfD13'Cy3 (lOpmol/μl) 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'Cy3
1 μl DNA Polymerisation Mix 20 mM ( 5mM jedes dNTP 's) (Abgene, Hamburg,
Deutschland)
5 μl Advantage2 PCR Puffer (Clontech, Palo Alto, USA)
1 μl genomische DNA aus Corynebacterium glutamicum (5pg/μl)
40,5 μl PCR-Grade Wasser
0,5 μl Taq-Polymerase 5U/μl (Clontech, Paolo Alta, USA)
Als Negativkontrolle wurde ein entsprechender 50 μl-Reaktionsansatz hergestellt, der jedoch keine Taq-Polymerase enthielt.
Die Substanzbibliothekenträgerhalterungen wurden je in ein Reaktionsgefäß gegeben und das Gefäß geschlossen.
Die PCR und die Hybridisierungsreaktion wurde in einem Thermocycler Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) nach folgendem Protokoll durchgeführt:
Nach der Reaktion wurden die Substanzbibliothekentrager einem Spülregime unterzogen.
Dazu wurde 3 x je ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 500 μl Waschpuffer 2xSSC + 0,2 % SDS gefüllt und in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
auf 30°C erwärmt. Die Substanzbibliothekentrager wurden aus den PCR- Reaktionsgefäßen in die mit Waschpuffer gefüllten Reaktionsgefäße gegeben und für 10 min bei 300 1/min geschüttelt.
Danach wurde die gleiche Prozedur mit 500 μl Waschpuffer 0,2x SSC wiederholt. Die Waschlösung wurde durch Pipetten aus dem Reaktionsgefäß entfernt und die Substanzbibliothekentrager anschließend in einer Speedvac (Concentrator 5301, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) unter Vakuum 10 min bei 30°C getrocknet.
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte mit Hilfe der Adapter (207, 401)
1) unter einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop (Zeiss): Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit betrag 5000 ms.
2) in einem Scanarray 4000 Konfokalscanner (GSI Lumonics): Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz.
Um ein Nachweis über eine sichere Amplifikation zu erhalten, wurden zusätzlich 5 μl jeder Reaktionslösung auf ein 2 % mit Ethidiumbromit abgefärbtes Agarosegel aufgetragen und bei einer konstanten Spannung von 220V für 30 min aufgetrennt.
In den Abbildungen 8 bis 12 ist gezeigt:
Abb. 8: Hybridisierungsmuster, PCR mit Taq-Polymerase (Halterungsaufbau (101)) Abb. 9: Hybridisierungsmuster, PCR mit Taq-Polymerase (Halterungsaufbau (207)) Abb. 10: Hybridisierungsmuster, PCR ohne Taq-Polymerase (ohne Halterang) Abb. 11: Hybridisierungsmuster, PCR mit Taq-Polymerase (Halterungsaufbau (401)) Abb. 12: Gelbild der Reaktionslösungen aus den Hybridisierungsversuchen
Beschreibung der Abbildungen:
Abbildung 1 : Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, umfassend eine Halterung (101), zwei Flansche (105) zur Fixierung und Ausrichtung des Substanzbibliothekenträgers, den Substanzbibliothekentrager (104) mit der zu detektierenden Fläche (Detektionsflache 107), sowie der Auflagefläche im Detektionsadapter (109).
Abbildung 2: Darstellung eines Detektionsadapters im Objektträgerformat (207) mit Auflagefläche (206) und Datenmatrix (208).
Zum Auslesen der Substanzbibliotheken auf der Detektionsflache (107) werden die Halterungen (101) mit den Substanzbibliothekentrager (104) derart in den Detektionsadapter (207) gelegt, dass die Detektionsflache (107) parallel zur Fokussierebene (201) des Detektionsgeräts ausgerichtet ist.
Abbildung 3: Substanzbibliothekentrager (104) mit Detektionsflache (107), Unterseite (303) und angebrachtem Magnet bzw. magnetischem Werkstoff (302). Die Unterseite (303) des Substanzbibliothekenträgers ist vorzugsweise magnetisch ausgestaltet, z.B. indem sie mit einer magnetischen Schicht versehen ist.
Abbildung 4: Darstellung eines Detektionsadapters (401) im Objektträgerformat. Die vorgesehenen Aussparungen (403) dienen der Aufnahme von Substanzbibliothekenträgem (104). Die Bodenflächen (402) der Aussparungen sind vorzugsweise magnetisch ausgestaltet. Am Kopf des Detektionsadapters (401) ist eine Datenmatrix (208) angebracht.
