GENE PMP69 DU PSORIASIS
La présente invention a pour objet l'utilisation d'une sonde relative au gène PMP69 pour la caractérisation d'un échantillon biologique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de cette sonde pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis, un procédé d'identification ainsi qu'un nouvel outil de recherche.
Le psoriasis est une pathologie dermatologique fréquente qui touche de 3 à 5% de la population européenne. Le psoriasis est couramment associé à d'autres pathologies, telles que l'hypertension, l'arthrite, ou encore le SIDA (Farber EM, Nall L, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapitre 9:107-157; Duvic M. ét al., J Invest Dermatol (1990 Nov);95(5):38S-40S).
Sur la base de l'âge d'apparition des symptômes et de l'association avec certains gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type I (CMH I), le psoriasis a été classé en deux sous-types appelés I et II (Henseler T, Christophers E, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapter 10:159-166). Des études ont également montré que 30 à 50% des patients atteints de psoriasis ont un antécédent familial chez un des parents du 1er ou 2e degré. Ces observations ont permis de suggérer que le psoriasis est une maladie génétique avec une composante autoimmune (Bos, Br. J. Dermatol. (1988) 118:141 ; Baadsgaard ét al., J. Invest. Dermatol. (1990) 95:328).
Les principales composantes physiopathologiques du psoriasis incluent une hyperprolifération associée à une différenciation anormale des kératinocytes de l'épiderme, une inflammation caractérisée par un infiltrat inflammatoire (principalement de lymphocytes T helpers activés) au niveau du derme et de l'épiderme et par le relargage de cytokines pro-inflammatoires, et enfin une vascularisation anormale du derme (Krueger JG, J Am Acad Dermatol 2002 Jan;46(1):1-23; quiz 23-6).
L'implication du processus inflammatoire dans la physiopathologie du psoriasis est soutenue par le mécanisme d'action de certains agents ayant un effet thérapeutique bénéfique pour la maladie. Par exemple, la cyclosporine utilisée dans le traitement des formes sévères de psoriasis, exerce un effet inhibiteur sur la synthèse de l'interleukine-2, cytokine promouvant la prolifération des lymphocytes T et la sécrétion des cytokines inflammatoires par ces cellules. Par conséquent, les modulateurs de l'inflammation permettent de limiter la composante inflammatoire caractérisant en partie le psoriasis. Cliniquement, le psoriasis se définit par une hyperplasie de l'épiderme, ainsi que par une desquamation, un érythème et une inflammation cutanés.
Les méthodes actuellement disponibles pour le traitement incluent la thérapie topique, la photothérapie, la photo-chimiothérapie et la thérapie systémique, réservée aux formes plus sévères de la maladie. Néanmoins, ces thérapies offrent uniquement des périodes de rémission aux patients, mais la pathologie resurgit généralement après l'arrêt du traitement.
Les glucocorticoïdes administrés par voie topique sont le plus généralement prescrits dans le traitement initial du psoriasis, et exercent des effets anti- inflammatoires, antimitotiques et antipruritiques bénéfiques.
Le goudron brut de charbon est un mélange complexe de milliers de composés d'hydrocarbure. Son effet thérapeutique est lié à l'inhibition d'enzymes et à des propriétés antimitotiques. Bien qu'efficace, ce traitement est de par son odeur désagréable à utiliser pour le patient. La photothérapie et photo-chimiothérapie basées sur l'administration du methoxsalen, principe actif photosensibilisant, sont seulement temporairement efficaces. Le traitement doit être répété et offre une thérapie palliative, mais non curative. De plus, ces traitements ont des effets secondaires à long terme, notamment des altérations immunologiques et un risque accru de carcinogenèse.
Le methotrexate est l'agent cytotoxique systémique le plus généralement administré pour les formes sévères de psoriasis s'étendant sur une surface
importante du corps. Les contre-indications de ce traitement sont nombreuses et l'arrêt du traitement peut s'accompagner d'une aggravation des symptômes. L'hydroxyurée, l'etretinate, la cyclosporine, et l'AZT sont également les médicaments systémiques utilisés pour lutter contre le psoriasis mais tous ont des effets secondaires sérieux.
