WO2004092373A1 - Ｈｔｌｖ－ｉ特異的ｃｔｌ誘導活性ペプチド - Google Patents

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WO2004092373A1
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htlv
peptide
specific ctl
inducing
hla
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Nanae Harashima
Mari Kannagi
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Japan Science And Technology Agency
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    • C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to an HTL capable of inducing cytotoxic T cells (CTLs) having an antitumor effect on human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) tumor such as adult T cell leukemia (ATL).
  • CTLs cytotoxic T cells
  • HTLV-I human T cell leukemia virus type I
  • ATL adult T cell leukemia
  • the present invention relates to a VI-specific CTL-inducing peptide, a DNA encoding the peptide, a vaccine for inducing an immune response using the peptide, a diagnostic agent for testing an immune function, and the like.
  • ATL is a T-cell malignancy that affects approximately 5% of human T-cell leukemia virus type I (HTLV-I) -infected individuals and is mainly CD4 + and CD25 + mature It is characterized by a T lymphocyte phenotype, middle-aged or later onset, immunosuppression, and poor prognosis (eg, Int. J. Cancer 45, 237-243, 1990; Blood 50, 481- Natl. Acad. Sci. USA 78, 6476-6480, 1981.). Although the clinical use of ATL with chemotherapy has increased the 4-year survival rate to 8 to 12%, it is still low compared to other types of leukemia (eg, J. Clin.
  • HSCT hematopoietic stem cell transplantation
  • Allogeneic HSCT received from siblings that human leukocyte antigen (HLA) has killed has been shown to cause some GVHD, and the recipient's minor tissue-matched antigen (mHA) has been considered a target antigen for GVHD.
  • HLA human leukocyte antigen
  • mHA minor tissue-matched antigen
  • Male-specific H—Y transplantation antigen see, for example, Science 269, 1588-1590, 1995
  • HA-1 antigen see, for example, Science 279, 1054-1057, 1998.
  • CD31 molecule See, for example, N. Engl. J. Med. 334, 286-291, 1996, Br. J.
  • HPA human platelet antigen
  • Tumor antigens such as bcr / ab1 fusion proteins and WT_1 that are tumor cell-specific or overexpressed in tumor cells, are also candidates for targets of GVL effects (eg, Blood 95, 1781-1787, 2000; Blood 96, 1480-1489, 2000.).
  • GVL effects eg, Blood 95, 1781-1787, 2000; Blood 96, 1480-1489, 2000.
  • Host cell-mediated immune response to HTL V-I especially the proliferation of cytotoxic T cells, is associated with asymptomatic HL TV-1 carrier and HTL V-I-associated myelopathy Tropical spastic paraplegia
  • HAM / TSP is frequently found in PBMC cultures of patients, but is rarely found in ATL patients (e.g., Leukemia 8 Suppl 1, S54-59, 1994, J. Immunol. 133, 1037-1041, 1984.;).
  • HTL V-I antigens such as the env, gag, and pop X gene products
  • the pX gene product Ta ⁇ is the dominant target antigen for HTL V-I-specific cytotoxic lymphocytes (CTLs).
  • CTLs cytotoxic lymphocytes
  • Tax is also known to play an important role in HTLV-I leukemia by promoting cell growth and suppressing apoptosis (e.g., Lancet 1, 1085-1086, 1987). J. Virol. 73, 7981-7987, 1999.). These findings suggest that Tax-specific CTLs may play a role in immunosurveillance of leukemia in HTL V-I infected cells ( we have previously been restricted to human HLA-A2). HLA-A2 is positive only in 30 to 40% of the Japanese population, although major epitopes of CTLs have already been found (see, for example, J. Virol. 66, 2928-2933, 1992).
  • Tax is By transplanting fresh T cells from syngeneic immunized rats vaccinated with either the encoding DNA or the peptide corresponding to the CTL epitope, Untreated fatal T cells in nude rats inoculated with syngeneic HTLV-I infected cells Empamas could be cured (see, for example, J.
  • ATL is a neoplastic disease caused by HTLV-I infection, which has a high prevalence in Japan, but has been regarded as an extremely poor prognostic malignant tumor due to resistance to chemotherapeutic drugs .
  • HTLV-ITax a major target antigen of CTL, has a tumorigenic function I know that there is. Therefore, for the development of more specific and safe vaccines, it is necessary to identify CTL recognition epitopes. However, no CTL epitope with an antitumor effect in human ATL patients was identified.
  • An object of the present invention is to provide an HTLV-I-specific CTL-inducing activity peptide capable of inducing CTL having an antitumor effect against HTLV-I tumors such as ATL, and encoding the peptide.
  • An object of the present invention is to provide DNA, a vaccine for inducing an immune response using the same, and a diagnostic reagent for testing antitumor immunity.
  • the present invention relates to an HTLV-I-specific CTL-inducing peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 (Claim 1); HTLV-I-specific CTL-inducing active peptide comprising an amino acid sequence in which two amino acids have been deleted, substituted or added (Claim 2), or HTLV-I-specific CTL-inducing active peptide according to Claim 1 or 2 And a fusion protein in which a marker protein and / or a peptide tag are bound (Claim 3), or the HLA-A24 and the HTLV-I-specific CTL-inducing active peptide according to Claim 1 or 2 And a protein peptide conjugate wherein HLA-A24 and the HTLV-I-specific CTL-inducing active peptide according to claim 1 or 2 are bound.
  • Tetramer (claim 5) or claim 4
  • the present invention relates to a DNA that hybridizes with the described DNA under stringent conditions and encodes an HTLV-I-specific CTL-inducing activity peptide (Claim 9).
  • the present invention relates to an HLA-A24-restricted TaX epitope comprising an HTLV-I-specific CTL-inducing activity peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (claim 10);
  • a vaccine for inducing an immune response (claim 11) containing, as an active ingredient, an HTLV-I-specific CTL-inducing peptide consisting of the amino acid sequence represented by 3 or 4;
  • An antibody for inducing an immune response comprising, as an active ingredient, an HTLV-I-specific CTL-inducing activity peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence (claim 1).
  • the vaccine for inducing an immune response according to any one of claims 8 to 10 (claim 14), and the immune response for inducing an immune response according to any one of claims 11 to 14 which comprises an adjuvant containing A pharmaceutical composition containing a vaccine as an active ingredient (Claim 15) or an immune function test containing an HTLV-I-specific CTL-inducing activity peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 as an active ingredient HTLV-I specific comprising a diagnostic agent (claim 16) or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the present invention relates to a diagnostic agent for immunological function test (claim 17) containing a CTL-inducing active peptide as an active ingredient. - Furthermore, the present invention provides a diagnostic agent for immunological function test comprising a vector capable of expressing the DNA according to any one of claims 7 to 9 as an active ingredient (claim 18), and HLA-A24.
  • An immunological function test / diagnostic agent comprising a protein peptide conjugate bound to the HTLV-I-specific CTL-inducing activity peptide according to claim 1 or 2 as an active ingredient (claim 19), and HLA-A
  • An immunological function test diagnostic agent comprising as an active ingredient a tetramer of a protein peptide conjugate in which 24 and HTLV-I-specific CTL-inducing active peptide according to claim 1 or 2 are bound (claim 2 0) or an HTLV-I tumor diagnostic agent comprising the DNA of any one of claims 7 to 9 as an active ingredient (claim 21), and an HTLV-I according to claim 1 or 2
  • An antibody (Claim 22) that specifically binds to a specific CTL-inducing peptide or a monoclonal antibody 22.
  • the antibody according to claim 22 (claim 23), which is a human body, or an antibody that specifically binds to the HTLV-I-specific CTL inducing peptide according to claim 22 or 23 as an active ingredient.
  • HTLV-I tumor diagnostic agent (Claim 24) or an expression vector capable of expressing the HTLV-I-specific CTL-inducing activity peptide of Claim 1 or 2 (Claim 2) 5), a host cell comprising an expression system capable of expressing the HTL V-I-specific CTL inducing peptide according to claim 1 or 2 (claim 26), and HLAA24.
  • An expression vector capable of expressing a conjugate with the HTLV-I-specific CTL-inducing active peptide according to claim 1 or 2, or HLA-A24 and the HLA-A24 according to claim 1 or 2.
  • a host cell containing an expression system capable of expressing a conjugate with an HTL V-I-specific CTL inducing activity peptide (Claim 28), or an AT cell before HSCT HTL V-I-recognizing C TL characterized by stimulating P BMC of the same patient after HS CT derived from allogeneic HLA-type donor using HT LV-I infected T cells from L patients
  • Method of claim (claim 29) and claim 1 or 2 A method for inducing HTL V-I-recognizing CTL, comprising stimulating P BMC of HLA_A24-positive ATL patient using an HTL V-I-specific CTL inducing activity peptide (claim 30) HTLV-I recognition, characterized by stimulating PBMC of an HLA-A24-positive ATL patient using
  • HTL V-I-specific CTL is rarely induced from ATL patients, but CTL for the epitope identified according to the present invention was selectively induced from ATL cases that entered complete remission after stem cell transplantation. This means that the epitope was strongly expressed in the patient's body, indicating that the present epitope is useful as a vaccine antigen.
  • FIG. 1 is a photograph showing CTL induction on ILT_ # 37 cells in PBMC of patients # 37 (FIG. 1a) and donor # 36 (FIG. Lb) after HSCT.
  • Various numbers of PBMC were cultured for 19 days, during which the first and 10 days were stimulated twice with formalin-immobilized ILT— # 3.7.
  • FIG. 4 is a view showing the result of measuring the amount of IFN-r in the supernatant by ELISA analysis. Values represent the average of two experiments.
  • FIG. 2 is a photograph showing the TaX specificity of HTLV_I of CTL induced from patient # 37 after HSCT and the restriction of MHC class I.
  • the target cells used were ILT-I # 37 ( ⁇ ), LCL— # 36 ( ⁇ ), and PHA-activated P BMC (X), HL A- For TCL _ K an ( ⁇ ) and LCL—K an ( ⁇ ) where A 2 and B 46 match, and for ILT-A s -2 ( ⁇ ) and LCL-A s ( ⁇ ) that HLA does not match there were.
  • Black symbols represent HTLV-I infected cells, white symbols represent EBV infected cells. Values represent the average of the cytotoxicity (Specific Lys is) of three experiments.
  • HTLV shows inhibition of ILT- # 37 specific cytotoxicity by competing cells expressing I Tax.
  • PBMC culture of patient # 37 after HS CT was stimulated with formalin-fixed ILT- # 37 cells 5 times in advance, and effector cells vs. target cells against radiolabeled ILT- # 37
  • the 51 Cr release analysis was performed with the ratio of 30 to 1.
  • unlabeled LCL infected with rVV expressing the HTL V-I pX gene product was infected with # L6 cells (LCL- # 36 / p27X) or control rvv.
  • the test was performed in the presence of unlabeled LCL- # 36 cells (LCL- # 36ZHA) or ILT- # 37 cells, and the ratio of competitor cells to target cells was 30: 1.
  • FIG. 4 presents photographs showing the results of the mapping of the HLA-A2-restricted tax epitope of HTLV-I recognized by L.
  • FIG. LCL- # 36 cells were pulse-labeled with 3 types of 9- to 24-base-length synthetic oligopeptides corresponding to the 10 mM T aX amino acid sequence, and compared to CTL of patient # 37 after HSCT. The respective sensitivities were determined using a 51 Cr release assay with a ratio of effector to target cells of 10. Values are the mean of the cytotoxicity of three experiments.
  • Fig. 4 shows the cytotoxicity induced by stimulation of ILT- # 37 cells in PBMC culture solution of patient # 37 before HSCT, patient # 37 after HSCT and donor # 36. 4 is a photograph showing a result of a feature.
  • the ratio of effector cells to target cells was 30 and the cells were stimulated twice and cultured for 40 days.
  • the cytotoxicity of PBMC of patient # 37 before HSCT, and cultured for 3 days with stimulation 3 times The cytotoxicity of PBMC in patients # 37 and donor # 36 after HSCT was measured.
  • the cytotoxicity against ILT- # 37 (black frame), the cytotoxicity against TLC-Kan (shaded frame), and the cytotoxicity against LCL-Kan (white frame) are shown, respectively. Values are the average of three experiments.
  • Figure 5 shows the CT derived from 113 (Patient 1 ⁇ 07 (Case.2)).
  • 3 is a photograph showing the results of mating of the HLA-A24-restricted Tax epitope of HTLV-I recognized by L.
  • CD8 + cell-rich PBMC were stimulated three times with formalin-fixed ILT-R07 cells, cultured for 32 days, and HL pulse-labeled with a series of 33 synthetic oligopeptides of T aX.
  • the A—A 24 + EBV-transformed B cell line, TOK was mixed with the effector to target at a ratio of 8 and incubated for 18 hours. After that, IFN- ⁇ in the supernatant was measured by ELISA analysis. Values are the average of two experiments.
  • Figure 6 shows the tetramer-bound CD8 of HLA-A * 2402 / Tax301-309 in CTL derived from patient R07 (Case 2) after HS CT.
  • 4 is a photograph showing a flow cytometry analysis result of + T cells. .
  • Culture of patient R07 after HS CT PBMC of 67 days were used.
  • the numbers in the upper right indicate the percentage of PBMC bound to the tetramer, a phenomenon in a total of 100,000 cells.
  • the HTLV-I-specific CTL-inducing peptide of the present invention that is, a peptide capable of inducing CTL having an antitumor effect specifically against HTLV-I tumor, is represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the peptide is not particularly limited as long as it has a specific CTL inducing activity (hereinafter, a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 and one or more amino acids in these amino acid sequences) are sometimes referred to as “the peptides” in combination with peptides modified by substitution, deletion or addition.)
  • the degree of “substitution, deletion or addition” of amino acids and their positions, etc. are determined in such a manner that the modified peptide is HTLV-I-specific similarly to the peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • amino acid sequence is not particularly limited as long as it has the same CTL-inducing activity.
