EP1618213A2 - Genes fancc, dad1, grim19 et hadhii marqueurs du psoriasis - Google Patents

Genes fancc, dad1, grim19 et hadhii marqueurs du psoriasis

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Publication number
EP1618213A2
EP1618213A2 EP04742515A EP04742515A EP1618213A2 EP 1618213 A2 EP1618213 A2 EP 1618213A2 EP 04742515 A EP04742515 A EP 04742515A EP 04742515 A EP04742515 A EP 04742515A EP 1618213 A2 EP1618213 A2 EP 1618213A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
probe
sequence seq
gene
hadhii
fancc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04742515A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Valérie Résidence Le moustié - Bat A2 TRINQUET
Patricia Rossio
Paul Fogel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP1618213A2 publication Critical patent/EP1618213A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the use of probes relating to the FANCC, DAD1 GRIM19 and HADHII genes for the characterization of a biological sample.
  • the invention also relates to the use of these probes for the identification of a compound intended for the treatment of psoriasis, a method of identification as well as a new research tool.
  • Psoriasis is a frequent dermatological pathology which affects 3 to 5% of the European population. Psoriasis is commonly associated with other pathologies, such as hypertension, arthritis, or AIDS (Farber EM, Nall L, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapter 9: 107-157; Duvic M., J Invest Dermatol (1990 Nov); 95 (5): 38S-40S).
  • psoriasis Based on the age of onset of symptoms and the association with certain genes of the major histocompatibility complex type I (MHC I), psoriasis has been classified into two subtypes called I and II (Henseler T, Christophers E, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapter 10: 159-166). Studies have also shown that 30 to 50% of psoriasis patients have a family history with one of the parents of 1 or 2 nd degree. These observations have made it possible to suggest that psoriasis is a genetic disease with an autoimmune component (Bos, Br. J. Dermatol. (1988) 118: 141; Baadsgaard et al., J. Invest. Dermatol. (1990) 95: 328 ).
  • the main pathophysiological components of psoriasis include hyperproliferation associated with abnormal differentiation of keratinocytes of the epidermis, an inflammation characterized by an inflammatory infiltrate (mainly activated helper T lymphocytes) in the dermis and epidermis and by the release of pro-inflammatory cytokines, and finally a abnormal vascularization of the dermis (Krueger JG, J Am Acad Dermatol (2002 Jan); 46 (1): 1-23; quiz 23-6).
  • inflammatory infiltrate mainly activated helper T lymphocytes
  • psoriasis The involvement of the inflammatory process in the pathophysiology of psoriasis is supported by the mechanism of action of certain agents having a therapeutic effect beneficial for the disease.
  • cyclosporine used in the treatment of severe forms of psoriasis, exerts an inhibitory effect on the synthesis of interleukin-2, a cytokine promoting the proliferation of T lymphocytes and the secretion of inflammatory cytokines by these cells. Consequently, the modulators of inflammation make it possible to limit the inflammatory component characterizing in part psoriasis.
  • psoriasis is defined by an hyperplasia of the epidermis, as well as by scaling, erythema and inflammation of the skin.
  • Apoptosis is a phenomenon of cell death (described among others by KERR J.F.R. et al., J. Cancer (1972), 265, 239) which is a highly selective form of cell suicide. It is characterized by easily observable morphological and biochemical phenomena. Thus, we observe a condensation of the chromatin associated or not with an endonuclease activity, the formation of apoptotic bodies and a fragmentation of deoxyribonucleic acid (DNA) due to the activation of endonucleases, in DNA fragments of 180 -200 base pairs giving a profile easily recognizable by electrophoresis on agarose gel. Apoptosis is involved in the development, differentiation and tissue renewal.
  • cDNA filters arrays
  • arrays are one of the technologies allowing to analyze simultaneously and quickly the expression of several hundred mRNAs from a skin biopsy taken from the patient, as opposed to other heavier technologies to implement, such as SAGE (“Sériai Analysis of Gène Expression”) (Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW , Science (1995 Oct) 20; 270 (5235): 484-7), or the Differential Display (Liang P, Pardee AB, Science (1992); 257: 967-971; Zhang L, et al., Science (1997 ); 276: 1268-1272).
  • SAGE Supplementai Analysis of Gène Expression
  • Velculescu VE Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW , Science (1995 Oct) 20; 270 (5235): 484-7
  • Differential Display Liang P, Pardee AB, Science (1992); 257: 967-971; Zhang L, et al., Science (1997 ); 276: 12
  • the Applicant has identified new marker genes for psoriasis.
  • the present invention relates to probes relating to the FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII genes for the characterization of a biological sample, and also a new tool for characterizing a compound intended for the treatment of psoriasis, as well as a new tool of research.
  • the invention relates to the use of at least one polynucleotide probe relating, respectively, to the FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII gene having a sequence of 10 to 500 base pairs and being complementary to at least 80% with a target sequence corresponding to all or part, respectively, of the FANCC gene (accession number NM 000136.1), DAD1 (accession number NM 001344.1), GRIM19 (accession number NM 015965.3), or HADHII ( Accession number NM 004493.1) as a psoriasis research tool.
  • At least one polynucleotide probe according to the invention allows in particular the characterization of a biological sample by measuring the level of expression of one or more genes chosen from FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII.
  • a biological sample corresponds to any sample or sample of living organism, preferably a mammal, in particular a human organism, in an amount sufficient to be characterized. Mention may be made, as a biological sample, by way of nonlimiting example, of a sample of skin, scalp, mucous membrane, or cell.
  • the characterization of a biological sample consists in measuring the level of expression of a gene of interest, that is to say more precisely the quantity of messenger RNA or protein corresponding to this gene which is present in the biological sample.
  • polynucleotide probe is meant a single or double-stranded oligo- or polynucleotide, of RNA or DNA, the sequence of which is complementary to a target sequence corresponding to part or all of said gene and which can range from 10 to conventionally 500 base pairs and whose sequence is complementary to the target sequence by at least 80% and preferably by at least 90% (percentage of nucleic acid bases paired between two sequences, see the calculation methods proposed by Atschul et al J. Molec. Biol. (1990), 215: 403).
  • the polynucleotide probes may also have a modified backbone giving it, for example, better stability.
  • the phosphodiester bonds of the natural RNA strands can be modified to include at least one nitrogen or sulfur atom.
  • the polynucleotide probes can be modified so that their phosphodiester bonds are replaced by peptide-like sequences (peptide nucleic acids).
  • polynucleotide probes according to the invention can comprise bases other than the 4 conventional bases.
  • the polynucleotide probes according to the invention can be synthesized according to numerous synthesis methods in vivo or in vitro manually or automatically.
  • RNA polymerase for example T3, T7 or SP6 RNA polymerase
  • a single-stranded cDNA probe can be generated by reverse transcription of an mRNA of interest in the presence of a reverse transcriptase (for example M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase isolated from Escherichia coli).
  • a reverse transcriptase for example M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase isolated from Escherichia coli.
  • double-stranded RNA can then be denatured to serve as a single stranded polynucleotide.
  • the polynucleotide probe can be or be part of a plasmid, a viral genome or another type of vector. It can, in other cases, be part of the genome of a cell, or else of a cell genetically modified to contain this probe in its genome. It can also be an isolated molecule.
  • this probe is preferably under the control of regulatory sequences. If the probe is inserted into a vector, said vector preferably comprises all the sequences necessary for the transcription and optionally the translation of the probe. This probe can also be surrounded by flanking regions allowing a step of homologous recombination with another polynucleotide fragment, possibly leading to the insertion of the probe of the invention into the genomic DNA of a target cell.
  • the invention also relates to the use of at least one polypeptide probe relating to the expression product of a gene chosen from FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII as a tool for researching psoriasis.
  • At least one polypeptide probe according to the invention makes it possible in particular to characterize a biological sample by measuring the level of expression of the FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII gene.
  • polypeptide probe relating to the expression product of the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII gene is meant a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression, respectively, of the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII gene, or against a biologically active fragment of said protein, or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • Said antibody can be obtained according to methods known to those skilled in the art (Catty D (Ed): Antibodies, A Practical Approach, Volume I (1989), chapters 2, 3 and 4; or Harlow E. and Lane D. Antibodies, A laboratory Manual (1988), chapters 6 and 7.) using said wild protein or said homologous polypeptide.
  • antibodies may, for example, be mono- or polyclonal antibodies, or their biologically active fragment capable of recognizing the protein encoded by the gene of interest.
  • These antibodies can be labeled, for example immuno-conjugated with enzymes or labeled using fluorescent compounds, biotin or even radiolabelled.
  • homologous polypeptides polypeptides whose amino acid sequences have at least 80%, and preferably 90% amino acids in common with the wild protein encoded by the gene of interest.
  • variant polypeptide is intended to denote a polypeptide mutated or corresponding to a polymorphism which may exist, in particular in humans and which may have a truncation, a substitution, a deletion and / or an addition of at least one amino acid relative to the sequence of the normal wild-type polypeptide.
