WO2004076669A2 - Cystein-substituierte fad-abhängige sulfhydryloxidasen - Google Patents

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WO2004076669A2
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Götz HOFHAUS
Thomas Lisowsky
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Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds

Definitions

  • the invention relates to recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidases in which at least one cysteine residue has been mutated in such a way that this leads to a change in the absorption maximum compared to the wild type protein, the corresponding nucleic acid molecules and a process for their preparation.
  • the invention further relates to the use of these proteins as biocatalysts for the synthesis of disulfide bridge bonds and their transfer to substrates and as regulatable indicators for redox reactions.
  • Sulfhydryl oxidases are enzymes that catalyze the introduction of disulfide bonds into protein substrates (overview in [1]; [2-3]).
  • Thio compounds (R-SH) are converted into the corresponding disulfide compounds according to the following equation:
  • FAD-dependent sulfhydryl oxidases are distinguished from other enzymes that catalyze dithiol / disulfide transfer reactions in that they can synthesize disulfide bonds de novo.
  • C cysteine
  • X any amino acid
  • the Erv / Alr sulfhydryl oxidase family which is named after Ervlp from Saccharomyces cerevisiae and its human homolog Alrp (see overview in [1]), represents a separate subgroup within the FAD-dependent sulfhydryl oxidases. These two enzymes are also the first of this group, whose DNA and protein sequences are known [5, 6]. Their activity is essential for cell survival. They play an important role in the biogenesis of mitochondria, especially with regard to an intact membrane morphology, and in the supply of cytoplasmic proteins with iron / sulfur clusters that are formed in the mitochondria (overview in [1]; [7]).
  • a second sulfhydryl oxidase has recently been found in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae, which was designated Erv2p [8, 9].
  • Another characteristic of these enzymes is their poorly conserved N-terminal domain, that of the subcellular one Localization of the proteins that are important for homodimer formation and possibly also for substrate interaction
  • Ervlp has a second CXXC motif in this region
  • European patent application EP 0 705 538 A1 discloses an enzyme composition of a sulfhydryl oxidase and a hemicellulase to improve the dough properties of bread and other baked goods.
  • US Pat. No. 5,547,690 describes a further enzyme composition, consisting of a sulfhydryl oxidase and a glucose oxidase, which improves the rheological properties, in particular the stability, of dough preparations.
  • German patent application DE 198 40 489 AI describes stable active substance preparations for food, feed or pharmaceutical applications in which the active substance (s) are surrounded by a protein layer. to The preparation of these preparations is the coat protein. cross-linked enzymatically, inter alia by the sulfhydryl oxidase-catalyzed synthesis of disulfide bridge bonds.
  • U.S. Patent 4,087,328 describes a multi-stage, conventional cleaning process for sulfhydryl oxidase from raw milk from cows. Another method for purifying sulfhydryl oxidase from the mold Aspergillus niger is in U.S. Patent 4,894,340.
  • EP 0 565 172 AI also described a recombinant process for the preparation of sulfhydryl oxidases from fila entous fungi, preferably again from ⁇ spergillus spec. , disclosed on a biotechnological scale.
  • the object of the invention is therefore to be able to control the catalytic activity of sulfhydryl oxidases.
  • This goal is achieved by providing novel sulfhydryl oxidases as molecular tools and the recombinant production of such FAD-dependent sulfhydryl oxidases in sufficiently large quantities.
  • these sulfhydryl oxidases according to the invention at least one cysteine residue of the amino acid sequence was mutated in such a way that the Absorption maximum compared to the wild type protein is changed.
  • the invention is based on the surprising discovery that the exchange of certain cysteine residues in the amino acid sequence of a sulfhydryl oxidase from Saccharomyces cerevisiae not only influenced the enzyme activity and homodimer formation, but also resulted in a color change in the protein. FAD-dependent sulfhydryl oxidases appear yellow due to the bound FAD cofactor. As a result of the exchange of a single cysteine residue, however, a color change can be observed and, among other things, obtained a black protein that was still catalytically active.
  • the coloring can be reversibly controlled by adjusting the redox potential. Since redox reactions can be followed very easily on the basis of the color change, the enzymes of the invention are ideal tools for the targeted control of redox reactions.
  • the invention includes all modified sulfhydryl oxidases in which the absorption maximum is changed compared to the wild type protein.
  • the absorption maximum denotes the wavelength ("color") of light at which a substance reduces the intensity most when illuminated. Light of other wavelengths is better transmitted. In visible light, the substance appears in the complementary color to its absorption maximum.
  • a change in the absorption maximum according to the invention includes all changes in the absorption behavior that result in a color change in the sulfhydryl oxidase protein.
  • the sulfhydryl oxidases according to the invention can be produced with the aid of recombinant DNA technology which allows complete control of the sequence and thus also the properties of a particular enzyme. Mutations can be introduced into the amino acid sequence very easily using established standard methods [20].
  • the invention includes all recombinant sulfhydryl oxidases in which one or more cysteine residues have been replaced, it being possible in principle for cysteine to be exchanged for any amino acid.
  • the cysteine residue is replaced by a serine residue. So far, however, the inventors have not yet been able to conclusively clarify whether the specific introduction of a serine residue into the amino acid sequence is directly related to the observed color changes of the mutated proteins. According to the understanding of the inventors, it should therefore be possible to also cause color changes in the mutated proteins by substituting one or more cysteine residues with other amino acids, e.g.
  • cysteine by replacing cysteine with alanine or threonine, both of which have properties similar to serine. In addition, this could also be done by introducing e.g. an arginine or a leucine residue instead of a cysteine residue.
  • cysteine residues occurring in a certain sulfhydryl oxidase can be exchanged for another amino acid.
  • one or more cysteine residues which are redox-reactive are replaced.
  • “redox-reactive” cysteine residues are understood to mean those residues that occur in the course of the catalytic Cycle through a cycle of oxidation and reduction and thereby form a disulfide bridge. Examples of redox-reactive cysteine residues are about C130 and C133 in Ervlp from Saccharomyces cerevisiae.
  • the invention also includes sulfhydryl oxidases that differ from the "wild type" sequence due to alternative splicing of a common pre-mRNA, but are still catalytically active.
  • Preferred embodiments of the invention comprise recombinant sulfhydryl oxidases from the family of the Evr / Alr sulfhydryl oxidases, Ervlp from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID No. 1) again being preferred.
  • sulfhydryl oxidases which are derived from Ervlp from Saccharomyces cerevisiae and in which at least one redox-active cysteine residue has been replaced, in particular the enzymes with a cysteine - »serine mutation at position 30 (C30S; SEQ ID No. 2) or one Cysteine - »serine mutation at position 130 (C130S; SEQ ID No. 3).
  • Another preferred embodiment of the invention comprises recombinant Ervl sulfhydryl oxidases from Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 4).
  • the recombinant sulfhydryl oxidase contains a protein or peptide affinity epitope at its N-terminus and / or C-terminus, which enables simple detection and / or purification of the protein.
  • Suitable epitopes are, for example, the myc epitope, the FLAG epitope, the Hisg epitope or the HA epitope.
  • the invention further relates to nucleic acid molecules (DNA and RNA) which comprise nucleic acid sequences which encode the sulfhydryl oxidases disclosed here.
  • the invention is not restricted to a specific nucleic acid molecule which encodes a sulfhydryl oxidase according to the invention, but includes all nucleic acid molecules which encode a functional sulfhydryl oxidase.
