WO2004069233A1 - 乳癌耐性蛋白阻害剤 - Google Patents

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WO2004069233A1
WO2004069233A1 PCT/JP2004/001054 JP2004001054W WO2004069233A1 WO 2004069233 A1 WO2004069233 A1 WO 2004069233A1 JP 2004001054 W JP2004001054 W JP 2004001054W WO 2004069233 A1 WO2004069233 A1 WO 2004069233A1
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hydrogen atom
bcrp
cells
compound
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PCT/JP2004/001054
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Ryuta Yamazaki
Yukiko Nishiyama
Tomio Furuta
Takeshi Matsuzaki
Hiroshi Hatano
Sachiko Matsumoto
Ritsuo Aiyama
Oh Yoshida
Masato Nagaoka
Shusuke Hashimoto
Yoshikazu Sugimoto
Original Assignee
Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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Definitions

  • the present invention relates to a breast cancer resistance protein (BCRP) inhibitor and an SN-38 resistant cancer cell useful for screening for a BCRP inhibitor.
  • BCRP breast cancer resistance protein
  • the drug-transporting protein P-glycoprotein encoded by the MDR1 gene discovered in the 1970's can overcome multidrug resistance by producing cross-resistance to multiple anticancer drugs with different chemical structures and mechanisms of action. It has been a potential target molecule for drugs.
  • P-glycoprotein alone cannot explain the mechanism of resistance to anticancer drugs, and there is a need for the development of new drug-overcoming agents that target new drug transport proteins.
  • BCRP breast cancer resistance protein
  • ABS ATP-binding cassette
  • BCRP has only one ATP-binding cassette in its structure, and is structurally different from P-glycoprotein and other drug transport proteins that have two ATP-binding cassettes.
  • BCRP is a topoisomerase such as irinotecan hydrochloride (CPT-11) or topotecan I It is deeply involved in the mechanism of resistance to inhibitors and topoisomerase II inhibitors such as mitoxantrone.
  • BCRP does not act on paclitaxel or pink listin excreted by P-glycoprotein, and CPT-11 and SN-38 (CPT-11 (Cancer Res. 59, 5938-5946 (1999)) and has been shown to have a different substrate specificity from P-glycoprotein. Furthermore, it has been suggested that BCRP is involved in the limitation of the bioavailability of orally administered anticancer drugs (J. Clin. Oncol. 20, 2943-2950 (2002)). Based on these facts, drugs that inhibit BCRP are expected to exert an effect of overcoming the resistance of anticancer drugs that could not be overcome by conventional resistance overcoming drugs, and also to improve the bioavailability of anticancer drugs, Its development is desired.
  • An object of the present invention is to provide a cancer cell useful for screening a BCRP-inhibiting drug and a BCRP-inhibiting drug. Disclosure of the invention
  • A549 cells which are cancer cells derived from human non-small cell lung cancer
  • BCRP flaponoid compounds represented by the following formulas (1), (2), (3), (4) or (5)
  • they have found that they have an inhibitory effect, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following formula (1), (2), (3), (4) or (5):
  • R 2 s may be the same or different, and represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a lower alkoxy group, a lower alkyl group. , a lower alkenyl group or showing a sugar residue, or be substituted with a lower alkyl group together with the adjacent R t rather it may also be formed a good pyran ring
  • R 3 is a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, It represents a lower alkyl group, a lower alkoxy group, an amino group or a nitro group.
  • R 4 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, a lower alkoxy group, a lower alkyl group or a lower alkenyl group
  • seven R 5 s may be the same or different
  • a hydrogen atom, a hydroxyl group, a lower Represents an alkoxy group or a lower alkyl group, or two adjacent groups R 5 together may form a pyran ring which may be substituted with a lower alkyl group
  • R 6 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, a lower alkoxy group, a lower alkyl group, an amino group or a nitro group. Show. ]
  • R 7 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, a lower alkoxy group or a lower alkyl group
  • two R 8 s may be the same or different, and represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a lower alkoxy group or a lower alkyl group.
  • R 9 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom or a lower alkoxy group
  • five R 1 (s) may be the same or different and represent a hydrogen atom, a hydroxyl group or a lower alkoxy group.
  • R l2 represents a hydrogen atom or a lower alkenyl group
  • R 13 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 14 represents a hydrogen atom.
  • a BCRP inhibitor comprising a flaponoid compound represented by the formula or a glycoside, ester or salt thereof as an active ingredient, an agent for overcoming an anticancer drug resistance to a cancer that has acquired resistance associated with BCRP, or expressing BCRP and having a low resistance to an anticancer agent It is intended to provide an agent for overcoming anticancer drug resistance to sensitive cancer.
  • the present invention also provides an anticancer agent containing the above BCRP inhibitor and an anticancer agent that can be a substrate of BCRP.
  • R 15 represents an amino group or a nitro group.
  • the present invention provides SN-38 resistant human non-small cell lung cancer A549 cells that highly express BCRP. ' BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a graph showing the degree of A549 / SN-38-4 cell acquisition of resistance to SN-38 (A) and mitoxantrone (B).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of analysis of mRNA expression of various drug transport proteins in A549 cells and A549 / SN-38 cells by RT-PCR.
  • FIG. 3 shows the results of quantitative analysis of BCRP (A) and MRP2 (B) mRM expression in A549 cells and A549 / SN-38 cells by real-time RT-PCR.
  • FIG. 4 is a graph showing the accumulated amounts of SN-38 (A) and SN-38 glucuronide conjugate (B) in A549 cells and A549 / SN-38-4 cells.
  • FIG. 3B is a view showing the overcoming action of 3-4 (E) and compound 3-6 (F)].
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of a flaponoid compound on increasing SN-38 accumulation in P388 / BCRP cells.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of flavonoid compounds on increasing SN-38 accumulation in MCF-7 cells.
  • Human non-small cell lung cancer A549 cells are known to be easy to culture, can be transplanted into mice, and have high sensitivity to SN-38, the active form of CPT-11. (J. Clin. Inves t. 101, 1789-1796 (1998)). By continuously culturing the A549 cells while gradually increasing the SN-38 concentration in the medium, SN-38 resistant A549 cells were established. The obtained SN-38 resistant A549 cells, as shown in the Examples below, overexpress BCRP and have acquired resistance by reducing intracellular accumulation of SN-38. Useful for screening. SN-38 resistant A549 cells Can be used for in vitro screening, and can also be used for in vivo screening by transplantation into mice.
  • the flaponoid compound of the present invention includes a flavone derivative represented by the above formula (1), a flavanone derivative represented by the formula (2), a chalcone derivative represented by the formula (3), an isoflavone derivative represented by the formula (4), or It is a flavonoid derivative represented by the formula (5).
  • the lower alkoxy group represented by preferably has 1 to 4 carbon atoms, and particularly preferably a methoxy group.
  • the lower alkyl group as preferably has 1 to 4 carbon atoms, and particularly preferably is a methyl group.
  • the lower alkenyl group as R 2 , R 4 or R 12 in the formulas (1), (2) and (5) preferably has 2 to 5 carbon atoms, particularly 3-methyl-1 or 2- Butenyl groups are preferred.
  • the halogen atom include a fluorine, chlorine, bromine and iodine atom, and a chlorine or bromine atom is preferable.
  • the pyran ring formed by adjacent R t and R 2 may be substituted with a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, particularly a methyl group.
  • two adjacent R 5 forming a pyridine ring are preferably on a dihydrobenzozopyran ring.