  • Amino acid sequence alteration may be caused by, for example, mutation or post-translational modification, but can also be artificially altered.
  • all modified peptides having the above-mentioned properties are included irrespective of the cause and means of such modified mutation.
  • the present peptides of the present invention can be produced by chemical or genetic engineering techniques.
  • Chemical methods include the usual liquid-phase and solid-phase methods for peptide synthesis. More specifically, the peptide synthesis method is based on amino acid sequence information, in which a stepwise erosion method in which each amino acid is sequentially linked one by one to extend the chain, and a fragment consisting of several amino acids are previously synthesized. And then subjecting each fragment to a coupling reaction.
  • the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 of the present invention can be synthesized by any of them.
  • the condensation method employed for the above-mentioned peptide synthesis can also be in accordance with various known methods. Specific examples thereof include azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, oxidation-reduction method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (1-hydroxybenzotriazole, N- Hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norpolene-2,3-dicarboxyimide and the like, and the Wood method.
  • the solvent that can be used in each of these methods can also be appropriately selected from general solvents that are well known to be used in this type of peptide condensation reaction. Examples include dimethylformamide (DMF) and dimethylsulfoxy. (DMS ⁇ ), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and a mixed solvent thereof.
  • the hydroxyl group in amino acids and peptides not involved in the reaction is generally esterified to form a lower alkyl ester such as methyl ester, ethyl ester and tertiary butyl ester, for example, benzyl ester, It can be protected as p-methoxybenzyl ester, p-nitrobenzyl ester, aralkyl ester and the like.
  • an amino acid having a functional group in a side chain for example, a hydroxyl group of Tyr may be protected with an acetyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary butyl group or the like, but such protection is not always required.
  • the guanidino group of Arg includes a nitro group, a tosyl group, a 2-methoxybenzenesulfonyl group, a methylene-12-sulfonyl group, a benzyloxycarbonyl group, an isoporonyloxycarbonyl group, and an adamantyloxy group.
  • a suitable protecting group such as a luponyl group.
  • the deprotection reaction of these protecting groups in the amino acids and peptides having the above protecting groups and the finally obtained peptides of the present invention can also be carried out by a conventional method, for example, a catalytic reduction method, liquid ammonia / sodium, and fluorine. It can be carried out according to a method using hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen chloride, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid, methanesulfonic acid or the like.
  • the present peptides of the present invention can be obtained by chemical synthesis as described above, or can be produced by a conventional method using a genetic engineering technique. Obtained in this way
  • the peptides of the present invention can be prepared according to conventional methods, for example, ion-exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), Purification can be performed appropriately according to a method widely used in the field of peptide chemistry such as a flow distribution method.
  • any fusion protein may be used as long as the present peptide is linked to a marker protein and Z or a peptide tag, and conventionally known marker proteins.
  • the protein is not particularly limited as long as it is a protein, and specific examples thereof include alkaline phosphatase, the Fc region of an antibody, HRP, GFP, and the like.
  • Specific examples include conventionally known peptide tags such as epitope tags such as FLAG, Myc and the like, and affinity tags such as GST, maltose binding protein, biotinylated peptide and oligohistidine.
  • Such fusion peptides can be prepared by a conventional method, and can be used to purify the peptides using the affinity of Ni-NTA and His tags, to detect the peptides, and to use the peptides It is also useful for the quantification of antibodies against and for other research reagents in this field.
  • the protein peptide conjugate of the present invention is not particularly limited as long as it is a conjugate of HLA-A24 and the present peptide.
  • it is shown in SEQ ID NO: 4 with HLA-A24 molecule
  • Preferred is a form that can bind to CTL that recognizes such a conjugate, such as a conjugate with a peptide consisting of an amino acid sequence.
  • the tetramer of the protein peptide conjugate of the present invention is not particularly limited as long as it is a tetramer of a protein conjugate in which HLA-A24 and the present peptide are bound.
  • the above-mentioned evening peptide conjugate may be a tetramer with streptavidin as a nucleus.
  • a substrate for the enzyme Bir-A may be added to the C-terminal of HLA-A24. Bir-A-dependent
  • the HLA-A24 ⁇ domain and / 3--2 microglobulin prepared by a conventional method using a genetic engineering technique utilizing the gene (accession number NM-004) were reconstituted.
  • a folding buffer Gibboczi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89: 3429-3433, 1992
  • the fusion protein of the present invention may be any fusion protein in which a tetramer of the protein-peptide conjugate or the protein conjugate is linked to a marker protein and a Z or peptide tag.
  • the marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein, and specific examples thereof include a fluorescent dye, alkaline phosphatase, the Fc region of an antibody, HRP, and GFP.
  • Conventionally known peptide tags include peptide tags such as HA, FLAG, Myc, and the like, and affinity tags such as GST, maltose-binding protein, biotinylated peptides, and oligohistidine. Specific examples of the peptide group can be given.
  • Such fusion proteins can be prepared by a conventional method, such as purification of protein peptide conjugates using affinity of Ni—NTA and His tags, detection of CTL, and other methods. It is also useful as a research reagent in this field.
  • antibodies specifically binding to the present peptides of the present invention include immunospecific antibodies such as monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies, and humanized antibodies. These can be prepared by a conventional method using the above-mentioned peptides as antigens, and among them, monoclonal antibodies are more preferable in view of their specificity.
  • Antibodies that specifically bind to the present peptides, such as the monoclonal antibodies are useful not only for the diagnosis of HTLV-I tumors such as ATL, but also for the HTLV-I specificity of the present peptides. It is useful for elucidating the active and molecular mechanisms of CTL induction.
  • Antibodies against the peptide of the present invention can be prepared in an animal (preferably, other than human) by using a conventional protocol to the peptide of the present invention, a complex of the peptide with an immunogenic protein, the peptide of the present invention.
  • the antibody is produced by administering cells or the like presenting on the membrane surface.
  • the hybridoma method (Nature 256, 495), which provides an antibody produced by a continuous cell line culture, is used.
  • Trioma method Trioma method, Human B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983), and E BV-MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985) can be used.
  • Examples of the DNA of the present invention include DNA encoding the above-mentioned peptides, DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 or 8, or a sequence complementary thereto, and the base shown in SEQ ID NO: 7 or 8.
  • the DNA is not particularly limited as long as it is a DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the sequence or its complementary sequence and encodes an HTLV-I-specific CTL-inducing peptide.
  • DNAs are sometimes collectively referred to as the “DNA group”. ).
  • Examples of the conditions for ⁇ hybridizing under stringent conditions '' include, for example, hybridization at 42 ° C., and 1 ⁇ SSC at 42 ° C. in a buffer containing 0.1% SDS. Washing treatment may be mentioned, and more preferably washing at 65 ° C with a hybridization solution at 65 ° C and a buffer containing 0.1 XSSC and 0.1% SDS. Wear.
  • the factors affecting the stringency of the hybridization include various factors other than the above-mentioned temperature conditions, and those skilled in the art will combine the various factors into the above-described hybridisation method. It is possible to achieve the same stringency as that of the session.
  • DNA groups of the present invention can be advantageously used when the peptides of the present invention are prepared by a conventional method using genetic engineering techniques.
  • the antisense strand of the DNA groups of the present invention includes ATL and the like.
  • HTLV-I is useful as a diagnostic probe for tumors.
  • an HTL V-I-specific CTL induction having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 capable of inducing CTL at in vivo opening
  • the present peptides including the HLA-A2-restricted TaX epitope, and the vectors capable of expressing the present DNA group are used for the induction of the immune response of the present invention such as cell-mediated immunity and humoral immunity. It can be used as an active ingredient in vaccines.
  • the vaccine for inducing an immune response according to the present invention can be used for treating HTL V-1 I tumors such as ATL.
  • the vaccine for inducing an immune response of the present invention those containing various adjuvants for enhancing cellular or local immunity are more preferable, and such adjuvants include, for example, efficient peptide-specific What
  • an adjuvant When used, it is used as a recombinant fusion protein or a recombinant fusion peptide prepared from DNA that continuously encodes various bacterial cell components, toxins, and the like serving as an adjuvant and the present peptides of the present invention. You can also.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing the vaccine for inducing an immune response of the present invention as an active ingredient may contain a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, an immunostimulant, an additive, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent include, for example, stabilizers such as SPGA, carbohydrates such as sorbitol, mannitol, starch, sucrose, glucose, dextran, and proteins such as albumin and casein; Specific examples thereof include protein-containing substances such as skim milk, and buffers such as phosphate buffer, physiological saline, and water.
  • the immunostimulant examples include cytokines such as interleukin-12 (IL-2), interleukin-12 (IL-12), and tumor necrosis factor ⁇ (THF-a).
  • Additives include low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues), proteins, amino acids, carbohydrates including glucose or dextran, chelating agents such as EDTA, protein stabilizers, microbial growth inhibitors or inhibitors, etc.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably in a form that can be administered orally, intravenously, intraperitoneally, intranasally, intradermally, subcutaneously, intramuscularly, or the like. Throw
  • the effective amount to be given can be appropriately determined in consideration of the type and composition of the drug or pharmaceutical composition, the administration method, the age and weight of the patient, etc., and these are administered one to several times a day. Is preferred.
  • oral administration it is usually administered in the form of a preparation prepared by mixing with a pharmaceutical carrier.
  • a carrier that can be used for the preparation a substance that is commonly used in the field of preparation and that does not react with the peptide of the present invention is used.
  • dosage forms include tablets, capsules, granules, powders, syrups, suspensions, suppositories, ointments, creams, gels, patches, inhalants, injections, etc.
  • preparations can be prepared according to a conventional method, and in particular, for liquid preparations, they can be dissolved or suspended in water or other appropriate medium at the time of use. Tablets and granules may be coated by a known method.
  • the peptide of the present invention is prepared by dissolving the peptide in water, but may be dissolved in a physiological saline solution or a glucose solution, if necessary, or by adding a buffer or a preservative. You may. These formulations may also contain other components of therapeutic value.
  • the peptides of the present invention can be used as food materials for preventing HTLV-I infection and improving symptoms of Z or HTLV-I related diseases, such as baked confectionery such as pudding, cooky, bread, cake, jelly, and rice crackers, and yokan.
  • Confectionery such as Japanese sweets, frozen desserts, chewing gum, etc.
  • fishery products such as udon, buckwheat, fish paste products such as kamaboko, ham, fish sausage, yogurt, drink yogurt, juice, milk, soy milk, alcoholic beverages
  • Various drinks such as coffee, black tea, sencha, oolong tea, sports drinks, seasonings such as miso, soy sauce, dressing, mayonnaise, sweeteners, tofu, konjac, other tsukudani, gyoza, croquettes, salads, etc. It can be added to various kinds of side dishes and ingested as a functional food.
  • the diagnostic agent for the immunological function test of the present invention includes the present peptides, the present DNA A vector capable of expressing a group, a protein peptide conjugate in which HLA-A24 and the present peptide are bound, or a tetramer of the protein peptide conjugate as an active ingredient, and an immune function, particularly There is no particular limitation as long as the immune function against HTLV-I can be tested and diagnosed.However, in general, it is possible to express the present DNA group in which the labeled product of the present peptide or the expression product is a labeled product.
  • a vector a label of a protein peptide conjugate in which HLA-A24 and the present peptide are bound, or a label of a tetramer of the protein peptide conjugate.
  • a labeling substance used for making a label a radioisotope can be used in addition to the above marker protein and peptide tag.
  • the immunological function test diagnostic agent of the present invention is brought into contact with peripheral blood leukocytes (lymphocytes) of a subject to recognize epitope in the present peptides and the like.
  • HTLV-ITaX-specific T cells can be identified by binding to T cells.
  • the fluorescent marker such as PE, a tetramer of the protein-peptide conjugate
  • a mononuclear cell fraction is separated from a heparin peripheral blood sample and activated with PE-labeled tetramer (tetramer of protein-peptide conjugate) and CD8 antibody labeled with FITC or Cy5
  • PE-labeled tetramer tetramer of protein-peptide conjugate
  • CD8 antibody labeled with FITC or Cy5 By performing double staining with a marker antibody and counting the number of CD8-positive tetramer-positive cells throughout the flow site, the immune function of the subject can be examined and diagnosed.
  • the expression vector of the present invention is not limited as long as it can express the peptide of the present invention or a conjugate of HLA-A24 (domain and Z or) 3-2 microglobulin) with the peptide of the present invention. Any expression system may be used as long as it is capable of expressing the present peptides in a cell, and may be derived from chromosomes, episomes and viruses.
  • Expression systems e.g., from bacterial plasmids, yeast plasmids, papopavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, retrovirus-derived vectors, bacteriophage, transposon And vectors derived from combinations thereof, for example, plasmids such as cosmid And those derived from the genetic elements of bacteriophages, and among them, viral vectors are preferred.
  • These expression systems may contain a control sequence that regulates the expression as well as causes the expression.
  • An expression vector series that can be translated by changing the reading frame can also be used advantageously.
  • the expression vector of the present invention is useful as an active ingredient in the immune response induction vaccine of the present invention.
  • the host cell of the present invention may be a cell containing the present peptide or an expression system capable of expressing a conjugate of HLAA24 (a domain and / or J3-2 microglobulin) and the present peptide. Any host cell may be used.
  • host cells used include bacterial prokaryotic cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, and Staphylococcus, eukaryotic cells such as yeast and Aspergillus, and Drosophila S2.
  • Insect cells such as Spodoptera Sf9, L cells, CH ⁇ cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BAL BZc3T3 cells (dihydrofolate reductase—zethymidine quinone) (Including mutants lacking ze) etc., BHK21 Vesicles, HEK293 cells, Bowes melanoma cells, oocytes and other animal and plant cells.
  • introduction of the expression system capable of expressing the present peptides into host cells is described in Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) and Sambrook et al.
  • host cells of the present invention are useful for elucidating the activity mechanism and molecular mechanism of the peptides of the present invention for inducing HTL VI-specific CTL.
