DE102004028778A1

DE102004028778A1 - Regulatorische Oligopeptide und deren Verwendung

Info

Publication number: DE102004028778A1
Application number: DE102004028778A
Authority: DE
Inventors: Thomas Lisowsky
Original assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Current assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Priority date: 2004-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2006-01-05

Abstract

Die Erfindung betrifft Oligopeptide mit zumindest einem Cysteinrest und zwei alphahelikalen Bereichen, welche ein Sequenzmotiv mit der Aminosäuresequenz X¶1¶X¶3¶X¶4¶X¶2¶ flankieren, bei denen eine der Aminosäuren X¶1¶ und X¶2¶ Cystein und die andere der Aminosäuren X¶1¶ und X¶2¶ eine andere Aminosäure ist, und wobei X¶3¶ und X¶4¶ beliebige Aminosäuren sind. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren, die für diese Oligopeptide kodieren, sowie Vektoren und Zellen, die diese Moleküle enthalten. Die Erfindung betrifft ferner besondere Verwendungen der Oligopeptide.

Description

Die Erfindung betrifft Oligopeptide mit zumindest einem Cysteinrest und zwei alpha-helikalen Bereichen, welche ein Sequenzmotiv mit der Aminosäuresequenz X₁X₃X₄X₂ flankieren. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren, die für diese Oligopeptide kodieren, sowie Vektoren und Zellen, die diese Moleküle enthalten. Die Erfindung betrifft ferner besondere Verwendungen der Oligopeptide.

Als neuer Wirkmechanismus der Regulation der zellulären Entwicklung wurde die Modifikation von Cysteinresten in Proteinen oder kleinen Molekülen gefunden [1-5]. Diese Modifikation ist nicht an das endoplasmatische Retikulum gebunden, sondern läuft über spezielle Sulfhydryloxidasen [6-11], die an allen subzellulären Orten oder sogar extrazellulär auftauchen [6, 7]. Sulfhydryloxidasen sind Enzyme, welche die Einführung von Disulfidbrückenbindungen in Proteinsubstrate katalysieren (Übersicht in [11]; [6-10]). Dabei werden Thiol-Verbindungen (R-SH) nach der folgenden Gleichung in die korrespondierenden Disulfid-Verbindungen umgesetzt: 2 R-SH + O₂ → R-S-S-R + H₂O₂

Prinzipiell unterscheidet man zwischen Metalloproteinen (eisen- oder kupferhaltig) und FAD (Flavinadenindinukleotid)-abhängigen Sulfhydryloxidasen. FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen zeichnen sich gegenüber anderen Enzymen, die Dithiol/Disulfid-Transferreaktionen katalysieren, dadurch aus, dass sie Disulfidbindungen de novo synthetisieren können. Neben FAD als nicht-kovalent gebundenem Cofaktor ist den Vertretern dieser Gruppe gemein, dass sie (A) als Homodimere vorliegen, (B) Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor verwenden und (C) in ihrer Sequenz ein konserviertes CXXC-Motiv besitzen (C = Cystein, X = beliebige Aminosäure), das an der primären Redoxreaktion beteiligt ist [10, 11, 20]. Die beiden bislang am besten untersuchten Vertreter dieser Klasse sind die Quiescin-Sulfhydryloxidasen aus Huhn und Mensch (Übersicht in [11]). Eine eigene Untergruppe innerhalb der FAD-abhängigen Sulfhydryloxidasen stellt die Familie der Erv1/Alr-Sulfhydryloxidasen dar, die nach Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae [12] sowie dessen humanem Homolog Alrp [13, 14] benannt ist. Diese beiden Enzyme sind auch die ersten dieser Gruppe, deren DNA- und Proteinsequenzen bekannt sind [12, 13, 14]. Ihre Aktivität ist essentiell für das Überleben der Zellen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Biogenese von Mitochondrien, insbesondere hinsichtlich einer intakten Membranmorphologie, sowie in der Versorgung cytoplasmatischer Proteine mit Eisen/Schwefel-Clustern, die in den Mitochondrien gebildet werden [15, 21, 22]. Die Sulfhydryloxidasen vom Typ Erv1p/Alrp oder QSOX haben einen gemeinsamen evolutionären Ursprung [16]. Daher hat das redoxaktive Zentrum der Enzyme mit dem redoxaktiven CXXC Motiv bei allen diesen Enzymen einen gleichen funktionellen Aufbau und ähnliche räumliche Struktur [17, 18, 19]. Ein weiteres Charakteristikum dieser Enzyme ist die hohe Sequenzvariabilität in ihren N-terminalen Domänen, die für die subzelluläre Lokalisation der Proteine, die Homodimerbildung sowie möglicherweise auch für die Substratinteraktion wichtig sind [6, 10, 11]. Das Hefe Erv1p weist in dieser Region ein zweites CXXC-Motiv auf (Aminosäuren 30-33). Die genauen strukturellen bzw. funktionellen Aufgaben, welche die einzelnen Cysteinreste in Erv1p bzw. Alrp innehaben, sind bislang noch nicht bekannt.

