WO2004094660A2 - Gene dpysl3 comme marqueur du psoriasis - Google Patents

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WO2004094660A2
WO2004094660A2 PCT/FR2004/000933 FR2004000933W WO2004094660A2 WO 2004094660 A2 WO2004094660 A2 WO 2004094660A2 FR 2004000933 W FR2004000933 W FR 2004000933W WO 2004094660 A2 WO2004094660 A2 WO 2004094660A2
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gene
dpysl3
psoriasis
expression
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PCT/FR2004/000933
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Valérie TRINQUET
Patricia Rossio
Paul Fogel
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Galderma Research & Development, S.N.C.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the use of a probe relating to the DPYSL3 gene for the characterization of a biological sample.
  • the invention also relates to the use of this probe for the identification of a compound intended for the treatment of psoriasis, a method of identification as well as a new research tool.
  • Psoriasis is a frequent dermatological pathology which affects 3 to 5% of the European population.
  • The. psoriasis is commonly associated with other pathologies, such as hypertension, arthritis, or AIDS (Farber EM, Nall L, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded ( 1998), chapter 9: 107-157; Duvic M. et al., J Invest Dermatol (1990 Nov); 95 (5): 38S-40S).
  • psoriasis Based on the age of onset of symptoms and the association with certain genes of the major histocompatibility complex type I (CHI), psoriasis has been classified into two subtypes called I and II (Henseler T , Christophers E, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapter 10: 159-166). Studies have also shown that 30 to 50% of psoriasis patients have a family history with one of the parents of 1 or 2 nd degree. These observations have made it possible to suggest that psoriasis is a genetic disease with an autoimmune component (Bos, Br. J. Dermatol. (1988) 118: 141; Baadsgaard et al., J. Invest. Dermatol. (1990) 95: 328 ).
  • the main pathophysiological components of psoriasis include hyperproliferation associated with abnormal differentiation of keratinocytes of the epidermis, an inflammation characterized by an inflammatory infiltrate (mainly activated helper T lymphocytes) in the dermis and epidermis and by the release of pro-inflammatory cytokines, and finally an abnormal vascularization of the dermis (Krueger JG, J Am Acad Dermatol (2002) Jan; 46 (1): 1-23; quiz 23-6).
  • the involvement of the inflammatory process in the pathophysiology of psoriasis is supported by the mechanism of action of certain agents having a therapeutic effect beneficial for the disease.
  • cyclosporine used in the treatment of severe forms of psoriasis, exerts an inhibitory effect on the synthesis of interleukin-2, a cytokine promoting the proliferation of T lymphocytes and the secretion of inflammatory cytokines by these cells. Consequently, the modulators of inflammation make it possible to limit the inflammatory component characterizing in part psoriasis.
  • psoriasis is defined by an hyperplasia of the epidermis, as well as by scaling, erythema and inflammation of the skin.
  • Glucocorticoids administered topically are most commonly prescribed in the initial treatment of psoriasis, and exert beneficial anti-inflammatory, antimitotic and antipruritic effects.
  • Raw coal tar is a complex mixture of thousands of hydrocarbon compounds. Its therapeutic effect is linked to the inhibition of enzymes and to antimitotic properties. Although effective, this treatment is, by its odor, unpleasant to use for the patient and can induce skin cancers.
  • Methotrexate is the most commonly used systemic cytotoxic agent for severe forms of surface-spreading psoriasis important body. There are many contraindications for this treatment and stopping treatment may be accompanied by worsening of symptoms. Hydroxyurea, etretinate, cyclosporine, and AZT are also the systemic drugs used to fight psoriasis but all have serious side effects.
  • the nervous system is a complex set of many processes and controls. Most of the activity of the nervous system is initiated by sensory receptors such as visual receptors, auditory receptors, tactile receptors on the surface of the skin or other receptors.
  • the sensory system transmits information following actions such as touch, pressure or vibrations to the brain from receptors present on the entire surface of the skin. This information enters the central nervous system through the peripheral nerves and is immediately led to many sensory areas such as in the spine, the medulla, the midbrain, the cerebral cortex, the thalamus.
  • the Applicant has identified a new marker gene for psoriasis.
  • the subject of the present invention is a probe relating to the DPYSL3 gene for the characterization of a biological sample, and also a new tool for characterizing a compound intended for the treatment of psoriasis, as well as a new research tool.
  • the invention relates to the use of a polynucleotide probe relating to the DPYSL3 gene having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the gene DPYSL3 (accession number NM 001387.1) as a psoriasis research tool.
  • polynucleotide probe according to the invention allows in particular the characterization of a biological sample by measuring the level of expression of the DPYSL3 gene.
  • a biological sample corresponds to any sample or sample of living organism, preferably a mammal, in particular a human organism, in an amount sufficient to be characterized. Mention may be made, as a biological sample, by way of nonlimiting example, of a skin, scalp, mucosa, or cell sample.
  • the characterization of a biological sample consists in measuring the level of expression of a gene of interest, that is to say more precisely the quantity of messenger RNA or protein corresponding to this gene which is present in the biological sample.
  • polynucleotide probe is meant a single or double-stranded oligo- or polynucleotide, of RNA or DNA, the sequence of which is complementary to a target sequence corresponding to part or all of said gene and which can range from 10 to conventionally 500 base pairs and whose sequence is complementary to the target sequence by at least 80% and preferably by at least 90% (percentage of nucleic acid bases paired between two sequences, see the calculation methods proposed by Atschul et al J. Molec. Biol. (1990), 215: 403).
  • polynucleotide probes according to the invention may be oligo- or polynucleotides comprising one or more nucleotides modified by substitution, deletion or insertion, these modifications will be such that the sequence of the probe will allow it to specifically recognize the target sequence fragment.
  • the polynucleotide probes may also have a modified backbone giving it, for example, better stability.
  • the phosphodiester bonds of the natural RNA strands can be modified to include at least one nitrogen or sulfur atom.
  • the polynucleotide probes can be modified so that their phosphodiester bonds are replaced by peptide-like sequences (peptide nucleic acids).
  • polynucleotide probes according to the invention can comprise bases other than the 4 conventional bases.
  • the polynucleotide probes according to the invention can be synthesized according to numerous synthesis methods in vivo or in vitro manually or automatically.
  • a single-stranded cRNA probe may be obtained by in vitro transcription of a template of DNA sequence of interest serving as a template, using an RNA polymerase (for example T3, T7 or SP6 RNA polymerase).
  • RNA polymerase for example T3, T7 or SP6 RNA polymerase.
  • a single-stranded cDNA probe can be generated by reverse transcription of an mRNA of interest in the presence of a reverse transcriptase (for example M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase isolated from Escherichia coli).
  • M-MLV Microloney Murine Leukemia Virus
  • the polynucleotide probe can be or be part of a plasmid, a viral genome or another type of vector. It can, in other cases, be part of the genome of a cell, or else of a cell genetically modified to contain this probe in its genome. It can also be an isolated molecule.
  • this probe is preferably under the control of regulatory sequences. If the probe is inserted into a vector, said vector preferably comprises all the sequences necessary for the transcription and optionally the translation of the probe. This probe can also be surrounded by flanking regions allowing a step of homologous recombination with another polynucleotide fragment, possibly leading to the insertion of the probe of the invention into the genomic DNA of a target cell.
  • the invention also relates to the use of a polypeptide probe relating to the expression product of the DPYSL3 gene as a tool for the detection of psoriasis.
  • polypeptide probe according to the invention allows in particular the characterization of a biological sample by measuring the level of expression of the DPYSL3 gene.
  • polypeptide probe relating to the expression product of the DPYSL3 gene is meant a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression of the DPYSL3 gene, or against a biologically active fragment of said protein, or also against a polypeptide homologous, modified or variant of the wild protein.
