WO2004095029A1

WO2004095029A1 - 一分子蛍光分析により核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法

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Publication number: WO2004095029A1
Application number: PCT/JP2003/005189
Authority: WO
Inventors: Noriko Kato; Naoaki Okamoto
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2003-04-23
Filing date: 2003-04-23
Publication date: 2004-11-04
Also published as: CN1860368A; EP1621889B1; EP1621889A4; DE60323690D1; US20060051805A1; EP1621889A1

Abstract

一分子蛍光分析により、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法。

Description

明細書

一分子蛍光分析により核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法

技術分野

本発明は、核酸と核酸結合タンパク質との結合を一分子蛍光分析により検出する方法に関する。とりわけ本発明は、遺伝子とそれに結合する転写因子の相互作用を探索し、タンパク質機能解析およびそれを利用した薬剤検出に有用である。背景技術

生命現象は、遺伝子発現により合成されるタンパク質が正常に発現 · 機能することにより営まれるが、異常な遺伝子発現は発がんやアポトーシスの原因となる。遺伝子発現の大部分は、転写因子と呼ばれる D N A結合タンパク質により制御されている。転写研究の進展により転写システムの全貌が明らかになりつつあり、酵母からヒトに至る真核生物で基本的な転写機構の類似性が示されている。例えば、プロモーターに集合した T B P ( TATA box-binding protein) / T F II A / T F II B複合体の立体構造もすでに解明されており、 D N A 鎖上での基本転写因子間のタンパク質一タンパク質相互作用や、基本転写因子による D N Aの高次構造形成などの新しい情報が蓄積されつつある。そのため、転写の基本となる転写システムを中心に、転写調節因子による転写活性化、あるいは不活性化の分子機構の解析が行われ、最終的には発生、分化、増殖、癌化といった生命現象を転写制御のネッ 1、ワークやカスケードを通して理解することが望まれている。このような状況下、転写因子と D N Aとの結合反応を迅速かつ特異的に検出する検出系が期待される。

これまで、転写因子と特定 D N A配列との特異的な結合を検出する系として、ゲルシフトアツセィ、 in vitro 転写アツセィおよぴフットプリント法といった電気泳動やアイソトープ (放射性物質）を用いた解析が知られている。

ゲルシフトアツセィは、転写因子と特定 D N A配列との特異的な結合により D N A結合タンパク質の電気泳動の移動度が低下することを利用した方法である。この方法は、数 m g の多量のタンパク質を必要とするうえに、電気泳動に時間がかカゝり、更に、 D N Aと結合したタンパク質複合体の分子量はォートラジオグラフィーによる解析が必要なため、多大な時間とコストがかかる。また、特異的なサンプルがあっても、サンプル回収が困難であり、プロテオーム解析などへの拡張性に乏しい。また、多くのタンパク質をスクリーニングするために非常に時間とコスト、手間がかかる。

in vitro 転写アツセィは、試験管内に鍚型となる所定の D N A配列、 R N Aポリメラーゼ、転写因子、基質 N T P (塩基成分 G、 A、 C、 U ) を入れ、 R N A合成反応を行わせ、転写因子の D N A配列への特異的な結合に基づく転写因子活性を測定する方法である。この方法は、合成された R N Aの検出を、電気泳動とその後のォートラジオグラフィーによる解析を行う必要があるため、多大な時間とコスト、手間がかかる。

フットプリント法は、 D N Aの特異的部位に結合するタンパク質の D N A鎖上での塩基配列認識部位を決定する方法である。この方法は、詳細には、まずタンパク質の結合部位を含む D N A断片の 5 ' または 3 ' 末端を 32 p で標識し、これを D Nァーゼ処理し、塩基非特異的切断を行い、ゲル電気泳動ののちォートラジオグラフィーを行うことにより、一塩基ずつの長さの違いで分離された D N A片のバンドを得る。他方、上述の D N A断片にタンパク質を結合させて D Nァーゼ処理を行うと、結合部位の塩基は切断されず、オートラジォグラフィーではそれに対応するパンドは消失し、白く抜けて見える。両者のォートラジオグラムを比較することにより、タンパク質の結合部位とその部分の塩基配列を決定することができる。この方法も、電気泳動およびオートラジオグラフィ一による解析を行う必要があるため、多大な時間とコスト、手間がかかる。

また、フットプリント法と同じ原理を用いてタンパク質とリガンドの相互作用を解析する方法もある。この方法は、タンパク質のコンフォーメーションの変化を検出するのに利用されている。転写複合体に応用して、 moribund complex と dead-end complex でのコンフォーメーションの変ィ匕を検出できる。 (参考文献 Nagai & S imamoto (1997) Most conserved regions of the a. coli primary sigma factor are involved m interaction with RNA polymerase core enzyme. Gene. Cells 2， 725-734) し力し、この方法でも、やはりアイソトープ、電気泳動、およびォートラジオグラフィーによる解析を使用するため、設備投資や専門家を要し、実験が大変しにくい。発明の開示