Das spezifische Redoxpotential humaner Zellen über Thiolverbindungen ist entscheidend beispielsweise an der Wundheilung, der Immunantwort, der Tumorabwehr, der Apoptose und der allgemeinen zellulären Differenzierung beteiligt [1-5]. Dieses Phänomen hat auch entscheidenden Einfluss auf zelluläre Alterungsprozesse, degenerative Erkrankungen und Tumorbildung, beispielsweise bei Alzheimer, Parkinson, Multipler Sklerose, Krebserkrankungen [1-5].

Die EP 0 239 211 A2 offenbart einen Prozess zur biomedizinischen Anwendung bei redoxgeschädigten Augenlinsen. Die Erfindung beinhaltet die Behandlung der Augenlinse mit Thioredoxin, Thioredoxin-Derivaten oder Thioredoxin ähnlichen Dithiol-Peptiden. Das Wirkprinzip dieser Dithiol-Peptide ist dabei aus dem redoxaktiven CXXC Motiv abgeleitet, das aus dem aktiven Zentrum der Thioredoxine stammt.

Aus der EP 0 237 198 A2 sind ferner therapeutische Dithiol-Peptide bekannt, die der Behandlung metallkatalysierter oxidativer Schäden dienen. Als wirksame Substanzen werden ebenfalls Thioredoxin, Thioredoxin-Derivate bzw. Thioredoxin ähnliche Dithiol-Peptide verwendet, wobei die Peptide jeweils auch das CXXC-Motiv als aktives Zentrum enthalten.

Aus der US 5,480,797 sind die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen der Alr-Sulfhydryloxidase aus Ratten bekannt. Darüber hinaus offenbart die US 550,037 zusätzlich die entsprechenden Sequenzen der Alr-Sulfhydryloxidase des Menschen. Aus der US 5,607,844 sind ferner verschiedene Varianten der Alr-Sulfhydryloxidasen aus Ratte und Mensch bekannt.