  • the invention further includes nucleic acid molecules which differ from the sequence recognized as a "wild type" due to alternative splicing of a common pre-RNA molecule.
  • Such splicing mechanisms include the alternative use of exons (i.e. nucleic acid sequences encoding an amino acid sequence), the alternative
  • the nucleic acid molecules encode recombinant sulfhydryl oxidases from the family of the Ev-r-Ai-r-Suifhydryloxidases, with Ervlp from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID No. 1) being particularly preferred.
  • nucleic acid sequences for sulfhydryl oxidases in which a redox active cysteine residue has been replaced.
  • nucleic acid sequences which are derived from Ervlp from Sacharomyces cerevisiae and here in particular the nucleic acid sequences which are responsible for a cysteine - »serine mutation at position 30 (C30S; SEQ ID No. 2) or a cysteine -> Encode the serine mutation at position 130 (C130S; SEQ ID No. 3).
  • a further preferred embodiment comprises nucleic acid molecules which encode the Ervl sulfhydryl oxidase from Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 4).
  • a nucleic acid molecule disclosed here can be “operatively” linked to a regulatory sequence in order to enable expression of the nucleic acid molecule.
  • a nucleic acid molecule is said to be "capable of expressing a nucleic acid sequence” if it comprises sequence elements which contain information relating to the regulation of transcription and / or translation and these elements are "operatively” linked to the nucleic acid sequence encoding the polypeptide.
  • An operative link is a link in which the regulatory sequence elements and the protein coding sequence are linked in such a way that gene expression is possible.
  • the exact nature of the regulatory regions required for gene expression can vary between different species. As a rule, however, these areas comprise a promoter which in prokaryotes consists of the promoter per se, ie DNA elements which control the initiation of transcription, and DNA elements which regulate the start of translation after their transcription in mRNA.
  • Such promoters typically include 5 'non-coding sequences involved in the initiation of transcription and translation, such as the -35 / -10- element and the Shine-Dalgarno element in prokaryotes or the TATA box, CAAT Sequences and 5 'capping elements in eukaryotes. These regions can also contain enhancer or repressor elements as well as translated ones Signal sequences to direct the native polypeptide chain into a special compartment of the host cell
  • the 3 "non-coding regions can also contain regulatory elements which are involved in the termination of transcription, polyadenylation or the like. If these termination sequences are not or only insufficiently functional in a specific host cell, they can be replaced by signals which are in of the cell in question are sufficiently functional.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can accordingly comprise a regulatory sequence, in particular a promoter sequence.
  • the nucleic acid molecule according to the invention comprises a promoter sequence and a transcription termination sequence.
  • Suitable prokaryotic promoters are, for example, the IacUV5 promoter or the T7 promoter.
  • suitable eukaryotic promoters are the SV40 promoter or the CMV promoter.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can also be contained in a vector or other cloning vehicle, such as phages, phagemids, cosmids, baculoviruses or artificial chromosomes.
  • the nucleic acid molecule is contained in a vector, in particular in an expression vector.
  • Such an expression vector can comprise, in addition to the regulatory sequences already described above and the nucleic acid sequence which encodes a sulfhydryl oxidase according to the invention, replication and control sequences which originate from an organism which is compatible with the host used for expression, and furthermore at least one Selection marker that transfers a selectable phenotype to a transformed cell.
  • suitable vectors for example pBluescript, pUC18, pET or pcDNA3, has been described in detail and is commercially available.
  • DNA molecules encoding a sulfhydryl oxidase according to the invention can be transformed into a corresponding host cell which is suitable for the expression of these DNA molecules.
  • the transformation can be carried out using established standard procedures [20].
  • the invention therefore also relates to a host cell which contains a nucleic acid molecule disclosed here.
  • the transformed host cells are subsequently cultivated under conditions which are suitable for expressing the nucleotide sequences which encode a sulfhydryl oxidase according to the invention.
  • the host cells used can be of prokaryotic origin, e.g. Escherichia coli (E. coli) or Bacillus subtilis, or of eukaryotic origin, such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 or High5 insect cells, immortalized mammalian cell lines (e.g. HeLa cells or CHO cells) or primary mammalian cells.
  • the invention also relates to a method for the recombinant production of a sulfhydryl oxidase according to the invention.
  • This method comprises the following steps: (a) Cloning a nucleic acid molecule which is a
  • Step (a) can be carried out with a nucleic acid molecule that only encodes the sulfhydryl oxidase. Alternatively, however, it can also be carried out with a nucleic acid molecule in which the sulfhydryl oxidase is operatively linked to a regulatory sequence.
  • the nucleic acid molecule according to the invention can also be linked to a fusion partner, such as an affinity epitope, which allows easy purification and / or detection of the recombinant protein.
  • the nucleic acid molecules cloned in this way can be expressed in a recombinant cell or a cell extract which contains all the factors required for transcription and translation.
  • the invention further relates to a composition which contains at least one recombinant sulfhydryl oxidase according to the invention.
  • the composition can exclusively comprise sulfhydryl oxidases, but also contain further enzymatically active proteins, such as lipoxygenases, protein disulfide isomerases, lysyl oxidases, tyrosine oxidases, hemicellulases or glucose oxidases.
  • the composition can also comprise carriers (e.g.
  • composition can be in solid form, for example lyophilized or crystalline, or else in solution, for example as a suspension or emulsion.
  • sulfhydryl oxidases as biocatalysts for the synthesis of disulfide bridge bonds and their transfer to substrates is disclosed, for example to dithiothreitol, cysteine or homocysteine.
  • the genetically modified enzymes of the invention have the decisive advantage that they can be regulated and this regulation can be easily followed by means of color changes in the protein.
  • the color of the protein is reversibly controlled by adjusting the redox potential via dithiothreitol, ß-mercaptoethanol or via atmospheric oxygen. This makes it possible to transfer a disulfide bond specifically to a specific substrate molecule and to follow the reaction based on the color change of the protein.
  • the peculiarity of the Ervl / Alr sulfhydryl oxidases is their substrate specificity for dithiols with a defined distance, since they can insert targeted disulfide bridges in the cellular environment regardless of the glutathione level.
  • Recent investigations by the inventors show the following sequence of artificial in vitro substrates: thioredoxin (reduced CXXC)> dithiothreitol> di-mercaptoethanol lysozyme (reduced)> cysteine.
  • thioredoxin reduced CXXC
  • dithiothreitol di-mercaptoethanol lysozyme (reduced)> cysteine.
  • Thioredoxin is the main redox regulator of the cell in the phenomena listed. Erv / Alrp acts as a thioredoxin oxidase and can thus intervene in the regulation.
  • the enzymes of the invention can be of clinical importance in the development of diagnostic reagents and test systems.
  • Reduced thioredoxin is an example essential cofactor of intracellular signal transmission, the control of apoptosis and necrosis formation and the modulation of fragility of red blood cells. It is also of great importance as an antioxidant. The oxidation taking place protects the vascular endothelium from damage by free radicals. The targeted control or detection of disulfide bridge formation can therefore be advantageous for the diagnosis and therapy of a number of diseases
  • the recombinant sulfhydryl oxidases of the invention can also be used as adjustable sensors / indicators for redox reactions.
  • the oxygen concentration of the medium influences the color of the protein via the redox potential.
  • the color of the protein can also be varied by changing the redox potential.
