FR2857452A1 - Test de depistage de l'autisme, methode de selection de patients repondant audit test et utilisation des medicaments activateurs de canaux bkca pour le traitement de ladite maladie - Google Patents

Abstract

Test de dépistage (diagnostic et/ou pronostic) de l'autisme, méthode de sélection de patients répondant audit test et utilisation des médicaments appartenant à la famille des agonistes ou activateurs de canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) pour le traitement de cette maladie, ainsi que suivi de cette maladie.Ledit test de dépistage de l'autisme, comprend : (1) la mesure de l'activité électrique des canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) dans un échantillon de cellules sanguines du sujet à dépister, et (2) la détermination d'une éventuelle diminution de ladite activité électrique, par comparaison avec un échantillon de cellules sanguines contrôle.

Description

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La présente invention est relative à un test de dépistage (diagnostic et/ou pronostic) de l'autisme, à une méthode de sélection de patients répondant audit test, à l'utilisation des médicaments appartenant à la famille des agonistes ou activateurs de canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) pour le traitement de cette maladie, ainsi qu'au suivi de cette maladie.

L'autisme (MIM 209850 ; MIM 607373) est un désordre psychiatrique qui se traduit essentiellement par des anomalies du comportement, tels que : absence du lien social, troubles de la communication, comportements répétitifs et ritualisés, et un profil limité d'intérêts et d'activités ; ce désordre apparaît généralement dans les 3 premières années de la vie (1, 2).

De manière plus précise, l'autisme est défini comme une modification des aptitudes essentielles pour s'adapter à l'environnement. Comme les signes de l'autisme sont généralement établis à un stade précoce de la vie, il a été postulé que les troubles autistiques sont l'expression d'anomalies intervenant au moment du développement cérébral, probablement au cours de la vie f#tale. Cette hypothèse neuro-développementale est renforcée par l'histoire de cette pathologie et par les anomalies observées par imagerie structurale et fonctionnelle du cerveau. Cependant, l'hypothèse du défaut fonctionnel ne peut pas être exclue. Les résultats obtenus par les Inventeurs montrent que les deux hypothèses sont possibles.

La prévalence de l'autisme est comprise entre 2 et 5 pour 10.000 enfants lorsque les critères de Kanner sont utilisés et augmente jusqu'à environ 1 pour 1. 000 lorsque des définitions plus larges sont appliquées, avec un rapport hommes/femmes d'environ 4/1.

Des études sur des jumeaux et des familles ont montré qu'il peut exister, dans certains cas, des facteurs génétiques dans l'étiologie de cette pathologie (3,4). Le risque de développement de l'autisme est 50 à 100 fois supérieur pour la fratrie des sujets autistes que dans la population générale (5). Les taux de concordance élevés et le phénotype observé chez des jumeaux monozygotes indiquent que dans certains cas, il est possible que des facteurs génétiques soient effectivement impliqués.

Toutefois, cette pathologie semble hétérogène tant au niveau clinique que génétique, suggérant que plusieurs locus sont impliqués.

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Approximativement 10 à 25% des patients affectés d'autisme présentent d'autres pathologies (par exemple, le syndrome de l'X fragile (MIM 309550) et la sclérose tubéreuse de Bourneville (MIM 191100). De plus, dans un petit nombre de cas, l'autisme est associé à des anomalies chromosomiques, en particulier des anomalies de la structure du chromosome 15 (2). Cependant, l'origine de l'autisme reste inconnue pour la majorité des patients.

Il est estimé que plusieurs locus chromosomiques contribuent à la susceptibilité génétique à l'autisme. Plusieurs criblages génomiques ont été effectués pour identifier ces gènes et les résultats ont montré une étiologie multiloci (6-11). De plus, l'étude de translocations équilibrées chez des autistes a montré une rupture de certains gènes (2).

Les Inventeurs ont trouvé que deux protéines présentes dans les régions pré- et post-synaptiques des synapses glutamatergiques sont impliquées dans certains phénotypes autistiques. Ils ont également montré que deux mécanismes différents sont impliqués : i) une activité électrique déficiente au niveau synaptique, avec un effet probable sur la transmission synaptique et ii) un complexe architectural défectueux qui perturberait la synaptogénèse.

Les Inventeurs ont ainsi trouvé, que certains autismes étaient liés à une déficience de l'activité électrique des cellules, due à une mutation au niveau de l'un des gènes codant pour une protéine du complexe glutamatergique et conduisant à un mauvais fonctionnement des canaux potassiques dépendants du calcium et qu'il était possible, pour évaluer l'existence d'un tel autisme, de mesurer l'activité électrique des canaux BKCa dans les cellules sanguines et notamment dans les cellules de la lignée lymphocytaire.

C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un test de dépistage de l'autisme lié à une activité électrique déficiente, qui permet de mieux cibler le choix du traitement à proposer au patient atteint d'un tel déficit.