  • modified polypeptide is intended to denote a polypeptide obtained by genetic recombination or by chemical synthesis, exhibiting a modification with respect to the normal wild-type sequence.
  • modifications may in particular relate to the pre-, pro- or mature domains of the polypeptides, to the amino acids at the origin of a spectrum specificity or of activity efficiency, or at the origin of the structural conformation. , charge or hydrophobicity, and the capacity for multimerization and membrane insertion of the polypeptides. It will thus be possible to create polypeptides of equivalent, narrower or wider activity.
  • the modifications may also relate to the sequences involved in the processing, transport and addressing of the polypeptides.
  • biologically active fragment of a polypeptide is intended to denote a polypeptide fragment having conserved at least one activity of the polypeptide from which it is derived.
  • FANCC Fluorescence Activated neutrophilic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic cytoplasmic
  • FANCC regulates cell apoptosis induced by gamma interferon (Pang Q, et al. EMBO J (2001 Aug) 15; 20 (16): 4478-89; Rathbun RK et al. Blood (2000 Dec) 15; 96 ( 13): 4204-11 Comment in: Blood. (2002 Apr) 1; 99 (7): 2627-8; discussion 2629-30) and TNF alpha (Pang Q, et al. EMBO J (2001 Aug) 15; 20 (16): 4478-89), which are two cytokines whose expression is increased in psoriasis (Chodorowska G.
  • FANCC also regulates apoptosis induced by oxidative stress or certain xenobiotics by modulating the activity of gluthatione-S-transferase P1 (GSTP1), responsible for the detoxification of these pro-apoptotic agents (Cumming RC et al. Nat Med ( 2001 Jul) 7 (7): 814-20 Comment in: Nat Med. (2001 Dec) 7 (12): 1259-60; Pagano G.
  • oxidative stress has been described as one of the potential etiological factors of psoriasis with in particular an increase in antioxidant activity in the disease (Shilov VN, Sergienko VI. Bull Exp Biol Med (2000 Apr) 129 (4): 309-13). FANCC could therefore play a role in the mechanism involving oxidative stress in the disease.
  • FANCC plays a role in cell proliferation (Nadler JJ, Braun RE. Genesis (2000 Jul) 27 (3): 117-23; Haneline LS, Gobbett TA, Ramani R et al. Blood (1999 Jul) 1; 94 (1): 1-8).
  • DAD1 plays a role in apoptosis (Hong NA et al. Dev Biol (2000 Apr) 1; 220 (1): 76-84; Nakashima T et al. Mol Cell Biol (1993 Oct) 13 (10): 6367- 74), and modulates the proliferation of T lymphocytes (Hong NA et al. J Immunol (1999 Aug) 15; 163 (4): 1888-93), which are important cells in the pathophysiology of psoriasis (Krueger JG, J Am Acad Dermatol (2002 Jan) 46 (1): 1-23; quiz 23-6).
  • GRIM19 is a modulator of apoptosis induced by interferon-beta and retinoic acid (Angell JE, Lindner DJ, Shapiro PS et al. J Biol Chem (2000 Oct) 27; 275 (43): 33416-26) .
  • HADHII hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type II
  • SDR short-chain dehydrogenases / reductases
  • HADHII is also involved in apoptosis and cell proliferation. Indeed, HADHII binds the amyloid peptide A-beta, which exerts regulatory effects on apoptosis. In addition, the amyloid A-beta seems to modulate cell proliferation, since its expression is associated with a senescent state of the cells (Adler MJ., Coronel C, Shelton E. Proc Natl Acad Sci USA (1991 Jan) 1; 88 ( 1): 16-20).
  • the present invention relates to the use of at least one polynucleotide probe relating to the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII gene as defined above for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis by measuring the level of d expression, respectively, of the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII gene.
  • the present invention also relates to the use of at least one polynucleotide probe relating to the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII gene as defined above for the identification of a compound intended for the treatment of psoriasis.
  • the polynucleotide probe relating to the FANCC gene is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the simple cDNA probe strand of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4.
  • the polynucleotide probe relating to the DAD1 gene is a fragment of 10 to 500 pairs of bases representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 6 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 7 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 8.
  • the polynucleotide probe relating to the GRIM19 gene is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the simple cDNA probe strand of sequence SEQD. ID. n ° 10 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 11 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 12.
  • the relative polynucleotide probe having the HADHII gene is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the simple cDNA probe strand of SED sequence. ID. n ° 14 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 15 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 16.
  • polynucleotide probe according to the invention will be used in the method described below.
  • the invention thus relates to a method of identifying a compound intended for the treatment of psoriasis comprising the following steps: a) preparation of at least two biological samples; b) bringing one of the samples into contact with one or more compounds to be tested; c) measuring the quantity of messenger RNA corresponding to the FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII gene in the biological samples using at least one polynucleotide probe, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part, respectively, of the FANCC gene (no.
  • GRIM19 and / or HADHII or the expression of the corresponding proteins is measured in the sample treated in step b).
  • Modulation of the transcription of a gene or the expression of the corresponding proteins is understood to mean an increase or a decrease in the quantity of messenger RNA or of the protein corresponding to said gene in a test sample.
  • step c) of the method can be implemented with: - a polynucleotide probe relating to the FANCC gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, d homology with the single-strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4;
  • a polynucleotide probe relating to the DAD1 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 6 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 7 or with the sequence RNA probe
  • a polynucleotide probe relating to the GRIM19 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 10 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 11 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 12; a relative polynucleotide probe having the HADHII gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 14 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. # 15 or with the RNA sequence probe
  • the measurement of the expression of the gene (s) FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII in a biological sample can be carried out using the technology of cDNA filters ("Arrays") on nylon support, according to which the mRNAs extracted from the biological sample are transcribed into radiolabelled single-stranded cDNAs which are then deposited on cDNA fliters.
  • Arrays cDNA filters
  • the total mRNAs extracted from the biological sample tested can be analyzed according to one of the detection methods known to those skilled in the art (Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Volume I (1989) Second Edition, chapter 7) as the technique of hybridization by Northern-Blot using a denatured double stranded cDNA probe.
  • the labeling of the probe may comprise a cycle of synthesis of double-stranded cDNA, from the total mRNAs extracted from the biological sample, coupled to an in vitro transcription in the presence of biotinylated ribonucleotides, generating Complementary labeled RNAs, these labeled antisense RNAs serving as a probe during hybridization on a DNA chip (Affymetrix, Gene Expression Monitoring, Technical Note; US 5,716,785, US 5,891,636, US 6,291,170).
  • the present invention relates to the use of at least one polypeptide probe relating to the FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII gene as defined above for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis of a sample biological by measuring the level of expression, respectively, of the FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII gene.
  • the present invention also relates to the use of at least one polypeptide probe relating to the FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII gene as defined above for the identification of a compound intended for the treatment psoriasis.
  • the present invention also relates to a method for identifying a compound intended for the treatment of psoriasis comprising the following steps: a) preparation of at least two biological samples; b) bringing one of the samples into contact with one or more compounds to be tested; c) measuring the quantity of protein produced by the expression of at least one gene chosen from FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII in biological samples using at least one polypeptide probe , said probe being a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression, respectively, of the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII gene, or against a biologically active fragment of said protein, or also against a homologous polypeptide, modified or variant of wild protein; d) selection of said compounds for which a modulation of the expression of said protein or proteins is measured in the sample treated in step b).
  • the present invention relates to a research tool comprising a polynucleotide probe, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the FANCC gene (accession number NM 000136.1) or DAD1 (accession number NM 001344.1) or GRIM19 (accession number NM 015965.3) or HADHII (accession number NM 004493.1).
  • the polynucleotide probe is:
  • a polynucleotide probe relating to the FANCC gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4;
  • a polynucleotide probe relating to the DAD1 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 6 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 7 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 8;
  • a polynucleotide probe relating to the GRIM19 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 10 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 11 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 12; a relative polynucleotide probe having the HADHII gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 14 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 15 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 16.
  • the present invention also relates to a research tool comprising a polypeptide probe, said probe being a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene, or against a biologically fragment active of said protein, or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • the research tool may also allow the analysis of the effects of certain treatments on the expression of these marker genes for psoriasis, such as FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII, or the mutation analysis of the sequence of these genes in individuals with psoriasis.
  • the research tool may also allow the analysis of the expression profile of the FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII gene in the cells constituting the epidermis, in particular the keratinocytes, for example according to their state of proliferation or differentiation.
  • the search tool may also allow constitutive expression, overexpression or inhibition of expression of the FANCC and / or DAD1 and / or GRIM19 and / or HADHII gene, according to in vitro or in vivo tests known to the skilled in the art.
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used, for example in a hybridization test by
  • FANCC FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII or of a homologous, variant, modified or partial sequence, in cells constituting the epidermis, in particular keratinocytes, expressing in vitro at least one gene chosen from FANCC, DAD1,
  • GRIM19 and HADHII for example depending on the state of differentiation or proliferation of cells.
