WO2004092382A1 - 膵ラ氏島アミロイドタンパク質変異遺伝子の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Definitions
- the present invention relates to a method for detecting a mutant gene of Perilla island amyloid protein, and a nucleic acid probe and a kit therefor.
- Islet Amyloid Polypeptide is a major component of amyloid that is frequently deposited on the knee island of type 2 diabetic patients, and is secreted into the blood together with insulin from Teng; 3 cells. Have been.
- a missense mutation S20G mutation in which the serine at position 20 of the IAPP amino acid sequence is replaced with glycine is present in about 2.6% of Japanese type 2 diabetes patients, of which about 10% of younger onset patients. It is said that the presence of this mutation increases the risk of developing diabetes.
- IAPP S20G mutation a restriction enzyme recognition site appears in that part, and amplification is carried out by PCR to include the mutated part. It is known that detection is carried out by a method (PCR-RFLP) that detects whether the DNA fragment has been cleaved by electrophoresis (PCR-RFLP). Do, P. 56-59).
- PCR amplifies several billion times more molecules from a few type II molecules, so even a small amount of the amplification product can cause false positives and false negatives.
- PCR-RFLP requires removal of the amplification product after PCR reaction and treatment with restriction enzymes, the amplification product may be mixed into the next reaction system. Thus, false-positive and false-negative results may be obtained.
- treatment with restriction enzymes is performed, and then electrophoresis is performed, so that the time required for detection is extremely long. In addition, automation is difficult due to the complicated operation.
- An object of the present invention is to specify a quenching probe effective for detecting the IAPP S20G mutation, and to provide a method for detecting the IAPP S20G mutation and a kit therefor.
- the present inventors have found that by designing a quenching probe based on a specific region containing the IAPP S20G mutation, it is possible to detect the IAPP S20G mutation by melting curve analysis using the quenching probe, and completed the present invention.
- the present invention provides the following.
- a nucleic acid probe whose end is labeled with a fluorescent dye and whose fluorescence decreases when hybridized, 13 to 30 bases ending with base number 247 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
- the above nucleic acid probe which has a sequence complementary to the long sequence and has a 5 ′ end labeled with a fluorescent dye.
- nucleic acid probe according to (1) wherein the nucleic acid probe has SEQ ID NO: 12 or 13.
- nucleic acids having single nucleotide polymorphism sites perform melting curve analysis by measuring the fluorescence of the fluorescent dye using a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, and based on the results of the melting curve analysis.
- a single nucleotide polymorphism The nucleic acid encoding the Ujishima amyloid protein is a mutation in the nucleotide sequence that causes a mutation in which the serine at position 20 of the amino acid sequence of the perilla islet amyloid protein is replaced with glycine.
- the kit for the method according to (3) which comprises the nucleic acid probe having a sequence complementary to the sequence of (5) and having a terminal labeled with a fluorescent dye.
- a region containing a nucleotide sequence mutation that results in a mutation in which the serine at position 20 of the amino acid sequence of Perilla islet amyloid protein is replaced with glycine in the nucleic acid encoding the Kura-jima island amyloid protein is treated with DNA polymerase.
- FIG. 1 shows the position of the quenching probe where the mutation is indistinguishable.
- FIG. 2 shows the location of the quenching probe that can identify the mutation.
- FIG. 3 shows the sensitivity of the method of Example 1 with respect to the absolute amount of genomic DNA.
- FIG. 4 shows the reproducibility of the method of Example 1.
- FIG. 5 shows the detection sensitivity and the quantification of the ratio of mutants in the method of Example 1.
- the probe of the present invention is a nucleic acid probe whose end is labeled with a fluorescent dye and the fluorescence of the fluorescent dye is reduced upon hybridization, wherein the base represented by SEQ ID NO: 1 It has a complementary sequence to a sequence having a length of 13 to 30 bases ending with base number 247 in the sequence, and is characterized in that the 5 'end is labeled with a fluorescent dye.
- a complementary sequence means that it is complementary to the entire length of the subject sequence.
