CN105164275A

CN105164275A - 针对卵母细胞能力的标志物基因

Info

Publication number: CN105164275A
Application number: CN201480017795.5A
Authority: CN
Inventors: J·史密兹; S·沃斯勒特; T·阿德里恩森斯
Original assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB
Current assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB; Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2013-02-18
Filing date: 2014-02-18
Publication date: 2015-12-16
Also published as: DK2956552T3; US10053733B2; HUE059437T2; EP2956552A1; JP2019088309A; HK1218660A1; JP7012676B2; CA2901144A1; ES2920753T3; EP2956552B1; US20160017422A1; PL2956552T3; JP2016509831A; WO2014125129A1

Abstract

将卵丘细胞(CC)基因表达作为形态学评分的另外方法进行探究，以选择具有最高妊娠机会的胚胎。本发明涉及基于使用活产和胚胎发育作为卵母细胞用于潜在生物标志物基因的外显子水平分析的终点标准，鉴定用于评估哺乳动物卵母细胞在受精后产生能存活的妊娠的能力的生物标志物基因的新型方法。本发明进一步提供了由此鉴定的CC表达的生物标志物基因，以及基于使用本发明的方法鉴定的生物标志物基因的预后模型。

Description

针对卵母细胞能力的标志物基因

发明领域

卵丘细胞(CC)基因表达正作为用以选择具有最高妊娠机会的胚胎的形态学评分的另外方法进行探究。本发明涉及鉴定用于评估哺乳动物卵母细胞在受精后产生可存能存活的妊娠的能力的生物标志物基因的新型方法，其基于使用活产和胚胎发育作为在潜在生物标志物基因的外显子水平分析中将使用的卵母细胞的终点标准。本发明进一步提供了由此鉴定的CC表达的生物标志物基因，以及基于使用本发明的方法鉴定的生物标志物基因的预后模型。

发明背景

单胚胎移植(SET)是限制ART后的多胎妊娠的优选处理。为了不危及带回家婴儿率，用于第一周期中的移植的胚胎的选择变得更加重要。紧跟着基于形态学的现有标准，目前其它方法正处于研究中。在生长和成熟期间与卵母细胞紧密接触的卵丘细胞(CC)中定量基因表达测量的使用似乎是有希望的方法(Huang和Wells2010)。自从关于CC表达可能与胚胎发育相关的主题的研究首次公开以后(McKenzie等人2004)，其它几项研究已探究了这种可能性，并尝试使CC表达与不同终点关联。所探究的终点的例子是：胚胎发育(Anderson等人2009；Cillo等人2007；Feuerstein等人2007；Hasegawa等人2005；vanMontfoort等人2008；Zhang等人2005)、卵母细胞的非整倍性阶段(Fragouli等人2012b)、卵母细胞核成熟阶段(Ouandaogo等人2011)以及从患者角度来看可能最重要的：妊娠结局(Assidi等人2011；Assou等人2008；Gebhardt等人2011；Wathlet等人2012；Wathlet等人2011)。不同研究之间的结果的确认在CC基因表达的分析中似乎并不明显。在目前的文献中，未发现许多在不同研究中共同的基因。例如，在两项研究中透明质酸合酶2(HAS2)在质量良好的胚胎中相比低胚胎形态表达更高(Cillo等人2007；McKenzie等人2004)，但在其它两项研究中可不与胚胎形态相关(Anderson等人2009；Gebhardt等人2011)。不一致性可以是由于不同实验设计、使用不同终点引起的，但基因表达可受已知因素例如患者的刺激方案(Adriaenssens等人2009；Adriaenssens等人2010；Grondahl等人2009)或仍未评估的因素例如在不同IVF实验室中使用的培养基的影响。

在本研究中，使用定量实时聚合酶链反应(QPCR)回顾性分析来自47个胞质内精子注射(ICSI)患者的47个个体卵丘复合物。通过使用目前的样品集，对来自先前研究(Wathlet等人2012)的妊娠预测模型就其预测力进行了验证。在下一步中，在寻找具有更强预测力的新基因的尝试中，通过考虑之前描述的3种基因(肝配蛋白-B2(EFNB2)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ID(CAMK1D)、斯钙素1(STC1))和多种新型基因以及所述基因的剪接变体，在数学模型中构建了新的多参数模型以预测卵母细胞能力(参见表)。

我们的患者样品集实现了之前从未在文献中报道过的分析：分析了来自在新移植周期中不导致妊娠的卵母细胞的CC和来自在冷冻胚胎移植(FRET)周期后导致妊娠的其同胞卵母细胞的CC(患者内分析)。就我们所知，这是比较来自如会在最终临床应用中完成的SET背景下相同回收周期的妊娠和非妊娠CC的首个研究。

附图简述

图1：在本研究中使用的样品的概述

本图代表用于本研究中执行的不同分析的样品的分布。灰色背景域限定用于特异度分析的样品，其在域的左侧上标记。SET：单胚胎移植；FRET冷冻胚胎移植周期；rFSH：重组促卵泡激素。^a：(Wathlet等人2012)。

A：妊娠分析(患者间)

-来自早期研究^a的妊娠模型的验证(EFNB2、CAMK1D和STC1)

-t检验分析妊娠相对于非妊娠

-用新的基因构建新的妊娠模型

B：妊娠分析(患者内)

-配对t检验妊娠相对于非妊娠

-测试在患者间分析中发现的多参数模型

图2：非妊娠相对于活产相关卵丘细胞样品的标准化基因表达值的t检验。

该图表代表在与卵母细胞相关的卵丘细胞样品之间的基因表达中的差异，所述卵母细胞在体外受精处理后导致(n＝19)或不导致(n＝28)活产。对B2M和UBC的平均值完成标准化。因为测试多重基因，所以邦弗朗尼校正(Bonferronicorrection)允许仅将P值<0.0042视为显著的。发现的表达总范围通过框和须线进行描述，所述框和须线分别代表中心为中值的两个内部和两个外部四分位数。

图3：3个妊娠模型的接受者操作特征(ROC)曲线

构建多参数模型以预测妊娠的机会，所述多参数模型包括在与卵母细胞相关的卵丘细胞样品中测量的基因表达水平，所述卵母细胞在体外受精处理后导致或不导致活产。对于模型3，还包括患者和周期特征(根据表3)。模型1局限于3种基因，且包括EFNB2、PGR和GSTA4。在模型2中，所有基因均允许进入模型，只要它们可以改善模型。对于模型2保留五种基因：EFNB2、PGR、GSTA4、GTSA3、GPX3。为了尝试改善模型2，在模型3中，如果它们可以改善模型的P值，则允许患者和周期特征进入模型：EFNB2、PGR、GSTA4、GTSA3、GPX3、年龄、相对E2和促排卵天数。各自的曲线下面积为0.79、0.89和0.90。相对E2：对于卵丘复合物数目在hCG日测量的E2值。

图4：关于患者内分析妊娠相对于非妊娠的配对t检验

该图比较对于每个患者，在后续单胚胎冷冻移植周期中，对应于不导致妊娠的卵母细胞的卵丘复合物与导致妊娠的卵母细胞的卵丘复合物的基因表达。每个患者卵母细胞源于一个回收周期。一个患者具有2个连续的冷冻周期，第一个未导致妊娠。一种颜色代表一个患者。虚线显示(仅在具有主要趋势的图表中：从非妊娠到妊娠向上或向下，其中P<0.1)该对未遵循主要趋势。这些对还在表7中用‘^a’标记。

图5：预测妊娠的最强模型用患者内分析获得，AUC＝曲线下面积。公式：预测妊娠的机会＝3.23+2.57*EFNB2+1.87*NCOA7p＝0.0127。(至少0.5的值指妊娠，更低的值指无妊娠)。

图6：在GnRH拮抗剂和rFSH预处理后，用患者间分析获得的预测妊娠的最强模型之一，AUC＝曲线下面积。公式：妊娠＝-1.36999+1.79393*CAMK1D外显子9+0.89385*HSPH1外显子2-0.73763*NCOA7(阳性值指妊娠，阴性值指无妊娠)。

图7：在GnRH拮抗剂和HP-hMG预处理后，用患者间分析获得的预测妊娠的最强模型之一，AUC＝曲线下面积。公式：妊娠＝0.46786+0.90886*SASH1-0.2264*CAMK1D外显子1(阳性值指妊娠，阴性值指无妊娠)。

发明概述

本发明涉及用于检测生物标志物基因或其剪接变体的方法，所述生物标志物基因或其剪接变体用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力；所述方法包括：

-使用活产或胚胎发育作为待使用的卵母细胞的选择终点；

-在样品的微阵列实验中进行基因表达的外显子水平分析，所述样品包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞；

-进行基因表达的所述外显子水平分析的基于患者内的比较；和

-对于能够评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的生物标志物基因，仅将在配对t检验中的p值<0.05视为显著的。

在备选实施方案中，在所述外显子水平基因分析的差异表达的情况下，其中所述差异表达是至少20％不同于对照或参考标准中的所述基因的外显子水平表达时，基因被视为评估卵母细胞的能力的生物标志物基因。

与现有方法相比较，本发明的方法的不同之处在于卵母细胞的选择终点、基因的外显子水平分析和基于患者内的比较。使用活产和胚胎发育作为待用于鉴定生物标志物基因的卵母细胞的选择终点的确使本发现的结果区别于本领域，在其中已使用其它终点也称为“中间终点”，如受精、基于形态的胚胎质量或胚泡发育。中间终点对于完全卵母细胞能力的相关性是有限的，因为例如在第3天时具有良好(基于形态的)胚胎发育能力的卵母细胞仅在33％的情况下导致妊娠。适当终点的选择因此对于获得本生物标志物基因集是关键的，所述生物标志物基因集显示为获得至少60％的阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。

进一步的区分特点基于基因选择基于患者内比较的事实。通过进行例如变得妊娠或未妊娠的患者的回顾性卵丘细胞分析，数据将通过影响基因表达的患者间变异而偏倚。卵丘细胞基因表达水平受下述影响：患者特异性特征(例如：年龄、BMI、预处理)、卵母细胞质量和其它基因的表达(Adriaenssens等人2010)。卵母细胞的能力还通过在不同过程中成功的能力进行测定。通过使用患者内样品来代替，所述患者间变异性被压制，从而增加被显示为是可用于具有不同预处理的患者的活产预测的可应用基因的本发明的生物标志物基因的鉴定。

最后，卵母细胞基因表达分析作为外显子水平分析执行。如下文实施例中证实的，这增加预测模型的分辨能力。当一些基因的总体表达显示并非预测性的时，察看这些基因内的外显子表达水平显示具有预测价值。当察看基因的总体表达时，在外显子水平下相关的一些信号将拉平目的标志物的可能丧失。

使用前述方法，已获得预测性生物标志物基因的最低限度列表，并且呈现于下文表13中。相应地，在进一步方面，本发明提供了前述方法，其中对表13的基因执行基因表达的外显子水平分析。该基因列表视为卵母细胞能力标志物基因的储库，其可以用于多参数分析中，以选择对于活产具有最强预测能力的独立基因的组合。如本文下文实施例中证实的，在不同类型的辅助生殖技术(ART)处理后，本发明人在卵母细胞能力的预测模型中成功地应用这些基因的组合。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供了在筛选实验中使用来自卵母细胞的卵丘细胞基因表达检测基因或剪接变体的生物标志物基因组合模型的方法，其包括：

a.检测使用前述方法鉴定的至少2种生物标志物基因；

b.使用双尾t检验来评价所述至少2种生物标志物基因的生物标志物基因表达组合与关于活产的卵母细胞能力的关联，并且保留具有I型p<0.05的截断值的所述至少2种生物标志物基因的组合作为模型，来预测哺乳动物卵母细胞在能够活产或者用于评估胚胎或胚细胞体外发育的能力；

c.进行逐步多参数回归分析，以确定所述至少2种生物标志物的剪接变体是否具有III型p值<0,3，并且将所述剪接变体加入步骤b中保留的模型；和

d.测定包含步骤c的剪接变体的模型的总体p值，并且当总体p值进一步降低时，将所述剪接变体保留在所述模型中。

如由下文实施例显而易见的，在一个实施方案中，前述筛选实验是微阵列实验或QPCR实验。

在备选方法中，替代地从如表13中呈现的基因的至少2种生物标志物基因的组合开始。在特定实施方案中，用于建立生物标志物基因表达模型的基因选自下表8中列出的11种基因。使用因此鉴定的生物标志物基因和生物标志物基因的组合，本发明进一步提供了所述基因和基因组合在体外方法中的用途，所述体外方法评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。

因此，在其它实施方案中，本发明提供了用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定使用上述方法鉴定的生物标志物基因表达水平；或使用前述方法鉴定的生物标志物组合的生物标志物基因表达水平，以检测基因或剪接变体的生物标志物基因组合模型；和