  • said expression can be constitutive or even inducible, the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII gene being able to be placed under the control of a constitutive promoter such as the SV40 or CMV promoter, or of an inducible promoter such as the system Tet Off Gene Expression
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used, for example in a hybridization test by Northern blot, or even in an amplification test by PCR (“Polymerase Chain Reaction”), to follow the expression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene or of a homologous, variant, modified or partial, in the cells constituting the epidermis of a strain of laboratory animals, in particular in keratinocytes, overexpressing said gene or sequence in vivo, for example under the control of a promoter specifically activated in the epidermis, such as the promoters of Keratin K14, K15 or Involucrine, for example depending on the state of differentiation or proliferation of the cells.
  • a promoter specifically activated in the epidermis such as the promoters of Keratin K14, K15 or Involucrine, for example depending on the state of differentiation or proliferation of the cells.
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used for the analysis, for example by Southern blotting, of an inactivation by deletion of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene, for example in constituent cells.
  • epidermis in particular keratinocytes, cultured in vitro or even in vivo in the cells of a strain of laboratory animals.
  • This inactivation can be carried out according to conventional techniques of homologous recombination.
  • the polynucleotide probe according to the invention can be used to draw and synthesize siRNAs, according to techniques known to those skilled in the art (Tuschl T, Borkhardt A, Mol Interv (2002) Jun ; 2 (3): 158-67).
  • These antisense RNAs can be used for the inhibition of the expression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene, for example in a line of constituent cells of the epidermis, in particular keratinocytes, in vitro, or even in vivo, for example in a strain of laboratory animals.
  • the research tool may also allow analysis of the effects of certain treatments on the expression of these psoriasis marker genes, or analysis of the mutation in the sequence of these genes in individuals suffering from psoriasis.
  • this search tool could be such that the probe or probes that it comprises, are brought into contact with the corresponding target sequence (s) deposited on a support such as a filter in nylon.
  • the probe can also be used in a hybridization test (for example a mismatch detection test), sequencing, microsequencing.
  • the probe according to the invention may be associated with another detectable probe, the nature of which may preferably be fluorescent, radioactive or enzymatic.
  • This characteristic can make it possible, among other things, to track the location of the probe, from the extracellular medium to the cell, or from the cytoplasm to the nucleus, or else to specify its interaction with DNA, or RNA or proteins.
  • detectable probe is best suited as a function of the characteristic that they want to be able to follow.
  • the polypeptide probe according to the invention can be used for immunolabelling of the target polypeptide as defined above, on tissue, according to conventional techniques known to those skilled in the art, for example on section of epidermis of laboratory animals, for example animals exhibiting an overexpression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII protein or of a homologous, variant, modified or active fragment of said protein, or even in vitro on cells constituting the epidermis, in particular keratinocytes, which may be the subject of an overexpression of the protein or of said polypeptide, or else of an inhibition of this expression, for example by the use of siRNA as envisaged previously.
  • the polypeptide probe can also be used to purify said protein or said polypeptide, for example according to immunoprecipitation techniques conventionally known to those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for characterizing skin samples to determine predisposition to psoriasis.
  • the Applicant has demonstrated that the expression of the FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII genes is induced in psoriatic lesional skin with a plaque of psoriasis, compared to healthy skin (average expression measured in 13 psoriatic subjects and 10 healthy subjects). The results obtained are presented in Table 1.
  • Measuring the expression of one of the genes, and preferably the four, FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII makes it possible to characterize lesional psoriatic skin independently of the type and location of the psoriasis plaque (Tables 2 and 3 ).
  • Table 2 shows the expression of the FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII genes relative to an average expression in healthy subjects, in patients with predominantly trunk and asymmetric plaques.
  • Table 3 represents the expression of the FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII genes relative to an average expression in healthy subjects, in patients presenting mainly symmetrical plaques.
  • the invention also relates to a method for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis comprising a step of measuring the overexpression in a biological sample of at least one of the FANCC, DAD1, GRIM19 or HADHII genes by putting in contact with at least one polynucleotide probe with the target sequences isolated from said biological sample, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the FANCC gene (NM accession number 000136.1) or DAD1 (NM accession number 001344.1) or GRIM19 (NM accession number 015965.3) or HADHII (NM accession number 004493.1).
  • polynucleotide probe is:
  • a polynucleotide probe relating to the FANCC gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4;
  • a polynucleotide probe relating to the DAD1 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. # 6 or with the double cDNA probe strand of sequence SEQ. ID. n ° 7 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 8;
  • a polynucleotide probe relating to the GRIM19 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 10 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 11 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 12;
  • a relative polynucleotide probe having the HADHII gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 14 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 15 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 16.
  • the invention also relates to a method for diagnosing psoriasis or a predisposition to psoriasis comprising a step of measuring the overexpression in a biological sample of the protein produced by the expression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene by contacting a polypeptide probe such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression, respectively, of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene, or against a biologically active fragment of said protein, or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • a polypeptide probe such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression, respectively, of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene, or against a biologically active fragment of said protein, or against a homologous, modified or variant polypeptide
  • overexpression of a gene in a biological sample is meant a higher expression of the messenger RNA or of the protein corresponding to this gene in this sample compared to a healthy reference sample.
  • the invention also relates to a diagnostic kit comprising at least one polynucleotide or polypeptide probe relating to at least one of the FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII genes.
  • the object of the present invention therefore relates to a diagnostic kit comprising at least one polynucleotide probe, said probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the FANCC gene (accession number NM 000136.1) and / or DAD1 (accession number NM 001344.1) and / or GRIM19 (accession number NM 015965.3) and / or HADHII (accession number NM 004493.1).
  • said polynucleotide probe of the diagnostic kit is:
  • a polynucleotide probe relating to the FANCC gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the sequence RNA probe
  • a polynucleotide probe relating to the DAD1 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 6 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 7 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 8;
  • a polynucleotide probe relating to the GRIM19 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 10 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 11 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 12;
  • a relative polynucleotide probe having the HADHII gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. # 14 or with the double cDNA probe strand of sequence SEQ. ID. n ° 15 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 16.
  • the subject of the present invention also relates to a diagnostic kit comprising at least one polypeptide probe such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene, or against a biologically active fragment of said protein, or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • a polypeptide probe such as a monoclonal or polyclonal antibody specifically directed against the wild-type protein resulting from the expression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene, or against a biologically active fragment of said protein, or against a homologous, modified or variant polypeptide of the wild-type protein.
  • FANCC FANCC
  • DAD1 DAD1
  • GRIM19 HADHII
  • Another object of the present invention relates to the use of a polynucleotide probe or one of its analogues, complementary, respectively, to the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene to modulate, respectively, the expression of the FANCC or DAD1 or GRIM19 or HADHII gene.
  • the polynucleotide probe may be an antisense RNA or a siRNA which has the role of inhibiting the expression of a specific gene (Fire A., Trends in Genetic (1999) 15: 358-363).
  • the polynucleotide probe is:
  • a polynucleotide probe relating to the FANCC gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 4;
  • a polynucleotide probe relating to the DAD1 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 8;
  • a polynucleotide probe relating to the GRIM19 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 12;
  • RNA probe having the HADHII gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 16.
  • the invention also relates to the use of at least one polynucleotide probe having a sequence of 10 to 500 base pairs and being at least 80% complementary with a target sequence corresponding to all or part of the FANCC gene ( accession number NM 000136.1) and / or DAD1 (accession number NM 001344.1) and / or GRIM19 (accession number NM 015965.3) and / or HADHII (accession number NM 004493.1) for manufacturing of a pharmaceutical composition intended for the treatment of psoriasis.
  • the polynucleotide probe may more particularly be:
  • a polynucleotide probe relating to the FANCC gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 2 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 3 or with the sequence RNA probe
  • a polynucleotide probe relating to the DAD1 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 6 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 7 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 8; a polynucleotide probe relating to the GRIM19 gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 10 or with the double stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 11 or with the sequence RNA probe
  • a relative polynucleotide probe having the HADHII gene which is a fragment of 10 to 500 base pairs representing at least 80%, and preferably at least 90%, of homology with the single-stranded cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 14 or with the double strand cDNA probe of sequence SEQ. ID. n ° 15 or with the RNA probe of sequence SEQ. ID. # 16.
  • a clinical study carried out in the presence of healthy volunteers and patients suffering from chronic vulgar plaque psoriasis has made it possible to demonstrate the involvement of the genes FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII in psoriasis.
  • Skin biopsies are taken from healthy volunteers, as well as from psoriasis plaques and non-lesional areas that appear clinically healthy, from patients with psoriasis.
  • the presence or absence of psoriasis on the area of biopsied skin, as well as the severity of the psoriasis plaque, are determined by the evaluation of local clinical parameters (erythema, scaling and plaque elevation scores). psoriasis).
  • the analysis of gene expression is then carried out from each individual biopsy.
  • the comparison of the gene profiles corresponding to healthy skin and psoriatic non-lesional and lesional skin, makes it possible to identify genes whose expression is induced in the disease.