  • the pyran ring formed by two adjacent R 5 may be substituted with a lower alkyl group having 14 to 14 carbon atoms, particularly a methyl group.
  • R 15 is a nitro group (2′-nitro-4,, 5,5 ′, 6,7,8-hexamethoxyflavone)
  • R 15 is Compounds that are amino groups (2'-amino-4,5,5 ', 6,7,8-hexamethoxyflavone) are also called V-aminonobiletin, and all are new compounds.
  • the above-mentioned flavonoid compounds also include glycosides to which sugars such as iS-D-darcoside are added.
  • pharmacologically, sodium, potassium, hydrochloride, etc. Acceptable salts can be formed and such salts are also included in the present invention.
  • lower fatty acids such as acetic acid, propionic acid, lactic acid, and butyric acid can be added to form a pharmacologically acceptable ester, and such an ester is also included in the present invention.
  • the flaponoid compound may exist in the form of a solvate such as a hydrate, and the solvate is also included in the present invention. Further, each isomer and a mixture thereof are also included in the present invention.
  • the origin of the flavonoid compound of the present invention is not particularly limited, and may be of plant origin, chemically synthesized product or semi-synthetic product.
  • the roots, stems, leaves, fruits, and Z or flower parts of plants may be prepared from water, methanol, lower alcohols such as ethanol, or acetone.
  • a hydrophobic organic solvent such as a supercritical fluid
  • a water-soluble organic solvent such as methanol.
  • Power the roots, stems, and / or leaves are shredded or ground, and mixed with a lower alcohol such as methanol. It is preferred to extract.
  • the flaponoid compound of the present invention can be isolated by fractionating and purifying the obtained extract using column chromatography or the like.
  • the flaponoid compound of the present invention can be administered as it is, Within a range that does not reduce the amount of powder, liquid dispersion, capsules, suspensions, emulsions, syrups, elixirs, etc. It can be used in the form of oral preparations such as granules, pills, tablets, troches and limonade, or injections.
  • Such carriers include water-soluble monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides such as mannitol, lactose and dextran; gel-forming or water-soluble such as hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethylcellulose and methylcellulose.
  • Cellulosics for example, crystalline cellulose, Q!
  • -Cellulose cross-linking ability
  • Water-absorbing and poorly water-soluble celluloses such as lipoxymethylcellulose sodium, and derivatives thereof; for example, hydroxypropyl starch, potassium propyloxymethyl starch, cross-linking
  • Water-absorptive and poorly water-soluble polysaccharides such as starch, amylose, mycobacterial pectin, pectin and derivatives thereof; water-absorbable and poorly water-soluble polysaccharides such as gum arabic, tragacanth gum, daricommannan and their derivatives Gums, eg polivi
  • Crosslinked vinyl polymers such as rupyrrolidone, crosslinked polyacrylic acid and salts thereof, crosslinked polyvinyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate and derivatives thereof; lipids forming ribosomes such as phospholipids and cholesterol; Can be mentioned.
  • a solubilization treatment can be performed.
  • a solubilization treatment a method that can be generally applied to pharmaceuticals, for example, surface activity of polyoxyethylene alcohol ethers, polyoxyethylene acyl esters, sorbitan acyl esters, polyoxyethylene sorbitan acyl esters, etc. And a method using a water-soluble polymer such as polyethylene dalicol. If necessary, a method of forming a soluble salt, a method of forming an inclusion compound using cyclodextrin, or the like can be used. The method of the solubilization treatment can be appropriately changed depending on the desired flavonoid compound.
  • BCRP inhibitors are used for cancers that have acquired BCRP-related resistance through administration of anticancer drugs. It can be used as an anticancer drug resistance overcoming agent. In addition, BCRP naturally expresses BCRP and can be used as an anticancer drug effect enhancer for cancers with low sensitivity to anticancer drugs.
  • anticancer drug that is a target of the anticancer drug-resistance overcoming agent and the anticancer drug effect enhancer containing a BCRP inhibitor as an active ingredient, as long as it is an anticancer drug that can be a substrate of BCRP.
  • irinotecan hydrochloride / CPT-11 active substance
  • Topoisomerase I inhibitors such as SN-38
  • topotecan topoisomerase II inhibitors
  • mitoxantrone such as SN-38
  • doxorubicin daunorubicin
  • bisanthrene etoposide
  • antifolates such as methotrexate.
  • the dose of the BCRP inhibitor of the present invention may be appropriately adjusted according to the administration method, the symptoms of the patient, and the like.Adults should be administered at a dose of lmg to 10g, more preferably 100mg to 10g, particularly 500mg to 10g per day. Is preferred.
  • the ratio of the anticancer agent to the BCRP inhibitor is not particularly limited, and the preferred range varies depending on the type of the anticancer agent and the inhibitor used.For example, when irinotecan hydrochloride is used as the anticancer agent, the anticancer agent: BCRP inhibitor It is preferable that the ratio of the agent is 1: 1-1: 500 in terms of weight, particularly 1: 1-1: 100, and more preferably 1: 1-1: 10.
  • Table 1 Table 2, Table 3, Table 4, and Table 5 show specific examples of the flavonoid compound used in the present invention.
  • Example 1 Isolation of 3 ', 5-dihydroxy-4', 6,7-trimethoxyflavone (compound 1-6)
  • the C6 fraction (100.1 mg) eluted with a hexane-ethyl acetate mixed solution (2: 1) was subjected to high performance liquid chromatography CMightysil RP-18 GP, 6.OX 250 mm, acetonitrile-water (45:55) mixture As a result, a fraction having a peak at a retention time of 15.2 minutes was obtained.
  • the C6 fraction was recrystallized from a mixed solution of chloroform and methanol (1: 1) to obtain 47.9 mg of compound 1-6.
  • the analysis results of this compound are as follows.
  • Example 2 Isolation of 5,4'-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone (compound 1-19) 500 g of Intinko (Inchinko) obtained from Takasago Pharmaceutical Co., Ltd. was refluxed with methanol for 2 hours. The extract was dried under reduced pressure. 5.07 g of the resulting extract (40.1 g) was spread on silica gel and eluted with hexane by medium pressure chromatography (A fraction), and then eluted with a hexane-ethyl acetate (4: 1) mixed solution ( The fraction B was eluted with ethyl acetate (fraction C), and further eluted with methanol (fraction D). The obtained C fraction
  • the solid obtained was the previous crystal and ⁇ , silica gel column chromatography [manufactured by Kanto Chemical Co., Si0 2, hexane - acetic E Ji Le (1: 1) eluting with] were fractionated by.
  • the desired fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to give 2′-nitro-4 ′, 5,5 ′, 6,7,8-hexamethoxyflavone (yield 326 mg: 35%).
  • the ethyl acetate layer was washed with 70 ml of saturated saline and dried over anhydrous magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off and washed with ethyl acetate, the ethyl acetate layer was concentrated to dryness under reduced pressure. The obtained solid is subjected to silica gel column chromatography [Kanto Ka Manabu made Si0 2, hexane - acetic acid Echiru (1: 1) was fractionated by eluting] in. The desired fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to give 2′-amino-4 ′, 5,5 ′, 6,7,8-hexamethoxyflavone (yield 66 mg: 52%).