  • the enzymes according to the invention can therefore also be used as redox-regulated pigments.
  • a protein of the invention can e.g. between two glass panes, which are connected to electrodes. By electrically controlling the redox potential, the protein can color the glass surface and thus act as light protection.
  • the enzymes disclosed here do not appear to be toxic to cells according to the results available to date, they should also be usable in vivo as a sun protection factor, since the light transmission of cells can in turn be regulated via the redox potential.
  • the recombinant enzymes of the invention can also be used as acceptor molecules in resonance energy transfer (RET) applications for determining distances between macromolecules.
  • RET resonance energy transfer
  • examples of such methods are fluorescence RET (FRET) and bioluminescence RET (BRET) [17, 18].
  • FRET fluorescence RET
  • BRET bioluminescence RET
  • the principle is based on the radiation-free transfer of light energy from a directly excited donor molecule to a nearby acceptor molecule. In order for an energy transfer to take place, the emission or absorption spectra of the donor or acceptor must overlap. Due to its black color and the broad absorption spectrum, the Q30S variant from Ervlp can be used as a universal acceptor domain that can be combined with any donor molecule.
  • the purified proteins (cf. also Example 1) each have a Hisg affinity epitope at their C-terminus , which allows both fast cleaning and immunochemical detection.
  • 200 ng of purified protein with (+) or without (-) 20 M DTT in the sample buffer were used to reduce 4% -12% non-reducing SDS polyacrylamigels ( Novex / Invitrogen)
  • the proteins were detected chemiluminometrically using a primary anti-His5 antibody and an AP-coupled secondary antibody.
  • Example 2 shows the determination of the in vitro activity of wild-type (WT) -Ervlp and various mutated variants.
  • the enzyme activity of the purified proteins was measured photometrically with DTT (corresponding to 50 nmol reduced tiol groups) as the substrate.
  • the substrate turnover was specified for each protein-bound FAD molecule (according to the spectroscopic determination). The results represent the mean ⁇ standard deviation from three independent experiments.
  • Fig. 3 shows the different colors of purified wild-type (WT) -Ervlp and different mutated variants. Due to different expression in E. coli, the protein concentrations of the individual solutions vary. Ervlp (5.9 mg / ml), C30S (36 mg / ml), C33S (10.8 mg / ml), C130S (14.1 mg / ml), C133S (4.1 mg / ml), C159S (9.9 mg / ml), C176S ( 6.0 mg / ml) and ⁇ N-Ervlp (4.1 mg / ml).
  • Fig. 4 shows spectra for wild-type (WT) -Ervlp and the two cysteine -> serine variants C30S and C130S.
  • the purified proteins were analyzed in a Zeiss S10 diode array photometer in a wavelength range from 320 n to 700 nm (see also Example 3).
  • the protein solutions used had the following concentrations: 2.2 mg / ml (Ervlp), 5.1 mg / ml (C30S) and 4.2 mg / ml (C130S). Since the FAD content of the samples is different and the molar absorption coefficients for the mutated proteins can also vary, the spectra are only evaluated qualitatively.
  • the cDNAs for the complete Ei? V2 gene and a 5'-terminally truncated variant ( ⁇ N-Ervlp; corresponds to amino acid 73-189 of the wild type) were amplified using established standard methods [20] and used as Ndel / Xhol- Fragments cloned into the vector pET24a (+) (Novagen) [5].
  • the recombinant vector which encoded the complete cDNA sequence was subsequently used for oligonucleotide-directed mutagenesis ("Excite" PCR-based site-directed mutagenesis kit / Stratagene).
  • C30S (5 '-CGATCA TGTAACACCCTAC-3' / 5 '-CGAAGGTTTGCCATCTTCG-3'), C33S (5 '-CTACTTGACTTT CAGTACGTGACC-3 * / 5' -GGTGGTAGATGATCGGCAAGGTTTGTGT-3 'GT' 'C130GT' ' / 5 '-AAGGATAAATATGTGAGAAGATATTC-3'), C133 (5 '-CTTTGAAAAAT ATATCAGAG ⁇ AAATG-3' / 5 * -TCTTTAGCAGACCAGTTGTAAGG-3 '), C159S (5' -GCCCACAATAAAGTCAATAAGCCT-3 '' / 3 (5 * -CTCCAATTTCTGGGAAAAAAGATGGAAG-3 '/ 5' -TCAAATTTG GGCTTCCTCAATTTC-
  • the purified plasmids (Plas id Purification Kit / QIAGEN) were transformed and amplified in E. coli BL21 (+) (Novagen) [20].
  • the individual proteins were purified via a Hisg affinity epitope (encoded in the sequence of pET24a (+)) at their C-termini.
  • the cleaning was carried out using Ni2 + NTA agarose under native conditions in phosphate buffer (50mM NaCl, 50mM KH2PO4, 10mmM imidazole, pH 7.5) according to the manufacturer's instructions (QIAGEN).
  • the homogeneity of the protein preparations was verified using SDS polyacrylamide gel electrophoresis and Western analysis.
  • the mutated proteins C30S, C33S and to a lesser extent C130S are primarily present as dimers, ie at least the two cysteine residues at positions 30 and 33 are involved in the dimer formation.
  • concentrations of the individual proteins were set to 10 pmol protein-bound FAD per 100 ⁇ l reaction mixture.
  • the enzyme reaction was carried out in PBS (68mM NaCl, 75mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, which contains 3m EDTA) with DTT as substrate (corresponding to 50 nmol reduced thiol groups).
  • a 100 ⁇ l aliquot of this reaction mixture was removed for each measurement.
  • 800 ⁇ l PBS and 100 ⁇ l DTNB solution (5, 5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, Ellman's reagent; final concentration 10 mm) were added to the aliquots. After 2 min incubation, the absorbance was measured at 412 nm and the thiol content was calculated (molar extinction coefficient 14mM ⁇ lcm _ l [21]).
  • the thiol content in the starting mixture was determined in a sample without enzyme addition.
  • the substrate turnover was given per protein-bound FAD molecule.
  • the results shown in Fig. 2 represent the Mean values ⁇ standard deviation from three independent experiments.
  • the mutated proteins show no (C130S, C133S) or only a greatly reduced (C30S, C33S, C159S, C176S) enzyme activity under in vitro conditions, so that all six cysteine residues tested appear to be important for the full activity of the Ervlp sulfhydryl oxidase.
  • the activity of the N-terminally shortened Ervlp is surprisingly comparable to that of the wild type protein.
  • Another study [19] showed, however, that the truncated protein cannot replace the wild type in vivo.
  • the protein solutions used had the following concentrations: 2.2 mg / ml (WT-Ervlp), 5.1 mg / ml (C30S) and 4.2 mg / ml (C130S) .. Because the FAD content of the samples is different, and also the molar absorption coefficients for the mutated proteins may vary, the spectra are only assessed qualitatively. What is striking in the C30S variant is an additional absorption maximum at 580 nm and a broadening of the absorption at 460 nm (corresponds to FAD) in the C130S variant. The spectra of all other mutant proteins correspond to the wild type protein (not shown).

Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen, in denen min-destens ein Cysteinrest derart mutiert wurde, dass dies zu einer Veränderung des Absorptionssmaximums im Vergleich zum Wildtypprotein führt, die korrespondierenden Nukleinsäuremoleküle sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Proteine als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbrückenbindungen und deren Übertragung auf Substrate sowie als regulierbare Indikatoren für Redoxreaktionen.