  • the determination of gene profiles is based on the hybridization of a probe single-stranded cDNA complex (generated by reverse transcription of mRNAs from each skin biopsy) onto cDNA fragments of interest, which are deposited on a support such as a nylon filter.
  • the hybridization signals obtained are proportional to the quantity of each labeled cDNA in the probe and reflect the level of expression of each mRNA in the analyzed skin sample (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1; 29 (1): 207-16).
  • Filters developed by the Applicant, specific to dermatology have been developed. These filters are made up of 474 cDNAs involved in the physiological processes of human skin. In parallel, commercial filters with 4200 human cDNAs (Invitrogen GF211) were used. These cDNA filters will make it possible to determine the expression of genes of interest in healthy skin as well as in non-lesional and lesional skin of patients suffering from chronic vulgar plaque psoriasis.
  • the measurement of gene expression in healthy skin and in psoriatic skin is carried out using the technology of cDNA filters (“arrays”) on nylon support.
  • the radiolabelled cDNA probes are generated by reverse transcription of the total RNAs (Invitrogen protocol), isolated from the different biopsies taken from 10 healthy volunteers and 13 subjects suffering from chronic plaques of vulgar psoriasis (RNEasy protocol, Qiagen).
  • the hybridization signals obtained are proportional to the quantity of each labeled cDNA present in the probe, which hybridizes on the cDNA which is complementary to it on the filter and thus reflect the transcriptional activity of the mRNAs in the biopsies analyzed.
  • the hybridization signals are measured by phospholuminescence, then quantified using the image analysis software Imagen (Biodiscovery).
  • Imagen image analysis software
  • the background noise linked to non-specific hybridization is measured on each filter on virgin areas of cDNA deposition (GF211 filters), or within a surrounding crown. each spot (dedicated filters).
  • a detection threshold making it possible to discriminate a measurement pertaining to a real signal or noise, is automatically determined for each filter using the method described previously by Fogel et al., 2002.
  • the hybridization signals are normalized by the median of the set of signals obtained for each biopsy (filters GF211), or by the expression of an RNA. exogenous messenger, serving as a reference, the expression of which is invariant between the samples analyzed.
  • This exogenous transcript is added in constant quantity to the total RNA preparations from the different samples, before synthesis of the radiolabelled cDNA probe.
  • the target sequence of this exogenous transcript is deposited on each filter.
  • an average reference expression is determined on all the biopsies of healthy subjects, then subtracted from the expression obtained in each biopsy of non-lesional and lesional psoriatic skin (values in log). The ratio between the expression of each gene in psoriatic skin compared to healthy skin is then obtained by taking the base 10 exponential of the value calculated previously (Tables 1 to 4).
  • Tables 2 and 3 indicate that these overexpressions are observed whatever the predominant type of plaques expressed in the patient (symmetrical or truncated) and also independently of the location of the psoriasis plaques.
  • the abbreviations mentioned in these tables represent the location of the biopsies taken from the body for each psoriatic subject (SP) and have the following signifi cation: JG: left leg, JD: right leg, BD: right arm, BG: left arm , T: trunk.
  • the different local clinical scores used to define the presence or absence of psoriasis on the biopsied skin area, as well as the severity of the psoriasis plaque, are the erythema, scaling and plaque elevation scores. These scores are conventionally measured using the following rankings:
  • the measurement of erythema is done using the following classification:
  • the plate elevation is measured using the following classification:
  • the results of table 4 made it possible to demonstrate at the molecular level, an overexpression of the genes FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII in certain non-lesionne psoriatic skin.
  • the measurement of the expression of the FANCC, DAD1, GRIM19 and HADHII genes therefore makes it possible to carry out a very early diagnosis of psoriasis, since the expression of these genes makes it possible to differentiate at the molecular level non-lesionneile skins already affected, while the clinical signs do not allow it.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation des sondes relatives aux gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII pour la caractérisation d'un échantillon biologique. L'invention a également pour objet l'utilisation de ces sondes pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis, un procédé d'identification ainsi qu'un nouvel outil de recherche.

Description

GENES FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII DU PSORIASIS
La présente invention a pour objet l'utilisation des sondes relatives aux gènes FANCC, DAD1 GRIM19 et HADHII pour la caractérisation d'un échantillon biologique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de ces sondes pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis, un procédé d'identification ainsi qu'un nouvel outil de recherche.
Le psoriasis est une pathologie dermatologique fréquente qui touche de 3 à 5% de la population européenne. Le psoriasis est couramment associé à d'autres pathologies, telles que l'hypertension, l'arthrite, ou encore le SIDA (Farber EM, Nall L, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapitre 9:107-157; Duvic M., J Invest Dermatol (1990 Nov);95(5):38S-40S).
Sur la base de l'âge d'apparition des symptômes et de l'association avec certains gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type I (CMH I), le psoriasis a été classé en deux sous-types appelés I et II (Henseler T, Christophers E, In Roenigk HH, Maibach Hl (Eds.): Psoriasis Third Edition, Revised and Expanded (1998), chapitre 10:159-166). Des études ont également montré que 30 à 50% des patients atteints de psoriasis ont un antécédent familial chez un des parents du 1er ou 2e degré. Ces observations ont permis de suggérer que le psoriasis est une maladie génétique avec une composante autoimmune (Bos, Br. J. Dermatol. (1988) 118:141; Baadsgaard et al., J. Invest. Dermatol. (1990) 95:328).
Les principales composantes physiopathologiques du psoriasis incluent une hyperprolifération associée à une différenciation anormale des kératinocytes de l'épiderme, une inflammation caractérisée par un infiltrat inflammatoire (principalement de lymphocytes T helpers activés) au niveau du derme et de l'épiderme et par le relargage de cytokines pro-inflammatoires, et enfin une vascularisation anormale du derme (Krueger JG, J Am Acad Dermatol (2002 Jan);46(1):1-23; quiz 23-6).
L'implication du processus inflammatoire dans la physiopathologie du psoriasis est soutenue par le mécanisme d'action de certains agents ayant un effet thérapeutique bénéfique pour la maladie. Par exemple, la cyclosporine utilisée dans le traitement des formes sévères de psoriasis, exerce un effet inhibiteur sur la synthèse de l'interleukine-2, cytokine promouvant la prolifération des lymphocytes T et la sécrétion des cytokines inflammatoires par ces cellules. Par conséquent, les modulateurs de l'inflammation permettent de limiter la composante inflammatoire caractérisant en partie le psoriasis. Cliniquement, le psoriasis se définit par une hyperplasie de l'épiderme, ainsi que par une desquamation, un érythème et une inflammation cutanés.
Les méthodes actuellement disponibles pour le traitement incluent la thérapie topique, la photothérapie, la photo-chimiothérapie et la thérapie systémique, réservée aux formes plus sévères de la maladie. Néanmoins, ces thérapies offrent uniquement des périodes de rémission aux patients, mais la pathologie resurgit généralement après l'arrêt du traitement. Les giucocortico'ides administrés par voie topique sont le plus généralement prescrits dans le traitement initial du psoriasis, et exercent des effets antiinflammatoires, antimitotiques et antipruritiques bénéfiques. Le goudron brut de charbon est un mélange complexe de milliers de composés d'hydrocarbure. Son effet thérapeutique est lié à l'inhibition d'enzymes et à des propriétés antimitotiques. Bien qu'efficace, ce traitement est, de par son odeur, désagréable à utiliser pour le patient et peut induire des cancers cutanés. La photothérapie et photo-chimiothérapie basées sur l'administration du methoxsalen, principe actif photosensibilisant, sont seulement temporairement efficaces. Le traitement doit être répété et offre une thérapie palliative, mais non curative. De plus, ces traitements ont des effets secondaires à long terme, notamment des altérations immunologiques et un risque accru de carcinogenèse. Le methotrexate est l'agent cytotoxique systémique le plus généralement administré pour les formes sévères de psoriasis s'étendant sur une surface importante du corps. Les contre-indications de ce traitement sont nombreuses et l'arrêt du traitement peut s'accompagner d'une aggravation des symptômes. L'hydroxyurée, l'etretinate, la cyclosporine, et l'AZT sont également les médicaments systémiques utilisés pour lutter contre le psoriasis mais tous ont des effets secondaires sérieux.
A ce jour, aucun traitement ne permet une rémission durable de cette pathologie sans engendrer des effets secondaires importants, car le psoriasis est une pathologie complexe d'origine multifactorielle. La compréhension du mécanisme physiopathologique conduisant au phénotype psoriasique demeure donc un défi important dans le traitement médical dermatologique. En effet, beaucoup d'aspects de la maladie restent à élucider, comme par exemple la réponse hétérogène à certains traitements, de patients présentant des signes cliniques semblables.
L'apoptose, est un phénomène de mort cellulaire (décrit entre autres par KERR J.F.R. et al., J. Cancer (1972), 265, 239) qui est une forme hautement sélective de suicide cellulaire. Elle se caractérise par des phénomènes morphologiques et biochimiques aisément observables. Ainsi, on observe une condensation de la chromatine associée ou non à une activité endonucléasique, la formation de corps apoptotiques et une fragmentation de l'acide désoxyribonucléique (ADN) du fait de l'activation d'endonucléases, en fragments d'ADN de 180-200 paires de base donnant un profil facilement reconnaissable par électrophorèse sur gel d'agarose. L'apoptose est impliquée dans le développement, la différenciation et le renouvellement tissulaire.
