CN105861709B - 利用颗粒细胞grim-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用颗粒细胞GRIM‑19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法，卵母细胞的颗粒细胞中GRIM‑19的相对表达量为0.16‑0.35时，判断得到的卵母细胞为高发育潜能的卵母细胞，当GRIM‑19的相对表达量为0‑0.12时，判断得到的卵母细胞为低发育潜能的卵母细胞，内参选用β‑肌动蛋白(β‑action)基因。本发明是一种较为客观、准确、可量化的卵母细胞质量评价方法，无创、且无需反复拿出培养箱观察，减少了不良环境刺激。由于本发明可量化，有具体的数值范围，操作容易，避免了因人为主观因素使判断标准出现不统一的问题。

Description

利用颗粒细胞GRIM-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能 的方法
技术领域
本发明涉及一种利用颗粒细胞中GRIM-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法。
背景技术
近年来，社会发展带来的生活节奏加快、工作竞争加剧、环境污染恶化、婚育年龄推后等问题逐渐突显，不孕症的发病率每年大幅增加。体外受精-胚胎移植(in-vitrofertilization，IVF-ET)和卵胞浆内单精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)技术是治疗不孕症患者所用的关键技术。在IVF/ICSI过程中，准确评估卵母细胞及受精后胚胎的发育潜能是现代辅助生殖技术的重点。目前，国内外生殖中心评估卵母细胞发育潜能的方法主要是依靠主观的光镜形态学评级，包括卵丘细胞层数、卵丘细胞扩张度、卵母细胞外观形态、卵母细胞胞浆情况等。然而，目前采用的卵母细胞评分并不能准确体现出卵母细胞的发育潜能。因此，迫切需要一种准确直观的反映出卵母细胞发育潜能的生物学指标，从而能够指导后续移植胚胎的筛选工作。另外，现有《GRIM-19在小鼠卵母细胞和植入前胚胎中表达及定位的研究》、《GRIM-19在小鼠植入前胚胎中表达及作用的研究》等文献，主要是通过观察GRIM-19在小鼠卵母细胞和植入前各期胚胎中的表达和定位情况，探讨了GRIM-19对早期胚胎生长发育的作用，评估卵母细胞发育潜能，然而均采用小鼠的卵母细胞或受精卵直接固定处理后进行实验，显然在评估人卵母细胞发育潜能时不能适用。
卵泡(follicle)中卵母细胞四周有一层菱形或扁平细胞围绕，在卵泡开始发育、卵母细胞成长的同时，周围的菱形细胞变为立方形，并由单层增生成复层，因其细胞浆内含有颗粒，故称为颗粒细胞(granulosa cells)。颗粒细胞中的线粒体在预测卵母细胞发育潜能方面能起到重要作用。卵母细胞发育潜能的好坏很大程度取决于线粒体功能是否正常。线粒体是除细胞核之外的唯一携带遗传物质的细胞器，是整个细胞的能量代谢中心。由于线粒体是母系遗传，在胚胎发育早期合子基因未激活，线粒体不复制，因此早期胚胎所有耗能活动主要依赖于卵母细胞所储备的线粒体。然而卵母细胞中的线粒体几乎都以球形、嵴少等不成熟的形式存在，一直处于低代谢状态，真正的能量供应在排卵后才开始启动，在此之前卵母细胞主要依靠周围的颗粒细胞通过缝隙连接供给能量和营养，因此颗粒细胞中线粒体能量代谢系统是否正常将直接影响到卵母细胞的生长发育。因此，颗粒细胞中线粒体的功能状态是预测卵母细胞发育潜能的一个重要指标，能直接反映出卵母细胞的质量和随后的胚胎发育。
维甲酸和干扰素诱导的细胞凋亡调控蛋白(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality 19，GRIM-19)是线粒体呼吸链复合物I的一部分，其对复合体I-IV的装配以及整个线粒体呼吸链的电荷转移和电化学势能的维持都是必要的，GRIM-19缺乏会导致线粒体结构、细胞分布，以致功能异常。目前，未见有利用颗粒细胞中GRIM-19相对表达量来判断卵母细胞发育潜能的相关研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种较为客观、准确、可量化的利用颗粒细胞中GRIM-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法，检测颗粒细胞中GRIM-19相对表达量能够反映出颗粒细胞中线粒体的生理学功能是否正常，从而预测卵母细胞的发育潜能。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供颗粒细胞中GRIM-19在作为评价卵母细胞发育潜能标志物中的应用。