  • Said antibody can be obtained according to methods known to those skilled in the art (Catty D (Ed): Antibodies, A Practical Approach, Volume I (1989), chapters 2, 3 and 4; or Harlow E. and Lane D. Antibodies, A laboratory Manual (1988), chapters 6 and 7) using said wild protein or said homologous polypeptide.
  • antibodies may, for example, be mono- or polyclonal antibodies, or their biologically active fragment capable of recognizing the protein encoded by the gene of interest.
  • These antibodies can be labeled, for example immuno-conjugated with enzymes or labeled using fluorescent compounds, biotin or even radiolabelled.
  • homologous polypeptides polypeptides whose amino acid sequences have at least 80%, and preferably 90% of amino acids in common with the wild protein encoded by the gene of interest.
  • variant polypeptide is intended to denote a polypeptide mutated or corresponding to a polymorphism which may exist, in particular in humans and which may have a truncation, a substitution, a deletion and / or an addition of at least one amino acid relative to the sequence of the normal wild-type polypeptide.
  • modified polypeptide is intended to denote a polypeptide obtained by genetic recombination or by chemical synthesis, exhibiting a modification with respect to the normal wild-type sequence.
  • modifications may in particular relate to the pre-, pro- or mature domains of the polypeptides, to the amino acids at the origin of a spectrum specificity or of activity efficiency, or at the origin of the structural conformation. , charge or hydrophobicity, and the capacity for multimerization and membrane insertion of the polypeptides. It will thus be possible to create polypeptides of equivalent, narrower or wider activity.
  • the modifications may also relate to the sequences involved in the processing, transport and addressing of the polypeptides.
  • biologically active fragment of a polypeptide is intended to denote a polypeptide fragment having conserved at least one activity of the polypeptide from which it is derived.
  • DPYSL3 Dihydropyrimidinase-like 3
  • hULIP unc-33-like phosphoprotein
  • Collapsin response mediator protein 4 Genbank reference (NCBI): NM_001387.1, whose transcriptional activity is induced in diseased skin.
  • This DPYSL3 gene is part of a family of TUC proteins, homologs to unc- 33 of C. elegans, involved in neuronal growth (Quinn CC et al. J. Neurobiol. (1999 Oct); 41 (1): 158- 64; Nacher J et al. J Comp Neurol (2000 Sep) 4; 424 (4): 628-39; BykT et al. J Neurosci. (1996 Jan) 15; 16 (2) -.688-701).
  • the DPYSL3 gene is also involved in neuronal differentiation and its expression is induced at the transcriptional level by retinoic acid (Gaetano C et al J BIol Chem. (1997 May) 2; 272 (18): 12195-201).
  • the present invention relates to the use of a polynucleotide probe relating to the DPYSL3 gene as defined above for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis of a biological sample by measuring the level of expression of the DPYSL3 gene.
  • the present invention also relates to the use of a polynucleotide probe relating to the DPYSL3 gene as defined above for the identification of a compound intended for the treatment of psoriasis.
  • the polynucleotide probe is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the probe
  • polynucleotide probe will be used in the method described below.
  • the invention thus relates to a method for identifying a compound intended for the treatment of psoriasis comprising the following steps: a) preparation of at least two biological samples; b) bringing one of the samples into contact with one or more compounds to be tested; c) measuring the quantity of messenger RNA corresponding to the DPYSL3 gene in biological samples using a polynucleotide probe, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the DPYSL3 gene (access number NM 001387.1); d) selection of said compounds for which an inhibition of the transcription of the messenger RNAs of the DPYSL3 gene is measured in the sample treated in step b).
  • step c) of the method can be implemented with a polynucleotide probe which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the cDNA probe.
  • a polynucleotide probe which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the cDNA probe.
  • the measurement of the expression of the DPYSL3 gene in a biological sample can be carried out using the technology of cDNA filters (“arrays”) on nylon support, according to which the extracted mRNAs of the biological sample are transcribed into radiolabelled single-stranded cDNAs which are then deposited on cDNA flitres.
  • the total mRNAs extracted from the biological sample tested can be analyzed according to one of the detection methods known to those skilled in the art (Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Volume I (1989) Second Edition, chapter 7) as the hybridization technique by Northem-Blot using a denatured double stranded cDNA probe.
  • the labeling of the probe may comprise a cycle of synthesis of double-stranded cDNA, from the total mRNAs extracted from the biological sample, coupled to an in vitro transcription in the presence of biotinyl ribonucleotides, generating Complementary labeled RNAs, these labeled antisense RNAs serving as a probe during hybridization on a DNA chip (Affymetrix, Gene Expression Monitoring, Technical Note; US 5,716,785, US 5,891,636, US 6,291,170).
  • the present invention relates to the use of a polypeptide probe relating to the DPYSL3 gene as defined above for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis of a biological sample by measuring the level expression of the DPYSL3 gene.
  • the present invention also relates to the use of a polypeptide probe relating to the DPYSL3 gene as defined above for the identification of a compound intended for the treatment of psoriasis.
  • the present invention also relates to a method for identifying a compound intended for the treatment of psoriasis comprising the following steps: a) preparation of at least two biological samples; b) bringing one of the samples into contact with one or more compounds to be tested; c) measuring the quantity of the protein produced by the expression of the DPYSL3 gene in biological samples using a polypeptide probe, said probe being a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild protein resulting from the expression of the DPYSL3 gene, or against a biologically active fragment of said protein, or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein; d) selection of said compounds for which an inhibition of the expression of said protein is measured in the sample treated in step b).
  • inhibition of the transcription of a DPYSL3 gene or of the expression of the protein is meant a reduction in the amount of messenger RNA or of the protein corresponding to said gene in a test sample.
  • the present invention relates to a research tool comprising a polynucleotide probe, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being complementary to at least 80% with a target sequence corresponding to all or part of the DPYSL3 gene (access number NM 001387.1).
  • the polynucleotide probe is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4.
  • the present invention also relates to a research tool comprising a polypeptide probe, said probe being a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression of the DPYSL3 gene, or against a biologically active fragment of said protein, or again against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • the research tool may also allow the analysis of the effects of certain treatments on the expression of psoriasis marker genes, such as DPYSL3, or the analysis of mutation of the sequence of these genes in individuals suffering from psoriasis.
  • the research tool may also allow the analysis of the expression profile of the DPYSL3 gene in the cells constituting the epidermis, in particular the keratinocytes, for example according to their state of proliferation or differentiation.
  • the research tool may also allow constitutive expression, overexpression or inhibition of expression of the DPYSL3 gene, according to in vitro or in vivo tests known to those skilled in the art.
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used, for example in a hybridization test by Northem-blot, or also in an amplification test by PCR (“Polymerase Chain Reaction” ), to follow the expression of the DPYSL3 gene or of a homologous, variant, modified or partial sequence in cells constituting the epidermis, in particular keratinocytes, expressing the DPYSL3 gene in vitro, for example as a function of the state of differentiation or proliferation of the cells.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the DPYSL3 gene can be placed under the control of a constitutive promoter such as the SV40 or CMV promoter, or of an inducible promoter such as the Tet Off Gene Expression System ( Invitrogen), classical techniques of genetic engineering and transfection are used (Gossen M, Bujard H., Annu Rev Genet. (2002) 36: 153-73).
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used, for example in a hybridization test with Northem-blot, or also in an amplification test by PCR (“Polymerase Chain Reaction”), to monitor the expression of the DPYSL3 gene or of a variant, modified or partial homogeneous sequence in the cells constituting the epidermis of a strain of laboratory animals, in particular in keratinocytes, overexpressing said gene in vivo or sequence, for example under the control of a promoter specifically activated in the epidermis, such as the promoters of Keratin K14, K15 or Involucrine, for example according to the state of differentiation or proliferation of the cells.
  • a promoter specifically activated in the epidermis such as the promoters of Keratin K14, K15 or Involucrine, for example according to the state of differentiation or proliferation of the cells.
