WO2004101796A1 - 改良された形質転換体およびそれを用いたポリエステルの製造方法 - Google Patents

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WO2004101796A1
WO2004101796A1 PCT/JP2004/006542 JP2004006542W WO2004101796A1 WO 2004101796 A1 WO2004101796 A1 WO 2004101796A1 JP 2004006542 W JP2004006542 W JP 2004006542W WO 2004101796 A1 WO2004101796 A1 WO 2004101796A1
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gene
genus
yeast
polyester
ser
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PCT/JP2004/006542
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Yuji Okubo
Tetsuya Nagaoka
Satoru Yokomizo
Keiji Matsumoto
Masamichi Takagi
Akinori Ohta
Original Assignee
Kaneka Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to an improved transformant and a method for producing a polyester using the same.
  • the present invention relates to a gene required for enzymatically synthesizing a copolymerized polyester, a microorganism for fermenting and synthesizing a polyester using the gene, and a method for producing a polyester using the microorganism.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • a typical example is poly-3-hydroxybutyric acid (hereinafter abbreviated as P (3HB)), which is a homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (hereinafter abbreviated as 3HB).
  • P (3HB) is a thermoplastic polymer, which has been attracting attention as an environmentally friendly plastic because it is biodegradable in the natural environment.
  • P (3HB) has high crystallinity and is hard and brittle, so its practical application is limited. For this reason, research aimed at improving this property has been made.
  • P (3HB-CO-3HH) 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid
  • 3HH 3-hydroxyhexanoic acid
  • Patent Documents 3 and 4 The process for producing P (3HB-co-3HH) in these patent documents uses oleic acid using Aeromonas caviae isolated from soil. It was produced by fermentation from fats and oils such as fatty oils such as pure oil. Also, studies on the properties of P (3H B—co—3HH) have been made (see Non-Patent Document 2). In this report, A.
  • caviae is cultivated using fatty acids having 12 or more carbon atoms as the sole carbon source, and 3HH fermentatively produces 11 to 19 mol% of P (3HB_co_3HH).
  • P (3HB_co_3HH) increases in mole fraction of 3HH, P (3HB) gradually becomes more flexible from hard and brittle to P (3HB-co_3HV). It was decided.
  • the cell production was 4 gZL, the polymer content was 30%, and the polymer productivity was low. Therefore, a method for obtaining higher productivity for practical use was searched.
  • a PHA synthase gene has been cloned from A. caviae producing P (3HB_co_3HH) (see Patent Document 5 and Non-Patent Document 3).
  • This gene was cultured in a transgenic strain transfected into Ralstonia eutropha (formerly Alcaligenes eutrophus) using vegetable oil as a carbon source, resulting in a cell content of 4 g and a polymer content of 80%. (See Non-Patent Document 4).
  • Also disclosed is a method for producing P (3HB-co-3HH) using bacteria such as Escherichia coli and plants as hosts, and its productivity is described (see Patent Document 6).
  • the polymer P (3HB-CO-3HH) has a wide range of physical properties from a hard polymer to a soft polymer by changing the mole fraction of 3HH. It can be expected to be applied to a wide range of fields, from those that require flexibility, such as thread and film. However, the productivity of P (3HB-co_3HH) is still low with the above-mentioned manufacturing method, and it is still insufficient as a production method for the practical use of P (3HB-co-3HH). I have to know.
  • P. (3HB-co_3HH) synthase derived from A. caviae was modified by Evolutional engineering by Yoshise et al. And transfected into Escherichia coli, whereby P (3HB- A method for producing Escherichia coli that highly accumulates CO-3HH) was disclosed (see Non-Patent Document 5).
  • E2-50 strain and T3-11 strain were obtained as strains having improved specific activity of P (3HB_co_3HH) synthase.
  • the 149th amino acid asparagine of P (3HB-CO-3HH) synthase was replaced with serine, and in the T3-11 strain, 171st asp.
  • Yeasts are known to grow quickly and have high cell productivity.
  • yeast belonging to the genus Candida has been attracting attention as a single cell protein in the past, ⁇ Production of feed-use cells as a carbon source has been studied.
  • a host vector system of the genus-(Candida) has been developed, and substance production using gene recombination technology has been reported (see Non-Patent Document 10).
  • the productivity of para-amylase using Candida utilis as a host is as high as about 12.3 g / L, and the genus Candida, which has such a high ability to produce substances, is used for polymer production.
  • the separation of cells from the culture solution is easier than that of bacteria, the extraction and purification steps of the polymer can be further simplified.
  • P (3HB-CO-3HH) having excellent physical properties using yeasts of the genus Candida has been developed. It is necessary to further improve in terms of polymer productivity.
  • One method for improving the amount of polymer produced per cell is to increase the amount of polymer synthase in the cell.
  • Methods for increasing the amount of polymer synthase in the bacterium include a method using a strong promoter, a method using a plasmid with a high copy number, and a method of introducing a large number of enzyme expression units into a plasmid or chromosome.
  • Non-Patent Documents 11 and 12 Since the molecular weight of a polymer greatly affects the properties of a biodegradable polymer, it has been desired to develop a method for improving productivity without causing a decrease in molecular weight.
  • Patent Document 1 JP-A-57-150393
  • Patent Document 2 JP-A-59-220192
  • Patent Document 3 JP-A-5-93049
  • Patent Document 4 JP-A-7-265065
  • Patent Document 5 JP-A-10-108682
  • Patent Document 6 WO 00/43525 pamphlet
  • Patent Document 7 International Publication No. 01/88144 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 M. Lemoigne, Ann. Inst. Pasteur, 39, 144 (1925)
  • Non-Patent Document 2 Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe, Macromolecules 28, 4822-4 823 (1995)
  • Patent Document 3 T. Fukui, Y. Doi, J. Bacteriol, vol. 179, No. 15, 4821-4830 (1997)
  • Non-Patent Document 4 T. Fukui et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 333 (1998)
  • Non-Patent Document 5 T. Kichise et al. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2411-2419 (2002)
  • Non-Patent Document 6 Amara AA. Et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59, 477-482 (2002)
  • Non-Patent Document 7 Microbiology, vol. 142, ppl 169—1180 (1996)
  • Non-Patent Document 8 Poirier Y. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67, 5254-5260
  • Non-Patent Document 9 Poirier Y. et al. FEMS Microbiology Lett., Vol. 207, pp97_102 (2002)
  • Patent Literature 10 Danigaku and Biology vol. 38, No. 9, 614 (2000)
  • Non-patent literature l l Sim S. J. et al. Nature Biotechnology, vol. 15, pp63_67 (1997)
  • Non-patent Document 12 Gerngross T.U., Martin D.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pp6279-6283 (1995)
  • the present invention provides a PHA synthase mutant gene that can be functionally and efficiently expressed in yeast, a transformant obtained by transforming a gene expression cassette comprising the mutant gene into yeast, and the obtained character.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a polyester such as P (3HB-CO-3HH) having biodegradability and excellent physical properties by culturing the transformant.
  • the present inventors have prepared genes encoding the amino acid sequences of mutants in which a specific mutation has been introduced into the amino acid sequence of the PHA synthase derived from Aeromonas serrata, and these genes have been prepared.
  • Each of which has a promoter A gene expression cassette is prepared by linking a minator, and then the present gene expression set is introduced into yeast to produce a transformant, and by culturing the transformant, extremely high productivity can be obtained from the culture. Found that polyester can be produced in a promising way.
  • the present invention relates to the use of a gene of a PHA synthase mutant derived from Aeromonas serrata in yeast.
  • a PHA synthase mutation obtained by performing at least one of the following amino acid substitutions (a) to (h) on a PHA synthase derived from Aeromonas serrata consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the present invention relates to a gene expression cassette comprising a PHA synthase mutant gene encoding a body, and a promoter and a terminator that function in yeast.
  • the present invention also relates to a gene obtained by adding a DNA encoding a peroxisome orientation signal to a PHA synthase mutant gene encoding the above PHA synthase mutant.
  • the gene comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3; more preferably, the nucleotide sequence of the DNA encoding the peroxisome orientation signal is SEQ ID NO: 4. Or the gene as set forth in SEQ ID NO: 5.
  • the above-mentioned gene which is converted to at least one of the genetic code CTG of a gene coding for a PHA synthase derived from Aeromonas radians TTA, TTG, CTT, CTC or CTA About.
  • the present invention provides the above-mentioned gene, a promoter and a terminator capable of functioning in yeast.
  • the present invention is particularly characterized in that one or more gene expression cassettes are introduced into yeast.
  • a transformant to be characterized preferably, the above transformant, wherein the yeast is Candida maltosa.
  • the present invention provides a method for collecting polyester from a culture obtained by culturing the transformant of form 1
  • the polyester is a copolymer of 3_hydroxybutyric acid represented by the following formula (1) and 3-hydroxyhexanoic acid represented by the following formula (2):
  • the present invention relates to a method for producing the above polyester which is a copolymerized polyester obtained by polymerization.
  • a PHA synthase mutation obtained by performing at least one of the following amino acid substitutions (a) to (h) on the amino acid sequence of the PHA synthase derived from Aeromonas The body is used as a useful variant.
  • Amin_149 means asparagine at position 149 in the amino acid sequence
  • amino acid substitution in (a) means conversion of asparagine at position 149 to serine.
  • Examples of the method for obtaining the above mutant include the following methods. There are various methods for obtaining a mutant having improved properties such as enzyme activity 'substrate specificity' and thermostability by modifying the amino acid sequence of a polyester synthase derived from a bacterium such as Aeromonas caviae. Although known, in particular, a molecular evolution engineering technique (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-199890) is highly useful because a desired mutant can be quickly obtained. Further, it is also possible to specify a useful amino acid mutation on the basis of the three-dimensional structure of the enzyme or a predicted three-dimensional structure on a computer, for example, using the program Shrike (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-184831). .
  • amino acid substitutions (a) to (h) A mutant obtained by performing two or more of the above is also preferably used.
  • the gene encoding the mutant obtained by the method described in (1) above includes a sequence number A PHA synthase gene derived from Aeromonas serrata consisting of the amino acid sequence represented by No. 1 and having a DNA mutation corresponding to the amino acid substitution described in (1) above may be mentioned. Further, a PHA synthase gene adapted to yeast into which a DNA mutation corresponding to the amino acid substitution described in (1) above has been introduced is preferable.
  • the PHA synthase gene adapted to yeast is not particularly limited, and is, for example, a gene encoding the same amino acid sequence in Candida maltosa as the PHA synthase gene derived from Aeromonas capillaris. (Described in SEQ ID NO: 3 of W ⁇ 01 / 88144).
  • a desired site is introduced into a desired site using a site-directed mutagenesis method. Mutations in the gene sequence can be introduced.
  • the method of site-specifically mutating the amino acid sequence of a gene can be performed using a recombinant DNA method, a PCR method, or the like. For example, if an appropriate restriction enzyme recognition sequence is present on both sides of the target site in the PHA synthase gene at which mutation is desired, a region containing the site desired to be mutated is cut with the restriction enzyme.
