JPWO2006035681A1

JPWO2006035681A1 - ＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘ抗腫瘍エピトープ

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Publication number: JPWO2006035681A1
Application number: JP2006537705A
Authority: JP
Inventors: 奈々江原嶋; 真理神奈木; 隆二田野崎
Original assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2004-09-27
Filing date: 2005-09-22
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2025-09-22
Also published as: JP5176099B2; WO2006035681A1

Abstract

成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する細胞傷害活性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、これらを利用した免疫応答誘導用ワクチンや免疫機能検査診断薬等を提供するものである。ＨＬＡが一致する同胞ドナーからの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後に完全寛解を得たＡＴＬ患者の細胞性免疫応答を調査したところ、ＡＴＬ患者のＨＳＣＴ後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の培養液において、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが、ＨＳＣＴ前にインビトロで構築した自己ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に応答して活発に増殖したＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘ８８-９６ならびにＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘ２７２-２８０エピトープに選択的に誘導された。これは、患者体内でこのエピトープが強く発現されていたことを意味し、本エピトープがワクチン抗原として有用であることを示している。

Description

本発明は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する細胞傷害活性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、該ペプチドをコードするＤＮＡや、これらを利用した免疫応答誘導用ワクチン並びに免疫機能検査診断薬等に関する。

成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）はヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）感染者の約５％が発症するＴ細胞悪性腫瘍であり、主にＣＤ４^＋及びＣＤ２５^＋成熟Ｔリンパ球表現型をもつこと、中年又はそれ以降の発症、免疫抑制、及び予後が悪いことを特徴としている（例えば、非特許文献１、２参照。）。ＡＴＬに対して化学療法を併用した臨床使用により４年生存率は８〜１２％に高まったものの、白血病の他のタイプと比べると依然として低率である（例えば、非特許文献３、４参照。）。最近になって、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が一部のＡＴＬ患者に適用されるようになってきた。自己ＨＳＣＴの初期の研究はＡＴＬ再発が頻繁に起きることを明らかにした（例えば、非特許文献５参照。）。しかしながら、より最近の報告によると、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の危険性は同様にあるものの、同種ＨＳＣＴの方がより良い結果を生じうることが明らかになった（例えば、非特許文献６参照。）。以上の報告は、他のタイプの白血病で観察されたように、レシピエントに対するドナーの細胞性免疫応答、つまり移植片対白血病（ＧＶＬ）効果がＡＴＬ細胞根絶に貢献することを強く示唆している。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致する同胞から受けた同種ＨＳＣＴはある程度のＧＶＨＤを起こすことが示され、レシピエントのマイナー組織適合抗原（ｍＨＡ）がＧＶＨＤの標的抗原と考えられてきた（例えば、非特許文献７参照。）。男性特異的Ｈ−Ｙ移植抗原（例えば、非特許文献８参照。）、ＨＡ−１抗原（例えば、非特許文献９参照。）、ＣＤ３１分子（例えば、非特許文献１０、１１参照。）、及びヒト血小板抗原（ＨＰＡ）（例えば、非特許文献１１、１２参照。）を含むいくつかのｍＨＡがＧＶＨＤに関与すると示唆されてきた。同種ＨＳＣＴ後の白血病再発の可能性は、移植片からＴ細胞を除去した場合又はドナーが遺伝学的に一卵性双生児の場合に増加することが知られており、ＧＶＬ効果が白血病再発を防ぐ為に重要であることを示している（例えば、非特許文献１３参照。）。従って、レシピエントの非造血細胞にではなく造血細胞において発現するｍＨＡ特異的なドナーＴ細胞応答を増加することが、ＧＶＨＤを引き起こさずにＧＶＬ効果を誘導できる戦略の一つとして提案されてきた（例えば、非特許文献１４参照。）。腫瘍細胞特異的又は腫瘍細胞において過剰発現するｂｃｒ／ａｂｌ融合タンパク質及びＷＴ−１等の腫瘍抗原もまた、ＧＶＬ効果の標的抗原の候補である（例えば、非特許文献１５、１６参照。）。

ＨＴＬＶ−Ｉに対する宿主細胞性免疫応答、特に細胞傷害性Ｔ細胞の増殖は、無症候性ＨＬＴＶ−１キャリア及びＨＴＬＶ−Ｉ随伴脊髄症／熱帯性痙性対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ）患者のＰＢＭＣ培養液からは頻繁に見い出されるが、ＡＴＬ患者から見い出されることは稀である（例えば、非特許文献１７、１８参照。）。ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｐＸ遺伝子産物等のＨＴＬＶ−Ｉ抗原のうち、ｐＸ遺伝子産物であるＴａｘがＨＴＬＶ−Ｉ特異的な細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の優位な標的抗原であることが知られている（例えば、非特許文献１９、２０参照。）。Ｔａｘはまた、細胞成長を促進しアポトーシスを抑制することによってＨＴＬＶ−Ｉの白血病化における重要な役割を果たしていることも知られている（例えば、非特許文献２１、２２参照。）。以上の発見からＴａｘ特異的ＣＴＬがＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の白血病化の免疫的監視の役割を果たしうることが示唆されている。

