WO2005008249A1 - Test de depistage de l'autisme, methode de selection de patients repondant audit test et utilisation des medicaments activateurs de canaux bkca pour le traitement de ladite maladie. - Google Patents

Test de depistage de l'autisme, methode de selection de patients repondant audit test et utilisation des medicaments activateurs de canaux bkca pour le traitement de ladite maladie. Download PDF

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WO2005008249A1
WO2005008249A1 PCT/FR2004/001822 FR2004001822W WO2005008249A1 WO 2005008249 A1 WO2005008249 A1 WO 2005008249A1 FR 2004001822 W FR2004001822 W FR 2004001822W WO 2005008249 A1 WO2005008249 A1 WO 2005008249A1
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WO
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seq
autism
electrical activity
bkca
screening test
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/001822
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English (en)
Inventor
Sylvain Briault
Frédéric LAUMONNIER
Jean-Yves Le Guennec
Sébastien ROGER
Original Assignee
Universite Francois Rabelais
Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the present invention relates to a screening test (diagnosis and / or prognosis) for autism, to a method of selecting patients responding to said test, to the use of drugs belonging to the family of agonists or activators of potassium channels calcium-dependent (BKCa channels) for the treatment of this disease, as well as for monitoring this disease.
  • Autism is a psychiatric disorder that mainly results in behavioral abnormalities, such as: lack of social ties, communication disorders, repetitive and ritualized behaviors, and a limited profile of interests and activities; this disorder usually appears in the first 3 years of life (1, 2). More specifically, autism is defined as a modification of essential skills to adapt to the environment. Since the signs of autism are generally established at an early stage of life, it has been postulated that autistic disorders are the expression of abnormalities occurring during brain development, probably during fetal life. This neuro-developmental hypothesis is reinforced by the history of this pathology and by the anomalies observed by structural and functional imaging of the brain. However, the hypothesis of functional defect cannot be excluded.
  • the results obtained by the Inventors show that the two hypotheses are possible.
  • the prevalence of autism is between 2 and 5 per 10,000 children when the Kanner criteria are used and increases to around 1 per 1,000 when broader definitions are applied, with a male / female ratio of approximately 4 / 1.
  • Studies on twins and families have shown that there may, in some cases, be genetic factors in the etiology of this pathology (3, 4).
  • the risk of development of autism is 50 to 100 times higher for the siblings of autistic subjects than in the general population (5). Concordance rates high and the phenotype observed in monozygotic twins indicates that in some cases it is possible that genetic factors are actually involved. However, this pathology seems heterogeneous both clinically and genetically, suggesting that several loci are involved.
  • autism is associated with chromosomal abnormalities, particularly abnormalities in the structure of chromosome 15 (2).
  • MIM 309550 fragile X syndrome
  • MIM 191100 Bourneville's tuberous sclerosis
  • autism is associated with chromosomal abnormalities, particularly abnormalities in the structure of chromosome 15 (2).
  • the origin of autism remains unknown for the majority of patients. It is estimated that more than one chromosomal locus contribute to genetic susceptibility to autism.
  • genomic screenings have been carried out to identify these genes and the results have shown a multiloci etiology (6-11).
  • the study of balanced translocations in autistic people has shown a rupture of certain genes (2).
  • the inventors have found that two proteins present in the pre- and post-synaptic regions of the glutamatergic synapses are involved in certain autistic phenotypes. They also showed that two different mechanisms are involved: i) an electrical activity deficient at the synaptic level, with a probable effect on synaptic transmission and ii) a defective architectural complex which would disturb synaptogenesis. The inventors have thus found that certain autisms as well as certain mental retardations are linked to a deficiency in the electrical activity of cells, due to a mutation in one of the genes coding for a protein of the glutamatergic complex (KNCMAl gene).
  • the present invention therefore relates to a screening test (diagnosis or prognosis) for autism, characterized in that it comprises: (1) measuring the electrical activity of potassium channels dependent on calcium in a sample of cells blood of the subject to be screened, the minimum number of cells to obtain an interpretable result being at least six blood cells and (2) the determination of a possible decrease in said electrical activity, by comparison with a sample of control blood cells.
  • the calcium-activated potassium channels known in the literature as maxi-K + , maxi-K, BK or BKCa channels are observed in most tissues and in particular in the brain. These maxi-K channels are unique in that they have a high conductance and require the presence of calcium and a depolarized membrane potential to be activated.
  • the patch clamp technique is known in itself.
  • the patch-clamp technique is implemented in whole cell mode and ruptured patch with a concentration of intracellular calcium of between 100 and 1000 nM. More precisely, the configuration used is that of the entire cell in ruptured patch.
  • a glass pipette is applied against the membrane.
  • the interaction between the glass and the membrane must be such that the electrical resistance is of the order of one gigaohm.
  • the piece of membrane caught under the pipette is broken either by suction or by the application of a brief but intense electric shock. This procedure opens electrical access to all of the channels contained in the cell.
  • the intracellular medium is replaced by the medium contained in the pipette, which makes it possible to control the activity of the ion channels.
  • a physiological solution contained in the pipette is chosen to allow the study of BKCa; thus the potassium concentration is high and the pCa is between 6 and 7 in order to activate the BKCa.
  • the sustain potential is set at -70 mV and the cell is depolarized for 500 msec from -50 mV to +50 mV by 10 mV jump every 4 seconds. This protocol makes it possible to plot the amplitude of the current as a function of the voltage that triggered it, and therefore to construct a current-voltage or IN curve.
  • the membrane capacity of each cell, reflecting the membrane surface and therefore the size of the cell, is determined for each cell.
  • the currents measured are then normalized to this capacity in order to overcome the variability in size between the cells.
  • the current is thus expressed in current density.
  • the functional presence of BKCa channels can be defined by the application of iberiotoxin (IbTx), a specific blocker of BKCa channels.
  • the current BKCa is defined as the fraction of current blocked by the IbTx.
  • said screening can be implemented: - either by looking for mutations, at the level of the genomic AD ⁇ , by a systematic analysis of the KCNMA1 gene; - Either by evaluation of the expression of the transcripts of the KCNMA1 gene by RT-PCR (qualitative, semi-quantitative or quantitative).
  • the present invention therefore also relates to an autism screening test, characterized in that it comprises:. isolation of nucleic acid from a biological sample from an autistic patient and. the detection of a mutation in the KCNMA1 gene, responsible for a decrease in the activity of the BKCa channels.
  • Said nucleic acid is advantageously selected from genomic DNA, cDNA and RNAs.
  • Said detection can be carried out by conventional techniques which are known per se, for example: (i) by amplification of a region of said KNCMAl gene capable of containing a mutation, then detection of said mutation by sequencing, by digestion with an enzyme appropriate restriction, or by analysis of profiles of the PCR product or RT-PCR obtained, or else (ii) by hybridization with a labeled probe specific for a region of said KNCMAl gene capable of containing a mutation, then direct detection of mismatches and / or digestion with an appropriate restriction enzyme.
  • said detection includes: (i) a step of amplification of at least one exon of said gene using at least a pair of primers representative of said gene and selected from the group consisting of the following pairs of primers: SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
  • the present invention also relates to an autism screening test, characterized in that it comprises: (a) the isolation of TARN from a biological sample from an autistic patient and (b) the evaluation of the quantity of KCNMA1 gene transcripts.
  • said evaluation is carried out by semi-quantitative or quantitative RT-PCR of the total RNA isolated in step (a) from blood cells of said autistic patient, in the presence of the pair of primers SEQ ID NO: 61 / SEQ ID NO: 62, and comparison of the amount of RNA obtained with the amount of RNA obtained with a control sample.
  • the general principles of qualitative RT-PCR are described in particular in Woodgate L. et al.
  • the present invention also relates to pairs of primers capable of amplifying at least one fragment of the KNMCA1 gene, characterized in that they are selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 / SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 / SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 / SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 / SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : ll / SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 / SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 / SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 / SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 / SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 / SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 / SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 / SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 / SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 / SEQ ID NO: 30,
  • the expression gene fragment includes both DNA and RNA.
  • the invention further relates to an in vitro autism screening kit, characterized in that it includes, in addition to the reagents necessary for the extraction of the nucleic acids from the sample to be treated, reagents suitable for amplification of said nucleic acids, at least one pair of primers, as defined above. It advantageously further comprises an internal control of the amplification reaction, a probe capable of hybridizing with the nucleic acid fragment contained in the internal control, a reverse transcriptase to obtain the cDNA from the RNA present. in the sample to be tested and possibly means to reveal the hybridization.
  • the present invention also relates to a method of selecting a subpopulation of subjects suffering from autism, characterized in that it comprises: (i) the implementation of the screening test, as described above, and (ii) the selection of subjects whose electrical activity of BKCa channels of blood cells is decreased compared to the electrical activity of BKCa channels of control blood cells.