  • the cassette After removal of the DNA fragments, the cassette can be subjected to a cassette mutation method in which a DNA fragment mutated only at the target site by chemical synthesis or the like is inserted.
  • the site-specific mutation introduced by PCR is performed by introducing a mutation primer in which the desired mutation is introduced at the desired site in the PHA synthase gene where mutation is desired, and a mutation containing the sequence of the terminal site of the gene.
  • One side of the gene is amplified with an amplification primer having no mutation, and a mutation primer having a sequence complementary to the mutation primer and the other end of the gene are amplified.
  • the amplification can be performed by amplifying the other with an amplification primer having no mutation including the sequence of the site, annealing the two amplified fragments obtained, and then performing PCR with the two types of amplification primers. I can do it.
  • the obtained site-specific construct is confirmed by determining the nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence can be determined by a method known in the art using an automatic nucleotide sequencer or the like.
  • any carbon source can be used without particular limitation as long as yeast can be used, such as glucose, oils and fatty acids.
  • these carbon sources are metabolized via the ⁇ -oxidation pathway, but metabolic intermediates in the ⁇ -oxidation pathway efficiently synthesize polyester (T. Fukui, Y. Doi, J. Bacteriol., 179, No. 15, 4821—4830 (1997); Q. Ren et al., J. Bacteriol., 182, No. 10, 2978—2981 (2000)).
  • / 3 in yeast is performed in peroxisomes, which are small organs in Itoda vesicles, enzymes involved in polyester synthesis must be localized in peroxisomes for efficient polyester synthesis. Is preferred.
  • Proteins to be transported to peroxisomes are synthesized on free ribosomes, and transported to peroxisomes by the action of a peroxisome orientation signal in the protein sequence (S. Subramani, J. Membrane Biol. , 125, 99-106 (1992), Yasuyuki Itai, Biology and Biology, 35, No. 10, 687-695 (1997), EH Hettema, Biochim. Biophys. Acta, 1451, 17-34 (1999) ).
  • DNA encoding these peroxisome orientation signals to a gene encoding an enzyme involved in the synthesis of polyester, that is, the above-mentioned PHA synthase mutant gene.
  • an enzyme involved in the synthesis of the polyester that is, a PHA synthase mutant can be localized in peroxisomes, and the polyester can be synthesized efficiently.
  • SKL seerine-lysine-single-mouth isine
  • AKI alanine-lysine-isoleucine
  • nucleotide sequence corresponding to the above amino acid there is no particular restriction on the nucleotide sequence corresponding to the above amino acid.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 can be used for SKL
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 can be used for AKI.
  • the nine amino acid sequences “(arginine / lysine) — (leucine Z valine Z isoleucine) — (5 amino acids) — (histidine / gunoletamine) — (leucine Zalanine)” present near the N-terminus are also peroxisome-oriented. Also known as a signal. Insertion and addition of these sequences to a PHA synthase mutant can also localize the enzyme to peroxisomes.
  • the gene expression cassette of the present invention comprises the mutant gene of the above (2), a promoter and a terminator that function in yeast.
  • a DNA sequence such as a promoter and an upstream activation region (UAS) is located at the upstream of the gene, and a poly-A is attached at the 3 ′ downstream of the gene.
  • a DNA sequence such as an additional signal and a terminator is required. If there is an appropriate site on the yeast chromosome that satisfies the above conditions, the gene may be directly inserted, or the gene may be inserted into a plasmid having an appropriate promoter and terminator, and this plasmid may be inserted. Yeast can also be transformed.
  • a gene expression cassette in which a promoter is linked to the 5 ′ upstream of the gene and a terminator is linked to the 3 ′ downstream, and this is transformed into yeast.
  • the promoter and terminator any sequence can be used as long as it functions in yeast as a host. Promoters include those that express constitutively and those that express inductively, and any promoter may be used.
  • the promoter and terminator when Candida maltosa is used as a host, the promoter and terminator preferably function in Candida maltosa, and the promoter and terminator are preferably Candida maltosa. Les, preferably from the origin. More preferably, a promoter derived from the ALK1, ALK2, and ALK5 genes of Candida maltosa, and a terminator derived from the ALK1 gene are used.
  • promoter ALKlp WOOl / 88144
  • ALK5 gene promoter ALK5p SEQ ID NO: 6
  • a promoter Yamague et al., 2002 Abstracts of Japanese Society of Agricultural Chemistry, pl 91
  • ARR alkane responsive nore region
  • the base sequence of one of the above promoter and terminator is a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted and / or added, as long as the base sequence functions in Candida maltosa.
  • the ⁇ base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted and / or added '' refers to a protein nucleic acid enzyme extra gene amplification PCR method TAKKAJ 35 (17), 2951-3178 (1990) or Henry A. Erlich, edited by Ikuyuki Karoto, translated by PCR technology (1990) and other methods well known to those skilled in the art to delete, replace and / or add as many bases as possible. And / or means an added nucleotide sequence.
  • the terminator is a DNA encoding a peroxisome orientation signal. It is linked to the 3 'downstream of the gene encoding the added PHA synthase mutant, respectively.
  • the vector used for construction of the gene expression cassette may be any vector as long as it is a plasmid that autonomously propagates in Escherichia coli, and may also have a region that can autonomously propagate in yeast. Vectors capable of autonomous propagation in yeast are retained in the cells. Further, the gene expression cassette can be integrated on the chromosome.
  • pUTUl capable of autonomous replication in Candida 'maltosa
  • pUTUl capable of autonomous replication in Candida 'maltosa
  • the method of linking the promoter and terminator with the structural gene to construct the gene expression cassette of the present invention is not particularly limited.
  • a PCR method can also be used to create a restriction enzyme site.
  • the method described in WO01 / 88144 can be used.
  • yeasts which are not particularly restricted are deposited with depository institutions (eg, IFO, ATCC, etc.) of strains of the genus Acicloconidium, genus Ambrosiozyma, and genus Ambrosiozyma.
  • depository institutions eg, IFO, ATCC, etc.
  • Yeasts such as genus owia, genus Zygoascus, genus Zygosaccharomyces, genus Zygowilliopsis and genus Zygozyma can be used.
  • the yeast used as a host of the transformant of the present invention is not particularly limited. Among them, Candida maltosa, which is preferably of the genus Candida or Yarrowia, is preferred. Candida 'maltosa, which is more preferred by Yarrowia lipolytica, is particularly preferred.
  • Candida maltosa AC16 strain has an accession number.
  • FERM BP-7366 was internationally deposited on November 15, 2000 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary 1 at Tsukuba-Higashi 1-chome 1-Chuo No. 6 Ibaraki, Japan ing.
  • the transformant of the present invention is obtained by introducing at least one gene expression cassette of the above (3) into yeast.
  • a Candida maltosa CHA1 strain (S. Kawai, et al, Agric. Biol. Chem., Vol. 55, 59-65 (1991)) can be used as a host.
  • the present strain is transformed with a plasmid vector or the like containing a gene expression cassette involved in polymer synthesis, and a Candida * having a plasmid such as pARR-ORF2S as shown in Examples described below *
  • a maltosa transformant can be prepared.
  • AC16 pUTA-149NSx2 which is a transformant into which plasmid pARR-149NSx2 has been introduced (Accession number: FERM BP-10019, original deposit date: May 8, 2003; international deposit based on the Budapest Treaty) Transferred to deposit), Plasmid pARR_149NS / 171DGx2 (Accession number FERM BP_10017, Deposit date: April 27, 2004, international deposit based on the Budapest Treaty),
  • polyester is collected from a culture obtained by culturing the transformant of the present invention.
  • the production of the polyester of the present invention can be carried out by adding the above transformant to a culture medium, culturing the resultant, and then recovering the polyester from the obtained cultured cells or culture.
  • the culture temperature is a temperature at which the bacterium can grow, preferably 15 ° C to 40 ° C, more preferably 20 ° C to 40 ° C, and still more preferably 28 ° C to 34 ° C.
  • the culture time is not particularly limited. For example, in batch culture, 117 days are preferable, and continuous culture is also possible.
  • the culture medium is not particularly limited as long as yeast can be used.
  • a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic nutrient sources can be used.
  • the carbon source is not particularly limited as long as it can be assimilated by yeast, and examples thereof include carbohydrates, fats and oils, fatty acids, and n-paraffin.
  • carbohydrate include gnocose, sucrose, glycerin and the like.
  • oils and fats include rapeseed oil, coconut oil, palm oil, palm kernel oil and the like.
  • fatty acids include saturated 'unsaturated fatty acids such as hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid, and myristic acid, and ester salts of these fatty acids.
  • Fatty acid derivatives of Examples of n-paraffin include dodecane and tetradecane.
  • an inducer for example, alcohol
  • Inducers may be the primary carbon source.
  • oil and fats can be used as the carbon source.
  • yeasts that cannot assimilate oils and fats or that cannot efficiently assimilate Can be improved by adding lipase to the medium.
  • lipase gene the ability to assimilate fats and oils can be imparted.
  • nitrogen source examples include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • inorganic salts include, for example, potassium monophosphate , Potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium salt, and the like.
  • organic nutrients include, for example, amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline; vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, biotin, nicotinamide, pantothenic acid, and vitamin C.
  • amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline
  • vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, biotin, nicotinamide, pantothenic acid, and vitamin C.
  • the following method can be used to recover polyester from bacterial cells.
  • the cells are separated from the culture using a centrifuge or the like, and the cells are washed with distilled water, methanol, and the like, and then dried.
  • the polyester is extracted from the dried cells using an organic solvent such as black-mouthed form.
  • Cell components are removed from the organic solvent solution containing the polyester by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate the polyester.
  • the supernatant can be removed from the precipitated polyester by filtration or centrifugation, and the polyester can be recovered by drying.
  • yeast is used as a cell producing polyester, the above simple separation and recovery method can be used.
  • the obtained polyester is analyzed by, for example, gas chromatography, nuclear magnetic resonance, or the like.
  • the GPC method can be used for measuring the molecular weight. After dissolving the recovered dried polymer with chlorophore, this solution can be analyzed using a Shimadzu GPC system equipped with Shodex K805L (manufactured by Showa Denko KK), and chromatoform as the mobile phase. .
  • Shodex K805L manufactured by Showa Denko KK
  • a commercially available standard polystyrene or the like can be used as the molecular weight standard sample.
  • a gene encoding a PHA synthase mutant derived from Aaeromonas capillar with improved enzyme activity, or a PHA synthesis derived from Aeromonas capillar with improved enzyme activity is provided.
  • a gene encoding a mutant enzyme and a DNA encoding a peroxisome orientation signal added to the gene encoding the mutant Using a gene expression cassette having a motor and a terminator, a recombinant strain of Candida maltosa is prepared, and a polyester can be efficiently synthesized by culturing the transformant.
  • a copolymerized polyester P (copolymerized by copolymerizing 3-hydroxybutyric acid represented by the formula (1) and 3-hydroxyhexanoic acid represented by the formula (2) 3 HB-CO-3HH) can be produced favorably.
  • 3-hydroxyalkanoic acids having biodegradability and excellent physical properties including 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid represented by the above formulas (1) and (2) It has become possible to efficiently produce a copolymerized polyester obtained by co-polymerizing yeast with yeast.