La présente invention a donc pour objet un test de dépistage (diagnostic ou pronostic) de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mesure de l'activité électrique des canaux potassiques dépendants du calcium dans un échantillon de cellules sanguines du sujet à dépister, le

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nombre minimum de cellules pour obtenir un résultat interprétable étant d'au moins six cellules sanguines et (2) la détermination d'une éventuelle diminution de ladite activité électrique, par comparaison avec un échantillon de cellules sanguines contrôle.

Les canaux potassiques activés par le calcium dénommés, dans la littérature, canaux maxi-K+, maxi-K, BK ou BKCa, sont observés dans la plupart des tissus et notamment dans le cerveau. Ces canaux maxi-K sont uniques en ce sens qu'ils présentent une conductance élevée et nécessitent la présence de calcium et d'un potentiel de membrane dépolarisé pour être activés.

Ces canaux potassiques s'ouvrent ainsi en réponse à une augmentation de la concentration intracellulaire en calcium et/ou à une dépolarisation de la membrane, ce qui entraîne une augmentation de l'efflux de potassium à partir des cellules et une régulation du potentiel de la membrane cellulaire (hyperpolarisation rapide de la membrane et réduction de l'influx de calcium par des canaux dépendant du voltage).

Cette activité constitue une boucle rétroactive endogène qui permet le retour des cellules à un état d'excitation moindre, à un potentiel plus hyperpolarisé, ce qui limite l'entrée du calcium dans les cellules dépendant du voltage.

D'autres gènes codant pour d'autres protéines faisant partie du complexe glutamatergique sont des candidats potentiels impliqués dans le phénotype de l'autisme.

Selon un mode de mise en #uvre avantageux dudit test, la mesure de l'activité électrique desdites cellules, conformément à l'étape (1) est effectuée par la technique du patch-clamp.

La technique du patch-clamp est connue en elle-même.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la technique du patch-clamp est mise en #uvre en mode cellule entière et patch rompu avec une concentration de calcium intracellulaire comprise entre 100 et 1000 nM.

De manière plus précise, la configuration utilisée est celle de la cellule entière en patch rompu. Dans cette configuration, une pipette de verre est appliquée contre la membrane. L'interaction entre le verre et la membrane doit être telle que la résistance électrique est de l'ordre de un gigaohm. Quand cette résistance

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est atteinte, le morceau de membrane pris sous la pipette est rompu soit par succion, soit par l'application d'un choc électrique bref mais intense. Cette procédure ouvre un accès électrique à l'ensemble des canaux contenus dans la cellule. De plus, le milieu intracellulaire est substitué par le milieu contenu dans la pipette ce qui permet de contrôler l'activité des canaux ioniques. Une solution physiologique contenue dans la pipette est choisie pour permettre l'étude du BKCa ; ainsi la concentration de potassium est élevée et la pCa est comprise entre 6 et 7 afin d'activer le BKCa. Le potentiel de maintien est fixé à-70 mV et la cellule est dépolarisée pendant 500 msec de -50 mV à +50 mV par saut de 10 mV toutes les 4 secondes. Ce protocole permet de porter sur un graphique l'amplitude du courant en fonction du voltage qui l'a déclenché, et donc de construire une courbe courant-voltage ou IV. La capacité membranaire de chaque cellule, reflet de la surface membranaire et donc de la taille de la cellule, est déterminée pour chaque cellule. Les courants mesurés sont alors normalisés à cette capacité afin de s'affranchir de la variabilité de taille entre les cellules. Le courant est ainsi exprimé en densité de courant.

Dans cette configuration, on peut définir la présence fonctionnelle de canaux BKCa, par l'application d'iberiotoxine (IbTx), bloqueur spécifique des canaux BKCa. Le courant BKCa est défini comme la fraction de courant bloqué par l'IbTx.

La présente invention a également pour objet une méthode de sélection d'une sous population de sujets atteints d'autisme, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) la mise en #uvre du test de dépistage, tel que décrit ci-dessus, et (ii) la sélection des sujets dont l'activité électrique des canaux BKCa des cellules sanguines est diminuée par rapport à l'activité électrique de canaux BKCa de cellules sanguines contrôles.

La possibilité de sélectionner de tels patients est cruciale pour la prescription d'un traitement adapté.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'activateurs ou d'agonistes des canaux BKCa pour la préparation d'un médicament utile dans le traitement de l'autisme lié à une activité électrique déficiente, et notamment d'une sous population de sujets autistes, aptes à répondre à un tel traitement.

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Des activateurs ou agonistes des canaux BKCa ont déjà été décrits : - des dérivés oxindoles substitués en position 3, dans la Demande Internationale PCT WO 02/30868 et les Brevets américains 5,565,483 et 5,602,169 ; - des dérivés 1,4 dihydropyridines, dans les Demandes de Brevets européens 705819 et 704434 ; - des dérivés 4-aryl-3 aminoquinoline-2-one, dans la Demande Internationale WO 99/09983 ; - des flavones, dans la Demande Internationale WO 01/30342.

D'autres activateurs ou agonistes des canaux potassiques peuvent être également mis en #uvre ; des tests de criblage de tels composés sont notamment décrits dans la Demande Internationale PCT WO 97/14036 ou la Demande Internationale WO 02/30868.