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used for the analysis for example by Southem-Blot of an inactivation by deletion of the DPYSL3 gene, for example in cells constituting the epidermis, in particularly keratinocytes, cultivated in vitro or even in vivo in the cells of a strain of laboratory animals.
  • This inactivation can be carried out according to conventional techniques of homologous recombination.
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used to draw and synthesize siRNAs, according to techniques known to those skilled in the art (Tuschl T, Borkhardt A, Mol Interv (2002) Jun ; 2 (3): 158-67).
  • These antisense RNAs can be used for the inhibition of the expression of the DPYSL3 gene, for example in a cell line constitutive of the epidermis, in particular keratinocytes, in vitro, or even in vivo, for example in a strain of laboratory animals.
  • this search tool could be such that the probe or probes that it comprises, are brought into contact with the corresponding target sequence (s) deposited on a support such as a filter in nylon.
  • the probe can also be used in a hybridization test (for example a mismatch detection test), sequencing, microsequencing.
  • the probe according to the invention may be associated with another detectable probe, the nature of which may preferably be fluorescent, radioactive or enzymatic.
  • This characteristic can make it possible, among other things, to track the location of the probe, from the extracellular medium to the cell, or from the cytoplasm to the nucleus, or else to specify its interaction with DNA, or RNA or proteins.
  • detectable probe is best suited as a function of the characteristic that they want to be able to follow.
  • the polypeptide probe according to the invention can be used for immunolabelling of the target polypeptide as defined above, on biological samples, according to the conventional techniques known to those skilled in the art, for example on section of epidermis of laboratory animals, for example animals exhibiting an overexpression of the DPYSL3 protein or of a homologous, variant, modified or active fragment of said protein, or even in vitro on cells constituting the epidermis, in particular keratinocytes, which may be the subject of an overexpression of the protein or of said polypeptide, or else of an inhibition of this expression, for example by the use of siRNA as envisaged previously.
  • the polypeptide probe can also be used to purify said protein or said polypeptide, by example, according to immunoprecipitation techniques conventionally known to those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for characterizing skin samples to determine predisposition to psoriasis.
  • the Applicant has demonstrated that the expression of the DPYSL3 gene is induced in lesional psoriatic skin with a plaque of psoriasis, compared to healthy skin (average expression measured in 13 psoriatic subjects and 10 healthy subjects). The results obtained are presented in Table 1.
  • Table 2 shows the expression of DPYSL3 relative to an average expression in healthy subjects, in patients with predominantly trunk and asymmetric plaques.
  • Table 3 represents the expression of DPYSL3 relative to an average expression in healthy subjects, in patients presenting mainly symmetrical plaques.
  • the invention also relates to a method for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis comprising a step of measuring the overexpression in a biological sample of the DPYSL3 gene by bringing a polynucleotide probe into contact with the target sequences isolated from said biological sample, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the DPYSL3 gene (access no. NM 001387.1).
  • the polynucleotide probe may be a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4.
  • the invention also relates to a method for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis comprising a step of measuring the overexpression in a biological sample of the protein produced by the expression of the DPYSL3 gene by bringing into contact with a probe polypeptide such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild protein resulting from the expression of the DPYSL3 gene, or against a biologically active fragment of said protein, or also against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild protein.
  • a probe polypeptide such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild protein resulting from the expression of the DPYSL3 gene, or against a biologically active fragment of said protein, or also against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild protein.
  • overexpression of a gene in a biological sample is meant a higher expression of the messenger RNA or of the protein corresponding to this gene in this sample compared to a healthy reference sample.
  • the invention also relates to a diagnostic kit comprising a polynucleotide or polypeptide probe relating to the DPYSL3 gene.
  • the object of the present invention therefore relates to a diagnostic kit comprising a polynucleotide probe, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the DPYSL3 gene (accession number NM 001387.1).
  • said polynucleotide probe of the diagnostic kit is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4.
  • the object of the present invention also relates to a diagnostic kit comprising a polypeptide probe such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild protein resulting from the expression of the DPYSL3 gene, or against a biologically active fragment of said protein , or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • a polypeptide probe such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild protein resulting from the expression of the DPYSL3 gene, or against a biologically active fragment of said protein , or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • DPYSL3 is a therapeutic target for the development of new therapies aimed at treat chronic common plaque psoriasis, regardless of the predominant type of plaque in the patient, and the location of the psoriasis plaque on the body.
  • Another object of the present invention therefore relates to the use of a polynucleotide probe complementary to the DPYSL3 gene to inhibit the expression of the DPYSL3 gene.
  • the polynucleotide probe may be an antisense RNA or a siRNA which has the role of inhibiting the expression of a specific gene (Fire A., Trends in Genetic (1999); 15: 358-363).
  • the polynucleotide probe will be a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4.
  • the invention also relates to the use of a polynucleotide probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the DPYSL3 gene (no. of accession NM 001387.1) for the manufacture of a pharmaceutical composition intended for the treatment of psoriasis.
  • the polynucleotide probe may more particularly be a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4.
  • the determination of the gene profiles is based on the hybridization of a complex single-stranded cDNA probe (generated by the reverse transcription of the mRNAs from each skin biopsy) on fragments of cDNA of interest, which are deposited on a support such as a nylon filter.
  • the hybridization signals obtained are proportional to the quantity of each labeled cDNA in the probe and reflect the level of expression of each mRNA in the analyzed skin sample (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1; 29 (1): 207-16).
  • Filters developed by the Applicant, specific to dermatology have been developed. These filters are made up of 474 cDNAs involved in the physiological processes of human skin. In parallel, commercial filters with 4200 human cDNAs (Invitrogen GF211) were used. These cDNA filters will make it possible to determine the expression of genes of interest in healthy skin as well as in non-lesional and lesional skin of patients suffering from chronic vulgar plaque psoriasis.
  • cDNA filters arrays
  • the principle of this technology is based on the hybridization of a single-stranded cDNA probe radiolabelled on target cDNA fragments deposited at high density on nylon filters (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1; 29 (1): 207-16).
  • nylon filters sold by the company Invitrogen on which 4200 identified human cDNAs are deposited, as well as filters dedicated to dermatology with 474 human cDNAs, developed by the Applicant, are used.
  • the radiolabelled cDNA probes are generated by retrotranscription of the total RNAs (Invitrogen protocol), isolated from the different biopsies taken from 10 healthy volunteers and 13 subjects suffering from chronic plaques of vulgar psoriasis (RNEasy protocol, Qiagen).
  • the hybridization signals obtained are proportional to the quantity of each labeled cDNA present in the probe, which hybridizes to the cDNA which is complementary to it on the filter and thus reflect the transcriptional activity of the mRNAs in the biopsies analyzed.
  • the hybridization signals are measured by phospholuminescence, then quantified using the image analysis software Imagen (Biodiscovery).
  • the background noise linked to non-specific hybridization is measured on each filter on virgin areas of cDNA deposition (GF211 filters), or within a surrounding crown. each spot (dedicated filters).
  • a detection threshold making it possible to discriminate a measurement relating to a real signal or noise, is automatically determined for each filter using the method described previously by Fogel et al., 2002.
  • the results of gene expression between the different biopsies analyzed, the hybridization signals are normalized by the median of the set of signals obtained for each biopsy (filters GF211), or by the expression of an exogenous messenger RNA, serving of reference, whose expression is invariant between the analyzed samples.
  • This exogenous transcript is added in constant quantity to the total RNA preparations from the different samples, before synthesis of the radiolabelled cDNA probe.
  • the target sequence of this exogenous transcript is deposited on each filter.
  • an average reference expression is determined on all the biopsies of healthy subjects, then subtracted from the expression obtained in each biopsy of non lesional and lesional psoriatic skin (values in log).