  • the possibility of selecting such patients is crucial for the prescription of suitable treatment.
  • the present invention also relates to the use of activators or agonists of BKCa channels for the preparation of a medicament useful in the treatment of autism linked to a deficient electrical activity, and in particular of a subpopulation of autistic subjects, able to respond to such treatment.
  • Activators or agonists of the BKCa channels have already been described: - oxindole derivatives substituted in position 3, in the Application
  • the present invention further relates to a method for monitoring the treatment of autism by activators or agonists of the BKCa channels, characterized in that it comprises: (i) monitoring the restoration of the electrical activity of the BKCa channels by the patch-clamp method in patients treated with activators or agonists of the BKCa channels, and (ii) comparing the electrical activity obtained by compared to the initial electrical activity of said patients.
  • All of the embodiments and modes of implementation described above also apply to mental retardation which can be linked to an electrical deficiency of the cells due to a mutation in the KNCMAl gene. Consequently, the present invention also relates to the application of the screening test as defined above to screening for mental retardation.
  • FIG. 1 illustrates the physical mapping of the translocation and the functional effect of the KCNMA1 rupture: a) Spreading of metaphases originating from a patient with a translocation t (9; 10) showing a red FISH marking obtained with BAC clones
  • RP11-85P23 (chromosome 9) (http: //www.ensembl. Or g) and RP11-619F23 (chromosome 10) (http://www.ensembl.org), with a probe corresponding to a specific centromeric alphoid sequence of the chromosome 9 (in green) and specific for chromosome 10 (in green).
  • the hybridization signals (white arrows) on the chromosomes der (9) and der (l ⁇ ) indicate that these BAC clones include the breakpoints.
  • FIGS. 2b and 2c represent alignments of the sequences of the homologous BKCa channels using the ClustalW software; this alignment shows the conservation of the codon alanine 114 in the different species and the substitution Al 14V. It should be understood, however, that these examples are given only by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation. The examples which follow show the advantage of having tools for selecting autistic responders to treatment with an activator or agonist of the BKCa channels, for prescribing the most suitable treatment.
  • EXAMPLE 1 DETECTION AND CHARACTERIZATION OF A TRANSLOCATION IN THE KCNMA1 GENE IN A 6-YEAR-OLD PATIENT WITH AUTISTIC DISORDERS 1
  • Patient and methods 1.1) Patient with translocation The male patient was 6 years old at the time of the clinical evaluation, the diagnosis of autistic disorder and severe mental retardation were confirmed. Developmental diagnosis and assessments were carried out by the Child Psychiatry Unit for the diagnosis and treatment of pervasive developmental disorders (TEACCH program) at the Chartres Hospital (France). The patient was assessed as having impairments in reciprocal social interactions and communication skills, with a lack of spoken language and reduced communication gestures. He also exhibited limited stereotypical behavior.
  • the isolation of the breakpoint regions was carried out by PCR, using the elongase amplification system (In Vitrogen). - Search for KCNMAI mutations
  • the coding regions of KCNMAI (29 exons of genomic DNA or the 12 overlapping fragments representing the complete coding sequence) were amplified, using specific primers represented in Tables I to III below.
  • the amplified products were analyzed by analysis of single-strand conformational polymorphism (Single Strand Conformation Polymorphism or SSCP) (12) or of high performance denaturing liquid chromatography (DHPLC). The nucleotide sequence of the fragments having an abnormal profile was checked.
  • D KCNMAI L 26 aggagggaacaggataactcac aatgcctgtgtgtggtcttca 61 204 m 10 (SEQ IDNO: 53) (SEQ ID NO: 54)
  • RNAble® reagent Eurobio
  • This system uses the method of Chomczynski et al. (1987), a simplified technique adapted from the technique of Chirgwin et al. (1979), which makes it possible to obtain, from isolated cells (or tissues), good quality total RNA not contaminated with DNA and usable within the framework of a quantitative analysis (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159; Chirgwin JM. Et al., Biochemistry, 1979, 18, 5294-5299).
  • Lymphoblastoid lines were obtained according to two modes of seeding. - The first consists in diluting 500 ⁇ l of whole blood in 10 ml of RPMI 1640 medium (In Vitrogen) supplemented with 20 mM glutamine (ATGC) and of obtaining a cell pellet by centrifuging the tube for 5 min at 2500 rpm. - The second way to seed the lymphocytes is to mix volume to volume of whole blood (10 ml) and RPMI 1640 supplemented with 20 mM glutamine. This mixture is poured dropwise into a 50 ml conical tube containing 10 ml of separation medium (Ficoll).
  • the tube is centrifuged for 30 min at 2500 rpm.
  • the cell ring is then recovered and the cells are resuspended in 30 ml of RPMI 1640 and then centrifuged again 10 min at 1500 rpm.
  • RPMI 1640 fetal calf serum
  • ATGC fetal calf serum
  • ATGC 200 mM glutamine
  • BioMérieux a mixture of antibiotics: penicillin (100 IU / ml) and streptomycin (10 ⁇ g / ml).
  • Cellular "transformation” is obtained by adding 5 ml (for the first case) or 1 ml (in the second case) of viral suspension (Epstein-Barr virus: EBV) produced from a strain of lymphoblasts (strain B95-8) from Marmouset and 1 ⁇ g / ml of cyclosporine. The cells are then incubated at 37 ° C. under 5% CO and 90% humidity> and the culture medium is regularly changed.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • RNA extracted from lymphoblastoid cells transformed by EB V is amplified by RT PCR.
  • the sense primer 5'-GGCTCCTATAGTGCGGTTAGTG-3 '(SEQ ID NO: 61) was used in exon 9 of KCNMAI, and the antisense primer 5' - TGTTTAGCAGATGGGCCTTGTT-3 '(SEQ ID NO: 62) in exon 14.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • This gene codes for a calcium channel activated by calcium with significant conductance (also called hSlo, channel BKc a , channel Slo ⁇ or channel Maxi-K) (13) and is transcribed from such an omer to the centromere ( Figure lb) .
  • Analysis by in vitro amplification (PCR: polymerase chain reaction) of the BAC RP11-619F23 clone made it possible to detect only the presence of exon 2 of the KCNMAI gene.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR tests were performed on total RNA isolated from lymphoblatooid cell lines (LCL) from the patient and from a healthy control subject (12). Specific PCR products were obtained corresponding to the cDNAs of KCNMAI and of ⁇ -actin in each of the two individuals. However, the amplification of the specific product KCNMAI was clearly reduced in the patient carrying the translocation ( Figure Id). This result confirmed that a copy of the KCNMAI gene was deactivated in the autistic patient and that the haploid deficiency could be sufficient to generate the disorder.
  • the KCNMAI gene comprises 29 exons covering 750 kb of genomic DNA ( Figure lb) (Genebank access no.
  • the BKCa channel contains 7 transmembrane domains (S0-S6), with the N terminal end on the extracellular part of the membrane ( Figure 2). In addition, this N-terminal end has been reported to be a binding domain for ⁇ (16) subunits.
  • the C-terminal part is composed of some 800 amino acids presumed to form an intracellular domain containing 4 potential hydrophobic segments (S7-S10), one or more calcium binding sites and also protein association domains for other proteins. ( Figure 2).
  • This gene is abundantly expressed in different areas of the human brain (tonsil, caudate nuclei, cerebral cortex, hippocampus, hypothalamus, and spinal cord) (14), and in the ear (cochlea) (17), muscles (18 ), and the secretory glands (19).
  • the gene is located on chromosome 10, at the cytogenetic band q22.3, near several markers associated with autism and language disorders such as D10S201 (7) and D10S2327 (20), located at 1.5 Mb and 1 Mb telomeric compared to KCNMAI, respectively.
  • D10S201 (7) and D10S2327 (20) located at 1.5 Mb and 1 Mb telomeric compared to KCNMAI, respectively.
  • EXAMPLE 2 EVIDENCE OF THE REDUCTION OF THE ACTIVITY OF THE BKCa CHANNEL BY THE PATCH-CLAMP TECHNIQUE IN THE AUTIST PATIENT AGE 6 YEARS (SEE EXAMPLE 1) 1) Patient and methods 1.1) Patient The patient who performs the object of these experiments is the same as that described in example 1. 1.2) Methods
  • the cells were perifused using experimental solutions (PSS with and without 100 nM IbTx) via a system of parallel tubes, placed close to the cells.
  • the time required for the exchange of solution around the patched cell is less than 10 seconds.
  • the cells were dialyzed in a pipette solution with a pCa of 6.4 (to activate the BKCa) containing (in mm-ol / 1): 125, K-glutamate; 20, KC1; 0.7, CaCl 2 ; 1, Mg-ATP; 1, Mg-GTP; 1, EGTA; 10, Hepes buffer; pH adjusted to 7.2 with KOH.
  • the resistance at the pipette tip was between 3 and 5 M ⁇ .