Lesdits activateurs ou agonistes sont mis en #uvre dans des compositions pharmaceutiques telles que celles décrites dans la Demande Internationale PCT WO 02/30868.

La présente invention a, en outre, pour objet une méthode de suivi du traitement de l'autisme par des activateurs ou des agonistes des canaux BKCa, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) le suivi de la restauration de l'activité électrique des canaux BKCa par la méthode du patch-clamp chez les patients traités par des activateurs ou des agonistes des canaux BKCa, et (ii) la comparaison de l'activité électrique obtenue par rapport à l'activité électrique initiale desdits patients.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la cartographie physique de la translocation et l'effet fonctionnel de la rupture de KCNMA1 : a) Etalement de métaphases provenant d'un patient ayant une translocation t(9 ; 10) montrant un marquage FISH rouge obtenu avec les clones BAC RP11-85P23 (chromosome 9) (http://www.ensembl.org) et RP11-619F23 (chromo-

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some 10) (http://www.ensembl.org), avec une sonde correspondant à une séquence alphoïde centromérique spécifique du chromosome 9 (en vert) et spécifique du chromosome 10 (en vert). Les signaux d'hybridation (flèches blanches) sur les chromosomes der(9) et der(10) indiquent que ces clones BAC englobent les points de cassure. b) Représentation schématique du contig BAC dans le gène KCNMA1. Le point de cassure se situe entre les 1er et 2ème exons. Tous les exons sont testés par PCR sur l'ADN des clones. c) Séquence génomique encadrant les points de cassure. La délétion de 14bp (en rouge) dans le fragment der(9). d) Résultats d'amplification par la technique RT-PCR e) Courants sensibles à l'IbTx dans les cellules des sujets témoin et des patients. En haut, les tracés initiaux proviennent des courants différentiels avant et après l'application de 100 nmol/1 d'IbTx sur les cellules du sujet témoin (à gauche) et du patient (à droite). Les courants sont stimulés par des étapes de dépolarisation de 8 mV à partir de-70 jusqu'à +42 mV.

Le pCa intracellulaire était fixé à 6,4. Les valeurs de capacité étaient de 14 pF (cellule du sujet témoin) et 22 pF (cellule du patient). En bas, les courants sensibles à l'IbTx sont représentés d'après une relation I-V moyenne dans les cellules du sujet témoin (carré, n=12 cellules) et du patient (cercle, n=12 cellules). La densité de courant des cellules du patient était significativement plus faible que celle des cellules du sujet témoin pour le même voltage (p<0,05).

- la figure 2 est une représentation schématique du canal BK.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Les exemples qui suivent montrent l'intérêt de disposer d'outils de sélection des autistes répondeurs à un traitement par un activateur ou un agoniste des canaux BKCa, pour la prescription du traitement le mieux adapté.

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EXEMPLE 1: DETECTION ET CARACTERISATION D'UNE TRANSLOCATION DANS LE GENE KCNMAI CHEZ LE PATIENT DE 6 ANS ATTEINT DE TROUBLES AUTISTIQUES 1) Patient et méthodes 1.1) Patient avec translocation
Le patient masculin était âgé de 6 ans au moment de l'évaluation clinique, le diagnostic du trouble autistique et du retard mental sévère ont été confirmés. Le diagnostic et les évaluations développementales ont été réalisés par l'Unité de psychiatrie chez l'enfant pour le diagnostic et le traitement des troubles envahissants du développement (programme TEACCH) à l'Hôpital de Chartres (France). Le patient a été évalué comme ayant des déficiences dans les interactions sociales réciproques et les aptitudes à communiquer, avec un manque de langage parlé et des gestes de communication réduits. Il montrait également des comportements stéréotypés limités.

Le diagnostic des troubles autistiques était confirmé lors d'un test (ADI-R) (32) et à l'aide de l'échelle de notation de l'autisme chez l'enfant (CARS) (33). Il a satisfait aux scores seuils tels que définis dans le test ADI-R, dans les trois classes de symptômes : déficience qualitative avec un score d'interaction social réciproque de 30 (score seuil pour l'autisme =10) ; déficience qualitative avec un score de communication non-verbale de 13 (score seuil pour l'autisme = 7) ; comportements répétitifs et profils stéréotypés de 7 (seuil pour l'autisme = 3) ; les premiers symptômes ont été observés chez ce patient à un âge inférieur à 36 mois. Globalement, le score de 40 par l'évaluation CARS rentrait dans la catégorie de l'autisme sévère. Le patient remplissait tous les critères du DSM IV pour l'autisme (34). De plus, les résultats du PEP-R (profil pédagogique psychologique modifié) (35) ont montré un score de développement équivalent à celui d'un enfant d'un âge de 23 mois. Ce niveau de développement a été également évalué en utilisant le test développement de Brunet-Lézine (36) (une adaptation française de l'échelle de Gesell) (37).