  • the method for inducing the HTL V_I recognition CTL of the present invention is derived from a Hatcho patient before HS CT! ! Induction of CTLs that stimulate PBMC of the same patient after HS CT from the same HLA type, i.e., HLA-A24 type donor, using in vitro, in vivo or ex vivo, using D-infected T cells Using the peptides of the present invention, inducing HTL V-I-recognizing CTLs that stimulate PBMC of HLA-A24-positive ATL patients in vitro, in vivo or ex vivo, and expressing the DNA group A vector capable of expressing HLA-A24-positive ATL patients in vitro, by in vivo or ex vivo, for example, by genetically engineering the peptide in antigen-presenting cells in the PBMC.
  • the method can be used for the treatment of HTL V-I tumors such as ATL, and is useful for elucidating the activation mechanism and molecular mechanism of HTL V-I-specific CTL induction.
  • Patient # 37 had a transient relapse 4 weeks after HSCT, but in all cases achieved a complete remission 2 months after HSCT.
  • Heparin-treated blood was collected from patient # 37, 12 days before and 18 days after transplantation, and from patient R07, 30 days before and 255 days after transplantation.
  • Their peripheral blood mononuclear cells were isolated by Ficoll-Hypaque Plus gradient centrifugation (Amersham Bioscience, Piscataway, New Jersey) and a portion was stored in liquid nitrogen until used.
  • A—2 (cell line).
  • HTLV-I-infected T cell lines IL T_ # 37 and ILT-R07, derived from patient # 37 and patient R07 before HSCT, respectively, were established by the following procedure. After removing CD8 + cells from P BMC using Dynabeads M450_CD8 (Dynal, Oslo, Norway), 1 g / m 1 of phytohemagglutinin (PHA) — P (SIGMA, St. Louis And then stimulated with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS) (SIGMA) and 10 UZm1 of recombinant human IL-12 (Shinogi Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • PHA phytohemagglutinin
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • SIGMA heat-inactivated fetal calf serum
  • PBMCs enriched in whole cells or CD8 + cells of patients # 37 and R07 after HSCT were stimulated with 1 g / ml PHA-P, followed by The cells were mixed with an equal number of ILT- # 37 or ILT-R07 cells pretreated with% formaldehyde / PBS.
  • ILT- # 37 or ILT-R07 cells pretreated with% formaldehyde / PBS.
  • T cells were maintained in AIM-V TM medium (GIBC0-Invitrogen) supplemented with 10% FCS and 100 U, ml of recombinant human IL-2, and from day 10 to 14 Each ILT cell was stimulated periodically at intervals of days.
  • the present inventors prepared a total of 38 peptides (9 to 24 bases in length) to cover the entire sequence of the HTL V-I TaX protein. Some peptides were synthesized according to previous methods (J. Natl. Cancer Inst. 93, 1775-1783, 2001; J. Virol. 66, 2928-2933, 1992) and all other 9-base length peptides were synthesized. Was purchased from Hokudo Co., Ltd. (Hokkaido, Japan). HTLV-I binds to HLA-A2 or HLA-A24 of Tax BI MAS, a computer-based program to identify potential peptides
  • A- 6 (Recombinant vaccinia virus)
  • IFN-specific ELISP ⁇ T analysis was performed. Then, the number of antigen-specific T cells producing IFN- ⁇ was counted. Briefly, a 96-well PVD F-plate (ELISIPIOSSP, Mil 1), previously coated three times with the anti-IFN-monoclonal macromolecule, 11 D1K (MABTECH, Nacka, Sweden) 3 ⁇ 10 5 cells of ZB PBMC together with 5 ⁇ 10 4 cells / pelle of stimulated cells or 10 ⁇ g / m 1 of peptide were added to ipore, Bedford, Massachusetts). The mixture was allowed to stand at ° C.
  • ELISIPIOSSP 96-well PVD F-plate
  • the cells were removed and incubated with the biotin-labeled anti-IFN-monoclonal antibody 7-B6-1_biotin (manufactured by MABTECH) for 2 hours, followed by streptavidin algal rephosphatase (MABTECH). For 1 hour. After reacting with BICP / NBT alkaline phosphatase substrate (SIGMA) for 10 minutes, the number of stained spots on the dried membrane was measured using a KS-ELISP0T optical microscope system (Carl Zeiss, Jena, Germany). And counted.
  • SIGMA BICP / NBT alkaline phosphatase substrate
  • PE Phycoerythrin
  • HLA—A * 021/1 / a11-19 LFGYPVYV; SEQ ID NO: 1
  • SFHSL HL LF SEQ ID NO: 4
  • the tetramer is NIAID Tetramer Fac i 1 i ty, Emory Univ. Vaccine Center at Yerks (At 1 ant a, Georgia)
  • the company commissioned synthesis and received the offer.
  • Lymphocytes C y - C hrome TM after using the composite anti-CD 8 anti mono Crona Ichiru antibody (BD Pharmingen, Inc.) was stained for 30 minutes, stained with further for 60 minutes 4t with tetramer Then, two-color analysis was performed on a FACSCal ibur using CellQues ⁇ Noftware (manufactured by Beckton Dickinson) (J. Immunol. 162, 1765-1771, 1999).
  • T cell response in PBMCs of patient # 37 after HS CT against ILT- # 37 cells was examined 18 days after HSCT when hematopoietic cells were completely replaced by donor-derived hematopoietic cells.
  • donor # 36 was an HTL V-I carrier
  • the T cell response of donor # 36 to ILT # 37 was also examined. 19 days after the start of culturing, PBMC of patient # 37 and PBMC of donor # 36 after HSCT stimulated twice with ILT-1 # 37 treated with formaldehyde in the presence of IL-12 in in vitro Then, the ability to produce interferon gamma (IFN-a) on IL- # 37 and K562 cells was measured.
  • IFN-a interferon gamma
  • IFN-7 was produced from both cultures # 37 and donor # 36 after HSCT for ILT- # 37, but not in K562 cells. Was not produced (Fig. 1).
  • the magnitude of the IFN- ⁇ production response was much greater in the # 37 culture after HSCT than in the donor # 36 culture.
  • Cell proliferation was also faster in the culture of patient # 37 after HSCT than in the culture of donor # 36.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • the present inventors have found that a 15 to 24 base length corresponding to a Ta X amino acid sequence predicted to be most likely to be an HLA-A2-restricted Tax epitope by a computer program based on the anchor motif. Using a panel of oligopeptides and five 9-mer peptides, the CTL strain of HTLV-I was recognized by the CTL line of patient # 37 after HSCT. I checked the app.
  • HTLV-I-specific CTL responses differed qualitatively or quantitatively between # 37 before HSCT, # 37 after HSCT, and donor # 36.
  • cryopreserved PBMCs were immediately subjected to ELISPOT analysis to determine IFN-r production.
  • Table 1 shows the results for the CTL precursor in non-cultured PBMC of recipient # 37 and donor # 36 responding to ILT- # 37 or TaX epitope.
  • the number of IFN-alpha producing cells resulting from overnight stimulation with ILT- # 37 was almost the same in patients # 37 and donor # 36 after HSCT.
  • the number of IFN-producing cells responding to the Ta 11-19 peptide was 113 (more in # 37 immediately after that than in donor # 36.
  • Patient # 3 before HS CT In 7 PBMCs, the number of IFN-producing cells is generally high even when there is no stimulation, and when stimulated with ILT_ # 37 cells or Ta11-19 peptide. Increased.
  • the present inventors also used these cultured PBMCs as HLA Staining was performed with a tetramer of -A * 021 / Taxll-19. Proportion of HLA- A * 0 2 0 1 / T axl 1- 1 9 + cells CD 8 + cells was significantly higher in patients # 3 7 after HSCT than donor # 3 6 (FIG. 4 b).
  • the culture of patient # 37 before HS CT consisted mainly of CD8-negative cells.
  • HTL V-I specific CTL of # 37 and donor # 36 after HS CT was Proliferate in response to ILT_ # 37 stimulus in vivo, but cannot proliferate # 37 HTLV-I-specific CTL prior to HSCT, and Tax11-19 specific Target CTL was found to be selectively activated in patient # 37 after HS CT.
  • a HTLV-I TaX-specific CTL response to a limited number of epitopes was found after nonmyeloablative HSCT from a HLA-infected sibling.
  • Cultured P BMC of patient # 37 after HSCT showed much higher amounts of HLA-A * 021 / Taxl1--194 than CTL strain of HTLV-I carrier Dona # 36. It contained CTL stained with the monomer (Fig. 4b). This means that the HTL VI-I specific CTL response in patients after HSCT and the CTL response in donors differ qualitatively as well as in amount of CTL.
  • mHAs that have been suggested to be involved in G VHD (N. Engl, J. Med. 334, 281-285, 1996; Science 279, 1054-1057, 1998; Br. J. Haematol 106, 723 -729, 1999; Blood 92, 2169-2176, 1998) are GVL target candidates.