Au vu des connaissances du processus physiologique d'apoptose cellulaire, rien ne permet à l'homme du métier de déduire une quelconque implication de celle-ci dans le dérèglement physiologique menant au phénotype psoriasique.
L'analyse de l'expression génique dans la peau de patients psoriasiques constitue une voie pour mieux comprendre le mécanisme physiopathologique de cette maladie (Bowcock AM, Shannon W, Du F, et al., Hum Mol Genêt (2001); 10(17): 1793-805 ; Oestreicher JL, Walters IB, Kikuchi T, et al., Pharmacogβnomics J (2001 ); 1 (4):272-87). La technologie des filtres à ADNc (« arrays ») (NGuyen C, Rocha D, Granjeaud S, et al., Genomics (1995)) est une des technologies permettant d'analyser simultanément et rapidement l'expression de plusieurs centaines d'ARNm à partir d'une biopsie cutanée prélevée chez le patient, par opposition à d'autres technologies plus lourdes à mettre en œuvre, comme le SAGE (« Sériai Analysis of Gène Expression ») (Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW, Science (1995 Oct) 20;270(5235):484-7), ou le Differential Display (Liang P, Pardee AB, Science (1992); 257: 967-971 ; Zhang L, ét al., Science (1997); 276: 1268-1272).
La Demanderesse a mis en évidence de nouveaux gènes marqueurs du psoriasis.
La présente invention a pour objet des sondes relatives aux gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII pour la caractérisation d'un échantillon biologique, et également un nouvel outil de caractérisation d'un composé destiné au traitement du psoriasis, ainsi qu'un nouvel outil de recherche.
En particulier, l'invention se rapporte à l'utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique relative, respectivement, au gène FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie, respectivement, du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1 ), DAD1 (n° d'accession NM 001344.1 ), GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3), ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1) comme outil de recherche du psoriasis.
L'utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique selon l'invention permet notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII.
Selon la présente invention, un échantillon biologique correspond à tout prélèvement ou échantillon d'organisme vivant, de préférence un mammifère, en particulier un organisme humain, en quantité suffisante pour être caractérisé. On peut citer comme échantillon biologique, à titre d'exemple non limitatif, un échantillon de peau, de cuir chevelu, de muqueuse, ou cellulaire.
Selon la présente invention, la caractérisation d'un échantillon biologique consiste à mesurer le niveau d'expression d'un gène d'intérêt, c'est à dire plus précisément la quantité d'ARN messager ou de protéine correspondante à ce gène qui est présente dans l'échantillon biologique.
Par sonde polynucléotidique, on entend un oligo- ou polynucléotide simple ou double brin, d'ARN, ou ADN, dont la séquence est complémentaire d'une séquence cible correspondant à une partie ou à la totalité dudit gène et pouvant aller de 10 à classiquement 500 paires de bases et dont la séquence est complémentaire avec la séquence cible à au moins 80% et préférentiellement d'au moins 90% (pourcentage de bases d'acide nucléiques appariées entre deux séquences, voir les méthodes de calcul proposées par Atschul et al. J. Molec. Biol. (1990), 215:403).
Les sondes polynucléotidiques pourront également présenter un squelette modifié lui conférant, par exemple, une meilleure stabilité.
Par exemple, les liaisons phosphodiesters des brins d'ARN naturels peuvent être modifiées pour inclure au moins un atome d'azote ou de soufre. Par ailleurs, les sondes polynucléotidiques pourront être modifiées de telle sorte que leurs liaisons phosphodiesters sont remplacées par des séquences de type peptidique (peptide nucleic acids).
De plus, les sondes polynucléotidiques selon l'invention peuvent comprendre des bases autres que les 4 bases classiques. Les sondes polynucléotidiques selon l'invention peuvent être synthétisées selon de nombreuses méthodes de synthèse in vivo ou in vitro de façon manuelle ou automatique.
Les méthodes de synthèse in vitro peuvent être chimiques ou enzymatiques. Par exemple, une sonde d'ARNc simple brin peut-être obtenue par transcription in vitro d'un modèle de séquence d'ADN d'intérêt servant de matrice, en faisant intervenir une ARN polymérase (à titre d'exemple la T3, T7 ou SP6 ARN polymérase).
Une sonde d'ADNc simple brin peut-être générée par transcription inverse d'un ARNm d'intérêt en présence d'une reverse transcriptase (par exemple la M- MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase isolée d'Escherichia coli).
De nombreuses méthodes de synthèse in vivo d'ARN double brin sont décrites dans la littérature, elles peuvent être réalisées dans divers types cellulaires de bactéries ou d'organismes supérieurs On pourra également se référer aux méthodes de synthèses décrites dans les demandes de brevet WO01/36646 et WO01/75164. Ces ARN double brin peuvent être ensuite dénaturés pour servir de polynucléotide simple brin.
Concernant son environnement, la sonde polynucléotidique peut être ou faire partie d'un plasmide, d'un génome viral ou d'un autre type de vecteur. Elle peut, dans d'autres cas, faire partie du génome d'une cellule, ou bien d'une cellule génétiquement modifiée pour comporter cette sonde dans son génome. Il peut s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant cette sonde, elle est de préférence sous le contrôle de séquences régulatrices. Si la sonde est insérée dans un vecteur, ledit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires à la transcription et éventuellement la traduction de la sonde. Cette sonde peut aussi être entourée par des régions flanquantes permettant une étape de recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique, conduisant éventuellement à l'insertion de la sonde de l'invention dans l'ADN génomique d'une cellule cible.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins une sonde polypeptidique relative au produit d'expression d'un gène choisi parmi FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII comme outil de recherche du psoriasis.
L'utilisation d'au moins une sonde polypeptidique selon l'invention permet notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression du gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII.
Par sonde polypeptidique relative au produit d'expression du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, on entend un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage. Ledit anticorps peut être obtenu selon les procédés connus de l'homme de l'art (Catty D (Ed) : Antibodies, A Practical Approach, Volume I (1989), chapitres 2, 3 et 4 ; ou encore Harlow E. et Lane D. Antibodies, A laboratory Manual (1988), chapitres 6 et 7.) en utilisant ladite protéine sauvage ou ledit polypeptide homologue.
Il pourra, par exemple, s'agir d'anticorps mono- ou polyclonal, ou de leur fragment biologiquement actif capable de reconnaître la protéine codée par le gène d'intérêt. Ces anticorps pourront être marqués, par exemple immuno- conjugués à des enzymes ou marqués à l'aide de composés fluorescents, de la biotine ou encore radiomarqués.
Par polypeptides homologues, on entend des polypeptides dont les séquences en acides aminés présentent au minimum 80%, et préférentiellement 90% d'acides aminés en commun avec la protéine sauvage codée par le gène d'intérêt. Par polypeptide variant, on entend désigner un polypeptide muté ou correspondant à un polymorphisme pouvant exister, notamment chez l'être humain et pouvant présenter une troncature, une substitution, une délétion et/ou une addition d'au moins un acide aminé par rapport à la séquence du polypeptide sauvage normal.
Par polypeptide modifié, on entend désigner un polypeptide obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, présentant une modification par rapport à la séquence sauvage normale. Ces modifications pourront notamment porter sur les domaines pré-, pro- ou mature des polypeptides, sur les acides aminés à l'origine d'une spécificité de spectre ou d'efficacité de l'activité, ou à l'origine de la conformation structurale, de la charge ou de l'hydrophobicité, et de la capacité de multimérisation et d'insertion membranaire des polypeptides. On pourra ainsi créer des polypeptides d'activité équivalente, plus étroite ou plus large. Les modifications pourront aussi porter sur les séquences impliquées dans la maturation, le transport et l'adressage des polypeptides.
Par fragment biologiquement actif d'un polypeptide, on entend désigner un fragment polypeptidique ayant conservé au moins une activité du polypeptide dont il est issu.
Une étude comparative de l'expression génique dans la peau psoriasique par rapport à la peau saine, a permis à la Demanderesse d'identifier quatre gènes, dénommés FANCC (Fanconi anémia, complémentation group C), référence Genbank (NCBI): NM_000136.1 , DAD1 (Defender against cell death 1) référence Genbank (NCBI): NM_001344.1 , GRIM19 (Gène associated with retinoid-interferon-induced mortality 19) référence Genbank (NCBI): NM_015965.3 et HADHII (Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase, type II) référence Genbank (NCBI): NM_004493.1 , dont l'activité transcriptionnelle est induite dans la peau malade. Ces gènes sont impliqués dans la régulation de l'apoptose et en partie également dans la régulation de la prolifération cellulaire.