Le quotient de développement déterminé par le test de BrunetLezine était de 33 (correspondant à un niveau d'âge de 24 mois) et a confirmé le diagnostic d'autisme associé, selon les critères du DSM IV. Les observations physiques ont révélé des paramètres de croissance normaux. Il n'y avait aucun élément dysmorphique. L'électroencéphalogramme (EEG) et l'imagerie par résonance

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magnétique (IRM) étaient normaux. Les parents de cet enfant autiste sont nonconsangins et sont dépourvus de tout trouble médical et neuropsychiatriques. Son frère âgé de 8 ans est atteint de phénylcétonurie (PCU) traitée par un régime réduit en phénylalanine depuis la naissance. Il a présenté un retard du langage. Aucune anomalie des taux de phénylalanine ou de la tétrahydrobioptérine (cofacteur de la phénylalanine hydroxylase) n'a été détectée chez le patient transloqué.

1.2) Méthodes - Isolement des points de cassure de la translocation
Une analyse par technique FISH a été réalisée en utilisant les clones BAC obtenus auprès du centre CHORI. Après hybridation et lavage, les sondes biotinylées ont été détectées par des anticorps antibitotine-Cy3. Les lamelles ont été observées sous microscope à fluorescence Zeiss (Axiophot).

L'isolement des régions de points de cassure a été réalisé par PCR, à l'aide du système d'amplification par élongase (In Vitrogen).

- Recherche de mutations de KCNMAI
Les régions codantes de KCNMAI (29 exons de l'ADN génomique ou les 12 fragments chevauchants représentant la séquence codante complète) ont été amplifiées, en utilisant des amorces spécifiques représentées dans les Tableaux 1 à III ci-après. Les produits amplifiés ont été analysés par l'analyse du polymorphisme conformationnel simple-brin (Single Strand Conformation Polymorphism ou SSCP) (12) ou de chromatographie liquide à haute performance dénaturante (DHPLC). La séquence nucléotidique des fragments ayant un profil anormal a été vérifiée.

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TABLEAU Séquences des amorces et conditions PCR établies pour l'étude de KCNMA1.

<tb>

Amorces <SEP> Température <SEP> Taille
<tb> 5'-3' <SEP> d'hybridation <SEP> ( C) <SEP> (pb)
<tb> Nom <SEP> Exon <SEP> Sens <SEP> Anti-sens
<tb> KCNMA1 <SEP> 1A <SEP> cccgttgctagctatggcaa <SEP> aaagcccaccacatgcgttg <SEP> 58 <SEP> 282
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:1) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:2)
<tb> KCNMA1 <SEP> 1B <SEP> catcccggtgaccatgga <SEP> gagaagcggtggggctgg <SEP> 58 <SEP> 219
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:3) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:4)
<tb> KCNMA1 <SEP> 2 <SEP> tccattgttccctatgtcttaac <SEP> tctcataagcaaagccaccttg <SEP> 61 <SEP> 275
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:5) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:6)
<tb> KCNMA1 <SEP> 3 <SEP> atcctgaggtccaactcttaagt <SEP> ggatcaatgtaaaggctcatgat <SEP> 59 <SEP> 176
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:7) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:8)
<tb> KCNMA1 <SEP> 4 <SEP> agcactaccacttctcagcat <SEP> tgtgatactgaacaatgttgcac <SEP> 59 <SEP> 210
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:9) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 10) <SEP>
<tb> KCNMA1 <SEP> 5 <SEP> ctttcttatttcttctttccccc <SEP> ccttcagccatgactcaggaa <SEP> 59 <SEP> 191
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 11) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:12)
<tb> KCNMA1 <SEP> 6 <SEP> gcaagaacttcccatcccttc <SEP> ttggcataggggactggaat <SEP> 59 <SEP> 236
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 13) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:14)
<tb> KCNMA1 <SEP> 7 <SEP> ggttgggagttagatgtggca <SEP> aagcgagagcagaagggtctt <SEP> 59 <SEP> 228
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:15) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:16) <SEP>
<tb> KCNMA1 <SEP> 8 <SEP> agcatgtttttcttttttctccc <SEP> atcatggaaaatattaacagcca <SEP> 59 <SEP> 270
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 17) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 18) <SEP>
<tb> KCNMAI <SEP> 9 <SEP> tccccccttttctttggc <SEP> gagaggattctaccgcagca <SEP> 59 <SEP> 198
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:19) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:20)
<tb> KCNMA1 <SEP> 10 <SEP> gtcctgtcgtggtgcctg <SEP> ggcagagggtctgacagca <SEP> 59 <SEP> 193
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:21) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:22) <SEP>
<tb> KCNMA1 <SEP> 11 <SEP> tagcgatttcttctctccctg <SEP> cccacaccaagatggaataa <SEP> 59 <SEP> 179
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:23) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:24)
<tb>