上記事情に鑑み、本発明は、ゲルシフトアツセィ、 in vitro 転写アツセィおよぴフットプリント法といったアイソトープ（放射性物質）や電気泳動を用いた検出方法の有している問題点をすベて解決できる、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する新規な方法を提供することを目的とする。本発明者らは、非放射性物質を検出マーカーとして用いて、簡便かつ迅速に、核酸に結合可能なタンパク質を検出する新たな方法を見出し、本発明を完成させるに至った。なお、本発明の方法は、ゲルシフトアツセィ、 in vitro 転写ァッセィおよぴフットプリント法など従来の検出方法の有している問題点を一気に解決できるものである。

すなわち、本発明は以下に記載の手段を提供するものである。

( 1 ) 一分子蛍光分析により、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法。

( 2 ) —分子蛍光分析により、核酸と 2種類の核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、

核酸と第一の核酸結合タンパク質との結合を検出する工程と、

前記工程において核酸と第一の核酸結合タンパク質との結合が検出された場合、得られた核酸タンパク質複合体と第二の核酸結合タンパク質との結合を検出する工程と

を具備することを特徴とする方法。

( 3 ) —分子蛍光分析により、核酸と n種類（ n は 2 以上の整数を表す）の核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、

前記工程において核酸と第一から第（ X— 1 ) まで（ X— 1 ) 個の核酸結合タンパク質との結合が検出された場合、得られた核酸タンパク質複合体と第 Xの核酸結合タンパク質との結合を検出する工程を、 X = 2 から X = n まで順次（ n — 1 ) 回繰り返す工程と

を具備することを特徴とする方法。

( 4 ) ( 1 ) 〜（ 3 ) の何れか 1 に記載の方法であって、核酸と 1 種類以上の核酸結合タンパク質との結合を、核酸結合タンパク質の何れか一に対する抗体を用いて確認するェ程を更に具備することを特徴とする方法。

( 5 ) ( 1 ) 〜（ 4 ) の何れか 1 に記載の方法であって、前記核酸が、タンパク質結合部位の配列を持つことを特徴とする方法。

( 6 ) ( 1 ) 〜（ 5 ) の何れ力ゝ 1 に記載の方法であって、前記核酸結合タンパク質が、 T A T Aボックス結合タンパク質であることを特徴とする方法。

( 7 ) ( 1 ) 〜（ 6 ) の何れか 1 に記載の方法であって、前記核酸に、蛍光物質、発光物質、酵素発光物質、放射活性物質を結合させることにより、前記核酸結合タンパク質との結合を光シグナルで検出することを特徴とする方法。

( 8 ) ( 1 ) 〜（ 7 ) の何れか 1 に記載の方法であって、前記核酸結合タンパク質が、基本転写因子、転写促進因子または転写阻害因子であることを特徴とする方法。

図面の簡単な説明

図 1 は、タンパク質の分子量と並進拡散時間の関係を示す図である

図 2 は D N Aサイズと並進拡散時間の関係を示す図である。

図 3 は本発明の検出方法に用いる蛍光相関分析装置の一例を示す図である。

図 3 において符号 1 〜 1 5 は以下のものを示す：

1 … レーザ光源、 2 …光強度調節手段（ N D フィルタ）、 3 …光減衰率選択装置（ N D フィルタチェンジャー）、 4 〜ダイクロイツクミラー、 5 …対物レンズ、 6 … ステージ、 7 … フィルタ、 8 …チューブレンズ、 9 …反射鏡、 1 0 … ピンホール、 1 1 … レンズ、 1 2 …光検出器（ァパランシャルフオトダイオード）、 1 3 …蛍光強度記録手段（コンビユータ）、 1 4 …試料、 1 5 …光ビーム。

図 4 は、 D N A と D N A結合タンパク質の相互作用検出を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

ぐ一分子蛍光分析技術 >

まず、本発明のスクリーユング方法に用いる解析技術、一分子蛍光分析について説明する。

一分子蛍光分析とは、微小な共焦点領域に出入りする蛍光分子に由来する蛍光シグナル（例えば、ゆらぎ運動および/ または蛍光強度）を計測し、この計測により得られるデータを関数により解析する技術である。この技術には、（ 1 ) 蛍光相 fe分光法 ( Fluorescence Correlation Spectroscopy) による解析、（ 2 ) 蛍光強度分布解析（ Fluorescence Intensity Distribution Analysis) 、および ( 3 ) これら角军析を同時に行う资光強度多分布角军析 ( Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis) 力 ^s含まれる。以下、それぞれについて説明する。

( 1 ) 蛍光相関分光法（以下 F C S ともいう）は、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるゆらぎ運動を測定し、自己相関関数（Autocorrelation function)を用レヽることにより、個々の標的分子の微小運動を正確に測定する技術である（参照文献： D . Magde and E. Elson, "Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization", Biopolymers 1974 13(1) 29-61) 。

F C S は、溶液中の蛍光分子のブラゥン運動をレーザ共焦点顕微鏡により微小領域で捉えることによって、蛍光強度のゆらぎから拡散時間を解析し、物理量（分子の数、大きさ）を測定することにより実行される。このような微小な領域で分子ゆらぎを捕える F C S による解析は、高感度、特異的に分子間相互作用を検出する上で有効である。