- the probe of the present invention has a structure similar to that of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (a sequence having a mutated nucleotide in the IAPP S20G mutation) which has a sequence complementary to a sequence of 13 to 30 nucleotides in length ending at base number 247. It may be the same as the quenching probe described in Reference 1. Examples of the base sequence of the quenching probe used in the present invention include SEQ ID NOS: 12 and 13. As the fluorescent dye, those described in Patent Document 1 can be used. Specific examples include FAM (trademark), TAMRA (trademark), B0DIPY (trademark) FL, and the like.
- the method for binding the fluorescent dye to the oligonucleotide can be performed according to a conventional method, for example, the method described in Patent Document 1.
- a nucleic acid having a single nucleotide polymorphism site is subjected to melting curve analysis by measuring the fluorescence of a fluorescent dye using a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye, and the results of the melting curve analysis
- a single nucleotide polymorphism, wherein the serine at position 20 of the amino acid sequence of Tengla islet amyloid protein is replaced with glycine in the nucleic acid encoding the knee islet amyloid protein It is a mutation in the nucleotide sequence that causes a mutation, and the nucleic acid probe is a probe of the present invention.
- the detection method of the present invention comprises the steps of amplifying a region containing the IAPP S20G mutation of DNA encoding IAPP, and using the probe of the present invention, except for ordinary nucleic acid amplification and melting curve analysis (Tm analysis). Can be performed according to the method described in
- a method using a polymerase As a method for nucleic acid amplification, a method using a polymerase is preferable, and examples thereof include PCR, ICAN, and LAMP.
- amplification is performed by a method using a polymerase, it is preferable to perform amplification in the presence of the probe of the present invention. It is easy for those skilled in the art to adjust the amplification reaction conditions and the like according to the probe used. As a result, only the Tm of the probe is analyzed after amplification of the nucleic acid, and there is no need to handle the amplified product after the reaction. Therefore, there is no risk of contamination by the amplification products. In addition, it is possible to detect with the same equipment as the equipment necessary for amplification, so it is necessary to move the container. I don't. Therefore, automation is easy.
- the primer pair used for PCR can be set in the same manner as the method for setting a primer pair in ordinary PCR, except that a region where the probe of the present invention can be hybridized is amplified.
- the length and Tm of the primer are usually 40 to 70 ° C for 10 to 40 mer, preferably 55 to 60 ° C for 15 to 25 mer.
- the length of each primer in the primer pair may not be the same, but it is preferable that the Tm of both primers is almost the same (usually, the difference is within 2 ° C).
- the Tm value is a value calculated by the nearest neighbor method. Examples of the primer pair include those comprising a primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 2 and 3.
- PCR is preferably performed in the presence of the probe of the present invention used in the present invention.
- Tm analysis can be performed without performing an operation for handling the amplification product after the completion of the amplification reaction. It is easy for those skilled in the art to adjust the Tm of the primer and the reaction conditions for PCR according to the probe used.
- composition of a typical PCR reaction solution is as follows.
- Tm analysis can be performed according to a usual method except for measuring the fluorescence of the fluorescent dye of the probe of the present invention. Fluorescence can be measured by measuring light having an emission wavelength using excitation light having a wavelength corresponding to the fluorescent dye.
- the heating rate in Tm analysis is usually 0.1 to 1 ° C / sec.
- the composition of the reaction solution when performing Tm analysis is not particularly limited as long as hybridization between the probe and a nucleic acid having a sequence complementary to its base sequence is possible.
- the cation concentration is 1.5-5 raM and the pH is 7-9. Since the reaction solution of the amplification method using a DNA polymerase such as PCR usually satisfies these conditions, the reaction solution after amplification can be used for Tm analysis as it is.
- Detection of the IAPP S20G mutation based on the result of Tm analysis can be performed according to a conventional method.
- the detection in the present invention includes not only detection of the presence or absence of mutation but also quantification of mutant DNA and measurement of the ratio of wild-type DNA to mutant DNA.
- the kit of the present invention is a kit for use in the detection method of the present invention.