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TABLEAU II

<tb> Amorces <SEP> Température <SEP> 1 <SEP> aille <SEP>
<tb> 5'-3' <SEP> d'hybridation <SEP> ( C) <SEP> (pb)
<tb> Nom <SEP> Exon <SEP> Sens <SEP> Anti-sens
<tb> KCNMA1 <SEP> 12 <SEP> tctgtgaattttcctttcggt <SEP> agaagatccaaaagggccgt <SEP> 59 <SEP> 184
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:25) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:26)
<tb> KCNMA1 <SEP> 13 <SEP> aaggcagacctgtctcagca <SEP> atgggtcttcagacctggag <SEP> 59 <SEP> 148
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:27) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:28)
<tb> KCNMA1 <SEP> 14 <SEP> gctctctactcaaccccacga <SEP> cctgagtggttgggcaatg <SEP> 59 <SEP> 316
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:29) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:30)
<tb> KCNMA1 <SEP> 15 <SEP> ctccgcatgtgttcctttcc <SEP> ggataccctcggcaattgtc <SEP> 59 <SEP> 255
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:31) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:32)
<tb> KCNMA1 <SEP> 16 <SEP> gaagtgaaccgaccgttctca <SEP> tgtgtgttatgtggctctggt <SEP> 58 <SEP> 210
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:33) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:34)
<tb> KCNMA1 <SEP> 17 <SEP> cttggcaaatggttagtcctg <SEP> tccttctggtgtcagtcgatt <SEP> 59 <SEP> 160
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:35) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:36)
<tb> KCNMA1 <SEP> 18 <SEP> tacagccgggccagaaagaa <SEP> cagaacatgacctcacaaatg <SEP> 59 <SEP> 185
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:37) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:38)
<tb> KCNMA1 <SEP> 19 <SEP> aggaatgagaaagggaggg <SEP> tgggtggattatgaaacgtg <SEP> 59 <SEP> 166
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:39) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:40)
<tb> KCNMA1 <SEP> 20 <SEP> ggctgcagggtagttattaaaa <SEP> caattcagctgtgagggagaaa <SEP> 59 <SEP> 268
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:41) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:42) <SEP>
<tb> KCNMA1 <SEP> 21 <SEP> gggaggaagagaagggctaa <SEP> tattgcacagtctgccctcaaa <SEP> 59 <SEP> 206
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:43) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:44)
<tb> KCNMA1 <SEP> 22 <SEP> agaagcgggcaacatcagat <SEP> tctgcatctttcacatcctc <SEP> 59 <SEP> 262
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:45) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:46)
<tb> KCNMA1 <SEP> 23 <SEP> gtgaatgaaaagaagaaaaggc <SEP> tctctgactcttacccacttctc <SEP> 59 <SEP> 305
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:47) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:48)
<tb> KCNMA1 <SEP> 24 <SEP> gcaggcacagcaaagaagtatt <SEP> tctctctctgtctctttctcccc <SEP> 59 <SEP> 289
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:49) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:50)
<tb>

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TABLEAU III

<tb> Amorces <SEP> Température <SEP> Taille
<tb> 5'-3' <SEP> d'hybridation <SEP> (pb)
<tb> ########################################################( C)
<tb> Nom <SEP> Exon <SEP> Sens <SEP> Anti-sens
<tb> KCNMAI <SEP> 25 <SEP> cctcatatcctgtatggtttg <SEP> ttctacttctctgatttttcttc <SEP> 59 <SEP> 226
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:51) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:52)
<tb> KCNMA1 <SEP> 26 <SEP> aggagggaacaggataactcac <SEP> aatgcctgtgtgtggtcttca <SEP> 61 <SEP> 204
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:53) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:54)
<tb> KCNMA <SEP> 27 <SEP> aaacagcaagctcaggtgacct <SEP> tgcttaaaggacttttccctcac <SEP> 61 <SEP> 274
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:55) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:56)
<tb> KCNMA1 <SEP> 28 <SEP> attaggtgggagggcagagtt <SEP> tgtcccttgattttcaggca <SEP> 59 <SEP> 217
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO: <SEP> 57) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> NO:58)
<tb> KCNMA1 <SEP> 29 <SEP> ggaaatgagtggcagatacagtt <SEP> ttctttactcagttactctcagg <SEP> 59 <SEP> 352
<tb> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:59) <SEP> (SEQ <SEP> ID <SEP> N0:60) <SEP>
<tb>

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- RT-PCR semi-quantitative - extraction de l'ARN
L'extraction d'ARN a été réalisée avec le réactif RNAble@ (Eurobio). Ce système utilise la méthode de Chomczynski et al. (1987), technique simplifiée et adaptée de la technique de Chirgwin et al. (1979), qui permet d'obtenir à partir de cellules isolées (ou de tissus) des ARN totaux de bonne qualité non contaminés par de l'ADN et utilisables dans le cadre d'une analyse quantitative (Chomczynski P. et al.,. Anal. Biochem., 1987, 162,156-159 ; Chirgwin JM. et al., Biochemistry, 1979, 18, 5294-5299.

- obtention des lignées lymphoblastoïdes
Les lignées lymphoblastoïdes ont été obtenues selon deux modes d'ensemencement.

- Le premier consiste à diluer 500 l de sang total dans 10 ml de milieu RPMI 1640 (In Vitrogen) supplémenté de glutamine 20 mM (ATGC) et d'obtenir un culot cellulaire en centrifugeant le tube pendant 5 min à 2500 tr/min.