F C S による検出の原理を更に詳しく説明する。 F C S では、試料中の微小視野領域から発生する蛍光信号を顕微鏡で検出定量する。このとき、媒質中の蛍光標識した標的分子は常に運動（ブラウン運動）している。従って、標的分子がこの微小視野領域内に進入する頻度および前記領域内に留まる時間に応じて、検出される蛍光強度が変化する。

例えば、分子の 2量体化が生じて見かけの分子量が増大すれば、標的分子の運動は遅くなり、見かけの分子数は減少する。その結果、 '微小視野領域内に入ってくる頻度は低下し、観察される蛍光強度が変化する。このような蛍光強度の変化をモニターすることにより、標的分子の見かけの分子量変化を追跡することができる。

( 2 ) 蛍光強度分布解析（以下 F I D Aともいう）は、文献 P Kask, et al; PNAS 23, 96, 13756-13761, 1999, W098/16814 に開示されている。 F I D Aは、サンプルにレ一ザ照射し、サンプル中から発せられる蛍光分子の励起光を、 A P D (高感度フォト検出器）によって計測し、計測した蛍光シグナルを、 4 0マイクロ秒という非常に短時間あたりに分解したフォトンカウントについて、ダブル · ポアソン分布関数解析し、統計処理解析する技術である。 F I D Aにより、 —分子あたりの蛍光強度（ブライトネス； q n ) と蛍光分子の数（ c n ) が算出される。分子種類が複数個あっても分布解析によって識別することができ、それぞれの分子種についてブライトネスと分子数を乗じた数値が総蛍光量として計算できる。

( 3 ) 蛍光強度多分布解析（以下 F I M D Aともいう）は、 F C S解析と F I D Aを同時に行うものである。詳細な内容は、文献 K Palo, Biophysical Journal, 79, 2858-2866, 2000) に開示されている。 F I M D Aによれば、蛍光分子の並進拡散時間、分子数、および一分子あたりの蛍光強度（プライトネス）に関するデータを同時に取得することができる。そのため、分子の大きさが判別できるだけでなく、 F C Sでは識別不可能であった 2倍程度の分子の大きさの変化をブライトネスの違いで識別することができる。なお、 F C S では 5倍程度の分子の大きさの変化を識別することが可能である。

<本発明の検出方法 > 上述の一分子蛍光分析技術を用いて、本発明の検出を行うことができる。すなわち、一分子蛍光分析技術を用いて、

「遊離の核酸結合タンパク質」が核酸に結合して複合体を形成したことを、並進拡散時間の増大（即ち、分子量の増大）により検出することができる（図 4参照）。また、一分子蛍光分析技術を用いて、「遊離の核酸結合タンパク質」と、核酸との結合により得られる「核酸タンパク質複合体」の存在比を、各分子の分子数の変化、一分子あたりの蛍光強度の変化により求めることができる。これにより、本発明の一分子蛍光分析技術を用いた検出方法は、核酸結合タンパク質の核酸への結合の有無を検出できるだけでなく、核酸結合タンパク質の核酸への結合能（結合力の強さ）を検出することもできる。

以下、本発明の方法を詳細に説明する。

本発明の検出方法は、一分子蛍光分析技術により、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法である。本発明の検出方法において、核酸結合タンパク質は、 1種類であつても複数種類であってもよい。すなわち、核酸結合タンパク質が 2種類である場合、本発明の一分子蛍光分析技術を用いた検出方法は、

を具備することを特徴とする。

更に、核酸結合タンパク質が n種類（ n は 2以上の整数を表す）である場合、本発明の一分子蛍光分析技術を用いた検出方法は、

前記工程において核酸と第一から第（ X— 1 ) まで（ X — 1 ) 個の核酸結合タンパク質との結合が検出された場合、得られた核酸タンパク質複合体と第 Xの核酸結合タンパク質との結合を検出する工程を、 X = 2 力ら X = n まで順次（ n — 1 ) 回繰り返す工程と

を具備することを特徴とする。 n は通常 2 〜 9種類が考えられる。

本発明の検出方法に従えば、予め「核酸」を選定しておくことにより、「該核酸に結合する核酸結合タンパク質」を探索することができる。また、本発明の検出方法に従えば、予め「核酸結合タンパク質」を選定しておくことにより、「該核酸結合タンパク質を結合する核酸」を探索することができる。

(核酸と核酸結合タンパク質について）

本発明において「核酸」は、 D N A、 R N Aの何れでもよく、修飾塩基を含んでいてもよい。また 1 本鎖、 2本鎖の何れでもよく特に限定されない。予め「核酸」を選定して、「該核酸に結合する核酸結合タンパク質」を探索する場合、「核酸」は、タンパク質結合部位 ( protein-binding site ) を有する核酸であることが好ましい。より具体的には、タンパク質が特異的に結合することにより遺伝子の転写を開始させたり転写を促進 · 抑制したりするタンパク質結合部位を含む核酸であり得る。このように、予め「核酸」を選定して、「該核酸に結合する核酸結合タンパク質」を探索する場合、「核酸結合タンパク質」は、前記「核酸」に特異的もしくは非特異的に結合することが予測される任意のタンパク質であり得る。