  • the ratio between the expression of each gene in psoriatic skin compared to healthy skin is then obtained by taking the base 10 exponential of the value calculated previously (Tables 1 to 4). The results obtained make it possible to highlight the overexpression of the DPYSL3 gene in lesional human skin having a plaque of psoriasis compared to healthy human skin (Table 1).
  • Tables 2 and 3 indicate that this overexpression is observed whatever the predominant type of plaques expressed in the patient (symmetrical or truncated) and also independently of the location of the psoriasis plaques.
  • the abbreviations mentioned in these tables represent the location of the biopsies taken from the body for each psoriatic subject (SP) and have the following meaning: JG: left leg, JD: right leg, BD: right arm, BG: left arm, T: trunk.
  • the different local clinical scores used to define the presence or absence of psoriasis on the biopsied skin area, as well as the severity of the psoriasis plaque, are the erythema, scaling and plate elevation. These scores are conventionally measured using the following rankings:
  • the measurement of erythema is done using the following classification:
  • Measuring the expression of the DPYSL3 gene therefore makes it possible to make a very early diagnosis of psoriasis, since the expression of these genes allows to differentiate at the molecular level non-lesional skins already affected, when the clinical signs do not allow it.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'une sonde relative au gène DPYSL3 pour la caractérisation d'un échantillon biologique. L'invention a également pour objet l'utilisation de cette sonde pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis, un procédé d'identification ainsi qu'un nouvel outil de recherche.

Description

GENE DPYSL3 DU PSORIASIS
La présente invention a pour objet l'utilisation d'une sonde relative au gène DPYSL3 pour la caractérisation d'un échantillon biologique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de cette sonde pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis, un procédé d'identification ainsi qu'un nouvel outil de recherche.
Le psoriasis est une pathologie dermatologique fréquente qui touche de 3 à 5% de la population européenne. Le. psoriasis est couramment associé à d'autres pathologies, telles que l'hypertension, l'arthrite, ou encore le SIDA (Farber EM, Nall L, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapitre 9:107-157; Duvic M. et al., J Invest Dermatol (1990 Nov);95(5):38S-40S).
Sur la base de l'âge d'apparition des symptômes et de l'association avec certains gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type I (C H I), le psoriasis a été classé en deux sous-types appelés I et II (Henseler T, Christophers E, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapter 10:159-166). Des études ont également montré que 30 à 50% des patients atteints de psoriasis ont un antécédent familial chez un des parents du 1er ou 2e degré. Ces observations ont permis de suggérer que le psoriasis est une maladie génétique avec une composante autoimmune (Bos, Br. J. Dermatol. (1988) 118:141 ; Baadsgaard et al., J. Invest. Dermatol. (1990) 95:328).
Les principales composantes physiopathologiques du psoriasis incluent une hyperprolifération associée à une différenciation anormale des kératinocytes de l'épiderme, une inflammation caractérisée par un infiltrat inflammatoire (principalement de lymphocytes T helpers activés) au niveau du derme et de l'épiderme et par le relargage de cytokines pro-inflammatoires, et enfin une vascularisation anormale du derme (Krueger JG, J Am Acad Dermatol (2002) Jan;46(1):1-23; quiz 23-6). L'implication du processus inflammatoire dans la physiopathologie du psoriasis est soutenue par le mécanisme d'action de certains agents ayant un effet thérapeutique bénéfique pour la maladie. Par exemple, la cyclosporine utilisée dans le traitement des formes sévères de psoriasis, exerce un effet inhibiteur sur la synthèse de l'interleukine-2, cytokine promouvant la prolifération des lymphocytes T et la sécrétion des cytokines inflammatoires par ces cellules. Par conséquent, les modulateurs de l'inflammation permettent de limiter la composante inflammatoire caractérisant en partie le psoriasis. Cliniquement, le psoriasis se définit par une hyperplasie de l'épiderme, ainsi que par une desquamation, un érythème et une inflammation cutanés.
Les méthodes actuellement disponibles pour le traitement incluent la thérapie topique, la photothérapie, la photo-chimiothérapie et la thérapie systémique, réservée aux formes plus sévères de la maladie. Néanmoins, ces thérapies offrent uniquement des périodes de rémission aux patients, mais la pathologie resurgit généralement après l'arrêt du traitement.
Les glucocorticoïdes administrés par voie topique sont le plus généralement prescrits dans le traitement initiai du psoriasis, et exercent des effets anti- inflammatoires, antimitotiques et antipruritiques bénéfiques.
Le goudron brut de charbon est un mélange complexe de milliers de composés d'hydrocarbure. Son effet thérapeutique est lié à l'inhibition d'enzymes et à des propriétés antimitotiques. Bien qu'efficace, ce traitement est, de par son odeur, désagréable à utiliser pour le patient et peut induire des cancers cutanés. La photothérapie et photo-chimiothérapie basées sur l'administration du methoxsalen, principe actif photosensibilisant, sont seulement temporairement efficaces. Le traitement doit être répété et offre une thérapie palliative, mais non curative. De plus, ces traitements ont des effets secondaires à long terme, notamment des altérations immunologiques et un risque accru de carcinogenèse.
Le methotrexate est l'agent cytotoxique systémique le plus généralement administré pour les formes sévères de psoriasis s'étendant sur une surface importante du corps. Les contre-indications de ce traitement sont nombreuses et l'arrêt du traitement peut s'accompagner d'une aggravation des symptômes. L'hydroxyurée, l'etretinate, la cyclosporine, et l'AZT sont également les médicaments systémiques utilisés pour lutter contre le psoriasis mais tous ont des effets secondaires sérieux.
A ce jour, aucun traitement ne permet une rémission durable de cette pathologie sans engendrer des effets secondaires importants, car le psoriasis est une pathologie complexe d'origine multifactorielle. La compréhension du mécanisme physiopathologique conduisant au phenotype psoriasique demeure donc un défi important dans le traitement médical dermatologique. En effet, beaucoup d'aspects de la maladie restent à élucider, comme par exemple la réponse hétérogène à certains traitements, de patients présentant des signes cliniques semblables.
Le système nerveux est un ensemble complexe de nombreux processus et de contrôles. La majeure partie de l'activité du système nerveux est initiée par les récepteurs sensoriels comme les récepteurs visuels, les récepteurs auditifs, les récepteurs tactiles à la surface de la peau ou d'autres récepteurs. Le système sensoriel transmet des informations suite à des actions comme le toucher, la pression ou les vibrations, au cerveau venant des récepteurs présents sur toute la surface de la peau. Ces informations entrent dans le système nerveux central à travers les nerfs périphériques et sont conduites immédiatement vers de nombreuses zones sensorielles comme dans la colonne vertébrale, la medulla, le mésencéphale, le cortex cérébral, le thalamus.
Au vu des connaissances du processus de transmission des sensations somatiques, rien ne permet à l'homme du métier de déduire une quelconque implication des nerfs sensitifs cutanés dans le dérèglement physiologique menant au phenotype psoriasique.
L'analyse de l'expression génique dans la peau de patients psoriasiques constitue une voie pour mieux comprendre le mécanisme physiopathologique de cette maladie (Bowcock AM, Shannon W, Du F, et al., Hum Mol Genêt (2001) 10(17):1793-805 ; Oestreicher JL, Walters IB, Kikuchi T, et al., Pharmacogenomics J (2001 ) 1 (4):272-87).
La technologie des filtres à ADNc (« arrays ») (NGuyen C, Rocha D, Granjeaud S, et al., Genomics (1995)) est une des technologies permettant d'analyser simultanément et rapidement l'expression de plusieurs centaines d'ARNm à partir d'une biopsie cutanée prélevée chez le patient, par opposition à d'autres technologies plus lourdes à mettre en œuvré, comme le SAGE (« Sériai Analysis of Gène Expression ») (Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW, Science (1995 Oct) 20;270(5235):484-7), ou le Differential Display (Liang P, Pardee AB, Science (1992) 257: 967-971; Zhang L, et al., Science : (1997) 276: 1268-1272).