  • Macroscopic K currents were generated in progressive depolarization steps of 8 mV (duration of 500 ms, 5 s interval) from a constant holding potential of -70 mV.
  • BKCa currents were defined as outgoing currents inhibited by 100 nmol / 1 of Iberotoxin (IbTx, Sigma), a specific blocking agent for BKCa channels (7).
  • the intracellular calcium (pCa) activity was adjusted to 6.4 to stimulate the calcium-activated potassium channels.
  • the capacity of each cell was estimated by integrating the capacitive current generated by a hyperpolarization pulse of 10 mV after the electronic cancellation of the pipette-patch capacity supplied by the Axopatch 200B amplifier (Axon Instrument).
  • the currents sensitive to IbTx were expressed in intensity currents, pA / pF. 1.2.2. Demonstration of the role of an activator of the BKCa channels, BMS204532, in the recovery of the activity of the BKCa channel.
  • BMS204532 the same cells as those studied above were first contacted with 4-AP (4-aminopyridine) to block most of the Kv channels (voltage-activated potassium channels; membranes) of the cells, then brought into contact with BMS204532 and 4-AP to observe the specific activation of the BKCa channels. In six cells, specific activation of BKCa channels was confirmed by the addition of 100 nM IbTx to the solution.
  • the current density sensitive to ITbTx in the patient's cells was about half that of the cells in the control subject, which was consistent with the reduced expression of mRNA encoding BKCa.
  • BKCa High-conductivity calcium activated potassium channels have been detected in neurons throughout the vertebrate nervous system, but their functional roles in the brain remain largely unknown (14). They are mainly located in the glutamatergic presynaptic active area and can regulate synaptic transmission and the release of the transmitter in the brain of vertebrates. These BKCa presynaptic channels are activated by calcium influx and can help repolarize the presynaptic potential and negative loop control of calcium influx.
  • the neurotransmitter glutamate is thought to be involved in autism because linkages and metabolic studies in autistic individuals have shown an association between glutamate transporters and autism (22, 23).
  • the BKCa channel exists in the presynaptic membrane opposite the synaptic key and is associated with other proteins such as calcium channels on the presynaptic side and NMDA receptors on the postsynaptic side (21). This synaptic protein complex with the neuroligins- ⁇ -neurexins combination is essential for the formation and integrity of the synapse (24).
  • EXAMPLE 3 DETECTION AND CHARACTERIZATION OF ANOTHER KCNMAI GENE ANOMALY IN ANOTHER PATIENT WITH AUTISTIC DISORDERS.
  • KCNMAI gene is indeed a possible marker of an autistic disorder.
  • tests were carried out for the search for mutations in patients with autistic disorders and a normal karyotype (46 Tunisians, 40 Italians and 30 French).
  • a patient there is a mutation by substitution of a base pair in the second exon of the KCNMAI gene inducing the change from an alanine to a valine at position 114 (FIG. 2), which is at the level of the first protein loop (Figure 2a). This region is highly conserved from C. elegans to mammals ( Figure 2c).

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Abstract

Test de dépistage (diagnostic et/ou pronostic) de l'autisme, méthode de sélection de patients répondant audit test et utilisation des médicaments appartenant à la famille des agonistes ou activateurs de canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) pour le traitement de cette maladie, ainsi que suivi de cette maladie. Ledit test de dépistage de l'autisme, comprend : (1) la mesure de l'activité électrique des canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) dans un échantillon de cellules sanguines du sujet à dépister, et (2) la détermination d'une éventuelle diminution de ladite activité électrique, par comparaison avec un échantillon de cellules sanguines contrôle.

Description

TEST DE DEPISTAGE DE L'AUTISME, METHODE DE SELECTION DE PATIENTS REPONDANT AUDIT TEST ET UTILISATION DES MEDICAMENTS ACTIVATEURS DE CANAUX BKCa POUR LE TRAITEMENT DE LADITE MALADIE. La présente invention est relative à un test de dépistage (diagnostic et/ou pronostic) de l'autisme, à une méthode de sélection de patients répondant audit test, à l'utilisation des médicaments appartenant à la famille des agonistes ou activateurs de canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) pour le traitement de cette maladie, ainsi qu'au suivi de cette maladie. L'autisme (MIM 209850 ; MIM 607373) est un désordre psychiatrique qui se traduit essentiellement par des anomalies du comportement, tels que : absence du lien social, troubles de la communication, comportements répétitifs et ritualisés, et un profil limité d'intérêts et d'activités ; ce désordre apparaît généralement dans les 3 premières années de la vie (1, 2). De manière plus précise, l'autisme est défini comme une modification des aptitudes essentielles pour s'adapter à l'environnement. Comme les signes de l'autisme sont généralement établis à un stade précoce de la vie, il a été postulé que les troubles autistiques sont l'expression d'anomalies intervenant au moment du développement cérébral, probablement au cours de la vie fœtale. Cette hypothèse neuro-développementale est renforcée par l'histoire de cette pathologie et par les anomalies observées par imagerie structurale et fonctionnelle du cerveau. Cependant, l'hypothèse du défaut fonctionnel ne peut pas être exclue. Les résultats obtenus par les Inventeurs montrent que les deux hypothèses sont possibles. La prévalence de l'autisme est comprise entre 2 et 5 pour 10.000 enfants lorsque les critères de Kanner sont utilisés et augmente jusqu'à environ 1 pour 1.000 lorsque des définitions plus larges sont appliquées, avec un rapport hommes/femmes d'environ 4/1. Des études sur des jumeaux et des familles ont montré qu'il peut exister, dans certains cas, des facteurs génétiques dans l'étiologie de cette pathologie (3, 4). Le risque de développement de l'autisme est 50 à 100 fois supérieur pour la fratrie des sujets autistes que dans la population générale (5). Les taux de concordance élevés et le phénotype observé chez des jumeaux monozygotes indiquent que dans certains cas, il est possible que des facteurs génétiques soient effectivement impliqués. Toutefois, cette pathologie semble hétérogène tant au niveau clinique que génétique, suggérant que plusieurs locus sont impliqués. Approximativement 10 à 25 % des patients affectés d'autisme présentent d'autres pathologies (par exemple, le syndrome de l'X fragile (MIM 309550) et la sclérose tubéreuse de Bourneville (MIM 191100). De plus, dans un petit nombre de cas, l'autisme est associé à des anomalies chromosomiques, en particulier des anomalies de la structure du chromosome 15 (2). Cependant, l'origine de l'autisme reste inconnue pour la majorité des patients. Il est estimé que plusieurs locus chromosomiques contribuent à la susceptibilité génétique à l'autisme. Plusieurs criblages génomiques ont été effectués pour identifier ces gènes et les résultats ont montré une étiologie multiloci (6-11). De plus, l'étude de translocations équilibrées chez des autistes a montré une rupture de certains gènes (2). Les Inventeurs ont trouvé que deux protéines présentes dans les régions pré- et post-synaptiques des synapses glutamatergiques sont impliquées dans certains phénotypes autistiques. Ils ont également montré que deux mécanismes différents sont impliqués : i) une activité électrique déficiente au niveau synaptique, avec un effet probable sur la transmission synaptique et ii) un complexe architectural défectueux qui perturberait la synaptogénèse. Les Inventeurs ont ainsi trouvé, que certains autismes ainsi que certains retards mentaux étaient liés à une déficience de l'activité électrique des cellules, due à une mutation au niveau de l'un des gènes codant pour une protéine du complexe glutamatergique (gène KNCMAl) et conduisant à un mauvais fonctionnement des canaux potassiques dépendants du calcium et qu'il était possible, pour évaluer l'existence d'un tel autisme, de mesurer l'activité électrique des canaux BKCa dans les cellules sanguines et notamment dans les cellules de la lignée lymphocytaire. C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un test de dépistage de l'autisme lié à une activité électrique déficiente, qui permet de mieux cibler le choix du traitement à proposer au patient atteint d'un tel déficit. La présente invention a donc pour objet un test de dépistage (diagnostic ou pronostic) de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mesure de l'activité électrique des canaux potassiques dépendants du calcium dans un échantillon de cellules sanguines du sujet à dépister, le nombre minimum de cellules pour obtenir un résultat interprétable étant d'au moins six cellules sanguines et (2) la détermination d'une éventuelle diminution de ladite activité électrique, par comparaison avec un échantillon de cellules sanguines contrôle. Les canaux potassiques activés par le calcium dénommés, dans la littérature, canaux maxi-K+, maxi-K, BK ou BKCa, sont observés dans la plupart des tissus et notamment dans le cerveau. Ces canaux maxi-K sont uniques en ce sens qu'ils présentent une conductance élevée et nécessitent la présence de calcium et d'un potentiel de membrane dépolarisé pour être activés. Ces canaux potassiques s'ouvrent ainsi en réponse à une augmenta- tion de la concentration intracellulaire en calcium et/ou à une dépolarisation de la membrane, ce qui entraîne une augmentation de l'efflux de potassium à partir des cellules et une régulation du potentiel de la membrane cellulaire (hyperpolarisation rapide de la membrane et réduction de l'influx de calcium par des canaux dépendant du voltage). Cette activité constitue une boucle rétroactive endogène qui permet le retour des cellules à un état d'excitation moindre, à un potentiel plus hyperpolarisé, ce qui limite l'entrée du calcium dans les cellules dépendant du voltage. D'autres gènes codant pour d'autres protéines faisant partie du complexe glutamatergique sont des candidats potentiels impliqués dans le phénotype de l'autisme. Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit test, la mesure de l'activité électrique desdites cellules, conformément à l'étape (1) est effectuée par la technique du patch-clamp. La technique du patch-clamp est connue en elle-même. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la technique du patch-clamp est mise en œuvre en mode cellule entière et patch rompu avec une concentration de calcium intracellulaire comprise entre 100 et 1000 nM. De manière plus précise, la configuration utilisée est celle de la cellule entière en patch rompu. Dans cette configuration, une pipette de verre est appliquée contre la membrane. L'interaction entre le verre et la membrane doit être telle que la résistance électrique est de l'ordre de un gigaohm. Quand cette résistance est atteinte, le morceau de membrane pris sous la pipette est rompu soit par succion, soit par l'application d'un choc électrique bref mais intense. Cette procédure ouvre un accès électrique à l'ensemble des canaux contenus dans la cellule. De plus, le milieu intracellulaire est substitué par le milieu contenu dans la pipette ce qui permet de contrôler l'activité des canaux ioniques. Une solution physiologique contenue dans la pipette est choisie pour permettre l'étude du BKCa ; ainsi la concentration de potassium est élevée et la pCa est comprise entre 6 et 7 afin d'activer le BKCa. Le potentiel de maintien est fixé à -70 mV et la cellule est dépolarisée pendant 500 msec de -50 mV à +50 mV par saut de 10 mV toutes les 4 secondes. Ce protocole permet de porter sur un graphique l'amplitude du courant en fonction du voltage qui l'a déclenché, et donc de construire une courbe courant- voltage ou IN. La capacité membranaire de chaque cellule, reflet de la surface membranaire et donc de la taille de la cellule, est déterminée pour chaque cellule. Les courants mesurés sont alors normalisés à cette capacité afin de s'affranchir de la variabilité de taille entre les cellules. Le courant est ainsi exprimé en densité de courant. Dans cette configuration, on peut définir la présence fonctionnelle de canaux BKCa, par l'application d'iberiotoxine (IbTx), bloqueur spécifique des canaux BKCa. Le courant BKCa est défini comme la fraction de courant bloqué par l'IbTx. Ce test permet, de manière avantageuse, de dépister des sujets présentant un type d'autisme dans lequel on observe une activité électrique déficiente des canaux BKCa, afin notamment de sélectionner un traitement adapté. Alternativement ledit dépistage peut être mis en œuvre : - soit par une recherche de mutations, au niveau de l'ADΝ génomique, par une analyse systématique du gène KCNMA1 ; - soit par évaluation de l'expression des transcrits du gène KCNMA1 par RT-PCR (qualitative, semi-quantitative ou quantitative). La présente invention a donc également pour objet un test de dépistage de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : . l'isolement d'acide nucléique à partir d'un échantillon biologique d'un patient autiste et . la détection d'une mutation dans le gène KCNMA1, responsable d'une diminution de l'activité des canaux BKCa. Ledit acide nucléique est avantageusement sélectionné parmi l'ADN génomique, l'ADNc et les ARNs. Ladite détection peut être réalisée par les techniques classiques qui sont connues en elles mêmes, par exemple : (i) par amplification d'une région dudit gène KNCMAl susceptible de contenir une mutation, puis détection de ladite mutation par séquençage, par digestion par une enzyme de restriction appropriée, ou par analyse de profils du produit de PCR ou de RT-PCR obtenu, ou bien (ii) par hybridation avec une sonde marquée spécifique d'une région dudit gène KNCMAl susceptible de contenir une mutation, puis détection directe des mésappariements et/ou digestion par une enzyme de restriction appropriée. Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit test, lorsque ledit acide nucléique est de l'ADN génomique, ladite détection inclut : (i) une étape d'amplification d'au moins un exon dudit gène à l'aide d'au moins un couple d'amorces représentatif dudit gène et sélectionné dans le groupe constitué par les couples d'amorces suivants : SEQ ID NO:l/SEQ ID NO:2, SEQ ID
NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO.5/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO-9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:l 1/SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO-13/SEQ
ID NO: 14, SEQ ID NO:15/SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17/SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23/SEQ ID
NO:24, SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27/SEQ ID NO-28, SEQ ID
NO:29/SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31/SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33/SEQ ID
NO:34, SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO:39/SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41/SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43/SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45/SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47/SEQ ID NO:48, SEQ ID
NO:49/SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51/SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53/SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55/SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57/SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59/SEQ ID NO:60 et (ii) une étape d'analyse des différents fragments amplifiés par comparaison avec un échantillon contrôle (gène non muté : obtenu à partir des banques de données ou à partir d'un échantillon biologique de contrôle). De manière avantageuse, ladite analyse peut être réalisée par SSCP (single-strand conformation polymorphism) ou chromatographie liquide à haute performance. Dans les cas de profils anormaux, un séquençage direct et une comparaison avec des fragments de référence et notamment ceux décrits dans le clone RP11-443A13 (n° d'accès Genebank NC_000010 : chromosome 10 humain) ou dans le clone RP11-619F23 (n° d'accès Genebank AL627447) peut être réalisé en outre. La présente invention a également pour objet un test de dépistage de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) l'isolement de TARN à partir d'un échantillon biologique d'un patient autiste et (b) l'évaluation de la quantité de transcrits du gène KCNMA1. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, ladite évaluation est réalisée par RT-PCR semi-quantitative ou quantitative de l'ARN total isolé à l'étape (a) à partir de cellules sanguines dudit patient autiste, en présence du couple d'amorces SEQ ID NO:61/SEQ ID NO:62, et la comparaison de la quantité d'ARN obtenue par rapport à la quantité d'ARN obtenue avec un échantillon témoin. Les principes généraux de la RT-PCR qualitative sont notamment décrits dans Woodgate L. et al. (Reverse Transcription and PCR, Encyclopedia of Life sciences, 2002) ; les principes généraux de la RT-PCR quantitative en temps réel, ainsi que les différentes techniques de détection quantitative des amplimères : à l'aide d'agents se liant à l'ADN double-brin (agents intercalants : bromure d'éthidium, SYBR Green I, YO-PRO-1 ; agents se fixant au sillon mineur : Hoechst 33258) ou à l'aide de sondes fluorescentes, à savoir : hydrolyse de sondes par l'activité 5' nucléase de l'ADN polymérase (TaqMan™), hybridation de 2 sondes (Hybprobes), balises moléculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers), sont connues de l'Homme du métier et sont notamment décrites dans Poitras et al., (Reviews in Biology and Biotechnology, 2002, 2, 1-11), dans Chomczynski P. et al., (Anal. Biochem., 1987, 162,156-159) ou dans Chirgwin JM. et al. (Biochemistry, 1979, 18, 5294-5299). La PCR et la RT-PCR quantitative en temps réel à l'aide de sondes du type TaqMan™ sont notamment décrites, respectivement dans Heid C. et al. (Génome Research, 1996, 6, 986-994) et Gibson U. et al. (Génome Research, 1996, 6, 995-1001). La présente invention a également pour objet des couples d'amorces aptes à amplifier au moins un fragment du gène KNMCA1, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : SEQ ID NO:l/SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:l l/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31/SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33/SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39/SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41/SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43/SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45/SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47/SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49/SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51/SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53/SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55/SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57/SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59/SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61/SEQ ID NO:62. Dans ce contexte, l'expression fragment de gène inclut aussi bien les ADN que les ARN. L'invention a en outre pour objet une trousse de dépistage in vitro de l'autisme, caractérisée en ce qu'elle inclut outre des réactifs nécessaires à l'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon à traiter, des réactifs appropriés à l'amplification desdits acides nucléiques, au moins un couple d'amorces, tel que défini ci-dessus. Elle comprend avantageusement en outre un contrôle interne de la réaction d'amplification, une sonde capable d'hybrider avec le fragment d'acide nucléique contenu dans le contrôle interne, une réverse-transcriptase pour obtenir l'ADNc à partir de l'ARN présent dans l'échantillon à tester et éventuellement des moyens pour révéler l'hybridation. La présente invention a également pour objet une méthode de sélection d'une sous population de sujets atteints d'autisme, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) la mise en œuvre du test de dépistage, tel que décrit ci-dessus, et (ii) la sélection des sujets dont l'activité électrique des canaux BKCa des cellules sanguines est diminuée par rapport à l'activité électrique de canaux BKCa de cellules sanguines contrôles. La possibilité de sélectionner de tels patients est cruciale pour la prescription d'un traitement adapté. La présente invention a également pour objet l'utilisation d' activateurs ou d' agonistes des canaux BKCa pour la préparation d'un médicament utile dans le traitement de l'autisme lié à une activité électrique déficiente, et notamment d'une sous population de sujets autistes, aptes à répondre à un tel traitement. Des activateurs ou agonistes des canaux BKCa ont déjà été décrits : - des dérivés oxindoles substitués en position 3, dans la Demande