また「核酸」は、所望の配列（例えばタンパク質結合部位）を有する限り、その長さは特に限定されない。ただし、

「核酸」と「核酸結合タンパク質」との結合をその分子量の変化に基づいて検出する場合であって、「核酸結合タンパク質」を蛍光標識した場合には、「核酸結合タンパク質」が

「核酸」と結合して複合体を形成した際に、 "遊離の核酸結合タンパク質" と比べて 5倍以上の分子サイズの増大を引き起こすように「核酸」の分子量を設定しておくことが望ましレヽ。

一方、予め「核酸結合タンパク質」を選定して、「該タンパク質を結合する核酸」を探索する場合、「核酸結合タンパク質」は、核酸に結合す'ることが既知のものであれば特に限定されず、具体的には、 D N Aに結合して転写の開始、伸長、終結などの転写調節に関わる転写因子が挙げられる。より具体的には、転写因子として、基本転写因子、転写促進因子、転写阻害因子が挙げられる。公知の転写因子の種類は、 5 0 種類以上を超えており、 A P — 1 ( activator protein 1 ) ， c _ M y b、 F A S T — 1 などがある。転写因子の分子量は、 1 2〜 2 5 0 k D a といわれており、 4 0 k D a 付近の分子量をもつ因子が多い。転写因子が結合する配列は、短い D N Aは 6塩基のものもあり、一分子蛍光分析によって計測することができる塩基配列は、 5 2 0 0塩基対までの長さが好ましく、 1 0 0 0塩基対までの長さがより好ましい。このように、予め「核酸結合タンパク質」を選定して、「該タンパク質を結合する核酸」を探索する場合、「核酸」は、前記「核酸結合タンパク質」を特異的もしくは非特異的に結合することが予測される任意の核酸であり得る。

なお、「核酸結合タンパク質」が複数予測される場合、それぞれの核酸結合タンパク質は直接核酸に結合するものであつてもよいし、他の核酸結合タンパク質を介して間接的に核酸に結合するものであっても何れでもよい。

予め選定した Γ核酸」の具体例として、 T A T Aボックスを含む核酸が挙げられる。 T A T Aボックスとは、遺伝子の転写開始位置より上流に位置し、転写開始に重要な役割を果たす特定の D N A配列である。 T A T Aボックスの配列は、 5 ，一 T A Τ A Α (もしくは Τ ) A Τ (もしくは Α )_ 3 ，として知られている。この T A T Aボックスに T A T A ボックス結合タンパク質（ TATA box-binding protein；即ち、転写因子 T F IID ) が結合し、その後転写因子 T F II B が結合することが知られている。本発明の検出方法に従って、 T A T Aボックスなどのタンパク質結合部位に結合可能なタンパク質を探索することができる。

また、予め選定した「核酸結合タンパク質」の具体例として、 T A T Aボックス結合タンパク質（即ち、 T F IID ) を用いれば、本発明の方法に従って、 T A T Aボックス結合タンパク質を結合可能な核酸を探索することができる。

本発明において '「核酸」と「核酸結合タンパク質」は、どのように調製されたものでもよい。「核酸」については、所望の配列を合成により調製することができる。「核酸結合タンパク質」については、例えば該タンパク質をコードする遺伝子を用いて、公知の遺伝子工学的手法により試験管内で発現させたものを利用してもよい。あるいは、該タンパク質を含む分画を生体や細胞から抽出してもよい。また、タンパク質、ペプチドライブラリーから得られるサンプルを使用してあよい。

ただし、本発明の検出方法は、上述の具体的な記載に限定されず、任意の核酸と任意の核酸結合タンパク質の結合を検出する際に利用可能であることはいうまでもない。

以下、真核生物の転写について説明する。

真核生物では、 3種類の R N Aポリメラーゼが存在し、それぞれ異なるクラスの遺伝子を転写する。タンパク質をコードする遺伝子の転写には、 R N Aポリメラーゼ II と 6種類の基本転写因子（ T F IIA , T F IIB , T F IID , T F IIE , T F II F , T F IIH ) が必要であり、これらの因子のなかで唯一 D N A結合能をもつ因子が T F II Dである。 T F II Dが T A T Aボックスに結合し、それに引き続いて各因子が順次プロモーター上に集合することにより、転写開始複合体（ p

I C ) が形成され、 R N Aポリメラーゼが P I C力ら離れることで転写伸長の段階へ移行する。ここ数年の間に転写システムを構成する各因子がスクリーニングされ、 P I C形成のメカニズムが詳細に解明されるとともに、基本転写因子や転写伸長因子の変異がヒトの遺伝病と密接に関係することも明らかにされており、有用な検出法が望まれている。従って、本発明の検出方法は、転写因子の変異が D N Aへの結合能に及ぼす影響を調べる際にも有用である。

(核酸と核酸結合タンパク質の結合を検出する工程）本発明において、「核酸結合タンパク質」もしくは「核酸」の少なくとも一方は、一分子蛍光分析のため、予め標識されている必要がある。以下、標識の代表パターンとして ( A ) 〜（ C ) の場合を挙げるが、本発明はこれらに限定されない。