本発明者らは以前にヒトＨＬＡ−Ａ２に拘束されるＣＴＬの主要エピトープを既に見い出している（例えば、非特許文献２３参照。）が、ＨＬＡ−Ａ２は日本人の３０〜４０％のみに陽性である。また、最近樹立したＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞リンパ腫瘍のモデル動物において、本発明者らはインビボでのＴａｘ特異的ＣＴＬの抗腫瘍効果を明らかにした（例えば、特許文献１、非特許文献２４、２５参照。）。このモデルにおいては、ＴａｘをコードするＤＮＡ又はＣＴＬエピトープに対応するペプチドのいずれかを用いたワクチン接種を受けた同系免疫担当ラットから新鮮なＴ細胞を移植することにより、同系ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を接種したヌードラットにおける無処置では致命的となるＴ細胞リンパ腫が根治し得た（例えば、非特許文献２６、２７参照。）。しかしながら、末梢血でのヒトＡＴＬ細胞におけるＨＴＬＶ−Ｉ発現は非常に低いので、実験動物における上記の観察がヒトに適用できるかどうかは不明である（例えば、非特許文献２８〜３０参照。）。

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ＡＴＬは、日本に多くの保有率を持つＨＴＬＶ−Ｉの感染によって引き起こされる腫瘍性疾患であるが、化学療法剤に抵抗性であるため、極めて予後の悪い悪性腫瘍とされてきた。種々の臨床的観察や動物実験結果から、宿主細胞性免疫、特にＣＴＬの抗腫瘍効果が示唆されているが、ＣＴＬの主要な標的抗原であるＨＴＬＶ−ＩＴａｘには腫瘍化促進機能があることが分かっている。従って、より特異的で安全性の高いワクチン開発のためには、ＣＴＬ認識エピトープを特定する必要がある。しかし、ヒトＡＴＬ患者において抗腫瘍効果を持つＣＴＬエピトープは特定されていなかった。本発明の課題は、ＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍に対して抗腫瘍効果を有するＣＴＬを誘導することができるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、該ペプチドをコードするＤＮＡや、これらを利用した免疫応答誘導用ワクチン並びに抗腫瘍免疫能検査診断薬等を提供することにある。

本発明者らは、ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に対する、ＨＳＣＴ後の同じ患者の細胞性免疫応答を調査した。これらのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞はＧＶＬ効果の標的を含む、レシピエント由来の抗原を所有すると考えられていた。本発明者らはＨＳＣＴ後のＰＢＭＣが実際にレシピエント由来細胞に応答することを見い出した。しかしながら、応答細胞の大部分はＨＴＬＶ−Ｉ抗原、特に限られた数のＴａｘエピトープに強く反応した。以上の観察から移植片対ＨＴＬＶ−Ｉ応答がＨＳＣＴ後のＡＴＬ患者に生じたことが明らかとなった。かかる研究の過程で、ＨＬＡ−Ａ１１に拘束される２つのＣＴＬの主要エピトープを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、（２）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、（３）上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチドや、（４）ＨＬＡ−Ａ１１と上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体や、（５）ＨＬＡ−Ａ１１と上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体や、（６）上記（４）記載のタンパク−ペプチド結合体又は請求項５記載のタンパク−ペプチド結合体の４量体と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質や、（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド
（ｂ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、（８）配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、（９）上記８記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードするＤＮＡに関する。

また本発明は、（１０）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドからなるＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘエピトープや、（１１）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチンや、（１２）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチンや、（１３）上記（７）〜（９）のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチンや、（１４）さらに、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性を増強するアジュバントが含まれている、上記（８）〜（１０）のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチンや、（１５）上記（１１）〜（１４）のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有する医薬組成物や、（１６）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬や、（１７）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬に関する。