-基于所述表达水平，评估卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。

在前述方法中，评估卵母细胞的能力使用生物标志物基因组合模型来完成，所述生物标志物基因组合模型使用本发明的方法测定。特别地，使用如本文描述的生物标志物基因组合模型之一。在所述模型中，基因的表达水平将用于提供所述卵母细胞的妊娠概率(P)的数学公式(下文)中。在一个实施方案中，用于评估卵母细胞的能力的表达水平是标准化的表达水平。因此，在一个实施方案中，如本文提供的用于评估卵母细胞的能力的体外方法进一步包括使表达水平标准化的步骤。在另一个实施方案中，它包括使表达水平标准化的步骤，其中通过比较其表达与并非标志物的基因(例如组成性表达的看家基因)的表达校正所述标志物的绝对表达水平来使所述生物标志物基因的表达水平标准化。在一个实施方案中，用于使所述生物标志物基因的表达水平标准化的看家基因选自UBC、B2M、肌动蛋白、GAPDH、HPRT、CPB、G6PD、组蛋白H2A和线粒体核糖体蛋白S18C基因(也称为RNA18S5)；特别是UBC或B2M。

在备选方法中，通过比较标志物基因表达的水平与其能力已知的对照来评估哺乳动物卵母细胞的能力。当在表达水平中存在至少20％差异时，所述基因的差异表达指示卵母细胞的能力。因此，在一个实施方案中，哺乳动物卵母细胞的能力使用如本文描述的生物标志物基因组合模型之一进行评估。在所述实施方案中，体外方法可以进一步包括下述步骤：使所述基因的外显子水平基因表达标准化；和基于所述标准化的表达水平，评估卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。在另一个实施方案中，任选使用标准化的表达水平，通过比较标志物基因表达的水平与其能力已知的对照来评估卵母细胞，并且其中当在所述基因的表达水平中存在至少20％差异时，所述卵母细胞能够导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精。

技术人员熟知可用于测定所述一种或多种生物标志物基因的标志物基因表达水平的方法。在一个实施方案中，它包括借助于使用引物和/或探针的生物测定法测量所述基因的多核苷酸水平，所述引物和/或探针能够与所述多核苷酸或者所述多核苷酸内的一个或多个区域特异性杂交。在另一个实施方案中，它包括借助于生物测定法测量相关基因产物的蛋白质水平，所述测定法使用针对所述蛋白质、其前体形式、其底物或其代谢产物的结合剂、抗体或其片段，。

尽管前述方法配置为测定哺乳动物卵母细胞且特别是人卵母细胞的能力，但这并非因此暗示样品局限于此。待用于本发明中的样品明显包括源于卵母细胞的颗粒细胞或卵丘，但还可以基于卵泡液或来自培养基，其包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞。在对照或参考样品中，卵母细胞的能力是已知的，可以使用具有已知有能力或已知无能力的卵母细胞的样品，其中所述样品可以得自与待测试样品相同或不同的受试者。在特定实施方案中，对照或参考样品包含与已知无能力的卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞，无论是否得自与待测试样品相同的受试者。

如由下文实施例可见的，已发现通过下述基因的外显子水平分析，允许建立生物标志物基因表达模型以预测样品中的卵母细胞的能力：CAMK1D、PTGS2、EFNB2、VCAN、STC1、STC2、PGR和GPX3。特别地，待用于根据本发明的体外方法中的生物标志物基因选自包含SASH1、MROH9、NCOA7、DNAH3、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、GALNTL6、SPTBN5、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9和EFNB2的组。本发明因此提供了用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自CAMK1D、PTGS2、EFNB2、VCAN、STC1、STC2、PGR和GPX3的一种或多种生物标志物基因的外显子水平基因表达；

-比较生物标志物基因表达的水平与其能力已知的对照；和

-基于所述比较，评估卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。

在特定实施方案中，对选自SASH1、MROH9、NCOA7、DNAH3、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、GALNTL6、SPTBN5、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9和EFNB2的一种或多种基因的剪接变体执行基因表达的外显子水平分析。在前述基因集内的生物标志物的优选组合选自：

·EFNB2和NCOA7；

·CAMK1D外显子9和HSPH1外显子2和NCOA7

·CAMK1D外显子9和HSPH1外显子6和NCOA7

·CAMK1D外显子1和SASH1；和

·EFBN2和SASH1；最终与选自表13中列出的基因的一种或多种另外基因组合；特别与选自表8中列出的基因的一种或多种另外的更多基因组合；特别与选自CAMK1D、PTGS2、EFNB2、VCAN、STC1、STC2、PGR和GPX3的一种或多种另外基因组合；更特别与选自EFNB2、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、NCOA7和SASH1的基因组合；更特别与选自HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、NCOA7和SASH1的基因组合。

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自CAMK1D、PTGS2、EFNB2、VCAN、STC1、STC2、PGR和GPX3的2、3、4、5、6、7或8种生物标志物基因的外显子水平基因表达；

-使所述基因的外显子水平表达基因表达标准化；和

-基于所述标准化的表达水平，评估卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，与选自表13中列出的基因的一种或多种另外基因组合地；特别与选自表8中列出的基因的一种或多种另外基因组合地；特别与选自HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、NCOA7和SASH1的一种或多种更多的另外基因组合地，测定CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9或EFNB2的外显子水平基因表达，；

-使所述基因的外显子水平表达基因表达标准化；和

在进一步方面，本发明提供了根据本发明的体外方法用于鉴定卵母细胞的用途，所述卵母细胞在受精后能够产生能存活的妊娠，任选与另一种体外卵母细胞、精子或胚胎评估方法组合。

在进一步方面，本发明提供了包含根据本发明的体外方法评分的哺乳动物卵母细胞的卵母细胞库，以及制备胚胎的方法，其包括使用根据本发明的体外方法评分的卵母细胞。

本发明的进一步的编号实施方案包括：

1.用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1的标志物基因表达水平；

-比较标志物基因表达的水平与其能力已知的对照，或使所述基因的外显子水平基因表达标准化；和

-基于所述比较或使用所述标准化的表达水平，评估卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。

2.根据权利要求1的体外方法，其进一步包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自包含PGR、GSTA4、GSTA3、GPX3、EFNB2、CAMK1D、PTGS2、STC1、STC2、SASH1、MROH9、SPTBN5、GALNTL6、NCOA7、DNAH3或VCAN的列表中的1种或多种另外基因；特别是选自包含EFNB2、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、NCOA7和SASH1的列表中的1种或多种另外基因的标志物基因表达水平。

3.根据权利要求2的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1和选自包含CAMK1D、PTGS2、EFNB2、GSTA4、STC1、STC2和VCAN的列表中的1、2、3、4、5、6或7种基因；特别是HSPH1和选自CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、EFNB2、NCOA7和SASH1的1、2、3、4或5种基因的标志物基因表达水平。

4.根据权利要求3的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1、CAMK1D、PTGS2、EFNB2、GSTA4、STC1、STC2和VCAN的标志物基因表达水平；特别是测定HSPH1、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、EFNB2、NCOA7和SASH1的标志物基因表达水平。

5.根据权利要求2的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1和选自包含SASH1、CAMK1D、MROH9、SPTBN5、GALNTL6、NCOA7、DNAH3和EFBN2的列表中的1、2、3、4、5、6或7种基因的标志物基因表达水平。

6.根据权利要求5的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1、SASH1、CAMK1D、MROH9、SPTBN5、GALNTL6、NCOA7、DNAH3和EFBN2的标志物基因表达水平。

7.根据权利要求1-6中任一项的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自包含RABGAP1L、SLC7A11、ALDH1L2、ASNS、BTNL3、TICRR、CHTOP、CDC42EP3、CEBPG、DOCK9、GATS、GOT1、HINT3、KLF10、MBD3、MOCOS、MSR1、NPHP4、NPR1、PAK7、PHGDH、RNF166、ROBO2、SLC6A9、SLIT2、TSC22D3、TUB1和UNC80的列表中的一种或多种另外基因的标志物基因表达水平。

8.根据权利要求1-7中任一项的体外方法，其中通过测定HSPH1的外显子2和/或外显子6的表达水平，来测定HSPH1的标志物基因表达水平。

9.用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定CAMK1D的外显子1和/或外显子9的标志物基因表达水平；

-比较标志物基因表达的水平与其能力已知的对照；和

可替代地，在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定CAMK1D的外显子1和/或外显子9的标志物基因表达水平，

-使所述基因的外显子水平基因表达标准化；和

10.根据权利要求9的体外方法，其进一步包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自包含PGR、GSTA4、GSTA3、GPX3、EFNB2、HSPH1、PTGS2、STC1、STC2、SASH1、MROH9、SPTBN5、GALNTL6、NCOA7、DNAH3或VCAN的列表中的1种或多种另外基因；特别是选自HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、EFNB2、NCOA7和SASH1的1、2、3、4或5种另外基因的标志物基因表达水平。

11.根据权利要求10的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定CAMK1D的外显子1和/或外显子9和选自包含HSPH1、PTGS2、EFNB2、GSTA4、STC1、STC2和VCAN的列表中的1、2、3、4、5、6或7种基因；特别是CAMK1D的外显子1和/或外显子9和选自HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、EFNB2、NCOA7和SASH1的1、2、3、4或5种基因的标志物基因表达水平。

12.根据权利要求11的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1、CAMK1D、PTGS2、EFNB2、GSTA4、STC1、STC2和VCAN；特别是CAMK1D的外显子1和/或外显子9和HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、EFNB2、NCOA7和SASH1的标志物基因表达水平。

13.根据权利要求9-12中任一项的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自包含RABGAP1L、SLC7A11、ALDH1L2、ASNS、BTNL3、TICRR、CHTOP、CDC42EP3、CEBPG、DOCK9、GATS、GOT1、HINT3、KLF10、MBD3、MOCOS、MSR1、NPHP4、NPR1、PAK7、PHGDH、RNF166、ROBO2、SLC6A9、SLIT2、TSC22D3、TUB1和UNC80的列表中的一种或多种另外基因的标志物基因表达水平。

14.用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定SASH1的标志物基因表达水平；

15.根据权利要求14的体外方法，其进一步包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自包含PGR、GSTA4、GSTA3、GPX3、EFNB2、CAMK1D、PTGS2、STC1、STC2、HSPH1、MROH9、SPTBN5、GALNTL6、NCOA7、DNAH3或VCAN的列表中的1种或多种另外基因；特别是选自包含EFNB2、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、NCOA7和SASH1的列表中的1种或多种另外基因的标志物基因表达水平。

16.根据权利要求15的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1和选自包含CAMK1D、PTGS2、EFNB2、GSTA4、STC1、STC2和VCAN的列表中的1、2、3、4、5、6或7种基因；特别是HSPH1和选自CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、EFNB2、NCOA7、HSPH1外显子2和HSPH1外显子6的1、2、3、4或5种基因的标志物基因表达水平。

17.根据权利要求16的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1、CAMK1D、PTGS2、EFNB2、GSTA4、STC1、STC2和VCAN的标志物基因表达水平；特别是测定HSPH1、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、EFNB2、NCOA7和SASH1的标志物基因表达水平。

18.根据权利要求15的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定SASH1和选自包含HSPH1、CAMK1D、MROH9、SPTBN5、GALNTL6、NCOA7、DNAH3和EFBN2的列表中的1、2、3、4、5、6或7种基因的标志物基因表达水平。

19.根据权利要求18的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定HSPH1、SASH1、CAMK1D、MROH9、SPTBN5、GALNTL6、NCOA7、DNAH3和EFBN2的标志物基因表达水平。

20.根据权利要求14-19中任一项的体外方法，其包括：在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定选自包含RABGAP1L、SLC7A11、ALDH1L2、ASNS、BTNL3、TICRR、CHTOP、CDC42EP3、CEBPG、DOCK9、GATS、GOT1、HINT3、KLF10、MBD3、MOCOS、MSR1、NPHP4、NPR1、PAK7、PHGDH、RNF166、ROBO2、SLC6A9、SLIT2、TSC22D3、TUB1和UNC80的列表中的一种或多种另外基因的标志物基因表达水平。

21.根据权利要求14-20中任一项的体外方法，其中通过测定SASH1的外显子12的表达水平，来测定SASH1的标志物基因表达水平。

发明详述

在本发明的上下文中，术语‘卵母细胞能力’或‘能力’意指卵母细胞重新开始减数分裂、在受精后卵裂、帮助促进胚胎发育和妊娠建立、且在良好健康状况下使妊娠达到足月的能力。换言之，它代表哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。