  • Example 7 3,3 ', 4', 5,6,7,8-heptamethoxyflavone (compounds 1-24) and
  • Example 8 Isolation of 5-hydroxy-1,6-, 7-dimethoxyflavone-1'-darcoside (Compound 1-26)
  • Example 10 4H, 8H-benzo [1,2-b: 3,4-b ';] dipyran-1-4-one, 2- (2,4-dihydroxyphenyl) -1-5-hydroxy-1,8 —Dimethyl-3— (3-Methyl_2-bute Nyl) (Isolation of compound 1-28)
  • the C4 fraction (217 mg) eluted in the mouth form was subjected to high performance liquid chromatography (Mightysil RP-18 GP, 6.0X 250 mm, Analysis was performed with ril-water (eluted with a 70:30 mixed solution), and a peak with a retention time of 9.8 minutes (compound 1-28) was collected.
  • the analysis results of this compound are as follows.
  • Example 11 Isolation of 1: 2,2,4 ', 5-trihydroxy-7-methoxy-6_ (3-methyl-1-butenyl) -13- (3-methyl-2-butenyl) -flavone (compound 29) Metabolize 169 g of Thai-produced Jack Fruit Tree (Artocarpus heterophyl lusDi $ V) The extract was extracted at room temperature for one week, and the extract was dried under reduced pressure. 4.7 g of the resulting extract (8.1 g) was eluted with hexane by medium pressure chromatography (Fraction A), and then eluted with a hexane-ethyl acetate (4: 1) mixed solution (B fraction). Subsequently, it was eluted with ethyl acetate-fraction (fraction C) and further eluted with methanol (fraction D).
  • the C4 fraction (217 mg) eluted in the pore form was analyzed by high performance liquid chromatography (Mightysil RP-18 GP, 6.0X250 ram, eluted with a mixture of acetonitrile-water (70:30)). The peak at a retention time of 8.5 minutes (compound 1-29) was collected.
  • the analysis results of this compound are as follows.
  • the obtained B fraction (1.2 g) was analyzed by high performance liquid chromatography (Mightysil RP-18 GP, 6.0X 250 mm, eluted with a mixed solution of acetonitrile-water (70:30)). The retention time was 15.2 minutes. The fraction showing the peak of was obtained.
  • the analysis results of this compound are as follows.
  • Extract 8 obtained.
  • 1 g 4.7 g was eluted with hexane by medium pressure chromatography (fraction A), and then eluted with a hexane-ethyl acetate (4: 1) mixed solution (fraction B).
  • -Ethyl was eluted (fraction C) and further eluted with methanol (fraction D).
  • the obtained C fraction 3.1 ⁇ 2 was eluted with chloroform through monitoring at 254 nm by medium pressure silica gel column chromatography, and then a chloroform-methanol (98: 2) mixed solution.
  • a mixed solution of 1), (9: 1), (4: 1), (2: 1), (1: 1) and methanol was eluted in this order to obtain 10 fractions.
  • the C3 fraction eluted with chloroform was analyzed by high performance liquid mouth chromatography (Migtysil RP-18 GP, 6.0X 250 thigh, eluted with a mixture of acetonitrile-water (70:30)), retention time 10.8 minutes The peak of (Compound 5-1) was collected.
  • Example 14 Establishment of SN-38 resistant A549 cells
  • Human non-small cell lung cancer A549 cells were prepared using Ham's F-12 medium (10% FBS / Ham's F-12) containing 10% FBS, 100 U / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin. They were subcultured in 5% C0 2, 37 ° C conditions. SN-38 resistant A549 cells were selected by subculturing A549 cells for 2 months by gradually increasing the SN-38 concentration in the medium (4-10 ng / ml). Furthermore, cloning was performed by limiting dilution from the SN-38 resistant A549 cells, and 6 cloned SN-38 resistant A549 cells (A549 / SN-38-1 to 6) were established.
  • Example 15 A549 / SN-38 cell anticancer drug sensitivity test
  • the IC5Q value is the concentration of an anticancer drug that inhibits cell proliferation by 50%.
  • the relative degree of resistance was IC 5 in A549 / SN-38 cells.
  • IC 5 that put the value in A549 cells. This value is divided by the value, and the higher the value, the higher the resistance acquisition.
  • A549 / SN-38 cells showed particularly strong resistance to BCRP substrates SN-38 and mitoxantrone.
  • Example 16 RT-PCR analysis of A549 / SN-38 cells
  • Total RNA was extracted from the cells using an RNA extraction reagent [IS0GEN (trade name), manufactured by Futatsu Gene], and RT-PCR reagents [Ready-To "Go RT-PCR Beads (trade name), Amersham Pharmacia” RT-PCR using Biotech (manufactured by Amersham Pharmaciabietech) and Thermocycler [manufactured by iCycler (trade name), Bio, RAD (BI0-RAD)] according to the attached procedure.
  • Total RNA 0.5 g
  • the PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel, stained with ethidium umide, and detected with a transilluminator.
  • RT-PCR results are shown in Fig. 2 and the real-time RT-PCR results are shown.
  • the results are shown in Figure 3.
  • BCHP expression was significantly increased in all six A549 / SN-38 cells compared to A549 cells, while the expression level of MRP2 using SN-38 as a substrate as in BCRP. No significant differences were found in the expression levels of other drug transport proteins between A549 cells and A549 / SN-38 cells. -38 may be involved in anticancer drug resistance mechanism Was instigation.
  • BCRP expression was also confirmed BCRP expression in human breast cancer MCF 7 cells.
  • topoisomerase-1 in addition to the expression of drug-transporting protein, the expression of topoisomerase-1, topoisomerase-11, Beto 2, Bax and I ⁇ was analyzed by Western blot for topoisomerase-1 activity. DM relaxation response was examined as an index, but these were A549 / SN-38 cells resistant to anticancer drugs. No data was suggested to implicate the mechanism.
  • Example 17 A549 / SN-38 cell accumulation of anticancer drug
  • SN-38 DMS0 solution 1 1 (final concentration: 300 ng / ml) in 1 ml of 10% FBS / RPMI 1640 suspended A549 cells or A549 / SN-38-4 cells (4 x 10 6 cel ls / ml) was added and incubated at 37 ° C for 60 minutes, followed by centrifugation (2 ° C, 1,400 X g, 1 min) to remove the supernatant. The precipitated cells were resuspended by adding ice-cold PBS, and centrifuged (2 ° C, 1,400 Xg, 1 min) to wash the cells. After performing this washing operation one more time, PBS 375 xl was added thereto to destroy the cells by ultrasonic treatment.
  • Example 18 Effect of flavonoid compound on the resistance of A549 / SN-38 cells to anticancer drugs
  • A549 cells or A549 / SN- 38- 4 cells were suspended in 10% FBS / Ham 's F- 12, 96 Ueru microplate seeding cultured in 5% C0 2, 37 ° C under conditions (2 10 3 ce lls / 50 l / we ll). After chromatography ⁇ culture, flavonoid compounds and SN - 38 dissolved 10% FBS / H am 's F- 12 respectively 25 1, and the mixture was incubated for 48 hours at 5% C0 2, 37 ° C conditions. After the culture, the number of viable cells was measured using TetraColor ONE according to the attached operation procedure. EC 5 resistance overcoming effect of each Furaponoido compounds in Table 7. Indicated by value. In addition, EC 5.
  • the value is the concentration of the flavonoid compound at which the relative tolerance is reduced by 50%.
  • the flavonoid compound showed a strong overcoming effect on SN-38 resistance of A549 / SN-38-4 cells.
  • the flaponoid compound itself did not affect the growth of A549 cells and A549 / SN-38-4 cells in the concentration range that overcomes the resistance in a concentration-dependent manner. This result suggests that the flaponoid compound of the present invention inhibits BCRP and overcomes anticancer drug resistance of cancer cells.