La Demanderesse a mis en évidence un nouveau gène marqueur du psoriasis.
La présente invention a pour objet une sonde relative au gène DPYSL3 pour la caractérisation d'un échantillon biologique, et également un nouvel outil de caractérisation d'un composé destiné au traitement du psoriasis, ainsi q'un nouvel outil de recherche.
En particulier, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polynucléotîdique relative au gène DPYSL3 ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (N° d'accession NM 001387.1) comme outil de recherche du psoriasis.
L'utilisation de la sonde polynucléotidique selon l'invention permet notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène DPYSL3.
Selon la présente invention, un échantillon biologique correspond à tout prélèvement ou échantillon d'organisme vivant, de préférence un mammifère, en particulier un organisme humain, en quantité suffisante pour être caractérisé. On peut citer comme échantillon biologique, à titre d'exemple non limitatif, un échantillon de peau, de cuir chevelu, de muqueuse, ou cellulaire.
Selon la présente invention, la caractérisation d'un échantillon biologique consiste à mesurer le niveau d'expression d'un gène d'intérêt, c'est à dire plus précisément la quantité d'ARN messager ou de protéine correspondante à ce gène qui est présente dans l'échantillon biologique.
Par sonde polynucléotidique, on entend un oligo- ou polynucléotide simple ou double brin, d'ARN, ou ADN, dont la séquence est complémentaire d'une séquence cible correspondant à une partie ou à la totalité dudit gène et pouvant aller de 10 à classiquement 500 paires de bases et dont la séquence est complémentaire avec la séquence cible à au moins 80% et préférentiellement d'au moins 90% (pourcentage de bases d'acide nucléiques appariées entre deux séquences, voir les méthodes de calcul proposées par Atschul et al. J. Molec. Biol. (1990), 215:403).
Les sondes polynucléotidiques selon l'invention pourront être des oligo- ou polynucléotides comportant un ou plusieurs nucléotides modifiés par substitution, délétion ou insertion, ces modifications seront telles que la séquence de la sonde lui permettra de reconnaître spécifiquement le fragment de séquence cible.
Les sondes polynucléotidiques pourront également présenter un squelette modifié lui conférant, par exemple, une meilleure stabilité. Par exemple, les liaisons phosphodiesters des brins d'ARN naturels peuvent être modifiées pour inclure au moins un atome d'azote ou de soufre. Par ailleurs, les sondes polynucléotidiques pourront être modifiées de telle sorte que leurs liaisons phosphodiesters sont remplacées par des séquences de type peptidique (peptide nucleic acids).
De plus, les sondes polynucléotidiques selon l'invention peuvent comprendre des bases autres que les 4 bases classiques. Les sondes polynucléotidiques selon l'invention peuvent être synthétisées selon de nombreuses méthodes de synthèse in vivo ou in vitro de façon manuelle ou automatique.
Les méthodes de synthèse in vitro peuvent être chimiques ou enzymatiques. Par exemple, une sonde d'ARNc simple brin peut-être obtenue par transcription in vitro d'un modèle de séquence d'ADN d'intérêt servant de matrice, en faisant intervenir une ARN polymérase (à titre d'exemple la T3, T7 ou SP6 ARN polymérase). Une sonde d'ADNc simple brin peut-être générée par transcription inverse d'un ARNm d'intérêt en présence d'une reverse transcriptase (par exemple la M- MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase isolée d'Escherichia coli).
De nombreuses méthodes de synthèse in vivo d'ARN double brin sont décrites dans la littérature, elles peuvent être réalisées dans divers types cellulaires de bactéries ou d'organismes supérieurs. On pourra également se référer aux méthodes de synthèses décrites dans les demandes de brevet WO01/36646 et WO01/75164. Ces ARN double brin peuvent être ensuite dénaturés pour servir de polynucléotide simple brin.
Concernant son environnement, la sonde polynucléotidique peut être ou faire partie d'un plasmide, d'un génome viral ou d'un autre type de vecteur. Elle peut, dans d'autres cas, faire partie du génome d'une cellule, ou bien d'une cellule génétiquement modifiée pour comporter cette sonde dans son génome. Il peut s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant cette sonde, elle est de préférence sous le contrôle de séquences régulatrices. Si la sonde est insérée dans un vecteur, ledit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires à la transcription et éventuellement la traduction de la sonde. Cette sonde peut aussi être entourée par des régions flanquantes permettant une étape de recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique, conduisant éventuellement à l'insertion de la sonde de l'invention dans l'ADN génomique d'une cellule cible.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde polypeptidique relative au produit d'expression du gène DPYSL3 comme outil de recherche du psoriasis.
L'utilisation de la sonde polypeptidique selon l'invention permet notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène DPYSL3.
Par sonde polypeptidique relative au produit d'expression du gène DPYSL3, on entend un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage. Ledit anticorps peut être obtenu selon les procédés connus de l'homme de l'art (Catty D (Ed) : Antibodies, A Practical Approach, Volume I (1989), chapitres 2, 3 et 4 ; ou encore Harlow E. et Lane D. Antibodies, A laboratory Manual (1988), chapitres 6 et 7) en utilisant ladite protéine sauvage ou ledit polypeptide homologue.
Il pourra, par exemple, s'agir d'anticorps mono- ou polyclonal, ou de leur fragment biologiquement actif capable de reconnaître la protéine codée par le gène d'intérêt. Ces anticorps pourront être marqués, par exemple immuno- conjugués à des enzymes ou marqués à l'aide de composés fluorescents, de la biotine ou encore radiomarqués.
Par polypeptides homologues, on entend des polypeptides dont les séquences en acides aminés présentent au minimum 80%, et preferentiellement 90% d'acides aminés en commun avec la protéine sauvage codée par le gène d'intérêt. Par polypeptide variant, on entend désigner un polypeptide muté ou correspondant à un polymorphisme pouvant exister, notamment chez l'être humain et pouvant présenter une troncature, une substitution, une délétion et/ou une addition d'au moins un acide aminé par rapport à la séquence du polypeptide sauvage normal.
Par polypeptide modifié, on entend désigner un polypeptide obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, présentant une modification par rapport à la séquence sauvage normale. Ces modifications pourront notamment porter sur les domaines pré-, pro- ou mature des polypeptides, sur les acides aminés à l'origine d'une spécificité de spectre ou d'efficacité de l'activité, ou à l'origine de la conformation structurale, de la charge ou de l'hydrophobicité, et de la capacité de multimérisation et d'insertion membranaire des polypeptides. On pourra ainsi créer des polypeptides d'activité équivalente, plus étroite ou plus large. Les modifications pourront aussi porter sur les séquences impliquées dans la maturation, le transport et l'adressage des polypeptides.
Par fragment biologiquement actif d'un polypeptide, on entend désigner un fragment polypeptidique ayant conservé au moins une activité du polypeptide dont il est issu.
Une étude comparative de l'expression génique dans la peau psoriasique par rapport à la peau saine, a permis à la Demanderesse d'identifier un gène, dénommé DPYSL3 (Dihydropyrimidinase-like 3) ou hULIP (unc-33-like phosphoprotein) ou Collapsin response mediator protein 4, référence Genbank (NCBI): NM_001387.1 , dont l'activité transcriptionnelle est induite dans la peau malade.
Ce gène DPYSL3 fait partie d'une famille de protéines TUC, homologues à unc- 33 de C. elegans, impliquées dans la croissance neuronale (Quinn CC et al. J. Neurobiol. (1999 Oct) ;41(1) :158-64; Nacher J et al. J Comp Neurol (2000 Sep) 4 ;424(4) :628-39; BykT et al. J Neurosci. (1996 Jan) 15; 16(2) -.688-701). Le gène DPYSL3 est aussi impliqué dans la différenciation neuronale et son expression est induite au niveau transcriptionnel par l'acide rétinoique (Gaetano C et al J BIol Chem. (1997 May) 2 ;272(18) :12195-201 ).