( A ) 「核酸結合タンパク質」を蛍光標識する場合この場合、遊離の核酸結合タンパク質と核酸に結合した複合体とは、複合体を形成した場合にその分子サイズが 5倍以上増加するように、「核酸」の長さを長くしておくことが望ましい。例えば、「核酸結合タンパク質」として転写因子 T F II D を使用した場合、その分子量 3 8 k D a である力ゝら、結合する「核酸」は、好ましくは 1 5 2 k D a 以上の分子量を持つように合成しておくことが望ましい。 2本鎖 D N Aは、 1塩基対で分子量 6 6 O D a である力ゝら、分子量 1 5 2 k D a の D N Aは 2 3 0塩基対に相当する。一方、 2 3 0塩基対未満の長さの「核酸」の場合は、タンパク質と核酸それぞれを 2色で蛍光標識することによって、相互相関分析すると解析することができる。

( B ) 「核酸」を標識する場合

核酸を蛍光標識する場合は、オリゴヌクレオチドを合成する際に、末端に蛍光物質を取り込ませることによって、容易に標識できる。また、任意の核酸をデォキシリボヌクレア一ゼ I で処理して切れ目（ニック）をつくらせ、次に 4種類のデォキシリボヌクレオチドと D N Aポリメラーゼ I を力 Bえて修復合成させ、 2番目の反応の際に蛍光標識したヌクレオチドを D N Aに取り込ませる方法（ニックトランスレーション法）を利用して標識することができる。合成オリゴヌクレオチドに比べて、「核酸結合タンパク質」はかなり大きいので、複合体形成によってサイズ変化が劇的にかわるため、一分子蛍光分析で識別することができる。

( C ) 複数の分子を蛍光標識する場合

「核酸」と「核酸結合タンパク質」の両方を 2色で色分けして蛍光標識することによって、相互の相関を検出する解析方法（蛍光相互相関分析）によって識別することができる。蛍光標識用のマーカーとしては、光学的に追跡できる信号を発するもの、すなわち光検出可能な物質であれば任意のものを使用することができる。例えば、蛍光物質、発光物質、酵素発光物質、放射活性物質を使用することができる。特に、微小物質の存在を個別に測定しえる蛍光色素が好ましい。好ましくは、検出可能な蛍光を発する任意の蛍光物質を使用することができる。例えば、ローダミン、 T A M R A、 C y 3、 C y 5 (アマシャム）、 Alexa シリーズ (モレキュラープロ一ブ）、蛍光緑色タンパク質 G F P (クロンテック社）等、さまざまな蛍光色素を用いることが可能である。蛍光標識は、既知の手法により行うことができる。

「核酸」と「核酸結合タンパク質」の結合を検出する工程は、「核酸」と「核酸結合タンパク質」とを所定の溶液中に置くことにより行われる。所定の溶液とは、「核酸」と該核酸に結合することが既知のタンパク質とが結合可能な溶液であり得る。例えば、生理食塩水やリン酸緩衝液を使用することができる。

この所定の溶液中で、「核酸」と「核酸結合タンパク質」を所定の条件下で維持することにより、「核酸結合タンパク質」のうち「核酸」に結合可能なタンパク質のみが結合反応を起こす。ここで所定の条件（温度、 p H、反応時間等）は - 「核酸」の種類等に応じて適宜設定することができる。

「核酸結合タンパク質」を蛍光標識する場合、反応溶液中に添加する「核酸結合タンパク質」の量は、最終濃度 0 . 0 1 〜： 1 0 0 n M程度になる量がよく、さらに好ましくは、 0 . 1 〜 5 0 η Μ程度がよい。また、添加する「核酸」の量は、最終濃度 0 . O l n M〜； L O ^u M程度になる量がよく、さらに好ましくは、 0 . 1 〜 5 0 n M程度力 Sよい。

反応の一例として、後述の実施例に記載されるとおり、 5 _ T A M R Aで標識した「核酸」を生理的緩衝溶液中に 1 0 n m o 1 / L含む溶液と、「核酸結合タンパク質」を生理的緩衝溶液中に 1 〜 1 0 0 n m o 1 / L含む溶液とを、それぞれ 5 0 μ Lずつ混合し、室温で 1 5 〜 3 0分間インキュベートすることにより行うことができる。

ィンキュベートするために、上記所定の溶液に反応成分のセットを浮遊状態で含んでなる反応液を、適宜の液体保持手段、例えば、試験管、ゥエル、キュベット、溝、管、平板、多孔体等に保持することができる。ここで、液体保持手段の形状、材質、サイズ等は、分注、攪拌、インキュベート、測定、搬送等の各種検出ステップの一部または全てを迅速に行うように選択するのが好ましい。例えば、一分子蛍光分析による測定は、光学的な焦点レベルの極微小な領域を測定場所とするので、非常に小型の液体収容手段で有り得る。特に、光学的測定による検出においては、測定用の光ビームがなるベく反応成分と直接的に関係するように、液体保持手段は、測定ビームが入射および/または出射するための開口部を有するのが好ましい。

前記反応後の溶液中において、「核酸」に結合している「核酸結合タンパク質」と、反応溶液中に遊離している「核酸結合タンパク質」の存在比を、それぞれの分子量の差に基づいて一分子蛍光分析により測定することができる。これにより、「核酸結合タンパク質」の「核酸」に対する結合のし易さ (親和性）を解離定数として求めることができる。