FANCC régule l'apoptose cellulaire induite par l'interféron gamma (Pang Q, et al. EMBO J (2001 Aug) 15;20(16):4478-89; Rathbun RK et al. Blood (2000 Dec) 15; 96(13):4204-11 Comment in: Blood. (2002 Apr) 1 ;99(7):2627-8; discussion 2629-30) et le TNF alpha (Pang Q, et al. EMBO J (2001 Aug) 15; 20(16):4478- 89), qui sont deux cytokines dont l'expression est augmentée dans le psoriasis (Chodorowska G. J Eur Acad Dermatol Venereol (1998 Mar) 10(2):147-51 ; Uyemura K, Yamamura M, Fivenson DF et al. J Invest Dermatol (1993 Nov) 101(5):701-5). FANCC régule également l'apoptose induite par un stress oxydatif ou certains xenobiotiques en modulant l'activité de la gluthatione-S- transferase P1 (GSTP1 ), responsable de la détoxification de ces agents pro- apoptotiques (Cumming RC et al. Nat Med (2001 Jul) 7(7):814-20 Comment in: Nat Med. (2001 Dec) 7(12):1259-60; Pagano G. Carcinogenesis (2000 May) 21 (5):1067-8). Or, le stress oxydatif a été décrit comme un des facteurs étiologiques potentiels du psoriasis avec notamment une augmentation de l'activité anti-oxydante dans la maladie (Shilov VN, Sergienko VI. Bull Exp Biol Med (2000 Apr) 129(4):309-13). FANCC pourrait donc jouer un rôle dans le mécanisme impliquant le stress oxydatif dans la maladie.
De plus, FANCC joue un rôle dans la prolifération cellulaire (Nadler JJ, Braun RE. Genesis (2000 Jul) 27(3):117-23; Haneline LS, Gobbett TA, Ramani R et al. Blood (1999 Jul) 1 ;94(1 ):1-8).
DAD1 joue un rôle dans l'apoptose (Hong NA et al. Dev Biol (2000 Apr) 1;220(1 ):76-84; Nakashima T et al. Mol Cell Biol (1993 Oct) 13(10):6367-74), et module la prolifération des lymphocytes T (Hong NA et al. J Immunol (1999 Aug) 15;163(4): 1888-93), qui sont des cellules importantes dans la physiopathologie du psoriasis (Krueger JG, J Am Acad Dermatol (2002 Jan) 46(1 ):1-23; quiz 23-6). GRIM19 est un modulateur de l'apoptose induite par l'interféron-beta et l'acide rétinoïque (Angell JE, Lindner DJ, Shapiro PS et al. J Biol Chem (2000 Oct) 27;275(43):33416-26).
HADHII, hydroxyacyl-CoA dehydrogenase de type II, fait partie de la famille des short-chain dehydrogenases/reductases (SDR) (Oppermann UC, Salim S et al. FEBS Lett (1999 May) 28;451(3):238-42). HADHII est également impliquée dans l'apoptose et la prolifération cellulaire. En effet, HADHII lie le peptide amyloide A-beta, qui exerce des effets régulateurs sur l'apoptose. De plus, l'amyloide A-beta semble moduler la prolifération cellulaire, puisque son expression est associée à un état sénescent des cellules (Adler MJ., Coronel C, Shelton E. Proc Natl Acad Sci U S A (1991 Jan) 1 ;88(1):16-20).
En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII telle que définie ci-dessus pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis par la mesure du niveau d'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
Dans un premier mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique relative au gène FANCC est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8.
Dans un troisième mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQD. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12.
Dans un quatrième mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SED. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la sonde polynucléotidique selon l'invention sera utilisée dans le procédé décrit ci-dessous.
L'invention se rapporte ainsi à un procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité d'ARN messager correspondant au gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII dans les échantillons biologiques à l'aide d'au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie, respectivement, du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1) et/ou DAD1 (n° d'accession NM 001344.1) et/ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) et/ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1 ) ; d) sélection desdits composés pour lesquels une modulation de la transcription des ARN messagers du gène FANCC et/ou DAD1 et/ou
GRIM19 et/ou HADHII ou de l'expression des protéines correspondantes est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
On entend par modulation de la transcription d'un gène ou de l'expression des protéines correspondantes, une augmentation ou une diminution de la quantité d'ARN messagers ou de la protéine correspondant audit gène dans un échantillon testé.
En particulier, l'étape c) du procédé pourra être mise en œuvre avec : - une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ; - une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°16.
Selon le mode de réalisation donné dans l'exemple 1 , la mesure de l'expression du ou des gènes FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII dans un échantillon biologique peut être réalisée en utilisant la technologie des filtres à ADNc (« arrays ») sur support nylon, selon laquelle les ARNm extraits de l'échantillon biologique sont transcrits en ADNc simple brin radiomarqués qui sont ensuite déposés sur des flitres à ADNc.
Selon un autre mode de réalisation possible, les ARNm totaux extraits de l'échantillon biologique testé peuvent être analysés selon l'une des méthodes de détection connues de l'homme de l'art (Sambrook et al. : Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Volume I (1989) Second Edition, chapitre 7) comme la technique d'hybridation par Northern-Blot utilisant une sonde cDNA double brin dénaturée.
Selon un autre mode de réalisation possible, le marquage de sonde peut comprendre un cycle de synthèse d'ADNc double brin, à partir des ARNm totaux extraits de l'échantillon biologique, couplé à une transcription in vitro en présence de ribonucleotides biotinylés, générant des ARN complémentaires marqués, ces ARN antisens marqués servant de sonde lors de l'hybridation sur une puce à ADN (Affymetrix, Gène Expression Monitoring, Technical Note ; US 5 716 785, US 5 891 636, US 6 291 170).
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins une sonde polypeptidique relative au gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII telle que définie ci-dessus pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression, respectivement, du gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins une sonde polypeptidique relative au gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
La présente invention se rapporte aussi à un procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité de la protéine produite par l'expression d'au moins un gène choisi parmi FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII dans les échantillons biologiques à l'aide d'au moins une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage ; d) sélection desdits composés pour lesquels une modulation de l'expression de la ou lesdites protéines est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à un outil de recherche comprenant une sonde polynucléotide, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1) ou DAD1 (n° d'accession NM 001344.1) ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1). En particulier, la sonde polynucléotidique est :
. - une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ; - une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
La présente invention se rapporte aussi à un outil de recherche comprenant une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonai ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage. L'outil de recherche pourra en outre permettre l'analyse des effets de certains traitements sur l'expression de ces gènes marqueurs du psoriasis, tels que FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII, ou l'analyse de mutation de la séquence de ces gènes chez des individus atteints de psoriasis.
L'outil de recherche pourra également permettre l'analyse du profil d'expression du gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII dans les cellules constituant l'épiderme, en particulier les kératinocytes, par exemple en fonction de leur état de prolifération ou de différenciation. L'outil de recherche pourra également permettre l'expression constitutive, la surexpression ou l'inhibition de l'expression du gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII, selon des tests in vitro ou in vivo connus de l'homme de l'art.
Par exemple, selon un outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée, par exemple dans un test d'hybridation par
Northem-blot, ou encore dans un test d'amplification par PCR (« Polymérase
Chain Reaction »), pour suivre l'expression d'au moins un gène choisi parmi
FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII ou d'une séquence homologue, variante, modifiée ou partielle, dans des cellules constituant l'épiderme, en particulier des kératinocytes, exprimant in vitro au moins un gène choisi parmi FANCC, DAD1 ,
GRIM19 et HADHII, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de prolifération des cellules. En particulier, ladite expression peut être constitutive ou encore inductible, le gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII pouvant être placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif tel que le promoteur SV40 ou CMV, ou d'un promoteur inductible tel que le système Tet Off Gène Expression
System (Invitrogen), sont utilisées les techniques classiques de génie génétique et de transfection (Gossen M, Bujard H. , Annu Rev Genet.(20Q2) 36:153-73).
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée, par exemple dans un test d'hybridation par Northern-blot, ou encore dans un test d'amplification par PCR (« Polymérase Chain Reaction »), pour suivre l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII ou d'une séquence homoloque, variante, modifiée ou partielle, dans les cellules constituant l'épiderme d'une souche d'animaux de laboratoire, en particulier dans les kératinocytes, surexprimant in vivo ledit gène ou séquence, par exemple sous le contrôle d'un promoteur spécifiquement activé dans l'épiderme, tel que les promoteurs de Kératine K14, K15 ou de l'Involucrine, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de prolifération des cellules.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée pour l'analyse par exemple par Southern-Blot d'une inactivation par délétion du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, par exemple dans des cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des kératinocytes, cultivés in vitro ou encore in vivo dans les cellules d'une souche d'animaux de laboratoire. Cette inactivation peut être réalisée selon les techniques classiques de recombinaison homologue.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon l'invention peut être utilisée pour dessiner et synthétiser des siARN, selon les techniques connues de l'homme de l'art (Tuschl T, Borkhardt A, Mol Interv (2002) Jun;2(3):158-67). Ces ARN antisens peuvent être utilisés pour l'inhibition de l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, par exemple dans une lignée de cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des kératinocytes, in vitro, ou encore in vivo, par exemple dans une souche d'animaux de laboratoire.