  • Candida's maltosa is an enzyme that translates CTG codons into serine instead of leucine. My mother. For this reason, CTG was not assigned to leucine codons. Codons corresponding to each amino acid were selected preferentially for codons frequently used in Candida's maltosa. The usage frequency of codons was referred to Klaus Wolf's Nonconvendtional Yeast in Biotechnology (published by Springer). In this way, the PHA synthase gene ORF2 (SEQ ID NO: 3 of WO01Z88144) was designed, chemically synthesized, and then cloned into the vector pUCNT (described in WO94Z03613).
  • the PHA synthase gene was cloned using SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 as PCR primers.
  • PUCNT was amplified.
  • Pfu polymerase from Stratagene was used for amplification.
  • the PCR conditions were 1 cycle at 96 ° C, 1 minute at 60 ° C, and 11 minutes at 68 ° C, and this cycle was repeated 18 times.
  • the plasmid was cleaved, E. coli JM109 strain was transformed, and a plasmid was obtained from the transformant.
  • the nucleotide sequence was confirmed using the primers of SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the nucleotide sequence was determined using a DNA Sequencer 310 Genetic Analyzer manufactured by PERKIN EL MER APPLIED BIOSYSTEMS. In this way, a PHA synthase mutant gene ORF2-149NS in which the gene mutation was introduced only at the target site was prepared.
  • the PHA synthase mutant genes ORF2 and ORF2-149NS described in Example 1 were each provided with a Candida's maltosa-derived promoter at the 5 'upstream and a 3' downstream And a terminator.
  • the promoter used was the promoter ARRp with an ARR sequence added upstream of the promoter of the Alk2 gene (GenBank X55881), and the terminator ALK1 t of the Alkl gene (GenBank D00481) of Candida maltosa at the 3 'downstream. was decided to be concatenated.
  • ARRp is obtained by binding the EcoRI-Xhol linker to the Pstl site of the gene (SEQ ID NO: 15) provided by the University of Tokyo and the synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 16 to the EcoT14I site, and Converted to a form that can be cut out.
  • the vector pUALl (described in WO01Z88144) was cut with EcoRI, blunt-ended, and ligated to prepare pUAL2 from which the EcoRI cleavage site had been removed.
  • pUAL2 was digested with Pvul / PvuII, and ligated to the Pvul / Smal site of pSTV28 (Takara Shuzo) to produce pSTALl.
  • Fig. 1 shows a schematic diagram of the construction of pSTARR from pUALl and a schematic diagram of each plasmid.
  • ORF2 and ORF2-149NS described in Example 1 were expressed in Candida 'maltosa and oriented to peroxinorme.
  • Ser_Lys_Leu (SKL) amino acid at the carboxyl terminal was decided to use Ser_Lys_Leu (SKL) amino acid at the carboxyl terminal as a peroxisome orientation signal to be added.
  • ORF2S and ORF2S-149NS were prepared using the ORF2 and ORF2-149NS cloned into pUCNT as type III and SEQ ID NOS: 17 and 18 as primers. These PHA synthase mutant genes were linked to the Ndel and Pstl sites of pSTARR to construct pSTARR-ORF2S and pSTARR_ORF2S149NS.
  • pUTA-1 (described in WO01 / 88144) was used as a vector for finally ligating the PHA synthase mutant gene.
  • pSTARR- ⁇ RF2S and pSTARR- ⁇ RF2S149NS an expression cassette was cut out with Xhol / Sall, and the Sail site of pUTA-1 was bound to construct pARR-ORF2S and pARR-149NS.
  • FIG. 2 shows a scheme for preparing pARR-149NSx2 and the like from pSTARR and a simple diagram of each plasmid.
  • Reagents used for culturing yeast were those sold by Wako Pure Chemical unless otherwise noted.
  • Candida 'Maltosa AC16 strain (FERM BP-7366), which is an ADE1 gene-disrupted strain and is internationally deposited at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, is used.
  • Plasmids pARR- ⁇ RF2S, pARR-149NS, pARR- ⁇ RF2Sx2 and pARR-149NSx2 each containing a gene expression cassette were introduced.
  • the constructed plasmid was introduced into the host by the electric pulse method.
  • Gene transfer device is BTX ELECTRO CELL MANIPULATO R 600 was used.
  • the cuvette used was BM6200 manufactured by BIO MEDICAL CORPORATION CO. LTD. Plasmid 1 / il was added to 100 / il of the competent cells, 100 ⁇ l of the prepared solution of the combi- tive cells / plasmid was taken, injected into a cuvette, and set in a pulse device. Subsequently, an electric pulse was applied under the conditions of a capacitance of 40 zF, a resistance of 246 ohm, and a voltage of 1.9 KV. After the pulsing, 1 ml of 1 M sorbitol was added to each cuvette, mixed gently, and left at room temperature for 1 hour.
  • the transformant was cultured on a selection plate (0.67 w / v% yeast nitrogen base without amino acid (manufactured by Difco), 2 wz% knollose, 2 w / v% agar).
  • a transformant into which the plasmid pARR_149NSx2 has been introduced has been internationally deposited at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as AC16 pUTA_149NSx2 (FERM BP-10019).
  • Candida maltosa transformant into which a gene required for polymer production was introduced was cultured as follows.
  • the medium used was a YNB medium (0.6% w / v% yeast nitrogen base with sodium amino acid, 2% w / v glucose) as a pre-culture medium, an M2 medium (12.7 g / L ammonium sulfate, 1.
  • the glycerol stock 500 of each transformant was inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask containing 50 ml of a pre-culture medium, cultured for 20 hours, and placed in a 2 L Sakaguchi flask containing 300 mL of the production medium at 10 v / v. % Inoculated. This was cultured under the conditions of a culture temperature of 30 ° C., a shaking speed of 90 rpm, and culture for 2 days.
  • the cells were collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 80 ml of distilled water, crushed with an ultra-high pressure homogenizer (APV Rannie2000; 15000 Psi for 15 minutes), and then centrifuged to obtain a precipitate. After washing with methanol, freeze drying did.
  • ADV Rannie2000 ultra-high pressure homogenizer
  • the cells were removed by filtration, the filtrate was concentrated to 12 ml with an evaporator, and about 10 ml of hexane was added to the concentrate to precipitate a polymer.
  • Table 1 shows the culture results.
  • the measurement of the molecular weight was performed as follows. After 10 mg of the collected dry polymer was dissolved in 5 ml of chloroform, insolubles were removed by filtration. This solution was analyzed using a GPC system manufactured by Shimadzu Corporation equipped with Shodex K805L (300x8 mm, two-piece connection) (manufactured by Showa Denko KK), and a chromate form as a mobile phase.
  • GPC system manufactured by Shimadzu Corporation equipped with Shodex K805L (300x8 mm, two-piece connection) (manufactured by Showa Denko KK), and a chromate form as a mobile phase.
  • For the molecular weight standard sample commercially available standard polystyrene was used, and the
  • the PHA of the present invention was compared to yeast transformed with plasmids pARR- ⁇ RF2S and pARR-ORF2Sx2 containing an expression set consisting of a gene encoding a wild-type PHA synthase.
  • the yeast transformed with the plasmids pARR-149NS and pARR-149NSx2 containing the expression cassette comprising the mutant gene encoding the synthetase mutant the polymer content and 3HH fraction are improved, and the PHA synthase mutation of the present invention is improved.
  • the molecular weight of the obtained PHA tended to increase not only by confirming the effect of improving body activity. Thus, the usefulness of the PHA synthase mutant of the present invention was confirmed.
  • a mutant in which aspartic acid, which is the 171st amino acid of PHA synthase, was substituted with glycine was produced using the method described in Example 1.
  • SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 were used as primers for introducing mutations.
  • the 149th amino acid A double mutant in which Gin is replaced with serine and 171 amino acid aspartic acid is replaced with glycine is the same as in Example 1 except that the PHA synthase mutant gene ORF2-149NS prepared in Example 1 is type II. It was produced by the method described above.
  • the PHA synthase mutant gene ORF2-171DG and the PHA synthase double mutant gene ⁇ RF2_149NS / 171DG were completed.
  • ALKlt of pSTARR-ORF2S171DG and pSTARR-ORF2S149NS / 171DG was removed with Pstl / Sall, and a plasmid into which LAC4t amplified with the primers shown in SEQ ID NOS: 22 and 23 was introduced instead was prepared.
  • the PHA synthase mutant expression cassette in which the terminator was replaced was excised with Xhol / Sall, respectively, and ligated to the Sail site of plasmids pARR-171DG and pARR-149NS / 171DG to obtain the PHA synthase mutant gene cassette.
  • Plasmid pARR-171DGx2 and pARR-149NS / 171DGx2 Two transfected plasmids pARR-171DGx2 and pARR-149NS / 171DGx2 were completed.
  • plasmid pARR_149NS / 171DGx2 (FERM BP-10017) has been internationally deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • These plasmids were introduced into Candida 'Maltosa AC16 strain (FERM BP-7366) by the method described in Example 3, polymer production and polymer analysis were performed by the method described in Example 4, and the results were tabulated. 2 and compared with the results of Example 4.
  • the PHA synthase mutant of the present invention was compared to a yeast transformed with the plasmid pARR- ⁇ RF2Sx2 containing an expression set consisting of a gene encoding a wild-type PHA synthase.
  • Plasmid containing an expression cassette consisting of a mutant gene coding for pARR-171DGx2 has an increased polymer content in yeast transformed with an expression cassette consisting of a double mutant gene encoding a PHA synthase double mutant.
  • the yeast transformed with the plasmid containing pARR-149NS / l71DGx2 it was revealed that the polymer content was further improved and the 3HH fraction was improved.
  • the usefulness of the PHA synthase mutant of the present invention was confirmed.
  • 3-hydroxyalkanoic acids having biodegradability and excellent physical properties including 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid represented by the above formulas (1) and (2) It has become possible to efficiently produce a copolymerized polyester obtained by co-polymerizing yeast with yeast.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a pSTARR produced from pUAL1 and a simple diagram of each plasmid in the example.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the preparation of pARR-149NSx2 and the like from pSTARR in the Examples, and a simple diagram of each plasmid.