  • the ILT- # 37 and ILT-R07 cell lines from ATL patients before HSCT possessed the recipient-derived antigen as well as the HTLV-I antigen.
  • Patient # 3 after HSCT for ILT-1 # 3 7 The cytotoxicity of the CTL strain established from step 7 was not completely competed using unlabeled T aX -expressing cells (Fig. 2b). It seems that CTL recognizing is also present.
  • HTL V-I-specific CTLs are rarely induced from ATL patients, but CTL for the epitope identified by the present invention is selectively induced from ATL cases that have entered complete remission after stem cell transplantation. Was. This means that this epitope was strongly expressed in the patient's body. It shows that tope is useful as a vaccine antigen.

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Abstract

　成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する細胞傷害活性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、これらを利用した免疫応答誘導用ワクチンや免疫機能検査診断薬等を提供するものである。ＨＬＡが一致する同胞ドナーからの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後に完全寛解を得たＡＴＬ患者の細胞性免疫応答を調査したところ、ＡＴＬ患者のＨＳＣＴ後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の培養液において、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが、ＨＳＣＴ前にインビトロで構築した自己ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に応答して活発に増殖したＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘ３０１−３０９エピトープにのみ誘導された。これは、患者体内でこのエピトープが強く発現されていたことを意味し、本エピトープがワクチン抗原として有用であることを示している。

Description

明 細 書
HTL V- I特異的 C T L誘導活性ペプチド 技術分野
本発明は、 成人 T細胞白血病 （ATL) 等のヒト T細胞白血病ウィル ス I型 （HTLV— I ) 腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する細胞傷害活性 T細胞 （CTL) を誘導することができる HTL V— I特異的 C TL誘 導活性ペプチドや、 該ペプチドをコードする DN Aや、 これらを利用し た免疫応答誘導用ワクチン並びに免疫機能検査診断薬等に関する。 背景技術
成人 T細胞白血病 （ATL) はヒ卜 T細胞白血病ウィルス I型 （HT L V- I ) 感染者の約 5 %が発症する T細胞悪性腫瘍であり、 主に CD 4+及び CD 2 5+成熟 Tリンパ球表現型をもつこと、 中年又はそれ以降 の発症、免疫抑制、 及び予後が悪いことを特徴としている （例えば、 Int. J. Cancer 45, 237-243, 1990; Blood 50, 481-492, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78， 6476-6480, 1981参照。 ） 。 ATLに対して化学療 法を併用した臨床使用により 4年生存率は 8〜 1 2 %に高まったものの. 白血病の他のタイプと比べると依然として低率である（例えば、 J. Clin. Oncol 6, 128-141, 1988、 J. Clin. Onco 6, 1088-1097, 1988参照。 ） 。 最近になって、 造血幹細胞移植 （HS C T) がー部の ATL患者に適用 されるようになつてきた。 自己 HS C Tの初期の研究は AT L再発が頻 繁に起きることを明らかにした （例えば、 Bone Marrow Transplant 23, 87-89, 1999 参照。 ） 。 しかしながら、 より最近の報告によると、 移植 片対宿主病 （GVHD) の危険性は同様にあるものの、 同種 HS CTの 方がより良い結果を生じうることが明らかになった （例えば、 Bone Marrow Transplant 27, 15-20, 2001 参照。 ） 。 以上の報告は、 他のタ ィプの白血病で観察されたように、 レシピエントに対するドナ一の細胞 性免疫応答、 つまり移植片対白血病 （GVL) 効果が ATL細胞根絶に 貢献することを強く示唆している。
ヒト白血球抗原 （HLA) がー致する同胞から受けた同種 H S CTは ある程度の GVHDを起こすことが示され、 レシピエントのマイナ一組 織適合抗原（mH A)が GVHDの標的抗原と考えられてきた（例えば、 N, Engl. J. Med. 334, 281-285, 1996 参照。 ） 。 男性特異的 H— Y移 植抗原 （例えば、 Science 269, 1588-1590, 1995参照。 ） 、 HA— 1抗 原 （例えば、 Science 279, 1054-1057, 1998参照。 ；） 、 C D 3 1分子 （例 えば、 N. Engl. J. Med. 334, 286-291 , 1996, Br. J. Haematol 106, 723-729, 1999参照。 ） 、 及びヒト血小板抗原 （H P A) (例えば、 Br. J. Haematol 106, 723-729, 1999、 Blood 92, 2169-2176, 1998 参照。 ) を含むいく つかの mH Aが GVHDに関与すると示唆されてきた。 同種 H S CT後 の白血病再発の可能性は、 移植片から T細胞を除去した場合又はドナー が遺伝学的に一卵性双生児の場合に増加することが知られており G V L効果が白血病再発を防ぐ為に重要であることを示している （例えば、 Blood 75, 552-562, 1990 参照。 ） 。 従って、 レシピエントの非造血細 胞にではなく造血細胞において発現する mHA特異的なドナ一 T細胞応 答を増加することが、 GVHDを引き起こさずに GV L効果を誘導でき る戦略の一つとして提案されてきた（例えば、 Blood 93, 2336-2341 , 1999 参照。 ） 。 腫瘍細胞特異的又は腫瘍細胞において過剰発現する b c r / a b 1融合タンパク質及び WT_ 1等の腫瘍抗原もまた、 G VL効果の 標的坊原の候補である （例えば、 Blood 95, 1781-1787, 2000、 Blood 96, 1480-1489, 2000参照。 ） 。 -. HTL V- I に対する宿主細胞性免疫応答、 特に細胞傷害性 T細胞の 増殖は、 無症候性 HL TV— 1キヤリァ及び HTL V— I随伴脊髄症ノ 熱帯性痙性対麻痺
(HAM/T S P)患者の P BMC培養液からは頻繁に見い出されるが、 AT L患者から見い出されることは稀である （例えば、 Leukemia 8 Suppl 1, S54-59, 1994、 J. Immunol. 133, 1037-1041, 1984参照。 ；） 。 e n v 、 g a g, p o p X遺伝子産物等の HTL V— I抗原のうち、 p X 遺伝子産物である T a χが HTL V— I特異的な細胞傷害性リンパ球 （ CTL) の優位な標的抗原であることが知られている （例えば、 Nature 348, 245-248, 1990、 Int. Immunol. 3, 761-767, 1991参照。 ；） 。 T a xはまた、 細胞成長を促進しアポト一シスを抑制することによって HT L V- Iの白血病化における重要な役割を果たしていることも知られて いる (例えば、 Lancet 1, 1085-1086, 1987、 J. Virol. 73, 7981-7987, 1999参照。 ） 。 以上の発見から T a x特異的 CTLが HTL V— I感染 細胞の白血病化の免疫的監視の役割を果たしうることが示唆されている ( 本発明者らは以前にヒト HL A— A 2に拘束される C TLの主要ェピ トープを既に見い出している （例えば J. Virol. 66, 2928-2933, 1992 参照。 ) が、 HLA— A 2は日本人の 3 0〜4 0 %のみに陽性である。 また、 最近樹立した HTL V— I感染 T細胞リンパ腫瘍のモデル動物に おいて、 本発明者らはインビポでの T a X特異的 C T Lの抗腫瘍効果を 明らかにした （例えば、 特開 2 0 0 2— 3 7 2 5 3 2号公報、 J. Virol. 74, 428-435, 2000、 J. Virol. 73, 6031-6040, 1999参照。 ） 。 このモ デルにおいては、 T a xをコードする DNA又は CTLェピトープに対 応するぺプチドのいずれかを用いたワクチン接種を受けた同系免疫担当 ラッ トから新鮮な T細胞を移植することにより、 同系 HTLV— I感染 細胞を接種したヌードラッ ト.における無処置では致命的となる T細胞リ ンパ腫が根治し得た （例えば、 J. Virol. 74, 9610-9616, 2000、 J. Natl. Cancer Inst. 93, 1775-1783, 2001参照。 ） 。 しかしながら、 末梢血で のヒト ATL細胞における HTLV— I発現は非常に低いので、 実験動 物における上記の観察がヒトに適用できるかどうかは不明である （例え ば、 非特許文献 Gann 73, 341-344, 1982、 Int. J. Cancer 54, 582-588, 1993、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5620-5624, 1989参照。 ） 。
ATLは、 日本に多くの保有率を持つ HTLV— Iの感染によって引 き起こされる腫瘍性疾患であるが、 化学療法剤に抵抗性であるため、 極 めて予後の悪い悪性腫瘍とされてきた。 種々の臨床的観察や動物実験結 果から、宿主細胞性免疫、特に C TLの抗腫瘍効果が示唆されているが、 CTLの主要な標的抗原である HTLV— I T a xには腫瘍化促進機 能があることが分かつている。 従って、 より特異的で安全性の高いワク チン開発のためには、 C T L認識ェピトープを特定する必要がある。 し かし、 ヒト AT L患者において抗腫瘍効果を持つ C T Lェピト一プは特 定されていなかった。 本発明の課題は、 AT L等の HT L V— I腫瘍に 対して抗腫瘍効果を有する C TLを誘導することができる HTL V— I 特異的 CTL誘導活性べプチドゃ、 該ぺプチドをコードする DN Aや、 これらを利用した免疫応答誘導用ワクチン並びに抗腫瘍免疫能検査診断 薬等を提供することにある。
本発明者らは、 H S C T前の AT L患者に由来する HTLV— I感染 T細胞に対する、 H S C T後の同じ患者の細胞性免疫応答を調査した。 これらの HTLV— I感染細胞は GVL効果の標的を含む、 レシピエン ト由来の抗原を所有すると考えられていた。 本発明者らは HS CT後の P BMCが実際にレシピエント由来細胞に応答することを見い出した。 しかしながら、 応答細胞の大部分は HTLV— I抗原、 特に限られた数 の T a Xェピトープに強く反応した。 H S C T後の AT L患者 2名から 同様の結果を得たが、 そのうち 1名のドナ一は HTLV— I陰性であつ た。 以上の観察から移植片対 HTLV— I応答が H S (3丁後の八丁1^患 者に生じたことが明らかとなった。 かかる研究の過程で、 HLA— A 2 に拘束される C T Lの主要ェピト一プを見い出し、 本発明を完成する に至った。 発明の開示
すなわち本発明は、 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列からな る HTLV— I特異的 CTL誘導活性ペプチド （請求項 1 ) や、 配列番 号 3又は 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる HTLV— I 特異的 CTL誘導活性ペプチド （請求項 2) や、 請求項 1又は 2記載の HTL V- I特異的 C T L誘導活性ペプチドと、 マ一カータンパク質及 び/又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド (請求項 3 ) や、 H L A- A 2 4と請求項 1又は 2記載の HTLV— I特異的 CTL誘導活 性ペプチドとが結合したタンパクーペプチド結合体 （請求項 4) や、 H L A- A 24と請求項 1又は 2記載の HT L V - I特異的 C T L誘導活 性べプチドとが結合したタンパクーペプチド結合体の 4量体 （請求項 5 ) や、 請求項 4記載のタンパクーペプチド結合体又は請求項 5記載の夕 ンパクーペプチド結合体の 4量体と、 マーカータンパク質及び/又はべ プチドタグとを結合させた融合タンパク質 （請求項 6) や、 以下の （ a ) 又は （b) のペプチドをコードする D N A。
(a) 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列からなる HT L V— I 特異的 C T L誘導活性べプチド
(b) 配列番号 3又は 4のいずれかに示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなる HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチド（請求項 7 )や、 • 配列番号 7又は 8に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなる DNA (請求項 8) や、 請求項 8記載の DNAとストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、 かつ HT L V— I特異的 C T L誘導活性ぺプ チドをコードする DNA (請求項 9) に関する。
また本発明は、 配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有する HTLV - I特異的 C T L誘導活性べプチドからなる HL A— A 24拘束性 T a Xェピト一プ （請求項 1 0 ) や、 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸 配列からなる HTL V— I特異的 CTL誘導活性ペプチドを有効成分と して含有する免疫応答誘導用ワクチン （請求項 1 1 ) や、 配列番号 3又 は 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる HTLV— I特異的 CTL誘導活性べプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ヮク チン （請求項 1 2) や、 請求項 7〜 9のいずれか記載の DNAを発現さ せることができるベクターを有効成分として含有する免疫応答誘導用ヮ クチン （請求項 1 3 ) や、 さらに、 HT L V— I特異的 C TL誘導活性 を増強するアジュバントが含まれている、 請求項 8〜 1 0のいずれか記 載の免疫応答誘導用ワクチン （請求項 1 4) や、 請求項 1 1〜 1 4のい ずれか記載の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有する医薬組 成物 （請求項 1 5) や、 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列から なる H T L V— I特異的 C T L誘導活性べプチドを有効成分として含有 する免疫機能検査診断薬 （請求項 1 6) や、 配列番号 3又は 4に示され るアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたアミノ酸配列からなる HTLV— I特異的 CTL誘導活 性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬 （請求項 1 7 ) に関する。 - さらに本発明は、 請求項 7〜 9のいずれか記載の D N Aを発現させる ことができるベクタ一を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬 (請求項 1 8 ) や、 HL A— A 2 4と請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C TL誘導活性べプチドとが結合したタンパクーペプチド結合 体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬 （請求項 1 9) や、 H L A— A 2 4と請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導活 性べプチドとが結合したタンパクーペプチド結合体の 4量体を有効成分 として含有する免疫機能検査診断薬 （請求項 2 0 ) や、 請求項 7〜 9の いずれか記載の DN Aを有効成分として含有する HT L V— I腫瘍の診 断薬 （請求項 2 1 ) や、 請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 CT L誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体 （請求項 2 2) や、 抗体が モノクローナル抗体である請求項 2 2記載の抗体 （請求項 2 3) や、 請 求項 2 2又は 2 3記載の HT LV— I特異的 C T L誘導活性ペプチドに 特異的に結合する抗体を有効成分として含有する HT LV— I腫瘍の診 断薬 （請求項 2 4) や、 請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 C T L誘導活性べプチドを発現することができる発現べクタ一（請求項 2 5 ) や、 請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 C T L誘導活性ペプチド を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項 2 6 )や、 HL A-A 2 4と請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導 活性べプチドとの結合体を発現することができる発現ベクター (請求項 2 7 ) や、 HL A— A 2 4と請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 CTL誘導活性べプチドとの結合体を発現することができる発現系を含 んでなる宿主細胞 （請求項 2 8 ) や、 H S C T前の AT L患者に由来す る HT LV— I感染 T細胞を用いて、 同種の HLAタイプのドナ一由来 の H S CT後の同じ患者の P BMCを刺激することを特徴とする HTL V- I認識 C TLの誘導方法 （請求項 2 9 ) や、 請求項 1又は 2記載の HTL V- I特異的 C T L誘導活性べプチドを用いて、 HL A_A 2 4 陽性の AT L患者の P BMCを刺激することを特徴とする HTL V— I 認識 CTLの誘導方法 （請求項 3 0 ) や、 請求項 7 ~ 9のいずれか記載 の DN Aを発現させることができるベクタ一を用いて、 HLA— A 24 陽性の ATL患者の P BMCを剌激することを特徴とする HTLV— I 認識 CTLの誘導方法 （請求項 3 1 ) に関する。