En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique relative au gène DPYSL3 telle que définie ci-dessus pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène DPYSL3.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique relative au gène DPYSL3 telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde
ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la sonde polynucléotidique sera utilisée dans le procédé décrit ci-dessous.
L'invention se rapporte ainsi à un procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité d'ARN messager correspondant au gène DPYSL3 dans les échantillons biologiques à l'aide d'une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accesssion NM 001387.1) ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de la transcription des ARN messagers du gène DPYSL3 est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
En particulier, l'étape c) du procédé pourra être mise en œuvre avec une sonde polynucléotidique qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Selon le mode de réalisation donné dans l'exemple 1 , la mesure de l'expression du gène DPYSL3 dans un échantillon biologique peut être réalisée en utilisant la technologie des filtres à ADNc (« arrays ») sur support nylon, selon laquelle les ARNm extraits de l'échantillon biologique sont transcrits en ADNc simple brin radiomarqués qui sont ensuite déposés sur des flitres à ADNc.
Selon un autre mode de réalisation possible, les ARNm totaux extraits de l'échantillon biologique testé peuvent être analysés selon l'une des méthodes de détection connues de l'homme de l'art (Sambrook et al. : Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Volume I (1989) Second Edition, chapitre 7) comme la technique d'hybridation par Northem-Blot utilisant une sonde cDNA double brin dénaturée.
Selon un autre mode de réalisation possible, le marquage de sonde peut comprendre un cycle de synthèse d'ADNc double brin, à partir des ARNm totaux extraits de l'échantillon biologique, couplé à une transcription in vitro en présence de ribonucleotides biotinyles, générant des ARN complémentaires marqués, ces ARN antisens marqués servant de sonde lors de l'hybridation sur une puce à ADN (Affymetrix, Gène Expression Monitoring, Technical Note ; US 5 716 785, US 5 891 636, US 6 291 170). Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polypeptidique relative au gène DPYSL3 telle que définie ci-dessus pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène DPYSL3.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde polypeptidique relative au gène DPYSL3 telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
La présente invention se rapporte aussi à un procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité de la protéine produite par l'expression du gène DPYSL3 dans les échantillons biologiques à l'aide d'une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de l'expression de ladite protéine est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
On entend par inhibition de la transcription d'un gène DPYSL3 ou de l'expression de la protéine, une diminution de la quantité d'ARN messagers ou de la protéine correspondant audit gène dans un échantillon testé.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à un outil de recherche comprenant une sonde polynucleotide, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accesssion NM 001387.1).
En particulier, la sonde polynucléotidique est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
La présente invention se rapporte aussi à un outil de recherche comprenant une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
L'outil de recherche pourra en outre permettre l'analyse des effets de certains traitements sur l'expression de gènes marqueurs du psoriasis, tel que DPYSL3, ou l'analyse de mutation de la séquence de ces gènes chez des individus atteints de psoriasis.
L'outil de recherche pourra également permettre l'analyse du profil d'expression du gène DPYSL3 dans les cellules constituant l'épiderme, en particulier les kératinocytes, par exemple en fonction de leur état de prolifération ou de différenciation. L'outil de recherche pourra également permettre l'expression constitutive, la surexpression ou l'inhibition de l'expression du gène DPYSL3, selon des tests in vitro ou in vivo connus de l'homme de l'art.
Par exemple, selon un outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée, par exemple dans un test d'hybridation par Northem-blot, ou encore dans un test d'amplification par PCR (« Polymérase Chain Reaction »), pour suivre l'expression du gène DPYSL3 ou d'une séquence homoloque, variante, modifiée ou partielle, dans des cellules constituant l'épiderme, en particulier des kératinocytes, exprimant in vitro le gène DPYSL3, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de prolifération des cellules. En particulier, ladite expression peut être constitutive ou encore inductible, le gène DPYSL3 pouvant être placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif tel que le promoteur SV40 ou CMV, ou d'un promoteur inductible tel que le système Tet Off Gène Expression System (Invitrogen), sont utilisées les techniques classiques de génie génétique et de transfection (Gossen M, Bujard H. , Annu Rev Genet.(2002) 36:153-73).
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée, par exemple dans un test d'hybridation par Northem-blot, ou encore dans un test d'amplification par PCR (« Polymérase Chain Reaction »), pour suivre l'expression du gène DPYSL3 ou d'une séquence homoloque, variante, modifiée ou partielle, dans les cellules constituant l'épiderme d'une souche d'animaux de laboratoire, en particulier dans les kératinocytes, surexprimant in vivo ledit gène ou séquence, par exemple sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement activé dans l'épiderme, tel que les promoteurs de Kératine K14, K15 ou de l'Involucrine, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de prolifération des cellules.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée pour l'analyse par exemple par Southem-Blot d'une inactivation par délétion du gène DPYSL3, par exemple dans des cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des kératinocytes, cultivés in vitro ou encore in vivo dans les cellules d'une souche d'animaux de laboratoire. Cette inactivation peut être réalisée selon les techniques classiques de recombinaison homologue.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée pour dessiner et synthétiser des siARN, selon les techniques connues de l'homme de l'art (Tuschl T, Borkhardt A, Mol Interv (2002) Jun;2(3):158-67). Ces ARN antisens peuvent être utilisés pour l'inhibition de l'expression du gène DPYSL3, par exemple dans une lignée de cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des kératinocytes, in vitro, ou encore in vivo, par exemple dans une souche d'animaux de laboratoire.
Par exemple, cet outil de recherche pourra être tel que la ou les sondes qu'il comprend, sont mises en contact avec la ou les séquence(s) cible(s) correspondante(s) déposées sur un support tel qu'un filtre en nylon.
La sonde peut encore être utilisée dans un test d'hybridation (par exemple un test de détection de mésappariement), un séquençage, un microséquençage.
Selon d'autres outils de recherche envisagés par la présente invention, la sonde selon l'invention pourra être associée à une autre sonde détectable dont la nature pourra être de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation de la sonde, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. L'homme du métier saura quelle sonde détectable est la mieux adaptée en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Selon un outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique selon l'invention peut être utilisée pour des immunomarquages du polypeptide cible tel que défini précédemment, sur des échantillons biologiques, selon les techniques classiques connues de l'homme de l'art, par exemple sur coupe d'épiderme d'animaux de laboratoire, par exemple les animaux présentant une surexpression de la protéine DPYSL3 ou d'un polypeptide homologue, variant, modifié ou fragment actif de ladite protéine, ou encore in vitro sur des cellules constituant l'épiderme, en particulier des kératinocytes, pouvant être l'objet d'une surexpression de la protéine ou dudit polypeptide, ou encore d'une inhibition de cette expression, par exemple par l'utilisation de siRNA comme envisagé précédemment.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique peut également être utilisée pour purifier ladite protéine ou ledit polypeptide, par exemple, selon des techniques d'immunoprécipitation classiquement connues de l'homme de l'art.
Les techniques classiquement connues de l'homme de l'art peuvent être les techniques décrites par Sambrook J, Fritsch EF et Maniatis T dans Molecular Cloning, A Laboratory Manual.
La découverte de la surexpression du gène DPYSL3 dans la peau psoriasique permet d'une part de diagnostiquer le psoriasis, et d'autre part, de développer de nouvelles thérapeutiques basées sur l'inhibition de l'expression et/ou de la fonction de DPYSL3 pour traiter le psoriasis en limitant la composante neuronale qui le caractérise.
Dans un aspect particulièrement préférable, la présente invention fournit une méthode pour caractériser des échantillons de peau pour déterminer la prédisposition au psoriasis.