また、「核酸」と「核酸結合タンパク質」の結合反応を行つた後、核酸結合タンパク質に対する特異的抗体を反応溶液中に添加することによって、核酸結合タンパク質が核酸に結合していることを、その分子量の増大により確定することができる（後述の実施例参照）。

また、核酸と核酸結合タンパク質の分子量は、解析によつて得られる並進拡散時間から容易に算定することができる。タンパク質の分子量の増加に従って、並進拡散時間が増大することを図 1 に示す。図 1 において横軸は、横軸は、タンパク質の分子量、縦軸は並進拡散時間（ μ秒）を示す。図 1 に示す 1 〜 9 の点は、以下のタンパク質を示す。

1 . ひ一ブンガ口トキシン（ a -Bungarotoxin) 分子量 8000

2 . カルモジュリン（Calmodulin) 分子量 16700

3 . トリプシンインヒビター（Trypsin Inhibitor) 分子量 21000

4 . ゥシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin) 分子量 66000

5 . トランスフェリン（Transferrin) 分子量 80000

6 . インゲンマメ由来のレクチン P H A— L (Lectin PHA-L from Phaseolus vulgaris) 分子量 120000

7 . I g G 分子量 150000

8 . フイブリノゲン（Fibrinogen) 分子量 340000 9 . α — クリスタリン（a - Crystallin) .分子量 800000

また、 D N Aサイズ（即ち塩基対）の増加に従って、並進拡散時間が増大することを図 2 に示す。図 2 において横軸は D N Aの塩基配列の長さ、縦軸は並進拡散時間（ μ秒）を示す。

<一分子蛍光分析を行うための装置 >

以下、一分子蛍光分析を行うための装置（以下、蛍光相関分析装置ともいう）の例を、図 3 を参照して説明する。

図 3 に示すように、蛍光相関分析装置は、レーザ光源 1 と、前記レーザ光源 1 からの光ビーム 1 5 の強度を減弱する光強度調節手段（ここでは N D フィルタ） 2 と、適切な光強度調節手段 2 を設定する光減衰選択装置 ( ここでは N D フィルタチェンジャー） 3 と、蛍光分子を含有する試料 1 4 を載せたステージ 6 と、前記レーザ光源 1 からの光ビーム 1 5 を前記試料 1 4 に集光し共焦点領域を形成する光学系 4 、 5 と、前記試料 1 4 からの蛍光を集光する光学系 7 〜 1 1 と、集光した蛍光を検出する光検出器 1 2 ·と、蛍光強度の変化を記録する蛍光強度記録手段 1 3 を具備する。このように、蛍光相関分析装置は、共焦点レーザ顕微鏡を利用したものである。

図 3 においてレーザ光源 1 から放射されるレーザは、アルゴンイオンレーザ、ヘリウム一ネオンレーザ、クリプトン、ヘリゥムーカドミゥム等何れであってもよい。図 3 においてレーザ光源からの光ビーム 1 5 を前記試料に集光し共焦点領域を形成する光学系 4 、 5 は、具体的にはダイクロイツクミラー 4 、および対物レンズ 5 を意味する。レーザ光源 1 からの光ビーム 1 5 は、図 3 中の矢印で示すような経路で、まず蛍光強度調節手段（ここでは N D フィルタ） 2 の減弱度に従つてその強度が減弱され、次いで、ダイクロイツクミラー 4 により入射光に対して 90 度ステージの方向に屈折し、対物レンズ 5 を通ってステージ 6 上の試料に照射される。このようにして光ビームは、微小な 1 点で前記試料に集光され共焦点領域が形成される。

図 3 において共焦点領域内の蛍光分子から放射された蛍光を集光する光学系 7 〜 1 1 は、具体的にはフィルタ 7 、チューブレンズ 8 、反射鏡 9 、ピンホール 1 0 、レンズ 1 1 を意味する。蛍光分子から放射された蛍光は、図 3 中の矢印で示すような経路で、まず、ダイクロイツクミラー 4 を光進行方向に透過し、フィルター 7 、チューブレンズ 8 を経て、反射鏡 9 により屈折し、ピンホール 1 0 に結像した後、レンズ 1 1 を通過して光検出器 1 2 に集光される。

集光された蛍光を検出する光検出器（ここではァパランシャルフォトダイオード） 1 2 は、受容した光信号を電気信号に変換し、蛍光強度記録手段（ここではコンビユー .タ） 1 3 に送信する。

蛍光強度の変化を記録する蛍光強度記録手段 1 3 は、伝達された蛍光強度データの記録 · 解析を行う。具体的には、この蛍光強度データの解析により自己相関関数を設定する。蛍光分子の受容体への結合による分子量の増大、および遊離の蛍光分子数の減少などは、自己相関関数の変化により検出することができる。なお、一分子蛍光分析を行うための装置（蛍光相関分析装置）は、図 3 に示す例に限定されない。例えば、「核酸」と「核酸結合タンパク質」を、それぞれ異なる励起波長を有する 2種類の蛍光物質で識別標識する場合には、蛍光相関分析装置は、それぞれの蛍光物質を励起させるための 2種類のレ一ザ光源を有し、更にそれぞれの蛍光物質から放射される光を検出するための 2種類の光検出器を有していることが必要である。光検出器は、 A P D (アバランシェ ' フォトダイォード）のほか、光電子増倍管からなる装置でもよい。