Bislang wurden humane Sulfhydryloxidasen noch nicht als Ziele für die Regulation zellulärer Redoxprozesse beschrieben, obwohl ihre ubiquitäre Verbreitung im Organismus ihre essentielle Funktion bei Disulfidtransferprozessen und ihre Bedeutung für die Organentwicklung und bei pathologischen Prozessen gerade publiziert wurden [7, 23, 24]. So war es bis jetzt auch nicht möglich, die zelluläre Aktivität von Sulfhydryloxidasen gezielt zu regulieren, obwohl eine derartige enzymatische Steuerungsmöglichkeit dieser Redoxreaktionen für eine Vielzahl von Anwendungen in der Grundlagenforschung, aber z.B. auch in der Medizin, wünschenswert wäre.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, Biomoleküle zur Verfügung zu stellen, welche die katalytische Aktivität von Sulfhydryloxidasen und ihrer Interaktionspartner in vitro, im Organismus oder in spezifischen Zellen steuern können.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Oligopeptide der eingangs genannten Art gelöst, bei denen eine der Aminosäuren X₁ und X₂ Cystein und die andere der Aminosäuren X₁ und X₂ eine andere Aminosäure ist, und wobei X₃ und X₄ beliebige Aminosäuren sind. Die Erfindung schließt also alle Oligopeptide ein, in denen ein Cysteinrest ersetzt wurde, wobei Cystein prinzipiell gegen eine beliebige Aminosäure ausgetauscht werden kann. Oligopeptide mit zumindest einer eigenen Thiolgruppe und Sequenzmotiven, die sich vom CXXC-Motiv ableiten, sowie Derivate davon greifen in vorteilhafter Weise regulierend (hemmend oder aktivierend) in das entsprechende regulatorische Netzwerk ein. Besonders effizient sind dabei Dithiolverbindungen, die sich vom redoxaktiven Zentrum der Sulfhydryloxidasen Erv1p, Alrp oder QSOX ableiten. In vielen biomedizinischen Anwendungsbereichen, beispielsweise bei der Redoxregulation oder dem Schutz vor Radikalen, ist die regulatorische Oxidation freier Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden erwünscht. Da oligopeptid-katalysierte Reaktionen im Vergleich zum Einsatz unspezifischer Oxidationsmittel (etwa Dithiothreitol, Glutathion, Dithioerythriol oder Bromide) keine unerwünschten Nebenprodukte bilden und die Reaktion auch wesentlich schneller abläuft, sind die erfindungsgemäßen Oligopeptide besonders vorteilhaft. Die erfindungsgemäßen Oligopeptide entfalten ihre vorteilhafte Wirkung durch Blockierung von Rezeptoren und Liganden, Blockierung der Dimerisation, Hemmung der Enzymaktivität und Hemmung der Interaktion mit anderen Biomolekülen. Hieraus ergibt sich ein neuer Wirkmechanismus mit höherer Effizienz, geringeren Nebenwirkungen sowie neuen Heilungsmöglichkeiten für bis jetzt nicht behandelbare Erkrankungen. Die erfindungsgemäßen Oligopeptide bieten neue pharmazeutische und biomedizinische Anwendungsmöglichkeiten, wie beispielsweise die Entwicklung neuer Medikamente, gezielte Redoxregulation der zellulären Entwicklung, Hemmung des Wachstums von Tumorzellen oder Verbesserung der Wundheilung.

Beispiele für Core-Sequenzen der erfindungsgemäßen Oligopeptide (siehe auch 1 und Seq ID Nr. 1 bis 10):

Derivat 1: -F-P-S ₁-X₃-X₄-C ₂-A-E-D-L-R-K-R-L-C-R-
Derivat 2: -Y-P-C ₁-X₃-X₄-S ₂-A-E-D-L-R-K-R-L-C-R-
Derivat 3: -F-P-A ₁-X₃-X₄-C ₂-A-E-D-L-R-K-R-L-C-R-
Derivat 4: -Y-P-C ₁-X₃-X₄-A ₂-A-E-D-L-R-K-R-L-C-R-

Weitere Beispiele für erfindungsgemäße Oligopeptide zeigen Seq ID Nrn. 1 bis 10.

Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass sowohl die Homodimerisierung als auch die Interaktion von Sulfhydryloxidasen mit Substraten über Disulfidtransferreaktionen am aktiven Zentrum abläuft und dieser Prozess durch die erfindungsgemäßen Oligopeptide durch Inhibition oder Aktivierung reguliert werden kann. Variationen einzelner Aminosäuren in der Oligopeptidsequenz ermöglichen dabei erst die vorteilhaften Reaktionen. Die Erfindung schließt daher alle modifizierten Oligopeptide des beschriebenen Aufbaus mit ein, die aus zwei alpha-Helices bestehen und mindestens einen Cysteinrest enthalten, wobei ein redoxaktives Cystein des Sequenzmotivs CXXC durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Unter "redoxreaktiven" Cysteinresten versteht man erfindungsgemäß dabei diejenigen Reste, die im Verlauf der katalytischen Reaktion einen Zyklus aus Oxidation und Reduktion durchlaufen und dabei eine Disulfidbrücke intern oder extern mit anderen Seitenketten, Proteinen oder Biomolekülen ausbilden, also beispielsweise die Cysteinreste des CXXC-Motivs der Sulfhydryloxidasen.