La Demanderesse a démontré que l'expression du gène DPYSL3 est induite dans la peau psoriasique lesionnelle présentant une plaque de psoriasis, par rapport à la peau saine (expression moyenne mesurée chez 13 sujets psoriasiques et 10 sujets sains). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1.
La mesure de l'expression de DPYSL3 permet de caractériser une peau psoriasique lesionnelle indépendamment du type et de la localisation de la plaque de psoriasis (tableaux 2 et 3). Le tableau 2 représente l'expression de DPYSL3 relative à une expression moyenne chez les sujets sains, chez les patients présentant majoritairement des plaques au niveau du tronc et des plaques asymétriques. Le tableau 3 représente l'expression de DPYSL3 relative à une expression moyenne chez les sujets sains, chez les patients présentant majoritairement des plaques de type symétrique. En outre, hormis la caractérisation d'une peau présentant une plaque de psoriasis par rapport à une peau saine, la découverte de ce nouveau marqueur du psoriasis permet également de discriminer une peau de patient psoriasique non lesionnelle (cliniquement saine) mais déjà engagée vers le processus psoriasique, d'une peau non lesionnelle ayant les réelles caractéristiques d'une peau saine.
La Demanderesse a découvert de façon surprenante, que certaines peaux non lésionnelles surexpriment aussi le gène DPYSL3. Sur la base de l'expression de ce gène, le diagnostic du psoriasis est réalisable très précocement puisque l'expression du gène DPYSL3 permet de différencier au niveau moléculaire des peaux non lésionnelles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le permettent pas. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 4.
Ainsi l'invention se rapporte également à un procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique du gène DPYSL3 par la mise en contact d'une sonde polynucléotidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon biologique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accesssion NM 001387.1).
En particulier, la sonde polynucléotidique pourra être un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
L'invention se rapporte aussi à un procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique de la protéine produite par l'expression du gène DPYSL3 par la mise en contact d'une sonde polypeptidique telle que un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
Par surexpression d'un gène dans un échantillon biologique, on entend une expression de l'ARN messager ou de la protéine correspondant à ce gène plus élevée dans cet échantillon par rapport à un échantillon sain de référence.
Par ailleurs, l'invention se rapporte aussi à un kit de diagnostic comprenant une sonde polynucléotidique ou polypeptidique relative au gène DPYSL3.
L'objet de la présente invention se rapporte donc à un kit de diagnostic comprenant une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1).
En particulier, ladite sonde polynucléotidique du kit de diagnostic est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
L'objet de la présente invention se rapporte aussi à un kit de diagnostic comprenant une sonde polypeptidique telle que un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
Les observations décrites ci-dessus indiquent également que DPYSL3 est une cible thérapeutique pour le développement de nouvelles thérapies visant à traiter le psoriasis chronique vulgaire en plaques, quelque soit le type prédominant de plaques chez le patient, et la localisation de la plaque de psoriasis sur le corps.
Ainsi, un autre objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique complémentaire, au gène DPYSL3 pour inhiber l'expression du gène DPYSL3.
En particulier, la sonde polynucléotidique pourra être un ARN antisens ou un siRNA qui a pour rôle d'inhiber l'expression d'un gène spécifique (Fire A., Trends in Genetic (1999) ; 15 : 358-363).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique sera un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Enfin, l'invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1 ) pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement du psoriasis.
La sonde polynucléotidique pourra plus particulièrement être un fragment de 10 a 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
EXEMPLE 1 - MESURE D'EXPRESSION GENIQUE DANS LA PEAU SAINE ET DANS LA PEAU PSORIASIQUE
Une étude clinique réalisée en présence de volontaires sains et de patients atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques, a permis de mettre en évidence l'implication du gène DPYSL3 dans le psoriasis. Des biopsies cutanées sont prélevées chez des volontaires sains, ainsi que sur des plaques de psoriasis et sur des zones non lésionnelles apparaissant cliniquement saines, chez des patients atteints de psoriasis. La présence ou l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiée, ainsi que la sévérité de la plaque de psoriasis, sont déterminées par l'évaluation de paramètres cliniques locaux (scores d'érythème, de desquamation et d'élévation de la plaque de psoriasis). L'analyse de l'expression génique est ensuite réalisée à partir de chaque biopsie individuelle. La comparaison des profils géniques correspondant à la peau saine et la peau psoriasique non lesionnelle et lesionnelle, permet d'identifier des gènes dont l'expression est induite dans la maladie.
La détermination des profils géniques est basée sur l'hybridation d'une sonde complexe d'ADNc simple brin (générée par la rétro-transcription des ARNm issus de chaque biopsie de peau) sur des fragments d'ADNc d'intérêt, qui sont déposés sur un support tel qu'un filtre en nylon. Les signaux d'hybridation obtenus sont proportionnels à la quantité de chaque ADNc marqué dans la sonde et reflètent le niveau d'expression de chaque ARNm au sein de l'échantillon de peau analysé (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1 ;29(1 ):207-16).
Des filtres élaborés par la Demanderesse, spécifiques à la dermatologie ont été développés. Ces filtres sont constitués de 474 ADNc impliqués dans les processus physiologiques de la peau humaine. En parallèle, des filtres commerciaux à 4200 ADNc humains (Invitrogen GF211 ) ont été utilisés. Ces filtres d'ADNc vont permettre de déterminer l'expression de gènes d'intérêt dans la peau saine ainsi que dans la peau non lesionnelle et lesionnelle de patients atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques.
Méthode
La mesure de l'expression génique dans la peau saine et dans la peau psoriasique est réalisée en utilisant la technologie des filtres à ADNc (« arrays ») sur support nylon. Le principe de cette technologie repose sur l'hybridation d'une sonde d'ADNc simple brin radiomarquée sur des fragments d'ADNc cibles déposés à haute densité sur des filtres de nylon (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1;29(1):207-16). Dans cette étude, des filtres de nylon (GF211) commercialisés par la société Invitrogen sur lesquels sont déposés 4200 ADNc humains identifiés, ainsi que des filtres dédiés à la dermatologie à 474 ADNc humains, développés par la Demanderesse, sont utilisés. Les sondes d'ADNc radiomarquées sont générées par rétrotranscription des ARN totaux (protocole Invitrogen), isolés à partir des différentes biopsies prélevées chez 10 volontaires sains et 13 sujets atteints de plaques chroniques de psoriasis vulgaire (protocole RNEasy, Qiagen). Les signaux d'hybridation obtenus sont proportionnels à la quantité de chaque ADNc marqué présent dans la sonde, qui s'est hybride sur l'ADNc qui lui est complémentaire sur le filtre et reflètent ainsi l'activité transcriptionnelle des ARNm dans les biopsies analysées.
Analyse, normalisation des résultats d'expression génique et comparaison des profils géniques entre la peau saine et la peau psoriasique
Les signaux d'hybridation sont mesurés par phospholuminescence, puis quantifiés à l'aide du logiciel d'analyse d'image Imagen (Biodiscovery).