さらに本発明は、（１８）上記（７）〜（９）のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬や、（１９）ＨＬＡ−Ａ１１と上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬や、（２０）ＨＬＡ−Ａ１１と上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬や、（２１）上記（７）〜（９）のいずれか記載のＤＮＡを有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬や、（２２）上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体や、（２３）抗体がモノクローナル抗体である上記（２２）記載の抗体や、（２４）上記（２２）又は（２３）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬や、（２５）上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現ベクターや、（２６）上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、（２７）ＨＬＡ−Ａ１１と上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現ベクターや、（２８）ＨＬＡ−Ａ１１と上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞や、（２９）ＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法や、（３０）上記（１）又は（２）記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを用いて、ＨＬＡ−Ａ１１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法や、（３１）上記（７）〜（９）のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを用いて、ＨＬＡ−Ａ１１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法に関する。

ＨＳＣＴ後の患者＃１５６（図１）のＰＢＭＣ中のＩＬＴ−＃１５６細胞に対するＣＴＬ誘導を示す図である。ＩＬ-２存在下でＩＬＴ−＃１５６細胞で２回刺激を加え１７日間培養したＨＳＣＴ後の患者＃１５６のＰＢＭＣを、ＩＬＴ−＃１５６（●）、ＬＣＬ-＃１５６（○）、ＨＬＡ-Ａ１１を共有するＴＣＬ-Ｋａｎ（▲）、ＬＣＬ-Ｋａｎ（△）、ＨＬＡ-Ａ２６を共有するＩＬＴ−Ｎｋｚ-２（■）、ＬＣＬ-Ｎｋｚ（□）、あるいは無刺激（×）で１８時間インキュベーションした後、上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ分析により測定した。値は２個のサンプルの検定結果の平均値である。ＨＳＣＴ後の患者＃１５６から誘導されたＣＴＬのＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的細胞傷害活性を示す図である。ＨＳＣＴ後の患者＃１５６のＰＢＭＣ培養液をホルマリンで固定化したＩＬＴ−＃１５６で３回刺激し、その細胞傷害性を⁵¹Ｃｒ放出分析を６時間行い調査した。使用した標的細胞はＨＬＡが一致するＩＬＴ−＃１５６（●）、ＬＣＬ−＃１５６（○）、ＨＬＡ−Ａ１１が一致するＴＣＬ−Ｋａｎ（▲）及びＬＣＬ−Ｋａｎ（△）、及びＨＬＡ−Ａ２６が一致するＩＬＴ−Ｎｋｚ-２（■）及びＬＣＬ−Ｎｋｚ（□）であった。黒色の記号はＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を表し、白色の記号はＥＢＶ感染細胞を表す。値は３個のサンプルで検定された細胞傷害性（％ Lysis）の平均を表す。ＨＳＣＴ後の患者＃１５６から誘導されたＣＴＬが認識するＨＴＬＶ−ＩのＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘエピトープのマッピングの結果を示す図である。ＬＣＬ−＃１５６細胞を１０ｍＭのＴａｘ蛋白全域にわたるアミノ酸配列に対応する１５〜２４塩基長の合成オリゴペプチド３６種類でパルスし、エフェクターであるＨＳＣＴ後の患者＃１５６ＣＴＬ（培養３１日）と標的細胞の割合を１０：１として混合し、１８時間インキュベーションした後、上清液中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ分析により測定した。値は２個のサンプルの検定結果の平均値である。ＨＳＣＴ後の患者＃１５６から誘導されたＣＴＬが認識するＨＴＬＶ−ＩのＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘエピトープのより詳細なマッピングの結果を示す図である。図３に示された実験の結果陽性と判明した１５〜２４塩基長のペプチドに加え、BIMASでの検索によってＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘエピトープである可能性が高いと予測された６種の９塩基長の合成オリゴペプチド１０mＭでＬＣＬ−＃１５６細胞をパルスし、エフェクターであるＨＳＣＴ後の患者＃１５６ＣＴＬ（培養４１日）と標的細胞の割合を１０：１として混合し、１８時間インキュベーションした後、上清液中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ分析により測定した。ＴＣＬ−Ｋａｎ及びＬＣＬ−Ｋａｎは患者＃１５６とＨＬＡ−Ａ１１が、ＩＬＴ−Ｎｋｚ-２及びＬＣＬ−Ｎｋｚは患者＃１５６とＨＬＡ−Ａ２６が一致する細胞株である。値は２個のサンプルの検定結果の平均値である。ＩＬＴ−＃１５６で刺激されたＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ*１１０１／Ｔａｘ８８-９６あるいはＨＬＡ−Ａ*１１０１／Ｔａｘ２７２-２８０の４量体（フィコエリスリン標識、縦軸）とＣＤ８（ＰＥ-Ｃｙ５標識、横軸）で二重染色しフローサイトメトリー分析を行った結果を示す。ＨＳＣＴ後の患者＃１５６のＰＢＭＣ培養液は４１日間培養したものを使用した。右上の数字は４量体に結合し且つＣＤ８陽性であるＰＢＭＣの割合を示す。各ケースとも全部で１００，０００の現象を示している。