Internationale PCT WO 02/30868 et les Brevets américains 5,565,483 et 5,602,169 ; - des dérivés 1,4 dihydropyridines, dans les Demandes de Brevets européens 705819 et 704434 ; - des dérivés 4-aryl-3 aminoquinoline-2-one, dans la Demande Inter- nationale WO 99/09983 ; ou - des flavones, dans la Demande Internationale WO 01/30342. D'autres activateurs ou agonistes des canaux potassiques peuvent être également mis en œuvre ; des tests de criblage de tels composés sont notamment décrits dans la Demande Internationale PCT WO 97/14036 ou la Demande Internatio- nale WO 02/30868. Lesdits activateurs ou agonistes sont mis en œuvre dans des compositions pharmaceutiques telles que celles décrites dans la Demande Internationale PCT WO 02/30868. La présente invention a, en outre, pour objet une méthode de suivi du traitement de l'autisme par des activateurs ou des agonistes des canaux BKCa, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) le suivi de la restauration de l'activité électrique des canaux BKCa par la méthode du patch-clamp chez les patients traités par des activateurs ou des agonistes des canaux BKCa, et (ii) la comparaison de l'activité électrique obtenue par rapport à l'activité électrique initiale desdits patients. L'ensemble des modes de réalisation et des modes de mise en œuvre décrits ci-dessus s'appliquent également aux retards mentaux qui peuvent être liés à une déficience électrique des cellules due à une mutation au niveau du gène KNCMAl . En conséquence, la présente invention a également pour objet l'application du test de dépistage tel que défini ci-dessus au dépistage des retards mentaux. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la cartographie physique de la translocation et l'effet fonctionnel de la rupture de KCNMA1 : a) Etalement de métaphases provenant d'un patient ayant une translocation t(9 ; 10) montrant un marquage FISH rouge obtenu avec les clones BAC
RP11-85P23 (chromosome 9) (http ://www.ensembl . or g) et RP11-619F23 (chromosome 10) (http://www.ensembl.org), avec une sonde correspondant à une séquence alphoïde centromérique spécifique du chromosome 9 (en vert) et spécifique du chromosome 10 (en vert). Les signaux d'hybridation (flèches blanches) sur les chromosomes der(9) et der(lθ) indiquent que ces clones BAC englobent les points de cassure. b) Représentation schématique du contig BAC dans le gène KCNMA1. Le point de cassure se situe entre les 1er et 2ème exons. Tous les exons sont testés par PCR sur l'ADN des clones. c) Séquence génomique encadrant les points de cassure. La délétion de 14bp (en rouge) dans le fragment der(9). d) Résultats d'amplification par la technique RT-PCR e) Courants sensibles à l'IbTx dans les cellules des sujets témoin et des patients. En haut, les tracés initiaux proviennent des courants différentiels avant et après l'application de 100 n-mol/1 d'IbTx sur les cellules du sujet témoin (à gauche) et du patient (à droite). Les courants sont stimulés par des étapes de dépolarisation de 8 mV à partir de -70 jusqu'à +42 mV. Le pCa intracellulaire était fixé à 6,4. Les valeurs de capacité étaient de 14 pF (cellule du sujet témoin) et 22 pF (cellule du patient). En bas, les courants sensibles à l'IbTx sont représentés d'après une relation I-N moyenne dans les cellules du sujet témoin (carré, n=12 cellules) et du patient (cercle, n=12 cellules). La densité de courant des cellules du patient était significativement plus faible que celle des cellules du sujet témoin pour le même voltage (p<0,05). f) Courants activés par le BMS204532 dans les cellules des patients. Le résultat I-N est obtenu dans des conditions similaires à celles expliquées en e), à l'exception de la présence de 4-AP (4-aminopyridine) pour enregistrer essentiellement le courant BKCa. 10 μM de BMS204532 active (carré, n=7 cellules), de manière significative le courant, en comparaison à des conditions témoins (cercle, n=7 cellules, p<0,05). En haut, les tracés initiaux proviennent des courants différentiels avant et après l'application de 10 μM de BMS204532 sur une cellule représentative de patient. - la figure 2a est une représentation schématique du canal BK. - les figures 2b et 2c représentent des alignements des séquences des canaux BKCa homologues à l'aide du logiciel ClustalW ; cet alignement montre la conservation du codon alanine 114 dans les différentes espèces et la substitution Al 14V. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Les exemples qui suivent montrent l'intérêt de disposer d'outils de sélection des autistes répondeurs à un traitement par un activateur ou un agoniste des canaux BKCa, pour la prescription du traitement le mieux adapté. EXEMPLE 1 : DETECTION ET CARACTERISATION D'UNE TRANSLOCATION DANS LE GENE KCNMA1 CHEZ UN PATIENT DE 6 ANS ATTEINT DE TROUBLES AUTISTIQUES 1) Patient et méthodes 1.1) Patient avec translocation Le patient masculin était âgé de 6 ans au moment de l'évaluation clinique, le diagnostic du trouble autistique et du retard mental sévère ont été confirmés. Le diagnostic et les évaluations développementales ont été réalisés par l'Unité de psychiatrie chez l'enfant pour le diagnostic et le traitement des troubles envahissants du développement (programme TEACCH) à l'Hôpital de Chartres (France). Le patient a été évalué comme ayant des déficiences dans les interactions sociales réciproques et les aptitudes à communiquer, avec un manque de langage parlé et des gestes de communication réduits. Il montrait également des comportements stéréotypés limités. Le diagnostic des troubles autistiques était confirmé lors d'un test (ADI-R) (32) et à l'aide de l'échelle de notation de l'autisme chez l'enfant (CARS) (33). Il a satisfait aux scores seuils tels que définis dans le test ADI-R, dans les trois classes de symptômes : déficience qualitative avec un score d'interaction social réciproque de 30 (score seuil pour l'autisme =10) ; déficience qualitative avec un score de communication non-verbale de 13 (score seuil pour l'autisme = 7) ; comportements répétitifs et profils stéréotypés de 7 (seuil pour l'autisme = 3) ; les premiers symptômes ont été observés chez ce patient à un âge inférieur à 36 mois. Globalement, le score de 40 par l'évaluation CARS rentrait dans la catégorie de l'autisme sévère. Le patient remplissait tous les critères du DSM IV pour l'autisme (34). De plus, les résultats du PEP-R (profil pédagogique psychologique modifié) (35) ont montré un score de développe- ment équivalent à celui d'un enfant d'un âge de 23 mois. Ce niveau de développement a été également évalué en utilisant le test développement de Brunet-Lézine (36) (une adaptation française de l'échelle de Gesell) (37). Le quotient de développement déterminé par le test de Brunet- Lezine était de 33 (correspondant à un niveau d'âge de 24 mois) et a confirmé le diagnostic d'autisme associé, selon les critères du DSM IV. Les observations physiques ont révélé des paramètres de croissance normaux. Il n'y avait aucun élément dysmorphique. L' électroencéphalogramme (EEG) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) étaient normaux. Les parents de cet enfant autiste sont non- consangins et sont dépourvus de tout trouble médical et neuropsychiatriques. Son frère âgé de 8 ans est atteint de phénylcétonurie (PCU) traitée par un régime réduit en phénylalanine depuis la naissance. Il a présenté un retard du langage. Aucune anoma- lie des taux de phénylalanine ou de la tétrahydrobioptérine (cofacteur de la phénylalanine hydroxylase) n'a été détectée chez le patient transloqué. 1.2) Méthodes - Isolement des points de cassure de la translocation Une analyse par technique FISH a été réalisée en utilisant les clones BAC obtenus auprès du centre CHORI. Après hybridation et lavage, les sondes bioti- nylées ont été détectées par des anticorps antibiotine-Cy3. Les lamelles ont été observées sous microscope à fluorescence Zeiss (Axiophot). L'isolement des régions de points de cassure a été réalisé par PCR, à l'aide du système d'amplification par élongase (In Vitrogen). - Recherche de mutations de KCNMAI Les régions codantes de KCNMAI (29 exons de l'ADN génomique ou les 12 fragments chevauchants représentant la séquence codante complète) ont été amplifiées, en utilisant des amorces spécifiques représentées dans les Tableaux I à III ci-après. Les produits amplifiés ont été analysés par l'analyse du polymorphisme conformationnel simple-brin (Single Strand Conformation Polymorphism ou SSCP) (12) ou de chromatographie liquide à haute performance dénaturante (DHPLC). La séquence nucléotidique des fragments ayant un profil anormal a été vérifiée.