- This kit is a nucleic acid probe (quenching probe) whose end is labeled with a fluorescent dye and the fluorescence of the fluorescent dye decreases upon hybridization, and ends with base number 247 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It comprises a nucleic acid probe having a sequence complementary to a sequence having a length of 13 to 30 bases and having a 5 ′ end labeled with a fluorescent dye.
- the quenching probe is as described above with respect to the probe of the present invention.
- the detection kit of the present invention may further include, in addition to the quenching probe, reagents required for performing nucleic acid amplification in the detection method of the present invention, in particular, primers for amplification using DNA polymerase.
- the quenching probe, the primer and other reagents may be housed separately, or a part of them may be a mixture.
- the primers shown in Table 2 were designed to amplify the portion containing the S20G mutation.
- the position indicates the base number in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
- PCR and Tm analysis were performed using the Smart Cycler System (Cephied) under the following conditions.
- the excitation wavelength and the detection wavelength in Tm analysis were 450 to 495 nm and 505 to 537 nra (BODIPY FL), 527 to 555 nm and 565 to 605 nm (TAMRA), respectively.
- Table 4 The excitation wavelength and the detection wavelength in Tm analysis were 450 to 495 nm and 505 to 537 nra (BODIPY FL), 527 to 555 nm and 565 to 605 nm (TAMRA), respectively.
- Tm analysis (l ° C / sec) As a result of PCR and Tm analysis using each probe, probe 5FL-mt- 1-18, 5T-mt-1-18, 5FL_mt- 1-21, and 5T-mt- Only when 1-21 was used, a change in fluorescence intensity that could be analyzed by Tm analysis was observed.
- the arrangement of each probe with respect to the nucleotide sequence containing the IAPP S20G mutation is shown in FIGS. 1 and 2.
- the wild-type sequence (SEQ ID NO: 15) and the mutant sequence (SEQ ID NO: 16) correspond to base numbers 213 to 262 of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
- F indicates a fluorescent dye.
- whether the probe can be used in Tm analysis is considered to depend on the position of C to which the fluorescent dye is attached, and the length of the probe is limited as long as it includes the polymorphic site. Not very important.
- a plasmid having a wild-type base sequence (same as the above plasmid except that base number 285 is A in the base sequence of SEQ ID NO: 1) was prepared.
- Ten samples (wt / rat) were prepared by mixing wild-type plasmid and this mutant-type plasmid, and a sample containing only wild-type plasmid (wt / wt) and a sample containing only mutant-type plasmid (mt / rat) were prepared. / m
- Fig. 4 shows the results. As is clear from FIG. 4, the method was excellent in reproducibility.
- Fig. 5 shows the results. The height of both peaks changed according to the ratio, and it was shown that the ratio could be determined based on the ratio of the heights of both peaks.
- the vertical axis represents the value of the inverse sign of the first derivative of the fluorescence intensity ( ⁇ dF / dt).
- the horizontal axis represents the temperature (° C.).
- a quenching probe effective for detecting an IAPP S20G mutation is provided, and a method for detecting an IAPP S20G mutation using the same and a kit therefor are provided. Since Tm analysis is completed in tens of seconds, the time required for detection can be greatly reduced. According to a preferred embodiment of the present invention in which amplification of a nucleic acid in the presence of a probe is combined with Tm analysis, it is only necessary to analyze the Tm of the probe after amplification of the nucleic acid, so that there is no need to handle the amplification product after the reaction is completed. Therefore, there is no need to worry about contamination by amplification products. In addition, since the detection can be performed with the same device as that required for amplification, it is not necessary to move the container. Therefore, automation is easy.