本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド、すなわち、ＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍に対して特異的に抗腫瘍効果を有するＣＴＬを誘導することができるペプチドとしては、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的にＣＴＬ誘導活性を有するペプチドであれば特に制限されるものではなく（以下、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド及びこれらアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変され、かつＨＴＬＶ−Ｉ特異的にＣＴＬ誘導活性を有するペプチドをあわせて「本件ペプチド類」ということがある）、ここで、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチドが、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと同様にＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性を有する同効物であれば特に制限されず、アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明においては、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ペプチドを包含する。例えば、複数個のアミノ酸が付加された本件ペプチド類として、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列を含む、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。

本発明の本件ペプチド類は、化学的又は遺伝子工学的手法により製造することができる。化学的方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明の配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド類の合成は、そのいずれによることもできる。

上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。

なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明の本件ペプチド類におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。

本発明の本件ペプチド類は、上記のように化学合成により得られる他、遺伝子工学的手法を用いて常法により製造することもできる。このようにして得られた本発明の本件ペプチド類は、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。

本発明の融合ペプチドとしては、本件ペプチド類とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチド類は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本件ペプチド類の精製や、本件ペプチド類の検出や、本件ペプチド類に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。

本発明のタンパク−ペプチド結合体としては、ＨＬＡ−Ａ１１と本件ペプチド類との結合体であれば特に制限されるものではなく、例えばＨＬＡ−Ａ１１分子と配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとの結合体など、かかる結合体を認識するＣＴＬに結合できる形態のものが好ましい。また、本発明のタンパク−ペプチド結合体の４量体としては、ＨＬＡ−Ａ１１と本件ペプチド類とが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体であれば特に制限されるものではなく、上記タンパク−ペプチド結合体を、ストレプトアビジンを核として４量体（テトラマー）としたものを例示することができ、例えばＨＬＡ−Ａ１１のＣ末端に酵素Bir-Aの基質を発現させておき、Bir-A-dependent biotinilation法でビオチン化したＨＬＡ−Ａ１１と、フィコエリトリン（ＰＥ）標識脱グリコシル化アビジンを４：１で混合することにより得ることができる（Altman, J.D., et al.: Science 274, 94-96, 1996）。これらタンパク−ペプチド結合体及びその４量体は、化学合成された本件ペプチド類と、ＨＬＡ−Ａ１１遺伝子（アクセッションナンバーＰ１３７４６）やβ−２ミクログロブリン遺伝子（アクセッションナンバーＮＭ＿００４０４８）を利用した遺伝子工学的手法を用いて常法により作製したＨＬＡ−Ａ１１のαドメイン及びβ−２ミクログロブリンとをリフォールディングバッファー中でインビトロで結合させる（Garboczi et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89: 3429-3433, 1992）ことにより、あるいは本件ペプチド類をコードするＤＮＡとＨＬＡ−Ａ１１遺伝子やβ−２ミクログロブリン遺伝子とをそれぞれ利用した遺伝子工学的手法を用いて常法により本件ペプチド類とＨＬＡ−Ａ１１のαドメインやβ−２ミクログロブリンとを同一宿主細胞内で共発現させ、精製後にこれらを結合させることにより作製することができる。

本発明の融合タンパク質としては、上記タンパク−ペプチド結合体又はタンパク−ペプチド結合体の４量体とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、蛍光色素、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質類は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したタンパク−ペプチド結合体の精製や、ＣＴＬの検出や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。

本発明の本件ペプチド類に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本件ペプチド類を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本件ペプチド類に特異的に結合する抗体は、例えば、ＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断に有用であるばかりでなく、本件ペプチド類のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上で有用である。

本件ペプチド類に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、該本件ペプチド類、該本件ペプチド類と免疫原性を有するタンパク質との複合体、該本件ペプチド類を膜表面に提示した細胞等を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。

また、本発明のＤＮＡとしては、上記本件ペプチド類をコードするＤＮＡや、（配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードする）配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、かかる配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限されるものではない（以下、上記の本発明のＤＮＡを総称して「本件ＤＮＡ群」ということがある。）。上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。これら本発明のＤＮＡ群には、例えば、（配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードする）配列番号５又は６に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ等も含まれる。また、本発明のＤＮＡ群は、本件ペプチド類を遺伝子工学的手法を用いて常法により作製するときに有利に用いることができる他、特に本発明のＤＮＡ群のアンチセンス鎖は、ＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断用プローブとして有用である。