Abbildung 5: Handhabungsmodul (600) für die Substanzbibliothekentrager (104) mit Griff (605).
Durch einen beweglich Schaft, z.B. einen Vollzylinder (602), der in einem Hohlzylinder (601) geführt wird, lässt sich der Substanzbibliothekentrager (104) mit seinem magnetischen Verbindungsstück (302) an die Stirnseite (604) des Handhabungsmoduls über das magnetische Fußende des Schafts befestigen und wieder von ihr lösen.
Abbildung 6: Trägerstreifen (701) mit und ohne Substanzbibliothekentrager (104). Zum Auslesen des Arrays im Durchlicht ist im Trägerstreifen ein Durchbruch (703) vorgesehen. Am Kopf des Trägerstreifen (701) ist vorzugsweise eine Datenmatrix (208) angebracht.
Abbildung 7: Halterung (101) mit Substanzbibliothekentrager (104) in einem 0,5 ml- Standard PCR-Reaktionsgefäß (1000).
Abbildung 8: Aufnahme eines Hybridisierangsmusters.
Der Substanzbibliothekentrager wurde an eine Halterung (101) fixiert, mit dieser prozessiert und in einem Detektionsadapter (207) ausgelesen.
Abbildung 9: Aufnahme eines Hybridisierangsmusters. Der Substanzbibliothekentrager wurde an eine Halterung (701) fixiert, mit dieser prozessiert und in einem Detektionsadapter (207) ausgelesen.
Abbildung 10: Aufnahme eines Hybridisierangsmusters. Negativkontrolle einer PCR ohne Taq-Polymerase.
Abbildung 11 : Aufnahme eines Hybridisierangsmusters.
Der Substanzbibliothekentrager wurde mit einem Magneten (302) versehen, mit diesem prozessiert und in einem Detektionsadapter (401) wie beschrieben ausgelesen.
Abbildung 12: Gel-Elektrophorese der Reaktionslösungen der Hybridisierangsexperimente.
Abbildung 13: Foto zweier Standard-Reaktionsgefäße aus Polypropylen mit 1,5 ml Füllvolumen.
Abbildung 14: Ergebnisse der Produktbildungskinetik nach Ausführungsbeispiel 1.
Die Menge an gebildetem PCR-Produkt ist dabei als Light cycler units in
Abhängigkeit von der Zyklenzahl angegebea
Abbildung 15: Vergleich der Hybridisierungssignale in Abhängigkeit vom
Kompetitor-Anteil (siehe Ausführungsbeispiel 1).
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte unter einem Zeiss
Fluoreszenzmikroskop (Zeiss). Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die
Belichtungszeit betrag 2000 ms.
Abbildung 16: Agarosegel, auf dem parallel 5 μl-Proben von Reaktionen mit einem Kompetitor-Anteil von 50% bzw. 87,5% analysiert wurden (siehe Ausführangsbeispiel 2).
Die Reaktionen waren jeweils nach der angegebenen Zyklenzahl gestoppt worden. Bei 87,5% Kompetitor-Anteil wird weniger Produkt erzeugt.
Abbildung 17: Abhängigkeit der Signalstärke vom Kompetitor-Anteil (siehe Ausführungsbeispiel 2).
Die Intensität der Hybridisierungssignale wurde gemessen, indem die Signalstärke (gemessene Graustufe) über den gesamten Bereich der Spots gemittelt wurde. Von diesem Wert wurde der über den Spot-freien Bereich (Hintergrund) gemittelte
Grauwert abgezogen. Die so errechneten Signalintensitäten wurden normiert (höchster Wert = 100%) und gegen die Zyklenzahl aufgetragen.
Abbildung 18: Gelanalyse von symmetrischen und asymmetrischen Reaktionen. Bei der Gelanalyse der symmetrischen Reaktionen wird für alle Reaktionen, in denen eine Amplifikation erfolgte, nur ein dominierendes Produkt nachgewiesen. Dabei handelt es sich um das doppelsträngige PCR-Produkt.
Im Gegensatz dazu werden bei allen detektierbaren asymmetrischen Reaktionen drei dominierende Produkte nachgewiesen. Neben dem doppelsträngigen Template werden zwei weitere Banden erhalten, die verschiedenen Strukturen des markierten Einzelstranges entsprechen. Die Gelanalyse zeigt, dass die asymmetrische Amplifikation zu einem Einzelstrangüberschuss führt.