- La seconde façon d'ensemencer les lymphocytes est de mélanger volume à volume du sang total (10 ml) et du RPMI 1640 supplémenté en glutamine 20 mM. Ce mélange est versé goutte à goutte dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de milieu de séparation (Ficoll). Le tube est centrifugé pendant 30 min à 2500 tr/min. L'anneau cellulaire est ensuite récupéré et les cellules sont resuspendues dans 30 ml de RPMI 1640 puis à nouveau centrifugées 10 min à 1500 tr/min.

Ces deux types de culots sont alors repris dans 2,5 ml (pour le premier cas), ou 5 ml (dans le second cas) d'un milieu de culture composé de RPMI 1640, de sérum de veau f#tal (SVF) à 15% (ATGC), de glutamine 200 mM (ATGC), et d'un mélange d'antibiotiques (BioMérieux) : pénicilline (100 UI/ml) et streptomycine (10 g/ml). La transformation cellulaire est obtenue par addition de 5 ml (pour le premier cas) ou de 1 ml (dans le second cas), de suspension virale (virus d'Epstein-Barr : EBV) produite à partir d'une souche de lymphoblastes (souche B95- 8) de Marmouset et de 1 p.g/ml de cyclosporine. Les cellules sont ensuite incubées à 37 C sous 5% de CO2 et 90% d'humidité et le milieu de culture est régulièrement changé.

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- conditions de la PCR
RT-PCR : kit Superscript II RNAse H- (In vitrogen)
PCR : Taq DNA polymerase (Promega)
Protocole standard selon consigne fournisseurs
RT PCR 65 C 10 min
23 C 10 min
42 C 60 min
95 C 8 min
PCR 95 C 5 min
95 C 1 min #
60 C 1 min #30 fois
72 C 1 min
72 C 7 min
L'ARN total extrait des cellules lymphoblastoïdes transformées par EBV est amplifié par RT PCR. Pour l'amplification du produit RT-PCR de 415 pb, on a utilisé comme amorce sens 5'-GGCTCCTATAGTGCGGTTAGTG-3' (SEQ ID NO:61) dans l'exon 9 de KCNMAI, et l'amorce anti-sens 5'TGTTTAGCAGATGGGCCTTGTT-3' (SEQ ID NO:62) dans l'exon 14. Un standard interne de 600 pb du fragment d'ADNc (ss-actine) a été co-amplifié avec les amorces suivantes: amorce sens 5'-TCATGCCATCCTGCGTCTGGACCT-3' (SEQ ID NO:63) et amorce anti-sens 5'-CCGGACTCATCGTACTCCTGCTTG-3' (SEQ ID NO:64) avec une température d'appariement de 60 C. La migration des produits PCR était réalisée sur gel d'agarose à 2%.

2) Résultats
L'analyse cytogénique a permis de mettre en évidence une translocation équilibrée de novo chez le patient masculin âgé de 6 ans [46, XY, t(9 ;10) (q23 ; q22) ], décrit ci-dessus. L'utilisation de l'hybridation in situ à fluorescence (FISH) avec une série de clones génomiques (banque RPCI) provenant des chromosomes 9 et 10, a permis de cartographier le point de cassure 9q sur le clone RP11- 85P23 (http://www.ensembl.org) du chromosome artificiel bactérien (BAC), et le point de cassure lOq sur le clone RP11-619F23 (http: //www.ensembl.org) (Figure la).

Aucun réarrangement supplémentaire n'a été détecté.

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L'analyse bioinformatique de la séquence des deux points de cassure et des régions avoisinantes ont révélé (i) l'absence de gène au point de cassure 9q et (ii) la localisation du gène KCNMAI dans la région du point de cassure lOq. Ce gène code pour un canal potassique activé par le calcium à conductance importante (aussi appelé hSlo, canal BKca, canal Sloa ou canal Maxi-K) (13) et est transcrit à partir du télomère jusqu'au centromère (Figure 1b). L'analyse par amplification in vitro (PCR : polymerase chain reaction) du clone BAC RP11-619F23 a permis de détecter seulement la présence de l'exon 2 du gène KCNMA1. De plus, elle a permis de montrer que les clones BAC voisins de RP 11-619F23 contiennent le 1er exon (clone RP11-428P16) et le 2ème exon (clone RP11-723F6). Ces résultats indiquent que le point de cassure lOq est situé entre les le et le 2ème exons dans une partie intronique de 230 kb. Afin d'isoler la séquence génomique chevauchant les points de cassure, on a combiné des réactions PCR de longue distance en utilisant une amorce spécifique située dans la séquence de 85P23 (BAC chevauchant le point de cassure du chromosome 9) et une amorce située dans la séquence de 619F23 (BAC chevauchant le point de cassure du chromosome 10). La séquence génomique des fragments de la jonction a été spécifiquement amplifiée. Une délétion de 14 pb a été détectée dans le fragment de jonction der (9) qu'aucune délétion n'a été décelée dans le fragment de jonction der( 10) (Figure le).