く本発明の効果について >

従来、転写因子の核酸への結合力に基づく転写因子活性の測定は、ゲルシフトアツセィ、 in vitro 転写アツセィおよびフットプリント法といった電気泳動ゃァイソトープ（放射性物質）を用いた解析であった。

ゲルシフトアツセィは、転写因子と特定 D N A配列との結合により D N A結合タンパク質の電気泳動の移動度が低下することを利用しているが、数 m g の多量のタンパク質を必要とするうえ、電気泳動に時間がかかり、更に、 D N Aと結合したタンパク質複合体の分子量はオートラジオグラフィ一による解析が必要なため、多大な時間とコストがかかる。また、特異的なサンプルがあっても、サンプル回収が困難であり、プロテオーム解析などへの拡張性に乏しい。また、多くのタンパク質をスクリー -ングするために非常に時間とコスト、手間がかかる。同様に in vitro 転写アツセィおよびフットプリント法も、電気泳動、ォ一トラジオグラフィーの煩雑な操作が必要である。

しかし、本発明の一分子蛍光分析技術を用いた検出方法によって、従来法の問題点は解決され、本発明の検出方法は、以下に記載の利点を有する。

( 1 ) 従来法に特有の煩雑さがなくなり、迅速かつ簡便に核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出することが可能である。一般に、一分子蛍光分析の計測時間は、数秒から数十秒で充分であり、その計測操作は簡便である。また、計測コストも低く抑えることができる。

( 2 ) 本発明の検出方法は、核酸結合タンパク質の核酸への結合の有無を検出できるだけでなく、核酸結合タンパク質の核酸への結合能（結合力の強さ）を検出することもできる。

( 3 ) —分子蛍光分析技術を利用しているため、サンプル溶液は数十マイクロリットルで充分であり、サンプル溶液中の試料が低濃度であっても高感度に検出することができる。また、サンプル溶液は精製されていない粗精製溶液であっても本発明では使用可能である。

( 4 ) サンプル溶液として粗精製溶液を使用し、該サンプル溶液に含まれる核酸もしくは核酸結合タンパク質の分子量が未知の場合であっても、結合反応の結果計測される並進拡散時間の増大値に基づいて、分子量を算定することができる。

以上まとめると、本発明の検出方法によれば、従来のゲルシフトアツセィ、 i n vitro 転写アツセィおよぴフットプリント法といった手法の問題点をすベて解決することが可能である。とりわけ、本発明の方法は、核酸と核酸結合能を示すタンパク質の相互作用をみる場合に、分子レベルでの相互作用をより迅速、高感度かつ安価に計測することができる。また解析によって求められる並進拡散時間から分子量を算定することができる。

ぐ実施例 >

T A T Aボックス配列を持つ合成オリゴヌクレォチドを T AM R Aラベルし、転写因子 T F IID、 T F IIB の複合体を形成する挙動を溶液中で解析することができた。その結果を図 4およぴ表 1 に示す。

表 1

サンプル複合体 1分子並進拡散時間並進拡散時間当りの分子量実測値予想値 (約 k D a ) (//秒） ( 秒）

T FHD結合部位 25 mer 17 178 178 オリゴヌクレオチド C基準値）

T FID結合部位 25 mer 55 237 264 才リゴヌクレオチド

+ T FH Dタンパク質

T FED結合部位 25 mer 87 295 307 才リゴヌクレオチド

+丁 FKDタンパク質

+ T FHBタン/ ク質

T FED結合部位 25 mer 227 435 423 オリゴヌクレオチド

+ T FIIDタンパク質

+ T FEBタンパク質

+抗 T FIIB抗体

21 merオリゴヌクレオチド A 14 208 167

21 merオリゴヌクレオチド A 1 . 220 167

+ T FEDタンパク質

+ T FIIBタンパク質

+抗丁 FEB抗体転写因子 T F II D の基本的な性質は参考文献による ( Ehrenberg, M.， Rigler,R. Chem.Phys., 4, 390-410, 1974) 。転写因子 T F II Β の基本的な性質は参考文献による ( Patterson, M.G., et.al; Science, 248, 1625-1630, 1990) 。

T A M R Aラベルした T F II D結合部位を有する 2 5塩基対オリゴヌクレオチド（シグマジエノシス（株））から 2本鎖 D N A とし、ヒト組み換え転写因子 T F II D、 T F IIB (プ口メガ（株））をそれぞれ添加した。このラベルされた 2本鎖 D N Aを、表 1 および以下の説明において、「 T F IID結合部位 2 5 mer オリゴヌクレオチド」と称する。「 T F IID結合部位 2 5 mer オリゴヌクレオチド」の溶液中の濃度は、 5 n Mとし、転写因子 T F IID、 T F IIB の溶液中の濃度は、それぞれ 5 0 n Mとした。

「 T F II D結合部位 2 5 mer オリゴヌクレオチド」の配列を、以下に示す。

5 ' -G C A G A G C A T A T A A G G T G A G G T A G G A - 3 ' (配列番号 1 )

3 ' -C G T C T C G T A T A T T C C A C T C C A T C C T - 5 ' (配列番号 2 )