A ce jour, aucun traitement ne permet une rémission durable de cette pathologie sans engendrer des effets secondaires importants, car le psoriasis est une pathologie complexe d'origine multifactorielle. La compréhension du mécanisme physiopathologique conduisant au phénotype psoriasique demeure donc un défi important dans le traitement médical dermatologique. En effet, beaucoup d'aspects de la maladie restent à élucider, comme par exemple la réponse hétérogène à certains traitements, de patients présentant des signes cliniques semblables.
Pour maintenir un niveau normal de l'activité métabolique dans le corps le bon taux d'hormone thyroïdienne doit être sécrété tout le temps. Un mécanisme de rétrocontrôle spécifique, opère à travers l'hypothalamus et les glandes pituitaires antérieures pour contrôler le niveau de sécrétion de la thyroïde. Dans la majeure partie des cas d'hyperthyroïdie, la glande thyroïde augmente de taille de 2 à 3 fois par rapport à la taille normale avec une hyperplasie et hyperprolifération cellulaire. Ces cellules sécrètent plus d'hormones thyroïdiennes, jusqu'à 5 à 15 fois plus que le taux normal. Au vu des connaissances sur l'hyperthyroidie, rien ne permet à l'homme du métier de déduire une quelconque implication de celle-ci dans le dérèglement physiologique menant au phénotype psoriasique.
L'analyse de l'expression génique dans la peau de patients psoriasiques constitue une voie pour mieux comprendre le mécanisme physiopathologique de cette maladie (Bowcock AM, Shannon W, Du F, et al., Hum Mol Genêt (2001) 10(17): 1793-805 ; Oestreicher JL, Walters IB, Kikuchi T, et al., Pharmacogenomics J (2001) 1(4):272-87).
La technologie des filtres à ADNc (« arrays ») (NGuyen C, Rocha D, Granjeaud S, et al., Genomics (1995)) est une des technologies permettant d'analyser simultanément et rapidement l'expression de plusieurs centaines d'ARNm à partir d'une biopsie cutanée prélevée chez le patient, par opposition à d'autres technologies plus lourdes à mettre en œuvre, comme le SAGE (« Sériai Analysis of Gène Expression ») (Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW, Science (1995 Oct) 20;270(5235):484-7), ou le Differential Display (Liang P, Pardee AB, Science (1992) 257: 967-971; Zhang L, et al., Science : (1997) 276: 1268-1272).
La Demanderesse a mis en évidence un nouveau gène marqueur du psoriasis.
La présente invention a pour objet une sonde relative au gène PMP69 pour la caractérisation d'un échantillon biologique, et également un nouvel outil de caractérisation d'un composé destiné au traitement du psoriasis, ainsi q'un nouvel outil de recherche.
En particulier, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique relative au gène PMP69 ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène PMP69 (N° d'accession NM_005050.1 ) comme outil de recherche du psoriasis.
L'utilisation de la sonde polynucléotidique selon l'invention permet notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène PMP69.
Selon la présente invention, un échantillon biologique correspond à tout prélèvement ou échantillon d'organisme vivant, de préférence un mammifère, en particulier un organisme humain, en quantité suffisante pour être caractérisé. On peut citer comme échantillon biologique, à titre d'exemple non limitatif, un échantillon de peau, de cuir chevelu, de muqueuse, ou cellulaire.
Selon la présente invention, la caractérisation d'un échantillon biologique consiste à mesurer le niveau d'expression d'un gène d'intérêt, c'est à dire plus précisément la quantité d'ARN messager ou de protéine correspondante à ce gène qui est présente dans l'échantillon biologique.
Par sonde polynucléotidique, on entend un oligo- ou polynucléotide simple ou double brin, d'ARN, ou ADN, dont la séquence est complémentaire d'une séquence cible correspondant à une partie ou à la totalité dudit gène et pouvant aller de 10 à classiquement 500 paires de bases et dont la séquence est complémentaire avec la séquence cible à au moins 80% et préférentiellement d'au moins 90% (pourcentage de bases d'acide nucléiques appariées entre deux séquences, voir les méthodes de calcul proposées par Atschul et al. J. Molec. Biol. (1990), 215:403).