Des réactions d'amplification in vitro avec transcription inverse (RT-PCR) semi-quantitatives ont été réalisées sur de l'ARN total isolé à partir de lignées cellulaires de lymphoblatoïdes (LCL) provenant du patient et d'un sujet témoin en bonne santé (12). Des produits PCR spécifiques ont été obtenus correspondant aux ADNc de KCNMAI et de la p-actine chez chacun des deux individus.

Cependant, l'amplification du produit spécifique KCNMAI était nettement réduite chez le patient porteur de la translocation (Figure Id). Ce résultat a confirmé qu'une copie du gène KCNMAI était désactivée chez le patient autiste et que la déficience haploïde pouvait être suffisante pour générer le trouble.

Le gène KCNMAI comprend 30 exons couvrant 750 kb d'ADN génomique (Figure 1b) et le cadre de lecture ouvert code pour une protéine comprenant 1195 acides aminés. L'épissage alternatif de l'ARN fournit aussi beaucoup d'isoformes, suggérant l'existence de fonctions spécifiques et d'une diversité de

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canaux (14, 15). Le canal BKCa contient 7 domaines transmembranaires (SO-S6), avec l'extrémité N terminale sur la partie extracellulaire de la membrane (Figure 2).

De plus, cette extrémité N-terminale a été rapportée comme étant un domaine de liaison pour les sous-unités ss (16). La partie C-terminale est composée de quelques 800 acides aminés présumés former un domaine intracellulaire contenant 4 segments (S7- SI 0) hydrophobes potentiels, un ou plusieurs sites de fixation du calcium et également des domaines d'association de protéine pour d'autres protéines (Figure 2). Ce gène est exprimé abondamment dans différentes zones du cerveau humain (amygdale, noyaux caudés, cortex cérébral, hippocampe, hypothalamus, et la moelle épinière) (14), et dans l' oreille (cochlée) (17), muscles (18), et les glandes sécrétrices (19).

Le gène est situé sur le chromosome 10, à la bande cytogénétique q22. 3, à proximité de plusieurs marqueurs associés à l'autisme et des troubles du langage tels que D10S201 (7) et D10S2327 (20), situés à 1,5 Mb et 1 Mb télomérique par rapport à KCNMA1, respectivement. La localisation d'un locus de susceptibilité à l'autisme et la rupture physique d'un gène chez un patient autiste dans la même région suggère fortement que ce gène peut être impliqué dans cette pathologie.

EXEMPLE 2 : REDUCTION DE L'ACTIVITE DU CANAL BKCa PAR LA TECHNIQUE DU PATCH-CLAMP CHEZ LE PATIENT AUTISTE AGE DE 6 ANS (VOIR EXEMPLE 1) 1) Patient et méthodes 1.1) Patient
Le patient qui fait l'objet de ces expériences est le même que celui décrit dans l'exemple 1.

1. 2) Méthodes - Enregistrement par la technique du patch-clamp des courants K+
Des enregistrements des courants K+ sur cellules entières ont été réalisés pour des cellules lymphoblastoïdes obtenues chez le patient autiste ou chez un sujet normal comme témoin. Les cellules étaient lavées et centrifugées trois fois et remises en suspension dans une solution physiologique (PSS) composée de (en mmol/1) : 140, NaCl ; 4, KCI ; 2, CaCl2 ; 1, MgCl2; 0,33, NaH2PO4; Il,1, glucose ; 10, Tampon Hepes ; ajusté à 7,4 avec NaOH. Une partie de ces cellules sont mises dans une boîte de Pétri contenant 2 ml de PSS. Les boîtes de Pétri sont placées sur la

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plateforme d'un microscope Elipse TE300 Nikon. Les cellules étaient périfusées à l'aide de solutions expérimentales (PSS avec et sans 100 nM d'IbTx) par l'intermédiaire d'un système de tubes parallèles, placé à proximité des cellules. Le temps nécessaire à l'échange de solution autour de la cellule patchée est inférieure à 10 secondes. Les cellules étaient dialysées dans une solution de la pipette avec à un pCa de 6,4 (pour activer les BKCa) contenant (en mmol/1) : 125, K-glutamate ; 20, KCl; 0,7, CaCl2 ; 1, Mg-ATP ; 1, Mg-GTP ; 1, EGTA ; 10, tampon Hepes ; pH ajusté à 7,2 avec KOH. La résistance à la pointe de la pipette se situait entre 3 et 5 M#. Les courant K+ macroscopiques étaient générés par étapes de dépolarisation progressives de 8mV (durée de 500 ms, 5 s d'intervalle) à partir d'un potentiel de maintien constant de -70mV. Les courants BKCa étaient définis comme étant les courants sortants inhibés par 100 nmol/1 d'ibériotoxine (IbTx, Sigma), un agent bloquant spécifique des canaux BKCa (7). L'activité du calcium intracellulaire (pCa) était ajustée à 6,4 pour stimuler les canaux potassiques activés par le calcium. On estimait la capacité de chaque cellule en intégrant le courant capacitif généré par une impulsion d'hyperpolarisation de 10 mV après l'annulation électronique de la capacité pipettepatch fournie par l'amplificateur Axopatch 200B (Axon Instrument). Les courants sensibles à l'IbTx étaient exprimés en courants d'intensité, pA/pF. Le protocole de voltage imposé (voltage-clamp) et d'acquisition de données étaient contrôlés par le logiciel pClamp V8.1 (Axon Instrument). Les données étaient numérisés à une fréquence de 20 kHz et enregistrées à l'aide d'un ordinateur après filtrage par un filtre 5-pole Bessel à 2kHz. Les expériences ont été réalisées à température ambiante.