根据本发明，卵母细胞可以起因于用于ART(辅助生殖技术)，包括例如体外受精(IVF)或精子卵浆内注射(ICSI)的天然周期、经修饰的天然周期或受激周期。在本发明的方法中使用的卵母细胞通常在排卵诱导后20-44小时获得，其中排卵诱导可以在天然或经修饰的天然周期中获得。术语“天然周期”指通过其雌性或女性产生卵母细胞的天然周期。术语“经修饰的天然周期”也称为“受激周期”，指通过其卵母细胞的多滤泡生长和/或排卵经由雌性或女性的处理进行诱导的过程。可以用于此类受激周期中的排卵触发物包括例如促黄体激素或类似物、绒毛膜促性腺激素和类似物、FSH和激动剂、GnRH和类似物、表皮生长因子(EGF)和类似物、EGF样蛋白(肽)双调蛋白、表皮调节素、β细胞素及其类似物、白细胞介素6、白细胞介素1、白血病抑制因子(LIF)磷酸二酯酶4型抑制剂、激活前述任一种的低分子量化合物、和前述的任何组合。特定处理包括用与重组FSH和/或hMG相关的GnRH类似物(激动剂或拮抗剂)的排卵刺激；或用柠檬酸克罗米芬、他莫昔芬、来曲唑等的促排卵。

在一个实施方案中，在本发明的方法中使用的卵母细胞在排卵触发后20-40小时获得和/或收集。在另一个实施方案中，在本发明的方法中使用的卵母细胞在排卵诱导后34-38小时特别是在排卵诱导后36小时获得和/或收集。如技术人员显而易见的，对卵母细胞的排卵触发可以在体外或体内执行。

‘颗粒细胞’也称为‘卵泡细胞’，是性索的体细胞，其与哺乳动物卵巢中发育中的雌配子(卵母细胞)紧密相关。

‘卵丘细胞’是如卵丘(细胞簇)中存在的细胞，其围绕在卵巢滤泡中和排卵后的卵母细胞。

在本发明的方法内，提及‘卵母细胞’意欲包括与成熟的卵母细胞和/或排卵诱导的卵母细胞相关的颗粒细胞和/或卵丘细胞。因此，在本发明的一个实施方案中，卵母细胞用于指卵丘细胞，其中所述卵丘细胞可以使用本发明的方法在排卵触发前或后进行分析。

短语“测定标志物表达的水平”意指在核酸或蛋白质水平下评价样品中的标志物表达程度，使用技术人员可获得的技术，以检测任何标志物表达产物(包括核酸和蛋白质)的足够部分。‘标志物基因表达水平’可以例如使用核酸微阵列、RNA印迹、逆转录PCR、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定法、蛋白质微阵列或FACS分析进行测定。术语‘标志物基因表达’意欲包括全长基因或其变体，特别是含有特定外显子的剪接变体的表达。在本发明的上下文中特别感兴趣的剪接变体是下述剪接变体中的任一种或其组合：

-HSPH1的外显子2和/或外显子6，

-CAMK1D的外显子1和/或外显子9，

-NCOA7的外显子1和/或外显子2，

-SASH1的外显子12，

-MROH9的外显子14，

-SPTBN5的外显子8，

-GALNTL6的外显子16，和/或

-DNAH3的外显子21。

在特定实施方案中，在本发明的方法中使用的剪接变体的组合选自：HSPH1的外显子2和HSPH1的外显子6，HSPH1的外显子2和CAMK1D的外显子1或外显子9，HSPH1的外显子2和NCOA7的外显子1或外显子2；HSPH1的外显子2和SASH1的外显子12，HSPH1的外显子2和MROH9的外显子14，HSPH1的外显子2和SPTBN5的外显子8，HSPH1的外显子2和GALNTL6，HSPH1的外显子2和DNAH3的外显子21，HSPH1的外显子6和CAMK1D的外显子1或外显子9，HSPH1的外显子6和NCOA7的外显子1或外显子2；HSPH1的外显子6和SASH1的外显子12，HSPH1的外显子6和MROH9的外显子14，HSPH1的外显子6和SPTBN5的外显子8，HSPH1的外显子6和GALNTL6，HSPH1的外显子6和DNAH3的外显子21，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子9，HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1，HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子2；HSPH1的外显子2和外显子6以及SASH1的外显子12，HSPH1的外显子2和外显子6以及MROH9的外显子14，HSPH1的外显子2和外显子6以及SPTBN5的外显子8，HSPH1的外显子2和外显子6以及GALNTL6，HSPH1的外显子2和外显子6以及DNAH3的外显子21，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1和外显子9，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子1和外显子2，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14以及SPTBN5的外显子8，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14以及SPTBN5的外显子8以及GALNTL6的外显子16，HSPH1的外显子2和外显子6以及CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14以及SPTBN5的外显子8以及GALNTL6的外显子16以及DNAH3的外显子21。

在进一步特定实施方案中，在本发明的方法中使用的剪接变体的组合选自：CAMK1D的外显子1和CAMK1D的外显子9，CAMK1D的外显子1和HSPH1的外显子2或外显子6，CAMK1D的外显子1和NCOA7的外显子1或外显子2，CAMK1D的外显子1和SASH1的外显子12，CAMK1D的外显子1和MROH9的外显子14，CAMK1D的外显子1和SPTBN5的外显子8，CAMK1D的外显子1和GALNTL6的外显子16，CAMK1D的外显子1和DNAH3的外显子21，CAMK1D的外显子9和HSPH1的外显子2或外显子6，CAMK1D的外显子9和NCOA7的外显子1或外显子2，CAMK1D的外显子9和SASH1的外显子12，CAMK1D的外显子9和MROH9的外显子14，CAMK1D的外显子9和SPTBN5的外显子8，CAMK1D的外显子9和GALNTL6，CAMK1D的外显子9和DNAH3的外显子21，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子6，CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子1，CAMK1D的外显子1和外显子9以及NCOA7的外显子2，CAMK1D的外显子1和外显子9以及SASH1的外显子12，CAMK1D的外显子1和外显子9以及MROH9的外显子14，CAMK1D的外显子1和外显子9以及SPTBN5的外显子8，CAMK1D的外显子1和外显子9以及GALNTL6的外显子16，CAMK1D的外显子1和外显子9以及DNAH3的外显子21，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1和外显子2，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14以及SPTBN5，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14以及SPTBN5以及GALNTL6的外显子16，CAMK1D的外显子1和外显子9以及HSPH1的外显子2和外显子6以及NCOA7的外显子1和外显子2以及SASH1的外显子12以及MROH9的外显子14以及SPTBN5以及GALNTL6的外显子16以及DNAH3的外显子21，CAMK1D的外显子1和SASH1，CAMK1D的外显子9和HSPH1的外显子2和NCOA7，CAMK1D的外显子9和HSPH1的外显子2以及NCOA7的外显子1或外显子2，CAMK1D的外显子1和SASH1的外显子12，CAMK1D的外显子9和HSPH1的外显子6和SASH1的外显子12，CAMK1D的外显子9和HSPH1的外显子6和SASH1。

在另一个实施方案中，在本发明的方法中使用的剪接变体的组合选自：EFNB2和CAMK1D的外显子9或外显子1，EFNB2和HSPH1的外显子2或外显子6，EFNB2和NCOA7的外显子1或外显子2，EFNB2和SASH1的外显子12，EFNB2和MROH9的外显子14，EFNB2和SPTBN5的外显子8，EFNB2和GALNTL6的外显子16，EFNB2和DNAH3的外显子21，EFNB2和CAMK1D的外显子9或外显子1和HSPH1的外显子2或外显子6，EFNB2和CAMK1D的外显子9或外显子1和NCOA7的外显子1或外显子2，EFNB2和CAMK1D的外显子9或外显子1和SASH1的外显子12，EFNB2和HSPH1的外显子2或外显子6和NCOA7的外显子1或外显子2，EFNB2和HSPH1的外显子2或外显子6和SASH1的外显子12，EFNB2和NCOA7的外显子1或外显子2和CAMK1D的外显子9或外显子1，EFNB2和NCOA7的外显子1或外显子2和HSPH1的外显子2或外显子6，EFNB2和NCOA7的外显子1或外显子2和SASH1的外显子12，EFNB2和SASH1的外显子12和NCOA7的外显子1或外显子2和HSPH1的外显子2或外显子6，EFNB2和CAMK1D的外显子9或外显子1和HSPH1的外显子2或外显子6和NCOA7的外显子1或外显子2，EFNB2和NCOA7，EFNB2和SASH1，EFNB2和NCOA7的外显子1或外显子2，EFNB2和SASH1的外显子12。

在另一个实施方案中，在本发明的方法中使用的剪接变体的组合选自：SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6；SASH1的外显子12和MROH9或MROH9的外显子14；SASH1的外显子12和SPTBN5或SPTBN5的外显子8；SASH1的外显子12和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9；SASH1的外显子12和GALNTL6或GALNTL6的外显子16；SASH1的外显子12和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2；SASH1的外显子12和DNAH3或DNAH3的外显子21；SASH1的外显子12和EFNB2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和SPTBN5或SPTBN5的外显子8；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和GALNTL6或GALNTL6的外显子16；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和DNAH3或DNAH3的外显子21；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和EFNB2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和GALNTL6或GALNTL6的外显子16；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和DNAH3或DNAH3的外显子21；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和EFNB2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和GALNTL6或GALNTL6的外显子16；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和DNAH3或DNAH3的外显子21；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和EFNB2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和GALNTL6或GALNTL6的外显子16；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和DNAH3或DNAH3的外显子21；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和EFNB2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和GALNTL6或GALNTL6的外显子16和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和GALNTL6或GALNTL6的外显子16和DNAH3或DNAH3的外显子21；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和GALNTL6或GALNTL6的外显子16和EFNB2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和GALNTL6或GALNTL6的外显子16和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2和DNAH3或DNAH3的外显子21；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和GALNTL6或GALNTL6的外显子16和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2和EFNB2；SASH1的外显子12和HSPH1或HSPH1的外显子2或外显子6和MROH9或MROH9的外显子14和SPTBN5或SPTBN5的外显子8和CAMK1D或CAMK1D的外显子1或外显子9和GALNTL6或GALNTL6的外显子16和NCOA7或NCOA7的外显子1或外显子2和DNAH3或DNAH3的外显子21和EFNB2。

在另一个实施方案中，在根据本发明的体外模型中使用的模型基于EFNB2或者CAMK1D的外显子1或外显子9的测定，与选自STC1、SASH1、PGR、GSTA4、GSTA3、GPX、NCOA7、HSPH1、MROH9、DNAH3、GALNTL6和SPTBN5的一种或多种标志物基因组合；特别与选自STC1、SASH1、PGR、GSTA4、GSTA3、GPX、NCOA7和HSPH1的一种或多种基因组合。在其它实施方案中，使用的模型基于EFNB2或者CAMK1D的外显子1或外显子9的测定，与选自SASH1的外显子12、NCOA7的外显子1、NCOA7的外显子2、HSPH1的外显子2、HSPH1的外显子6、MROH9的外显子14、DNAH3的外显子21、GALNTL6的外显子16和SPTBN5的外显子8的一种或多种剪接变体组合；特别与选自SASH1的外显子12、NCOA7的外显子1、NCOA7的外显子2、HSPH1的外显子2和HSPH1的外显子6的一种或多种剪接变体组合。

对照是与其能力是已知的卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞。在这方面，阳性对照是与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞，所述卵母细胞能够导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精。在另一个实施方案中，阳性对照可以是染色体正常的卵母细胞。

在某些实施方案中，测定表13的至少2种标志物基因的表达水平。在特定实施方案中，对于下述组合之一测定生物标志物基因表达的水平：

EFNB2、GSTA4和PGR；

EFNB2、GSTA4、PGR、GPX3和GSTA3；

EFNB2和NCOA7；

EFNB2和SASH1；

EFNB2、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、SASH1、MROH9、NCOA7、DNAH3、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、GALNTL6、和SPTBN5；

EFNB2、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、NCOA7和SASH1；

CAMK1D外显子9、HSPH1外显子2和NCOA7；

CAMK1D外显子9、HSPH1外显子6和NCOA7；

CAMK1D外显子1和SASH1。

这些新模型证明能够就其妊娠和活产的能力给卵母细胞排序。如由前述模型显而易见的，CAMK1D外显子1或外显子9和EFNB2证实为在患者内和患者间分析中的阳性对照基因，组合这些标志物与选自GSTA4、GSTA3、PGR、GPX3、NCOA7、SASH1、MROH9、DNAH3、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、GALNTL6和SPTBN5的进一步基因，导致在测定卵母细胞妊娠和活产能力中是预测性的模型。如由下文实施例显而易见的，使用这些基因组合，预测的PPV、NPV和准确度超过60％。在另一个实施方案中，本发明的体外模型，参见例如下表6中的模型3，可以进一步包含患者和/或周期参数，例如年龄、刺激天数和相对雌二醇(E2)、抗苗勒管激素水平(AMH)、第3天促卵泡激素水平(第3天FSH)等；在特定实施方案中，在本发明的体外模型中使用的患者和周期参数是刺激天数、相对E2和年龄。

在一个实施方案中，且从前述基因集开始，本发明提供了用于预测哺乳动物卵母细胞导致妊娠和活产的能力的体外模型；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定EFNB2、GSTA4和PGR的标志物基因表达水平，