L'outil de recherche pourra en outre permettre l'analyse des effets de certains traitements sur l'expression de ces gènes marqueurs du psoriasis, ou l'analyse de mutation de la séquence de ces gènes chez des individus atteints de psoriasis. Par exemple, cet outil de recherche pourra être tel que la ou les sondes qu'il comprend, sont mises en contact avec la ou les séquence(s) cible(s) correspondante(s) déposées sur un support tel qu'un filtre en nylon. La sonde peut encore être utilisée dans un test d'hybridation (par exemple un test de détection de mésappariement), un séquençage, un microséquençage.
Selon d'autres outils de recherche envisagés par la présente invention, la sonde selon l'invention pourra être associée à une autre sonde détectable dont la nature pourra être de préférence fluorescente, radioactive ou enzymatique. Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation de la sonde, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le noyau, ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines. L'homme du métier saura quelle sonde détectable est la mieux adaptée en fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Selon un outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique selon l'invention peut être utilisée pour des immunomarquages du polypeptide cible tel que défini précédemment, sur tissu, selon les techniques classiques connues de l'homme de l'art, par exemple sur coupe d'épiderme d'animaux de laboratoire, par exemple les animaux présentant une surexpression de la protéine FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII ou d'un polypeptide homologue, variant, modifié ou fragment actif de ladite protéine, ou encore in vitro sur des cellules constituant l'épiderme, en particulier des kératinocytes, pouvant être l'objet d'une surexpression de la protéine ou dudit polypeptide, ou encore d'une inhibition de cette expression, par exemple par l'utilisation de siRNA comme envisagé précédemment.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique peut également être utilisée pour purifier ladite protéine ou ledit polypeptide, par exemple selon des techniques d'immunoprécipitation classiquement connues de l'homme de l'art.
Les techniques classiquement connues de l'homme de l'art peuvent être les techniques décrites par Sambrook J, Fritsch EF et Maniatis T dans Molecular Cloning, A Laboratory Manual. La découverte de la surexpression de FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII, dans la peau psoriasique permet d'une part de diagnostiquer le psoriasis, et d'autre part, de développer de nouvelles thérapeutiques basées sur la modulation de l'expression et/ou de la fonction d'un ou plusieurs de ces gènes, pour traiter le psoriasis en agissant sur la composante apoptotique en vue de limiter les désordres de la prolifération cellulaire qui caractérisent en partie le psoriasis.
Dans un aspect particulièrement préférable, la présente invention fournit une méthode pour caractériser des échantillons de peau pour déterminer la prédisposition au psoriasis.
La Demanderesse a démontré que l'expression des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII était induite dans la peau psoriasique lésionnelle présentant une plaque de psoriasis, par rapport à la peau saine (expression moyenne mesurée chez 13 sujets psoriasiques et 10 sujets sains). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1.
La mesure de l'expression de l'un des gènes, et de préférence les quatre, FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII permet de caractériser une peau psoriasique lésionnelle indépendamment du type et de la localisation de la plaque de psoriasis (tableaux 2 et 3). Le tableau 2 représente l'expression des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII relative à une expression moyenne chez les sujets sains, chez les patients présentant majoritairement des plaques au niveau du tronc et des plaques asymétriques. Le tableau 3 représente l'expression des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII relative à une expression moyenne chez les sujets sains, chez les patients présentant majoritairement des plaques de type symétrique.
En outre, hormis la caractérisation d'une peau présentant une plaque de psoriasis par rapport à une peau saine, la découverte de ces nouveaux marqueurs du psoriasis permet également de discriminer une peau de patient psoriasique non lésionnelle (cliniquement saine) mais déjà engagée vers le processus psoriasique, d'une peau non lésionnelle ayant les réelles caractéristiques d'une peau saine.
La Demanderesse a découvert de façon surprenante, que certaines peaux non lésionneiles surexprimaient aussi les gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII. Sur la base de l'expression de ces gènes, le diagnostic du psoriasis est réalisable très précocement puisque l'expression des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII permet de différencier au niveau moléculaire des peaux non lésionneiles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le permettent pas. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 4.
Ainsi l'invention se rapporte également à un procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique d'au moins un des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII par la mise en contact d'au moins une sonde polynucléotidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon biologique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1) ou DAD1 (n° d'accession NM 001344.1) ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1).
En particulier, la sonde polynucléotidique est :
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4 ; - une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
L'invention se rapporte aussi à un procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique de la protéine produite par l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII par la mise en contact d'une sonde polypeptidique telle que un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
Par surexpression d'un gène dans un échantillon biologique, on entend une expression de l'ARN messager ou de la protéine correspondant à ce gène plus élevée dans cet échantillon par rapport à un échantillon sain de référence.
Par ailleurs, l'invention se rapporte aussi à un kit de diagnostic comprenant au moins une sonde polynucléotidique ou polypeptidique relative à au moins un des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII. L'objet de la présente invention se rapporte donc à un kit de diagnostic comprenant au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1) et/ou DAD1 (n° d'accession NM 001344.1) et/ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) et/ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1).
En particulier, ladite sonde polynucléotidique du kit de diagnostic est :
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
L'objet de la présente invention se rapporte aussi à un kit de diagnostic comprenant au moins une sonde polypeptidique telle que un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
Les observations décrites ci-dessus indiquent également que FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII sont des cibles thérapeutiques pour le développement de nouvelles thérapies visant à traiter le psoriasis chronique vulgaire en plaques, quelque soit le type prédominant de plaques chez le patient, et la localisation de la plaque de psoriasis sur le corps.
Ainsi, un autre objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation d'une sonde polynucléotidique ou de l'un de ses analogues, complémentaire, respectivement, au gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII pour moduler, respectivement, l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII.
En particulier, la sonde polynucléotidique pourra être un ARN antisens ou un siRNA qui a pour rôle d'inhiber l'expression d'un gène spécifique (Fire A., Trends in Genetic (1999) 15 : 358-363). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde polynucléotidique est :
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
Enfin, l'invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1) et/ou DAD1 (n° d'accession NM 001344.1) et/ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) et/ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1) pour la fabrication d'une composition pharmaceutique destinée au traitement du psoriasis.
La sonde polynucléotidique pourra plus particulièrement être :
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ; - une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
EXEMPLE 1 - MESURE D'EXPRESSION GENIQUE DANS LA PEAU SAINE ET DANS LA PEAU PSORIASIQUE
Une étude clinique réalisée en présence de volontaires sains et de patients atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques, a permis de mettre en évidence l'implication des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII dans le psoriasis. Des biopsies cutanées sont prélevées chez des volontaires sains, ainsi que sur des plaques de psoriasis et sur des zones non lésionneiles apparaissant cliniquement saines, chez des patients atteints de psoriasis. La présence ou l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiée, ainsi que la sévérité de la plaque de psoriasis, sont déterminées par l'évaluation de paramètres cliniques locaux (scores d'érythème, de desquamation et d'élévation de la plaque de psoriasis).
L'analyse de l'expression génique est ensuite réalisée à partir de chaque biopsie individuelle. La comparaison des profils géniques correspondant à la peau saine et la peau psoriasique non lésionnelle et lésionnelle, permet d'identifier des gènes dont l'expression est induite dans la maladie.
La détermination des profils géniques est basée sur l'hybridation d'une sonde complexe d'ADNc simple brin (générée par la rétro-transcription des ARNm issus de chaque biopsie de peau) sur des fragments d'ADNc d'intérêt, qui sont déposés sur un support tel qu'un filtre en nylon. Les signaux d'hybridation obtenus sont proportionnels à la quantité de chaque ADNc marqué dans la sonde et reflètent le niveau d'expression de chaque ARNm au sein de l'échantillon de peau analysé (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1 ;29(1 ):207-16).
Des filtres élaborés par la Demanderesse, spécifiques à la dermatologie ont été développés. Ces filtres sont constitués de 474 ADNc impliqués dans les processus physiologiques de la peau humaine. En parallèle, des filtres commerciaux à 4200 ADNc humains (Invitrogen GF211) ont été utilisés. Ces filtres d'ADNc vont permettre de déterminer l'expression de gènes d'intérêt dans la peau saine ainsi que dans la peau non lésionnelle et lésionnelle de patients atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques.
Méthode
La mesure de l'expression génique dans la peau saine et dans la peau psoriasique est réalisée en utilisant la technologie des filtres à ADNc (« arrays ») sur support nylon.
Le principe de cette technologie repose sur l'hybridation d'une sonde d'ADNc simple brin radiomarquée sur des fragments d'ADNc cibles déposés à haute densité sur des filtres de nylon (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep) 1 ;29(1):207-16). Dans cette étude, des filtres de nylon (GF211) commercialisés par la société Invitrogen sur lesquels sont déposés 4200 ADNc humains identifiés, ainsi que des filtres dédiés à la dermatologie à 474 ADNc humains, développés par la Demanderesse, sont utilisés. Les sondes d'ADNc radiomarquées sont générées par transcription inverse des ARN totaux (protocole Invitrogen), isolés à partir des différentes biopsies prélevées chez 10 volontaires sains et 13 sujets atteints de plaques chroniques de psoriasis vulgaire (protocole RNEasy, Qiagen). Les signaux d'hybridation obtenus sont proportionnels à la quantité de chaque ADNc marqué présent dans la sonde, qui s'est hybride sur l'ADNc qui lui est complémentaire sur le filtre et reflètent ainsi l'activité transcriptionnelle des ARNm dans les biopsies analysées.