Description

Re ombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen, in denen mindestens ein Cysteinrest derart mutiert wurde, dass dies zu einer Veränderung des Absorptionssmaximums im Vergleich zum Wildtypprotein führt, die korrespondierenden Nukleinsauremolekule sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Proteine als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbruckenbindungen und deren Übertragung auf Substrate sowie als regulierbare Indikatoren für Redoxreaktionen.
Sulfhydryloxidasen sind Enzyme, welche die Einführung von Disulfidbruckenbindungen in Proteinsubstrate katalysieren (Übersicht in [1]; [2-3]) . Dabei werden Thio-Verbindungen (R- SH) nach der folgenden Gleichung in die korrespondierenden Disulfid-Verbindungen umgesetzt werden:
2 R-SH + 02 → R-S-S-R + H2C>2.
Prinzipiell unterscheidet • man zwischen Metalloproteinen (eisen- oder kupferhaltig) und FAD (Flavinadenindinukleotid) - abhängigen Sulfhydryloxidasen, wobei die Erfindung letztere Gruppe betrifft.
FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen zeichnen sich gegenüber anderen Enzymen, die Dithiol/Disulfid-Transferreaktionen katalysieren, dadurch aus, dass sie Disulfidbindungen de novo synthetisieren können. Neben FAD als nicht-kovalent gebundenem Cofaktor ist den Vertretern dieser Gruppe gemein, dass sie (1) als Homodimere vorliegen, (2) Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor verwenden und (3) in ihrer Sequenz ein konserviertes CXXC-Motiv besitzen (C = Cystein, X = beliebige Aminosäure) , das an der primären Redoxreaktion beteiligt ist (Übersicht in [1]; [4]). Die beiden bislang am besten untersuchten Vertreter dieser Klasse sind die Quiescin-Sulfhydryloxidasen aus Huhn und Mensch (Übersicht in [1]) •
Eine eigene Untergruppe innerhalb der FAD-abhängigen Sulfhydryloxidasen stellt die Familie der Erv/Alr- Sulfhydryloxidasen dar, die nach Ervlp aus Saccharomyces cerevisiae sowie dessen humanem Homolog Alrp benannt ist (Übersicht in [1]) . Diese beiden Enzyme sind auch die ersten dieser Gruppe, deren DNA- und Proteinsequenzen bekannt sind [5, 6]. Ihre Aktivität ist -essentiell für das Überleben der Zellen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Biogenese von Mitochondrien, insbesondere hinsichtlich einer intakten Membranmorphologie, sowie in der Versorgung cytoplas atischer Proteine mit Eisen/Schwefel-Clustern, die in den Mitochondrien gebildet werden (Übersicht in [1]; [7]) . Im endoplasmatischen Reticulum von Saccharomyces cerevisiae wurde vor kurzem eine zweite Sulfhydryloxidase gefunden, die als Erv2p bezeichnet wurde [8, 9].
Die C-terminalen Domänen von Ervlp und Erv2p, die das redoxaktive Zentrum und die FAD-Bindedomäne enthalten, sind einander sehr ähnlich (30% Identität) . Sie sind insbesondere durch ein konserviertes YPCXXC-Motiv (Y = Tyrosin, P = Prolin, C = Cystein, X = beliebige Aminosäure) gekennzeichnet, das für die enzymatische Aktivität sowie die Interaktion mit FAD essentiell ist. Bei Ervlp entspricht dieses Motiv den Aminosäureresten 128-133.
Ein weiteres Charakteristikum dieser Enzyme ist ihre wenig konservierte N-terminale Domäne, die für die subzelluläre Lokalisation der Proteine, die Homodimerbildung sowie möglicherweise auch für die Substratinteraktion wichtig sind
[10]. Ervlp weist in dieser Region ein zweites CXXC-Motiv auf
(Aminosäuren 30-33), das Erv2p fehlt. Letzteres enthält allerdings an seinem C-Terminus ein möglicherweise funktioneil homologes CGC-Motiv (G = Glycin) . Die genauen strukturellen bzw. funktioneilen Aufgaben, welche die einzelnen Cysteinreste in Ervlp bzw. Erv2p innehaben, sind bislang noch nicht völlig verstanden, werden aber derzeit intensiv untersucht.
In vielen Anwendungsbereichen, z.B. bei der Teigherstellung für Backwaren oder der Entfernung von Fremdaromen aus Milch oder Bier, ist die Oxidation freier Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden erwünscht. Da enzymkatalysierte Reaktionen im Vergleich zum Einsatz unspezifischer Oxidationsmittel (etwa Wasserstoffperoxid, Perazide oder Bromide) keine unerwünschten Nebenprodukte bilden und die Reaktion auch wesentlich schneller abläuft, wurde die Verwendung von Sulfhydryloxidasen für zahlreiche Applikationen beschrieben.
Die Europäische Patentanmeldung EP 0 705 538 AI offenbart eine Enzymzusammensetzung aus einer Sulfhydryloxidase und einer Hemicellulase zur Verbesserung der Teigeigenschaften von Brot und anderen Backwaren. Das US Patent 5,547,690 beschreibt eine weitere Enzymzusammensetzung, bestehend aus einer Sulfhydryloxidase und einer Glucoseoxidase, welche die rheologischen Eigenschaften, insbesondere die Stabilität, von Teigzubereitungen verbessert.
Die Deutsche Patentanmeldung DE 198 40 489 AI beschreibt stabile WirkstoffZubereitungen für Lebensmittel, Futtermittel oder pharmazeutische Anwendungen, bei denen der/die Wirkstoffe von einer Proteinschicht umgeben sind. Zur Herstellung dieser Zubereitungen wird das Hüllprotein . enzymatisch quervernetzt, u.a. durch die Sulfhydryloxidase- katalysierte Synthese von Disulfidbruckenbindungen.
Bislang wurden Sulfhydryloxidasen hauptsächlich aus Milch bzw. aus verschiedenen Pilzen isoliert. U.S. Patent 4,087,328 beschreibt ein mehrstufiges, konventionelles Reinigungsverfahren für Sulfhydryloxidase aus Rohmilch von Kühen. Ein anderes Verfahren zur Reinigung von Sulfhydryloxidase aus dem Schimmelpilz Äspergillus niger ist im U.S. Patent 4,894,340 offenbart. Daneben wurde in der Europäischen Patentanmeldung EP 0 565 172 AI auch ein rekombinantes Verfahren zur Herstellung von Sulfhydryloxidasen aus fila entösen Pilzen, vorzugsweise wiederum aus Äspergillus spec. , in biotechnologischem Maßstab offenbart.
Bislang war es allerdings nicht möglich, Sulfhydryloxidasen herzustellen, deren katalytische Aktivität reguliert werden kann, obwohl eine derartige enzymatische Steuerungsmöglichkeit von Redoxreaktionen für eine Vielzahl von Anwendungen in der Grundlagenforschung, aber z.B. auch, in der Lebensmitteltechnologie wünschenswert wäre.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, die katalytische Aktivität von Sulfhydryloxidasen steuern zu können.
Dieses Ziel wird durch die Bereitstellung neuartiger Sulfhydryloxidasen als molekularen Werkzeuge sowie die rekombinante Herstellung solcher FAD-abhängiger Sulfhydryloxidasen in ausreichend großen Mengen gemäß Anspruch 1 erreicht. Bei diesen erfindungsgmäßen Sulfhydryloxidasen wurde mindestens ein Cysteinrest der Amino-säuresequenz derart mutiert, dass das Absorptionssmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist.