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Abstract
膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の20位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異（IAPP S20G変異）を含む核酸について、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号247で終わる13～30塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する。
Description
明細書 膝ラ氏島アミロイドタンパク質変異遺伝子の検出法ならびにその めの核酸プロ ーブおよぴキット 技術分野
本発明は、 腌ラ氏島アミロイドタンパク質変異遺伝子の検出法ならびにそのた めの核酸プローブおよびキットに関する。 背景技術
滕ラ氏島アミロイドタンパク質 （Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) ) は 2 型糖尿病患者の膝ラ氏島に高頻度に沈着しているアミロイドの主要構成成分で、 滕； 3細胞からインスリンと共に血中に分泌されている。 IAPPのアミノ酸配列の 20 位のセリンがグリシンに置換するミスセンス変異 （S20G変異） は日本人 2型糖尿 病患者の約 2. 6%、 その中でも若年発症者の約 10%に存在しており、 この変異が存 在することで糖尿病の発症リスクが高まるといわれている。
IAPPに S20G変異をもたらす塩基の変異 （以下、 「IAPP S20G変異」 ともいう） が存在するとその部分に制限酵素の認識部位が出現するため、 PCRで変異部分を 含むように増幅を行い、 制限酵素で切断し、 その後電気泳動で切断されたかどう かを検出するという方法 （PCR - RFLP) で検出を行うことが知られている （日本糖 尿病学会編、 「糖尿病遺伝子診断ガイド」 、 文光堂、 P . 5 6— 5 9 ) 。
PCRは数分子の铸型から数 10億倍もの分子を増幅するため、 増幅産物がほんの 少し混入した場合でも偽陽性、 偽陰性の原因になり得る。 PCR-RFLPは PCR反応後 に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行うという必要があるため、 増幅産物が 次の反応系に混入する恐れがある。 よって、 偽陽性、 偽陰性の結果が得られてし まうことがある。 さらに、 PCR終了後、 制限酵素で処理を行い、 その後電気泳動 を行うため、 検出に必要な時間も非常に長くかかってしまう。 また、 操作が複雑 なため、 自動化が困難である。
一方、 一般に、 変異を含む領域を PCRで増幅した後、 蛍光色素で標識された核
酸プローブを用レ、て融解曲線分析を行レ、、 融解曲線分析の結果に基づいて変異を 解析する方法が知られている （クリエカルケミストリー（Clinical Chemistry)、 2000年、 第 46卷、 第 5号、 p. 631— 635、 特開 2002— 1 1 929 1 号公報） 。 発明の開示
本発明の課題は、 IAPP S20G変異を検出するのに有効な消光プローブを特定し、 IAPP S20G変異を検出する方法及ぴそのためのキットを提供することを課題とす る。
上述のプローブを用いる方法に関する文献においては、 プローブの設計に関し、 末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダィゼー シヨンしたとき、 末端部分においてプローブ一核酸ハイプリッドの複数塩基対が 少なくとも一つの Gと Cのペアを形成するように設計するという教示があるのみで ある。 本発明者らは、 IAPP S20G変異に関し、 上記条件を満たす消光プローブを 設計し、 検出を試みたが、 容易に検出を可能とする消光プローブは得られなかつ た。
本発明者らは、 IAPP S20G変異を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設 計することにより、 消光プローブを用いる融解曲線分析により IAPP S20G変異を 検出できることを見出し、 本発明を完成した。
本発明は、 以下のものを提供する。
(1) 末端が蛍光色素で標識され、 ハイブリダィゼーシヨンしたときに蛍光色 素の蛍光が減少する核酸プローブであって、 配列番号 1に示す塩基配列において 塩基番号 247で終わる 13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、 5' 末端が蛍 光色素で標識されている前記核酸プロープ。 '
(2) 核酸プローブが、 配列番号 12または 1 3を有する （1) の核酸プロ一 ブ。