( 1 ) 本発明により、 日本人の 6 0 %以上が有する HL A_ A 2 4に拘 束される CTLの主要ェピト一プを見い出された。 HTL V— I に対す る免疫応答の検査に本ェピトープ部位のぺプチドを使用することによつ て、 日本人集団のかなりの部分をカバーできることになる。
( 2 ) 現在では、 それぞれの HL Aについて親和性のあるアミノ酸アン 力—モチーフからェピト一プの予測が可能である。 しかしながら、 生体 内の病原体に対する宿主の免疫反応は必ずしもこの予測と一致しない。 本発明により同定されたェピト一プは感染個体から得られたものであり . しかも他のェピトープょりも非常に強い選択性を持って認識されている,
( 3) ATL患者から HTL V— I特異的 C T Lが誘導されることは稀 だが 幹細胞移植後に完全寛解に入った ATL症例から、 本発明により 同定されたェピトープに対する C T Lが選択的に誘導された。 これは、 患者体内でこのェピト一プが強く発現されていたことを意味し、 本ェピ 卜一プがワクチン抗原として有用であることを示している。 図面の簡単な説明
第 1図は、 H S C T後の患者 # 3 7 (図 1 a ) 及びドナ一 # 3 6 (図 l b) の P BMC中の I LT_# 3 7細胞に対する C T L誘導を示す写 真である。 様々な数の P BMCを 1 9日間培養し、 その間初日及び 1 0 日目にホルマリンで固定化した I L T— # 3·7で 2回刺激を与えた。 上 記 P BMCを刺激することなく （〇） 又は I LT— # 3 7を用いて刺激 し （翁） 、 又は K 5 6 2を用いて刺激し （X) 、 1 8時間インキュベー ションした後、 上澄中の I FN— r量を E L I S A分析により測定した 結果を示す図である。 値は 2回の実験の平均値を示す。
第 2図は、 H S C T後の患者 # 3 7から誘導された C T Lの HT L V _ Iの T a X特異性と MH Cクラス I拘束性を示す写真である。
a. HS CT後の患者 # 3 7の P B M C培養液をホルマリンで固定化し た I L T_ # 3 7で 4回刺激し、 その細胞傷害性を51 C r放出分析を 6 時間行い調査した。 使用した標的細胞は HL Aがー致する I L T一 # 3 7 (·) 、 L C L— # 3 6 (〇） 、 及び H S C T前の患者 # 3 7の P H A活性化 P BMC (X) 、 H L A- A 2及び B 4 6がー致する T C L _ K a n (▲) 及び L C L— K a n (△) 、 及び H L Aがー致しない I L T - A s - 2 (♦) 及び L C L一 A s (◊) であった。 黒色の記号は H TL V— I感染細胞を表し、 白色の記号は E B V感染細胞を表す。 値は 3回の実験の細胞障害性（Specific Lys i s)の平均を表す。
b . HTLV— Iの T a xを発現する競合細胞による I LT一 # 3 7特 異的細胞傷害性の阻害を表す。 HS CT後の患者 # 3 7の P BMC培養 液を、 ホルマリンで固定した I L T— # 3 7細胞であらかじめ 5回刺激 し、 放射能標識した I L T一 # 3 7に対してエフェクター細胞対標的細 胞の割合を 3 0対 1 として51 C r放出分析を行った。 上記分析は HTL V— Iの p X遺伝子産物を発現する r V Vに感染させた非標識の L C L — # 3 6細胞 (L C L— # 3 6/p 2 7 X) 、 又はコントロール r v v で感染させた非標識の L C L一 # 3 6細胞 （L C L一 # 3 6ZHA) 又 は I LT一 # 3 7細胞の存在下で行い、 競合細胞対標的細胞の割合は 3 0対 1 とした。
第 3図は、 113〇丁後の患者# 3 7 (ケース 1 ) から誘導された CT Lが認識する HT LV— Iの HLA— A 2拘束性 T a xェピト一プのマ ッビングの結果を示す写真である。 L C L一 # 3 6細胞を 1 0 mMの T a Xアミノ酸配列に対応する 9— 2 4塩基長の合成オリゴぺプチド 3 3 種類でパルス標識し、 H S C T後の患者 # 3 7の C TLに対するそれぞ れの感受性を 51C r放出分析を用いてエフェクター対標的細胞の割合を 1 0として測定した。 値は 3回の実験の細胞障害性の平均値である。 第 4図は、 I L T一 # 3 7細胞の刺激により誘導された、 H S C T前 の患者 # 3 7、 H S C T後の患者 # 3 7及びドナ一 # 3 6の P BMC培 養液における細胞傷害性の特徴についての結果を示す写真である。
a . エフェクター細胞対標的細胞の割合を 3 0とし、 2回刺激を与え 4 0 日間培養した H S C T前の患者 # 3 7の P BMCの細胞傷害性、 及び 3回刺激を与え 4 1 日間培養した H S C T後の患者 # 3 7及びドナ一 # 3 6の P B M Cの細胞傷害性を測定した。 I L T一 # 3 7に対する細胞 傷害性 (黒枠) 、 TL C一 K a nに対する細胞傷害性 (斜線枠) 、 及び L C L - K a n (白枠) に対する細胞傷害性をそれぞれ示す。 値は 3回 の実験の平均値である。
b . I L T _ # 3 7で刺激された P BMC中の HLA— A*0 2 0 1 /Ύ a x i l— 1 9の 4量体結合 C D 8 +T細胞のフローサイ トメトリ一分 析結果を示す。 H S C T後の患者 # 3 7及びドナー # 3 6の P BMC培 養液は 46 日間培養したものを使用したが、 H S C T前の患者 # 3 7の P BMC培養液は長期培養が不可能だったため 3 6日間培養したものを使 用した。 11丁 ¥— 1 の丁 & 1 1 _ 1 9特異的細胞株である T c一 M y j (Int. Immunol. 3, 761-767, 1991)を染色して、 4量体特異性を確認 した。 右上の数字は 4量体に結合した P BMCの割合を示す。 各ケース とも全部で 1 0 0， 0 0 0の現象を示している。
第 5図は、 113 ( 丁後の患者1^ 0 7 (ケ一.ス ·2 ) から誘導された C T Lが認識する HTLV— Iの HLA— A 24拘束性 T a xェピト一プの マツビングの結果を示す写真である。 CD 8 +細胞を豊富に含む P BMC をホルマリンで固定した I LT一 R 0 7細胞で 3回刺激し 3 2 日間培養 し、 T a Xの一連の 3 3合成オリゴぺプチドでパルス標識した HL A— A 24+E B V形質転換 B細胞株である T OKとエフェクター対標的の 割合を 8として混合し、 1 8時間インキュベーションした後、 上澄液中 の I F N—ァを E L I S A分析により測定した。 値は 2回の実験の平均 値である。
第 6図は、 HS CT後の患者 R 0 7 (ケース 2) から誘導された CT L中の HLA— A* 2 4 0 2 /T a x 3 0 1— 3 0 9の 4量体結合 C D 8 +T細胞のフローサイ トメトリー分析結果を示す写真である。 。 HS CT後の患者 R 0 7の培養 6 7日の P BMCを使用した。 右上の数字は 4量体に結合した P BMCの割合を示しており、 全部で 1 0 0， 0 0 0 個の細胞における現象である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の HTLV— I特異的 C TL誘導活性ペプチド、 すなわち H TL V— I腫瘍に対して特異的に抗腫瘍効果を有する CTLを誘導する ことができるぺプチドとしては、 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸 配列からなるぺプチドゃ、 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列に おいて、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァ ミノ酸配列からなり、 HTLV— I特異的に CTL誘導活性を有するぺ プチドであれば特に制限されるものではなく （以下、 配列番号 3又は 4 に示されるアミノ酸配列からなるぺプチド及びこれらアミノ酸配列にお いて、 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失若しくは付加により改 変されたペプチドをあわせて 「本件ペプチド類」 ということがある） 、 ここで、 アミノ酸の 「置換、 欠失若しくは付加」 の程度及びそれらの位 置などは、 改変されたペプチドが、 配列番号 3又は 4に示されるァミノ 酸配列からなるペプチドと同様に H T L V— I特異的 C T L誘導活性を 有する同効物であれば特に制限されず、アミノ酸配列の改変（変異）は、 例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、 人為的 に改変することもできる。 本発明においては、 このような改変 '変異の 原因及び手段などを問わず、 上記特性を有する全ての改変べプチドを包 含する。
本発明の本件べプチド類は、 化学的又は遺伝子工学的手法により製造 することができる。 化学的方法には、 通常の液相法及び固相法によるべ プチド合成法が包含される。 かかるぺプチド合成法は、 より詳しくは、 アミノ酸配列情報に基づいて、 各アミノ酸を 1個ずつ逐次結合させ鎖を 延長させていくステップワイズエロゲ一ション法と、 アミノ酸数個から なるフラグメントを予め合成し、 次いで各フラグメントをカップリング 反応させるフラグメント · コンデンセーション法とを包含する。 本発明 の配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるぺプチド類の合成は、 そ のいずれによることもできる。
上記べプチド合成に採用される縮合法も、 公知の各種方法に従うこと ができる。 その具体例としては、 例えばアジド法、 混合酸無水物法、 D C C法、 活性エステル法、 酸化還元法、 D P P A (ジフエニルホスホリル アジド）法、 D C C +添加物（1―ヒドロキシベンゾトリァゾール、 N— ヒドロキシサクシンアミ ド、 N—ヒドロキシ一 5 _ノルポルネンー 2 , 3ージカルボキシィミ ド等）、 ウッ ドヮ一ド法等を例示できる。 これら各 方法に利用できる溶媒もこの種べプチド縮合反応に使用されることがよ く知られている一般的なものから適宜選択することができる。 その例と しては、 例えばジメチルホルムアミ ド （D M F ) .、 ジメチルスルホキシ ド （D M S〇） 、 へキサホスホロアミ ド、 ジォキサン、 テトラヒドロフ ラン （T H F ) 、 酢酸ェチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることが できる。
なお、 上記ペプチド合成反応に際して、 反応に関与しないアミノ酸及 至ペプチドにおける力ルポキシル基は、 一般にはエステル化により、 例 えばメチルエステル、 ェチルエステル、 第三級ブチルエステル等の低級 アルキルエステル、 例えばべンジルエステル、 p —メトキシベンジルェ ステル、 p —二トロべンジルエステルァラルキルエステル等として保護 することができる。 また、 側鎖に官能基を有するアミノ酸、 例えば T y rの水酸基は、ァセチル基、ベンジル基、ベンジルォキシカルポニル基、 第三級ブチル基等で保護されてもよいが、 必ずしもかかる保護を行う必 要はない。 更に例えば A r gのグァニジノ基は、 ニトロ基、 トシル基、 2—メトキシベンゼンスルホニル基、 メチレン一 2—スルホニル基、 ベ ンジルォキシカルポニル基、 ィソポルニルォキシカルボ二ル基、 ァダマ ンチルォキシ力ルポニル基等の適当な保護基により保護することができ る。 上記保護基を有するアミノ酸、 ペプチド及び最終的に得られる本発 明の本件べプチド類におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、 慣用さ れる方法、 例えば接触還元法や、 液体アンモニア/ナトリウム、 フッ化 水素、 臭化水素、 塩化水素、 トリフルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メタンス ルホン酸等を用いる方法等に従って、 実施することができる。
本発明の本件べプチド類は、上記のように化学合成により得られる他、 遺伝子工学的手法を用いて常法により製造することもできる。 このよう にして得られた
本発明の本件ペプチド類は、 通常の方法に従って、 例えばイオン交換樹 脂、 分配クロマトグラフィ一、 ゲルクロマトグラフィ一、 ァフィ二ティ —クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー （H P L C ) 、 向 流分配法等のぺプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、 適宜 その精製を行うことができる。
本発明の融合べプチドとしては、 本件べプチド類とマーカータンパク 質及び Z又はべプチドタグとが結合しているものであればどのようなも のでもよく、 マーカータンパク質としては、 従来知られているマ一力一 タンパク質であれば特に制限されるものではなく、 例えば、 アルカリフ ォスファターゼ、 抗体の F c領域、 HR P、 GF Pなどを具体的に挙げ ることができ、 またペプチドタグとしては、 HA、 F LAG, My c等 のェピトープタグや、 G S T、 マルトース結合タンパク質、 ピオチン化 ぺプチド、 オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているべ プチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合べプチド類は、 常法により作製することができ、 N i 一 NTAと H i sタグの親和性を 利用した本件ペプチド類の精製や、 本件べプチド類の検出や、 本件ぺプ チド類に対する抗体の定量や、 その他当該分野の研究用試薬としても有 用である。
本発明のタンパクーペプチド結合体としては、 HL A— A 24と本件 ぺプチド類との結合体であれば特に制限されるものではなく、 例えば H L A— A 2 4分子と配列番号 4に示されるアミノ酸配列からなるぺプチ ドとの結合体など、 かかる結合体を認識する CTLに結合できる形態の ものが好ましい。 また、 本発明のタンパクーペプチド結合体の 4量体と しては、 H L A - A 24と本件べプチド類とが結合したタンパクーペプ チド結合体の 4量体であれば特に制限されるものではなく、 上記夕ンパ クーペプチド結合体を、 ストレプトアビジンを核として 4量体 (テトラ マー） としたものを例示することができ、 例えば HL A— A 24の C末 端に酵素 Bir- Aの基質を発現させておき、 Bir-A- dependent
0^1^1&^011法でビォチン化した；^[ —八 24と、フィコ 'エリ トリン (P E) 標識脱グリコシル化アビジンを 4 ： 1で混合することにより得 ることができる (Altman, J.D. , et al.： Science 274, 94-96, 1996) 。 これらタンパクーペプチド結合体及びその 4量体は、 化学合成された本 件ペプチド類と、 HL A— A 2 4遺伝子 （ァクセッションナンバー A AB 6 0 6 5 1 ) や ]3— 2ミクログロブリン遺伝子 (ァクセッションナ ンバー NM— 0 0 4 0 4 8) を利用した遺伝子工学的手法を用いて常 法により作製した HL A— A 2 4の α ドメイン及び/ 3— 2ミクログロブ リンとをリフォールディングパッファ一中でインビトロで結合させる （ Garboczi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89: 3429-3433, 1992 ) ことにより、 あるいは本件ペプチド類をコードする DN Aと HLA— A 2 4遺伝子や) 3— 2ミクログロプリン遺伝子とをそれぞれ利用した遺 伝子工学的手法を用いて常法により本件べプチド類と HLA— A 2 4の a ドメインや 一 2ミクログロプリンとを同一宿主細胞内で共発現させ 精製後にこれらを結合させることにより作製することができる。