  • Example 20 Effect of flaponoid compound on anticancer drug resistance of human BCRP transgenic mouse leukemia P388 cells
  • Mouse leukemia ⁇ 88 cells or human BCRP transgenic P388 cells (P388 / BCRP cells, obtained from Yoshikazu Sugimoto, Cancer Chemotherapy Center, Cancer Society of Japan) suspended in 10% FBS / RPMI 1640 96-well microphone plate after seeding in (1 X 10 4 cel ls / 50
  • Example 21 Effect of flavonoid compound on multidrug resistance of MES-SA / DX5 cells Human uterine cancer MES-SA cells or MES-SA / Dx5 cells which overexpressed P-glycoprotein and acquired multidrug resistance (Cancer Res. 45, 4091-4096 ( 1985)) was suspended in 10% FBS / DMEM, and cultured in 5% C0 2, 37 ° C conditions, were seeded in 9 6-well microphone opening plate (3 X 10 3 ce l ls / 50 ⁇ I / wel l).
  • Furaponoido compound and paclitaxel dissolve the the 10% FBS / DMEM, respectively 25, and the mixture was incubated for 48 hours at 5% C0 2, 37 ° C conditions. After the culture, the number of viable cells was measured using TetraColor ONE according to the attached operation procedure. The effect on multidrug resistance of each Furabonoido compound shown by the EC 5Q values in Table 9. In addition, EC 5. The value is the concentration of the flavonoid compound at which the relative tolerance is reduced by 50%. As a result, flavonoid compounds did not affect paclitaxel resistance of MES-SA / Dx5 cells in the concentration range examined.
  • the flavonoid compound itself did not affect the proliferation of MES-SA cells and HES-SA / DX5 cells.
  • the results showed that the flavonoid compound of the present invention did not act on P-glycoprotein and had specificity for BCRP.
  • Table 9 Compounds Overcoming resistance
  • P388 cells and P388 / BCRP cells (1 10 7 cel ls / ml ), or MCF-7 cells (3 x 10 6 cel ls / ml)
  • Furaponoido compound 10% FBS / RPMI 1640 1ml was suspended and SN - 38 (Final concentration: 500 ng / ml), incubated at 37 ° C for 60 minutes, and centrifuged (2 ° C, 1,400 X g, 1 min) to remove the supernatant. After ice-cold 10% FBS / RPMI 1640 was added to the precipitated cells and resuspended, the cells were washed by centrifugation (2, 1, 400 xg, 1 min).
  • PBS 3751 was added and the cells were disrupted by sonication.
  • methanol 3751 and 15 l of a 10% zinc sulfate solution were added, stirred, and then centrifuged (2 ° C, 12,500 X g, 5 min) to collect a supernatant.
  • the amount of SN-38 in the supernatant was measured using a microplate fluorometer (SN-38: The excitation wavelength was 380 nm and the measurement wavelength was 560 nm), and the amount accumulated in the cells was calculated.
  • the flaponoid compound of the present invention was accumulated in SN388 cells of P388 / BCRP cells. Increased capacity. Further, as shown in FIG. 7, the flaponoid compound of the present invention increased the amount of SN-38 accumulated in MCF-7 cells. This result suggests that the flavonoid compound of the present invention inhibits BCKP and increases the amount of an anticancer agent taken up into cells.
  • Example 23 Effect of overcoming anticancer drug resistance of flaponoid compounds in vivo
  • P388 cells or P388 / BCRP (1 ⁇ 10 6 cells / mouse) were transplanted intraperitoneally into 6-week-old CDF, strain, female mice (5 / group), and flavonoid compounds and irinotecan hydrochloride (CPT-11) were implanted.
  • CPT-11 flavonoid compounds and irinotecan hydrochloride
  • the survival days of the mice after tumor transplantation were examined, and the survival rate T / C (%) was calculated from the following formula to determine the antitumor effect.
  • Example 24 The following components were mixed, and the mixture was tableted.
  • the present invention makes it possible to overcome BCRP-related anticancer drug resistance. It is also possible to enhance the effects of anticancer drugs against BCRP-expressing cancers. Furthermore, it is expected to improve the bioavailability of anticancer drugs, which is expected to lead to an improvement in treatment results in cancer chemotherapy.