(3) 一塩基多型の部位を有する核酸について、 蛍光色素で標識された核酸プ ロープを用いて、 蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、 融 解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、 一塩基多型は、 脖ラ
氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、 腌ラ氏島アミロイドタン パク質のアミノ酸配列の 20位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基 配列の変異であり、 核酸プローブは、 （1) または （2) の核酸プローブである 刖 '己方 fe。
(4) 試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一 塩基多型を有する核酸を得ることを含む （3) の方法。
(5) 増幅を DNAポリメラーゼを用いる方法により行う （4) の方法。
(6) 増幅を核酸プローブの存在下で行う （5) の方法。
(7) 末端が蛍光色素で標識され、 ハイプリダイゼーシヨンしたときに蛍光色 素の蛍光が減少する核酸プローブであって、 配列番号 1に示す塩基配列において 塩基番号 247で終わる 13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、 5， 末端が蛍 光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、 （3) の方法のためのキット。
(8) 核酸プローブが、 配列番号 1 2または 1 3を有する （6) のキット。
(9) 膝ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、 腌ラ氏島ァ ミロイドタンパク質のアミノ酸配列の 20位のセリンがグリシンに置換する変異を もたらす塩基配列の変異を含む領域を、 DNAポリメラーゼを用いる方法で増幅す るためのプライマーをさらに含む （7) または （8) のキット。 図面の簡単な説明
図 1は、 変異の識別不可能な消光プローブの位置を示す。
図 2は、 変異の識別可能な消光プローブの位置を示す。
図 3は、 実施例 1の方法のゲノム DNAの絶対量に関する感度を示す。
図 4は、 実施例 1の方法の再現性を示す。
図 5は、 実施例 1の方法の変異型の割合に関する検出感度、 定量性を示す。 発明を実施するための最良の形態
< 1 >本発明プローブ及び本発明検出方法
本発明プローブは、 末端が蛍光色素で標識され、 ハイブリダィゼーシヨンした ときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、 配列番号 1に示す塩基
配列において塩基番号 247で終わる 13〜30塩基長の配列に相捕的な配列を有し、 5 ' 末端が蛍光色素で標識されていることを特徴とする。
本明細書において、 相補的な配列とは、 対象の配列の全長に対して相補的であ ることを意味する。
本発明プローブは、 配列番号 1に示す塩基配列 （IAPP S20G変異における変異 型の塩基を有する配列） において塩基番号 247で終わる 13〜30塩基長の配列に相 補的な配列を有する他は、 特許文献 1に記載された消光プローブと同様でよい。 本発明に使用される消光プローブの塩基配列の例としては、 配列番号 1 2及び 1 3が挙げられる。 蛍光色素としては、 特許文献 1に記載されたものが使用できる 、 具体例としては、 FAM (商標）、 TAMRA (商標）、 B0DIPY (商標） FL等が挙げられ る。 蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、 通常の方法、 例えば特許文 献 1に記載の方法に従って行うことができる。
本発明検出方法は、 一塩基多型の部位を有する核酸について、 蛍光色素で標識 された核酸プローブを用いて、 蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分 析を行い、 融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、 一塩基 多型は、 膝ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、 滕ラ氏島ァ ミロイドタンパク質のアミノ酸配列の 20位のセリンがグリシンに置換する変異を もたらす塩基配列の変異であり、 核酸プローブは本発明プローブであることを特 徴とする。
本発明検出方法は、 IAPPをコードする DNAの IAPP S20G変異を含む領域を増幅す ること、 及び、 本発明プローブを用いることの他は、 通常の核酸増幅及ぴ融解曲 線分析 （Tm解析） の方法に従って行うことができる。