Les sondes polynucleotidiques selon l'invention pourront être des oligo- ou polynucléotides comportant un ou plusieurs nucléotides modifiés par substitution, délétion ou insertion, ces modifications seront telles que la séquence de la sonde lui permettra de reconnaître spécifiquement le fragment de séquence cible.
Les sondes polynucleotidiques pourront également présenter un squelette modifié lui conférant, par exemple, une meilleure stabilité. Par exemple, les liaisons phosphodiesters des brins d'ARN naturels peuvent être modifiées pour inclure au moins un atome d'azote ou de soufre. Par ailleurs, les sondes polynucleotidiques pourront être modifiées de telle sorte que leurs liaisons phosphodiesters sont remplacées par des séquences de type peptidique (peptide nucleic acids).
De plus, les sondes polynucleotidiques selon l'invention peuvent comprendre des bases autres que les 4 bases classiques.
Les sondes polynucleotidiques selon l'invention peuvent être synthétisées selon de nombreuses méthodes de synthèse in vivo ou in vitro de façon manuelle ou automatique.
Les méthodes de synthèse in vitro peuvent être chimiques ou enzymatiques. Par exemple, une sonde d'ARNc simple brin peut-être obtenue par transcription in vitro d'un modèle de séquence d'ADN d'intérêt servant de matrice, en faisant intervenir une ARN polymérase (à titre d'exemple la T3, T7 ou SP6 ARN polymérase). Une sonde d'ADNc simple brin peut-être générée par transcription inverse d'un ARNm d'intérêt en présence d'une reverse transcriptase (par exemple la M- MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase isolée à'Escherichia coli).
De nombreuses méthodes de synthèse in vivo d'ARN double brin sont décrites dans la littérature, elles peuvent être réalisées dans divers types cellulaires de bactéries ou d'organismes supérieurs. On pourra également se référer aux méthodes de synthèses décrites dans les demandes de brevet WO01/36646 et WO01/75164. Ces ARN double brin peuvent être ensuite dénaturés pour servir de polynucléotide simple brin.
Concernant son environnement, la sonde polynucléotidique peut être ou faire partie d'un plasmide, d'un génome viral ou d'un autre type de vecteur. Elle peut, dans d'autres cas, faire partie du génome d'une cellule, ou bien d'une cellule génétiquement modifiée pour comporter cette sonde dans son génome. Il peut s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant cette sonde, elle est de préférence sous le contrôle de séquences régulatrices. Si la sonde est insérée dans un vecteur, ledit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires à la transcription et éventuellement la traduction de la sonde. Cette sonde peut aussi être entourée par des régions flanquantes permettant une étape de recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique,
conduisant éventuellement à l'insertion de la sonde de l'invention dans l'ADN génomique d'une cellule cible.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde polypeptidique relative au produit d'expression du gène PMP69 comme outil de recherche du psoriasis.
L'utilisation de la sonde polypeptidique selon l'invention permet notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène PMP69.
Par sonde polypeptidique relative au produit d'expression du gène PMP69, on entend un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène PMP69, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage. Ledit anticorps peut être obtenu selon les procédés connus de l'homme de l'art (Catty D (Ed) : Antibodies, A Practical Approach, Volume I (1989), chapitres 2, 3 et 4 ; ou encore Harlow E. et Lane D. Antibodies, A laboratory Manual (1988), chapitres 6 et 7) en utilisant ladite protéine sauvage ou ledit polypeptide homologue.
Il pourra, par exemple, s'agir d'anticorps mono- ou polyclonal, ou de leur fragment biologiquement actif capable de reconnaître la protéine codée par le gène d'intérêt. Ces anticorps pourront être marqués, par exemple immuno- conjugués à des enzymes ou marqués à l'aide de composés fluorescents, de la biotine ou encore radiomarqués.
Par polypeptides homologues, on entend des polypeptides dont les séquences en acides aminés présentent au minimum 80%, et préférentiellement 90% d'acides aminés en commun avec la protéine sauvage codée par le gène d'intérêt.