-比较标志物基因表达水平与其能力已知的对照；或使所述基因的外显子水平基因表达标准化，和

基于所述比较或所述标准化的表达水平，评估卵母细胞导致妊娠和活产的能力。

在前述方法的一个实施方案中，卵母细胞的能力基于测定通过等式P＝-a+b*EFNB2+c*GSTA4–d*PGR获得的妊娠概率(P)；其中a是1,00至4,00的数目；b是0,00至2,00的数目；c是0,00至2,00的数目；d是0,00至2,00的数目；EFNB2是EFNB2的标准化表达水平；GSTA4是GSTA4的标准化表达水平；并且PGR是PGR的标准化表达水平。在特定实施方案中，在前述等式中，a是2,00至3,00的数目；b是0,00至1,00的数目；c是0,00至1,00的数目；d是0,00至1,00的数目。在甚至其它实施方案中，在前述等式中，a是2,26；b是0,79；c是0,095；并且d是0,096。

在基于EFNB2、GSTA4和PGR的前述模型的一个实施方案中，体外方法进一步包括在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定GPX3和GSTA3的标志物基因表达水平，并且在评估卵母细胞的能力中使用所述进一步的标志物基因表达。在基于EFNB2、GSTA4和PGR的前述模型的一个实施方案中，卵母细胞的能力基于测定通过等式P＝-a+b*EFNB2+c*GSTA4–d*PGR–e*GPX3–f*GSTA3获得的妊娠概率(P)；其中a是1,00至4,00的数目；b是0,00至2,00的数目；c是0,00至2,00的数目；d是0,00至2,00的数目；e是0,00至2,00的数目；f是0,00至2,00的数目；EFNB2是EFNB2的标准化表达水平；GSTA4是GSTA4的标准化表达水平；PGR是PGR的标准化表达水平；GPX3是GPX3的标准化表达水平；并且GSTA3是GSTA3的标准化表达水平。在特定实施方案中，在前述等式中，a是1,00至2,00的数目；b是0,00至1,00的数目；c是0,00至1,00的数目；d是0,00至1,00的数目；e是0,00至1,00的数目；并且f是0,00至1,00的数目。更特别地，在前述等式中，a是1,02，b是0,63，c是0,27，d是0,11，e是0,43，并且f是0,51。

在基于EFNB2、GSTA4和PGR的前述模型的一个实施方案中，体外方法进一步包括测定患者和周期特征：年龄、刺激天数和RelE2(相对E2)，并且在评估卵母细胞的能力中使用所述进一步的患者和周期特征。在基于EFNB2、GSTA4和PGR的前述模型的一个实施方案中，卵母细胞的能力基于测定通过等式P＝-a+b*EFNB2+c*GSTA4–d*PGR–e*GPX3–f*GSTA3+g*刺激天数+h*RelE2+i*年龄获得的妊娠概率(P)；其中a是5,00至15,00的数目；b是0,00至2,00的数目；c是0,00至2,00的数目；d是0,00至2,00的数目；e是0,00至2,00的数目；f是0,00至2,00的数目；g是0,00至2,00的数目；h是0,00至2,00的数目；i是0,00至2,00的数目；EFNB2是EFNB2的标准化表达水平；GSTA4是GSTA4的标准化表达水平；PGR是PGR的标准化表达水平；GPX3是GPX3的标准化表达水平；并且GSTA3是GSTA3的标准化表达水平。在特定实施方案中，在前述等式中，a是9,00至13,00的数目；b是1,00至2,00的数目；c是0,00至1,00的数目；d是0,00至1,00的数目；e是0,00至1,00的数目；并且f是0,00至1,00的数目；g是0,00至1,00的数目；h是0,00至1,00的数目；i是0,00至1,00的数目。更特别地，在前述等式中，a是11,27，b是1,35，c是0,46，d是0,24，e是0,66，f是0,86，g是0,0,50，h是0,009，并且i是0,14。

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定EFNB2和NCOA7的标志物基因表达水平，

在前述方法的一个实施方案中，卵母细胞的能力基于测定通过等式P＝a+b*EFNB2+c*NCOA7获得的妊娠概率(P)；其中a是2,00至5,00的数目；b是2,00至4,00的数目；c是1,00至3,00的数目；EFNB2是EFNB2的标准化表达水平；并且NCOA7是NCOA7的标准化表达水平。在特定实施方案中，妊娠概率(P)通过等式P＝a+b*EFNB2+c*NCOA7获得；其中a是3,00至4,00的数目；b是2,00至3,00的数目；c是1,00至2,00的数目。在甚至其它实施方案中，在前述等式中，a是3,23；b是2,57，并且c是1,87。

在一个实施方案中，且从前述基因集开始，本发明提供了用于预测在用GnRH(促性腺素释放激素)拮抗剂和rFSH(重组促卵泡激素)预处理的受试者中，哺乳动物卵母细胞导致妊娠和活产的能力的体外模型；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定CAMK1D外显子9、HSPH1外显子2和NCOA7的标志物基因表达水平，

基于所述比较或所述标准化的表达水平，评估卵母细胞导致妊娠的能力。

在前述方法的一个实施方案中，卵母细胞的能力基于测定通过等式P＝a+b*CAMK1D外显子9+c*HSPH1外显子2+d*NCOA7获得的妊娠概率(P)；其中a是-3,00至-1,00的数目；b是2,00至4,00的数目；c是0,00至3,00的数目；d是0,00至2,00的数目；CAMK1D外显子9是CAMK1D外显子9的标准化表达水平；HSPH1外显子2是HSPH1外显子2的标准化表达水平；NCOA7是NCOA7的标准化表达水平；并且其中阳性值指妊娠，且阴性值指无妊娠。在特定实施方案中，妊娠概率(P)通过等式P＝a+b*CAMK1D外显子9+c*HSPH1外显子2+d*NCOA7获得；其中a是-2,00至-1,00的数目；b是1,00至2,00的数目；c是0,00至1,00的数目；d是0,00至1,00的数目。在甚至其它实施方案中，a是-1,37；b是1,79；c是0,89，并且d是0,74。

在一个实施方案中，且从前述基因集开始，本发明提供了用于预测在用GnRH(促性腺素释放激素)拮抗剂和HP-hMG(高度纯化的人绝经期促性腺激素)预处理的受试者中，哺乳动物卵母细胞导致妊娠和活产的能力的体外模型；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定CAMK1D外显子1和SASH1的标志物基因表达水平，

在前述方法的一个实施方案中，卵母细胞的能力基于测定通过等式P＝a+b*SASH1-c*CAMK1D外显子1获得的妊娠概率(P)；其中a是0,00至2,00的数目；b是0,00至2,00的数目；c是0,00至2,00的数目；CAMK1D外显子1是CAMK1D外显子1的标准化表达水平；SASH1是SASH1的标准化表达水平；并且其中阳性值指妊娠，且阴性值指无妊娠。在特定实施方案中，妊娠概率(P)通过等式P＝a+b*SASH1-c*CAMK1D外显子1获得；其中a是0,00至1,00的数目；b是0,00至1,00的数目；c是0,00至1,00的数目。在甚至其它实施方案中，a是0,47；b是0,91；并且c是0,0,23。

优选在获得的基因表达水平已就测定的样品量的差异和使用的样品质量中的变异性两者进行校正后(例如测试的mRNA的量和质量)，执行根据本发明的方法的基因表达水平的比较。针对相同样品中的参考基因使水平标准化可以进行校正。通常“看家基因”例如UBC、B2M、肌动蛋白、GAPDH、HPRT、CPB、G6PD、组蛋白H2A或线粒体核糖体蛋白S18C基因，特别是UBC或B2M用于该标准化。通过比较其表达与并非标志物的基因(例如组成性表达的看家基因)的表达，通过校正标志物的绝对表达水平，可以使标志物基因的表达水平标准化。用于标准化的合适基因包括看家基因，例如UBC、B2M、肌动蛋白、GAPDH、HPRT、CPB、G6PD、组蛋白H2A或线粒体核糖体蛋白S18C基因。该标准化尤其允许比较一种样品例如测试样品与对照样品中的表达水平。

与组中的其它卵母细胞相关的卵丘细胞或颗粒细胞的表达水平相比较，与给定卵母细胞相关的卵丘细胞或颗粒细胞中的标志物基因表达中的差异，允许根据相对质量给卵母细胞组中的卵母细胞排序。因此，在本发明的一个实施方案中，将来自个体或个体组的多个卵母细胞分组，并且在单一测定法中筛选；随后选择表征为具有最高质量概率得分的卵母细胞，用于受精和/或植入。

标志物的鉴定以及卵丘细胞中的标志物基因表达中的变化和伴随卵母细胞质量之间的相关的测定，提供了基于mRNA或蛋白质表达的临床诊断试剂盒的基础。根据本发明用于测定卵母细胞质量所需的基础材料和试剂可以在试剂盒中装配。在某些实施方案中，试剂盒包含特异性检测如本文公开的至少一种基因的表达水平的至少一种试剂，和根据本发明的一种或多种方法使用试剂盒的说明书。每个试剂盒必定包含致使操作特异性的试剂。因此，为了检测由集合的至少一种标志物基因表达的mRNA，试剂将包含与mRNA互补的核酸探针，例如cDNA或寡核苷酸。核酸探针可以固定或不固定到固体表面(例如微阵列)上。为了检测由集合的至少一种基因编码的多肽产物，试剂将包含与多肽特异性结合的抗体。取决于操作，试剂盒可以进一步包括下述中的一种或多种：提取缓冲液和/或试剂、扩增缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、免疫检测缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂、以及检测工具。关于使用这些缓冲液和试剂用于执行操作的不同步骤的方案也可以包括在试剂盒中。试剂可以以固体(例如冻干)或液体形式供应。本发明的试剂盒可以任选包含用于每种个别缓冲液和/或试剂的不同容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶)。还可以提供适合于进行公开方法的某些步骤的其它容器。在某些实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括对照样品。根据本发明的一种或多种方法使用试剂盒的说明书可以包括用于处理卵丘细胞或颗粒细胞样品和/或执行测试的说明书，以及用于解释结果的说明书，即关于卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的决定。在一个实施方案中，通过定量RT-PCR用于测定标志物基因的mRNA表达的试剂盒将包括用于执行定量RT-PCR的标准引物及其它试剂，其中反应组分配制用于最佳化成功检测待测定的每种基因。取决于待测定的哺乳动物卵母细胞的种类，扩增引物可以基于有关标志物基因的核苷酸序列进行选择。任何单一标志物基因或标志物基因的组合可以掺入试剂盒内。为了提供在覆盖度和成本之间的平衡的用户选项，不同试剂盒可以提供关于靶向用于分析的标志物基因的不同引物集合。

根据本发明的方法的可能应用

在优选实施方案中，基于差异表达的基因集的表达水平，本发明方法还可以用于鉴定其产生或不产生有妊娠能力的卵母细胞的女性受试者。然而，本发明方法同样可应用于非人动物，例如其它哺乳动物、禽类、两栖类、爬行类等。例如，本发明可以用于取得用于研究假定的雌性能育性处理的动物模型。

另外，本发明可以用于鉴定雌性受试者，其具有阻止或抑制其产生有妊娠能力的卵母细胞的能力的异常性，例如暴露于药剂、暴露于有毒物质、环境因素、卵巢功能障碍、卵巢囊肿、绝经前或绝经期状况、癌症、自身免疫病症、激素功能障碍、细胞增殖病症、或者抑制或阻止有妊娠能力的卵母细胞的发育的另一种健康状况。例如，可以筛选在特征性表达水平下不表达特定妊娠标记基因的受试者，以评价她们是否具有阻止其产生有妊娠能力的卵母细胞的潜在健康状况。特别地，可以筛选此类受试者，以评价她们是否显示出绝经体征，她们是否患有癌症、自身免疫疾病或卵巢异常性例如卵巢囊肿，或她们是否患有可以阻止“妊娠能力”卵母细胞的发育的另一种健康状况，例如激素紊乱、过敏病症等。

另外，主题方法可以用于评价假定的雌性能育性处理在人或非人雌性受试者中的功效。基本上，此类方法可以包括用假定的雌性能育性处理来处理雌性受试者，优选女性，在处理后从所述女性中分离至少一个卵母细胞和相关的周围卵泡或颗粒细胞，任选在处理前进一步分离至少一个卵母细胞和相关的周围细胞，从所述分离的卵母细胞各自中分离至少一个卵丘细胞；检测由卵母细胞在特征性水平下表达或未表达的至少一种基因的表达水平，所述卵丘细胞与(周围)有妊娠能力的卵母细胞相关；并且基于它是否导致在卵丘细胞(其围绕有妊娠能力的卵母细胞)更特征性的水平下表达至少一种妊娠标记基因的卵丘细胞(与不含处理相比较)，评价所述假定的能育性处理的功效。如注意到的，虽然雌性人受试者是优选的，但主题方法可以用于评价假定的能育性处理在非人雌性动物中的功效，所述非人雌性动物例如雌性非人灵长类或用于评估假定的能育性处理的功效的其它合适动物模型。