核酸増幅の方法としては、 ポリメラーゼを用いる方法が好ましく、 その例とし ては、 PCR、 ICAN、 LAMP等が挙げられる。 ポリメラーゼを用いる方法により増幅 する場合は、 本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。 用いるプロ ーブに応じて、 増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。 これにより、 核酸の増幅後にプローブの Tmを解析するだけなので、 反応終了後増 幅産物を取り扱う必要がない。 よって、 増幅産物による汚染の心配がない。 また、 増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、 容器を移動する必要
すらない。 よって、 自動化も容易である。
以下、 PCRを用いる場合を例として、 さらに説明する。 PCRに用いるプライマー 対は、 本発明プローブがハイブリダィゼーションできる領域が増幅されるように する他は、 通常の PCRにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定するこ とができる。 プライマーの長さ及ぴ Tmは、 通常には、 10mer〜40merで 40〜70°C、 好ましくは 15mer〜25merで 55〜60°Cである。 プライマー対の各プライマーの長さ は同一でなくてもよいが、 両プライマーの Tmはほぼ同一 （通常には、 相違が 2 °C 以内） であることが好ましい。 なお、 Tm値は最近接塩基対（Nearest Neighbor)法 により算出した値である。 プライマー対の例としては、 配列番号 2及ぴ 3に示す 塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
PCRは、 本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましレ、。 これにより、 増幅反応終了後に増幅産物を取り扱う操作を行うことなく Tm解析を 行うことができる。 用いるプローブに応じて、 プライマーの Tmや PCRの反応条件 を調整することは当業者であれば容易である。
代表的な P C R反応液の組成を挙げれば、 以下の通りである。
D NA断片 1〜^8分子 z反応
プライマー 200〜1000M
プローブ 100〜1000 n M
ヌクレオチド 各 20〜200 Μ
DNAポリメラーゼ 0. 01〜0. 03単位/ / 1
Tris-HCl (pH 8. 4〜9. 0) 5〜20mM
M g C 1 2 1. 5〜3mM
K C 1 10〜100mM
グリセ口ール 0〜20%
(最終液量： 10〜100 / 1 ) また、 代表的な温度サイクルを挙げれば、 以下の通りであり、 この温度サイク ルを通常 25〜40回繰り返す。
(1) 変性、 90〜98°C、 1〜60秒
(2) アニーリング、 60〜70°C、 10〜60秒
(3) 伸長、 60〜75°C、 10~180秒
アニーリング及び伸長を一ステップで行う場合には、 60〜70°C、 10〜180秒の 条件が挙げられる。
Tm解析は、 本発明プローブの蛍光色素の蛍光を測定する他は通常の方法に従つ て行うことができる。 蛍光の測定は、 蛍光色素に応じた波長の励起光を用い発光 波長の光を測定することに行うことができる。 Tm解析における昇温速度は、 通常 には、 0. 1〜1°C/秒である。 Tm解析を行うときの反応液の組成は、 プローブとそ の塩基配列に相補的な配列を有する核酸とのハイブリダィゼーションが可能であ れば特に制限されないが、 通常には、 一価の陽イオン濃度が 1. 5〜5 raM、 pHが 7 〜9である。 PCR等の DNAポリメラーゼを用いる増幅方法の反応液は、 通常、 この 条件を満たすので、 増幅後の反応液をそのまま Tm解析に用いることができる。
Tm解析の結果に基づく IAPP S20G変異の検出は通常の方法に従って行うことが できる。 本発明における検出とは、 変異の有無の検出の他、 変異型 DNAの定量、 野生型 DNAと変異型 DNAの割合の測定も包含する。
< 2 >本発明キット
本発明キットは、 本発明の検出方法に用いるためのキットである。 このキット は、 末端が蛍光色素で標識され、 ハイブリダィゼーシヨンしたときに蛍光色素の 蛍光が減少する核酸プローブ （消光プローブ） であって、 配列番号 1に示す塩基 配列において塩基番号 247で終わる 13〜 30塩基長の配列に相補的な配列を有し、 5 ' 末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含むことを特徴とする。 消光プローブについては、 本発明プローブに関し、 上記に説明した通りである。 本発明検出キットは、 消光プローブの他に、 本発明の検出方法における核酸増 幅を行うのに必要とされる試薬類、 特に DNAポリメラーゼを用いる増幅のための プライマーをさらに含んでいてもよい。
本発明検出キットにおいて消光プローブ、 プライマー及びその他の試薬類は、 別個に収容されていてもよいし、 それらの一部が混合物とされていてもよい。
実施例
以下に、 本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例 1