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Description

乳癌耐性蛋白阻害剤
技術分野
本発明は乳癌耐性蛋白 （BCRP) 阻害剤および BCRP阻害剤のスクリーニングに有 用な SN- 38耐性癌細胞に関する。明
背景技術
癌化学療法において、 治療開始時から抗癌剤書に無効である自然耐性や、 抗癌剤 を長期に連用するとその効果が低下する獲得耐性の出現は大きな問題となってい る。 この抗癌剤に対する耐性の克服は、 癌化学療法の治療成績向上につながるこ とが期待され、 これまでに様々な耐性機構の存在が明らかにされてきた。 その中 でも抗癌剤を細胞外へ能動輸送し、 その細胞内蓄積量を減少させる薬剤輸送蛋白 質の発現は、 耐性機構の中心的な役割を果たしていると考えられている。
特に、 1970年代に発見された MDR1遺伝子にコードされる薬剤輸送蛋白質 P-糖蛋 白質は、 化学構造や作用機序が異なる複数の抗癌剤に対して交叉耐性を生じるこ とから、 多剤耐性克服剤の有力な標的分子とされてきた。 しかし、 P-糖蛋白質だ けでは抗癌剤耐性機構を説明しきれないことも次第に明らかとなり、 さらに新し い薬剤輸送蛋白質を標的分子とした耐性克服剤の開発が望まれている。
その様な中、 1998年に、 P-糖蛋白質と同じく ATP結合カセット （ABC) トランス ポータ—スーパ—ファミリーと呼ばれる一群に属する薬剤輸送蛋白質として、 乳 癌耐性蛋白質 (BCRP) が発見された (Proc. Nat l . Acad. Sc i. USA 95, 15665-1 5670 (1998) ) 。 BCRPの構造には ATP結合カセットがーつしか存在せず、 二つの A TP結合カセットを有する P-糖蛋白質や他の薬剤輸送蛋白質とは構造的に異なって いる。 BCRPは塩酸イリノテカン （CPT- 11) やトポテカン等のトポイソメラ一ゼ I 阻害剤、 ミトキサントロン等のトポイソメラーゼ I I阻害剤に対する耐性機構に深 く関与する。 一方、 BCRPは P-糖蛋白質により排出されるパクリタキセルやピンク リスチン等に対しては作用しないこと、 また P -糖蛋白質ではほとんど細胞外へ排 出されない CPT-11や SN-38 (CPT- 11の活性体） 等のカンプトテシン誘導体の排出 に関わることかち (Cancer Res. 59, 5938-5946 (1999) ) 、 P -糖蛋白質とは異 なる基質特異性を有することが明らかにされている。 さらに、 BCRPは経口投与さ れた抗癌剤のバイオアべィラピリティの限界にも関与していることが示唆されて いる （J. Cl in. Oncol . 20, 2943-2950 (2002) ) 。 これらの事実から、 BCRPを 阻害する薬剤は、 従来の耐性克服剤では克服され得なかつた抗癌剤の耐性に対し て克服効果を発揮し、 さらには抗癌剤のバイオアベイラビリティをも向上させる ことが期待され、 その開発が望まれる。
これまでに、 抗癌剤に対する耐性克服を目的として数多くの P-糖蛋白質阻害剤 が開発されている。 一方、 BCRPに対する特異的な阻害剤に関する報告は少なく、 またその阻害作用も十分とはいえないことから、 より強力な BCRP阻害作用を有す る薬剤が要望されていた (Mol . Cancer. Ther. 1, 27-434 (2002) ) 。 なお、 フラポノィド化合物の中には P-糖蛋白質に対して阻害作用を示すものが報告され ている （J. Med. Chem. 41, 4161-4164 (1998) ； Biochem. Biophys. Res. Comm un. 295, 832-840 (2002) ) が、 BCRPに対して阻害作用を示すフラポノイド化合 物については知られていない。
本発明は、 BCRPを阻害する薬剤のスクリーニングに有用な癌細胞および BCRPを 阻害する薬剤を提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者は、 上記課題を解決すべく、 ヒト非小細胞肺癌由来の癌細胞である A5 49細胞を SN- 38含有培地にて継代培養することにより、 BCRPを高発現することで 抗癌剤耐性を獲得したヒト癌細胞を樹立した。 さらに、 該癌細胞を用いて、 耐性 克服作用を指標に様々な植物由来の成分についてスクリーニングを行った結果、 下記式 （1) 、 （2) 、 （3) 、 （4) 又は (5)で表されるフラポノイド化合物に強 力な BCRP阻害作用があることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 下記式 （1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 又は (5) ：
Figure imgf000006_0001
(1)
〔式中、 は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基又は低級アル キル基を示し、 7個の R2は同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基、 低級ァ ルコキシ基、 低級アルキル基、 低級アルケニル基又は糖残基を示すか、 或は隣接 する Rtと共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよ く、 R3は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルキル基、 低級アルコキシ 基、 アミノ基又はニトロ基を示す。 〕
Figure imgf000006_0002
(2)
〔式中、 R4は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基、 低級アルキ ル基又は低級アルケニル基を示し、 7個の R5は同一でも異なってもよく、 水素原 子、 水酸基、 低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示すか、 或は隣接する二つ の R5は共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、 R6は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基、 低級アルキル基、 ァ ミノ基又はニトロ基を示す。 〕
Figure imgf000007_0001
〔式中、 R7は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基又は低級アル キル基を示し、 2個の R8は同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基、 低級ァ ルコキシ基又は低級アルキル基を示し、 R9は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子又 は低級アルコキシ基を示し、 5個の R1 ()は同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基又は低級アルコキシ基を示す。 〕
Figure imgf000007_0002
(4)
〔式中、 3個の Ruは同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基又は低級アル コキシ基を示す。 〕 Rl3 O R12
(5)
〔式中、 Rl2は水素原子又は低級アルケニル基を示し、 R13は水素原子又は水酸基 を示し、 R14は水素原子を示す。 〕
で表されるフラポノイド化合物、 又はその配糖体、 エステル若しくは塩を有効成 分とする BCRP阻害剤、 BCRP関与の耐性を獲得した癌に対する抗癌剤耐性克服剤、 又は BCRPを発現し、 抗癌剤 対して低感受性の癌に対する抗癌剤耐性克服剤を提 供するものである。
また本発明は、 上記の BCRP阻害剤および BCRPの基質となり得る抗癌剤を含有す る抗癌剤を提供するものである。
また、 本発明は下記式 （6) ：
Figure imgf000008_0001
(6)
〔式中、 R15はァミノ基またはニトロ基を示す。 〕
で表される新規なフラボノィド化合物を提供するものである。
さらに本発明は、 BCRPを高発現する SN- 38耐性ヒト非小細胞肺癌 A549細胞を提 供するものである。 ' 図面の簡単な説明
図 1は、 A549/SN- 38-4細胞の SN- 38 (A) およびミトキサントロン （B) に対 する耐性獲得の程度を示す図である。