TABLEAU I Séquences des amorces et conditions PCR établies pour l'étude de KCNMAI. Amorces Température Taille 5'-3' d'hybridation (°C) 5 Nom Exon Sens Anti-sens m τι m KCNMAI 1A cccgttgctagctatggcaa aaagcccaccacatgcgttg 58 282 (SEQ ID NO:l) (SEQ IDNO:2) l~ KCNMAI 1B catcccggtgaccatgga gagaagcggtggggctgg 58 219 m (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4) 10 KCNMAI 2 tccattgttccctatgtcttaac tctcataagcaaagccaccttg 61 275
D m (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6)
73 KCNMAI 3 atcctgaggtccaactcttaagt ggatcaatgtaaaggctcatgat 59 176 m (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8)
S KCNMAI 4 agcactaccacttctcagcat tgtgatactgaacaatgttgcac 59 210 H1
T3 ϋ 15 (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO: 10)
> KCNMAI 5 ctttcttatttcttctttccccc ccttcagccatgactcaggaa 59 191
O (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) m KCNMAI 6 gcaagaacttcccatcccttc ttggcataggggactggaat 59 236 m (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) z 20 KCNMAI 7 ggttgggagttagatgtggca aagcgagagcagaagggtctt 59 228
H (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO: 16) KCNMAI 8 agcatgtttttcttttttctccc atcatggaaaatattaacagcca 59 270 m (SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18)
O KCNMAI 9 tccccccttttctttggc gagaggattctaccgcagca 59 198 m 25 (SEQ ID NO:19) (SEQ ID NO:20)
Ni KCNMAI 10 gtcctgtcgtggtgcctg ggcagagggtctgacagca 59 193 σ> (SEQ ID NO:21) (SEQ ID NO:22) KCNMAI 11 tagcgatttcttctctccctg cccacaccaagatggaataa 59 179 (SEQ ID NO:23) (SEQ ID NO:24) 30
TABLEAU II Amorces Température Taille 5'-3' d'hybridation (°C) (pb) Nom Exon Sens Anti-sens 5 KCNMA l 12 tctgtgaattttcctttcggt agaagatccaaaagggccgt 59 184 (SEQIDNO:25) (SEQIDNO:26) τι KCNMA l 13 aaggcagacctgtctcagca atgggtcttcagacctggag 59 148 m (SEQIDNO:27) (SEQ ID NO:28) KCNMA L 14 gctctctactcaaccccacga cctgagtggttgggcaatg 59 316 ι~ 10 (SEQIDNO-29) (SEQ ID NO:30) m KCNMAI L 15 ctccgcatgtgttcctttcc ggataccctcggcaattgtc 59 255 (SEQIDNO:32)
D (SEQIDNO.31) m KCNMA] t 16 gaagtgaaccgaccgttctca tgtgtgttatgtggctctggt 58 210
7i (SEQIDNO-33) (SEQIDNO:34) m 15 KCNMA] l 17 cttggcaaatggttagtcctg tccttctggtgtcagtcgatt 59 160 ι
S (SEQIDNO:35) (SEQIDNO:36)
"0 KCNMAI L 18 tacagccgggccagaaagaa cagaacatgacctcacaaatg 59 185
> (SEQ ID NO:37) (SEQIDNO:38)
O KCNMAI aggaatgagaaagggaggg tgggtggattatgaaacgtg 59 166 m [ 19 20 (SEQIDNO:39) (SEQIDNO:40) m KCNMAI 20 ggctgcagggtagttattaaaa caattcagctgtgagggagaaa 59 268 z (SEQIDNO:41) (SEQIDNO:42)
-\ KCNMAI 21 gggaggaagagaagggctaa tattgcacagtctgccctcaaa 59 206 ai (SEQIDNO:43) (SEQIDNO:44) m :25 KCNMAI 22 agaagcgggcaacatcagat tctgcatctttcacatcctc 59 262
O (SEQ ID NO:45) (SEQIDNO:46) m KCNMAI 23 gtgaatgaaaagaagaaaaggc tctctgactcttacccacttctc 59 305
Ni (SEQ ID NO:47) (SEQIDNO:48) σ> KCNMAI 24 gcaggcacagcaaagaagtatt tctctctctgtctctttctcccc 59 289 30 (SEQIDNO:49) (SEQIDNO:50)
TABLEAU III Amorces Température Taille
T| 5'-3' d'hybridation (pb) m 5 (°C) Nom Exon Sens Anti-sens KCNMA] L 25 cctcatatcctgtatggtttg ttctacttctctgatttttcttc 59 226 m (SEQ IDNO:51) (SEQ ID NO:52)
D KCNMAI L 26 aggagggaacaggataactcac aatgcctgtgtgtggtcttca 61 204 m 10 (SEQ IDNO:53) (SEQ ID NO:54)
73 KCNMA] L 27 aaacagcaagctcaggtgacct tgcttaaaggacttttccctcac 61 274 m (SEQ IDNO:55) (SEQ ID NO:56) KCNMAI L 28 attaggtgggagggcagagtt tgtcccttgattttcaggca 59 217 (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO:58)
> 15 KCNMA] L 29 ggaaatgagtggcagatacagtt ttctttactcagttactctcagg 59 352
O m (SEQID NO:59) (SEQ IDNO:60) m
73 m
m
Ni
- RT-PCR semi-quantitative - extraction de TARN L'extraction d'ARN a été réalisée avec le réactif RNAble® (Eurobio). Ce système utilise la méthode de Chomczynski et al. (1987), technique simplifiée et adaptée de la technique de Chirgwin et al. (1979), qui permet d'obtenir à partir de cellules isolées (ou de tissus) des ARN totaux de bonne qualité non contaminés par de l'ADN et utilisables dans le cadre d'une analyse quantitative (Chomczynski P. et al.,. Anal. Biochem., 1987, 162,156-159 ; Chirgwin JM. et al., Biochemistry, 1979, 18, 5294-5299). - obtention des lignées lymphoblastoïdes Les lignées lymphoblastoïdes ont été obtenues selon deux modes d'ensemencement. - Le premier consiste à diluer 500 μl de sang total dans 10 ml de milieu RPMI 1640 (In Vitrogen) supplémenté de glutamine 20 mM (ATGC) et d'obtenir un culot cellulaire en centrifugeant le tube pendant 5 min à 2500 tr/min. - La seconde façon d'ensemencer les lymphocytes est de mélanger volume à volume du sang total (10 ml) et du RPMI 1640 supplémenté en glutamine 20 mM. Ce mélange est versé goutte à goutte dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de milieu de séparation (Ficoll). Le tube est centrifugé pendant 30 min à 2500 tr/min. L'anneau cellulaire est ensuite récupéré et les cellules sont resuspendues dans 30 ml de RPMI 1640 puis à nouveau centrifugées 10 min à 1500 tr/min. Ces deux types de culots sont alors repris dans 2,5 ml (pour le premier cas), ou 5 ml (dans le second cas) d'un milieu de culture composé de RPMI 1640, de sérum de veau fœtal (SVF) à 15% (ATGC), de glutamine 200 mM (ATGC), et d'un mélange d'antibiotiques (BioMérieux) : pénicilline (100 Ul/ml) et streptomycine (10 μg/ml). La « transformation » cellulaire est obtenue par addition de 5 ml (pour le premier cas) ou de 1 ml (dans le second cas), de suspension virale (virus d'Epstein-Barr : EBV) produite à partir d'une souche de lymphoblastes (souche B95- 8) de Marmouset et de 1 μg/ml de cyclosporine. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C sous 5% de CO et 90%> d'humidité et le milieu de culture est régulièrement changé. - conditions de la PCR RT-PCR : kit Superscript II RNAse H- (In vitrogen) PCR : Taq DNA polymérase (Promega) Protocole standard selon consigne fournisseurs RT PCR 65°C 10 min 23°C 10 min 42°C 60 min 95°C 8 min PCR 95°C 5 min 95°C 1 min - 60°C 1 min J 30 fois 72°C 1 min 72°C 7 min L'ARN total extrait des cellules lymphoblastoïdes transformées par EB V est amplifié par RT PCR. Pour 1 ' amplification du produit RT-PCR de 415 pb, on a utilisé comme amorce sens 5'-GGCTCCTATAGTGCGGTTAGTG-3' (SEQ ID NO:61) dans l'exon 9 de KCNMAI, et l'amorce anti-sens 5'- TGTTTAGCAGATGGGCCTTGTT-3' (SEQ ID NO:62) dans l'exon 14. Un standard interne de 600 pb du fragment d'ADNc (β-actine) a été co-amplifié avec les amorces suivantes : amorce sens 5'-TCATGCCATCCTGCGTCTGGACCT-3' (SEQ ID NO:63) et amorce anti-sens 5'-CCGGACTCATCGTACTCCTGCTTG-3' (SEQ ID NO:64) avec une température d'appariement de 60°C. La migration des produits PCR était réalisée sur gel d'agarose à 2%. 2) Résultats L'analyse cytogénique a permis de mettre en évidence une translocation équilibrée de novo chez le patient masculin âgé de 6 ans [46, XY, t(9 ;10) (q23 ; q22)], décrit ci-dessus. L'utilisation de l'hybridation in situ à fluorescence (FISH) avec une série de clones génomiques (banque RPCI) provenant des chromosomes 9 et 10, a permis de cartographier le point de cassure 9q sur le clone RP11- 85P23 (http ://www. ensembl. or g) du chromosome artificiel bactérien (BAC), et le point de cassure lOq sur le clone RP11-619F23 (http://www.ensembl.org) (Figure la). Aucun réarrangement supplémentaire n'a été détecté. L'analyse bioinformatique de la séquence des deux points de cassure et des régions avoisinantes ont révélé (i) l'absence de gène au point de cassure 9q et (ii) la localisation du gène KCNMAI dans la région du point de cassure lOq. Ce gène code pour un canal potassique activé par le calcium à conductance importante (aussi appelé hSlo, canal BKca, canal Sloα ou canal Maxi-K) (13) et est transcrit à partir du tel omère jusqu'au centromère (Figure lb). L'analyse par amplification in vitro (PCR : polymérase chain reaction) du clone BAC RP11-619F23 a permis de détecter seulement la présence de l'exon 2 du gène KCNMAI. De plus, elle a permis de montrer que les clones BAC voisins de RP11-619F23 contiennent le lerexon (clone RP11-428P16) et le 2eme exon (clone RP11-723F6). Ces résultats indiquent que le point de cassure lOq est situé entre les 1er et le 2eme exons dans une partie intronique de 230 kb. Afin d'isoler la séquence génomique chevauchant les points de cassure, on a combiné des réactions PCR de longue distance en utilisant une amorce spécifique située dans la séquence de 85P23 (BAC « chevauchant » le point de cassure du chromosome 9) et une amorce située dans la séquence de 619F23 (BAC « chevauchant » le point de cassure du chromosome 10). La séquence génomique des fragments de la jonction a été spécifiquement amplifiée. Une délétion de 14 pb a été détectée dans le fragment de jonction der(9) alors qu'aucune délétion n'a été décelée dans le fragment de jonction der(lθ) (Figure le). Des réactions d'amplification in vitro avec transcription inverse