Par polypeptide variant, on entend désigner un polypeptide muté ou
correspondant à un polymorphisme pouvant exister, notamment chez l'être humain et pouvant présenter une troncature, une substitution, une délétion et/ou une addition d'au moins un acide aminé par rapport à la séquence du polypeptide sauvage normal.
Par polypeptide modifié, on entend désigner un polypeptide obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, présentant une modification par rapport à la séquence sauvage normale. Ces modifications pourront notamment porter sur les domaines pré-, pro- ou mature des polypeptides, sur les acides aminés à l'origine d'une spécificité de spectre ou d'efficacité de l'activité, ou à l'origine de la conformation structurale, de la charge ou de l'hydrophobicité, et de la capacité de multimérisation et d'insertion membranaire des polypeptides. On pourra ainsi créer des polypeptides d'activité équivalente, plus étroite ou plus large. Les modifications pourront aussi porter sur les séquences impliquées dans la maturation, le transport et l'adressage des polypeptides.
Par fragment biologiquement actif d'un polypeptide, on entend désigner un fragment polypeptidique ayant conservé au moins une activité du polypeptide dont il est issu.
Une étude comparative de l'expression génique dans la peau psoriasique par rapport à la peau saine, a permis à la Demanderesse d'identifier un gène, dénommé PMP69 (Peroxisomal membrane protein 69) référence Genbank (NCBI): NM_005050.1 , dont l'activité transcriptionnelle est induite dans la peau malade.
En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique relative au gène PMP69 telle que définie ci-dessus pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène PMP69.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde
polynucléotidique relative au gène PMP69 telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la sonde polynucléotidique sera utilisée dans le procédé décrit ci-dessous.
L'invention se rapporte ainsi à un procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité d'ARN messager correspondant au gène PMP69 dans les échantillons biologiques à l'aide d'une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène PMP69 (n° d'accesssion NM_005050.1 ) ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de la transcription des ARN messagers du gène PMP69 est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
En particulier, l'étape c) du procédé pourra être mise en œuvre avec une sonde polynucléotidique qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc
double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Selon le mode de réalisation donné dans l'exemple 1 , la mesure de l'expression du gène PMP69 dans un échantillon biologique peut être réalisée en utilisant la technologie des filtres à ADNc (« arrays ») sur support nylon, selon laquelle les ARNm extraits de l'échantillon biologique sont transcrits en ADNc simple brin radiomarqués qui sont ensuite déposés sur des flitres à ADNc.
Selon un autre mode de réalisation possible, les ARNm totaux extraits de l'échantillon biologique testé peuvent être analysés selon l'une des méthodes de détection connues de l'homme de l'art (Sambrook et al. : Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Volume I (1989) Second Edition, chapitre 7) comme la technique d'hybridation par Northern-Blot utilisant une sonde cDNA double brin dénaturée.
Selon un autre mode de réalisation possible, le marquage de sonde peut comprendre un cycle de synthèse d'ADNc double brin, à partir des ARNm totaux extraits de l'échantillon biologique, couplé à une transcription in vitro en présence de ribonucleotides biotinyles, générant des ARN complémentaires marqués, ces ARN antisens marqués servant de sonde lors de l'hybridation sur une puce à ADN (Affymetrix, Gène Expression Monitoring, Technical Note ; US 5 716 785, US 5 891 636, US 6 291 170).
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polypeptidique relative au gène PMP69 telle que définie ci-dessus pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène PMP69.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde polypeptidique relative au gène PMP69 telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
L'invention se rapporte aussi à un procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d' au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité de la protéine produite par l'expression du gène PMP69 dans les échantillons biologiques à l'aide d'une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène PMP69, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage ; d) sélection desdits composés pour lesquels une inhibition de l'expression de ladite protéine est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
On entend par inhibition de la transcription d'un gène PMP69 ou de l'expression de la protéine, une diminution de la quantité d'ARN messagers ou de la protéine correspondant audit gène dans un échantillon testé.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à un outil de recherche comprenant une sonde polynucléotide, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène PMP69 (n° d'accesssion NM 005050.1).