所述应用方法具体是：利用颗粒细胞中GRIM-19的表达量来评价卵母细胞发育潜能。
所述颗粒细胞中GRIM-19的表达量为GRIM-19的相对表达量，颗粒细胞中GRIM-19的相对表达量为0.16-0.35时，判断得到的卵母细胞为高发育潜能的卵母细胞，当GRIM-19的相对表达量为0-0.12时，判断得到的卵母细胞为低发育潜能的卵母细胞，内参选用β-肌动蛋白(β-action)基因。
本发明的第二个方面，提供一种检测颗粒细胞中GRIM-19相对表达量的试剂在制备用于评价卵母细胞发育潜能高低试剂中的应用。
颗粒细胞中GRIM-19相对表达量为0.16-0.35时，判断得到的卵母细胞为高发育潜能的卵母细胞，GRIM-19相对表达量为0-0.12时，判断得到的卵母细胞为低发育潜能的卵母细胞，内参选用β-肌动蛋白基因。
本发明的第三个方面，提供一种利用颗粒细胞中GRIM-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法，所述颗粒细胞中GRIM-19相对表达量采用GRIM-19mRNA/内参β-肌动蛋白(β-action)表示。
经过大量实验验证与分析，颗粒细胞中GRIM-19/β-action值为0.16-0.35时，判断得到的卵母细胞为高发育潜能的卵母细胞，GRIM-19/β-action值为0-0.12时，判断得到的卵母细胞为低发育潜能的卵母细胞。
所述利用颗粒细胞中GRIM-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法，包括以下步骤：
(1)收集颗粒细胞；
(2)对步骤(1)中颗粒细胞进行RNA提取；
(3)针对步骤(2)中的RNA进行逆转录得到cDNA；
(4)以β-肌动蛋白基因作为内参，针对β-肌动蛋白基因和GRIM-19基因设计引物；
(5)进行实时定量荧光PCR，通过CT值计算GRIM-19相对表达量。
步骤(1)中，收集颗粒细胞的方法，具体是：
从月经第8天起每天B超监测卵泡大小，至少3个主导卵泡直径≥18mm时，注射人绒毛膜促性腺激素HCG 5000～10000U，34～36h后B超介导下取卵；去除卵丘-卵母细胞复合体中最外层的部分颗粒细胞，清洗，去除卵泡液中的杂质，置于离心管中备用。
步骤(4)中，检测GRIM-19的相对表达量需要一种非常灵敏且特异的检测方法，引物、反应体系及内参体系均需筛选及优化。
经过大量试验验证与分析，针对β-肌动蛋白基因的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如表2β-actin Forward或如SEQ.ID.NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如表2β-actin Reverse或如SEQ.ID.NO.2所示。
针对GRIM-19基因的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如表2GRIM-19Forward或如SEQ.ID.NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如表2GRIM-19Reverse或如SEQ.ID.NO.4所示。
步骤(5)中，根据目的基因(GRIM-19)和内参基因(β-肌动蛋白)的CT值，GRIM-19相对表达量＝2^-(目的基因CT值–内参基因CT值)，该值的计算为本领域技术人员的公知常识。
本发明第四个方面，提供检测所述GRIM-19的引物对，所述上游引物的核苷酸序列如表2GRIM-19Forward或如SEQ.ID.NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如表2GRIM-19Reverse或如SEQ.ID.NO.4所示。
本发明第五个方面，提供一种颗粒细胞中GRIM-19相对表达量的检测试剂盒，包括检测所述GRIM-19的引物对。
所述试剂盒还包括：反转录缓冲液、dNTP混合液、核糖核酸酶抑制剂、反转录酶、SYBY Green混合液、无RNA酶双蒸水。
本发明的第六个方面，下述任一应用：
(1)所述的方法在评价卵母细胞发育潜能中的应用；