本発明の融合タンパク質としては、 上記タンパク—ペプチド結合体又 は夕ンパクーペプチド結合体の 4量体とマーカータンパク質及び Z又は ペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、 マーカ一タンパク質としては、 従来知られているマーカ一タンパク質で あれば特に制限されるものではなく、 例えば、 蛍光色素、 アルカリフォ スファターゼ、 抗体の F c領域、 H R P、 G F Pなどを具体的に挙げる ことができ、 またペプチドタグとしては、 HA、 F L AG, M y c等の ェピトープタグや、 G S T、 マルト一ス結合夕ンパク質、 ピオチン化べ プチド、 オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているぺプ チド夕グを具体的に例示することができる。かかる融合夕ンパク質類は、 常法により作製することができ、 N i — NT Aと H i sタグの親和性を 利用したタンパクーペプチド結合体の精製や、 C TLの検出や、 その他 当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明の本件べプチド類に特異的に結合する抗体としては、 モノクロ —ナル抗体、 ポリクロ一ナル抗体、 キメラ抗体、 一本鎖抗体、 ヒト化抗 体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、 これらは上記本 件べプチド類を抗原として用いて常法により作製することができるが、 その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。 かか るモノクローナル抗体等の本件べプチド類に特異的に結合する抗体は、 例えば、 AT L等の HT L V— I腫瘍の診断に有用であるばかりでなく、 本件べプチド類の HTLV— I特異的 C TL誘導の活性機構や分子機構 を明らかにする上で有用である。
本件ペプチド類に対する抗体は、 慣用のプロトコールを用いて、 動物 (好ましくはヒト以外) に、 該本件ペプチド類、 該本件ペプチド類と免 疫原性を有するタンパク質との複合体、 該本件べプチド類を膜表面に提 示した細胞等を投与することにより産生され、 例えばモノクロ一ナル抗 体の調製には、 連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、 ハイプリ ドーマ法 (Nature 256, 495-497, 1975) 、 トリォ一マ法、 ヒト B細胞ハイブリ ド一マ法 （Immunology Today 4, 72, 1983) 及び E BV —八イブリ ドーマ法 (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.， 1985) など任意の方法を用いることがで きる。
また、 本発明の DNAとしては、 上記本件ペプチド類をコードする D NAや、 配列番号 7又は 8に示される塩基配列若しくはその相補的配列 からなる DNAや、 かかる配列番号 7又は 8に示される塩基配列若しく はその相補的配列からなる D N Aとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、 かつ HTL V— I特異的 CTL誘導活性ペプチドをコード する DN Aであれば特に制限されるものではない （以下、 上記の本発明
6 の DN Aを総称して 「本件 DNA群」 ということがある。 ） 。 上記 「ス トリンジェントな条件下でハイプリダイズする」条件としては、例えば、 42 °Cでのハイブリダィゼーシヨン、 及び 1 X S S C、 0. 1 %の S D Sを含む緩衝液による 42 °Cでの洗浄処理を挙げることができ、 6 5 °C でのハイブリダィゼ一シヨン、 及び 0. 1 X S S C、 0. 1 %の S D S を含む緩衝液による 6 5 °Cでの洗浄処理をより好ましく挙げることがで きる。 なお、 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響を与 える要素としては、 上記温度条件以外に種々の要素があり、 当業者であ れば、 種々の要素を組み合わせて、 上記例示したハイブリダィゼ一ショ ンのストリンジエンシーと同等のストリンジエンシーを実現することが 可能である。 これら本発明の DN A群は、 本件ペプチド類を遺伝子工学 的手法を用いて常法により作製するときに有利に用いることができる他. 特に本発明の DN A群のアンチセンス鎖は、 ATL等の HTLV— I腫 瘍の診断用プローブとして有用である。
本発明の HL A— A 2拘束性 T a Xェピトープとしては、 インビポゃ インビト口において C T Lを誘導することができる、 上記配列番号 4に 示されるアミノ酸配列を有する HTL V— I特異的 C TL誘導活性ぺプ チドからなるェピ卜ープであれば特に制限されるものではない。 かかる H L A - A 2拘束性 T a Xェピトープを含めた本件べプチド類や、 本件 DNA群を発現させることができるベクタ一は、 細胞性免疫や体液性免 疫等の本発明の免疫応答誘導用ワクチンにおける有効成分として用いる ことができる。 本発明の免疫応答誘導用ワクチンは AT L等の HT L V 一 I腫瘍の治療に用いることができる。
また、 本発明の免疫応答誘導用ワクチンとしては、 さらに細胞性の又 は局所的な免疫を増強する種々のアジュバントを含むものがより好まし く、 かかるアジュバントとしては、 例えば、 効率よくペプチド特異的な
7 C TLを誘導することができる樹状細胞、 C p Gモチーフを含む I S S — 0 D N ^ immunost imulatory DNA sequences-ol igodeoxynucleot ide； Nat. Med. 3， 849-854, 1997) 、 細胞傷害性 T細胞を剌激する Q S 2 1 (Qui 11 ai a saponar i a¾ Cambridge Biotech, Worcester, MAより商業的 に入手可能） 、 水酸化アルミニウム、 リン酸アルミニウム、 酸化アルミ 二ゥム、 油性ェマルジヨン、 サポニン、 ビタミン E溶解物等を具体的に 挙げることができる。 アジュバントを用いる場合、 アジュバントとなる 種々の菌体成分や毒素等と、 前記本発明の本件べプチド類とを連続して コードする DN Aから作製した組換え融合タンパクあるいは組換え融合 ぺプチドとして用いることもできる。
また、 上記本発明の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有す る本発明の医薬組成物は、 医薬的に容認可能な担体又は希釈剤、 免疫賦 活剤、 添加剤等を含んでいてもよく、 かかる担体又は希釈剤としては、 例えば、 S P G Aなどの安定化剤や、 ソルビトール、 マンニトール、 澱 粉、 スクロース、 グルコース、 デキストラン等の炭水化物や、 アルブミ ン、 カゼイン等のタンパク質や、 ゥシ血清、 スキムミルク等のタンパク 質含有物質や、 リン酸緩衝液、 生理食塩水、 水等の緩衝液などを具体的 に挙げることができる。 免疫賦活剤としては、 インターロイキン一 2 ( I L - 2 ) 、 インタ一ロイキン— 1 2 ( I L - 1 2 ) 、 腫瘍壊死因子 α (THF - a ) 等のサイ トカインを具体的に例示することができ、 添加 剤としては、低分子量のポリペプチド (約 1 0残基未満) 、 タンパク質、 アミノ酸、 グルコース又はデキストランを含む炭水化物、 EDTAなど のキレート剤、 蛋白質安定化剤、 微生物増殖阻止若しくは抑制剤等を例 示することができるがこれらに限定されるものではない。
また、 本発明の医薬組成物は、 経口、 静脈内、 腹腔内、 鼻腔内、 皮内、 皮下、 筋肉内等により投与することができる形態のものが好ましい。 投
8 与すべき有効量は、 医薬品や医薬組成物の種類 ·組成、 投与方法、 患者 の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、 これらを 1 日あた り 1〜数回投与することが好ましい。 また、 経口投与する場合、 通常、 製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。 この際、 製剤に 用いることができる担体としては、 製剤分野において常用され、 かつ本 発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。 また、 剤型としては、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤、 懸濁剤、 坐剤、 軟膏、 クリーム剤、 ゲル剤、 貼付剤、 吸入剤、 注射剤等を具体的に例示するこ とができ、 これらの製剤は常法に従って調製され、 特に液体製剤にあつ ては、 用時、 水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすること もできる。 また錠剤、 顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。 注射剤の場合には、 本発明のぺプチドを水に溶解させて調製されるが、 必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、 ま た緩衝剤や保存剤を添加してもよい。 またこれらの製剤は、 治療上価値 のある他の成分を含有していてもよい。
さらに、 本発明の本件ペプチド類は、 H T L V— Iの感染予防及び Z 又は H T L V— I関連疾患の症状改善用食品素材として、 プリン、 クッ キー、 パン、 ケーキ、 ゼリー、 煎餅などの焼き菓子、 羊羹などの和菓子、 冷菓、 チューインガム等のパン ·菓子類や、 うどん、 そば等の麵類や、 かまぼこ、 ハム、 魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、 ヨーグルト、 ド リンクヨーグルト、 ジュース、 牛乳、 豆乳、 酒類、 コ一ヒー、 紅茶、 煎 茶、 ウーロン茶、 スポーツ飲料等の各種飲料や、 みそ、 しょう油、 ドレ ッシング、 マヨネーズ、 甘味料等の調味類や、 豆腐、 こんにゃく、 その 他佃煮、 餃子、 コロッケ、 サラダ等の各種総菜へ配合し、 機能性食品と して摂取することもできる。
本発明の免疫機能検査診断薬としては、 本件ペプチド類、 本件 D N A 群を発現させることができるベクター、 H L A— A 2 4と本件べプチド 類とが結合したタンパクーペプチド結合体、 又は該夕ンパクーペプチド 結合体の 4量体を有効成分とし、 免疫機能、 特に H T L V— I に対する 免疫機能を検査 ·診断しうるものであれば特に制限されるものではない が、 通常は、 本件ペプチド類の標識体、 発現産物が標識体となる本件 D N A群を発現させることができるベクタ一、 H L A— A 2 4と本件ぺプ チド類とが結合したタンパクーペプチド結合体の標識体、 又は該タンパ クーペプチド結合体の 4量体の標識体を用いることが好ましい。 標識体 とするために用いられる標識化物質しては、 上記のマ一カータンパク質 やペプチドタグの他、 放射性同位元素を用いることができる。 本発明の 免疫機能検査診断薬を用いた免疫機能検査診断は、 対象被験者の末梢血 白血球 （リンパ球） に本発明の免疫機能検査診断薬を接触させ、 本件べ プチド類等におけるェピトープを認識する T細胞と結合させることによ り H T L V— I T a X特異的 T細胞を識別することができる。免疫機能 検査診断薬の中でも、 上記夕ンパク—ベプチド結合体の 4量体の P E等 の蛍光標識体はフローサトメトリーによる C T Lの検出 ·定量を可能に するため、 免疫機能検査診断薬の他、 ワクチン効果判定に特に有用であ る。 例えば、 へパリン末梢血検体から単核球分画を分離し、 P E標識テ トラマ一 (タンパク—ペプチド結合体の 4量体） と、 F I T Cや C y 5 で標識した C D 8抗体等の活性化マーカ一抗体とで 2重染色し、 フロー サイ トメ一夕一で C D 8陽性テトラマー陽性の細胞数を計箅することに より、 対象被験者の免疫機能の検査 ·診断を行うことができる。 また、 新鮮血液検体ではテトラマ一陽性細胞数が非常に少ないことがよくある ことから、 新鮮血液検体だけでなく、 本件ペプチド類やその発現細胞な どで一回刺激をした後、 数日〜 1週間培養後に同様の染色解析をするこ ともできる。 本発明の発現べクタ一としては、 本件ペプチド類や、 H L A— A 2 4 ( ドメイン及び Z又は )3 — 2ミクログロブリン） と本件ペプチド類と の結合体を発現することができるものであればどのようなものでもよく 使用される発現系としては、 上記本件べプチド類を細胞内で発現させる ことができる発現系であればどのようなものでもよく、 染色体、 ェピソ ーム及びウィルスに由来する発現系、 例えば、 細菌プラスミド由来、 酵 母プラスミ ド由来、 S V 4 0のようなパポパウィルス、 ワクシニアウイ ルス、 アデノウィルス、 鶏痘ウィルス、 仮性狂犬病ウィルス、 レトロゥ ィルス由来のベクタ一、 バクテリオファージ由来、 トランスポゾン由来 及びこれらの組合せに由来するベクター、 例えば、 コスミ ドゃファ一ジ ミ ドのようなプラスミ ドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来する ものを挙げることができるが、 中でもウィルス系ベクターが好ましい。 これら発現系は、 発現を起こさせるだけでなく、 発現を調節する制御配 列を含んでいてもよい。 また、 読み枠を変えて翻訳することができる発 現べクタ一シリーズも有利に用いることができる。 本発明の発現べク夕 一は、 本発明の免疫応答誘導用ワクチンにおける有効成分として有用で ある。
本発明の宿主細胞としては、 本件ペプチド類や、 H L A-A 2 4 ( a ドメイン及び 又は J3 — 2ミクログロブリン） と本件べプチド類との結 合体を発現することができる発現系を含む細胞であればどのようなもの でもよく、 使用される宿主細胞としては、 大腸菌、 ストレプトミセス、 枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、 酵母、 ァスペルギルス等の真核細胞や、 ドロソフイラ S 2、 スポドプテ ラ S f 9等の昆虫細胞や、 L細胞、 CH〇細胞、 C O S細胞、 H e L a 細胞、 C 1 2 7細胞、 B A L BZ c 3 T 3細胞 （ジヒドロ葉酸レダク夕 —ゼゃチミジンキナ一ゼなどを欠損した変異株を含む） 、 B HK 2 1細 胞、 HEK 2 9 3細胞、 B owe sメラノーマ細胞、 卵母細胞等の動植 物細胞などを挙げることができる。 また、 本件ペプチド類を発現するこ とができる発現系の宿主細胞への導入は、 Davisら （BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) 及び Sambrookら (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989) などの多くの標準的な実験室マニュ アルに記載される方法、 例えば、 リン酸カルシウムトランスフエクショ ン、 D EAE—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、 卜ランスべク シヨン（transvection)、 マイクロインジェクション、 カチオン性脂質媒 介卜ランスフエクシヨン、 エレクト口ポレーシヨン、 形質導入、 スクレ —フローテインク (scrape loading), 弾丸導入 (bal 1 ist ic
introduction),感染等により行うことができる。 これら本発明の宿主細 胞は、 本件ペプチド類の HTL V— I特異的 CTL誘導の活性機構や分 子機構を明らかにする上で有用である。
本発明の HTL V_ I認識 C T Lの誘導方法としては、 HS CT前の 八丁 患者に由来する！！丁 ー I感染 T細胞を用いて、 同種の HL A タイプ、 すなわち HL A— A 24タイプのドナ一由来の HS C T後の同 じ患者の P BMCをインビトロ、 ィンビボ又はェクスビボで刺激する C T Lを誘導する方法や、 本件ペプチド類を用いて、 HL A— A 2 4陽性 の A T L患者の P B M Cをインビトロ、 ィンビポ又はェクスビポで剌激 する HTL V— I認識 CTLの誘導方法や、 本件 DNA群を発現させる ことができるベクターを用いて、 例えば P BMC中の抗原提示細胞に遺 伝子工学的にぺプチドを発現させるなど、 HL A— A 2 4陽性の AT L 患者の P BMCをインビトロ、 ィンビポ又はェクスビポで刺激する HT L V- I認識 C T Lの誘導方法であれば特に制限されるものではなく、 かかる誘導方法により得られる HTLV— I認識 CTLは、 養子免疫療 法として AT L等の HTL V— I腫瘍の治療に用いることができる他、 HTL V- I特異的 CTL誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上 で有用である。
(実施例）
以下に、 実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、 この発 明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
A [方法と材料]
A— 1 (レシピエント Zドナ一組み合わせ及び血液サンプル）
2名の急性型 AT L患者である # 3 7 (ケース 1 ) 及び R 0 7 (ケ一 ス 2 ) 、 並びに、 それぞれの患者の H L Aがー致する同胞ドナーである # 3 6及び D 0 7から末梢血サンプルを得た。 患者 # 3 7は H S C T後 4週間で一過性再発を起こしたものの、 いずれのケースも HS CT後 2 ヶ月で完全寛解を得た。 へパリン処置した血液を、 移植 1 2日前及び移 植 1 8 3 日後に患者 # 3 7から、 移植 3 0日前及び移植 2 5 5 日後に患 者 R 0 7から、 それぞれ採取した。 彼らの末梢血単核細胞 （P BMC) をフィコール ·ハイパックプラス勾配遠心法（Amersham Bioscience社製、 Piscataway, New Jersey)により単離し、 使用するまで一部を液体窒素で 保存した。
A— 2 (細胞株) .