En particulier, la sonde polynucléotidique est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
La présente invention se rapporte aussi à un outil de recherche comprenant une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène PMP69, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
L'outil de recherche pourra en outre comprendre l'analyse des effets de certains traitements sur l'expression de ces gènes marqueurs du psoriasis, ou l'analyse de mutation de la séquence de ces gènes chez des individus atteints de psoriasis.
L'outil de recherche pourra également permettre l'analyse du profil d'expression du gène PMP69 dans les cellules constituant l'épiderme, en particulier les kératinocytes, par exemple en fonction de leur état de prolifération ou de différenciation. L'outil de recherche pourra également permettre l'expression constitutive, la surexpression ou l'inhibition de l'expression du gène PMP69, selon des tests in vitro ou in vivo connus de l'homme de l'art.
Par exemple, selon un outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée, par exemple dans un test d'hybridation par Northern-blot, ou encore dans un test d'amplification par PCR (« Polymérase Chain Reaction »), pour suivre l'expression du gène PMP69 ou d'une séquence homoloque, variante, modifiée ou partielle, dans des cellules constituant l'épiderme, en particulier des kératinocytes, exprimant in vitro le gène PMP69, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de prolifération des cellules. En particulier, ladite expression peut être constitutive ou encore inductible, le gène PMP69 pouvant être placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif tel que le promoteur SV40 ou CMV, ou d'un promoteur inductible tel que le système Tet Off Gène Expression System (Invitrogen), sont utilisées les techniques classiques de génie génétique et de transfection (Gossen M, Bujard H. , Annu Rev Genet.(2002) 36:153-73).
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée, par exemple dans un test d'hybridation par Northern-blot, ou encore dans un test d'amplification par PCR (« Polymérase Chain Reaction »), pour suivre l'expression du gène PMP69 ou d'une séquence homoloque, variante, modifiée ou partielle, dans les cellules constituant l'épiderme d'une souche d'animaux de laboratoire, en particulier dans les kératinocytes, surexprimant in vivo ledit gène ou séquence, par exemple sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement activé dans l'épiderme, tel que les promoteurs de Kératine K14, K15 ou de l'Involucrine, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de prolifération des cellules.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée pour l'analyse par exemple par Southem-Blot d'une inactivation par délétion du gène PMP69, par exemple dans des cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des kératinocytes, cultivés in vitro ou encore in vivo dans les cellules d'une souche d'animaux de laboratoire. Cette inactivation peut être réalisée selon les techniques classiques de recombinaison homologue.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée pour dessiner et synthétiser des siARN, selon les techniques connues de l'homme de l'art (Tuschl T, Borkhardt A, Mol Interv (2002) Jun;2(3):158-67). Ces ARN antisens peuvent être utilisés pour l'inhibition de l'expression du gène PMP69, par exemple dans une lignée de cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des kératinocytes, in vitro, ou encore in vivo, par exemple dans une souche d'animaux de laboratoire.
Par exemple, cet outil de recherche pourra être tel que la ou les sondes qu'il comprend, sont mises en contact avec la ou les séquence(s) cible(s) correspondante(s) déposées sur un support tel qu'un filtre en nylon.
La sonde peut être utilisée dans un test d'hybridation (par exemple un test de détection de mésappariement), un séquençage, un microséquençage.
Selon d'autres outils de recherche envisagés par la présente invention, la sonde selon l'invention pourra être associée à une autre sonde détectable dont la nature pourra être de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation de la sonde, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. L'homme du métier saura quelle sonde détectable est la mieux adaptée en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Selon un outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique selon l'invention peut être utilisée pour des immunomarquages du polypeptide cible tel que défini précédemment, sur des échantillons biologiques, selon les techniques classiques connues de l'homme de l'art, par exemple sur coupe d'épiderme d'animaux de laboratoire, par exemple les animaux présentant une surexpression de la protéine PMP69 ou d'un polypeptide homologue, variant, modifié ou fragment actif de ladite protéine, ou encore in vitro sur des cellules constituant l'épiderme, en particulier des kératinocytes, pouvant être l'objet d'une surexpression de la protéine ou dudit polypeptide, ou encore d'une inhibition de cette expression, par exemple par l'utilisation de siRNA comme envisagé précédemment.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique peut également être utilisée pour purifier ladite protéine ou ledit polypeptide, par exemple, selon des techniques d'immunoprécipitation classiquement connues de l'homme de l'art.