図 2は、 A549細胞および A549/SN- 38細胞における各種薬剤輸送蛋白質の mRNAの 発現を RT-PCR法により解析した結果を示す図である。
図 3は、 A549細胞および A549/SN-38細胞における BCRP (A) および MRP2 (B) mRMの発現をリアルタイム RT-PCR法により定量的に解析した結果を示す図 である。
図 4は、 A549細胞および A549/SN- 38-4細胞の SN- 38 (A) および SN-38グルクロ ン酸抱合体 （B ) の蓄積量を示す図である。
図 5は、 P388/BCRP細胞の SN- 38耐性に対するフラポノイド化合物 〔化合物 1-1 (A) 、 化合物 1 - 4 ( B ) 、 化合物 1 - 6 ( C ) 、 化合物 1-14 (D ) 、 化合物 3-4 (E) 、 化合物 3- 6 ( F) 〕 の克服作用を示す図である。
図 6は、 フラポノィド化合物による P388/BCRP細胞の SN- 38蓄積増大作用を示す 図である。
図 7は、 フラボノィド化合物による MCF-7細胞の SN- 38蓄積増大作用を示す図で ある。 発明を実施するための最良の形態
ヒ卜非小細胞肺癌 A549細胞は、 培養が容易であり、 マウスに移植することが可 能であるとともに、 CPT-11の活性本体である SN-38に対して高い感受性を示すこ とが知られている (J. Cl in. Inves t. 101 , 1789-1796 (1998) ) 。 この A549細 胞を培地中の SN- 38濃度を段階的に上げながら継続的に培養することにより、 SN- 38耐性 A549細胞を樹立した。 得られた SN- 38耐性 A549細胞は、 後記の実施例に示 すように、 BCRPを高発現し、 SN-38の細胞内蓄積を減少させることにより耐性を 獲得しており、 BCRP阻害剤のスクリーニングに有用である。 SN-38耐性 A549細胞 は、 in vi t roのスクリーニングに用いてもよく、 また、 マウスに移植することに より in vivoのスクリーニングに用いることも可能である。
当該細胞を用いて、 SN- 38耐性克服作用を指標に様々な植物由来の成分につい てスクリーニングを行った結果、 フラボノィド化合物に強力な BCRP阻害作用があ ることを見出した。
本発明のフラポノイド化合物は、 上記の式 （1) で示されるフラボン誘導体、 式 （2) で示されるフラバノン誘導体、 式（3)で示されるカルコン誘導体、 式 (4) で示されるイソフラボン誘導体、 又は式（5)で表されるフラボノイド誘導体 である。
式（1)〜（4)中、 〜 としての低級アルコキシ基は、 炭素数 1〜4であるのが 好ましく、 特にメトキシ基が好ましい。 また、 〜 としての低級アルキル基 は、 炭素数 1〜4であるのが好ましく、 特にメチル基が好ましい。 式 (1)、 （2)及 び（5)中の R2、 R4又は R12としての低級アルケニル基は、 炭素数 2〜 5であるのが 好ましく、 特に 3—メチル— 1又は 2—ブテニル基が好ましい。 ハロゲン原子と しては、 フッ素、 塩素、 臭素及びヨウ素原子が挙げられ、 塩素又は臭素原子が好 ましい。 式（1)において隣接する Rtと R2が形成するピラン環は、 炭素数 1—4の 低級アルキル基、 特にメチル基、 で置換されていてもよい。 式（2)においてピラ ン環を形成する隣接する二つの R5は、 ジヒドロべンゾピラン環上にあるのが好ま しい。 隣接する二つの R5が形成するピラン環は、 炭素数 1一 4の低級アルキル 基、 特にメチル基、 で置換されていてもよい。
式 において、 Rl 5がニトロ基である化合物 （2 ' -ニトロ - 4， , 5, 5 ' , 6, 7， 8 -へキサメトキシフラボン) は 2， -ニトロノビレチンとも呼ばれ、 R15がァミノ 基である化合物 (2 ' -ァミノ- 4， , 5, 5 ' ，6， 7， 8-へキサメ卜キシフラボン) は V -ァミノノビレチンとも呼ばれ、 いずれも新規化合物である。
上記のフラボノィド化合物には、 例えば iS -D-ダルコシド等の糖が付加した配 糖体も含まれる。 また、 ナトリウム、 カリウム、 塩酸塩等が付加して薬理学的に 許容される塩を形成することができ、 斯かる塩もまた本発明に含まれる。 さらに は、 例えば酢酸、 プロピオン酸、 乳酸、 酪酸等の低級脂肪酸類力付加して、 薬理 学的に許容されるエステルを形成することができ、 斯かるエステル体もまた本発 明に含まれる。 また、 フラポノイド化合物は水和物等の溶媒和物の形態で存在す ることもあり、 当該溶媒和物も本発明に含まれる。 さらには、 各異性体及びその 混合物も本発明に含まれる。
本発明のフラポノィド化合物の由来については特に制限はなく、 植物由来のも のであってもよいし、 化学合成品や半合成品であってもよい。 植物から本発明の フラボノイド化合物を取得する方法に特に限定はなく、 例えば植物の根、 茎、 葉、 果実、 及び Z又は花部を水、 メタノール、 ェタノ一ル等の低級アルコール又 はァセトンのような水溶性有機溶媒で室温又は加熱にて抽出する方法、 水とこれ らの水溶性有機溶媒との混合物により抽出する方法、 更にクロ口ホルム、 ジクロ ロメタン、 酢酸エステル類、 トルエン、 又は炭酸ガスによる超臨界流体等の疎水 性有機溶媒とメタノール等の水溶性有機溶媒の混合物により抽出する方法がある 力 特に、 根、 茎、 及び/又は葉を細断または粉碎し、 メタノール等の低級アル コールで抽出するのが好ましい。 そして、 得られた抽出物はさらにカラムクロマ トグラフィ一等を用いて分画、 精製することにより、 本発明のフラポノイド化合 物を単離することができる。
式 （6) で R15がニトロ基である 2 ' -ニトロ- 4 ' , 5, 5 ' , 6, 7, 8-へキサメトキシ フラボンは、 4， , 5, 5 ' ， 6， 7, 8 -へキサメトキシフラボンを慣用の方法に従って二 トロ化することにより製造することができる。 ニトロ化剤としては、 例えば硝酸 一硫酸のような混酸が用いられる。
式 (6) で R15がァミノ基である 2 ' -アミノ- 4， , 5 , 5 ' ，6， 7， 8-へキサメトキシ フラボンは、 V -ニトロ- 4' , 5, 5 ' , 6， 7, 8-へキサメトキシフラボンを常法に従 つて還元することにより製造することができる。
本発明のフラポノイド化合物は、 そのままでも投与することができるが、 効果 を低減させない範囲内で、 分散補助剤、 賦形剤等の通常製剤化に使用されるよう な担体と混合し、 粉剤、 液剤、 カプセル剤、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ剤、 エリキ シル剤、 顆粒剤、 丸剤、 錠剤、 トローチ剤、 リモネーデ剤等の経口剤又は注射剤 等の剤形で使用することができる。
この様な担体としては、 例えば、 マンニトール、 乳糖、 デキストラン等の水溶 性の単糖類ないしオリゴ糖類もしくは多糖類；例えばヒドロキシプロピルセル口 —ス、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 メチルセルロース等のゲル形成性 又は水溶性のセルロース類；例えば結晶性セルロース、 Q!—セルロース、 架橋力 ルポキシメチルセルロースナトリゥム、 及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ 水難溶性のセルロース類；例えばヒドロキシプロピル澱粉、 力ルポキシメチル澱 粉、 架橋澱粉、 アミロース、 アミ口べクチン、 ぺクチン及びそれらの誘導体等の 水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；例えばアラビアガム、 トラガントガム、 ダリ コマンナン及びそれらの誘導体等の水吸収性でかつ水難溶性のガム類；例えばポ リビニルピロリドン、 架橋ポリァクリル酸及びその塩、 架橋ポリビニルアルコー ル、 ポリヒドロキシェチルメタクリレート及びそれらの誘導体等の架橋ビニル重 合体類； リン脂質、 コレステロール等のリボソーム等分子集合体を形成する脂質 類等を挙げることができる。
本発明のフラポノィド化合物の溶解性が低い場合には、 可溶化処理を施すこと ができる。 可溶化処理としては通常医薬に適用できる方法、 例えば、 ポリオキシ エチレンアルコールェ一テル類、 ポリオキシエチレンァシルエステル類、 ソルビ タンァシルエステル類やポリオキシエチレンソルビタンァシルエステル類等の界 面活性剤を添加する方法、 ポリエチレンダリコール等の水溶性高分子を使用する 方法等が挙げられる。 また、 必要により、 可溶性の塩にする方法、 シクロデキス 卜リン等を用いて包接ィヒ合物を形成させる方法等も使用できる。 可溶化処理の方 法は、 目的とするフラボノィド化合物に応じて適宜変更できる。