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Abstract

本発明は、変異の導入されたアエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット；該遺伝子発現カセットを酵母に導入してなる形質転換体；該形質転換体を用いたポリエステルの製造方法である。 本発明により、生分解性及び優れた物性を有する、３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になった。

Description

明 細 書
改良された形質転換体およびそれを用いたポリエステルの製造方法 技術分野
[0001] 本発明は、共重合ポリエステルを酵素合成するために必要な遺伝子、同遺伝子を利 用してポリエステルを発酵合成する微生物、及び、その微生物を用いたポリエステル の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリヒドロキシアル カン酸 (以下、 PHAと略す)等のポリエステルを菌体内に蓄積することが知られてい る。その代表例としては 3—ヒドロキシ酪酸（以下、 3HBと略す）のホモポリマーである ポリ— 3—ヒドロキシ酪酸（以下、 P (3HB)と略す）であり、 1925年にバシラス'メガテリ ゥム（Bacillus megaterium)で最初に発見された（非特許文献 1参照）。 P (3HB) は熱可塑性高分子であり、 自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさし いプラスチックとして注目されてきた。しかし、 P (3HB)は結晶性が高いため、硬くて 脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の 改良を目的とした研究がなされてきた。
[0003] その中で、 3—ヒドロキシ酪酸（3HB)と 3—ヒドロキシ吉草酸（以下、 3HVと略す）とから なる共重合体（以下、 P (3HB-co-3HV)という）の製造方法が開示されている（特 許文献 1、 2参照）。この P (3HB_co_3HV)は P (3HB)に比べると柔軟性に富むた め、幅広い用途に応用できると考えられた。し力 ながら、実際のところ P (3HB— co_ 3HV)は 3HVモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しぐ特にフィル ム等に使用するのに要求される程、柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使 い捨て剃刀の取っ手等硬質成型体の分野にしか利用されなかった。
[0004] 近年、 3HBと 3—ヒドロキシへキサン酸（以下、 3HHと略す）との 2成分共重合ポリエス テル（以下、 P (3HB-CO-3HH)とレ、う）及びその製造方法にっレ、て研究がなされた (特許文献 3、 4参照）。これら特許文献の P (3HB-co-3HH)の製造方法は、土壌 より単離されたァエロモナス'キヤビエ（Aeromonas caviae)を用いて、ォレイン酸 等の脂肪酸ゃォリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、 P (3H B— co— 3HH)の性質に関する研究もなされている（非特許文献 2参照）。この報告で は炭素数が 12個以上の脂肪酸を唯一の炭素源として A. caviaeを培養し、 3HHが 1 1一 19mol%の P (3HB_co_3HH)を発酵生産している。この P (3HB_co_3HH) は 3HHモル分率の増加にしたがって、 P (3HB)の硬くて脆い性質から次第に柔軟 な性質を示すようになり、 P (3HB— co_3HV)を上回る柔軟性を示すことが明らかに された。し力、しながら、上記製造方法では菌体生産量 4gZL、ポリマー含量 30%で あり、ポリマー生産性が低いことから、実用化に向けさらに高い生産性が得られる方 法が探索された。
[0005] P (3HB_co_3HH)を生産するァエロモナス.キヤビエ（A. caviae)より PHA合成酵 素遺伝子がクローニングされた（特許文献 5、非特許文献 3参照）。本遺伝子をラルス トニア'ユートロファ (Ralstonia eutropha、 旧 Alcaligenes eutrophus)に尋入し た形質転換株を用いて、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量 4g / ポリマー含量 80%が達成された (非特許文献 4参照）。また、大腸菌等の細菌 や植物を宿主とした P (3HB— co— 3HH)の製造方法も開示されている力 その生産 性は記載されてレ、なレ、（特許文献 6参照）。
[0006] 上記ポリマー P (3HB-CO-3HH)は 3HHモル分率を変えることで、硬質ポリマーか ら軟質ポリマーまで幅広い物性を持っため、テレビの筐体等のように硬さを要求され るもの力ゝら、糸やフィルム等のような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応 用が期待できる。し力 ながら、先に述べた製造方法では P (3HB-co_3HH)の生 産性が依然として低ぐ P (3HB— co— 3HH)の実用化に向けた生産方法としては未 だ不十分とレ、わざるを得なレ、。
[0007] 最近、吉瀬らにより A. caviae由来の P (3HB_co_3HH)合成酵素を進化工学的に 改変し、大腸菌に遺伝子導入することで、野生型の遺伝子を導入した大腸菌に比べ 、 P (3HB-CO-3HH)を高蓄積する大腸菌を作製する方法が示された (非特許文献 5参照）。その中で P (3HB_co_3HH)合成酵素比活性が向上した株として E2—50 株及び T3—11株が得られてレ、る。 E2—50株は P (3HB-CO-3HH)合成酵素の 149 番目のアミノ酸であるァスパラギンがセリンに置換され、 T3—11株は 171番目のァス パラギン酸がグリシンに置換された変異株である。 E2-50株の変異酵素比活性は天 然型の約 1. 5倍、 T3-11株では約 1. 2倍に向上している。しかし、通常大腸菌は、 炭素源として安価な油脂を資化することができず、また P (3HB-CO-3HH)の構成 単位を合成する経路に必要なァセチル Co— Aの 2量ィヒ酵素を有しないため、別途油 脂分解系や基質供給系の遺伝子を導入する等しなければ、安価で効率的な生産系 が得られない。またアマラらも比活性が 5倍に向上する変異体を取得しているが、グ ルコースを炭素源としたときのポリマー生産性は僅かに向上したにすぎなかった（非 特許文献 6参照）。大腸菌においては、活性の向上した変異型ポリマー合成酵素は、 十分にその能力を発揮できないし、また大腸菌は安価な植物油脂を炭素源として直 接利用することは出来ない等、経済性の面でポリマー生産宿主としての実用性に乏 しい。
[0008] 菌体生産性の高い酵母を宿主とした生分解性ポリエステルの生産研究が Leafらによ つて行われた（非特許文献 7参照）。酵母の一種であるサッカロマイセス'セルピシェ（ Saccharomyces cerevisiae) (こフノレストニゾ 'ユートロファ (R. eutropha)の 、リエ ステル合成酵素遺伝子を導入して形質転換体を作製し、グルコースを炭素源として 培養することによって P (3HB)の蓄積を確認している。しかし、上記研究で生産され るポリマー含量は 0· 5%に留まり、そのポリマーは硬くて脆い性質を有する P (3HB) であった。脂肪酸を炭素源として、酵母サッカロマイセス'セルピシェにシユードモナ ス属（Pseudomonas aeruginosa)由来のポリエステル合成酵素遺伝子を発現させ 、炭素数 5以上のモノマーを含む共重合ポリマーを生産する検討もなされた。この場 合も生産されるポリマー含量は 0. 5%に留まった（非特許文献 8参照）。さらに、酵母 ピキア'パストリス（Pichia Pastoris)のペルォキソームに、同シユードモナス種由来 のポリエステル合成酵素遺伝子を配向発現させ、ォレイン酸を炭素源としてポリエス テルを生産させる検討もなされている。この研究によれば乾燥菌体当たり 1 %重量の ポリマーを蓄積することが示されてレ、る（非特許文献 9参照）。しかしこの程度の蓄積 量では、全く不十分である。
[0009] 酵母は増殖が早く菌体生産性が高いことで知られている。その中でもキャンディダ（C andida)属に属する酵母は、過去 Single Cell Proteinとして注目され、ノルマル Γ炭素源とした飼料用菌体生産が研究されてきた。また、近年- (Candida)属の宿主ベクター系が開発され、遺伝子組換え技術を用いた物質生産 が報告されている（非特許文献 10参照）。キャンディダ.ユーティリス（Candida utili s)を宿主としたひアミラーゼの生産性は約 12. 3g/Lと高く、このように高い物質生 産能力を有するキャンディダ（Candida)属は、ポリマー生産用宿主として期待される 。さらに、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であることから、ポリマーの抽出 精製工程をより簡単にすることも可能である。
[0010] そこで、優れた物性を有する P (3HB-CO-3HH)をキャンディダ (Candida)属酵母 等を用いて生産する方法が開発されている力 ポリマー生産性の点でさらに改良を 加える必要があった（特許文献 7参照）。菌体当たりのポリマー生産量を向上させる方 法の一つとして、ポリマー合成酵素の菌体内量を増加させる方法が挙げられる。ポリ マー合成酵素の菌体内量を増加させる方法としては、強力なプロモーターを用いる 方法やコピー数の多いプラスミドを用いる方法、プラスミドあるいは染色体に酵素発 現ユニットを多数導入する方法等がある。しかしながら、菌体当たりの酵素の分子数 を増すと、生産されるポリマーの分子量低下が起こることが知られてレ、る（非特許文献 11、 12参照）。ポリマーの分子量は生分解性ポリマーの物性に多大な影響を与える ため、分子量の低下を招くことなぐ生産性を向上させる方法の開発が望まれていた
[0011] 特許文献 1 :特開昭 57 - 150393号公報
特許文献 2 :特開昭 59— 220192号公報
特許文献 3：特開平 5 - 93049号公報
特許文献 4 :特開平 7— 265065号公報
特許文献 5：特開平 10 - 108682号公報
特許文献 6 :国際公開第 00/43525号パンフレット
特許文献 7：国際公開第 01/88144号パンフレット
非特許文献 1 : M. Lemoigne, Ann. Inst. Pasteur, 39， 144 (1925)
非特許文献 2 : Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe, Macromolecules 28, 4822-4 823 (1995) 特許文献 3 : T. Fukui, Y. Doi, J. Bacteriol, vol. 179, No. 15, 4821-4830 (1997)
非特許文献 4 : T. Fukui等 Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 333 (1998) 非特許文献 5 : T. Kichise等 Appl. Environ. Microbiol. 68, 2411-2419 (20 02)
非特許文献 6 : Amara AA.等 Appl. Microbiol. Biotechnol. 59, 477-482 ( 2002)
非特許文献 7 : Microbiology, vol. 142, ppl 169— 1180 (1996)
非特許文献 8 : Poirier Y.等 Appl. Microbiol. Biotechnol. 67, 5254-5260
(2001)
非特許文献 9 : Poirier Y.等 FEMS Microbiology Lett.， vol. 207, pp97_ 102 (2002)
特許文献 10 :ィ匕学と生物 vol. 38, No. 9, 614 (2000)
非特許文献 l l : Sim S. J.等 Nature Biotechnology, vol. 15, pp63_67 (19 97)
非特許文献 12 : Gerngross T. U. , Martin D. P. , Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, vol. 92, pp6279-6283 (1995)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明は、上記現状に鑑み、酵母で機能的かつ効率よく発現できる PHA合成酵素 変異遺伝子、同変異遺伝子から成る遺伝子発現カセットを酵母に形質転換した形質 転換体、及び得られた形質転換体を培養することにより、生分解性及び優れた物性 を有する P (3HB-CO-3HH)等のポリエステルを製造する方法を提供することを目 的とする。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは様々な検討を行った結果、ァエロモナス'キヤビエ由来の PHA合成酵 素のアミノ酸配列に特定の変異を導入した変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子 を作製し、これら遺伝子のそれぞれに、酵母で実質的に機能するプロモーター、ター ミネーターを連結することにより遺伝子発現カセットを作製し、さらに本遺伝子発現力 セットを酵母に導入して形質転換株を作製し、本形質転換株を培養することにより、 その培養物から極めて高い生産性が期待できる方法でポリエステルを製造できること を見いだした。