Les techniques classiquement connues de l'homme de l'art peuvent être les techniques décrites par Sambrook J, Fritsch EF et Maniatis T dans Molecular Cloning, A Laboratory Manual.
La découverte de la surexpression de PMP69, dans la peau psoriasique permet d'une part de diagnostiquer le psoriasis, et d'autre part, de développer de
nouvelles thérapeutiques basées sur l'inhibition de l'expression et/ou de la fonction de ce gène, pour traiter le psoriasis.
Dans un aspect particulièrement préférable, la présente invention fournit une méthode pour caractériser des échantillons de peau pour déterminer la prédisposition au psoriasis.
La Demanderesse a démontré que l'expression du gène PMP69 était induite dans la peau psoriasique lésionnelle présentant une plaque de psoriasis, par rapport à la peau saine (expression moyenne mesurée chez 13 sujets psoriasiques et 10 sujets sains). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1.
La mesure de l'expression du gène PMP69 permet de caractériser une peau psoriasique lésionnelle indépendamment du type et de la localisation de la plaque de psoriasis (tableaux 2 et 3). Le tableau 2 représente l'expression du gène PMP69 relative à une expression moyenne chez les sujets sains, chez les patients présentant majoritairement des plaques au niveau du tronc et des plaques asymétriques. Le tableau 3 représente l'expression du gène PMP69 relative à une expression moyenne chez les sujets sains, chez les patients présentant majoritairement des plaques de type symétrique.
En outre, hormis la caractérisation d'une peau présentant une plaque de psoriasis par rapport à une peau saine, la découverte de ces nouveaux marqueurs du psoriasis permet également de discriminer une peau de patient psoriasique non lésionnelle (cliniquement saine) mais déjà engagée vers le processus psoriasique, d'une peau non lésionnelle ayant les réelles caractéristiques d'une peau saine.
La Demanderesse a découvert de façon surprenante, que certaines peaux non lésionnelles surexpriment aussi le gène PMP69. Sur la base de l'expression de ce gène, le diagnostic du psoriasis est réalisable très précocement puisque l'expression du gène PMP69 et permet de différencier au niveau moléculaire
des peaux non lésionnelles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le permettent pas. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 4.
Ainsi l'invention se rapporte également à un procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique du gène PMP69 par la mise en contact d'une sonde polynucléotidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon biologique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène PMP69 (n° d'accesssion NM 005050.1).
En particulier, la sonde polynucléotidique pourra être un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
L'invention se rapporte aussi à un procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique de la protéine produite par l'expression du gène PMP69 par la mise en contact d'une sonde polypeptidique telle que un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène PMP69, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
Par surexpression d'un gène dans un échantillon psoriasique, on entend une expression de l'ARN messager ou de la protéine correspondant à ce gène plus élevée dans cet échantillon par rapport à un échantillon sain de référence.
Par ailleurs, l'invention se rapporte aussi à un kit de diagnostic comprenant au moins une sonde polynucléotidique ou polypeptidique relative au gène PMP69.
L'objet de la présente invention se rapporte donc à un kit de diagnostic comprenant une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène PMP69 (n° d'accession NM 005050.1).
En particulier, ladite sonde polynucléotidique du kit de diagnostic est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
L'objet de la présente invention se rapporte aussi à un kit de diagnostic comprenant une sonde polypeptidique telle que un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène PMP69, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
Les observations décrites ci-dessus indiquent également que PMP69 sont des cibles thérapeutiques potentielles pour le développement de nouvelles thérapies visant à traiter le psoriasis chronique vulgaire en plaques, quelque soit le type prédominant de plaques chez le patient, et la localisation de la plaque de psoriasis sur le corps.
Ainsi, un autre objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique complémentaire au gène PMP69 pour inhiber l'expression du gène PMP69. En particulier, la sonde polynucléotidique pourra être un ARN antisens ou un siRNA qui a pour rôle d'inhiber l'expression d'un gène spécifique (Fire A., Trends in Genetic (1999) ; 15 : 358-363).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique sera un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Enfin, l'invention se rapporte également à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène PMP69 (n° d'accession NM 005050.1) pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement du psoriasis.