Die Erfindung beruht dabei auf der überraschenden Entdeckung, dass der Austausch bestimmter Cysteinreste in der Aminosäuresequenz einer Sulfhydryloxidase aus Saccharomyces cerevisiae nicht nur die Enzymaktivität und die Homodimerbildung beeinflusste, sondern auch eine Farbveränderung des Proteins zur Folge hatte. FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen erscheinen aufgrund des gebundenen FAD- Cofaktors gelb. Infolge des Austausches eines einzelnen Cysteinrests ist jedoch eine Farbänderung zu beobachten und so wurde u.a. ein schwarzes Protein erhalten, das weiterhin katalytisch aktiv war.
Ferner wurde festgestellt, dass die Farbgebung reversibel durch Einstellung des Redoxpotentials gesteuert werden kann. Da sich so Redoxreaktionen sehr leicht anhand der Farbänderung verfolgen lassen, sind die Enzyme der Erfindung ideale Werkzeuge zur gezielten Steuerung von Redoxreaktionen.
Die Erfindung schließt alle modifizierten Sulfhydryloxidasen ein, bei denen das Absorptionsmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist.- Das Absorptionsmaximum bezeichnet die Wellenlänge ("Farbe") des Lichtes, bei der eine Substanz beim Durchleuchten die Intensität am stärksten reduziert. Licht anderer Wellenlängen wird besser durchgelassen. Im sichtbaren Licht erscheint dadurch die Substanz in der Komplementärfarbe zu ihrem Absorptionsmaximum. Eine Veränderung des Absorptionsmaximums gemäß der Erfindung umfasst dabei alle Veränderungen des Absorptionsverhaltens, die eine Farbänderung des Sulfhydryloxidase-Proteins zur Folge haben. Die Sulfhydryloxidasen gemäß der Erfindung können mit Hilfe rekombinanten DNA-Technologie hergestellt werden, die eine vollständige Kontrolle der Sequenz und damit auch der Eigenschaften eines bestimmten Enzyms erlaubt. Mutationen können sehr einfach unter Verwendung etablierter Standardverfahren [20] in die Aminosäuresequenz eingeführt werden.
Die Erfindung schließt alle rekombinanten Sulfhydryloxidasen ein, in denen ein oder .mehrere Cysteinreste ersetzt wurden, wobei Cystein prinzipiell gegen eine beliebige Aminosäure ausgetauscht werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Cysteinrest durch einen Serinrest ersetzt. Bislang, konnte jedoch seitens der Erfinder noch nicht abschließend geklärt werden, ob die spezifische Einführung eines Serinrests in die Aminosäuresequenz in direktem Zusammenhang mit den beobachteten Farbänderungen der mutierten Proteine steht. Es sollte entsprechend dem Verständnis der Erfinder deshalb möglich sein, auch durch Substitution eines oder mehrerer Cysteinreste durch andere Aminosäuren Farbänderungen der mutierten Proteine hervorzurufen, so z.B. durch den Austausch von Cystein gegen Alanin oder Threonin, die beide zu Serin ähnliche Eigenschaften besitzen. Daneben könnte dies aber durchaus auch durch die Einführung z.B. eines Arginin- oder eines Leucinrests anstelle eines Cysteinrests bewirkt werden.
Grundsätzlich können alle in einer bestimmten Sulfhydryloxidase vorkommenden Cysteinreste gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden jedoch ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt, die redoxreaktiv sind. Unter "redoxreaktiven" Cysteinresten versteht man erfindungsgemäß dabei diejenigen Reste, die im Verlauf der katalytischen Reaktion einen Zyklus aus Oxidation und Reduktion durchlaufen und dabei eine Disulfidbrücke ausbilden. Beispiele für redoxreaktive Cysteinreste sind etwa C130 und C133 in Ervlp aus Saccharomyces cerevisiae.
Die Erfindung schließt ferner Sulfhydryloxidasen ein, die sich von der als "Wildtyp" anerkannten Sequenz aufgrund von alternativem Splicing einer gemeinsamen prä-mRNA unterscheiden, aber nach wie vor katalytisch aktiv sind.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen rekombinante Sulfhydryloxidasen aus der Familie der Evr/Alr- Sulfhydryloxidasen, wobei wiederum Ervlp aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID. Nr. 1) bevorzugt wird.
Bevorzugt sind ferner Sulfhydryloxidasen, die von Ervlp aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet sind, und bei denen mindestens ein redoxaktiver Cysteinrest ersetzt wurde, insbesondere die Enzyme mit einer Cystein —» Serin-Mutation an Position 30 (C30S; SEQ ID Nr. 2) bzw. einer Cystein -» Serin-Mutation an Position 130 (C130S; SEQ ID Nr. 3) .
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst rekombinante Ervl-Sulfhydryloxidasen aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nr. 4) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die rekombinante Sulfhydryloxidase ein Protein- oder Peptidaffinitätsepitop an ihrem N-Terminus und/oder C- Terminus, das eine einfache Detektion und/oder Reinigung des Proteins er-möglicht. Geeignete Epitope sind zum Beispiel das myc-Epitop, das FLAG-Epitop, das Hisg-Epitop oder das HA- Epitop. Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsauremolekule (DNA und RNA) , die Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche die hier offenbarten Sulfhydryloxidasen kodieren. Da es aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes möglich ist, bestimmte Codons durch andere Codons zu ersetzen, welche die gleiche Aminosäure kodieren, ist die Erfindung nicht auf ein spezifisches Nukleinsäuremolekül beschränkt, das eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodiert, sondern schließt alle Nukleinsauremolekule ein, die eine funktioneile Sulfhydryloxidase kodieren.
Die Erfindung schließt ferner Nukleinsauremolekule ein, die sich aufgrund von alternativem Splicing eines gemeinsamen prä- RNA Moleküls von der als "Wildtyp" anerkannten Sequenz unterscheiden. Derartige Splicing-Mechanismen umfassen die alternative Verwendung von Exons (i.e. Nukleinsäuresequenzen, die eine Aminosäuresequenz kodieren) , die alternative
Anordnung von Exons sowie das "Nicht-entfernen" von Introns
(i.e. intervenierende Sequenzen, die normalerweise keine Aminosäuresequenz kodieren) aus dem mRNA-Molekül.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kodieren die Nukleinsauremolekule rekombinante Sulfhydryloxidasen aus der Familie der- Ev-r-Ai-r-Suifhydryloxidasen, wobei insbesondere Ervlp aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID. Nr. 1) bevorzugt wird.
Andere bevorzugte Ausführungsformen umfassen Nukleinsäuresequenzen für Sulfhydryloxidasen, in denen ein redoxaktiver Cysteinrest ersetzt wurde. Besonders bevorzugt werden Nukleinsäuresequenzen, die von Ervlp aus Sacharomyces cerevisiae abgeleitet sind, und hier insbesondere die Nukleinsäuresequenzen, die für eine Cystein —» Serin-Mutation an Position 30 (C30S; SEQ ID Nr. 2) bzw. eine Cystein -> Serin-Mutation an Position 130 (C130S; SEQ ID Nr. 3) kodieren.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst Nukleinsauremolekule, welche die Ervl-Sulfhydryloxidase aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nr. 4) kodieren.