Analyse de normalisation des résultats d'expression gaéniqu et comparaison des profils géniques entre la peau saine et la peau psoriasique
Les signaux d'hybridation sont mesurés par phospholuminescence, puis quantifiés à l'aide du logiciel d'analyse d'image Imagen (Biodiscovery). Afin de discriminer les signaux d'hybridation spécifiques des gènes étudiés, le bruit de fond lié à une hybridation non spécifique est mesuré sur chaque filtre sur des zones vierges de dépôt d'ADNc (filtres GF211), ou au sein d'une couronne entourant chaque spot (filtres dédiés). Après transformation des données en log, un seuil de détection permettant de discriminer une mesure relevant d'un signal réel ou du bruit, est déterminé automatiquement pour chaque filtre en utilisant la méthode décrite précédemment par Fogel et al., 2002.
En vue de comparer les résultats d'expression génique entre les différentes biopsies analysées, les signaux d'hybridation sont normalisés par la médiane de l'ensemble de signaux obtenus pour chaque biopsie (filtres GF211), ou par l'expression d'un ARN messager exogène, servant de référence, dont l'expression est invariante entre les échantillons analysés. Ce transcrit exogène est ajouté en quantité constante dans les préparations d'ARN totaux issues des différents échantillons, avant synthèse de la sonde d'ADNc radiomarquée. La séquence cible de ce transcrit exogène est déposée sur chaque filtre. Pour chaque gène, une expression moyenne de référence est déterminée sur l'ensemble des biopsies de sujets sains, puis soustraite à l'expression obtenue dans chaque biopsie de peau psoriasique non lésionnelle et lésionnelle (valeurs en log). Le ratio entre l'expression de chaque gène dans la peau psoriasique par rapport à la peau saine est alors obtenu en prenant l'exponentielle en base 10 de la valeur calculée précédemment (tableaux 1 à 4).
Les résultats obtenus permettent de mettre en évidence la surexpression des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII dans la peau humaine lésionnelle présentant une plaque de psoriasis par rapport à la peau humaine saine (tableau 1).
Les résultats des tableaux 2 et 3 indiquent que ces surexpressions sont observées quelque soit le type prédominant de plaques exprimées chez le patient (symétrique ou troncal) et également indépendamment de la localisation des plaques de psoriasis. Les abrév ations mentionnées dans ces tableaux représentent la localisation des biops es prélevées sur le corps pour chaque sujet psoriasique (SP) et ont la signifi cation suivante: JG: jambe gauche, JD: jambe droite, BD: bras droit, BG: bras gauche, T: tronc.
Les résultats du tableau 4 montrent que l'expression de ces gènes est également induite dans la peau psoriasique non lésionnelle. Les abréviations ont la même signification que précédemment.
EXEMPLE 2 - MESURES DES PARAMETRES CLINIQUES LOCAUX LIES A LA PLAQUE DE PSORIASIS : SCORES D'ERYTHEME. DE DESQUAMATION ET D'ELEVATION DE LA PLAQUE
Les différents scores cliniques locaux permettant de définir la présence ou l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiee, ainsi que la sévérité de la plaque de psoriasis, sont les scores d'érythème, de desquamation et d'élévation de la plaque. Ces scores sont classiquement mesurés grâce aux classements suivants:
La mesure de l'érythème se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence d'érythème)
1 = léger (légère rougeur présente)
2 = modéré (rougeur facilement décelable)
3 = sévère (rougeur intense) 4 = très sévère (rougeur très intense)
La mesure de la desquamation se fait à l'aide du classement suivant: 0 = aucun (absence de desquamation) 1 = léger (squames détectés, une seule couche de desquamation)
2 = modéré (squames de degré intermédiaire entre le léger et le sévère)
3 = sévère (Plusieurs couches de squames)
4 = très sévère (plusieurs couches de squames épais)
La mesure de l'élévation de la plaque se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence d'élévation de l'épaisseur)
1 = léger (légère élévation détectable au toucher)
2 = modéré (épaisseur modérée) 3 = sévère (fort épaississement)
4 = très sévère (très fort épaississement)
Cette étude démontre que les paramètres cliniques locaux obtenus avec la peau psoriasique non lésionnelle ne sont pas différents de ceux obtenus pour la peau saine. Ils ne permettent donc pas de différencier une peau psoriasique non lésionnelle d'une peau saine.
Par contre, les résultats du tableau 4 ont permis de mettre en évidence au niveau moléculaire, une surexpression des gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII dans certaines peaux psoriasiques non lésionneiles. La mesure de l'expression des gènes FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII, permet donc de réaliser un diagnostic très précoce du psoriasis, puisque l'expression de ces gènes permet de différencier au niveau moléculaire des peaux non lésionneiles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le permettent pas.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie d'un gène choisi parmi FANCC (n° d'accession NM 000136.1), DAD1 (n° d'accession NM 001344.1), GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1 ) comme outil de recherche du psoriasis.
2. Utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie d'un gène choisi parmi FANCC (n° d'accession NM 000136.1), DAD1 (n° d'accession NM 001344.1 ), GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1) pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII.
3. Utilisation d'au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie d'un gène choisi parmi FANCC (n° d'accession NM 000136.1), DAD1 (n° d'accession NM 001344.1 ), GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1) pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite sonde est relative au gène FANCC et est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simble brin de séquence SEQ. ID n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite sonde est relative au gène DAD1 et est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence
SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite sonde est relative au gène GRIM19 et est un fragment de 10 à
500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQD. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite sonde est relative au gène HADHII et est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SED. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
8. Procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité d'ARN messager correspondant au gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII dans les échantillons biologiques à l'aide d'au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie, respectivement, du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1) et/ou DAD1 (n° d'accession NM 001344.1 ) et/ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) et/ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1) ; d) sélection desdits composés pour lesquels une modulation de la transcription des ARN messagers du gène FANCC et/ou DAD1 et/ou
GRIM19 et ou HADHII est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite sonde de l'étape c) est choisie parmi : - une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4 ; - une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ; - une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
10. Procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique d'au moins un gène choisi parmi FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII par mise en contact d'au moins une sonde polynucléotidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon biologique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1), DAD1 (n° d'accession NM 001344.1 ), GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1 ).
11. Procédé de diagnostic selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite sonde choisie parmi :
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ; - une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°1β.
12. kit de diagnostic du psoriasis comprenant au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1), DAD1 (n° d'accession NM 001344.1), GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1).
13. Kit de diagnostic selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite sonde est choisie parmi :
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et preferentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
14. Utilisation d'au moins une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage comme outil de recherche du psoriasis.
15. Utilisation d'au moins une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage pour diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon biologique par la mesure du niveau d'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII.
16. Utilisation d'au moins une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage pour l'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis.
17. Procédé d'identification d'un composé destiné au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ; b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à tester ; c) mesure de la quantité de la protéine produite par l'expression d'au moins un gène choisi parmi FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII dans les échantillons biologiques à l'aide d'au moins une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage ; d) sélection desdits composés pour lesquels une modulation de l'expression de la ou lesdites protéines est mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
18. Procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la surexpression dans un échantillon biologique d'un gène choisi parmi FANCC, DAD1 , GRIM19 et HADHII par mise en contact d'au moins une sonde polypeptidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon biologique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
19. kit de diagnostic comprenant au moins une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression, respectivement, du gène FANCC, DAD1 , GRIM19 ou HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2983873B1 (fr) * 2011-12-13 2016-12-30 Oreal Marqueurs indicatifs de l'etat d'un cuir chevelu et utilisations.
KR101724169B1 (ko) * 2012-09-05 2017-04-06 가톨릭대학교 산학협력단 Ｇｒｉｍ19를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 지질 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN105861709B (zh) * 2016-05-19 2019-10-18 山东大学齐鲁医院 利用颗粒细胞grim-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993022435A1 (fr) * 1992-04-29 1993-11-11 Hospital For Sick Children Gene de la maladie de fanconi pour le groupe c de complementation
WO1998051792A1 (fr) * 1997-05-15 1998-11-19 Brigham & Women's Hospital, Inc. Molecules fac et leurs utilisations
WO2000009754A2 (fr) * 1998-08-14 2000-02-24 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. COMPOSITIONS ASSOCIEES A LA STEAROYL-CoA DESATURASE HUMAINE ET PROCEDES DE TRAITEMENT D'AFFECTIONS CUTANEES
GB9906993D0 (en) * 1999-03-26 1999-05-19 Univ Leicester Psoriasis

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