La sonde polynucléotidique pourra plus particulièrement être un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
EXEMPLE 1 - MESURE D'EXPRESSION GENIQUE DANS LA PEAU SAINE ET DANS LA PEAU PSORIATIQUE
Une étude clinique réalisée en présence de volontaires sains et de patients atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques, a permis de mettre en évidence l'implication du gène PMP69 dans le psoriasis. Des biopsies cutanées sont prélevées chez des volontaires sains, ainsi que sur des plaques de psoriasis et sur des zones non lésionnelles apparaissant cliniquement saines, chez des patients atteints de psoriasis. La présence ou l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiée, ainsi que la sévérité de la plaque de psoriasis, sont déterminées par l'évaluation de paramètres cliniques locaux (scores d'érythème, de desquamation et d'élévation de la plaque de psoriasis).
L'analyse de l'expression génique est ensuite réalisée à partir de chaque biopsie individuelle. La comparaison des profils géniques correspondant à la peau saine et la peau psoriasique non lésionnelle et lésionnelle, permet
d'identifier des gènes dont l'expression est induite dans la maladie.
La détermination des profils géniques est basée sur l'hybridation d'une sonde complexe d'ADNc simple brin (générée par la rétro-transcription des ARNm issus de chaque biopsie de peau) sur des fragments d'ADNc d'intérêt, qui sont déposés sur un support tel qu'un filtre en nylon. Les signaux d'hybridation obtenus sont proportionnels à la quantité de chaque ADNc marqué dans la sonde et reflètent le niveau d'expression de chaque ARNm au sein de l'échantillon de peau analysé (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1 ;29(1):207-16).
Des filtres élaborés par la Demanderesse, spécifiques à la dermatologie ont été développés. Ces filtres sont constitués de 474 ADNc impliqués dans les processus physiologiques de la peau humaine. En parallèle, des filtres commerciaux à 4200 ADNc humains (Invitrogen GF211) ont été utilisés. Ces filtres d'ADNc vont permettre de déterminer l'expression de gènes d'intérêt dans la peau saine ainsi que dans la peau non lésionnelle et lésionnelle de patients atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques.
Méthode
La mesure de l'expression génique dans la peau saine et dans la peau psoriasique est réalisée en utilisant la technologie des filtres à ADNc (« arrays ») sur support nylon. Le principe de cette technologie repose sur l'hybridation d1 une sonde d'ADNc simple brin radiomarquee sur des fragments d'ADNc cibles déposés à haute densité sur des filtres de nylon (Nguyen C et al. Genomics 1995 Sep 1 ;29(1):207-16). Dans cette étude, des filtres de nylon (GF211) commercialisés par la société Invitrogen sur lesquels sont déposés 4200 ADNc humains identifiés, ainsi que des filtres dédiés à la dermatologie à 474 ADNc humains, développés par la Demanderesse, sont utilisés. Les sondes d'ADNc radiomarquées sont générées par transcription inverse des ARN totaux (protocole Invitrogen), isolés à partir des différentes biopsies prélevées chez 10 volontaires sains et 13 sujets atteints de plaques chroniques de psoriasis
vulgaire (protocole RNEasy, Qiagen). Les signaux d'hybridation obtenus sont proportionnels à la quantité de chaque ADNc marqué présent dans la sonde, qui s'est hybride sur l'ADNc qui lui est complémentaire sur le filtre et reflètent ainsi l'activité transcriptionnelle des ARNm dans les biopsies analysées.