Afin de discriminer les signaux d'hybridation spécifiques des gènes étudiés, le bruit de fond lié à une hybridation non spécifique est mesuré sur chaque filtre sur des zones vierges de dépôt d'ADNc (filtres GF211 ), ou au sein d'une couronne entourant chaque spot (filtres dédiés). Après transformation des données en log, un seuil de détection permettant de discriminer une mesure relevant d'un signal réel ou du bruit, est déterminé automatiquement pour chaque filtre en utilisant la méthode décrite précédemment par Fogel et al., 2002. En vue de comparer les résultats d'expression génique entre les différentes biopsies analysées, les signaux d'hybridation sont normalisés par la médiane de l'ensemble de signaux obtenus pour chaque biopsie (filtres GF211 ), ou par l'expression d'un ARN messager exogène, servant de référence, dont l'expression est invariante entre les échantillons analysés. Ce transcrit exogène est ajouté en quantité constante dans les préparations d'ARN totaux issues des différents échantillons, avant synthèse de la sonde d'ADNc radiomarquée. La séquence cible de ce transcrit exogène est déposée sur chaque filtre. Pour chaque gène, une expression moyenne de référence est déterminée sur l'ensemble des biopsies de sujets sains, puis soustraite à l'expression obtenue dans chaque biopsie de peau psoriasique non lesionnelle et lesionnelle (valeurs en log). Le ratio entre l'expression de chaque gène dans la peau psoriasique par rapport à la peau saine est alors obtenu en prenant l'exponentielle en base 10 de la valeur calculée précédemment (tableaux 1 à 4). Les résultats obtenus permettent de mettre en évidence la surexpression du gène DPYSL3 dans la peau humaine lesionnelle présentant une plaque de psoriasis par rapport à la peau humaine saine (tableau 1). Les résultats des tableaux 2 et 3 indiquent que cette surexpression est observée quelque soit le type prédominant de plaques exprimées chez le patient (symétrique ou troncal) et également indépendamment de la localisation des plaques de psoriasis. Les abréviations mentionnées dans ces tableaux représentent la localisation des biopsies prélevées sur le corps pour chaque sujet psoriasique (SP) et ont la signification suivante: JG: jambe gauche, JD: jambe droite, BD: bras droit, BG: bras gauche, T: tronc.
Les résultats du tableau 4 montrent que l'expression de ce gène est également induite dans la peau psoriasique non lesionnelle. Les abréviations ont la même signification que précédemment.
EXEMPLE 2 - MESURES DES PARAMETRES CLINIQUES LOCAUX LIES A LA PLAQUE DE PSORIASIS : SCORES D'ERYTHEME. DE DESQUAMATION ET D'ELEVATION DE LA PLAQUE
Les différents scores cliniques locaux permettant de définir la présence ou l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiée, ainsi que la sévérité de la plaque de psoriasis, sont les scores d'érythème, de desquamation et d'élévation de la plaque. Ces scores sont classiquement mesurés grâce aux classements suivants:
La mesure de l'érythème se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence d'érythème)
1 = léger (légère rougeur présente)
2 = modéré (rougeur facilement décelable)
3 = sévère (rougeur intense)
4 = très sévère (rougeur très intense)
La mesure de la desquamation se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence de desquamation)
1 = léger (squames détectés, une seule couche de desquamation)
2 = modéré (squames de degré intermédiaire entre le léger et le sévère) 3 = sévère (Plusieurs couches de squames)
4 = très sévère (plusieurs couches de squames épais)
La mesure de l'élévation de la plaque se fait à l'aide du classement suivant: 0 = aucun (absence d'élévation de l'épaisseur) 1 = léger (légère élévation détectable au toucher)
2 = modéré (épaisseur modérée)
3 = sévère (fort épaississement)
4 = très sévère (très fort épaississement)
Cette étude démontre que les paramètres cliniques locaux obtenus avec la peau psoriasique non lesionnelle ne sont pas différents de ceux obtenus pour la peau saine. Ils ne permettent donc pas de différencier une peau psoriasique non lesionnelle d'une peau saine. Par contre, les résultats du tableau 4 ont permis de mettre en évidence au niveau moléculaire, une surexpression du gène DPYSL3 dans certaines peaux psoriasiques non lésionnelles.
La mesure de l'expression du gène DPYSL3, permet donc de réaliser un diagnostic très précoce du psoriasis, puisque l'expression de ces gènes permet de différencier au niveau moléculaire des peaux non lésionnelles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le permettent pas.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1), comme outil de recherche du psoriasis.
2. Utilisation d'une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1), pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène DPYSL3.
3. Utilisation d'une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1), pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite sonde est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
5. Procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité d'ARN messager correspondant au gène DPYSL3 dans les échantillons biologiques à l'aide d'une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1) ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de la transcription des ARN messagers du gène DPYSL3 est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite sonde de l'étape c) est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°4.
7. Procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique du gène DPYSL3 par mise en contact d'une sonde polynucléotidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon biologique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1 ).
8. Procédé de diagnostic selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite sonde est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
9. kit de diagnostic du psoriasis comprenant une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène DPYSL3 (n° d'accession NM 001387.1 ).
10. Kit de diagnostic selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite sonde est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
11. Utilisation d'une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage comme outil de recherche du psoriasis.
12. Utilisation d'une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène DPYSL3.
13. Utilisation d'une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
14. Procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité de la protéine produite par l'expression du gène DPYSL3 dans les échantillons biologiques à l'aide d'une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de l'expression de ladite protéine est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
15. Procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique du gène DPYSL3 par mise en contact d'une sonde polypeptidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon biologique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
16. Kit de diagnostic comprenant une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène DPYSL3, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001057058A2 (fr) * 2000-01-31 2001-08-09 Metagen Pharmaceuticals Gmbh Detection d'expression genique differentielle
WO2001094629A2 (fr) * 2000-06-05 2001-12-13 Avalon Pharmaceuticals Determination de gene du cancer et recherche therapeutique utilisant des ensembles de genes signature
WO2002002620A2 (fr) * 2000-06-29 2002-01-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Acide nucleique, polypeptide de crmp-5 et utilisations de ceux-ci
US20020119944A1 (en) * 2000-11-09 2002-08-29 Michelle Aguera Use of Ulip-and/or Ulip2 in the treatment of myelin disorders
WO2003022298A2 (fr) * 2001-09-07 2003-03-20 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Utilisation d'une proteine de la famille des crmps pour le traitement des maladies liees au systeme immunitaire

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA200204907B (en) * 2001-06-26 2003-03-03 Univ Nat Taiwan Collapsin Response Mediator Protein-1.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001057058A2 (fr) * 2000-01-31 2001-08-09 Metagen Pharmaceuticals Gmbh Detection d'expression genique differentielle
WO2001094629A2 (fr) * 2000-06-05 2001-12-13 Avalon Pharmaceuticals Determination de gene du cancer et recherche therapeutique utilisant des ensembles de genes signature
WO2002002620A2 (fr) * 2000-06-29 2002-01-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research Acide nucleique, polypeptide de crmp-5 et utilisations de ceux-ci
US20020119944A1 (en) * 2000-11-09 2002-08-29 Michelle Aguera Use of Ulip-and/or Ulip2 in the treatment of myelin disorders
WO2003022298A2 (fr) * 2001-09-07 2003-03-20 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Utilisation d'une proteine de la famille des crmps pour le traitement des maladies liees au systeme immunitaire

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOWCOCK A M ET AL: "Insights into psoriasis and other inflammatory diseases from large-scale gene expression studies" HUMAN MOLECULAR GENETICS, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, vol. 10, no. 17, 15 août 2001 (2001-08-15), pages 1793-1805, XP002265788 ISSN: 0964-6906 cité dans la demande *
HAMAJIMA N ET AL: "A novel gene family defined by human dihydropyrimidinase and three related proteins with differential tissue distribution" GENE: AN INTERNATIONAL JOURNAL ON GENES AND GENOMES, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, BARKING, GB, vol. 180, no. 1-2, 21 novembre 1996 (1996-11-21), pages 157-163, XP004071911 ISSN: 0378-1119 cité dans la demande *
OESTREICHER J L ET AL: "Molecular classification of psoriasis disease-associated genes through pharmacogenomic expression profiling." THE PHARMACOGENOMICS JOURNAL. 2001, vol. 1, no. 4, 2001, pages 272-287, XP008036398 ISSN: 1470-269X cité dans la demande *
PRADET-BALADE B ET AL: "Translation control: bridging the gap between genomics and proteomics?" TIBS TRENDS IN BIOCHEMICAL SCIENCES, ELSEVIER PUBLICATION, CAMBRIDGE, EN, vol. 26, no. 4, 1 avril 2001 (2001-04-01), pages 225-229, XP004233580 ISSN: 0968-0004 *

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