(2)所述的引物对在评价卵母细胞发育潜能中的应用；
(3)所述的引物对在制备颗粒细胞中GRIM-19相对表达量的检测试剂盒中的应用；
(4)所述的试剂盒在评价卵母细胞发育潜能中的应用。
卵母细胞的高发育潜能是形成优质胚胎的基础，然而最终妊娠结局是是受多种因素影响的，不仅取决于卵母细胞的发育潜能，还需要考虑精子的质量以及其它外界因素。本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而是一种作为中间结果的信息的方法，仅仅作为卵母细胞发育潜能的评价，并不能作为决定是否容易受孕的决定性因素。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用颗粒细胞中的GRIM-19的相对表达量来评价卵母细胞发育潜能。由于人卵母细胞的特殊性，只选用卵母细胞周围的颗粒细胞，保证对卵母细胞无创损伤的前提下，通过颗粒细胞角度评估卵母细胞发育潜能。
(2)现有的形态学评分存在缺陷，如不能全面地反映胚胎的发育潜能，过多依赖于实验室技术人员的主观判断标准，观察时间过短，数据之间缺乏联系，同时缺少客观可量化的指标等。而本发明是一种较为客观、准确、可量化的卵母细胞质量评价方法，无创、且无需反复拿出培养箱观察，减少了不良环境刺激。由于本发明可量化，有具体的数值范围，操作容易，避免了因人为主观因素使判断标准出现不统一的问题。
(3)本发明进行大量的实验验证和分析，得到：颗粒细胞中GRIM-19/β-action值为0.16-0.35时，判断得到的卵母细胞为高发育潜能的卵母细胞，GRIM-19/β-action值为0-0.12时，判断得到的卵母细胞为低发育潜能的卵母细胞。经过验证，该评价方法可以较为准确的评价卵母细胞的质量及其发育潜能，对评价和预测卵母细胞发育潜能具有十分重要的意义。
(4)本发明GRIM-19的表达量检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，可以满足卵母细胞发育质量的检测需求，应用范围广，经临床验证预测准确率高。
附图说明
图1：颗粒细胞GRIM-19mRNA水平与卵母细胞成熟度。
图2：卵母细胞发育潜能和颗粒细胞中GRIM-19相对表达量变化。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一种利用颗粒细胞中GRIM-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法，所述的颗粒细胞中GRIM-19相对表达量指的是GRIM-19mRNA和内参β-肌动蛋白(β-action)比值表示：
用于受精的卵母细胞的颗粒细胞中GRIM-19/β-action值为0.16-0.35时，判断得到的卵母细胞为高发育潜能的卵母细胞，用于受精的卵母细胞的颗粒细胞中，GRIM-19/β-action值为0-0.12时，判断得到的卵母细胞为低发育潜能的卵母细胞。
本实施例中，通过以下步骤测量颗粒细胞中GRIM-19相对表达量：
1.收集人的颗粒细胞：
采用常规促排卵方案，主要是长方案或短方案促排卵治疗，均从月经第8天起每天B超监测卵泡大小，至少3个主导卵泡直径≥18mm时，注射人绒毛膜促性腺激素HCG 5000～10000U，34～36h后B超介导下取卵。用巴斯德管(Pasteur pipette)去除卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complex，COCs)中最外层的部分颗粒细胞，转移至磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS；Invitrogen Corp，Carlsbad，CA，USA)中清洗3遍，去除卵泡液中的杂质，置于离心(eppendorf pipette，EP)管中备用。
2.RNA的提取
本实验采用Aidlab试剂公司的RNA提取试剂盒(艾德莱，北京，中国)提取RNA,具体操作如下所述：
(1)轻弹管底使颗粒细胞分开，每管添加1ml的TRIZOL，上下吹吸使颗粒细胞完全裂解，将样品室温放置5min。
(2)每管加入0.2ml的氯仿，盖上盖子，用手剧烈摇匀15s，然后室温放置5min。
(3)4℃12000g离心15min。
(4)用移液器轻轻把无色的水相转移到1.5ml的离心管中，并向其中加入等体积的异丙醇室温放置10分钟，轻轻颠倒混匀。