Toutes les données sont exprimées en moyenne écart-type (SEM). Les comparaisons statistiques ont été réalisées entre les groupes par analyse de la variance à deux voies de mesures répétées suivie d'un test d'analyse de Dunnett post hoc. Le seuil de signification est fixé à P<0.05.

2) Résultats
La technique du patch-clamp permet de confirmer que la réduction en ARNm codant pour la protéine BKCa correspond à une réduction similaire de l'activité du canal (Figure le). Les courants K+ de la cellule entière étaient stimulés par des étapes de dépolarisation de 8 mV à partir de-70 jusqu'à +42 mV avant et après le blocage du BKCa à l'aide d'un agent bloquant spécifique, l'IbTx. L'intensité

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des courants sensibles à l'IbTx (BKCa) était alors comparée entre les cellules lymphoblastoïdes du sujet témoin et celles du patient. Alors que la capacité membranaire était similaire dans chacun des groupes cellulaires (16,3 0,7pF et 170,9pF chez le témoin et le patient respectivement), le potentiel membranaire au repos et la résistance membranaire était significativement différent entre les deux groupes (p<0,05). Les changements étaient en accord avec l'activité réduite du canal potassique. La moyenne du potentiel membranaire au repos était de-72 0,9mV (n=12 cellules) pour les cellules du sujet témoin et -68,4l,7mV (n=12 cellules) pour les cellules du patient et la résistance d'entrée moyenne était de 50976 M# (n=12 cellules) pour les cellules du sujet témoin et 74457 M# (n=12 cellules) pour les cellules du patient. Comme indiqué dans la figure le, la densité du courant sensible à l'IbTx dans les cellules du patient était d'environ la moitié de celle des cellules du sujet témoin, ce qui était en accord avec l'expression réduite d'ARNm codant pour BKCa.

Des canaux potassiques activés par le calcium à grande conductance (BKCa) ont été détectés dans les neurones de tout le système nerveux des vertébrés mais leurs rôles fonctionnels dans le cerveau restent en grande partie inconnus (14).

Ils sont principalement situés dans la zone active pré-synaptique glutamatergique et peuvent réguler la transmission synaptique et la libération du transmetteur dans le cerveau des vertébrés. Ces canaux pré-synaptiques BKCa sont activés par de l'influx de calcium et peuvent contribuer à repolariser le potentiel pré-synaptique et le contrôle en boucle négatif de l'influx de calcium. Cette régulation peut se produire dans des conditions physiologiques mais les canaux BKCa sont également présumés agir en tant que frein d'urgence pour se protéger contre l'hyperactivité, l'excitotoxicité et la mort cellulaire dans certaines pathologies (21). On pense que le neurotransmetteur glutamate est impliqué dans l'autisme car les liaisons et les études métaboliques chez des individus autistes ont montré une association entre les transporteurs du glutamate et l'autisme (22,23). Le canal BKCa existe dans la membrane pré-synaptique en face de la clé synaptique et est associé à d'autres protéines telles que les canaux calciques sur le côté pré-synaptique et les récepteurs au NMDA sur le côté post-synaptique (21).

Ce complexe protéique synaptique avec la combinaison neuroligines-P-neurexines est essentiel pour la formation et l'intégrité de la synapse (24).

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Claims (6)

REVENDICATIONS

1 ) Test de dépistage de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mesure de l'activité électrique des canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) dans un échantillon de cellules sanguines du sujet à dépister, et (2) la détermination d'une éventuelle diminution de ladite activité électrique, par comparaison avec un échantillon de cellules sanguines contrôle.

2 ) Test de dépistage selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mesure de l'activité électrique desdites cellules, conformément à l'étape (1) est effectuée par la technique du patch-clamp.

3 ) Test de dépistage selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la technique du patch-clamp est mise en #uvre en mode cellule entière et patch rompu avec une concentration de calcium intracellulaire comprise entre 100 et 1000 nM.

4 ) Test de dépistage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les courbes courant-voltage des cellules contrôles et des cellules du sujet à dépister sont comparées pour des voltages compris entre-50 mV et +50 mV.

5 ) Méthode de sélection d'une sous population de sujets atteints d'autisme, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) la mise en #uvre du test de dépistage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et (ii) la sélection des sujets dont l'activité électrique des canaux BKCa des cellules sanguines est diminuée par rapport à l'activité électrique de canaux BKCa de cellules sanguines contrôles.

6 ) Utilisation d'activateurs ou d'agonistes des canaux BKCa pour la préparation d'un médicament utile dans le traitement de l'autisme, lié à une activité électrique déficiente.