Ein hier offenbartes Nukleinsäuremolekül kann "operativ" mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft sein, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen.
Ein Nukleinsäuremolekül wird als "fähig zur Expression einer Nukleinsäuresequenz" bezeichnet, wenn es Sequenzelemente umfasst, die Informationen hinsichtlich der Regulation von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente "operativ" mit der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in Prokaryonten aus dem Promotor per se besteht, i.e. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren schließen normalerweise 5' nicht-kodierende Sequenzen ein, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die -35/-10- Ele ente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryonten oder die TATA-Box, CAAT-Sequenzen und 5 ' -Capping-Elemente in Eukaryonten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten sowie translatierte Signalsequenzen, um die native Polypeptidkette in ein spezielles Kompartiment der Wirtszelle zu dirigieren
Zusätzlich können auch die 3" nicht-kodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription, der Polyadenylierung o.a. beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktioneil sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind.
Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz umfassen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung eine Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz. Geeignete prokaryontische Promotoren sind zum Beispiel der IacUV5-Promotor oder der T7-Promotor. Beispiele für geeignete eukaryontische Promotoren sind der SV40-Promotor oder der CMV-Pro otor.
Die Nukleinsauremolekule gemäß der Erfindung können ferner in einem Vektor oder einem anderen Klonierungsvehikel enthalten sein, wie zum Beispiel Phagen, Phagemiden, Cosmiden, Baculoviren oder künstlichen Chromosomen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen Sequenzen und der Nukleinsäuresequenz, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodiert, Replikations- und Kontrollsequenzen umfassen, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt. Eine große Zahl geeigneter Vektoren, z.B. pBluescript, pUC18, pET oder pcDNA3, ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich.
DNA-Moleküle, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodieren, und insbesondere ein Vektor, der die kodierende Sequenz einer solchen Sulfhydryloxidase enthält, können in eine entsprechende Wirtszelle transformiert werden, die zur Expression dieser DNA-Moleküle geeignet ist. Die Transformation kann dabei mit Hilfe etablierter Standardverfahren [20] durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft daher auch eine Wirtszelle, die ein hier offenbartes Nukleinsäuremolekül enthält.
Die transformierten Wirtszellen werden in der Folge unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression der Nukleotidsequenzen, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodieren, geeignet sind. Die verwendeten Wirtszellen können prokaryontischen Ursprungs sein, wie z.B. Escherichia coli (E. coli) oder Bacillus subtilis, oder eukaryontischen Ursprungs, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 oder High5 Insektenzellen, immortalisierte Säugetierzelllinien (z.B. HeLa-Zellen oder CHO-Zellen) oder primäre Säugetierzellen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Klonieren eines Nukleinsäure oleküls, das eine
Sulfhydryloxidase kodiert, in einen geeigneten Vektor, und (b) Einbringen des in (a) erhaltenen rekombinanten Vektors in eine geeignete Wirtszelle oder einen geeigneten Zellextrakt.
Schritt (a) kann dabei mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, das nur die Sulfhydryloxidase kodiert. Alternativ kann er aber auch mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, in dem die Sulfhydryloxidase operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist. Optional kann das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung auch mit einem Fusionspartner verknüpft sein, wie etwa einem Affinitätsepitop, das eine einfache Reinigung und/oder Detektion des rekombinanten Proteins erlaubt. Die Expression der so klonierten Nukleinsauremolekule kann in einer rekombinanten Zelle oder einem Zellextrakt erfolgen, die/der alle für die Transkription und Translation erforderlichen Faktoren enthält.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, die mindestens eine rekombinante Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung enthält. Die Zusammensetzung kann dabei ausschließlich Sulfhydryloxidasen umfassen, aber auch weitere enzymatisch aktive Proteine enthalten, wie z.B. Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Lysyloxidasen, Tyrosinoxidasen, Hemicellulasen oder Glucoseoxidasen. Ferner kann die Zusammensetzung je nach Verwendungszweck auch Trägerstoffe (z.B. Stärke, Laktose, Gelatine, Fette, Wachse, Öle oder Polyole) , verschiedenen Zusatzstoffe (etwa Füllstoffe, Stabilisierungsmittel, Emulgiermittel oder Konservierungsmittel, Puffersubstanzen, Lösungsmittel oder Lösungsvermittler) oder Transportvehikel umfassen. Die Zusammensetzung kann in fester Form vorliegen, z.B. lyophilisiert oder kristallin, oder aber gelöst, z.B. als Suspension oder Emulsion. Außerdem wird die Verwendung der rekombinanten Sulfhydryloxidasen als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbruckenbindungen sowie deren Übertragung auf Substrate offenbart, z.B. auf Dithiothreitol, Cystein oder Homocystein. Im Vergleich zu herkömmlichen Sulfhydryloxidasen besitzen die gentechnologisch modifizierten Enzymen der Erfindung den entscheidenden Vorteil, dass sie regulierbar sind, und diese Regulation anhand von Farbänderungen des Proteins leicht verfolgt werden kann. Die Steuerung der Farbgebung des Proteins erfolgt dabei reversibel durch Einstellung des Redoxpotentials über Dithiothreitol, ß- Mercaptoethanol bzw. über Luftsauerstoff. Dadurch wird es möglich, eine Disulfidbindung gezielt auf ein bestimmtes Substratmolekül zu übertragen und die Reaktion anhand der Farbänderung des Proteins zu verfolgen.
Die Besonderheit der Ervl/Alr Sulfhydryloxidasen ist ihre Substratspezifität für Dithiole mit einem definierten Abstand, da sie so in der zellulären Umgebung unabhängig vom Glutathionspiegel gezielte Disulfidbrücken einfügen können. Jüngste Untersuchungen der Erfinder zeigen folgende Reihenfolge von künstlichen in vitro Substraten: Thioredoxin (reduziertes CXXC) > Dithiothreitol > Di-Mercaptoethanol Lysozym (reduziert) > Cystein. Demzufolge scheinen Erv/Alr Sulfhydryloxidasen eine starke Präferenz für Dithiole in Proteinen mit einem genau definierten Abstand zu haben. Thioredoxin der Haupt-Redoxregulator der Zelle bei den aufgeführten Phänomenen. Dabei wirkt Erv/Alrp als Thioredoxin-Oxidase und kann so in die Regulation eingreifen.
Die Enzyme der Erfindung können z.B. klinisch bei der Entwicklung diagnostischer Reagenzien und Testsysteme von Bedeutung sein. Reduziertes Thioredoxin ist z.B. ein essentieller Cofaktor der intrazellulären Signalübertragung, der Steuerung von Apoptose und Nekrosenbildung sowie der Modulation der Fragilität roter Blutkörperchen. Auch als Antioxidationsmittel ist es von großer Bedeutung. Die dabei stattfindende Oxidation schützt u.a. das vaskuläre Endothel vor einer Schädigung durch freie Radikale. Die gezielte Steuerung bzw. der Nachweis einer erfolgten Disulfidbrückenbildung können daher für die Diagnose, aber auch Therapie einer Reihe von Krankheiten vorteilhaft sein
Die rekombinanten Sulfhydryloxidasen der Erfindung können ferner als regulierbare Sensoren/Indikatoren für Redoxreaktionen verwendet werden. So kann z.B. die Sauerstoffkonzentration des Mediums über das Redoxpotential die Farbe des Proteins beeinflussen.