本発明のＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘエピトープとしては、インビボやインビトロにおいてＣＴＬを誘導することができる、上記配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドからなるエピトープであれば特に制限されるものではない。かかるＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘエピトープを含めた本件ペプチド類や、本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクターは、細胞性免疫や体液性免疫等の本発明の免疫応答誘導用ワクチンにおける有効成分として用いることができる。本発明の免疫応答誘導用ワクチンはＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の治療に用いることができる。

また、本発明の免疫応答誘導用ワクチンとしては、さらに細胞性の又は局所的な免疫を増強する種々のアジュバントを含むものがより好ましく、かかるアジュバントとしては、例えば、効率よくペプチド特異的なＣＴＬを誘導することができる樹状細胞、ＣｐＧモチーフを含むＩＳＳ−ＯＤＮ（Immunostimulatory DNAsequences-oligodeoxynucleotide；Nat. Med. 3, 849-854, 1997）、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するＱＳ２１（Quil1aia saponaria、Cambridge Biotech，Worcester，MAより商業的に入手可能）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油性エマルジョン、サポニン、ビタミンＥ溶解物等を具体的に挙げることができる。アジュバントを用いる場合、アジュバントとなる種々の菌体成分や毒素等と、前記本発明の本件ペプチド類とを連続してコードするＤＮＡから作製した組換え融合タンパクあるいは組換え融合ペプチドとして用いることもできる。

また、上記本発明の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、医薬的に容認可能な担体又は希釈剤、免疫賦活剤、添加剤等を含んでいてもよく、かかる担体又は希釈剤としては、例えば、ＳＰＧＡなどの安定化剤や、ソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン等の炭水化物や、アルブミン、カゼイン等のタンパク質や、ウシ血清、スキムミルク等のタンパク質含有物質や、リン酸緩衝液、生理食塩水、水等の緩衝液などを具体的に挙げることができる。免疫賦活剤としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＨＦ−α）等のサイトカインを具体的に例示することができ、添加剤としては、低分子量のポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質、アミノ酸、グルコース又はデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、蛋白質安定化剤、微生物増殖阻止若しくは抑制剤等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。

また、本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内等により投与することができる形態のものが好ましい。投与すべき有効量は、医薬品や医薬組成物の種類・組成、投与方法、患者の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、これらを１日あたり１〜数回投与することが好ましい。また、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。この際、製剤に用いることができる担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。またこれらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。

さらに、本発明の本件ペプチド類は、ＨＴＬＶ−Ｉの感染予防及び／又はＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の症状改善用食品素材として、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合し、機能性食品として摂取することもできる。

本発明の免疫機能検査診断薬としては、本件ペプチド類、本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクター、ＨＬＡ−Ａ１１と本件ペプチド類とが結合したタンパク−ペプチド結合体、又は該タンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分とし、免疫機能、特にＨＴＬＶ−Ｉに対する免疫機能を検査・診断しうるものであれば特に制限されるものではないが、通常は、本件ペプチド類の標識体、発現産物が標識体となる本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクター、ＨＬＡ−Ａ１１と本件ペプチド類とが結合したタンパク−ペプチド結合体の標識体、又は該タンパク−ペプチド結合体の４量体の標識体を用いることが好ましい。標識体とするために用いられる標識化物質しては、上記のマーカータンパク質やペプチドタグの他、放射性同位元素を用いることができる。本発明の免疫機能検査診断薬を用いた免疫機能検査診断は、対象被験者の末梢血白血球（リンパ球）に本発明の免疫機能検査診断薬を接触させ、本件ペプチド類等におけるエピトープを認識するＴ細胞と結合させることによりＨＴＬＶ−ＩＴａｘ特異的Ｔ細胞を識別することができる。免疫機能検査診断薬の中でも、上記タンパク−ペプチド結合体の４量体のＰＥ等の蛍光標識体はフローサトメトリーによるＣＴＬの検出・定量を可能にするため、免疫機能検査診断薬の他、ワクチン効果判定に特に有用である。例えば、ヘパリン末梢血検体から単核球分画を分離し、ＰＥ標識テトラマー（タンパク−ペプチド結合体の４量体）と、ＦＩＴＣやＰＥ-Ｃｙ５で標識したＣＤ８抗体等の活性化マーカー抗体とで２重染色し、フローサイトメーターでＣＤ８陽性テトラマー陽性の細胞数を計算することにより、対象被験者の免疫機能の検査・診断を行うことができる。また、新鮮血液検体ではテトラマー陽性細胞数が非常に少ないことがよくあることから、新鮮血液検体だけでなく、本件ペプチド類やその発現細胞などで一回刺激をした後、数日〜１週間培養後に同様の染色解析をすることもできる。