[0014] 即ち、本発明は、酵母におけるァエロモナス'キヤビエ由来 PHA合成酵素変異体の 遺伝子の利用に関する。
具体的には、配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるァエロモナス'キヤビエ由来 の PHA合成酵素に、以下の（a)— (h)のアミノ酸置換を少なくとも 1つ行ってなる PH A合成酵素変異体をコードする PHA合成酵素変異遺伝子と、酵母で機能するプロ モーター及びターミネータ一からなる遺伝子発現カセットに関する。
(a) Asn_149を Serに
(b) Asp_171をGlyに
(c) Phe— 246を Ser又は Ginに
(d) Tyr_318を Alaに
(e) Ile_320を Ser、 Ala又は Valに
(f) Leu_350を Valに
(g) Phe— 353を Thr、 Ser又は Hisに
(h) Phe— 518を lieに
[0015] また、本発明は、上記 PHA合成酵素変異体をコードする PHA合成酵素変異遺伝子 に、ペルォキシソーム配向シグナルをコードする DNAが付加されてなる遺伝子に関 する。
その好ましい実施態様としては、ペルォキシソーム配向シグナル力 配列番号 2又は 配列番号 3によって示されるアミノ酸配列からなる上記遺伝子；さらに好ましくは、ぺ ルォキシソーム配向シグナルをコ一ドする DNAの塩基配列が、配列番号 4又は配列 番号 5によつて示されるものである上記遺伝子に関する。
別の好ましい実施態様としては、ァエロモナス'キヤビエ由来の PHA合成酵素をコー ドする遺伝子の遺伝暗号 CTGの少なくとも 1つ力 TTA、 TTG、 CTT、 CTC又は C TAに変換されているものである上記遺伝子に関する。 [0016] さらに、本発明は、上記遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネータ一 力 H
oなる遺伝子発現カセットに関する。
また、本発明は、該遺伝子発現カセットが、酵母に 1つ以上導入されてなることを特 c
徴とする形質転換体；好ましくは、酵母がキャンディダ ·マルトーサである上記形質転 換体に関する。
H c
[0017] さらに、本発明は、該一形 2 質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採 o c
取することを特徴とするポリエステルの製造方法に関し;好ましくは、ポリエステルが、 下記式（1)で示される 3_ヒドロキシ酪酸と下記式（2)で示される 3—ヒドロキシへキサ ン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルである上記ポリエステルの製造方法に関 する。
[0018] [化 1]
CH 3
HO― CH—— C— C— OH ( 1 )
H2 0
OH ( 2 )
[0019] 以下に、本発明を詳細に説明する。
(1)ポリエステル合成酵素の有用な変異体
本発明においては、配列番号 1で表されるァエロモナス'キヤビエ由来の PHA合成 酵素のアミノ酸配列に、以下の（a)—（h)のアミノ酸置換を少なくとも 1つ行って得ら れる PHA合成酵素変異体を、有用な変異体として用いる。
(a) Asn_149を Serに
( 3)八3 _171を0 に
(c) Phe— 246を Ser又は Ginに
(d) Tvr_318を Alaに (e) Ile_320を Ser、 Ala又は Valに
(f) Leu_350を Valに
(g) Phe— 353を Thr、 Ser又は Hisに
(h) ?1½—518を1
[0020] ここで、例えば、「Asn_149」とレ、うのは、アミノ酸配列において 149番目のァスパラ ギンを意味し、 （a)のアミノ酸置換は 149番目のァスパラギンをセリンに変換すること を意味する。
[0021] 上記変異体を得る方法としては、例えば以下のような方法等が挙げられる。ァエロモ ナス .キヤビエ（Aeromonas caviae)等の細菌由来のポリエステル合成酵素のアミ ノ酸配列を改変し、酵素活性'基質特異性'熱安定性等の性質の改良された変異体 を取得する方法は種々知られているが、特に分子進化工学的手法（特開 2002— 19 9890号公報)等が、迅速に所望の変異体を得られることから有用性が高い。また、コ ンピュータ上で酵素の立体構造又は予想される立体構造を基に、有用なアミノ酸変 異を特定することも、例えばプログラム Shrike (特開 2001-184831号公報）等を用 いて可能である。
[0022] このようにして特定されたアミノ酸置換 (変異）が、 目的宿主に対して予想通りの効果 を示すものであるか否かは、実際に適応してみて初めて確認が出来る。なぜならば、 前述の T. Kichise等 Appl. Environ. Microbiol. 68, 2411— 2419 (2002)や、 Amara AA.等 Appl. Microbiol. Biotechnol. 59, 477— 482 (2002)の大腸 菌を用いた分子進化工学的手法で得られる変異体は、その変異体を取得するのに 用いた大腸菌生育条件において最も適応した変異体であり、異なる生育条件やまし てや別の菌種において適応する保証はなぐまた、コンピュータ上で作製される変異 体は確度が未だ十分では無レ、からである。
[0023] また、分子進化工学的手法等によって得られた変異は、それらを組み合わせることで さらに好適な変異体を得ることができ、本発明においては、上記（a)—（h)のアミノ酸 置換を 2つ以上行って得られた変異体も好ましく用いられる。
[0024] (2)酵母用変異遺伝子の作製
上記（1)に記載の方法によって得られた変異体をコードする遺伝子としては、配列番 号 1で表されるアミノ酸配列からなるァエロモナス'キヤビエ由来の PHA合成酵素遺 伝子に、上記（1)のアミノ酸置換に対応する DNA変異を行ったもの等が挙げられる 。また、酵母に適応した PHA合成酵素遺伝子中に、上記（1)のアミノ酸置換に対応 する DNA変異を導入したものが好ましレ、。
[0025] 酵母に適応した PHA合成酵素遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ァェ ロモナス ·キヤビエ由来の PHA合成酵素遺伝子と同じアミノ酸配列をキャンディダ ·マ ルトーサにおいてコードする遺伝子である〇RF2 (W〇01/88144の配列番号 3に 記載)等が挙げられる。
[0026] 即ち、細菌由来の遺伝子をそのまま用いると、宿主酵母の中には遺伝暗号読みとり に異常を示す場合があり、例えば、キャンディダ'マルトーサ（Candida maltosa) ( H. Sugiyama et al, Yeast 11 43— 52 (1995) )では遺伝暗号 CTG力 口イシ ンではなくセリンに翻訳される。このような問題は、予め遺伝子内に含まれる遺伝喑 号 CTGの少なくとも 1つを、ロイシンに対応する他の遺伝暗号 (TTA, TTG, CTT, CTC, CTA)に変換した遺伝子を使用することによって解決することができる。さらに 、使用宿主における遺伝子を構成する遺伝暗号使用頻度を考慮し、使用頻度の高 い遺伝暗号に変更した遺伝子を作製 ·利用することが出来る。
[0027] 上記（1)に記載のアミノ酸置換 (変異）を、上述の酵母に適応した PHA合成酵素遺 伝子中に導入するためには、部位特異的変異法を用いて所望の部位に、遺伝子喑 号の変異を導入することができる。遺伝子のアミノ酸配列を部位特異的に変異させる 方法は、組換え DNA法、 PCR法等を用いて行うことが出来る。例えば、 PHA合成酵 素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列 が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む 領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入した DNA断片 を揷入するカセット変異法によって行うことが出来る。また、 PCRによる部位特異的変 異の導入は、 PHA合成酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の 変異を導入した変異用プライマーと、前記遺伝子の末端部位の配列を含む変異を有 しない増幅用プライマーとで、前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマー に対して相補的な配列を有する変異用プライマーと、前記遺伝子のもう一方の末端 部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで、もう片方を増幅し、得られ た 2つの増幅断片をァニール後、さらに前記 2種類の増幅用プライマーで PCRをす る事により行うことが出来る。得られた部位特異的構築物について、塩基配列を決定 することにより確認を行う。塩基配列の決定は、当該技術分野で公知の手法により、 自動塩基配列決定器等を用いて行うことが出来る。
[0028] 一般に、酵母を用いてポリエステルを発酵生産させる場合、炭素源はブドウ糖や油 脂類、脂肪酸類等、酵母が利用できるものであれば特に制限なく利用することができ る。特に、油脂類、脂肪酸類あるいは n-パラフィン等を炭素源としてポリエステルを 発酵生産する場合、これらの炭素源は β酸化経路を経て代謝されるが、 β酸化経路 の代謝中間体は効率よくポリエステル合成の基質として利用される (T. Fukui, Y. D oi, J. Bacteriol.， 179, No. 15, 4821—4830 (1997)； Q. Ren等， J. Bacteriol . , 182, No. 10， 2978—2981 (2000) )。ここで、酵母における /3酸ィ匕は糸田胞内小 器官であるペルォキシソーム内で行われることから、ポリエステルの効率の良い合成 のためには、ポリエステル合成に関与する酵素がペルォキシソームに局在することが 好ましい。
[0029] ペルォキシソームへ輸送されるタンパク質は、遊離のリボソーム上で合成され、そのタ ンパク質配列中にあるペルォキシソーム配向シグナルの働きにより、ペルォキシソー ムへ輸送される（S. Subramani, J. Membrane Biol. , 125, 99—106 (1992)、 板井康肯 ィ匕学と生物， 35, No. 10, 687—695 (1997)、 E. H. Hettema, Bioch im. Biophys. Acta, 1451 , 17—34 (1999) )。
[0030] 従って、本発明においては、これらペルォキシソーム配向シグナルをコードする DN Aを、ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子、即ち上記 PHA合成 酵素変異遺伝子に付加させるのが好ましぐこのことにより、ポリエステルの合成に関 与する酵素、即ち PHA合成酵素変異体をペルォキシソームに局在化させることがで き、ポリエステルを効率よく合成することができる。
[0031] カルボキシル末端にあるペルォキシソーム配向シグナルとして、 3つのアミノ酸配列 力 成る「（セリン/ァラニン Zシスティン)—（リジン Zアルギニン/ヒスチジン)—ロイ シン」が知られている。ここで、例えば、（セリン/ァラニン/システィン）とは、セリン、 ァラニン又はシスティンのレ、ずれかであるとレ、うことを意味する。 PHA合成酵素変異 体をペルォキシソームに配向させるためには、前記 3アミノ酸を同酵素のカルボキシ ル末端に付加すればよい。このうち、一般的なカルボキシル末端ペルォキシソーム 配向シグナルとして知られている「セリン一リジン一口イシン」（以下 SKLと略す）（配列 番号 2)や、キャンディダ 'トロピカリス（Candida tropicalis)でカルボキシル末端ぺ ノレォキシソーム配向シグナルとして知られている i. D. Aitchison et al, J. Biol. Chem. 266, 23197— 23203 (1991) )「ァラニン—リジン—イソロイシン」（以下 AKI と略す）（配列番号 3)をカルボキシノレ末端に付加するのが好ましい。
上記アミノ酸に対応する塩基配列に特に制限はなぐ例えば SKLであれば配列番号 4、 AKIであれば配列番号 5の塩基配列を使用することができる。