H S C T前の患者 # 3 7及び患者 R 0 7のそれぞれに由来する H T L V— I感染 T細胞株である I L T_ # 3 7及び I L T— R 0 7を、 下記 の手順で樹立した。 P BMCからダイナビーズ M450_CD8(Dynal社製、 Oslo, Norway)を用いて C D 8 +細胞を除去した後に 1 g/m 1のフイ トへマ グルチニン （P H A) — P (SIGMA社製、 St. Louis, Mi s sour i)で剌激し、 次に 1 0 %熱不活性ゥシ胎児血清 （F C S) (SIGMA社製）と、 1 0 UZm 1 の組換えヒト I L一 2 (塩野義製薬社製、 大阪、 日本） 又は 1 0 n g /m 1 の組換えヒト I L— 1 5 (SIGMA社製） とを含む R P M I - 1 64 0培地（GIBCO-Invitrogen社製、 Grand Island, New York)で 5 %の二酸 化炭素と共に 3 7 °Cで 2ヶ月以上維持した。 ェプスタイン .バールウイ ルス （EBV) 形質転換 B細胞株である L C L一 # 3 6は、 E BVを含 む B 9 5— 8細胞（J. Immunol. 124， 1045-1049， 1980)の上澄を用いて 感染させたドナー # 3 6の CD 1 9+P BMCからインビトロで樹立し た。 HTL V— I感染 T細胞株である T C L -K a n (Int. J. Cancer 34, 221-228, 1984)及び I L T— A s— 2 (Int. Immunol. 3, 761-767, 1991) 、 E B V形質転換 B細胞株である L C L— K a n， L C L一 A s、 及び TOK (J. Virol. 66, 2928-2933, 1992)、 及び赤芽球様細胞株である K 5 6 2 (Blood 45, 321-334, 1975)もまた使用した。
A - 3 (HTL V_ I特異的 CTLの誘導）
H S C T後の患者 # 3 7及び R 0 7の全細胞又は C D 8 +細胞を豊富 に含む 1 0 0万個の P BMCを、 1 g/m 1の P HA— Pで刺激し、 次に 1 %ホルムァルデヒド/ P B Sで前処理した同数の I L T— # 3 7 又は I LT— R 0 7細胞と混合した。 これらの T細胞を 1 0 % F C S及 び 1 0 0 U,m 1の組換えヒト I L— 2を添加した A I M— V™培地 (GIBC0- Invitrogen社製）で維持し、 1 0日から 1 4日の間隔をあけて定 期的にそれぞれの I L T細胞で刺激をあたえた。
A - 4 (合成ペプチド）
本発明者らは HTL V— Iの T a Xタンパク質の配列すベてを網羅す るために全部で 3 8のペプチド （9〜 24塩基長） を調製した。 いくつ かのペプチドは従前の方法に従って合成し（J. Natl. Cancer Inst. 93, 1775-1783, 2001； J. Virol. 66， 2928-2933, 1992)、 他のすべての 9塩 基長のペプチドは株式会社ホク ドー （北海道、 日本） より購入した。 H T L V - Iの T a xのうち HLA— A 2又は HLA— A 24と結合する 可能性のあるべプチドを同定するために、 コンピュータを利用したプロ グラムである B I MAS
(ht t ://bimas. dcr t. nih. gov/iol i l/hla#bind/)を文献（J. Immunol. 152, 163-175, 1994; J. Immunol. 152, 3913-3924, 1994)記載の方法に 従い使用した。
A- 5 (C TL分析）
様々なエフェクター細胞対標的細胞 （E/T) 割合において文献（J. Natl. Cancer Inst. 93, 1775-1783, 2001； J. Virol. 76, 7010-7019, 2002)記載の方法に従い、 51C r放出分析を 6時間行い、 細胞傷害活性を 測定した。 特異的細胞傷害性を式 （ [実験により得られた51 C r放出量 一自発性の51 C r放出量] / [最大51 C r放出量一自発性の51 C r放出量 ] X 1 0 0 %) により算出した。 エフェクター細胞が産生する I F N - Tを測定するために、 様々な E/T割合において標的細胞と 1 8時間ィ ンキュベ一ションした後に、 E L I S A法 （ヒト I F N—ァ E L I S A キッ ト， Endogen社製、 Woburn, Massachusetts) を用いて 2回測定した
A- 6 (組み換えワクシニアウィルス）
HT L V— Iの p X遺伝子を含む組換えワクシニアウィルス ( r V V
) WR - p 2 7X及び HTL V_ I遺伝子をもたない W R— H Aは Dr. Hisatoshi Shida (北海道大学、 日本) (Cell 55, 197-209, 1988)から供 与されたものを用い、 文献（Int. Immunol. 3, 761-767, 1991； J. Natl.
Cancer Inst. 93， 1775-1783, 2001)記載の方法に従い感染効率 (MO I
) を 5 0にして使用した。
A- 7 (E L I S P〇T分析）
文献（J. Immunol. Methods 191, 131-142, 1996; J. Exp. Med. 186,
859-865, 1997)記載の方法で、 I F N—ァ特異的 E L I S P〇 T分析を 行い、 I F N—ァを産生する抗原特異的 T細胞数を計測した。 簡潔に述 ベると、 抗 I F N—ァモノクロナ一ル坊体である 1 一 D 1 K (MABTECH社 製， Nacka, Sweden)であらかじめ 3回コーティングした 9 6ゥエルの P VD Fプレート（ELISIPIOSSP, Mil 1 ipore社製、 Bedford, Massachusetts) に、 5 X 1 04細胞/ゥエルの剌激細胞又は 1 0 X g/m 1のべプチドと 共に、 1 X 1 05細胞 Zゥエルの P B MCを 3 7 °Cでー晚静置した。 翌日 に細胞を除去し、 ゥエルをピオチン標識した抗 I F N—ァモノクロナー ル抗体である 7 — B 6 _ 1ピオチン（MABTECH社製）と共に 2時間ィンキ ュベーションした後、 ストレブトァビジンアル力リフォスファターゼ (MABTECH社製）と共にさらに 1時間ィンキュベ一ションした。 B I C P/ N B Tアルカリフォスファタ一ゼ基質（SIGMA社製）と 1 0分間反応させ た後、 乾燥させた膜上の染色箇所数を KS- ELISP0T光学顕微鏡システム (Carl Zeiss社製、 Jena, Germany)を用いて計数した。
A- 8 ( 4量体染色）
フィコエリ トリン （P E) 複合型 H L A— A*0 2 0 1 /Ύ a 1 1 - 1 9 (L L F G Y P V Y V ；配列番号 1 ) 4量体およびフィコエリ トリ ン （ Ρ Ε ) 複合体 H L A- A*2 4 0 2./T a x 3 0 1 — 3 0 9 ( S F H S L HL L F；配列番号 4 ) 4量体は、 NIAID Tetramer Fac i 1 i ty, Emory Univ. Vaccine Center at Yerks (At 1 ant a, Georgia)に合成を委託し提 供を受けた。 リンパ球を、 C y - C h r o m e TM複合型抗 C D 8抗モノ クロナ一ル抗体 (BD Pharmingen社製) を用いて 3 0分間染色した後、 4 量体を用いてさらに 6 0分間 4tで染色し、次に CellQuesぃノフトウエア (Beckton Dickinson社製）を用いて FACSCal iburで 2色解析を行った （J. Immunol. 162, 1765-1771, 1999) 。
B [結果]
B - 1 (H S C T前の HT L V— I感染細胞と反応する H S C T後のレ シピエントからの CTL誘導）
HS CT前のレシピエント由来の造血細胞に対する H S C T後のレシ ピエン卜の免疫応答を調べるために、 本発明者らは H S CT前の患者 # 3 7及び R 0 7それぞれから、 I L _ 2又は I L一 1 5の存在下で P H Aの刺激を受けた P BMCを 2ヶ月以上維持することにより、 T細胞株 でぁる 1 丁ー # 3 7及び I L T _ R 0 7を樹立した。 どちらの細胞株 も CD 4や、 HTLV— Iの T a x、 p 1 9等の H T L V— I抗原に陽 性であった。
I LT一 # 3 7細胞に対する H S CT後の患者 # 3 7の P BMCにお ける τ細胞応答を、 造血細胞がドナー由来の造血細胞に完全に置換され た HS CTの 1 8 3日後に調べた。 ドナー # 3 6は HTL V— Iキヤリ ァだったので、 ドナ一 # 3 6の I L T# 3 7に対する T細胞応答も調べ てみた。 培養開始 1 9 日後に、 インピトロで I L一 2の存在下において ホルムアルデヒド処理した I L T一 # 3 7で 2回剌激した H S C T後の 患者 # 3 7の P BMCとドナ一 # 3 6の P BMCを調べ、 I LT— # 3 7及び K 5 6 2細胞に対するィンターフェロンガンマ ( I FN—ァ） 産 生能力を測定した。 ー晚ィンキュベーションした後、 I L T— # 3 7に 対しては H S C T後の # 3 7及びドナ一 # 3 6両方の培養から I FN— 7が産生されたが、 K 5 6 2細胞に対しては産生されなかった (図 1 )。 I FN-ァ産生応答の規模はドナ一 # 3 6の培養液よりも H S C T後の # 3 7の培養液においてはるかに大きかった。 細胞増殖もまた、 ドナ一 # 3 6の培養液よりも H S C T後の患者 # 3 7の培養液において速かつ た。 本発明者らは、 H S C T後の患者 # 3 7のエフェクター細胞のほと んどが I LT— # 3 7細胞を死滅させる能力のある CD 8+細胞傷害性 Tリンパ球 （CTL) であることを51 C r放出分析により確認した。
B— 2 (H S C T後の患者から誘導した C T Lの HT L V— I特異性） 次に、 I L T一 # 3 7細胞の刺激に対する、 113 (：丁後の患者# 3 7 由来の CTLの特異性を調べた。 I L T一 # 3 7に対して顕著なレベル の細胞傷害性を観察したが、 PHAで刺激を受けた H S C T前の患者 # 3 7の P BMCに対しては観察できなかった（図 2 a )。 この結果は、 ど ちらの標的細胞も H S C T前の患者 # 3 7から由来するものの、 CTL の主な標的抗原は好ましくは I LT_ # 3 7で発現する抗原であり、 P H Aで刺激を受けた P BMCで発現する抗原ではないということを明示 している。 さらに、 CTLは HL A— A 2及び B 46を共有する同種 H T L V - I感染 TC L— K a n細胞を効果的に死滅させたが、 HL A不 一致の HT L V— I感染 I L T— A s — 2、 H LAがー致するドナー # 3 6由来の E B V感染 L C L _ # 3 6、 L C L— K a n、 L C L—A s 細胞は死滅させなかった。 以上の結果は、 I L T— # 3 7に応答する H S C T後の患者 # 3 7から樹立した C Tし株 ( H S C T後の患者 # 3 7 の CTL株） が HTL V_ I坊原特異的であることを強く明示した。 放射標識した I L T— # 3 7に対する H S C T後の患者 # 3 7の C T L株の細胞傷害性は顕著であつたが、 T a Xを含む HTL V— Iの p X 遺伝子産物を発現するワクシニア組換え体で感染させた非標識の L C L 一 # 3 6 (L C L— # 3 6Zp 2 7 X) によって部分的に抑制され （図 2 b) 、 H S C T後の患者 # 3 7の C T L株が I L T一 # 3 7細胞を溶 解することのできる大量の HTLV— Iの T a x特異的 CD 8+CTL を含むことが示された。
さらに本発明者らは、 アンカーモチーフに基づきコンピュータプログ ラムによって HLA— A 2拘束性 T a Xェピトープである可能性が最も 高いと予測された T a Xアミノ酸配列に対応する 1 5から 24塩基長の オリゴペプチドのパネルと、 5種の 9塩基長のペプチドを用いて H S C T後の患者 # 3 7の C T L株が認識した HT L V— Iの T a xにおける' ェピ卜一プを調べた。 オリゴペプチド T a X 1— 2 4 (MAHF P GF GQ S L L F GYP VYVF GD CV ；配列番号 2 ) 及び T a x i l— 1 9 (L L F GYP VYV ;配列番号 1 )でパルスされた L C L一 # 3 6 細胞は、 HS CT後の患者 # 3 7の CTL株によって選択的に死滅させ られた。 以上の結果は、 H S CT後の患者 # 3 7の CTL培養液中の H TL V— Iの T a X特異的 C T Lの主な集団が、 HL A— A 2拘束性 T a x i l— 1 9ェピトープに導かれることを明らかにした （図 3) 。 な お、かかる H L A - A 2拘束性 T a x i l— 1 9ェピト一プについては、 本発明者らは以前にヒト HL A— A 2に拘束される C T Lの主要ェピト —プとして既に報告している（J. Virol. 66， 2928-2933, 1992)。
B— 3 (HS CT前の患者、 HS CT後の患者、 及びドナ一間での異な る HT L V_ I特異的応答）
次に、 HS C T前の # 3 7、 H S C T後の # 3 7及びドナー # 3 6間 で、 HT L V— I特異的 C T L応答が質的又は量的に異なるかどうかを 調べてみた。 インビトロ培養による実験的なバイアスを受けずに、 HT L V- I特異的 CTL前駆体細胞数を調べるために、 冷凍保存した P B M Cを直ちに E L I S P O T分析にかけ、 I F N - r産生を調べた。 I L T一 # 3 7又は T a Xェピトープに応答するレシピエント # 3 7及び ドナ一 # 3 6の非培養 P BMC中の C T L前駆体についての結果を表 1 に示す。 冷凍貯蔵されていた H S C T前及び H S C T後の患者 # 3 7の 非培養 P BMC及びドナー # 3 6の非培養 P BMCを直接解凍し、 上記 A [方法と材料]で述べたように、ホルマリン処理した I L T— # 3 7、 合成オリゴぺプチド T a x i 1— 1 9及び T a x 3 0 7— 3 1 5、 又は コントロール培地と共にー晚ィンキュベ一ションした後、 I F N—ァの E L I S P〇T分析を行い、 1 05あたりの I FN—ァ産生細胞の数を測 定した。 値は 3回の実験の平均値土 S Dである。 また、 I FN—ァの E L I S P OT分析の結果は P BMC 1 05あたりのスポッ ト形成細胞（S' F C) で表わされている。 その結果、 一晩 I LT一 # 3 7で刺激を受け た結果生じた I F N— ァ産生細胞数は、 H S C T後の患者 # 3 7及びド ナ一 # 3 6でほぼ同じであった。 しかしながら T a 1 1 - 1 9ぺプチ ドに応答する I F N—ァ産生細胞数は、 113 ( 丁後の# 3 7の方がドナ 一 # 3 6よりも多かった。 H S CT前の患者 # 3 7の P BMCにおいて は、 I FN—ァ産生細胞数は刺激がないときであっても一般的に高く、 I L T _ # 3 7細胞又は T a 1 1 - 1 9ぺプチドで刺激を受けるとさ らに増加した。
(表 1 )
o
IFN-v-oroducing SFC/105 PBMC
Stimulator Pre-HSCT#37 Donor #36
ILT-#37 58±10 17±2 16±1
Tax11-19(LLFGYPVYV) 42±18 18±2 7+3
Tax307-315(LLFEEYTNI) 18+2 2+1 1±0.6