Abbildung 19: Anordnung der Sonden nach Ausführangsbeispiel 4. Schwarze Felder entsprechen der Sonde C2938T, graue Felder entsprechen der Sonde C2938WT.
Abbildung 20: Detektion der Hybridisierungssignale mit und ohne Zugabe von Strukturbrechern (siehe Ausfuhrungsbeispiel 4). Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte unter einem Zeiss
Fluoreszenzmikroskop. Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD- Kamera (PCO-Sensicam) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit betrug 5,000 ms.
Abbildung 21 : Detektion der Hybridisierungssignale (siehe Ausführangsbeispiel 5). Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgte unter einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop. Die Anregung erfolgte im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale wurden mit einer CCD- Kamera (PCO-Sensicam) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit betragt 10,000 ms.
Abbildung 22: Anordnung der Sonden auf dem Array gemäß Ausführuiigsbeispiel 6.
Abbildung 23: Detektion der Hybridisierang nach Ausführangsbeispiel 6. Abbildung 23a zeigt die Fluoreszenzsignale nach Hybridisierang einer PCR unter Zugabe von Strakturbrechem. Die Aufnahme erfolgte in einem Slidescanner mit Laser-Power 70 und Photomultiplier 80. Abbildung 23b zeigt die Negativkontrolle ohne Zugabe der entsprechenden Strakturbrecher. Die Scannereinstellungen waren Laser-Power 100 und Photomultiplier 75.
Abbildung 24: Darstellung der normalisierten Messergebnisse aus der
Hybridisierang einer PCR unter Zugabe und bei Fehlen von Strakturbrechem (siehe
Ausführangsbeispiel 6).
Aufgetragen ist zusätzlich das Verhältnis Hybridisierungssignal mit/ohne
Strukturbrecher.
Abbildung 25: Scanneraufhahmen der hybridisierten und gewaschenen Chips nach
Ausführangsbeispiel 7.
Abbildung 25a zeigt die Fluoreszenzsignale nach Hybridisierang einer PCR und
Zugabe von Strakturbrechem, Abbildung 25b die Reaktion ohne Zugabe der entsprechenden Strakturbrecher.
Abbildung 26: Zuordnung der einzelnen Sonden auf die Array-Elementen nach Ausführungsbeispiel 8.
Mit der Match-Sonde belegte Array-Elemente sind weiß, mit der Detektionssonde belegte Array-Elemente sind schwarz und mit der Insertions-Sonde belegte Array- Elementen sind grau dargestellt.
Abbildung 27: Vergleich der Hybridisierungssignale von asymmetrischen und symmetrischen Reaktionen für eine nach 10 bzw. 30 Zyklen abgestoppte Reaktion (siehe Ausführangsbeispiel 8).
Bezugszeichenliste:
101 Halterung für einen Substanzbibliothekentrager
104 Substanzbibliothekentrager
105 Flansche zur Fixierung und Ausrichtung des Substanzbibliothekenträgers
106 Befestigungsstelle, insbesondere Klebestelle
107 Substanzbibliotheken/Detektionsfläche
108 Spalt zwischen den Flansche zum Einlegen und Fixieren des Substanzbibliothekenträgers 109 Auflagefläche zum Einlegen in einen Detektionsadapter
201 Fokussierebene
206 Auflagefläche im Detektionsadapter
207 Detektionsadapter
208 Datenmatrix/Barcode 301 Befestigungsstelle, insbesondere Klebestelle
302 Magnet bzw. magnetischer Werkstoff oder anderes Material für lösbare Befestigung
303 Unterseite des Substanzbibliothekenträgers 401 Detektionsadapter 402 Auflagefläche für den Substanzbibliothekentrager
403 Aufnahmetaschen bzw. Aussparungen für die
Substanzbibliothekentrager
600 Handhabungsmodul
601 Hohlzylinder 602 Vollzylinder
603 Magnetisches Fußende
604 Fläche, um den Substanzbibliothekentrager abzuwerfen
605 Bedienerknopf
701 Trägerstreifen für die Substanzbibliothekentrager
702 Klebeverbindung
703 Loch zur Durchlichtdetektion
1000 Standard-Reaktionsgefäß (Schnittzeichnung)