(RT-PCR) semi-quantitatives ont été réalisées sur de l'ARN total isolé à partir de lignées cellulaires de lymphoblatoïdes (LCL) provenant du patient et d'un sujet témoin en bonne santé (12). Des produits PCR spécifiques ont été obtenus correspondant aux ADNc de KCNMAI et de la β-actine chez chacun des deux individus. Cependant, l'amplification du produit spécifique KCNMAI était nettement réduite chez le patient porteur de la translocation (Figure Id). Ce résultat a confirmé qu'une copie du gène KCNMAI était désactivée chez le patient autiste et que la déficience haploïde pouvait être suffisante pour générer le trouble. Le gène KCNMAI comprend 29 exons couvrant 750 kb d'ADN génomique (Figure lb) (n° d'accès Genebank NC-000010) et le cadre de lecture ouvert code pour une protéine comprenant 1195 acides aminés. L'épissage alternatif de l'ARN fournit aussi beaucoup d'isoformes, suggérant l'existence de fonctions spécifiques et d'une diversité de canaux (14, 15). Le canal BKCa contient 7 domaines transmembranaires (S0-S6), avec l'extrémité N terminale sur la partie extracellulaire de la membrane (Figure 2). De plus, cette extrémité N-terminale a été rapportée comme étant un domaine de liaison pour les sous-unités β (16). La partie C-terminale est composée de quelques 800 acides aminés présumés former un domaine intracellulaire contenant 4 segments (S7-S10) hydrophobes potentiels, un ou plusieurs sites de fixation du calcium et également des domaines d'association de protéine pour d'autres protéines (Figure 2). Ce gène est exprimé abondamment dans différentes zones du cerveau humain (amygdale, noyaux caudés, cortex cérébral, hippocampe, hypo- thalamus, et la moelle épinière) (14), et dans l'oreille (cochlée) (17), muscles (18), et les glandes sécrétrices (19). Le gène est situé sur le chromosome 10, à la bande cytogénétique q22.3, à proximité de plusieurs marqueurs associés à l'autisme et des troubles du langage tels que D10S201 (7) et D10S2327 (20), situés à 1,5 Mb et 1 Mb télomérique par rapport à KCNMAI, respectivement. La localisation d'un locus de susceptibilité à l'autisme et la rupture physique d'un gène chez un patient autiste dans la même région suggère fortement que ce gène peut être impliqué dans cette pathologie. EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE DE LA REDUCTION DE L'ACTIVITE DU CANAL BKCa PAR LA TECHNIQUE DU PATCH-CLAMP CHEZ LE PATIENT AUTISTE AGE DE 6 ANS (VOIR EXEMPLE 1) 1) Patient et méthodes 1.1) Patient Le patient qui fait l'objet de ces expériences est le même que celui décrit dans l'exemple 1. 1.2) Méthodes
1.2.1 Enregistrement par la technique du patch-clamp des courants Des enregistrements des courants K sur cellules entières ont été réalisés pour des cellules lymphoblastoïdes obtenues chez le patient autiste ou chez un sujet normal comme témoin. Les cellules étaient lavées et centrifugées trois fois et remises en suspension dans une solution physiologique (PSS) composée de (en mmol/1) : 140, NaCl ; 4, KC1 ; 2, CaCl2 ; 1, MgCl2 ; 0,33, NaH2PO4 ; 11,1, glucose ; 10, Tampon Hepes ; pH ajusté à 7,4 avec NaOH. Une partie de ces cellules sont mises dans une boîte de Pétri contenant 2 ml de PSS. Les boîtes de Pétri sont placées sur la plateforme d'un microscope Elipse TE300 Nikon. Les cellules étaient périfusées à l'aide de solutions expérimentales (PSS avec et sans 100 nM d'IbTx) par l'intermédiaire d'un système de tubes parallèles, placé à proximité des cellules. Le temps nécessaire à l'échange de solution autour de la cellule patchée est inférieure à 10 secondes. Les cellules étaient dialysées dans une solution de la pipette avec à un pCa de 6,4 (pour activer les BKCa) contenant (en mm-ol/1) : 125, K-glutamate ; 20, KC1 ; 0,7, CaCl2 ; 1, Mg-ATP ; 1, Mg-GTP ; 1, EGTA ; 10, tampon Hepes ; pH ajusté à 7,2 avec KOH. La résistance à la pointe de la pipette se situait entre 3 et 5 MΩ. Les courant K macroscopiques étaient générés par étapes de dépolarisation progressives de 8 mV (durée de 500 ms, 5 s d'intervalle) à partir d'un potentiel de maintien constant de —70 mV. Les courants BKCa étaient définis comme étant les courants sortants inhibés par 100 nmol/1 d'ibériotoxine (IbTx, Sigma), un agent bloquant spécifique des canaux BKCa (7). L'activité du calcium intracellulaire (pCa) était ajustée à 6,4 pour stimuler les canaux potassiques activés par le calcium. On estimait la capacité de chaque cellule en intégrant le courant capacitif généré par une impulsion d'hyperpolarisation de 10 mV après l'annulation électronique de la capacité pipette- patch fournie par l'amplificateur Axopatch 200B (Axon Instrument). Les courants sensibles à l'IbTx étaient exprimés en courants d'intensité, pA/pF. 1.2.2. Mise en évidence du rôle d'un activateur des canaux BKCa, le BMS204532, dans la récupération de l 'activité du canal BKCa. Pour étudier les effets du BMS204532, les mêmes cellules que celles étudiées ci-dessus ont d'abord été mises en contact avec de la 4-AP (4-aminopyridine) pour bloquer la plupart des canaux Kv (canaux potassiques activés par le voltage ; membranaires) des cellules, puis mises en contact avec du BMS204532 et de la 4-AP pour observer l'activation spécifique des canaux BKCa. Dans six cellules, l'activation spécifique des canaux BKCa a été confirmée par l'addition de 100 nM d'IbTx à la solution. Dans les deux enregistrements (1.2.1 et 1.2.22), le protocole de voltage imposé (voltage-clamp) et d'acquisition de données étaient contrôlés par le logiciel pClamp V8.1 (Axon Instrument). Les données étaient numérisées à une fréquence de 20 kHz et enregistrées à l'aide d'un ordinateur après filtrage par un filtre 5-pole Bessel à 2 kHz. Les expériences ont été réalisées à température ambiante. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (SEM). Les comparaisons statistiques entre les groupes ont été réalisées par analyse de la variance à deux voies de mesures répétées suivie d'un test d'analyse de Dunnett post hoc. Le seuil de signi- fication est fixé à P<0,05. 2) Résultats La technique du patch-clamp permet de confirmer que la réduction en ARNm codant pour la protéine BKCa correspond à une réduction similaire de l'activité du canal (Figure le). Les courants K de la cellule entière étaient stimulés par des étapes de dépolarisation de 8 mV à partir de -70 jusqu'à +42 mV avant et après le blocage du BKCa à l'aide d'un agent bloquant spécifique, l'IbTx. L'intensité des courants sensibles à l'IbTx (BKCa) était alors comparée entre les cellules lymphoblastoïdes du sujet témoin et celles du patient. Alors que la capacité membranaire était similaire dans chacun des groupes cellulaires (16,3 ±0,7pF et 17±0,9pF chez le témoin et le patient respectivement), le potentiel membranaire au repos et la résistance membranaire était significativement différent entre les deux groupes (p<0,05). Les changements étaient en accord avec l'activité réduite du canal potassique. La moyenne du potentiel membranaire au repos était de —72,8 ±0,9 mV (n≈π cellules) pour les cellules du sujet témoin et -68,4±1,7 mV (n=12 cellules) pour les cellules du patient et la résistance d'entrée moyenne était de 509±76 MΩ (n=12 cellules) pour les cellules du sujet témoin et 744±57 MΩ (n=12 cellules) pour les cellules du patient. Comme indiqué dans la figure le, la densité du courant sensible à ITbTx dans les cellules du patient était d'environ la moitié de celle des cellules du sujet témoin, ce qui était en accord avec l'expression réduite d'ARNm codant pour BKCa. Les résultats obtenus en présence de l' activateur des canaux BKCa sensibles au calcium montrent de manière intéressante qu'on observe effectivement une augmentation de l'activité des canaux BKCa (figure lf). Des canaux potassiques activés par le calcium à grande conductance (BKCa) ont été détectés dans les neurones de tout le système nerveux des vertébrés mais leurs rôles fonctionnels dans le cerveau restent en grande partie inconnus (14). Ils sont principalement situés dans la zone active pré-synaptique glutamatergique et peuvent réguler la transmission synaptique et la libération