ヒト IAPP遺伝子の S20G変異を含む塩基配列 （配列番号 1 ) に基づき、 S20G変異 を含む部分を増幅できるように表 2に示すプライマーを設計した。 表 2中、 位置 は、 配列番号 1に示す塩基配列における塩基番号を示す。 表 2
プライマー
名称 配列（5'→3' ) mer 位置 配列番号
F cacatgtgcaacgcagcg 18 192-209 2
R ctcttgccatatgtattggatccc 24 296-273 3 次に、 表 3に示す、 末端部に Cを有するプローブを設計した。 表 3中、 位置は、 配列番号 1に示す塩基配列における塩基番号を示す。 また、 塩基配列中の大文字 は、 IAPP S20G変異の部位を示し、 3'末端の（P)は、 リン酸化されていることを示 す。 B0DIPY (商標） FL及ぴ TAMRA (商標）による標識は、 常法に従って行った。
表 3
プローブ
名称 配列（5'→3' ) mer位置 配列番号
5FL-rat-5-14 (BODIPY FL) -cattccGgcaacaa- (P) 14 229-242 4 5FL- mt- 5 - 15 (BODIPY FL) -cattccGgcaacaac- (P) 15 229-243 5 5FL- wt - 5 - 22 (BODIPY FL) -cattccAgcaacaactttggtg- (P) 22 229-250 6 5FL- mt - 5 - 22 (BODIPY FL) -cattccGgcaacaactttggtg- (P) 22 229-250 7 3FL-wt-4-25 caccaaagttgttgcTggaatgaac- (BODIPY FL) 25 250-226 8 3FL - mt- 3-22 gaatggcaccaaagttgttgcC- (BODIPY FL) 22 256-235 9 5FL - wt_2 - 24 (BODIPY FL) -cTggaatgaactaaaaaatttgcc- (P) 24 236-213 10 5FL-mt-2-24 (BODIPY FL) -cCggaatgaactaaaaaatttgcc- (P) 24 236-213 11 5FL-mt-l-21 (BODIPY FL) -caaagttgttgcCggaatgaa- (P) 21 247-227 12 5T-mt-l-21 (6-TAMRA) -caaagttgttgcCggaatgaa- (P) 21 247-227 12 5FL- mt- 1-18 (BODIPY FL) -caaagttgttgcCggaat- (P) 18 247-230 13 5T-mt-l-18 (6-TAMRA) -caaagttgttgcCggaat- (P) 18 247-230 13 5FL— wt-1— 18 (BODIPY FL) -caaagttgttgcTggaat- (P) 18 247-230 14
IAPP S20G周辺領域約 600bp (配列番号 1 ) を組み込んだプラスミ ドをサンプル として、 Smart Cycler System (Cephied)を用い、 以下の条件で PCR及ぴ Tm解析を 行った。 Tm解析における励起波長及び検出波長は、 それぞれ 450〜495nm及び 505 〜537 nra (BODIPY FL)、 527〜555 nm及び 565〜605 nm (TAMRA)であった。 表 4
反応液組成
H20 15. 95 /z L
10 X Gene Taqバッファー 2. 5 L
40% グリセローノレ 3. 125
各 lOraM dATP, dUTP, dGTP, dCTP 0. 5 μ Ι
2\ / μ Ι ゥラシル- N-グリコシラ' -ゼ 0. 05 L
5 / M プローブ Ι μ Ι
lOOmM MgCl 2 0. 375 /x L
100 Μ プライマー F 0. 25 /x L
100 Μ プライマー R 0. 125 /z L
5U/ μ L Gene Taq 0. 125 i L
サンプル （0〜2000コピー） 1 μ L
合計 25 μ ΐ
表 5
反応条件
50°C， 2rain
I
95。C， 2min
1
95°C, lsec
66。C， 18sec (50cycles)
i
Tm解析 （l°C/sec) 各プローブを用いて PCR及び Tm解析を行った結果、 プローブ 5FL-mt- 1-18、 5T-m t - 1-18、 5FL_mt- 1- 21および 5T- mt- 1- 21を用いたときのみ、 Tm解析で解析の可能 な蛍光強度の変化が認められた。 なお、 各プローブの IAPP S20G変異を含む塩基 配列に対する配置を図 1及ぴ 2に示す。 図中、 野生型配列 （配列番号 1 5 ) 及び 変異型配列 （配列番号 1 6 ) は、 配列番号 1の塩基配列の塩基番号 213〜262に相 当する。 また、 図中、 Fは蛍光色素を示す。 図 1及び 2に示す配置からみて、 プ ローブが Tm解析で使用できるかどうかは、 蛍光色素を結合させた Cの位置に依存 すると考えられ、 プローブの長さは、 多型部位を含む限り、 あまり重要でないと 考えられる。