[0032] また、 N末端付近に存在する 9つのアミノ酸配列「（アルギニン/リジン)—(ロイシン Z バリン Zイソロイシン) - (5アミノ酸)― (ヒスチジン/グノレタミン) - (ロイシン Zァラニン） 」もペルォキシソーム配向シグナルとして知られている。これらの配列を PHA合成酵 素変異体に挿入、付加することによつても、同酵素をペルォキシソームに局在させる こと力 Sできる。
[0033] 上記ペルォキシソーム配向シグナルをコードする DNAを PHA合成酵素変異遺伝子 に付加させるためには、化学合成法、 PCR法等を用いることが出来る。
[0034] (3)遺伝子発現カセットの構築
本発明の遺伝子発現カセットは、上記（2)の変異遺伝子と、酵母で機能するプロモ 一ター及びターミネータ一からなるものである。
[0035] 上記（2)の変異遺伝子を酵母で発現させるには、当該遺伝子の^ 上流にプロモー ター、上流活性化領域 (UAS)等の DNA配列が、当該遺伝子の 3' 下流にポリ A付 加シグナル、ターミネータ一等の DNA配列が必要である。酵母の染色体上に上記 条件を満たす適当な部位があれば、当該遺伝子を直接挿入しても良いし、また、適 当なプロモーター及びターミネータ一を有するプラスミドに当該遺伝子を揷入し、この プラスミドを酵母に形質転換させることもできる。
本発明においては、当該遺伝子の 5'上流にプロモーター、 3 '下流にターミネータ一 を連結した遺伝子発現カセットを構築し、これを酵母に形質転換するのが好ましレ、。 [0036] 使用するプロモーター、ターミネータ一は、宿主となる酵母で機能するものであれば どのような配列でも利用できる。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的 に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターも用いてもよレ、。本発明において、 宿主としてキャンディダ 'マルトーサを使用する場合には、上記プロモーター、ターミ ネーターが、キャンディダ'マルトーサで機能するものであることが好ましぐ上記プロ モーター、ターミネータ一がキャンディダ 'マルトーサ由来であることが好ましレ、。より 好ましくは、キャンディダ 'マルトーサの ALK1、 ALK2、 ALK5遺伝子由来のプロモ 一ター、 ALK1遺伝子由来のターミネータ一を利用する。
[0037] 例えば、プロモーターとしてはキャンディダ 'マルトーサの ALK1遺伝子（GenBank
D00481)のプロモーター ALKlp (WOOl/88144)、 ALK5遺伝子のプロモータ 一 ALK5p (配列番号 6)等を用いることができる。さらに、これらのプロモーターの上 流に ARR (アルカン レスポンシブノレ リージョン）配列を複数個付加することによりプ 口モーター活性を向上させたプロモーター (木暮ら 2002年日本農芸化学大会講演 要旨集 pl 91)を利用することもできる（配列番号 7)。また、ターミネータ一としては キャンディダ 'マルトーサの ALK1遺伝子のターミネータ一 ALKlt (WO01/88144 )等を用いることができる。
[0038] なお、上記プロモーター、ターミネータ一の塩基配列は、キャンディダ 'マルトーサで 機能する配列であれば、 1つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換及び/又は、付加 された塩基配列であってもよい。ここで、 「1つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換お よび/または付加された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素 増刊 遺伝子増幅 PCR法 TAKKAJ 35 (17) , 2951-3178 (1990)又は Henry A. Erlich編 カロ藤郁之 進鑑訳 PCRテクノロジー（1990)等に記載の当業者に周知の方法により、欠失、置 換および/または付加できる程度の数の塩基が、欠失、置換および/または付加さ れてなる塩基配列を意味する。
[0039] 上記プロモーターは、ペルォキシソーム配向シグナルをコードする DNAが付加され たァエロモナス.キヤビエ由来の PHA合成酵素変異体をコードする遺伝子の 5 '上流 に、ターミネータ一は、ペルォキシソーム配向シグナルをコードする DNAが付加され た PHA合成酵素変異体をコードする遺伝子の 3'下流に、それぞれ連結される。 [0040] 遺伝子発現カセットの構築に用いられるベクターは、大腸菌において自律増殖する プラスミドであればどのようなベクターでもよぐさらに酵母において自律増殖可能な 領域を合わせ持っていてもよい。酵母において自律増殖できるベクターは、菌体内 に保持される。また、遺伝子発現カセットを染色体上に組み込むこともできる。ベクタ 一の一例として、キャンディダ 'マルトーサにおいて自律増殖可能な pUTUlを用い ること力 Sできる（M. Ohkuma, et al, J. Biol. Chem.， vol. 273, 3948—3953 (1 998) )。
[0041] プロモーター及びターミネータ一と構造遺伝子を連結し、本発明の遺伝子発現カセ ットを構築する方法は、特に限定されるものではない。後述の本実施例に記載の方 法の他に、制限酵素部位を作製するために PCR法も利用できる。例えば、 WO01/ 88144に記載の方法が使用できる。
[0042] (4)宿主
本発明でレ、う酵母には特に制限はなぐ菌株の寄託機関（例えば IFO、 ATCC等）に 寄託されている、ァシクロコニディウム属（Aciculoconidium属），アンブロシォザィ マ属 (Ambrosiozyma属)，ァノレスロアスカス属 (Arthroascus属)，アルキシォザィ マ属 (Arxiozyma属)，ァシュビア属 (Ashbya属)，バブジエビア属 (Babjevia属)， ベンシングトニァ属 (Bensingtonia属)，ボトリオァスカス属 (Botryoascus属)，ボトリ ォザイマ属 (Botryozyma属)，ブレツタノマイセス属 (Brettanomyces属)，ビユレラ 属 (Bullera属)，ビユレロマイセス属 (Bulleromyces属)，キャンディダ属 (Candida 属)、シテロマイセス属 (Citeromyces属)，クラビスポラ属 (Clavispora属)，タリプト コッカス j¾ (Cryptococcusjft,) ,シストフイロノヽンアイゥム為 (Cystofilobasidium属) ,デバリオマイセス属（Debaryomyces属），デッケラ属（Dekkara属），ディポダスコ プシス属（Dipodascopsis属），ディポダスカス属（Dipodascus属），ェニエラ属 (Ee niella属)，エンドマイコプセラ属 (Endomycopsella属)，エレマスカス属 (Eremasc us属)，ェレモセシウム属 (Eremothecium属)，エリスロバシディウム属 (Erythroba sidium属)，フエロマイセス属 (Fellomyces属)，フィロノくシディウム属 (Filobasidiu m属），ガラクトマイセス属（Galactomyces属），ゲオトリクム属（Geotrichum属），ガ イラ一モンテラ属 (Guilliermondella属)，ノヽンセニァスポラ属 (Hanseniaspora属) , ノヽンセヌラ ϋ (Hansenulail) , ノヽセガ 1 エア ϋ (tiasegawaeail) ,ホノレ夕一マン ニァ属 (Holtermannia属)，ホノレモアスカス属 (Hormoascus属)，ハイフォピキア属 (Hyphopichia属)，ィサットヘンキア属 (Issatchenkia属)，クロエケラ属 (Kloecker a属)，クロエケラスポラ属 (Kloeckeraspora属)，タノレイべロマイセス属 (Kluyverom yces属），コンドア属（Kondoa属），クライシァ属（Kuraishia属），クルツマノマイセス j¾ (Kurtzmanomyces属リ，ロイコスポリディ1ノム (Leucosporidium属)，リホマイ セス属 (Lipomyces属)，ロデロマイセス属 (Lodderomyces属)，マラセジァ属 (Mai assezia属)，メトシュニコウイァ属 (Metschnikowia属)，ムラキア属 (Mrakia属)，マ イクソザイマ属（Myxozyma属），ナドソニァ属（Nadsonia属），ナカザヮエア属（Na kazawaea属)，ネマトスポラ属 (Nematospora属)，ォガタエァ属 (OgataeaJS)，ォ ースポリディウム属（Oosporidium属），パチソレン属（Pachysolen属），ファチコス ポラ属 (Phachytichospora属)，ファフィァ属 (Phaffia属)，ピキア属 (Pichia属)，口 ドスポリディウム属 (Rhodosporidium属)，ロドトノレラ属 (Rhodotorula属)，サッカロ マイセス^! (SaccharomycesJ禹)，サッカロマイコーテス属 (Saccharomycodes属 ,サッカロマイコプシス属 (Saccharomycopsis属)，サイトエラ属 (Saitoella属)，サ カグチア属（Sakaguchia属），サターノスポラ属（Satumospora属），シゾブラストス ポリオン属 (SchizoblastosporiorU禹)，シゾサッ刀口マイセス属 (Schizosaccharom yces属)，シュヮニォマイセス属 (Schwanniomyces属)，スポリディオボラス属 (Spo ridiobolus属)，スポロボロマイセス属 (Sporobolomyces属)，スポロパキデミァ属 ( Sporopachydermia属)，ステファノァスカス属 (Stephanoascus属)，ステリグマトマ イセス属 (Sterigmatomyces属)，ステリグマトスポリディウム属 (Sterigmatosporidi um属），シンビォタフリナ属（Symbiotaphrina属），シンポディォマイセス属（Symp odiomycesj¾) ,シンホティォマィコフシス属 (Sympodiomycopsis属)， トノレフスホ ラ属 (Torulaspora属)，トリコスポリエラ属 (Trichosporiella属)，トリコスポロン属 (T richosporon属)，トリコノフシス属、 i'rigonopsis属リ，ツチヤエァ j¾ (Tsuchiyaea晨 ) ,ゥデュオマイセス属 (Udeniomyces属)，ヮノレトマイセス属 (Waltomyces属)，ゥ イカ一ハミァ属 (Wickerhamia属)，ウイカーノヽミエラ属 (Wickerhamiella属)，ゥイリ ォプシス属（Williopsis属），ヤマダザイマ属（Yamadazyma属），ャロウィァ属（Yarr owia属)，ザィゴァスカス属 (Zygoascus属)，ザィゴサッカロマイセス属 (Zygosacch aromyces属)，ザィゴウイリオプシス属 (Zygowilliopsis属)，ザィゴザイマ属 (Zygoz yma属）等の酵母を使用することができる。
[0043] また、本発明の形質転換体の宿主として用いられる酵母としては、特に限定されない が、上記のなかでも、キャンディダ属、ャロウィァ属のものが好ましぐキャンデイダ-マ ノレトーサ (Candida maltosa)、ャロウィァ'リポリティ力 (Yarrowia lipolytica)がよ り好ましぐキャンディダ'マルトーサが特に好ましい。
[0044] なお、宿主として用いられる酵母のうち、 Candida maltosa AC16株は、受託番号
FERM BP—7366として、平成 12年 11月 15日に、 日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一に国際寄託されている。
[0045] (5)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、上記（3)の遺伝子発現カセットが、酵母に 1つ以上導入さ れてなるものである。
[0046] ポリマー合成に関与する遺伝子発現カセット組換えベクターを酵母に導入するため には、公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウム法（Lederberg. E. M . et al. , J. Bacteriol. 119. 1072 (1974) )やエレクト口ポレーシヨン法（Current Protocols in Morecular Biology, 1卷、 1. 8· 4頁、 1994年）等を用いること ができる。また、 Fast TrackTM— Yeast Transformation KitSM (Geno Tec hnology)のような市販の形質転換キットを利用することもできる。
[0047] 一例として宿主として、キャンディダ.マルトーサ CHA1株（S. Kawai, et al, Agric . Biol. Chem.， vol. 55, 59—65 (1991) )を用レヽることカできる。上記の形質転換 法を用いて、ポリマー合成に関与する遺伝子発現カセットを含むプラスミドベクター等 で、本菌株を形質転換し、後述の実施例に示すような pARR— ORF2S等のプラスミド を有するキャンディダ*マルトーサ形質転換体を作製することができる。