du transmetteur dans le cerveau des vertébrés. Ces canaux pré-synaptiques BKCa sont activés par de l'influx de calcium et peuvent contribuer à repolariser le potentiel pré-synaptique et le contrôle en boucle négatif de l'influx de calcium. Cette régulation peut se produire dans des conditions physiologiques mais les canaux BKCa sont également présumés agir en tant que frein d'urgence pour se protéger contre l'hyperactivité, l'excitotoxicité et la mort cellulaire dans certaines pathologies (21). On pense que le neurotransmetteur glutamate est impliqué dans l'autisme car les liaisons et les études métaboliques chez des individus autistes ont montré une association entre les transporteurs du glutamate et l'autisme (22, 23). Le canal BKCa existe dans la membrane pré-synaptique en face de la clé synaptique et est associé à d'autres protéines telles que les canaux calciques sur le côté pré-synaptique et les récepteurs au NMDA sur le côté post-synaptique (21). Ce complexe protéique synaptique avec la combinaison neuroligines-β-neurexines est essentiel pour la formation et l'intégrité de la synapse (24). EXEMPLE 3 : DETECTION ET CARACTERISATION D'UNE AUTRE ANOMALIE DU GENE KCNMAI, CHEZ UN AUTRE PATIENT ATTEINT DE TROUBLES AUTISTIQUES. Pour vérifier que le gène KCNMAI est effectivement un marqueur possible d'un trouble autistique, des tests ont été faits pour la recherche de mutations chez des patients présentant des troubles autistiques et un caryotype normal (46 tunisiens, 40 italiens et 30 français). Chez un patient, on constate une mutation par substitution d'une paire de bases dans le deuxième exon du gène KCNMAI induisant le changement d'une alanine en une valine à la position 114 (figure 2), qui se trouve au niveau de la première boucle de la protéine (figure 2a). Cette région est hautement conservée de C. elegans aux mammifères (figure 2c). RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS 1°) Test de dépistage de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mesure de l'activité électrique des canaux potassiques dépendants du calcium (canaux BKCa) dans un échantillon de cellules sanguines du sujet à dépister, et (2) la détermination d'une éventuelle diminution de ladite activité électrique, par comparaison avec un échantillon de cellules sanguines contrôle. 2°) Test de dépistage selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mesure de l'activité électrique desdites cellules, conformément à l'étape (1) est effectuée par la technique du patch-clamp. 3°) Test de dépistage selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la technique du patch-clamp est mise en œuvre en mode cellule entière et patch rompu avec une concentration de calcium intracellulaire comprise entre 100 et 1000 nM. 4°) Test de dépistage selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que les courbes courant- voltage des cellules contrôles et des cellules du sujet à dépister sont comparées pour des voltages compris entre -50 mV et +50 mV. 5°) Méthode de sélection d'une sous population de sujets atteints d'autisme, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) la mise en œuvre du test de dépistage selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et (ii) la sélection des sujets dont l'activité électrique des canaux BKCa des cellules sanguines est diminuée par rapport à l'activité électrique de canaux BKCa de cellules sanguines contrôles. 6°) Utilisation d'activateurs ou d'agonistes des canaux BKCa pour la préparation d'un médicament utile dans le traitement de l'autisme, lié à une activité électrique déficiente. 7°) Méthode de suivi du traitement de l'autisme par des activateurs ou des agonistes des canaux BKCa, caractérisée en ce qu'elle comprend : (i) le suivi de la restauration de l'activité électrique des canaux BKCa par la méthode du patch-clamp chez les patients traités par des activateurs ou des agonistes des canaux BKCa, et (ii) la comparaison de l'activité électrique obtenue par rapport à l'activité électrique initiale desdits patients. 8°) Test de dépistage de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : . l'isolement d'acide nucléique à partir d'un échantillon biologique d'un patient autiste et . la détection d'une mutation dans le gène KCNMAI, responsable d'une diminution de l'activité des canaux BKCa. 9°) Test de dépistage selon la revendication 8, caractérisé en ce que lorsque ledit acide nucléique est de l'ADN génomique, ladite détection inclut : (i) une étape d'amplification d'au moins un exon dudit gène à l'aide d'au moins un couple d'amorces représentatif dudit gène et sélectionné dans le groupe constitué par les couples d'amorces suivants : SEQ ID NO:l/SEQ ID NO:2, SEQ ID
NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:l l/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13/SEQ
ID NO:14, SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23/SEQ ID
NO:24, SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28, SEQ ID
NO:29/SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31/SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33/SEQ ID
NO:34, SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO:39/SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41/SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43/SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45/SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47/SEQ ID NO:48, SEQ ID
NO:49/SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51/SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53/SEQ ID
NO:54, SEQ ID NO:55/SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57/SEQ ID NO:58, SEQ ID
NO:59/SEQ ID NO:60 et (ii) une étape d'analyse des différents fragments amplifiés par comparaison avec un échantillon contrôle. 10°) Test de dépistage de l'autisme, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) l'isolement de l'ARN à partir d'un échantillon biologique d'un patient autiste et (b) l'évaluation de la quantité de transcrits du gène KCNMAI . 11 °) Test de dépistage selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite évaluation est réalisée par RT-PCR semi-quantitative ou quantitative de l'ARN total isolé à l'étape (a) à partir de cellules sanguines dudit patient autiste, en présence du couple d'amorces SEQ ID NO:61/SEQ ID NO:62, et la comparaison de la quantité d'ARN obtenue par rapport à la quantité d'ARN obtenue avec un échantillon témoin. 12°) Couples d'amorces aptes à amplifier au moins un fragment du gène KNMCA1, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par SEQ ID NO:l/SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:l l/SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15/SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17/SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31/SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33/SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39/SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41/SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43/SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45/SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47/SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49/SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51/SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53/SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55/SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57/SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59/SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61/SEQ ID NO:62. 13°) Trousse de dépistage in vitro de l'autisme, caractérisée en ce qu'elle inclut outre des réactifs nécessaires à l'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon à traiter, des réactifs appropriés à l'amplification desdits acides nucléiques, au moins un couple d'amorces, tel que défini à la revendication 12. 14°) Trousse selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, un contrôle interne de la réaction d'amplification, une sonde capable d'hybrider avec le fragment d'acide nucléique contenu dans le contrôle interne, une réverse-transcriptase pour obtenir l'ADNc à partir de l'ARN présent dans l'échantillon à tester et éventuellement des moyens pour révéler l'hybridation. 15°) Application du test de dépistage tel que défini aux revendications 1 à4ou8àll,au dépistage des retards mentaux.
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