Medium 29±12 2±1 1±1 次に、 I L— 2の存在下で I LT一 # 3 7細胞により定期的に刺激を 与え、 H S C T前の患者 # 3 7の P BMCを培養した。 H S CT後の患 者 # 3 7の P BMCと異なり、 H S C T前の P B M Cは増殖せず、 7週 間以上維持することができなかつた。 この細胞株の培養開始 40日後の 細胞傷害能力を示す（図 4 a)。 同じように培養した培養 46日後の H S CT後の # 3 7及びドナー # 3 6の P B M Cと対照的に、 H S C T前の 患者 # 3 7の培養液は HT L V - I特異的細胞傷害性の有意なレベルを 示さなかった。 また、 本発明者らはこれらの培養した P BMCを HLA -A*0 2 0 1 /T a x l l - 1 9の 4量体で染色した。 CD 8+細胞中 の HLA— A*0 2 0 1 /T a x l 1— 1 9 +細胞の割合はドナー # 3 6 よりも H S C T後の患者 # 3 7において著しく高かった （図 4 b) 。 H S CT前の患者 # 3 7の培養液は主に CD 8陰性細胞で構成されていた, 以上の観察から、 HS CT後の # 3 7及びドナー # 3 6の HTL V— I 特異的 C T Lはインビポで I L T_ # 3 7の刺激に応答して増殖するこ とができるが、 HS CT前の # 3 7の HTLV— I特異的 CTLは増殖 できないこと、 及び T a X 1 1— 1 9特異的 CTLは H S CT後の患者 # 3 7において選択的に活性化されることが明らかとなった。
B - 4 (HT L V - I陰性ドナ一からの H S CT後の HTLV— I特異 的 CTLの誘導）
HS CTの 2番目のケースでは、 H S CT前の患者 R 0 7から由来す る I L T _ R 0 7に対して、 H S C T後の患者 R 0 7 (HS C T 2 5 5 日後） の細胞性免疫応答を同様に調査した。 インビトロでの培養 3週間 後に、 ホルムアルデヒド処理した I L T— R 0 7で剌激を受けた H S C T後の患者 R 0 7の CD 8+細胞を豊富に含む P BMCは、 HLA— A 2 4を共有する I LT一 R 0 7及び同種 HTLV— I感染細胞に対する顕 著なレベルの細胞傷害性及び I FN— r産生を示した。 このように、 H S C T後の患者 R 0 7の P BMC培養液中に、 HL A- A 24拘束性 H TL V- I特異的 CTLが存在することが強く示唆された。 続いてこれ らの CTLのェピトープのマッピングを行った。 HL A- A 24拘束性 ェピト一プである可能性が最も高いとコンピュータプログラムが予測し た T a xの 1 5から 24塩基長のオリゴぺプチドのパネル及び 5種の 9 塩基長のオリゴぺプチドのうち、 T a x 3 0 1 - 3 1 5 (S FHS LHL L F E EYTN I ;配列番号 3 )及び T a x 3 0 1 - 3 0 9 (S FHS L HL L F ； 配列番号 4)が応答細胞と選択的に反応した （図 5 ) 。 また、 本発明者らはこれらの培養 P BMCを HLA— A*240 2 /T a x 3
0 1 - 3 0 9の 4量体で染色した。 CD 8 +細胞中の H LA— A* 2 4 0 2/T a x 3 0 1 - 3 0 9 +細胞の割合は 3割を超えていた （図 6 ) 。 以上の観察から、 選択的な T a Xェピトープに対する HTL V— I特異 的 CTL応答が、 H S C T後の患者 # 3 7においてもみられたように、 H S C T後の患者 R 0 7においても誘導されることが明らかにされた。 C [考察]
2名の AT L患者において、 H L Aがー致する同胞からの骨髄非破壊 性 H S CT後に、 限られた数のェピト一プに対する HTLV— I の T a X特異的 C T L応答が見い出された。 H S C T後の患者 # 3 7の培養 P BMCは、 H T L V - Iキヤリアであるドナ一 # 3 6の CTL株よりも はるかに大量の HLA— A*0 2 0 1 /T a x l 1— 1 9の 4量体で染 色される C T Lを含有していた (図 4 b ) 。 これは、 H S C T後の患者 の HTL V— I特異的 C TL応答とドナーにおける C T L応答とが C T Lの量だけではなく質的にも異なることを意味している。 ドナ一におい ては、 HTL V— I特異的 T細胞免疫応答は一次的な HTL V— I感染 に対して取得した宿主防御応答として誘引されなければならなかった。 それに対して、 H S C T後のレシピエントにおいては、 T細胞免疫は H TL V- Iが持続的に感染している状態において導入された。 移植後レ シピエン卜に観察されたと同様の HTL V— I特異的 CTLのオリゴク ローナル（oligoclonal)増殖が、ウィルス量が通常高い H AMZT S P患 者にも観察されることは興味深いことであり（Virology 217, 139-146,
1996; J. Clin. Invest. 94, 1830-1839, 1994)、 HS CT後の ATL患 者に観察される HTL V— I特異的応答の特定のパターンは、 インビポ での豊富な抗原提示が原因でありうることが示唆された。 非感染ドナー からの HS C Tであった 2番目のケースでは、 HS CT後の患者 R 0 7 から誘導された C T Lもまた限られたェピト一プ、 つまり HLA— A 2 4拘束性 T a x 3 0 1— 3 0 9ェピトープを特異的に認識し、 選択的 C T L応答の原因がドナー側ではなくレシピエント側にあることを明示し ている。
HS CT後の患者 # 3 7及びドナ一 # 3 6の非培養 P BMCを HTL V— I抗原で一晚剌激後、 E L I S P OT分析を行い、 ほぼ同量の含有 I FN—ァ産生細胞数を検出した （表 1) 。 特に、 H S CT前の患者 # 3 7の P BMCは刺激を受けなくても自発的に I F N—ァを産生する、 かなりの数の細胞を含んでいた。 しかしながら、 1 丁ー# 3 7細胞に よる刺激を受けたインビトロ培養後には、 HTL V— I特異的 CTLは HS CT後の患者 # 3 7及びドナー # 3 6からは誘導されたものの、 H S C T前の患者 # 3 7からは誘導され得なかった （図 4 a、 b) 。 この 結果は HTL V— I特異的 C T Lの増殖は AT L患者においては稀であ るという従前の観察と一致するものである (Leukemia 8 Suppl 1， S54-59, 1994; J. Immunol. 133, 1037-1041, 1984; J. Exp. Med. 177, 1567-1573, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7568-7573, 1998; J. Immunol. 162, 1765-1771 , 1999)。 A T L患者において H T L V— I特異的 C TL が増殖できない理由は未だ不明であるが、 本発明者らが得た結果によつ て、 HS CT後の免疫再構築は抗原刺激により、 記憶状態にある HTL V - I特異的 C T Lを増殖可能にならしめることが明示された。
G VHDに関与することが示唆されてきたいくつかの mH A (N. Engl, J. Med. 334, 281-285, 1996; Science 279, 1054-1057, 1998; Br. J. Haematol 106, 723-729, 1999; Blood 92, 2169-2176, 1998)は GVL標 的の候補である。 H S C T前の AT L患者に由来する I LT— # 3 7及 び I L T— R 0 7細胞株は、 HT L V— I抗原と共にレシピエント由来 の抗原も所有していた。 I L T一 # 3 7に対する H S C T後の患者 # 3 7から樹立した C TL株の細胞傷害性は、 非標識の T a X発現細胞を用 いても完全には競合されなかったので （図 2 b) 、 T a x特異的抗原以 外の他の抗原を認識する C T Lも同時に存在すると思われる。 G VL効 果の正確な標的抗原及び GVL効果に対する HTL V— Iの T a x特異 的 C T Lの貢献度は充分には解明されていない。 しかし、 HAM/T S P患者において同様に観察されたように、 強力で選択的な HT L V— I 特異的 C TL応答が、 HL A—致の同胞からの同種 H S C T後に ATL 患者に樹立されたことは、 患者体内で C TLェピトープが強く発現され ていたことを意味し、 本発明の CTLェピトープがワクチン抗原として 有用であることを示す。 このワクチン抗原を用いると、 HTL V- I感 染細胞の増殖をィンビポで抑制する C T Lを誘導することが可能となる 産業上の利用可能性
( 1 ) 本発明により、 日本人の 6 0 %以上が有する HL A— A 2 4に拘 束される C T Lの主要ェピトープを見い出された。 H T L V - I に対す る免疫応答の検査に本ェピトープ部位のぺプチドを使用することによつ て、 日本人集団のかなりの部分をカバ一できることになる。
( 2 ) 現在では、 それぞれの H L Aについて親和性のあるアミノ酸アン 力—モチーフからェピ卜一プの予測が可能である。 しかしながら、 生体 内の病原体に対する宿主の免疫反応は必ずしもこの予測と一致しない。 本発明により同定されたェピト一プは感染個体から得られたものであり しかも他のェピトープょりも非常に強い選択性を持って認識されている
( 3 ) ATL患者から HTL V— I特異的 C T Lが誘導されることは稀 だが、 幹細胞移植後に完全寛解に入った ATL症例から、 本発明により 同定されたェピトープに対する C TLが選択的に誘導された。 これは、 患者体内でこのェピトープが強く発現されていたことを意味し、 本ェピ トープがワクチン抗原として有用であることを示している。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列からなる HTL V— I特 異的 C T L誘導活性べプチド。
2. 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数 個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる H TL V- I特異的 C T L誘導活性ペプチド。
3. 請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチド と、 マーカータンパク質及び Z又はべプチドタグとを結合させた融合べ プチド。
4. HLA— A 2 4と請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 CTL 誘導活性ペプチドとが結合したタンパクーペプチド結合体。
5. HL A- A 2 4と請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 CTL 誘導活性べプチドとが結合したタンパクーペプチド結合体の 4量体。
6. 請求項 4記載のタンパク—ペプチド結合体又は請求項 5記載のタン パクーペプチド結合体の 4量体と、 マーカータンパク質及び/又はぺプ チド夕グとを結合させた融合夕ンパク質。
7. 以下の ( a) 又は （b) のペプチドをコードする DNA。
( a) 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列からなる HT L V— I 特異的 C T L誘導活性べプチド
(b) 配列番号 3又は 4のいずれかに示されるアミノ酸配列において、
1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなる HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチド。
8. 配列番号 7又は 8に示される塩基配列若しくはその相補的配列から なる DNA。
9. 請求項 8記載の D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイ ズし、 かつ HT L V - I特異的 C T L誘導活性べプチドをコ一ドする D N A。
1 0. 配列番号 4に示されるアミノ酸配列を有する HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチドからなる H L A _ A 24拘束性 T a Xェピト一 プ。
1 1. 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列からなる HT L V— I 特異的 C T L誘導活性べプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導 用ワクチン。
1 2. 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる
HTL V— I特異的 CTL誘導活性ペプチドを有効成分として含有する 免疫応答誘導用ワクチン。
1 3. 請求項 7〜 9のいずれか記載の DN Aを発現させることができる ベクターを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン。
1 4. さらに、 HTL V— I特異的 CTL誘導活性を増強するアジュバ ントが含まれている、 請求項 8〜 1 0のいずれか記載の免疫応答誘導用 ワクチン。
1 5. 請求項 1 1〜 1 4のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチンを有 効成分として含有する医薬組成物。
1 6. 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列からなる HT L V— I 特異的 CTL誘導活性べプチドを有効成分として含有する免疫機能検査 診断薬。
1 7. 配列番号 3又は 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる HTL V- I特異的 C T L誘導活性べプチドを有効成分として含有する 免疫機能検査診断薬。
1 8. 請求項 7〜 9のいずれか記載の D N Aを発現させることができる ベクターを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
1 9. HL A- A 24と請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチドとが結合したタンパクーペプチド結合体を有効成分 として含有する免疫機能検査診断薬。
2 0. HL A- A 24と請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチドとが結合したタンパクーペプチド結合体の 4量体を 有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
2 1. 請求項 7〜 9のいずれか記載の DN Aを有効成分として含有する HTL V- I腫瘍の診断薬。
2 2. 請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 C T L誘導活性べプチ ドに特異的に結合する抗体。
2 3. 抗体がモノクローナル抗体である請求項 2 2記載の抗体。
24. 請求項 2 2又は 2 3記載の HTL V— I特異的 CTL誘導活性べ プチドに特異的に結合する抗体を有効成分として含有する HT L V- I 腫瘍の診断薬。
2 5. 請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチ ドを発現することができる発現ベクター。
2 6. 請求項 1又は 2記載の HTL V— I特異的 C T L誘導活性べプチ ドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
2 7. HL A- A 24と請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチドとの結合体を発現することができる発現ベクター。
2 8. HL A- A 24と請求項 1又は 2記載の HT L V— I特異的 C T L誘導活性べプチドとの結合体を発現することができる発現系を含んで なる宿主細胞。
2 9. H S ( 丁前の八丁し患者に由来する！！丁 ー I感染 T細胞を用 いて、 同種の HLAタイプのドナ一由来の HS C T後の同じ患者の P B MCを刺激することを特徴とする HTL V— I認識 CTLの誘導方法。
3 0. 請求項 1又は 2記載の HTLV— I特異的 CTL誘導活性べプチ ドを用いて、 HLA— A 24陽性の ATL患者の P BMCを刺激するこ とを特徴とする HTLV— I認識 CTLの誘導方法。
3 1. 請求項 7〜 9のいずれか記載の DN Aを発現させることができる ベクタ一を用いて、 HLA— A 24陽性の A T L患者の P B M Cを剌激 することを特徴とする HTLV— I認識 C TLの誘導方法。
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