Die Oligopeptide gemäß der Erfindung können mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden, die eine vollständige Kontrolle der Sequenz und damit auch der Eigenschaften eines bestimmten Peptides erlaubt. Mutationen können sehr einfach unter Verwendung etablierter Standardverfahren in die Aminosäuresequenz eingeführt werden. Die Kürze der Oligopeptide erlaubt ferner die chemische Synthese auch ohne rekombinante DNA-Technologien.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist die andere Aminosäure eine Aminosäure, welche die Ausbildung einer alpha-helikalen Tertiärstruktur zulässt, so dass die vorteilhafte Struktur mit zwei flankierenden alpha-Helices enthalten bleibt. In besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist dabei die andere Aminosäure Serin, das eine geeignete Struktur aufweist und zudem noch redoxaktiv ist, oder Alanin, das zwar nicht redoxaktiv ist, aber dennoch eine geeignete Struktur aufweist und somit die Tertiärstruktur des Oligopeptids nicht wesentlich verändert (vgl. Seq ID Nrn. 1 bis 10).

In weiterer besonders vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung weist das von den alpha-helikalen Bereichen flankierte Sequenzmotiv an seinem N-Terminus zusätzlich die Aminosäure Prolin auf. Prolin bewirkt die Ausbildung eines „Knicks" in der Tertiärstruktur zwischen den beiden alpha-Helices, so dass die für die Funktion der Oligopeptide vorteilhafte Struktur stabilisiert wird.

In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Oligopeptids weist das von den alpha-helikalen Bereichen flankierte Sequenzmotiv an seinem N-Terminus zusätzlich die Aminosäure Phenylalanin und/oder die Aminosäure Tyrosin auf. In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Oligopeptids weist das von den alpha-helikalen Bereichen flankierte Sequenzmotiv an seinem C-Terminus zusätzlich die Aminosäure Alanin auf. Hierdurch entsprechen die erfindungsgemäßen Oligopeptide im Bereich des zentralen X₁X₃X₄X₂-Motivs der Sequenz natürlicher Sulfhydryloxidasen, was sich vorteilhaft auf ihre regulatorische Wirksamkeit auswirkt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Oligopeptide ein Protein- oder Peptidaffinitätsepitop an ihrem N-Terminus und/oder C-Terminus, das eine einfache Detektion und/oder Reinigung der Peptide ermöglicht. Geeignete Epitope sind zum Beispiel das myc-Epitop, das FLAG-Epitop, das His₆-Epitop oder das HA-Epitop.

Die alpha-helikalen Bereiche des erfindungsgemäßen Oligopeptids bestehen vorzugsweise jeweils aus 7 bis 22 Aminosäuren, insbesondere 10 bis 15 Aminosäuren, so dass sie einerseits lang genug sind, um die vorteilhafte Tertiärstruktur auszubilden, und andererseits kurz genug, um eine einfache Synthese zu ermöglichen.

Besonders vorteilhaft sind Oligopeptide, die mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nrn. 1 bis 10 zumindest 90% Homologie aufweisen.

Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle (DNA und RNA), die Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche für die erfindungsgemäßen Oligopeptide kodieren. Bevorzugt sind dabei Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Oligopeptid kodiert, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

a) Isolierte oder künstliche Nukleotidsequenz, welche für die erfindungsgemäßen Oligopeptide kodiert,
b) Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen gemäß a) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet.