Umgekehrt kann aber auch die Farbe des Proteins durch Änderung des Redoxpotentials variiert werden. Die Enzyme gemäß der Erfindung können demnach auch als redox-regulierte Pigmente verwendet werden. Ein Protein der Erfindung kann z.B. zwischen zwei Glasscheiben eingebracht werden, welche mit Elektroden verbunden sind. Durch elektrische Steuerung des Redoxpotentials kann das Protein die Glasfläche einfärben und somit als Lichtschutz fungieren.
Da die hier offenbarten Enzyme nach den bislang vorliegenden Ergebnissen für Zellen nicht toxisch zu sein scheinen, sollten sie auch in vivo als Lichtschutzfaktor einsetzbar sein, da sich die Lichtdurchlässigkeit von Zellen wiederum über das Redoxpotential regulieren lässt.
Die rekombinanten Enzyme der Erfindung, und insbesondere die C30S-Variante von Ervlp aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID Nr. 2) können weiterhin als Akzeptormoleküle in Resonanzenergietransfer (RET) -Applikationen zur Bestimmung von Abständen zwischen Makromolekülen eingesetzt werden. Beispiele derartiger Verfahren sind Fluoreszenz-RET (FRET) und Biolumineszenz-RET (BRET) [17, 18]. Das Prinzip beruht dabei auf dem strahlungslosen Transfer von Lichtenergie von einem direkt angeregten Donormolekül auf ein sich in der Nähe befindliches Akzeptormoleül. Damit ein Energietransfer stattfinden kann, müssen die Emmissions- bzw. Absorptions- spektren von Donor bzw. Akzeptor überlappen. Aufgrund seiner schwarzen Farbe und des breiten Absorptionsspektrums kann die Q30S-Variante von Ervlp als universelle Akzeptordomäne eingesetzt werden, die sich mit einem beliebigen Donormolekül kombinieren lässt .
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden nichteinschränkenden Figuren und Beispiele veranschaulicht.
Dabei zeigt Fig. 1 die Expression von Wildtyp (WT) -Ervlp sowie verschiedener mutierter" Varianten (C = Cystein, S = Serin). Die gereinigten Proteine (vgl. auch Beispiel 1) tragen an ihrem C-Terminus jeweils ein Hisg-Affinitätsepitop, das sowohl eine schnelle Reinigung als auch den immunchemischen Nachweis erlaubt. Pro Spur wurden 200 ng gereinigtes Protein mit (+) bzw. ohne (-) 20 M DTT im Probenpuffer auf 4%-12% nicht-reduzierende SDS-Poly- acrylamiggele (Novex/ Invitrogen) aufgetragen. Die Proteine wurden über einen primären anti-His5 Antikörper und einen AP- gekoppelten sekundären Antikörper chemiluminometrisch nachgewiesen.
Fig. 2 zeigt die Bestimmung der in vitro-Aktivität von Wildtyp (WT) -Ervlp sowie verschiedener mutierter Varianten. Die Enzymaktivität der gereinigten Proteine (vgl. auch Beispiel 2) wurde photometrisch mit DTT (entsprechend 50 nmol reduzierte T iol-Gruppen) als Substrat gemessen. Der Substratumsatz wurde dabei pro proteingebundenes FAD-Molekül (gemäß der spektroskopischen Bestimmung) angegeben. Die Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.
Fig. 3 zeigt die unterschiedlichen Färbungen von gereinigtem Wildtyp (WT) -Ervlp sowie verschiedener mutierter Varianten. Aufgrund von unterschiedlicher Expression in E. coli variieren die Proteinkonzentrationen der einzelnen Lösungen. Ervlp (5.9 mg/ml) , C30S (36 mg/ml) , C33S (10.8 mg/ml) , C130S (14.1 mg/ml) , C133S (4.1 mg/ml) , C159S (9.9 mg/ml) , C176S (6.0 mg/ml) und ΔN-Ervlp (4.1 mg/ml) .
Fig. 4 zeigt Spektren für Wildtyp (WT) -Ervlp sowie die beiden Cystein -> Serin Varianten C30S und C130S. Die gereinigten Proteine wurden in einem Zeiss S10 Dioden-Array Photometer in einem Wellenlängebereich von 320 n bis 700 nm analysiert (vgl. auch Beispiel 3) . Die verwendeten Proteinlösungen hatten die folgenden Konzentrationen: 2.2 mg/ml (Ervlp), 5.1 mg/ml (C30S) und 4.2 mg/ml (C130S) . Da der FAD-Gehalt der Proben unterschiedlich ist, und auch die molaren Absorptionskoeffizienten für die mutierten Proteine variieren können, werden die Spektren nur qualitativ bewertet.
Beispiel 1
Klonierung und Reinigung von rekombinanten Ervlp-Varianten aus Saccharomyces cexrevlsiae
Die cDNAs für das vollständige Ei?V2-Gen sowie eine 5'- terminal verkürzte Variante (ΔN-Ervlp; entspricht Aminosäure 73-189 des Wildtyps) wurden mittels etablierter Standardverfahren [20] amplifiziert und als Ndel/Xhol- Fragmente in den Vektor pET24a(+) (Novagen) kloniert [5]. Der rekombinante Vektor, der die vollständige cDNA-Sequenz kodierte, wurde im folgenden zur oligonukleotid-gerichteten Mutagenese ("Excite" PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit/Stratagene) verwendet. Die zur Einführung der einzelnen Mutationen (C = Cystein, S = Serin) verwendeten Primer (jeweils vorwärts/rückwärts) haben die folgenden Sequenzen:
C30S (5 ' -CGATCA TGTAACACCCTAC-3 ' /5 ' -CGAAGGTTTGCCATCTTCG-3 ' ) , C33S (5 ' -CTACTTGACTTT CAGTACGTGACC-3 * /5 ' -GGTGGTAGATGATCGGCAAGGTTTGC-3 ' ) , C130S (5 ' -CCA ATTGGTGTGCTAAAGACTTTG-3 ' /5 ' -AAGGATAAATATGTGAGAAGATATTC-3 ' ) , C133 (5 ' -CTTTGAAAAAT ATATCAGAGÄAAATG-3 ' /5 * -TCTTTAGCAGACCAGTTGTAAGG-3 ' ) , C159S (5 ' -GCCCACAATAAAGTCAATAAGAAAT-3 ' /5 '-CTCAGACATCCACCTCCCAAG TTCTT-3 ' ) C176S (5 * -CTCCAATTTCTGGGAAAAAAGATGGAAG-3 ' /5 ' -TCAAATTTG GGCTTCCTCAATTTC-
3').
Die Identität der mutierten Sequenzen wurde anhand von Restriktions- bzw. Sequenzanalysen verifiziert.