[0048] なお、プラスミド pARR— 149NSx2が導入された形質転換体である AC16 pUTA— 149NSx2 (受託番号 FERM BP— 10019、原寄託日平成 15年 5月 8日の国内寄 託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、 プラスミド pARR_149NS/171DGx2 (受託番号 FERM BP_10017、寄託日平 成 16年 4月 27日、ブダペスト条約に基づく国際寄託）、
はそれぞれ、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。
[0049] (6)ポリエステルの製造
本発明のポリエステルの製造方法では、本発明の上記形質転換体を培養して得られ る培養物から、ポリエステルを採取する。
つまり、本発明のポリエステルの製造は、培養培地に上記形質転換体を添加して培 養した後、得られた当該培養菌体又は培養物からポリエステルを回収することにより 行うことができる。ここで、培養温度は、その菌の生育可能な温度、好ましくは 15°C 40°C、より好ましくは 20°C— 40°C、さらに好ましくは 28°C 34°Cである。また、培養 時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では 1一 7日間が好ましぐまた連 続培養も可能である。
[0050] 培養培地は、酵母が利用できるものである限り特に限定されない。例えば、炭素源、 窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる
[0051] 炭素源としては、酵母が資化できるものである限り特に限定されず、例えば炭水化物 、油脂類、脂肪酸類、 n-パラフィン等を用いることができる。炭水化物としては、例え ばグノレコース、シユークロース、グリセリン等が挙げられる。油脂類としては、例えばナ タネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸類としては、例えば へキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ォレイン酸、パルミチン酸、リノール酸 、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和 '不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステ ルゃ塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。 n-パラフィンとしては、例えばドデカン、テ トラデカン等が挙げられる。
また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質 (例えば、アルコ ール等）を添加すればよい。誘導物質が主要炭素源である場合もある。
[0052] 一例として、キャンディダ'マルトーサの培養において、炭素源として油脂類を用いて 培養することもできる。また、油脂を資化できなレ、かまたは効率よく資化できない酵母 では、培地中にリパーゼを添加することによって改善することもできる。さらに、リパー ゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資化能を付与することもできる。
[0053] 窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、リン酸ァ ンモニゥム等のアンモニゥム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる 無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸' ム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、ァラニン、セリン、スレオニン、プロリ ン等のアミノ酸類；ビタミン Bl、ビタミン B12、ピオチン、ニコチン酸アミド、パントテン 酸、ビタミン C等のビタミン類等が挙げられる。
[0054] 本発明において、ポリエステルの菌体からの回収は、例えば次のような方法が使用で きる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水及 びメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体からクロ口ホルム等の有 機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液か ら濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやへキサン等の貧溶媒 をカ卩えてポリエステルを沈殿させる。沈殿したポリエステルから濾過や遠心分離によ つて上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。本発明で は、ポリエステルを生産する菌体として酵母を使用するため、上記のような簡便な分 離回収方法が利用可能である。
[0055] 得られたポリエステルの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等に より行う。分子量の測定には、 GPC法が利用できる。回収した乾燥ポリマーをクロロホ ノレムで溶解したのち、この溶液を、 Shodex K805L (昭和電工社製）を装着した島 津製作所製 GPCシステムを用レ、、クロ口ホルムを移動相として分析する事が出来る。 分子量標準サンプノレには市販の標準ポリスチレン等が使用できる。
[0056] 上述したように、本発明においては、酵素活性の改良されたァエロモナス.キヤビエ 由来の PHA合成酵素変異体をコードする遺伝子、又は、酵素活性の改良されたァ エロモナス.キヤビエ由来の PHA合成酵素変異体をコードする遺伝子に、ペルォキ シソーム配向シグナルをコードする DNAを付加した遺伝子と、酵母で機能するプロ モーター及びターミネータ一を有する遺伝子発現カセットを用いて、キャンディダ 'マ ルトーサ組み換え株を作製し、該形質転換体を培養する方法により、ポリエステルを 率よく合成することができる。
[0057] また、本発明においては、ポリエステルとして、式（1)で示される 3—ヒドロキシ酪酸と 式（2)で示される 3—ヒドロキシへキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステル P (3 HB-CO-3HH)が好 2ましく製造できる。
[0058] [化 2]
CH 3
HO― CH—— C— C— OH ( 1 )
H2 0
Figure imgf000019_0001
発明の効果
[0059] 本発明により、生分解性及び優れた物性を有する、上記式（1)、（2)で示される 3—ヒ ドロキシ酪酸や 3—ヒドロキシへキサン酸をはじめとする 3—ヒドロキシアルカン酸を共重 合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になつ た。
発明を実施するための最良の形態
[0060] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実 施例にその技術範囲を限定するものではない。
[0061] (実施例 1) PHA合成酵素遺伝子の合成と改変
配列番号 1に示されるァエロモナス 'キヤビエの由来の PHA合成酵素（T. Fukui, et al, FEMS Microbiology Letters, vol. 170, 69—75 (1999) )のアミノ酸酉己歹 (J をもとに、当該 PHA合成酵素遺伝子を合成した。
また、キャンディダ'マルトーサは、 CTGコドンをロイシンではなくセリンに翻訳する酵 母である。このため、ロイシンコドンには CTGを割り当てなかった。各アミノ酸に対応 するコドンは、キャンディダ'マルトーサにおいて使用頻度の高いコドンを優先的に選 択した。コドンの使用頻度は、 Klaus Wolf著の Nonconvendtional Yeast in B iotechnology (Springer出版）を参考にした。このようにして PHA合成酵素遺伝子 ORF2 (WO0lZ88144の配列番号 3)を設計し、化学合成した後、ベクター pUCN T (W〇94Z03613に記載）にクローニングした。
[0062] 次に、該 PHA合成酵素の 149番目のアミノ酸であるァスパラギンをセリンに置換する ため、 PCR用プライマーとして配列番号 8と配列番号 9を用いて PHA合成酵素遺伝 子のクローニングされてレ、る pUCNTを増幅した。増幅には Stratagene社製 Pfuポリ メラーゼを用いた。 PCRの条件は 96°Cで 1分、 60°Cで 1分、 68°Cで 11分を 1サイク ルとし、これを 18回繰り返した後、制限酵素 Dpnlをカ卩え、铸型としたプラスミドを切断 し、大腸菌 JM109株を形質転換し、形質転換体よりプラスミドを得た。配列番号 10か ら 14のプライマーを使用し、塩基配列を確認した。塩基配列決定は、 PERKIN EL MER APPLIED BIOSYSTEMS社製の DNAシークェンサ一 310 Genetic Analyzerを用いた。このようにして遺伝子変異が目的部位のみに導入された PHA 合成酵素変異遺伝子 ORF2— 149NSを作製した。
[0063] (実施例 2) PHA合成酵素変異遺伝子発現カセットの構築
キャンディダ'マルトーサで PHA合成酵素を発現させるために、実施例 1に記載の P HA合成酵素変異遺伝子 ORF2、 ORF2—149NSにおける、それぞれの 5'上流に キャンディダ 'マルトーサ由来プロモーターを、 3'下流にターミネータ一を連結するこ とにした。プロモーターとしては、 Alk2遺伝子（GenBank X55881)のプロモータ 一の上流に ARR配列を付加したプロモーター ARRpを用レ、、 3 '下流には共にキヤ ンデイダ.マルトーサの Alkl遺伝子（GenBank D00481)のターミネータ一 ALK1 tを連結することにした。 ARRpは、東京大学より分与された遺伝子（配列番号 15)の Pstlサイトに EcoRI— Xholリンカ一を結合させ、 EcoT14Iサイトに配列番号 16に示 した合成 DNAを結合させることにより、 Xhol及び Ndelで切り出すことの出来る形に 変換した。ベクター pUALl (WO0lZ88144に記載）を EcoRIで切断後、平滑末端 化しライゲーシヨンを行うことにより、 EcoRI切断部位を除去した pUAL2を作製した。 pUAL2を Pvul/PvuIIで切断し、 pSTV28 (宝酒造社製）の Pvul/Smalサイトに 結合させ、 pSTALlを作製した。この pSTALlを EcoRl/Ndelで切断し、先に述べ た ARRpと結合させ、 pSTARRを作製した。図 1に pUALlから pSTARRを作製した 模式と、それぞれのプラスミドの模式図を示した。
[0064] 実施例 1に記載の ORF2、 ORF2—149NSがキャンディダ 'マルトーサで発現し、ぺ ルォキシノームに配向するように、カルボキシル末端にペルォキシソーム配向シグナ ルを付加することにした。付加するペルォキシソーム配向シグナルとしては、カルボキ シル末端に Ser_Lys_Leu (SKL)のアミノ酸を使用することにした。 pUCNTにクロ 一二ングされた ORF2及び ORF2—149NSを錡型にして、配列番号 17と 18をプライ マーとして使用して、 ORF2S及び ORF2S— 149NSを作製した。 pSTARRの Ndel 、 Pstlサイトに、これら PHA合成酵素変異遺伝子を結合させ、 pSTARR— ORF2S、 pSTARR_ORF2S149NSを構築した。
[0065] 最終的に PHA合成酵素変異遺伝子を連結するベクターには、 pUTA-1 (WO01/ 88144に記載）を使用した。 pSTARR-〇RF2S、 pSTARR-〇RF2S149NSより、 Xhol/Sallで発現カセットを切り出し、 pUTA— 1の Sailサイトを結合させ、 pARR— ORF2S及び pARR— 149NSを構築した。さらに、作製した pARR— ORF2S及び pA RR—149NSを Sailで切断し、 pSTARR— ORF2Sと pSTARR— ORF2S149NSよ り切り出した Xhol/Sallの発現カセットを結合させ、 pARR—〇RF2Sx2及び pARR -149NSx2を構築した。図 2に、 pSTARRから pARR-149NSx2等を作製した模 式と、それぞれのプラスミドの簡単な図を示した。
[0066] (実施例 3)形質転換体の構築