再进一步地，本发明可以用于增强体外或体内能育性处理的功效。特别地，在体内或体外受精之前、期间或之后，发现为“妊娠无能”或不成熟的卵母细胞可以在含有一种或多种基因产物的培养基中进行培养，所述一种或多种基因产物由鉴定为“妊娠标记”基因的基因编码，例如激素、生长因子、分化因子等。基本上，这些基因产物的存在应补充营养基因产物中的缺陷，所述营养基因产物通常由围绕“妊娠能力的”卵母细胞的卵丘细胞和/或颗粒细胞表达，并且通常为成熟卵母细胞，且从而促进这些卵母细胞在受精后获得能存活的妊娠的能力。

备选地，由所述妊娠标记基因编码的一种或多种基因产物可以施用于受试者，其根据本发明的方法发现不产生有妊娠能力的卵母细胞。此类施用可以是肠胃外的，例如通过静脉内、肌内、阴道内、皮下注射或者通过口服或经皮施用。备选地，这些基因产物可以局部施用于靶部位，例如雌性卵巢或子宫环境。例如，雌性受试者可以具有用药物递送装置植入的子宫或卵巢，所述药物递送装置提供了由“妊娠标记”基因编码的一种或多种基因产物的持续递送。

如上文详述的，与组中的其它卵母细胞相关的卵丘细胞或颗粒细胞的表达水平相比较，与给定卵母细胞相关的卵丘细胞或颗粒细胞中的标志物基因表达中的差异，允许根据相对质量给卵母细胞组中的卵母细胞排序。因此，在本发明的一个实施方案中，将来自个体或者人或非人雌性受试者组的多个卵母细胞分组，并且在单一测定法中筛选；随后选择表征为具有最高质量概率得分的卵母细胞，用于受精和/或植入。

实施例

实施例1-QPCR分析

材料与方法

患者群体

本研究由UZBrussel伦理委员会批准，并且获得患者书面同意。基于胚胎移植政策(单胚胎移植)，选择四十七个ICSI患者，并且制定促排卵方案：与重组促卵泡激素(FSH)组合的GnRH拮抗剂(Gonal-f，Merck-Serono，Geneva，瑞士；n＝4或Puregon，MSD，Oss，荷兰；n＝43)。不孕的原因是：仅雄性因素(n＝19)，仅雌性因素(排卵紊乱n＝3，和输卵管性不孕n＝2)，组合雄性和雌性因素(OAT和子宫内膜异位症n＝3)和特发性的(n＝20)。二十个患者具有在培养第3天时的单胚胎移植，其中10个变得妊娠。二十七个患者具有在第5天时的移植，其中9个变得妊娠。

人卵丘细胞的收集和胚胎培养

阴道超声用于监控卵泡发育。通过在COBAS6001免疫分析仪(Roche、RocheDiagnostics、Mannheim、德国)上的电化学发光，通过血清17β-雌二醇(E2)、孕酮、FSH和LH的分析监控内分泌概况，使用具有5ng/l、0.03μg/l、<0.1IU/l、0.1IU/l的各自灵敏度以及分别<6、<7、<6和<6的总不精确性(％CV)的验证测定法。当通过经阴道超声观察到直径17mm的至少三个卵泡时，用10000IUhCG的剂量诱导最终的卵泡成熟。36小时后完成卵母细胞回收。CC收集如(Wathlet等人2011)中所述完成。简言之，在含有80IU/mlCumulase(MediCult，Lyon，法国)的40μlHTF-SSS小滴中，执行个体卵母细胞剥落不长于30秒，并且在不含酶的小滴中序贯洗涤。在任何时间，卵母细胞从这个点开始向前个别处理，以便允许CC/卵母细胞的回顾性分析。在剥落后，将CC直接投入液氮中。ICSI如先前描述的(VanLanduyt等人2005)执行，并且胚胎在SAGE的序贯培养基(CooperSurgical，LeisegangMedical，Berlin)中进行培养。如较早描述的(VanLanduyt等人2011)，胚胎在胚胎培养的第3天或第5/6天玻璃化，并且用于后续FRET周期中。

对于所有47个患者，仅分析与导致选择用于移植的胚胎的那些卵母细胞相关的CC，除了对于28个非妊娠患者中的7个，分析与玻璃化的胚胎有关的1个额外CC样品(除1个患者有2个CC样品之外)，所述玻璃化的胚胎在冷冻单胚胎移植周期后获得妊娠(来自7个患者的总共8个额外CC)。图1显示了用于各分析的不同样品。

基因选择

本研究是使用QPCR就卵母细胞质量评估CC基因表达的预测价值的列中的第3项。在3项研究中，我们遵循精确策略，来选择关于ICSI患者中的卵母细胞质量所分析的基因。第一项研究鉴定4种顶部基因，2种预测胚胎形态(肌醇三磷酸3-激酶A(ITPKA)和瞬时受体电位阳离子通道，亚家族M，成员7(TRPM7))，并且2种预测妊娠结局(多配体聚糖4(SDC4)和多功能蛋白聚糖(VCAN))。选择在下一项研究中包括这4种基因(Wathlet等人2012)。ITPKA和TRPM7再次与胚胎发育有关，但SDC4和VCAN这次未保留在妊娠模型中，并且当使用逐步多元回归分析时，替换为EFNB2、CAMK1D和STC1。因为几项研究显示在对于胚胎发育和妊娠结局预测性的基因之间不相关(Gebhardt等人2011；Wathlet等人2012)，所以决定在本第三项研究中仅重复3种妊娠相关基因。我们的假设是通过该‘级联’测试策略，可以通过连续研究过滤出最强的妊娠预测基因(表2)。在本研究中分析的其它9种基因是GSTA3、GSTA4、GPX3、GSR、ITPR1、SLC2A1、THBS1、TGFB1和PGR(表1)。

表1：就妊娠预测在卵丘细胞中分析的基因。

(A)指来自‘一般功能’列的信息；(B)指来自‘先前描述为人CC中的卵母细胞质量标志物’列的信息；CC：卵丘细胞；FSH：促滤泡激素；ICSI：精子卵浆内注射

表2：经过3项研究获得关于来自ICSI患者的经保存的卵丘细胞的最强质量相关基因的策略。

对于三个不同样品集的三个基因实验对象组，评价与ICSI中的相应卵母细胞的不同胚胎形态或妊娠结局相关的卵丘细胞(CC)的基因表达。在后续独立的患者样品集中测试在各样品集中发现最有预测性的基因。以粗体标记的基因保留为来自先前研究的最佳预测基因。MII：中期II卵母细胞；COC：卵丘复合物；rFSH：重组促滤泡激素；HP-hMG：高度纯化的人绝经期促性腺激素

RNA提取和cDNA合成

使用RNeasyMicroKit(Qiagen，Westburg，Leusden，荷兰)，如较早描述的(Adriaenssens等人2010)提取总RNA，包括在提取前的DNA酶步骤和5ng/μl聚(dA)(RocheAppliedScience，Mannheim，德国)的添加。提取后为第二次DNA酶处理(RQ1RNase-FreeDNase，Promega，Leiden，荷兰)。

使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-RadLaboratories，Ghent，比利时)，如先前描述的(Adriaenssens等人2010)完成逆转录(RT)。阴性对照通过在RT反应中省略酶或RNA来生成。

实时PCR

关于CAMK1D、STC1和EFNB2的引物序列在Wathlet等人2012中列出。关于GPX3、GSTA3、GSTA4、PGR、THB1、ITPRA、SLC2A1、GSR和TGFb1的引物可以在表3中发现。验证了β-2-微球蛋白(B2M)和泛素C(UBC)且其先前用作标准化因子(Wathlet等人2011)。循环条件、阴性对照、标准曲线和标准化(使用B2M和UBC)如较早描述的(Wathlet等人2011)，但所有PCR反应均适应于10μl反应。下文提及的所有值均是对于各样品针对B2M和UBC的平均值进行标准化的值。

表3:引物序列。

统计学

患者间分析

在第一项分析中，双尾t检验(用于Windows的GraphPadPrism版本4.01，GraphPadSoftware，SanDiegoCaliforniaUSA)用于比较导致妊娠或非妊娠的卵母细胞的卵丘复合物(19个活产，28个非妊娠)。所有数据均进行LOG转化，以获得正态分布。因为测试多重基因，所以邦弗朗尼校正允许仅将在邦弗朗尼校正后的P值<0.0042视为显著的。

在第二项分析中，如较早描述的(Wathlet等人2011)，使用逐步多元回归分析构建模型。简言之，使用基因表达和/或患者和周期特征(全部在表3中列出)作为应答变量(x、z、s、t、u、v、w)，构建使用等式‘y＝a+bx+cz+ds+et+fu+gv+hw’作为输出的线性回归模型。‘b-h’是包括的变量的分别指数，并且‘a’是等式的截距。如果变量的III型P值为<0.3，并且如果模型的P值得到改善，则将变量加入模型中。在模型结束时，执行后退回归步骤，以排除冗余变量。构建四种不同模型以预测妊娠。在两种模型中，仅允许基因表达值(首先模型局限于3种基因，接下来所有基因均允许进入模型，只要它们改善模型的P值)。在两种其它模型中，通过允许所有患者和周期特征进入仅包括基因的模型(当这些额外变量可以改善模型时)来评价通过患者和周期特征校正的需要。通过引入这些额外因素，关于基因表达的可能患者间变异性可以被拉平，并且增加与卵母细胞质量相关的差异。

对于所有模型，计算准确度((真阳性+真阴性)/(真阳性+假阳性+假阴性+真阴性))，以及阳性和阴性预测值(PPV＝真阳性/(真阳性+假阴性)和NPV＝真阴性/(真阴性+假阳性)。所有模型的能力通过接受者操作特征(ROC)表示，且计算曲线下面积(AUC)。

患者内分析

最后，本研究允许比较源于每卵母细胞具有已知妊娠结局的一个卵母细胞回收周期的2(或3)个卵母细胞，因为所有胚胎均在连续周期中单独移植。为此，对于在新周期中非妊娠的28个患者中的7个，将在导致妊娠的后续冷冻单胚胎移植周期中被替换的胚胎的CC与在新周期中移植的那些相比较。对于一个患者，分析两个连续的冷冻胚胎替换周期，因为第一个胚胎未以妊娠结束。基于当首先加入妊娠模型时，其添加P值或其在上述模型之一中的存在，选择七种基因用于该分析。对于每种基因执行配对t检验，并且用来自患者间分析的较早定义的模型计算妊娠机会，所述模型仅含有基因且对47个CC样品(19个活产)构建，但排除来自冷冻周期的8个CC样品。

结果

患者群体

在妊娠和非妊娠组的患者和周期特征中未发现统计学差异(表3)。两组患者的平均年龄和BMI很低，但是可比较的。孕酮水平在两组中很低。平均周期数尝试在两组中并无不同：在妊娠和非妊娠组中分别有12和17个患者经历其第一个周期，6和10个患者经历其第二个周期，并且两组中分别有1个患者经历其第三个周期。卵母细胞成熟和受精百分比在两组中均为正常的，并且在第3天的良好质量胚胎百分比超过50％。在移植时刻的胚胎质量得分对于两组并无不同。十九个新SET周期导致活产。

表3:患者和周期特征。

COC：卵丘复合物；相对E2:E2/回收的COC；卵巢应答：(回收的COC/促性腺激素剂量)x100；卵母细胞成熟：MII/回收的COC的比率；2PN：ICSI后2PN/完整卵母细胞的比率；≥7细胞第3天＝在第3天时具有至少7个细胞的胚胎/2PN的比率；低破碎：在第3天时具有<10％破碎的胚胎/2PN的比率；良好质量胚胎：在第3天时具有<10％破碎和至少7个细胞的胚胎/2PN的比率；^a如在hCG日测量的血清值；ns:P>0.05；SD＝标准差。

妊娠预测

使用在先前样品集上构建的模型验证预测基因(CAMK1D、EFNB2和STC1)

在目前的独立患者系列中测试在先前研究(Wathlet等人2012)中考虑的包括3种基因的预测妊娠的模型。在先前获得的等式中引入关于47个患者的CC的CAMK1D、EFNB2和STC1的基因表达值，并且获得预测对于47个卵母细胞各自的妊娠机会的值。用本研究的47个样品计算获得的PPV和NPV为62％和86％，具有72％的准确度。

患者间分析：在目前样品集中的所有12种基因的t检验

未导致妊娠的28个卵母细胞的卵丘复合物与导致活产的卵母细胞的19个CC相比较。仅EFNB2在妊娠组中统计上更高。CAMK1D、GSTA4和GSR仅显示在妊娠组中更高表达的趋势(分别的P值：0.0068、0.0123和0.0507)。关于所有基因的图表均可在图2中发现。

患者间分析：逐步多元回归分析

在构建妊娠模型的第一步中，对于所有基因计算当作为第一变量添加时的添加P值，并且可见于表4中。

表4：关于测试的不同基因的添加P值

当每种基因作为第一变量插入妊娠模型时，获得添加P值。基因以渐增的P值排序。

变量	添加P值	变量	添加P值
				EFNB2	0.01	STC1	0.38
GSTA4	0.01	TGFB1	0.43
				GPX3	0.04	ITPR1	0.50
CAMKID	0.05	SLC2A1	0.61
				GSR	0.06	THBS1	0.68
PGR	0.16	GSTA3	0.75