Da es aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes möglich ist, bestimmte Codons durch andere Codons zu ersetzen, welche für die gleiche Aminosäure kodieren, ist die Erfindung nicht auf ein spezifisches Nukleinsäuremolekül beschränkt, das ein Oligopeptid gemäß der Erfindung kodiert, sondern schließt alle Nukleinsäuremoleküle ein, die für ein funktionelles Oligopeptid kodieren. Die Erfindung schließt ferner Nukleinsäuremoleküle ein, die sich aufgrund von alternativem Splicing eines gemeinsamen prä-mRNA Moleküls von der als "Wildtyp" anerkannten Sequenz unterscheiden. Derartige Splicing-Mechanismen umfassen die alternative Verwendung von Exons, d.h. Nukleinsäuresequenzen, die für eine Aminosäuresequenz kodieren, die alternative Anordnung von Exons sowie das "nicht-Entfernen" von Introns, d.h. intervenierenden Sequenzen, die normalerweise nicht für eine Aminosäuresequenz kodieren, aus dem mRNA-Molekül.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können "operativ" mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft sein, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen. Ein Nukleinsäuremolekül wird als "fähig zur Expression einer Nukleinsäuresequenz" bezeichnet, wenn es Sequenzelemente umfasst, die Informationen hinsichtlich der Regulation von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente "operativ" mit der das Oligopeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in Prokaryonten aus dem Promotor per se besteht, d.h. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren schließen normalerweise 5' nicht-kodierende Sequenzen ein, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die -35/-10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryonten oder die TATA-Box, CAAT-Sequenzen und 5'-Capping-Elemente in Eukaryonten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten sowie translatierte Signalsequenzen, um die native Polypeptidkette in ein spezielles Kompartiment der Wirtszelle zu dirigieren. Zusätzlich können auch die 3' nichtkodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription, der Polyadenylierung und ähnlichem beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz umfassen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung eine Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz. Geeignete prokaryontische Promotoren sind zum Beispiel der lacUVS-Promotor oder der T7-Promotor. Beispiele für geeignete eukaryontische Promotoren sind der SV40-Promotor oder der CMV-Promotor.

Die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können ferner in einem Vektor oder einem anderen Klonierungsvehikel enthalten sein, wie zum Beispiel Phagen, Phagemiden, Cosmiden, Baculoviren oder künstlichen Chromosomen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen Sequenzen und der Nukleinsäuresequenz, die ein Oligopeptid umfassen, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt, umfassen. Eine große Zahl geeigneter Vektoren, z.B. pBluescript, pUC18, pET oder pcDNA3, ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich.

DNA-Moleküle, die ein Oligopeptid gemäß der Erfindung kodieren, und insbesondere ein Vektor, der die kodierende Sequenz eines solchen Oligopeptids enthält, können in eine Zelle transformiert werden, die zur Expression dieser DNA-Moleküle geeignet ist. Die Transformation kann dabei mit Hilfe etablierter Standardverfahren durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft daher auch eine Zelle, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen dieses enthaltenden Vektor enthält.

Die transformierten Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression der Nukleotidsequenzen, die für ein Oligopeptid gemäß der Erfindung kodieren, geeignet sind. Die verwendeten Wirtszellen können prokaryontischen Ursprungs sein, wie z.B. Escherichia coli (E. coli) oder Bacillus subtilis, oder eukaryontischen Ursprungs, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 oder High5 Insektenzellen, immortalisierte Säugetierzelllinien (z.B. HeLa-Zellen oder CHO-Zellen) oder primäre Säugetierzellen.

Die erfindungsgemäßen Oligopeptide können beispielsweise mittels eines Verfahrens hergestellt werden, dass die folgenden Schritte umfasst:

(a) Klonieren eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls in einen geeigneten Vektor, und
(b) Einbringen des rekombinanten Vektors in eine geeignete Wirtszelle oder einen geeigneten Zellextrakt.

Schritt (a) kann dabei mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, das nur für das Oligopeptid kodiert. Alternativ kann er aber auch mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, in dem das Oligopeptid operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist. Optional kann das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung auch mit einem Fusionspartner verknüpft sein, wie etwa einem Affinitätsepitop, das eine einfache Reinigung und/oder Detektion des rekombinanten Proteins erlaubt. Die Expression der so klonierten Nukleinsäuremoleküle kann in einer rekombinanten Zelle oder einem Zellextrakt erfolgen, die/der alle für die Transkription und Translation erforderlichen Faktoren enthält.

Die Erfindung umfasst ferner ein Kit, welches das Oligopeptid nach der Erfindung, ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, einen dieses enthaltenden Vektor und/oder zumindest eine Zelle, wie oben beschrieben, enthält.