(5)4℃12000g离心10min，在管底会有无色透明的RNA沉淀。
(6)移除上清，加入1ml的75％的乙醇，放在涡旋仪中涡旋，然后4℃7500g离心5min中，弃除上清。
(7)室温干燥沉淀5-10min后，加入20ul的无RNA酶的水，60℃放置10min。
(8)测定RNA浓度，然后逆转录或者放于-70℃保存备用。
3.逆转录
(1)RNA热变性：取1μl RNA+1μl Oligo(dT)20+10μl无RNA酶水进行65℃，5分钟热变形后，立即置于冰上。
(2)反应体系(20μl)配制：
表1.逆转录反应体系
(3)逆转录：配制完逆转录体系后按30℃10min,42℃20min,99℃5min,4℃5min,瞬间离心反应条件进行逆转录，转录完毕后将cDNA放于-80℃冰箱冷冻保存。
4.引物设计与合成
表2.引物序列
5.Real-time PCR
(1)配制反应体系，反应体系如下(20μl)：
表3.Real-time PCR反应体系
(2)反应条件：
第一步：(预变性)94℃30s，1个循环；
第二步：(PCR反应)94℃5s、60℃30s，40个循环；
第三步：(溶解曲线分析)95℃15s、60℃1min、95℃15s，1个循环。
(3)数据处理：
根据GRIM-19基因和内参基因的CT值，GRIM-19相对于内参基因的相对表达量，计算公式为：2^-(目的基因CT值–内参基因CT值)。计算所用数据均进行了中值标准化，平均数和标准差来源于3-6个重复测量结果，并且样品基因的相对表达量均进行了绘图。所有的试验均重复了三次，并用平均值±标准差的形式呈现。
本发明方法的可行性证明试验：
通过检测卵母细胞颗粒细胞GRIM-19相对表达量，然后进行体处受精，受精卵发育阶段观察时，分别记录原核期形态、卵裂球数量、卵裂球的均匀程度及碎片，并进行受精卵发育状态的评分。受精卵发育潜能判断方法同为形态学评分法，形态学评分法如下：
当受精卵发育处于第2天时，根据卵裂球数目、发育的受精卵碎片的数量及其分布、对称性特征，将发育的受精卵分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4个级别，I级和Ⅱ级的受精卵为高发育潜能的受精卵，且受精卵的发育潜能为：I级＞Ⅱ级，各个级别发育的受精卵的特点为：I级：卵裂球大小均匀，形状规则，透明带完整，胞质均匀清晰，没有颗粒现象，碎片含量在0～5％；II级：卵裂球大小略不均匀，形状略不规则，胞质有颗粒现象，碎片在6％～20％；III级：卵裂球大小明显不均匀，形状不规则，胞质有粗大的颗粒，碎片在21％～50％；Ⅳ级：卵裂球大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象，碎片在50％以上。
本发明的可行性证明试验方法只是在体外进行受精，然后对受精卵发育阶段进行观察，并不对受精卵造成伤害，所以并不违反法律和社会公德。
根据形态学评分法得到的结果如下：
图1结果显示，MII成熟卵母细胞卵丘颗粒细胞GRIM-19mRNA水平明显高于GV和MI卵母细胞(P＜0.01)。
图2结果显示，高发育潜能胚胎的卵母细胞颗粒细胞的GRIM-19mRNA表达量显著高于低发育潜能胚胎(P<0.05)。

Claims (1)

1.一种利用颗粒细胞中GRIM-19相对表达量来评价卵母细胞发育潜能的方法，所述颗粒细胞中GRIM-19相对表达量指的是GRIM-19mRNA和内参β-肌动蛋白基因表达比值，其特征是：颗粒细胞中GRIM-19/β-action值为0.16-0.35时，判断得到的卵母细胞为高发育潜能的卵母细胞，GRIM-19/β-action值为0-0.12时，判断得到的卵母细胞为低发育潜能的卵母细胞；
具体包括以下步骤：
(1)收集颗粒细胞；
(2)对步骤(1)中颗粒细胞进行RNA提取；
(3)针对步骤(2)中的RNA进行逆转录得到cDNA；
(4)以β-肌动蛋白基因作为内参，针对β-肌动蛋白基因和GRIM-19基因设计引物；
(5)进行实时定量荧光PCR，通过CT值计算GRIM-19相对表达量；
其中，步骤(1)中，收集颗粒细胞的方法，具体是：
从月经第8天起每天B超监测卵泡大小，至少3个主导卵泡直径≥18mm时，注射人绒毛膜促性腺激素5000～10000 U，34～36h后B超介导下取卵；去除卵丘-卵母细胞复合体中最外层的部分颗粒细胞，清洗，去除卵泡液中的杂质，置于离心管中备用。
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