首先，模型局限于包括12种基因中的3种(模型1)。保留EFNB2、GSTA4和PGR，且获得具有P值0.0015、PPV68％、NPV79％、准确度73％和AUC0.82的模型。当尝试通过还允许患者和周期特征(来自表3)来改善该模型时，未发现对先前模型的改善(模型1bis)。

在下一步中，如果改善P值，允许超过3种基因进入模型内(模型2)。12种基因中的五种在该模型中被保留(即EFNB2、GSTA4、PGR、GPX3和GSTA3)，其获得P值<0.0001，伴随PPV78％、NPV83％、准确度81％和AUC0.93。添加患者和周期特征改善模型(模型3)。保留的参数为：刺激天数、相对E2和年龄。扩展模型的PPV、NPV和准确度均增至93％并且AUC增至0.95(表5)。完全数学模型可以在表6中发现。ROC曲线显示于图3中。

表5：用于活产预测的多参数模型的示意性概述。

仅列出至少保留一次的基因和因素。在模型1中，保留最多三种基因以使模型完结。在模型2中，如果可以改善模型的P值，允许不受限制数目的基因进入模型内。为了尝试改善模型1和模型2，允许来自表3的患者和周期特征进入模型内。仅模型2可以得到改善且导致模型3。x：显著改善模型的因素；#：数目；‘不受限制’指如果可以改善模型，则所有12种基因均允许进入模型的事实；stim：卵巢刺激；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值；AUC：曲线下面积；^a：模型中的最终III型P值<0.01；*仅包括42个患者以构建该模型，因为在hCG日的E2值对于5个患者丢失。

表6：用于妊娠预测的数学模型

用于使用卵丘细胞基因表达值以及患者和周期特征预测妊娠结局的完全数学模型。#：数目

患者内妊娠预测

对于七个患者，分析与冷冻保藏的胚胎相关的冷冻保存的CC样品，所述冷冻保藏的胚胎在后续移植周期中在移植后导致临床妊娠。该材料用于分析上文获得的多参数模型中存在的基因(表6)和/或具有最小添加P值的5种基因(表4)，即CAMK1D、EFNB2、GPX3、GSR、GSAT4、GSTA3和PGR。作为第一种探究方法，执行关于那七种基因的配对t检验，其可见于图4中。五种基因在导致妊娠的卵母细胞的CC中具有向上趋势(P值<0.05；在关于多重比较的邦弗朗尼校正后，仅P值<0.07是显著的)：EFNB2(在妊娠和非妊娠之间的唯一的显著差异)、CAMK1D、GSR和PGR.GSTA4、GPX3和GSTA3均具有P值>0.05。计算来自相同患者的CC之间的倍数变化，并且制备平均值/基因(从1.1到2.5)(表7)。对于在配对t检验中具有P值<0.1的五种基因，基于由配对t检验预期的水平(例如与非妊娠相关的CC相比较，在妊娠中预期更高的表达)，正确估计的CC的百分比为71％-88％。在下一步中，在患者间分析(47个CC样品)中获得的多参数模型(3基因模型(＝模型1)和5基因模型(＝模型2))的预测力用于就其妊娠机会给每个患者的CC排序(表6)。因为所有患者和周期特征对于单个回收周期内的卵母细胞是相同的，所以使用含有这些变量的模型明显是无意义的。除了患者4之外的所有CC均就其妊娠机会正确排序(表7)。

表7：未导致妊娠的新周期与导致妊娠的冷冻移植周期的基因表达水平的比较(患者内分析)。

该表给出了患者内分析的概述。每一排代表一个卵丘复合物。每个患者分析来自1个回收周期的2或3个卵丘复合物。基因表达水平的比率始终是妊娠相对于非妊娠。对于患者6，妊娠FRET周期的卵丘复合物与新的和FRET非妊娠周期的卵丘复合物相比较。模型1和2分别为用来自表5的3和5种基因构建的模型。通过将表达值插入来自表6的数学模型来获得排名。排名编号‘1’是具有实现妊娠的最高机会的卵母细胞。ns：不显著；na：不适用；nlr：非线性相关。^a：表达值在妊娠和非妊娠之间并非更高或更低，如基于较早结果预期的。^b：排名使用多参数模型是不正确的。FRET：冷冻胚胎移植周期。

讨论

在本研究中分析CC中的12种基因的表达及其预测其围绕的卵母细胞的妊娠潜力的能力。包括了来自先前研究(Wathlet等人2012)的三种基因(CAMK1D、EFNB2和STC1)，其中它们作为用于妊娠预测的最具预测性基因出现。EFNB2在目前的研究中在来自获得妊娠的卵母细胞的CC中也显著上调，并且CAMK1D显示相同趋势(P＝0.0068)。在该独立的患者组中验证使用CAMK1D、EFNB2和STC1的包括仅来自先前患者数据集的基因的模型，并且获得模型的相似总体表现，在目前的研究中具有72％的准确度，而在先前研究中具有79％的准确度。

除来自我们的先前研究的EFNB2和CAMK1D之外，两种新近研究的基因GSTA4和GSR也显示在妊娠组的CC中的上调趋势。

多参数方法测试是否能够通过使用目前样品集中的12种测试基因中的仅3种预测活产(患者间分析)。3种最具预测性的基因为GSTA4、PGR和EFNB2，并且导致与具有EFNB2、CAMK1D和STC1的先前模型相似的准确度(73％相对于72％)。使用三种基因，患者或周期特征无一可以改善该模型，提示三种基因的表达受患者和周期因素最低影响。活产模型可以通过包括两种更多的基因(GPX3和GSTA3)得到改善，其使准确度增加高达81％且导致0.93的AUC。该5基因模型使用三种患者和周期特征(年龄、相对E2和刺激天数)得到改善，并且导致具有93％的PPV、NPV和准确度的最佳化模型，但与仅含有基因的模型具有相似的AUC。理想地，基于基因表达的妊娠预测使用有限的基因集以减少分析时间和成本应是可能的。在该患者群体中测试的12种基因中，2种出现频率最高的基因是GSTA4和EFNB2(参见表5)。这2种基因存在于所有3个妊娠模型中，并且分别在3个预测模型中的3个和3个预测模型中的2个中具有III型P值<0.01。该模型还显示基因表达值始终比患者和周期特征更重要，因为模型中的III型P值仅对于基因是显著的，而对于患者和周期特征并不显著。此外，AUC结果在仅含有基因的模型以及组合基因以及患者和周期特征的模型之间是可比较的。

对于7个患者，分析来自产生具有良好形态并被连续移植的胚胎的卵母细胞的2(或3)个CC(患者内分析)。对于所有卵母细胞，妊娠结局是已知的，因为在后续SET周期中完成所有胚胎移植。通过评价7种基因(EFNB2、CAMK1D、GSR、PGR、GSTA4、GSTA3和GPX3)的表达，基于模型中的单一基因或其组合，容易评估两个考虑的卵母细胞中的哪一个具有最高的妊娠机会。当个别察看每种基因时，对于CAMK1D、GSR、EFNB2、PGR和GSTA4发现最佳预测，具有71％-86％正确估计。根据较早模型，通过组合3或5种基因，7个患者中的6个具有正确预测妊娠机会的卵丘复合物。当使用3或5基因模型时，这种预测是相同的。令人惊讶的是，相比单基因分析，多参数模型对不同患者失败。多参数方法看起来比个体基因更强，因为关于患者6的第二次比较，所有基因均错误预测妊娠结局，但多参数模型成功预测，尤其当未考虑导致妊娠的卵母细胞的CC用于构建预测模型时。多参数方法对于患者4的失败预测(其中各基因在5种中的4种是正确的)可能是由于其它因素(例如在移植时刻的子宫内膜状态)引起的。尽管这种分析在患者数目中仍是受限的，但这些结果是鼓舞人心的。这是证实下述的首个研究：预测患者间的妊娠的一些基因还可能能够使用多参数方法给患者内的卵母细胞质量排序，且提供关于每个卵母细胞的妊娠机会。CC基因表达分析可能变成ART实验室中有价值的工具，但明显未考虑到弱精子质量和异相子宫内膜的最终影响。

本研究可以证实较早发现的预测基因在新患者群体中的用途，其中使用相同的刺激方案，但培养基不同。该数据提示在两个研究中使用两种不同培养基分析的唯一基因，EFNB2和CAMK1D，不受培养基影响。为了测试目前模型的有效性，未来分析应涉及具有不同刺激方案的患者和不同培养基。本研究的特定基因对于妊娠预测为何重要的原因仍是推测性的。如先前提及的(Wathlet等人2012)，在其它途径中，通过其与类固醇相关基因(CYP11A1、STC2和HSD3B1)的强关联，CAMK1D可能与类固醇生成相关。在该数据集中，CAMK1D也与类固醇相关基因(即紧靠EFNB2和GSTA4的PGR)强关联(使用皮尔森关联分析，均为P<0.0001)，仍留下CAMK1D可以与之相关的超过一种途径的可能性。在妊娠模型中PGR的存在及其在患者内的预测力可以指示：类固醇相关基因可有助于妊娠预测。PGR先前已得到描述，但使用定量PCR无法证实在妊娠和非妊娠之间的差异(Hamel等人2010b)。在一些妊娠模型中存在的GSTA3也具有与孕酮生产的联系(Raffalli-Mathieu等人2008)，重申类固醇生成途径的重要性。EFNB2在卵巢中的功能仍是未知的，但已提出B类肝配蛋白与黄体化过程相关(Egawa等人2003)，并且与非整倍体卵母细胞相比较，发现肝配蛋白B2受体在来自正常卵母细胞的CC之间差异表达(Fragouli等人2012b)。在测试的其它基因中，仅谷胱甘肽家族的成员保留在模型中或在t检验中是显著的。谷胱甘肽酶对于细胞中使用通过谷胱甘肽的(自由基的)解毒作用是重要的。缺氧导致活性氧(ROS)的形成，所述活性氧可以引起脂质过氧化、酶失活和细胞损伤，导致不仅在CC中，而且在卵母细胞(Tatemoto等人2000)中的细胞凋亡(Buttke和Sandstrom1994)。氧化性应激已经由其它团体报道为评价卵母细胞质量的可能靶(Lee等人2010；vanMontfoort等人2008)。这些途径的一些转录物在来自产生妊娠的卵母细胞的CC中更高的一个原因可能是在需要时，这些卵母细胞受到更好的保护以抵抗应激环境。

结论

通过在对其中卵丘复合物进行每卵母细胞个别冷冻的不同患者组的三个连续研究中逐批测试推测重要的基因，我们保留了对于妊娠的最具预测性基因，并且每次使这些与新候选基因对立。该‘级联’策略尝试通过使用CC基因表达作为ART中的卵母细胞的质量标志物，来增加妊娠预测力。该策略证明是有效的，因为具有来自第二项研究(Wathlet等人2012)的EFNB2、CAMK1D和STC1的模型可以在独立的患者样品集上得到证实。在进一步改善关于活产的预测模型的尝试中，构建了模型(患者间分析)，仍保留EFNB2连同PGR以及与谷胱甘肽代谢相关的基因。新模型证明为能够就其妊娠潜力给卵母细胞排序(患者内分析)。为了常规应用，我们的目前模型的有效性仍需要允许患者内分析的在更大和更多样化的患者群体中的前瞻性评价。

实施例2–外显子水平分析

执行三个微阵列实验，并且其所得到的数据导致4个微阵列分析。下文分别命名为微阵列分析1、2、3或4(参见下表14)。阵列实验1和2用于数据挖掘(为了发现对于卵母细胞能力预测性的基因或基因的外显子)，并且阵列实验3用于过滤经常出现的预测基因(发现可更一般应用的基因或外显子，因为它们在不同生育中心中和在略微不同的处理后是预测性的)。最新型的分析基于微阵列实验2，其包含对于活产的患者内和周期内(来自相同刺激同类者的卵母细胞)分析。

材料：

对于三个微阵列实验，如先前描述的收集卵丘细胞(Wathlet等人2011)。如Wathlet等人2011中描述的，使用QiagenRneasymicro试剂盒提取RNA。使用Bioanalyzer(Agilent)和Nanodrop(ThermoScientific)验证RNA的质量和数量。

对于第一集合中的微阵列，通过从100ng总RNA和1轮基于T7的扩增开始执行扩增(MessageAmpII-BiotinEnhanced，Ambion)。验证良好质量aRNA(尺寸分布，3’/5’比和存在的调用％)，并且在SalkInstitute(USA，SanDiego)执行Affymetrix人基因组U133Plus2.0测定。使用Genesifter(PerkinElmer)执行基因读出的进一步分析。对于阵列实验2和3，将RNA提取，测量且如上所述评估，但使用NugenV2试剂盒执行扩增。对于阵列实验2和3两者，阵列为Affymetrix人基因ST阵列。数据主要在MicrosoftExcel中进行分析。