Die Erfindung umfasst weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche das Oligopeptid nach der Erfindung, ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül und/oder einen dieses enthaltenden Vektor, sowie vorzugsweise übliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe, enthält. Die Zusammensetzung kann dabei ausschließlich Oligopeptide umfassen, aber auch weitere enzymatisch aktive Proteine enthalten, wie z.B. Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Lysyloxidasen, Tyrosinoxidasen, Hemicellulasen oder Glucoseoxidasen. Ferner kann die Zusammensetzung je nach Verwendungszweck auch Trägerstoffe (z.B. Stärke, Laktose, Gelatine, Fette, Wachse, Öle oder Polyole), verschiedenen Zusatzstoffe (etwa Füllstoffe, Stabilisierungsmittel, Emulgiermittel oder Konservierungsmittel, Puffersubstanzen, Lösungsmittel oder Lösungsvermittler) oder Transportvehikel umfassen. Die Zusammensetzung kann in fester Form vorliegen, z.B. lyophilisiert oder kristallin, oder aber gelöst, z.B. als Suspension oder Emulsion.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Oligopeptid zur Regulation der biologischen Aktivität zellulärer Biomoleküle, insbesondere zellulärer Sulfhydryloxidasen, sowie zur Blockierung zellulärer Rezeptoren oder Liganden verwendet.

Die Erfindung umfasst ferner die Verwendung eines Oligopeptids, welches mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nrn. 11 bis 15 zumindest 90% Homologie aufweist, zur Regulation der biologischen Aktivität zellulärer Biomoleküle, insbesondere zellulärer Sulfhydryloxidasen, sowie die Verwendung eines Oligopeptids, welches mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nr. 11 bis 15 zumindest 90% Homologie aufweist, zur Blockierung zellulärer Rezeptoren oder Liganden. Für die genannten Verwendungen können in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung neben den erfindungsgemäßen Oligopeptiden also auch Oligopeptide eingesetzt werden, die ein zentrales CXXC-Motiv enthalten, d.h. bei denen kein Cystein aus dem redoxaktiven Zentrum durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Solche Oligopeptide sind insbesondere dann vorteilhaft verwendbar, wenn die Wirkung der Sulfhydryloxidasen verstärkt werden soll.

Die Oligopeptide der Erfindung können beispielsweise klinisch bei der Entwicklung diagnostischer Reagenzien und Testsysteme eingesetzt werden. Zum Beispiel ist reduziertes Glutathion ein essentieller Cofaktor der intrazellulären Signalübertragung, der Steuerung von Apoptose und Nekrosenbildung sowie der Modulation der Fragilität roter Blutkörperchen. Auch als Antioxidationsmittel ist es von großer Bedeutung. Die dabei stattfindende Oxidation zu Disulfidglutathion schützt u.a. das vaskuläre Endothel vor einer Schädigung durch freie Radikale. Die gezielte Steuerung bzw. der Nachweis einer erfolgten Disulfidbrückenbildung durch die erfindungsgemäßen Oligopeptide kann daher für die Diagnose oder die Therapie einer Reihe von Krankheiten vorteilhaft sein.

Die Erfindung wird im weiteren durch die folgenden Figuren beispielhaft näher erläutert.

Es zeigt:

1 die Grundstruktur und den Aufbau verschiedener Varianten der erfindungsgemäßen Oligopeptide,

2 ein Modell der Tertiärstruktur der erfindungsgemäßen Oligopeptide,

3 ein Schema zum Funktionsprinzip der erfindungsgemäßen Oligopeptide,

4 ein Diagramm der Enzymaktivität eines intakten 15 kDa Proteinfragmentes, eines mutierten CXXS Fragmentes und Mischungen aus beiden, und

5 eine Western-Blot-Analyse eines 15 kDa Alrp-6H-Fragments mit CXXC-Motiv und einer Mutante mit CXXS-Motiv.

1 zeigt Beispiele für die Grundstruktur und den Aufbau der Oligopeptide in Form zweier beispielhafter Varianten, die ein SXXC- bzw. CXXS-Motiv enthalten. Zwei kurze alpha-Helices (als Zylinder dargestellt) sind durch ein modifiziertes CXXC-Motiv verbunden. Die Derivate 1 und 2 zeigen dabei Varianten mit dem Austausch eines definierten Cysteinrests durch Serin. In der Darstellung ist C ein Cystein, S ein Serin und X eine beliebige Aminosäure, bevorzugt aber eine solche, die die Ausbildung einer alpha-Helix erlaubt. Zur Exponierung des redoxaktiven Cysteins für den nukleophilen Angriff zur Übertragung der Disulfidbrücke ist die Unterbrechung der alpha-Helix durch einen Prolinrest (P) vorteilhaft.