Analyse de normalisation des résultats d'expression génique et comparaison des profils géniques entre la peau saine et la peau psoriasique
Les signaux d'hybridation sont mesurés par phospholuminescence, puis quantifiés à l'aide du logiciel d'analyse d'image Imagen (Biodiscovery). Afin de discriminer les signaux d'hybridation spécifiques des gènes étudiés, le bruit de fond lié à une hybridation non spécifique est mesuré sur chaque filtre sur des zones vierges de dépôt d'ADNc (filtres GF211), ou au sein d'une couronne entourant chaque spot (filtres dédiés). Après transformation des données en log un seuil de détection permettant de discriminer une mesure relevant d'un signal réel ou du bruit, est déterminé automatiquement pour chaque filtre en utilisant la méthode décrite précédemment par Fogel et al, 2002. En vue de comparer les résultats d'expression génique entre les différentes biopsies analysées, les signaux d'hybridation sont normalisés par la médiane de l'ensemble de signaux obtenus pour chaque biopsie (filtres GF211 ), ou par l'expression d'un ARN messager exogène, servant de référence, dont l'expression est invariante entre les échantillons analysés. Ce transcrit exogène est ajouté en quantité constante dans les préparations d'ARN totaux issues des différents échantillons, avant synthèse de la sonde d'ADNc radiomarquee. La séquence cible de ce transcrit exogène est déposée sur chaque filtre. Pour chaque gène, une expression moyenne de référence est déterminée sur l'ensemble des biopsies de sujets sains, puis soustraite à l'expression obtenue dans chaque biopsie de peau psoriasique non lésionnelle et lésionnelle (valeurs en log). Le ratio entre l'expression de chaque gène dans la peau psoriasique par rapport la peau saine est alors obtenu en prenant l'exponentielle en base 10 de la valeur calculée précédemment (tableaux 1 à 4).
Les résultats obtenus permettent de mettre en évidence la surexpression du gène PMP69 dans la peau humaine lésionnelle présentant une plaque de psoriasis par rapport à la peau humaine saine (tableau 1). Les résultats des tableaux 2 et 3 indiquent que ces surexpressions sont observées quelque soit le type prédominant de plaque exprimées chez le patient (symétrique ou troncal) et également indépendamment de la localisation des plaques de psoriasis. Les abréviations mentionnées dans ces tableaux représentent la localisation des biopsies prélevées sur le corps pour chaque sujet psoriasique (SP) et ont la signification suivante: JG: jambe gauche, JD: jambe droite, BD: bras droit, BG: bras gauche, T: tronc.
Les résultats du tableau 4 montrent que l'expression de ces gènes est également induite dans la peau psoriasique non lésionnelle. Les abréviations ont la même signification que précédemment.
EXEMPLE 2 - MESURES DES PARAMETRES CLINIQUES LOCAUX LIES A LA PLAQUE DE PSORIASIS : SCORES D'ERYTHEME, DE DESQUAMATION ET D'ELEVATION DE LA PLAQUE
Les différents scores cliniques locaux permettant de définir la présence ou l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiée, ainsi que la sévérité de la plaque de psoriasis, sont les scores d'érythème, de desquamation et d'élévation de la plaque. Ces scores sont classiquement mesurés grâce aux classements suivants:
La mesure de l'érythème se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence d'érythème)
1 = léger (légère rougeur présente) 2 = modéré (rougeur facilement décelable)
3 = sévère (rougeur intense)
4 = très sévère (rougeur très intense)
La mesure de la desquamation se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence de desquamation)
1 = léger (squames détectés, une seule couche de desquamation)
2 = modéré (squames de degré intermédiaire entre le léger et le sévère) 3 = sévère (Plusieurs couches de squames)
4 = très sévère (plusieurs couches de squames épais)
La mesure de l'élévation de la plaque se fait à l'aide du classement suivant: 0 = aucun (absence d'élévation de l'épaisseur) 1 = léger (légère élévation détectable au toucher)
2 = modéré (épaisseur modérée)
3 = sévère (fort épaississement)
4 = très sévère (très fort épaississement)
Cette étude démontre que les paramètres cliniques locaux obtenus avec la peau psoriasique non lésionnelle ne sont pas différents de ceux obtenus pour la peau saine. Ils ne permettent donc pas de différencier une peau psoriasique non lésionnelle d'une peau saine. Par contre, les résultats du tableau 4 ont permis de mettre en évidence au niveau moléculaire, une surexpression du gène PMP69 dans certaines peaux psoriasiques non lésionnelles.
La mesure de l'expression du gène PMP69, permet donc de réaliser un diagnostic très précoce du psoriasis, puisque l'expression de ce gène permet de différencier au niveau moléculaire des peaux non lésionnelles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le permettent pas.