方法：

患者内比较包含源于相同患者以及相同刺激和挑选周期的阳性样品(在单胚胎移植中导致妊娠的卵母细胞的CC)和阴性样品(在单胚胎移植后导致无妊娠的卵母细胞的CC)两者。

比较或分析使用常规或配对t检验一参数地和使用逐步多回归分析多参数地执行。多参数方法导致增加预测力的基因或外显子组合。

目标：

发现在ART处理后对于活产预测性的基因或基因的剪接变体(外显子)。这在患者内比较中完成。

设置和第一结果(阵列分析1和2)：

在2006年执行的阵列实验1包含对于活产的患者间比较和对于胚胎发育的患者内比较。患者预处理为与HP-hMG组合的GnRH激动剂。这导致2个质量列表：包含超过500种基因(“Q1”＝对于成功卵母细胞和胚胎发育预测性的基因，“Q3”＝对于活产预测性的基因)。

阵列分析2在2012年1月执行，并且由对于5个患者的关于活产和延迟发育的患者内分析和15个阵列组成，并且导致具有差异调节的基因的几个列表。患者在这种情况下用GnRH拮抗剂和重组FSH进行预处理。

阵列实验3仅用作微阵列分析4中的证实数据集，并且在下文进一步描述。

表14：通过FOBI的微阵列实验

阵列分析4：阵列实验2+3在外显子水平上的微阵列数据的重新分析

在寻找对于妊娠预测性的在卵丘细胞中表达的基因中，我们惊讶地发现对于一些基因，这些基因的剪接变体的特定组合是预测性的。该发现使用目前实验室可获得的2种最标准的分析方法(微阵列和QRT-PCR)是非显而易见的，如下文所说明的。

在本研究领域中，最常应用的微阵列分析(Affymetrix人基因组U133Plus2和Affymetrix人基因ST阵列)评估/考虑每种基因获得的一个一般性(平均)表达值，其基于识别与特定基因相关的编码和非编码RNA的一些部分的4种或更多种探针获得。这个数字反映与特定基因相关的大量RNA分子的丰度或不存在，但未获得关于特定剪接变体调节的信息。

另一方面，备选的“标准”分析技术，即在逆转录后的定量PCR(RT-QPCR)，通常仅分析1个外显子的丰度，其对于大多数基因对应于仅评估该特定基因的剪接变体的特定级分。

特别地，研究超过1种剪接变体是有意义的，因为特定剪接变体可以编码蛋白质的组织特异性(例如卵丘细胞特异性)或分泌的或更具活性的形式。备选剪接变体(通常为更短形式)还可以具有调节功能并实际地下调蛋白质的量或效应。因此，组合关于特定基因的不同剪接变体的信息容纳更多信息，但也需要更多调查时间和资源，并且通常不可实现。

然而，在本研究中，我们在外显子水平上重新分析了前述阵列实验。在该实验中，如下所述在阵列实验2中选择在外显子水平上预测成功受精、胚胎发育和植入的基因。

样品：

对来自五个ICSI患者的15个卵丘样品执行十五个Affymetrix微阵列。CC源于导致3个结果类别的卵母细胞：1.具有高形态得分的胚胎(胚胎质量1)，其被移植且导致妊娠(P-CC)，2.具有高形态得分的胚胎(胚胎质量1)，其被移植但未导致妊娠(NP-CC)，和3.发育太缓慢从而未考虑用于移植的胚胎(NT-CC)。

考虑用于本研究的患者用GnRH拮抗剂和rFSH进行刺激，并且在第一次单胚胎移植后未妊娠，并且返回用于导致妊娠的单个冷冻胚胎的移植。如此，来自类别1、2或3的CC样品源于1个挑选周期，并且这因此允许患者内分析。

分析：

该分析在外显子水平上执行。执行四次比较，3次是比较3种条件的ANOVA，1次是执行2个t检验来比较最佳条件，1个t检验比较P-CC与NP-CC和1个t检验比较P-CC与NT-CC。患者变量被视为t检验比较中的随机变量，并且在关于5个患者的ANOVA分析中一次随机和一次固定，并且在5个患者中的3个的ANOVA比较(仅考虑在第5天时获得移植的患者，且不考虑在第3天时获得移植的2个患者)中被视为随机的。

基因视为潜在有利的，如果它们：a)在P-CC与NP-CC和NT-CC之间差异表达，b)在相同方向上不同(例如在2种阴性对照样品中向下)，c)差异中的至少一个为>1.5，伴随q<0.1(假发现率)，和d)保留该基因的超过一个外显子。

结果：

这导致作为本专利申请主题的34基因列表。这些随后补充迄今为止来自较早列表的十一种最强的基因(Q1+2+1.246–上表14)，这导致45列表(表13)。这些在阵列实验3中使用逐步多元回归分析在外显子水平上进行过滤。简言之，在阵列实验3中，112个微阵列可得自112个患者的个体CC，所述患者在单胚胎移植周期(SET-周期)后是妊娠或是非妊娠的。来自这112个患者中的表13基因的所有外显子值被考虑用于使用逐步多元回归分析来构建预测模型。这在多个回合中完成以补偿过高数目的变量，并且使用交叉验证来执行以防止过度拟合。这导致保留最有力的基因组合，其产生“11基因列表”(SASH1、MROH9、NCOA7、DNAH3、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、GALNTL6、SPTBN5、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、EFNB2)。(表8)

“11基因列表”由最具预测性的外显子水平基因组合组成，并且因此是本申请的核心。原始“45基因列表”含有与其相关的其它基因，并且需要时，可以最终替换11种基因中的一种或多种。这样的一个例子在下文给出且在表11中更详细地讨论。简言之，发现关于GnRH拮抗剂和rFSH刺激的患者的强卵母细胞能力预测模型含有CAMK1D外显子9、HSPH1外显子2和NCOA7(准确度＝73％ROC-AUC＝0.733)，但对于相同患者，具有CAMK1D外显子9、HSPH1外显子6和NCOA7的模型也预测卵母细胞能力，即使它的预测力稍微更小，(准确度＝68％ROC-AUC＝0.714)。

表8

NCOA7*也在基因水平上。可以使用外显子中的任一。

结论：

几种基因和基因的特定外显子已在包括经历不同预处理的患者的阵列实验中与活产和胚胎发育成功相关，并且这些也在独立的阵列数据集(阵列实验3)中得到证实。第3个阵列实验的强有力性是因下述事实：它对来自三个不同欧洲场所的样品执行。由此，与迄今为止的任何已知的基因组合相比较，保留的最终基因子集应是可更普遍应用的。为了测试这点，从这个11种基因的子集开始执行两个证实实验，以证实前述基因在预测卵母细胞能力中的能力。第一证实实验是回顾性研究，包括患者内和患者间分析，并且第二研究是3个患者组中的前瞻性研究。

实施例3–回顾性研究

回顾性研究用从两个临床场所中的107个患者中收集的样品执行。QPCR对于三个不同分批中来自11基因列表的7种卵母细胞质量标志物(HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9、EFNB2、NCOA7、SASH1)和2个内源对照(UBC和B2M)特异性的外显子执行(表9)。

表9：可用于概念证明研究的样品。B1/2/3＝分批1/2/3，场所1+2＝欧洲和美国生育中心，患者预处理＝与rFSH或HP-hMG组合的GnRH拮抗剂，和妊娠结局＝移植后妊娠至少2周，非妊娠＝在移植后无妊娠，延迟的＝胚胎发育缓慢且不考虑用于移植

卵丘细胞收集：

卵丘细胞样品在一个欧洲和一个美国生育中心(表9)收集，并且源于获得一个胚胎/移植(SET＝单胚胎移植)且证明妊娠或非妊娠的患者。这允许有能力和能力较小的卵母细胞的CC的回顾性比较。这是最显而易见的方法，但卵母细胞源于不同患者(＝患者间分析)，并且这导致未受控制的一些患者间变异。还存在患者子集，其获得来自单个卵母细胞收获操作(挑选)的2次或更多次连续的单胚胎移植，其导致妊娠或非妊娠，因此在回顾性研究中还允许CC的患者内比较。

已收集三类卵丘细胞样品：来自其胚胎被移植且导致妊娠的卵母细胞的样品，来自被移植但未导致妊娠的良好质量胚胎的样品，以及来自延迟胚胎的卵丘样品。延迟的胚胎是发育较缓慢的胚胎，其视为指示弱卵母细胞能力，并且这些胚胎因此不考虑用于移植。来自延迟胚胎的卵丘样品用作具有产生妊娠的卵母细胞的那些患者的患者内阴性对照。导致妊娠和非妊娠(以后称为妊娠相对于非妊娠)的形态相同胚胎的CC之间的区别视为比导致妊娠或导致在体外发育期间延迟的胚胎(以后也称为“妊娠相对于延迟的胚胎发育”)的卵母细胞的CC之间的区别更重要，因为后者的信息对于执行延长胚胎培养的实验室是已经可用的。

所有患者均经历使用GnRH拮抗剂和rFSH或HP-hMG的卵巢刺激，并且最初根据处理组进行分析。

统计学：

在统计分析期间，首先使用采用斯氏t检验(配对和非配对的)的一参数方法。其次，使用关于二元响应的逐步多元回归分析构建交叉验证的多参数模型。

结果1.：患者内分析

a)一参数的：妊娠相对于延迟的胚胎发育

在导致妊娠或延迟的胚胎生长的卵母细胞的CC之间(n＝8)的一参数分析(配对t检验)中，我们研究了7种基因，并且发现在7种基因中的4种中的一致上调(表10)。CAMK1D外显子1和NCOA7在88％的情况下是上调的，而CAMK1D外显子9和SASH1在75％的患者中是上调的。然而，由于大的患者间变异，未达到显著差异(配对t检验p值范围为0.14至0.24)。

b)一参数的：妊娠相对于非妊娠

在相同患者的导致妊娠或非妊娠的卵母细胞的CC之间(n＝7)的比较中，研究的7种基因中的3种显示在71至86％的患者中的一致上调：EFNB2、CAMK1D外显子1和CAMK1D外显子9。显著性由CAMK1D外显子1(p0.021)达到。一种基因即HSPH1外显子6显示在71％患者中的一致下调。

该第一项患者内分析因此证实：与相同患者的导致良好形态胚胎(其未导致妊娠或导致延迟胚胎)的卵母细胞的CC相比较，一种已知的卵母细胞质量标志物基因即CAMK1D在导致妊娠的卵母细胞的CC中上调。这些结果还证实三种新基因的相关性：NCOA7、SASH1和HSPH1。

表10：n＝患者数目，#ok＝具有上调或下调的患者％，妊娠中＝在妊娠患者中，基因是上调或下调的

相似背景下的较早结果指示多参数方法增加正确预测的样品的数目(Wathlet等人，2013)。因此，我们还对相同样品执行多参数患者内分析。

c)多参数的：妊娠相对于延迟的胚胎发育或非妊娠

更复杂的多参数分析导致具有EFNB2和NCOA7的强妊娠预测模型，显示73％的准确度和0.772的ROC-AUC。更详细的结果在下文提供(表11和图5)。这进一步证实已知的和新型的CC基因作为卵母细胞质量标志物的预测质量。

结果2：患者间分析

为了增加样品大小，还对来自2个场所的样品执行患者间分析。这种额外分析应提供可更一般性应用的模型。

虽然相同基因预测用GnRH拮抗剂和rFSH或HP-hMG刺激的患者中的卵母细胞能力，但对于一些基因，关联性是相反的(例如图6和7中的CAMK1D)。为了便于解释，此处构建且描述了预处理特异性模型。这些将随后组合到具有处理特异性指数的一个数学模型内(Adriaenssens等人2010中较早应用的)。

a)GnRH拮抗剂和rFSH刺激的患者，妊娠相对于延迟的胚胎发育

患者内分析指示此处分析的七种基因中的四种可以用于区别导致妊娠或导致发育延迟的胚胎的卵母细胞的CC。

然而，在目前的GnRH拮抗剂和rFSH刺激的患者中，患者间变异看起来阻止强数学模型的构建。45列表的额外基因的添加可避免这点。

b)GnRH拮抗剂和rFSH刺激的患者，妊娠相对于非妊娠

对于在分批1、2和3中的GnRH拮抗剂和rFSH刺激的患者(n＝34个妊娠和29个非妊娠患者)，获得含有3种基因的强卵母细胞质量预测模型。两种基因即CAMK1D外显子9和HSPH1外显子2与妊娠正相关，并且NCOA7是负相关的。更详细的结果在下文提供(表11和图6)。该模型的准确度为73％，并且AUC为0.733。该模型目前用于GnRH拮抗剂和rFSH刺激的患者的前瞻性研究中。

c)GnRH拮抗剂和HP-hMG刺激的患者，妊娠相对于延迟的胚胎发育

已发现，关于拮抗剂HP-hMG患者区别导致妊娠的卵母细胞的CC与导致具有延迟发育的胚胎的卵母细胞的CC(n＝20)的多参数模型，具有高准确度(80％)和AUC(0.8081)。SASH1与妊娠正相关，并且CAMK1D外显子1与妊娠负相关。更详细的结果在下文提供(表11和图7)。SASH1表达还与CAMK1D外显子9、NCOA7表达关联。CAMK1D外显子1表达与CAMK1D外显子9表达关联。

d)GnRH拮抗剂和HP-hMG刺激的患者，妊娠相对于非妊娠

在GnRH激动剂和HP-HMG患者(n＝24)中的妊娠相对于非妊娠多参数模型也很强(准确度＝75％和AUC＝0.8392)，并且还在很大程度上取决于SASH1表达与卵母细胞发育能力的正相关(详细数字未显示)。