本発明の発現ベクターとしては、本件ペプチド類や、ＨＬＡ−Ａ１１（αドメイン及び／又はβ−２ミクログロブリン）と本件ペプチド類との結合体を発現することができるものであればどのようなものでもよく、使用される発現系としては、上記本件ペプチド類を細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができるが、中でもウイルス系ベクターが好ましい。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、読み枠を変えて翻訳することができる発現ベクターシリーズも有利に用いることができる。本発明の発現ベクターは、本発明の免疫応答誘導用ワクチンにおける有効成分として有用である。

本発明の宿主細胞としては、本件ペプチド類や、ＨＬＡ−Ａ１１（αドメイン及び／又はβ−２ミクログロブリン）と本件ペプチド類との結合体を発現することができる発現系を含む細胞であればどのようなものでもよく、使用される宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。また、本件ペプチド類を発現することができる発現系の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。これら本発明の宿主細胞は、本件ペプチド類のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上で有用である。

本発明のＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法としては、ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプ、すなわちＨＬＡ−Ａ１１タイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激するＣＴＬを誘導する方法や、本件ペプチド類を用いて、ＨＬＡ−Ａ１１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激するＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法や、本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクターを用いて、例えばＰＢＭＣ中の抗原提示細胞に遺伝子工学的にペプチドを発現させるなど、ＨＬＡ−Ａ１１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激するＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法であれば特に制限されるものではなく、かかる誘導方法により得られるＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬは、養子免疫療法としてＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の治療に用いることができる他、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上で有用である。

以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
Ａ［方法と材料］
Ａ−１（レシピエント／ドナー組み合わせ及び血液サンプル）
ＨＬＡが一致する同胞ドナーからＨＳＣＴを受けた急性型ＡＴＬ患者並びにドナーから末梢血サンプルを得た。患者はＨＳＣＴ後３ヶ月で完全寛解を得て、以後それを維持している。ヘパリン処置した血液を、移植１４７日後に採取し末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール・ハイパックプラス勾配遠心法により単離し、使用するまで一部を液体窒素で保存した。

Ａ−２（細胞株）
ＨＳＣＴ前の患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株であるＩＬＴ−＃１５６を、下記の手順で樹立した。ＰＢＭＣからＣＤ８^＋細胞を除去した後に１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−Ｐで刺激し、次に１０％熱不活性ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と、３０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２又は１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で５％の二酸化炭素と共に３７℃で２ヶ月以上維持した。また、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞株であるＬＣＬ−＃１５６は、ＥＢＶを含むＢ９５−８細胞の上清を用いて感染させたドナーのＣＤ１９^＋ＰＢＭＣからインビトロで樹立した。

Ａ−３（ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬの誘導）
ＨＳＣＴ後の患者の全細胞又はＣＤ８^＋細胞を豊富に含む２６０万個のＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐで刺激し、次に１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで前処理した同数のＩＬＴ−＃１５６細胞と混合した。これらのＴ細胞を１０％ＦＣＳ及び１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を添加したＡＩＭ−Ｖ^TM培地(GIBCO-Invitrogen社製)で維持し、１４日間隔にて定期的にＩＬＴ−＃１５６細胞で刺激をあたえた。

Ａ−４（合成ペプチド）
本発明者らはＨＴＬＶ−ＩのＴａｘタンパク質の配列すべてを網羅するために１５〜２４塩基長のペプチドを用意した。これに加え、コンピュータ予測プログラムであるＢＩＭＡＳ(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbil/hla#bind/)を文献(J. Immunol. 152, 163-175, 1994; J. Immunol. 152, 3913-3924, 1994)記載の方法に従い使用し、ＨＬＡ-Ａ１１と結合する可能性のある９塩基長のＨＴＬＶ−ＩＴａｘペプチドを用意した。

Ａ−５（ＣＴＬ分析）
様々なエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ／Ｔ）割合において⁵¹Ｃｒ放出分析を６時間行い、細胞傷害活性を測定した。特異的細胞傷害性を式（［実験により得られた⁵¹Ｃｒ放出量−自発性の⁵¹Ｃｒ放出量］／［最大⁵¹Ｃｒ放出量−自発性の⁵¹Ｃｒ放出量］×１００％）により算出した。エフェクター細胞が産生するＩＦＮ−γを測定するために、様々なＥ／Ｔ割合において標的細胞と１８時間インキュベーションした後に、ＥＬＩＳＡ法（ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット, Biosource社製、 Camarillo、California）を用いて二重測定した。