2 zeigt ein Modell der Tertiärstruktur der erfindungsgemäßen Oligopeptide, mit dem redoxaktiven X₁X₃X₄X₂-Motiv gemäß der Erfindung. Entscheidend ist der Aufbau in Form zweier alpha-Helices in deren Mitte das exponierte X₁X₃X₄X₂-Motiv liegt.

3 zeigt ein Schema zum Funktionsprinzip der Oligopeptide, aus dem die unterschiedlichen Wirkungen der erfindungsgemäßen Oligopeptide hervorgehen. Beispielsweise bewirken die Oligopeptide mit dem CXXC-Motiv eine reversible Bindung an entsprechende komplementäre Sequenzen, während die erfindungsgemäßen Oligopeptide mit dem X₁X₃X₄X₂-Motiv zu einer irreversiblen Bindung führen. Durch die erfindungsgemäßen Oligopeptide kann also die Dimerisierung von Sulfhydryloxidasen verhindert und ferner die katalytische Aktivität dieser Enzyme gehemmt werden.

4 zeigt ein Diagramm der Enzymaktivität eines intakten 15 kDa Proteinfragmentes, eines mutierten CXXS Fragmentes und Mischungen aus beiden. Die Enzymaktivität wurde mit 5pMol des 15 kDa Proteinfragmentes und DTT (Dithiothreitol) als Substrat gemessen und als Umsatzzahl pro Minute (Turn over) angegeben. Es wurden mindestens drei unabhängige Messungen durchgeführt. Der Mittelwert der Messungen ist jeweils als Zahl aufgeführt. Die Standardabweichung der Messungen ist bei jedem Balken des Diagramms eingefügt. Die Zugabe von mutiertem CXXS-Proteinfragment, das keine katalytische Aktivität zeigt, inhibiert das intakte Enzym, da sich Heterodimere aus defekten und intakten Enzymuntereinheiten bilden (vgl. 3). Mit zunehmender Menge an defekten Untereinheiten nimmt auch die Inhibition zu, da immer weniger intakte Homodimere gebildet werden können.

5 zeigt eine Western-Blot-Analyse des Alrp-6H 15kDa-Fragments mit CXXC-Motiv (und einer Mutante mit CXXS-Motiv jeweils mit und ohne Reduktionsmittel (DTT = Dithiothreitol)). Es wurden jeweils Aliquots von 100 μg Protein/Probe aufgetragen. Der Nachweis erfolgte über Antikörper gegen Alrp und Chemilumineszenz. Es zeigt sich, dass durch die Modifikation des CXXC-Motivs durch Austausch eines Cysteins gegen ein Serin die Fähigkeit zur Dimerisierung bzw. Multimerisierung ausgeschaltet werden kann und somit die entsprechenden erfindungsgemäßen Oligopeptide ihre regulatorischen Eigenschaften erhalten.

Referenzen:

[1] Nakamura, H. et al. (1997) Ann. Rev. Immunol. 15, 351-369.
[2] Langouet, S. et al. (2000) Chem. Res. Toxicol. 4, 245-252.
[3] Edwards, B.S. et al. (1995) Blood. 86, 2288-2301.
[4] Chivers, P.T. et al. (1999) Biochemistry 36, 4061-4066.
[5] Wang, G., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 11469-11472.
[6] Thorpe, C. et al. (2002) Arch. Biochem. Biophys. 405, 1-12.
[7] Klissenbauer, M. et al. (2002) J. Exp. Biol. 205, 1979-1986.
[8] Hoober, K.L. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 22147-22150.
[9] Hoober, K.L. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 31759-31762.
[10] Lee, J.E. et al. (2000) FEBS Lett. 477, 62-66.
[11] Raje, S. and Thorpe, C. (2003) Biochemistry 42, 4560-4568.
[12] Lisowsky, T. (1992) Mol. Gen. Genet. 232, 58-64.
[13] Lisowsky, T. et al. (1995). Genomics 29, 690-697.
[14] Giorda, R. (1996) Mol. Med. 2, 97-108.
[15] Lange, H. et al. (2001) EMBO Rep. 2, 715-720.
[16] Coppock, D.L. et al. (1998) Genomics 54, 460-468.
[17] Hofhaus, G. (2003). Euro. J. Biochem. 270, 1528-1535.
[18] Gross, E. et al. (2002) Nat. Struct. Biol. 9, 61-67.
[19] Wu, C.-K. et al. (2003) Prot. Sci. 12, 1109-1118.
[20] Lisowsky, T. et al. (2001) Digest Liver Dis 33, 173-180.
[21] Polimero, L. et al. (2000) Digest Liver Dis 32, 217-225.
[22] Polimero, L. et al. (2000) Digest Liver Dis 32, 510-517.
[23] Chen, X., et al.(2003) J. Biol. Chem. 278, 49022-49030.
[24] Benayoun, B. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 13830-13837.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligopeptid mit zumindest einem Cysteinrest und zwei alpha-helikalen Bereichen, welche ein Sequenzmotiv mit der Aminosäuresequenz X₁X₃X₄X₂ flankieren, wobei eine der Aminosäuren X₁ und X₂ Cystein und die andere der Aminosäuren X₁ und X₂ eine andere Aminosäure ist, und wobei X₃ und X₄ beliebige Aminosäuren sind.
Oligopeptid nach Anspruch 1, wobei die andere Aminosäure eine Aminosäure ist, welche die Ausbildung einer alpha-helikalen Tertiärstruktur zulässt.
Oligopeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die andere Aminosäure Serin oder Alanin ist.
Oligopeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das von den alpha-helikalen Bereichen flankierte Sequenzmotiv an seinem N-Terminus zusätzlich die Aminosäure Prolin aufweist.
Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das von den alphahelikalen Bereichen flankierte Sequenzmotiv an seinem N-Terminus zusätzlich die Aminosäure Phenylalanin und/oder die Aminosäure Tyrosin aufweist.
Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das von den alphahelikalen Bereichen flankierte Sequenzmotiv an seinem C-Terminus zusätzlich die Aminosäure Alanin aufweist.
Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei dieses ein Protein- oder Peptidaffinitätsepitop an seinem N- und/oder C-Terminus aufweist.
Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die alpha-helikalen Bereiche jeweils aus 7 bis 22 Aminosäuren, vorzugsweise 10 bis 15 Aminosäuren, bestehen.
Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei dieses mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nrn. 1 bis 10 zumindest 90 Homologie aufweist.
Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Oligopeptid kodiert, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Isolierte oder künstliche Nukleotidsequenz, welche für das Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert, b) Nukleotidsequenz, welche sich von den Nukleotidsequenzen gemäß a) durch den Austausch zumindest eines Codons gegen ein synonymes Codon unterscheidet.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10, wobei das Nukleinsäuremolekül operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 11, wobei die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz und/oder eine Transkriptionsterminationssequenz umfasst.
Vektor zur Expression eines Oligopeptids in einer geeigneten Zelle, wobei dieser das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10, 11 oder 12 in exprimierbarer Form enthält.
Zelle, welche das Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10, 11 oder 12 und/oder den Vektor nach Anspruch 13 enthält.
Kit, welches das Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10, 11 oder 12, den Vektor nach Anspruch 13 und/oder zumindest eine Zelle nach Anspruch 14 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche das Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 10, 11 oder 12 und/oder den Vektor nach Anspruch 13, sowie vorzugsweise übliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe, enthält.
Verwendung des Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Regulation der biologischen Aktivität zellulärer Biomoleküle, insbesondere zellulärer Sulfhydryloxidasen.
Verwendung des Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Blockierung zellulärer Rezeptoren oder Liganden.
Verwendung eines Oligopeptids, welches mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nrn. 11 bis 15 zumindest 90% Homologie aufweist, zur Regulation der biologischen Aktivität zellulärer Biomoleküle, insbesondere zellulärer Sulfhydryloxidasen.
Verwendung eines Oligopeptids, welches mit einer der Aminosäuresequenzen gemäß Seq ID Nrn. 11 bis 15 zumindest 90% Homologie aufweist, zur Blockierung zellulärer Rezeptoren oder Liganden.