BCRP阻害剤は、 抗癌剤の投与によって BCRP関与の耐性を獲得した癌に対しては 抗癌剤耐性克服剤として使用することが出来る。 また、 もとから BCRPを発現し、 抗癌剤に対して低感受性の癌に対しては抗癌剤効果増強剤として使用することが 出来る。 BCRP阻害剤を有効成分とする抗癌剤耐性克服剤および抗癌剤効果増強剤 の対象となる抗癌剤としては、 BCRPの基質となり得る抗癌剤であれば特に制限は ないが、 例えば塩酸イリノテカン/ CPT- 11 (活性本体： SN - 38) やトポテカン等の トポイソメラーゼ I阻害剤や、 ミトキサントロン、 ドキソルビシン、 ダウノルビ シン、 ビスアントレン、 エトポシド等のトポイソメラーゼ I I阻害剤や、 メトトレ キサート等の葉酸代謝拮抗薬等が挙げられる。
本発明の BCRP阻害剤の投与量は、 投与法や患者の症状等に合わせて適宜調整す ればよいが、 成人 1日あたり lmg〜10g、 更に 100mg〜10g、 特に 500mg〜10g投与す るのが好ましい。 また、 抗癌剤と BCRP阻害剤との比率は、 特に限定されず、 その 好適な範囲は用いる抗癌剤、 阻害剤の種類等により異なるが、 例えば抗癌剤とし て塩酸ィリノテカンを用いる場合には、 抗癌剤: BCRP阻害剤が重量換算で 1 : 1-1： 500、 特に 1 : 1〜1 : 100、 更に 1 : 1〜1 : 10の比率とすることが好ましい。
本発明に用いられるフラボノイド化合物の具体例を表 1、 表 2、 表 3、 表 4及 び表 5に示す。
表 1
フラボン誘導体 化合物 化学名
1-1 5, 4' -シ'、ヒド口キシ- 7-メトキシフラホ、、ン （EXTRASYNTHSSE製）
1-2 5' 7-シ、、ヒドロキシ- 3， ， 4， , 5， -トリメトキシフラホ"ン (INDOFINE し hemical し ompany^)
1-3 5， 7-シ、、ヒドロキシフラホ、、ン （INDOFINE Chemical Company製）
1-4 3， ， 4' -シ"メトキシフラホ '、ン （EXTRASYNTHSSE製）
1-5 2' -ァミノ- 4， , 5, 5' ， 6， 7， 8 -へキサメトキシフラホ'、ン (実施例 4)
1-6 3， , 5 -シ、、ヒドロキシ- 4' , 6， 7 -トリメトキシフラホ"ン (実施例 1)
1-7 3, 4' , 5， 7-テトラヒドロキシフラホ、、ン （EXTRASYNTHfiSE製）
1-8 3' , 4' ， 5, 7 -テトラヒドロキシフラホ'、ン （EXTRASYNTHfiSE製）
1-9 4' ， 5, 7 トリヒドロキシフラホ、 'ン （EXTRASYNTHfiSE製）
1-10 4 ' ， 5 - ヒドロキシフラ; Tンー 7—ク、、ルコシド （EXTRASYNTHfiSE製）
1-11 3, 4' ， 5, 7-テトラヒド Pキシ- 3' -メトキシフラ; Tン （EXTRASYNTH
E製）
1-12 5, 6 -シ"ヒドロキシ _7 -メトキシフラホ"ン （EXTRASYNTHSSE製）
1-13 3' -ヒドロキシ- 4， ， 5, 6， 7 -テトラメトキシフラホ"ン (EXTRASYNTHES
E製）
1-14 3， ， 4， ， 7-トリメトキシフラホ、、ン (INDOFINE Chemical Compan y製）
1-15 6， 7 -シ"メトキシフラホ ン (INDOFINE Chemical Company製)
1-16 2， ， 4， ， 6 -トリメトキシフラホ'、ン (INDOFINE Chemical Compan y製）
1-17 3, 4' -シ、、メトキシフラホ、、ン (INDOFINE Chemical Company製)
1-18 6, 8 -シ'、クロ口 _4， -メチルフラホ、、ン (INDOFINE Chemical
Company^) 1-19 5, 4' -シ、、ヒド口キシ- 6， 7-シ、、メトキシフラホ"ン (実施例 2)
1-20 2， -ニトロ- 4， , 5, 5 ' ，6， 7， 8 -へキサメトキシフラホ"ン (実施例 3)
1-21 3， ，6 - メトキシフラホ、、ン （INDOFINE Chemical Company製）
1 - 22 4' ，5 -シ"ヒドロキシ- 3, 3 ' , 7 -トリメトキシフラホ"ン (実施例 5)
1-23 5 -ヒ ロキシ- 3， ，4' ，7-トリメトキシフラ； Γン (実施例 6)
1-24 3, 3' , 4' ，5, 6， 7, 8-へフ。タメトキシフラホ、'ン (実施例 7)
1-25 3， ，4' , 5, 6， 7 - ンタメトキシフラホ、'ン (実施例 7)
1-26 5 -ヒド Pキシ- 6， 7-シ、、メトキシフラホ'、ン- 4， - ルコシド (実施例 8)
1-27 5 -ヒド Pキシ- 7-メトキシフラホ、、ン- 4' -ク、、ルコシド （実施例 9)
1-28 4H, 8H -へ、、ンソ、、 [1， 2-b： 3， 4— b， ]シ、、ピラン— 4—オン， 2— (2, 4—シ、、ヒ 口キシフ ル) -5-ヒト、、口キシ- 8， 8_シ、、メチル -3- (3-メチル -2-フ、、テニル） (実施例 10)
1-29 2， , 4， ， 5—トリヒド Pキシ— 7—メトキシ- 6— (3—メチル -1—フ、、テニル）—3—
(3 -メチル -2 -フ、、テニル) -フラホ、、ン (実施例 11)
フラバノン誘導体 化合物 化学名
2-1 3 ' , 5， 7-トリヒドロキシ- 4， -メトキシフラハ ン（EXTRASYNTH E
2-2 4， ， 5-シ、、ヒド口キシ— 7—メトキシフラハ"ノン (EXTRAS雷 HfiSE製)
2-3 2H, 6H—へ、、ン [1， 2 - b： 5, 4— b ' ]シ"ピラン—6—オン， 7, 8—シ"ヒ ロ- 5-ヒドロキシ -8- (4 -ヒドロキシフエニル) -2, 2 -シ、、メチル- 10- (3 -メチ ル -2-ア'テニル） （実施例 12) 表 3
カルコン誘導体
化合物 化学名
3-1 2， ， 4 -シ、、ヒドロキシ- 4， ， 6' -シ"メトキシかレコン （EXTRASYNTH£S
E製）
3-2 3， 4—シ"メトキシカノレコン （EXTRASYNTH£SE製）
3-3 2， ーヒドロキシ _3， 4ーシ"メトキシカルコン (INDOFINE Chemical し ompany製)
3-4 2， -ヒドロキシ- 3, 4, 4' ， 6， -テトラエトキシカルコン (INDOFINE し hemical Company^)
3-5 2， ， 4' —シ、、ヒドロキシー 3， 4—シ トキシカルコン
(INDOFINE Chemical Company製）
3-6 2' -ヒド Pキシ- 2, 4， 4， ， 5， 6， -へ。ンタメトキシカルコン（INDOFINE
Chemical Company^)
3-7 5， —フ、、口モ- 3， —クロ口 _2， ーヒ ロキシ— 3, 4， 5 -トリメトキシかレコン
(INDOFINE Chemical Company製）
3-8 2， ， 6， -シ、、ヒドロキシ- 4， 4， -シ、、メトキシカルコン (EXTRASYNTHES
E製）
3-9 2' -ヒドロキシ— 2， 3， 5， -トリメトキシカルコン （INDOFINE Chemica
1 Company製)
3-10 3' -ァ、口モ- 5' -クロ P- 2， ーヒドロキシ- 3， 4， 5 -トリメトキシカルコン
(INDOFINE Chemical Company製）
イソブラボン誘導体
化合物 化学名
4-1 5, 7-シ"ヒド'口キシ- 4' -メトキシィ、ノフラホ"ン （EXTRASYNTH£SE製）
4-2 5-ヒト" Pキシ- 4' -メトキシイソフラホ'、ン- 7-ク、、ルコシド
(EXTRASYNTHお E製） 表 5
フラポノィド誘導体
Figure imgf000017_0001
実施例
次に本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明するが、 これは単に例示であって 本発明を限定するものではない。
実施例 1 ： 3' ，5 -ジヒドロキシ- 4' ，6,7-トリメトキシフラボン (化合物 1-6) の単離