表11：在回顾性QPCR研究中在不同亚群中的基因模型(当有关时，外显子水平)及其预测值的示意性概述

*关联的基因是在模型中显示与基因的强关联的基因，并且因此不通过多元回归分析进行选择。这些中的一些还具有强预测力，并且可以用作测试中的“另外”基因。这通过备选拮抗剂/rFSH患者间妊娠与非妊娠模型加以证实，其中HSPH1外显子2替换为HSPH1外显子6。

回顾性研究的结论：

被选择为阳性对照基因的CAMK1D外显子9和EFNB2在目前数据集中在患者内和患者间分析中均被证实。

卵母细胞能力和可专利性基因的表达之间的相关也通过在不同类型的ART预处理后，其在预测模型中的牵涉加以证实。HSPH1外显子2和NCOA7保留在对于拮抗剂/rFSH刺激的患者的最终模型中。SASH1是对于拮抗剂/HP-hMG刺激的患者的有力预测基因。HSPH1外显子6和EFNB2未保留在最终模型中的事实并非暗示这些标志物与卵母细胞能力无关；由于它们与其它标志物关联(HSPH1外显子6与HSPH1外显子2关联，并且EFNB2与CAMK1D表达关联)，并因此在回归分析中被拒绝。

实施例4–前瞻性研究

使用较高描述的卵母细胞能力预测模型的2个，通过FOBI执行病例对照评价者不知情的前瞻性研究(图6和7)。该研究包含3组患者：具有形态胚胎分级(如Wathlet等人2012中描述的)和第3天胚胎的移植和CC基因分析的实验组，以及具有单独的形态胚胎分级和第3天或第5天胚胎移植的2个对照组。包括2个对照是因为妊娠率在两种移植方案之间不同。第5天移植轻微增加第一个周期中的临床妊娠率，但累积妊娠率在第3天移植周期中更高(Glujovsky等人Cochranereview2012)。

目标：

目标是通过比较围绕每个卵母细胞的CC中的特定基因的表达，在得自每个患者的卵母细胞库内鉴定具有最高能力的卵母细胞。将源于该卵母细胞的胚胎移植回给患者。与无CC评估的匹配患者(即移植胚胎的选择仅由常规的形态胚胎分级决定)相比较，与形态分级组合的CC基因表达分析预期增加这些患者的妊娠机会。

患者群体和分析的基因：

本研究包含17个患者。包括的患者是来自ART诊所的患者，其预定用于使用胞质内精子注射(ICSI)和在3天胚胎培养(一般为8细胞期胚胎)后的单胚胎移植的能育性处理。允许的患者预处理是GnRH拮抗剂加上rFSH或HP-hMG，并且图5和6中所述的基因表达模型分别用于这些患者。

分析的基因(CAMK1D外显子9、CAMK1D外显子1、HSPH1外显子2、NCOA7、SASH1)源于本专利申请中提交的11和45基因列表。

程序中的不同步骤：

本研究包括下述步骤：

1.当患者签署知情同意书时，通知且包括患者，

2.照常从这些患者中收集卵母细胞

3.照常使用cumulase从其卵丘细胞中分别释放卵母细胞

4.将卵丘细胞立即处理或冷冻

5.卵母细胞进一步用于能育性处理(在目前研究中：ICSI和胚胎培养)*

6.评价在卵丘细胞中的特定基因的表达

7.所获得的CC得分潜在指示最有能力的卵母细胞(具有最高的活产机会)，并且用于选择在对于每个患者可获得的具有最佳形态级别的胚胎之间最有希望的胚胎

8.将单胚胎植回给患者**

9.对于基于CC基因表达获得胚胎移植的每个患者，以评价者不知情方式在无CC基因表达分析的情况下选择在第3天(一般为8细胞胚胎)和第5天(一般为扩大的胚泡)时具有胚胎移植的匹配患者(相同年龄类别、相似的预处理且具有相同量的可用于移植的良好质量胚胎)。

10.对于3组患者(实验组和2个对照组)，评估植入和妊娠率。

备注：*该步骤可以包括卵母细胞冷冻用于以后使用，最终处于补充有营养素的特定培养基中以补偿在CC基因表达结果中观察到的缺陷。

**CC评分可以独立使用或与形态或者其它卵母细胞、精子或胚胎评估方法组合

卵丘细胞基因表达评估：

特定基因的表达在每个卵母细胞的CC中进行定量。每种基因的绝对表达针对相同CC样品中的2种内源基因的表达标准化，以补偿样品间的细胞数目差异和技术变动。标准化的表达值随后用于图6和7中所述的数学式中，并且导致关于每个卵母细胞的得分。该得分越高，该卵母细胞导致活产的机会越高。

结果：在使用基于CC基因表达的卵母细胞评估时的妊娠率

在17个患者中，8个具有GnRH拮抗剂rFSH预处理，并且9个具有GnRH拮抗剂HP-hMG预处理。CC评估的有利效应对于第3天移植方案是明显的(图7)。与具有第3天胚胎移植且无CC测试的那些患者相比较，对于具有第3天胚胎移植和CC测试的患者的妊娠机会要高2x。当与具有第5天胚胎移植的患者相比较时，目前的患者数目太有限而无法证实增加的显著性。

表12：前瞻性研究中的中间结果

灰色＝实验臂中的17个患者，白色＝2个对照组，显著性＝基于比较实验组与各对照组的卡方检验，ns＝p>0.05，妊娠＝至少2周妊娠(2次连续阳性的hCG检测)。

前瞻性研究的结论：

如上所述在诊所中实施CC测试分析显著增加对于研究中涉及的患者的妊娠机会，并且因此证明作为本专利申请主题的基因的相关性。

在该原理证明实验中使用的模型含有2和3种基因。根据较早的微阵列实验(其中分析更多基因和更多患者)，我们已知添加更多基因(高达至少5或6种)将进一步改善模型的预测力。这项工作目前正使用来自本专利的列表的更多基因进行。

一般结论：

45卵母细胞质量标志物基因列表源于使用UZBrussel患者的2个阵列实验，并且使用来自第3个独立阵列实验的数据交叉验证，所述第3个独立阵列实验含有来自3个不同的欧洲生育中心的超过100个患者。这种方法应提供可靠的标志物基因和基因组合/模型，以预测治疗结果。

作为概念证明，使用备选技术(QPCR)，对来自在2个生育中心处收集的新患者的CC样品，测试含有4种新型基因的7种基因子集。所述4种基因被证实为有价值的卵母细胞质量标志物。这证实所提出的基因列表含有有效的卵母细胞质量预测基因。

最后，在前瞻性研究中测试了基因模型，其中妊娠率在其中基于CC中的上述卵母细胞质量标志物基因的表达选择胚胎的患者中增加。

后面一项研究在经历通过ICSI的标准处理的ART诊所的患者中执行，并且因此证实卵母细胞质量标志物在临床背景下的适用性。

参考文献：

GlujovskyD，BlakeD，FarquharC，BardachA.Cleavagestageversusblastocyststageembryotransferinassistedreproductivetechnology.CochraneDatabaseSystRev.2012Jul11；7

WathletS，AdriaenssensT，SegersI，VerheyenG，JanssensR，CouckeW，DevroeyP和SmitzJ，Newcandidategenestopredictpregnancyoutcomeinsingleembryotransfercycleswhenusingcumuluscellgeneexpression，FertilSteril98，432-439，2012.

表13：基因列表

Claims

1.用于检测生物标志物基因或其剪接变体的方法，所述生物标志物基因或其剪接变体用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力；所述方法包括：

-使用活产和胚胎发育作为待使用的卵母细胞的选择终点；

-在样品中进行基因表达的外显子水平分析，所述样品包含与所述卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞；

-对于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的生物标志物基因，仅将在配对t检验中的p值<0.05视为显著的。

2.根据权利要求1的方法，其中在包含表13的基因的实验上执行基因表达的所述外显子水平分析。

3.用于在实验中使用来自卵母细胞的卵丘细胞基因表达来检测基因或剪接变体的生物标志物基因组合模型的方法，其包括：

a.使用权利要求1或2的方法检测至少2种生物标志物基因；

b.使用双尾t检验来比较导致妊娠或非妊娠的所述至少2种生物标志物基因的卵丘生物标志物基因表达组合，并且保留具有I型p<0.05的截断值的所述至少2种生物标志物基因的组合作为模型，来预测哺乳动物卵母细胞在能够活产或者用于评估胚胎或胚细胞体外发育的能力；

c.进行逐步多参数回归分析，以确定所述至少2种生物标志物的剪接变体是否具有III型p值<0,3，并将所述剪接变体加入步骤b中保留的模型；和

d.测定包含步骤c的剪接变体的模型的总体p值，并且当所述总体p值进一步降低时，将所述剪接变体保留在所述模型中。

4.用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，测定使用权利要求1或2的方法鉴定的生物标志物基因表达水平；或使用权利要求3的方法鉴定的生物标志物组合的生物标志物基因表达水平；和

-基于所述表达水平，评估所述卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力。

5.根据权利要求2或4的体外方法，其中对选自CAMK1D、PTGS2、EFNB2、VCAN、STC1、STC2、PGR和GPX3的基因的剪接变体执行基因表达的外显子水平分析。

6.根据权利要求4的体外方法；其中所述一种或多种生物标志物基因选自SASH1、MROH9、NCOA7、DNAH3、HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、GALNTL6、SPTBN5、CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9和EFNB2。

7.根据权利要求4的体外方法，其中所述生物标志物的组合选自包含下列的列表：

●EFNB2和NCOA7；

●CAMK1D外显子9和HSPH1外显子2和NCOA7

●CAMK1D外显子9和HSPH1外显子6和NCOA7

●CAMK1D外显子1和SASH1；和

●EFBN2和SASH1。

8.用于评估哺乳动物卵母细胞导致分娩、植入、形成植入前胚泡或胚胎和/或导致受精的能力的体外方法；所述方法包括下述步骤：

-在包含与卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品中，与选自表13中列出的基因的一种或多种基因组合地；特别与选自表8中列出的基因的一种或多种另外基因组合地；特别与选自HSPH1外显子2、HSPH1外显子6、NCOA7和SASH1的一种或多种另外基因组合地，测定CAMK1D外显子1、CAMK1D外显子9或EFNB2的外显子水平基因表达；和

9.根据权利要求1-8中任一项的体外方法，其进一步包括使所述基因的外显子水平基因表达标准化的步骤。

10.根据权利要求1-8中任一项的体外方法，其中测定所述一种或多种生物标志物基因的标志物基因表达水平包括借助于使用引物和/或探针的生物测定法来测量所述基因的多核苷酸水平，所述引物和/或探针能够与所述多核苷酸或者所述多核苷酸内的一个或多个区域特异性杂交。

11.根据权利要求1-8中任一项的体外方法，其中测定所述一种或多种基因的标志物基因表达水平包括借助于生物测定法来测量相关基因产物的蛋白质水平，所述生物测定法使用针对所述蛋白质、其前体形式或其代谢产物的结合剂、抗体或其片段。

12.根据权利要求1-8中任一项的体外方法，其中所述哺乳动物卵母细胞是人卵母细胞。

13.根据权利要求1-8中任一项的体外方法，其中对照或参考标准是包含与已知有能力或无能力的卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品，其得自或并非得自与待测试的样品相同的受试者。

14.根据权利要求1-8中任一项的体外方法，其中对照或参考标准是包含与已知无能力的卵母细胞联合的至少一个颗粒细胞或卵丘细胞的样品，其得自或并非得自与待测试的样品相同的受试者。

15.根据权利要求9-10中任一项的体外方法，其中所述样品来源于卵母细胞，包括颗粒细胞和/或卵丘细胞、来源于卵泡液或来源于培养基。

16.根据权利要求4-15中任一项的体外方法用于鉴定卵母细胞的用途，所述卵母细胞能够在受精后产生能存活的妊娠。

17.根据权利要求4-15中任一项的体外方法与另一种体外卵母细胞、精子或胚胎评估方法组合的用途。

18.卵母细胞库，其包含根据权利要求4-15中任一项的体外方法评分的哺乳动物卵母细胞。

19.制备胚胎的方法，其包括根据权利要求4-15中任一项的体外方法评分的卵母细胞的使用。