Ａ−６（４量体染色）
フィコエリトリン（ＰＥ）複合型ＨＬＡ−Ａ*１１０１／Ｔａｘ８８-９６（KVLTPPITH；配列番号３）並びにＨＬＡ−Ａ*１１０１／Ｔａｘ２７２-２８０（QSSSFIFHK；配列番号４）４量体は、NIAID Tetramer Facility, Emory Univ. Vaccine Center at Yerks (Atlanta, Georgia)に合成を委託し提供を受けた。リンパ球を、ＰＥ-Ｃｙ５複合型抗ＣＤ８抗モノクロナール抗体（BD Pharmingen社製）を用いて３０分間染色した後、４量体を用いてさらに６０分間４℃で染色し、次にCellQuestソフトウェア(Beckton Dickinson社製)を用いてFACSCaliburで２色解析を行った。

Ｂ［結果］
Ｂ−１（ＨＳＣＴ前のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞と反応するＨＳＣＴ後のレシピエントからのＣＴＬ誘導）
ＨＳＣＴ前のレシピエント由来の造血細胞に対するＨＳＣＴ後のレシピエントの免疫応答を調べるために、本発明者らはＨＳＣＴ前の患者から、ＩＬ−２又はＩＬ−１５の存在下でＰＨＡの刺激を受けたＰＢＭＣを２ヶ月以上維持することにより、Ｔ細胞株であるＩＬＴ−＃１５６を樹立した。この細胞株はＣＤ４陽性で、ＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ、ｐ１９等のＨＴＬＶ−Ｉ抗原に陽性であった。

ＩＬＴ−＃１５６細胞に対するＨＳＣＴ後の患者のＰＢＭＣにおけるＴ細胞応答を、造血細胞がドナー由来の造血細胞に完全に置換されたＨＳＣＴ１４７日後に調べた。インビトロでＩＬ−２の存在下においてホルムアルデヒド処理したＩＬＴ−＃１５６で２回刺激したＨＳＣＴ後の患者のＰＢＭＣのＩＬＴ−＃１５６及びＬＣＬ−＃１５６細胞に対するインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生能力を培養１７日後に測定した。一晩インキュベーションした後、ＩＬＴ−＃１５６に対してはＩＦＮ−γが産生されたが、ＬＣＬ−＃１５６細胞に対しては産生されなかった（図１）。またＨＬＡ-Ａ１１を共有する同種ＨＴＬＶ-Ｉ感染ＴＣＬ-Kａｎ細胞に対してもＩＦＮ−γが産生されたが、ＨＬＡ-Ａ１１を共有するＬＣＬ−Kａｎ、ＨＬＡ-Ａ２６を共有するＨＴＬＶ-Ｉ感染ＩＬＴ−Ｎｋｚ-２やＬＣＬ−Ｎｋｚに対してはＩＦＮ−γは産生しなかった。

Ｂ−２（ＨＳＣＴ後の患者から誘導したＣＴＬのＨＴＬＶ−Ｉ特異性）
次に、ＨＳＣＴ後の患者ＰＢＭＣからＩＬＴ−＃１５６に対して増殖したエフェクター細胞の細胞傷害特異性を^５１Ｃｒ放出分析により調べた。このエフェクター細胞はほとんどがＣＤ８陽性であり、ＩＬＴ−＃１５６に対して顕著なレベルの細胞傷害性を示すとともに (図２)、ＨＬＡ−Ａ１１を共有する同種ＨＴＬＶ−Ｉ感染ＴＣＬ-Kａｎ細胞を効果的に死滅させたが、ＨＬＡ-Ａ１１を共有するＬＣＬ−Kａｎ、ＨＬＡ-Ａ２６を共有するＨＴＬＶ-Ｉ感染ＩＬＴ−Ｎｋｚ-２やＬＣＬ−Ｎｋｚに対しては死滅させなかった。以上の結果は、ＩＬＴ−＃１５６に応答してＨＳＣＴ後の患者ＰＢＭＣから増殖した細胞株が、ＨＬＡ-Ａ１１に拘束されるＨＴＬＶ−Ｉ抗原特異的ＣＤ８^＋細胞傷害性Tリンパ球（ＣＴＬ）を含むことを強く明示した。