以下、 プローブ 5FL- mt - 1- 21を用いて、 ゲノム DNAの絶対量に関する感度、 再現 性、 及び、 変異型の割合に関する検出感度を検討した。
上記プラスミドの代わりに、 ゲノム DNA (野生型） をそれぞれ、 0、 20、 200及 び 2000コピー含むサンプルを用いて、 上記の方法を繰り返した。 結果を図 3に示 す。 図 3から明らかなように、 20コピーであっても検出可能であることが示され た。
次に、 野生型の塩基配列 （配列番号 1の塩基配列において塩基番号 285が Aであ る他は上記プラスミ ドと同じ） を有するプラスミドを調製した。 野生型プラスミ ドとこの変異型プラスミ ドとを混合したサンプル (wt/rat)を 1 0個調製し、 野生 型プラスミ ドのみのサンプル（wt/wt)及ぴ変異型プラスミ ドのみのサンプル (mt/m
t)とともに、 上記の方法を繰り返した。 結果を図 4に示す。 図 4から明らかなよ うに、 本方法は再現性に優れることが示された。
さらに、 野生型プラスミドと変異型プラスミ ドとの比率を変えて、 上記の方法 を繰り返した。 結果を図 5に示す。 比率に応じて、 両ピークの高さが変化し、 両 ピークの高さの比に基づいて、 比率を求めることが可能なことが示された。
なお、 図 3〜 5において縦軸は、 蛍光強度の一次導関数の逆符号の値 （- dF/dt) . 横軸は温度 (°C) である。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 IAPP S20G変異を検出するのに有効な消光プローブが提供さ れ、 さらに、 それを用いる IAPP S20G変異を検出する方法及びそのためのキット が提供される。 Tm解析は数十秒で完了するため、 検出に必要な時間も大幅に短略 化出来る。 プローブの存在下での核酸の増幅と Tm解析を組み合わせる本発明の好 ましい態様によれば、 核酸の増幅後にプローブの Tmを解析するだけなので、 反応 終了後増幅産物を取り扱う必要がない。 よって、 増幅産物による汚染の心配がな い。 また、 増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、 容器を移 動する必要すらない。 よって、 自動化も容易である。
Claims
1 . 末端が蛍光色素で標識され、 ハイブリダィゼーシヨンしたときに蛍光色 素の蛍光が減少する核酸プローブであって、 配列番号 1に示す塩基配列において 塩基番号 247で終わる 13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、 5 ' 末端が蛍 光色素で標識されている前記核酸プローブ。 -
2 . 核酸プローブが、 配列番号 1 2または 1 3を有する請求項 1記載の核酸 プローブ。
3 . 一塩基多型の部位を有する核酸について、 蛍光色素で標識された核酸プ ローブを用いて、 蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、 融 解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、 一塩基多型は、 膝ラ 氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、 腌ラ氏島アミロイドタン パク質のアミノ酸配列の 20位のセリンがダリシンに置換する変異をもたらす塩基 配列の変異であり、 核酸プローブは、 請求項 1または 2に記載の核酸プローブで ある前記方法。
4 . 試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一 塩基多型を有する核酸を得ることを含む請求項 3記載の方法。
5 . 増幅を DNAポリメラーゼを用いる方法により行う請求項 4記載の方法。
6 . 增幅を核酸プローブの存在下で行う請求項 5記載の方法。
7 . 末端が蛍光色素で標識され、 ハイブリダィゼーシヨンしたときに蛍光色 素の蛍光が減少する核酸プローブであって、 配列番号 1に示す塩基配列において 塩基番号 247で終わる 13〜30塩基長の配列に相補的な配列を有し、 5 ' 末端が蛍 光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、 請求項 3記載の方法のための キット。
8 . 核酸プローブが、 配列番号 1 2または 1 3を有する請求項 6記載のキッ 卜。
9 . 腌ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、 膝ラ氏島ァ ミロイドタンパク質のアミノ酸配列の 20位のセリンがグリシンに置換する変異を もたらす塩基配列の変異を含む領域を、 DNAポリメラーゼを用いる方法で増幅す るためのプライマーをさらに含む請求項 7または 8記載のキット。
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