酵母菌の培養用に使用した試薬は、特に断らない限り和光純薬から販売されている ものを用いた。宿主には、 ADE1遺伝子破壊株であり、独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センターに国際寄託されているキャンディダ 'マルトーサ AC16 株（FERM BP—7366)を使用し、上記の本発明の遺伝子発現カセットを含むプラ スミド pARR—〇RF2S、 pARR— 149NS、 pARR—〇RF2Sx2及び pARR— 149NS x2をそれぞれ導入した。宿主に構築したプラスミドを導入する方法は、電気パルス法 で行った。遺伝子導入装置は BTX社製の ELECTRO CELL MANIPULATO R 600を用いた。キュベットは BIO MEDICAL CORPORATION CO. LTD 製の BM6200を用いた。コンビテント細胞 100 /i lにプラスミド 1 /i lを加え、調製した コンビテント細胞/プラスミド溶液を 100 μ ΐ取り、キュベットに注入し、パルス装置に セットした。続いて、静電容量 40 z F、抵抗値 246ohm、電圧 1. 9KVの条件で電気 パルスをかけた。パルス後、それぞれのキュベットに 1Mソルビトールを lmlカ卩え、穏 やかに混合し、室温で 1時間放置した。プラスミドを導入後、選択プレート（0. 67w/ v%Yeast Nitrogen base without amino acid (Difco社製)、 2wz %クノレ コース、 2w/v%寒天）で培養し、形質転換体を取得した。このうち、プラスミド pARR _149NSx2が導入された形質転換体は、 AC16 pUTA_149NSx2 (FERM BP -10019)として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際 寄託されている。
[0067] (実施例 4)形質転換体を使用したポリマー生産
ポリマー生産に必要な遺伝子を導入したキャンディダ ·マルトーサ形質転換体を次の ように培養した。培地は、 YNB培地（0· 67w/v%Yeast Nitrogen base witho ut amino acid、 2w/v%Glucose)を前培養用培地として用レ、、 M2培地（12. 7 5g/L硫酸アンモニゥム、 1. 56g/Lリン酸 2水素カリウム、 0. 33g/Lリン酸 1水素 カリウム · 3水和物、 0. 08g/L塩化カリウム、 0. 5g/L塩化ナトリウム、 0. 41g/L硫 酸マグネシウム · 7水和物、 0. 4g/L硝酸カルシウム · 7水和物、 0. 01g/L塩化鉄（ III) ·4水和物）に、 2w/v%パームオイルと塩酸に溶解したトレースエレメント（lg/ mL硫酸鉄（II) · 7水和物、 8g/mL硫酸亜鉛（II) · 7水和物、 6. 4g/mL硫酸マン ガン（II) ·4水和物、 0. 8g/mL硫酸銅（II) · 5水和物） 0. 45ml/Lを添加した培地 を生産培地として使用した。
[0068] 各形質転換体のグリセロールストック 500 を、 50mlの前培養用培地が入った 500 ml坂口フラスコに接種して 20時間培養し、 300mLの生産培地を入れた 2L坂口フラ スコに 10v/v%接種した。これを培養温度 30°C、振盪速度 90rpm、 2日間培養とい う条件で培養した。培養液から遠心分離によって菌体を回収し、 80mlの蒸留水に懸 濁して、超高圧ホモジナイザー（APV社製 Rannie2000 ; 15000Psiで 15分間）で 破砕した後、遠心分離を行い、得られた沈殿物をメタノールで洗浄した後、凍結乾燥 した。
[0069] 得られた乾燥菌体を粉碎し、クロ口ホルムを 100ml添加し、一晩攪拌して抽出した。
濾過して菌体を除去し、濾液をエバポレーターで 1一 2mlにまで濃縮し、濃縮液に約 10mlのへキサンを添カ卩して、ポリマーを析出させた。このときの培養結果を表 1に示 す。分子量の測定は、以下のようにして行った。回収した乾燥ポリマー 10mgを、クロ 口ホルム 5mlに溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液を Shodex K8 05L (300x8mm, 2本連結）（昭和電工社製）を装着した島津製作所製 GPCシステ ムを用い、クロ口ホルムを移動相として分析した。分子量標準サンプノレには市販の標 準ポリスチレンを用い、重量平均分子量として求めた。 3HHモル分率は、 NMR分析 FOEL、 JNM-EX400)により測定した。
[0070] [表 1]
Figure imgf000023_0001
[0071] 上記結果が示すように、野生型の PHA合成酵素をコードする遺伝子からなる発現力 セットを含むプラスミド pARR—〇RF2S、 pARR— ORF2Sx2によって形質転換され た酵母に比べて、本発明の PHA合成酵素変異体をコードする変異遺伝子からなる 発現カセットを含むプラスミド pARR— 149NS、及び pARR— 149NSx2によって形質 転換された酵母では、ポリマー含有量及び 3HH分率が向上し、本発明の PHA合成 酵素変異体の活性向上効果が確認できただけではなぐ得られる PHAの分子量も 増加する傾向が見られた。このように、本発明の PHA合成酵素変異体の有用性が 確認された。
[0072] (実施例 5)二重変異体
PHA合成酵素の 171番目のアミノ酸であるァスパラギン酸をグリシンに置換した変異 体を、実施例 1に記載の方法を用いて作製した。変異を導入するためのプライマーと しては配列番号 19と配列番号 20を用いた。また、 149番目のアミノ酸であるァスパラ ギンをセリンに、 171番目のアミノ酸であるァスパラギン酸をグリシンに置換した二重 変異体を、実施例 1で作製した PHA合成酵素変異遺伝子 ORF2— 149NSを铸型と して、実施例 1と同様の手法で作製した。このようにして、 PHA合成酵素変異遺伝子 ORF2—171DG及び PHA合成酵素二重変異遺伝子〇RF2_149NS/171DGを 完成した。
[0073] 次に、これらの変異遺伝子を用いて、実施例 2に記載の方法により、配列番号 17と 1 8をプライマーとして使用してシグナル配列を付加し、プラスミド pSTARRにクロー二 ングして、 pSTARR—〇RF2S171DG、 pSTARR— ORF2S149NS/171DGを構 築した。この変異遺伝子発現カセットを、実施例 2に記載の方法により pUTA— 1に導 入し、プラスミド pARR_171DG及び PARR—149NS/171DGを作製した。次に、 ターミネータ一として ALKltの代わりに LAC4遺伝子（GenBank M84410)のタ ーミネーター LACt (配列番号 21)を用いた発現カセットを作製した。 pSTARR— OR F2S171DG及び pSTARR— ORF2S149NS/171DGの ALKltを Pstl/Sallで 除去し、代わりに配列番号 22と 23に示すプライマーで増幅した LAC4tを導入したプ ラスミドを作製した。このターミネータ一の置換された PHA合成酵素変異体発現カセ ットを、それぞれ Xhol/Sallで切り出し、プラスミド pARR-171DG及び pARR-14 9NS/171DGの Sailサイトに結合させ、 PHA合成酵素変異遺伝子カセットの 2個 導入されたプラスミド pARR— 171DGx2及び pARR— 149NS/171DGx2を完成し た。このうち、プラスミド pARR_149NS/171DGx2 (FERM BP—10017)は、独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。 これらのプラスミドを実施例 3に記載の方法で、キャンディダ 'マルトーサ AC16株（F ERM BP— 7366)に導入し、実施例 4に記載の方法でポリマー生産とポリマー分析 を行い、その結果を表 2に示し、実施例 4の結果と比較した。
[0074] [表 2] ブフス 卜 Γ>リ a ο Η Η;¾" 八 7. .
半
(wt%) (mol%) (M. W. ) pARR-ORF 2 S x 2 2.97 21.7 260000 pARR- 1 49NS x 2 12.8 28.4 455000 p ARR- 1 7 1 DG x 2 4.5 23.0 330000 p ARR- 149 N S 14.0 34.1 320000
/ 1 7 1 DG X 2
[0075] 上記結果が示すように、野生型の PHA合成酵素をコードする遺伝子からなる発現力 セットを含むプラスミド pARR—〇RF2Sx2によって形質転換された酵母に比べて、本 発明の PHA合成酵素変異体をコードする変異遺伝子からなる発現カセットを含むプ ラスミド pARR— 171DGx2によって形質転換された酵母では、ポリマー含有量が向 上し、 PHA合成酵素二重変異体をコードする二重変異遺伝子からなる発現カセット を含むプラスミド pARR— 149NS/l71DGx2によって形質転換された酵母では、ポ リマー含有量がさらに向上すると共に 3HH分率が向上する事が明らかとなった。この ように、本発明の PHA合成酵素変異体の有用性が確認された。
産業上の利用可能性
[0076] 本発明により、生分解性及び優れた物性を有する、上記式（1)、（2)で示される 3—ヒ ドロキシ酪酸や 3—ヒドロキシへキサン酸をはじめとする 3—ヒドロキシアルカン酸を共重 合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になつ た。
図面の簡単な説明
[0077] [図 1]実施例において、 pUALlから pSTARRを作製した模式と、それぞれのプラスミ ドの簡単な図である。
[図 2]実施例において、 pSTARRから pARR— 149NSx2等を作製した模式と、それ ぞれのプラスミドの簡単な図である。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるァエロモナス'キヤビエ由来のポリヒドロキ シアルカン酸合成酵素に、以下の（a)— (h)のアミノ酸置換を少なくとも 1つ行ってな るポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異体をコードするポリヒドロキシアルカン酸合 成酵素変異遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネータ一からなる遺 伝子発現カセット。
(a) Asn_149を Serに
( 3)八3 _171を0 に
(c) Phe— 246を Ser又は Ginに
(d) Tyr_318を Alaに
(e) Ile_320を Ser、 Ala又は Valに
(f) Leu_350を Valに
(g) Phe— 353を Thr、 Ser又は Hisに
(h) Phe— 518を lieに
[2] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるァエロモナス'キヤビエ由来のポリヒドロキ シアルカン酸合成酵素に、以下の（a)— (h)のアミノ酸置換を少なくとも 1つ行ってな るポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異体をコードするポリヒドロキシアルカン酸合 成酵素変異遺伝子に、ペルォキシソーム配向シグナルをコードする DNAが付加され てなる遺伝子。
(a) Asn_149を Serに
(b) Asp_171をGlyに
(c) Phe_246を Ser又は Ginに
(d) Tyr—318¾rAla
(e) Ile_320を Ser、 Ala又は Valに
(f) Leu_350を Valに
(g) Phe— 353を Thr、 Ser又は Hisに
(h) Phe— 518を lieに
[3] ペルォキシソーム配向シグナル力 配列番号 2又は配列番号 3によって示されるアミ ノ酸配列からなる請求項 2記載の遺伝子。
[4] ペ Hル oォキシソーム配向シグナルをコードする DNAの塩基配歹 I」が、配列番号 4又は配 列番号 5によって示されるものである請求項 3記載の遺伝子。
C C——
[5] ァエロモナス TX.キヤビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子 ト
の遺伝暗号 CTG 7の少なくとも 1つ力 TTA、 TTG、 CTT、 CTC又は CTAに変換さ
H c
れてレ、るものである請一 2求項 2 4のレ、ずれかに記載の遺伝子。
[6] 請求項 2— 5のいずれかに o c
記載の遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミ ネーターからなる遺伝子発現カセット。
[7] 請求項 1又は 6記載の遺伝子発現カセットが、酵母に 1つ以上導入されてなることを 特徴とする形質転換体。
[8] 酵母がキャンディダ*マルトーサである請求項 7記載の形質転換体。
[9] 請求項 7又は 8記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採 取することを特徴とするポリエステルの製造方法。
[10] ポリエステルが、下記式（1)で示される 3—ヒドロキシ酪酸と下記式（2)で示される 3—ヒ ドロキシへキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルである請求項 9記載のポリ エステルの製造方法。
[化 1]
CH 3
HO― CH—— C— C— OH ( 1 )
H2 0
OH ( 2 )
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