図 4 において、（ 1 ) は、「 T F IID結合部位 2 5 mer ォリゴヌクレオチド」のみ存在する溶液をサンプルとした場合の、該ォリゴヌクレオチド蛍光分子の並進拡散時間を示す。

( 2 ) は、 ( 1 ) の溶液に転写因子 T F IID を添加した場合の、当該溶液中の蛍光分子の並進拡散時間を示す。（ 3 ) は、

( 2 ) の溶液に転写因子 T F IIB を添加した場合の、当該溶液中の蛍光分子の並進拡散時間を示す。（ 4 ) は、（ 3 ) の溶液に抗 T F II B モノクローナル抗体 ( Anti- T F II B ) を添加した場合の、当該溶液中の蛍光分子の並進拡散時間を示す。

( 5 ) は、 T F II D結合部位をもたない蛍光ラベルされた合成オリゴヌクレオチド ( 2 1 mer) のみ存在する溶液をサンプルとした場合の、該オリゴヌクレオチド蛍光分子の並進拡散時間を示す。（ 6 ) は、（ 5 ) の溶液に、転写因子 T F II D、転写因子 T F IIB 、および抗 T F II B モノクローナル抗体を添加した場合の、当該溶液中の蛍光分子の並進拡散時間を示す。また、（ 1 ) 〜（ 6 ) それぞれの場合について、各分子の挙動を模式的に図 4 に示す。

Γ T F IID結合部位 2 5 mer オリゴヌクレオチド」は、分子量 1 7 k D a であり、並進拡散時間は 1 7 8 μ 秒であった

(図 4 ( 1 ) ) 。これに T F IIDを添加すると並進拡散時間は 2 3 7 秒となり、複合体の分子量 5 5 k D a から予想される並進拡散時間が 2 6 4 μ 秒となり、実測値と予想値の格差は 1 割程度に収まることがわかった（図 4 ( 2 ) ) 。このことより、並進拡散時間から分子量の概算を立てることができると判断できる。

さらに、転写因子 T F II Β の添加により、さらに大きく複合体が 8 7 k D a となるが、これも同様に 1 分子あたりの分子量の増加に伴って、元の合成オリゴヌクレオチドを基準とした並進拡散時間が計算値に近似した値で増加していくことがわかった（図 4 ( 3 ) ) 。この際の実測値と予想値の並進拡散時間の格差はわずか 4 %程度に収まることがわかった。さらに、溶液中に複合体が存在することを抗 T F II Bモノクローナル抗体または抗 T F II Dモノクローナル抗体の添カロによって確定することができた (図 4 ( 4 ) ) 。抗体は分子量 1 4 0 k D a であるが、抗体を含めた複合体は 2 2 7 k D a であるが、同様に求めた並進拡散時間の予想値と実測値の格差はわずか 3 %程度に収まることがわかった。なお、ここで溶液中に添加する抗体は、抗 T F II B抗体、抗 T F II D抗体の何れを使用してもよいし、両方を使用してもよい。

以上、図 4 ( 1 ) 〜 ( 4 ) は、「 T F II D結合部位 2 5 mer オリゴヌクレオチド」に順次タンパク質が結合することにより、該オリゴヌクレオチド蛍光分子のサイズが増大し、蛍光分子の並進拡散時間が増大することを示す。

—方、 T A T Aボックス配列を持たない合成オリゴヌタレォチド（ 2 1 mer ) では、転写因子ゃ抗転写因子抗体を添加しても、蛍光シグナルをもつ複合体を形成せず、並進拡散時間に顕著な増力!] はなかった（表 1 、図 4 ( 5 ) および

( 6 ) ) ₀

産業上の利用可能性

本発明によれば、核酸と核酸結合タンパク質との結合を一分子蛍光分析により検出する方法が提供される。とりわけ本発明は、遺伝子とそれに結合する転写因子の相互作用を探索し、タンパク質機能解析およびそれを利用した薬剤検出に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 一分子蛍光分析により、核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法。

2 . —分子蛍光分析により、核酸と 2種類の核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、

を具備することを特徴とする方法。

3 . —分子蛍光分析により、核酸と n種類（ n は 2以上の整数を表す）の核酸結合タンパク質との結合を検出する方法であって、

を具備することを特徴とする方法。

4 . 請求項 1 〜 3 の何れか 1 項に記載の方法であって、核酸と 1 種類以上の核酸結合タンパク質との結合を、核酸結合タンパク質の何れか一に対する抗体を用いて確認するェ程を更に具備することを特徴とする方法。

5 . 請求項 1 に記載の方法であって、

前記核酸が、タンパク質結合部位の配列を持つことを特徴とする方法。

6 . 請求項 1 に記載の方法であって、

前記核酸結合タンパク質が、 T A T Aボックス結合タンパク質であることを特徴とする方法。

7 . 請求項 1 に記載の方法であって、

「己核酸に、蛍光物質、発光物質、酵素発光物質、放射活性物質を結合させることにより、前記核酸結合タンパク質との結合を光シグナルで検出することを特徴とする方法。

8 . 請求項 1 に記載の方法であって、

前記核酸結合タンパク質が、基本転写因子、転写促進因子または転写阻害因子であることを特徴とする方法。