Die gereinigten Plasmide (Plas id Purification Kit/QIAGEN) wurden in E. coli BL21(+) (Novagen) transformiert und amplifiziert [20]. Die Reinigung der einzelnen Proteine erfolgte über ein Hisg-Affinitätsepitop (in der Sequenz von pET24a(+) kodiert) an deren C-Termini. Die Reinigung wurde mit Hilfe von Ni2+ NTA-Agarose unter nativen Bedingungen in Phosphatpuffer (50mM NaCl, 50mM KH2PO4, lOmM Imidazol, pH 7.5) nach Herstelleranweisung (QIAGEN) durchgeführt. Die Homogenität der Proteinpräparationen wurde mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Analyse verifiziert. Dazu wurden jeweils 200 ng Protein in 4%-12% nicht-reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen (Novex/Invitrogen) aufgetrennt. Die Bildung von Protein-Di eren (oder -Multimeren) wurde durch Zugabe bzw. Weglassen von DTT (20mM) im Probenpuffer untersucht (siehe Fig.l). Aus Fig. 1 ist ersichtlich, dass die N-terminal verkürzte Ervlp ausschließlich als Monomer, das Wildtypprotein jedoch als eine Mischung aus Monomeren und Dimeren vorliegt. Dies zeigt, dass die N-terminale Domäne für die Bildung von Dimeren entscheidend ist. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen findet man mit Ausnahme von C133S keine Mono ere. Die mutierten Proteine C30S, C33S und in geringerem Maße C130S liegen vornehmlich als Dimere vor, d.h. zumindest die beiden Cysteinreste an Position 30 bzw. 33 sind an der Dimerbildung beteiligt. Das Vorliegen hochmolekularer Proteinmultimere bei den Varianten C133S, C159S und C176S deutet hingegen eine unspezifische Aggregation dieser Proteine an. Beispiel 2 Analyse der in vxtro-Enzymaktivität von Ervlp-Varianten
Zur Aktivitätsbestimmung wurden die Konzentrationen der einzelnen Proteine auf 10 pmol proteingebundenes FAD pro 100 μl Reaktionsansatz eingestellt.
Die Enzymreaktion wurde in PBS (68mM NaCl, 75mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.5, der 3m EDTA enthält) mit DTT als Substrat (entsprechend 50 nmol reduzierter Thiolgruppen) durchgeführt. Für jede Messung wurde ein 100 μl Aliquot dieser Reaktionsmischung entnommen. Zur Bestimmung des Thiolgehalts wurden die Aliquots mit 800 μl PBS und 100 μl DTNB-Lösung (5, 5 ' -Dithio-bis-2-nitrobenzoesaure, Ellman's Reagens; Endkonzentration lOmM) versetzt. Nach 2 min Inkubation wurde die Extinktion bei 412 nm gemessen und der Thiolgehalt berechnet (molarer Extinktionskoeffizient 14mM~ lcm_l [21]). Der Thiolgehalt in der Ausgangsmischung wurde in einer Probe ohne Enzymzugabe ermittelt. Der Substratumsatz wurde pro proteingebundenes FAD-Molekül angegeben. Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.
Die mutierten Proteine zeigen unter in vitro Bedingungen keine (C130S, C133S) oder nur eine stark verminderte (C30S, C33S, C159S, C176S) Enzymaktivität, sodass alle sechs getesteten Cysteinreste für die volle Aktivität der Ervlp- Sulfhydryloxidase wichtig zu sein scheinen. Die Aktivität der N-terminal verkürzten Ervlp ist erstaunlicherweise mit der des Wildtypproteins vergleichbar. Eine weitere Studie [19] hat jedoch gezeigt, dass das verkürzte Protein den Wildtyp in vivo nicht ersetzen kann.
Beispiel 3 Spektroskopische Analyse von Ervlp-Varianten
Der Austausch von Cystein- gegen Serinreste hatte in einigen Fällen auch eine Veränderung der Proteinfärbung zur Folge (siehe Fig. 3) . Während das Wildtypprotein und die N-terminal verkürzte Ervlp aufgrund des gebundenen FAD intensiv gelb erscheinen, führt eine Mutation an Position 30 zu einer Schwarzfärbung des Proteins, eine Mutation an Position 130 hingegen zu einer Orangefärbung. Ervlp (C159S) erscheint farblos, und die anderen drei Varianten (C33S, C133C und C176S) sind ähnlich dem Wildtyp gelb gefärbt.
Alle Farben verschwinden nach Reduktion der Proteine mit Dithionit. Nach Reoxidation in der Luft verfärben sich die Proteinlösungen gelb. Auch bei längerer Lagerung (über mehrere Tage) verändern sich die Farben der mutierten Proteine hin zum Gelb des Wildtyps, vermutlich ebenfalls durch Oxidation mit Luftsauerstoff. Im Stand der Technik gelang es nach einer derartigen Verfärbung nicht, die ursprüngliche Farbe eines mutierten Proteins wiederherzustellen. Die Farbveränderungen der beiden Ervlp-Varianten C30S und C130S wurden in einem Zeiss S10 Dioden-Array Photometer im Detail untersucht. Es wurden Spektren in einem Wellenlängebereich von 320 nm bis 700 nm aufgenommen (vgl. Fig. 4) . Die verwendeten Proteinlösungen hatten die folgenden Konzentrationen: 2.2 mg/ml (WT-Ervlp) , 5.1 mg/ml (C30S) und 4.2 mg/ml (C130S).. Da der FAD-Gehalt der Proben unterschiedlich ist, und auch die molaren Absorptionskoeffizienten für die mutierten Proteine variieren können, werden die Spektren nur qualitativ bewertet. Auffällig sind bei der C30S-Variante ein zusätzliches Absorptionsmaximum bei 580 nm sowie eine Verbreiterung der Absorption bei 460 nm (entspricht FAD) bei der C130S- Variante. Die Spektren aller anderen mutierten Proteine entsprechen dem Wildtypprotein (nicht gezeigt) .
Referenzen:
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Claims

Pate ansp üche
1. Rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidase, in der mindestens ein Cysteinrest der Aminosäuresequenz derart mutiert wurde, dass das Absorptionssmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist.
2. Sulfhydryloxidase gemäß Anspruch 1, die aus der Familie der Erv/Alr-Sulfhydryloxidasen ausgewählt wird.
3. Sulfhydryloxidase gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei ein redoxaktiver Cysteinrest ersetzt wurde.
4. Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei die Sulfhydryloxidase Ervlp aus Saccharomyces cerevisiae ist
(SEQ ID Nr. 1) .
5. Sulfhydryloxidase gemäß Anspruch 4, wobei der Cysteinrest an Position 30 (SEQ ID Nr. 2) oder an Position 130 (SEQ ID Nr. 3) durch einen Serinrest ersetzt wurde.
6. Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei die Sulfhydryloxidase Ervl aus Arabidopsis thaliana ist (SEQ ID Nr. 4) .
7. Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-6, die ein Protein- oder Peptidaffinitätsepitop an ihrem N- und/oder C-Terminus aufweist.
8. Nukleinsäuremolekül, das eine Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-7 kodiert.
9. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 8, wobei das Nukleinsäuremolekül operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen.
10. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 9, wobei die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz und eine
Transkriptionsterminationssequenz umfasst .
11. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 8-10, das in einem Vektor enthalten ist.
12. Wirtszelle, die ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 8-11 enthält.
13. Verfahren zur Herstellung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-7, das umfasst:
(a) Klonieren eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Sulfhydryloxidase kodiert, in einen geeigneten Vektor, und
(b) Einbringen des in (a) erhaltenen rekombinanten Vektors in eine geeignete Wirtszelle oder einen geeigneten Zellextrakt.
14. Zusammensetzung, die mindestens eine Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-7 enthält.
15. Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-7 als regulierbarer Biokatalysator für die Synthese von Disulfidbruckenbindungen und deren Übertragung auf Substrate.
16. Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-7 als Sensor/Indikator für Redoxreaktionen.
17. Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-7 als redox-reguliertes Pigment.
18. Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1-7 als Akzeptormolekül in Resonanzenergietransfer-Applikationen.
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