本発明者らは、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬの主要認識抗原がＴａｘであることから、樹立されたＣＴＬもＴａｘを認識する可能性が最も高いと考え、Ｔａｘアミノ酸配列に対応する１５〜２４塩基長のオリゴペプチドのパネルを用いてＨＳＣＴ後の患者由来ＣＴＬ株の認識エピトープを調べた。オリゴペプチドＴａｘ８１-１０４（QRTSKTLKVLTPPITHTTPNIPPS；配列番号１）及びＴａｘ２７１-２８５（LQSSSFIFHKFQTKA；配列番号２）でパルスされたＬＣＬ−＃１５６細胞は、ＨＳＣＴ後の患者のＣＴＬ株によって選択的に死滅させられた（図３）。続いて、Ｔａｘのアミノ酸配列の中で、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性エピトープである可能性が最も高いとコンピュータプログラムが予測した５種の９塩基長のオリゴペプチドを用いたところ、Ｔａｘ８８-９６ (KVLTPPITH；配列番号３)及びＴａｘ２７２-２８０ (QSSSFIFHK；配列番号４)が応答細胞と選択的に反応した（図４）。Ｔａｘ８８-９６はＴａｘ８１-１０４に含まれ、Ｔａｘ２７２-２８０はＴａｘ２７１-２８５に含まれている。以上の結果は、ＨＳＣＴ後の患者由来ＣＴＬ株の中に、２種類のＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的ＣＴＬクローンが優位な集団を占めており、ＣＴＬクローンの一つはＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘ８８-９６エピトープを、もう一つのＣＴＬクローンはＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘ２７２-２８０エピトープを認識することを示している。

Ｃ［考察］
本発明者らは以前、ＡＴＬ患者において、ＨＬＡが一致する同胞からの骨髄非破壊性ＨＳＣＴ後に、限られた数のエピトープに対するＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的ＣＴＬ応答がおこることを見い出した（Cancer Res. 64, 391-399, 2004）。今回、新たなＨＳＣＴ後のＡＴＬ患者由来ＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ１１に拘束される２個のＴａｘエピトープに対するＣＴＬ応答を見い出した。これらのＣＴＬは、ＨＬＡ-Ａ*１１０１／Ｔａｘ８８-９６ならびにＨＬＡ-Ａ*１１０１／Ｔａｘ２７２-２８０の４量体で染色されるＣＴＬを多数含有していた（図５）。
ＧＶＬ効果の正確な標的抗原及びＧＶＬ効果に対するＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的ＣＴＬの貢献度は充分には解明されていない。しかし、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者において観察されたのと同様の、強力で選択的なＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答が、ＨＬＡ一致の同胞からの同種ＨＳＣＴ後にＡＴＬ患者に樹立されたことは、患者体内でＣＴＬエピトープが強く発現されていたことを意味し、本発明のＣＴＬエピトープがワクチン抗原として有用であることを示す。このワクチン抗原を用いると、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の増殖をインビボで抑制するＣＴＬを誘導できる可能性がある。

（１）本発明により、日本人でＨＬＡ遺伝子頻度が９.３％であるＨＬＡ−Ａ１１に拘束
されるＣＴＬの主要エピトープが見出された。ＨＴＬＶ−Ｉに対する免疫応答の検査に本エピトープ部位のペプチドを使用することによって、これまでに見出したＨＬＡ−Ａ２, ＨＬＡ−Ａ２４に拘束されるＴａｘエピトープと合わせ、日本人集団のかなりの部分をカバーできることになる。
（２）現在では、それぞれのＨＬＡについて親和性のあるアミノ酸アンカーモチーフからエピトープの予測が可能である。しかしながら、生体内の病原体に対する宿主の免疫反応は必ずしもこの予測と一致しない。本発明により同定されたエピトープは感染個体から得られたものであり、しかも他のエピトープよりも非常に強い選択性を持って認識されている。
（３）ＡＴＬ患者からＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが誘導されることは稀だが、幹細胞移植後に完全寛解に入ったＡＴＬ症例から、本発明により同定されたエピトープに対するＣＴＬが選択的に誘導された。これは、患者体内でこのエピトープが強く発現されていたことを意味し、本エピトープがワクチン抗原として有用であることを示している。

Claims

配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド。
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド。
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
ＨＬＡ−Ａ１１と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体。
ＨＬＡ−Ａ１１と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体。
請求項４記載のタンパク−ペプチド結合体又は請求項５記載のタンパク−ペプチド結合体の４量体と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド
（ｂ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド
配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
請求項８記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードするＤＮＡ。
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドからなるＨＬＡ−Ａ１１拘束性Ｔａｘエピトープ。
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン。
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン。
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン。
さらに、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性を増強するアジュバントが含まれている、請求項８〜１０のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチン。
請求項１１〜１４のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有する医薬組成物。
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
ＨＬＡ−Ａ１１と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
ＨＬＡ−Ａ１１と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬。
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体。
抗体がモノクローナル抗体である請求項２２記載の抗体。
請求項２２又は２３記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬。
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現ベクター。
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
ＨＬＡ−Ａ１１と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現ベクター。
ＨＬＡ−Ａ１１と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法。
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを用いて、ＨＬＡ−Ａ１１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法。
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを用いて、ＨＬＡ−Ａ１１陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法。