ブラジル産生薬の力ルケ一ジャ 368 gをメタノールで二時間還流し、 抽出液を 減圧乾固した。 得られたエキス 8.1 gのうち、 5.09 gを中圧クロマトグラフィー によりへキサンで溶出した後 （A画分） 、 へキサン-酢酸ェチル （4:1) 混合溶液 で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸ェチル溶出して （C画分） 、 更にメタノールで溶 出した （D画分） 。 得られた C画分 1.53 gのうち、 1.0 gを中圧クロマトグラフィ 一により 254皿にてモニタ一しながらへキサンで溶出した後、 へキサン-酢酸ェ チル （2:1) 混合溶液、 同 （1:1) 混合溶液、 続いて酢酸ェチル、 メタノールの順 に溶出し、 12画分を得た。 へキサン-酢酸ェチル混合溶液 （2:1) で溶出された C6 画分 (100.1 mg) を高速液体クロマトグラフィー CMightysil RP-18 GP、 6. OX 250 mm, ァセトニトリル-水の （45:55) 混合溶液で溶出〕 で分析した結果、 保持 時間 15.2分のピークを示す画分が得られた。 この C6画分をクロロホルム-メ夕ノ ール （1:1) 混合溶液により再結晶し、 化合物 1-6を 47.9 mg得た。 この化合物 の分析結果は次の通りである。
IR V max (KBr) cm"1: 1649 (C=0)
EI -MS m/z: 315 [M] + lH -醒 R(DMS0-d6) δ : 3.74(C6-0CH3, s), 3.88(C4' - 0CH3， s)， 3.94(C7- 0CH3， s), 6.83(C3-H, s), 6.92(C8-H, s), 7.10(C5' - H， d， J=8.8Hz), 7.48(C2' -H, d, J=2.2Hz), 7.57(8.5, C6' -H, dd, J=2.4Hz), 9.44(C3' -OH, s)， 12.90(C5-O
H, s),
l3C-NMR(DMS0-d6) δ 56.2 (C6-OCH3) , 56.9 (C7-OCH3) , 60.5 (C6-0CH3) , 92.0(C- 8), 103.7(C-3), 105.4(C-10), 112.5(C-5' ), 113.2(C-2' )， 119.3(C-6' ), 1 23.2(C-1' ), 132.2(C-6), 147.0(C-3' ), 151.7(C-4' )， 152.0(C-5), 153.1 (C-9) , 159.KC-7), 164.3(C-2), 182.5(C-4)
実施例 2 ： 5,4' -ジヒドロキシ- 6,7-ジメトキシフラボン (化合物 1 - 19) の単離 高砂薬業 （株） より入手したインチンコゥ （茵陳蒿） 500 gをメタノールで二 時間還流し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 40.1 gのうち 5.07 gをシリ 力ゲルにまぶし、 中圧クロマトグラフィーによりへキサンで溶出した後 （A画 分） 、 へキサン-酢酸ェチル （4:1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸ェ チル溶出して （C画分） 、 更にメタノールで溶出した （D画分） 。 得られた C画分
I.56 gのうち 1.5 gを中圧クロマトグラフィーにより 254 nmにてモニターしなが らクロロホルムで溶出した後、 クロ口ホルム-メタノール （99:1) 混合溶液、 同
(19:1) 混合溶液、 続いて同 （9:1) 混合溶液、 メタノールの順に溶出し、 14画 分を得た。 クロ口ホルムで溶出された C6画分 （112.4 mg) をメタノールに溶解 し、. C6メタノール不溶性画分 (70 nig) を得た。 この C6メ夕ノール不溶性画分を 高速液体ク口マトグラフィー [Mightysil RP-18 GP、 6.0X 250 mm, ァセトニト リル- 0.7%蟻酸溶液の （30:70) 混合溶液で溶出〕 で分析した結果、 保持時間 28.0 分のピークを示した。 この保持時間 28.0分のピークを有する画分を精製して得た 化合物 1-19の分析結果は次の通りである。
IR V max (KBr) cm一1: 1655 (C=0)
MS (ESI) m/z: 315[M+H] +
'H-NMR(CDCL3) δ： 3.87(0CH3, s), 3.99(0CH3, s)， 6.57(C3-H, s)， 6.62(C8-H, s), 6.96(C3' - H, C5' 一 H, dd, J=8.8Hz, 1.7), 7.79(C2' -H, C6， - H, dd, J= 8.8Hz, 1.5), 9.89(C4' -OH, s)， 12.88(C5-OH, s)
実施例 3 ： 2' -ニトロ - 4' ,5,5' ,6, 7， 8-へキサメトキシフラボン （化合物 1-2 0) の合成 .
4' ,5,5' ,6, 7， 8-へキサメトキシフラボン 831mgを氷浴中で濃硫酸 17mlに溶解 した。 溶液に 5%発煙硝酸-硫酸混液 1.7mlを滴下し、 そのまま氷浴中で 30分間攪 拌した。 反応液を 50mlの氷水にあけ、 10分間攪拌した。 析出した結晶を吸引濾過 し、 結晶を酢酸ェチルにて洗浄した。 水層は酢酸ェチル 50mlにて 2回抽出した。 得られた酢酸ェチル層を減圧下濃縮乾固した。 得られた固形物を先の結晶と併 せ、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー [関東化学製 Si02、 へキサン-酢酸ェチ ル（1： 1)で溶出]にて分画した。 目的の画分を減圧下濃縮乾固することにより、 2' -ニトロ - 4' ,5,5' ,6,7,8-へキサメトキシフラボンを得た（収量 326mg ： 収率 35%)。
IR y max (KBr) cm1 :3489, 2943, 2838, 1655, 1530
MS (ESI) m/z ： 448 [M+H] +
—丽 R(CDC13) δ： 3.83(3H, s)， 3.95(3H, s) , 3.97(3H, s)， 3.98(3H, s), 4. 03 (3H, s), 4.08(3H, s), 6.41(1H, s), 7.00(1H, s)， 7.67(1H, s)
実施例 4： -ァミノ- 4， ,5,5' ，6， 7， 8 -へキサメトキシフラボン (化合物 1 - 5) の合成
2' -二トロ- 4' ,5,5' ,6， 7, 8-へキサメトキシフラボン 135mgを濃塩酸-メタノ —ル（1:1)混液 5mlに溶解し、 鉄粉末 51.6mgを加え—， 室温にて 4時間攪拌した。 反 応液に精製水 20nil、 酢酸ェチル 20mlを加え、 分液した。 得られた水層を飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液にて PH8に調整し、 酢酸ェチル 130mlにて 2回抽出した。 酢 酸ェチル層を飽和食塩水 70mlにて洗浄後、 無水硫酸マグネシウムにて乾燥した。 硫酸マグネシウムを濾別し、 酢酸ェチルにて洗浄した後、 酢酸ェチル層を減圧下 濃縮乾固した。 得られた固形物をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー [関東化 学製 Si02、 へキサン-酢酸ェチル（1:1)で溶出]にて分画した。 目的の画分を減圧 下濃縮乾固することにより、 2' -ァミノ- 4' ,5,5' ,6,7,8-へキサメ トキシフラ ボンを得た（収量 66mg ： 収率 52%)。
IR vmax(KBr) cm—1： 3496, 3326， 1624, 1560， 1520
MS (ESI) m/z ： 418 [M+H] +
¾_NMR(CDC13) δ： 3.85 (3H, s)， 3.89 (3H, s), 3.96 (6H, s), 3.99(3H, s), 4. 09 (3H, s)， 6.28 (1H, s), 6.48 (1H, s), 6.96 (1H, s)
実施例 5 ： 4' ，5—ジヒ ドロキシ一 3，3， ，7—トリメ トキシフラボン （化合物 1-2 2) の単離
タイ WAM( Pogostemon cablin の枝葉 53.8 gをメタノールで一週間室温抽出 し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 4.9 gのうち、 4.7 gを中圧クロマト グラフィ一によりへキサンで溶出した後 （A画分） 、 へキサン-酢酸ェチル （4: 1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出して （C画分） 、 更にメ タノールで溶出した （D画分） 。 得られた B画分 1.3 gのうち、 0.5 gを遠心クロマ トグラフィ一により 254 nmにてモニターしながらクロ口ホルムで溶出した後、 ク 口口ホルム-メタノール （9： 1) 混合溶液、 メタノールの順に溶出し、 18画分を得 た。 クロ口ホルム-メタノール （9:1) 混合溶液で溶出された B9画分 （14.8 mg) を高速液体クロマトグラフィー （Mightysil RP- 18 GP、 6.0X250 mm、 ァセトニ トリル-水の （45:55) 混合溶液で溶出） で分析した結果、 保持時間 14.5分のピー クを示す画分が得られた。 この化合物の分析結果は次の通りである。
MS (ESI) m/z: 345[M+H]+, 343[M- H]一
-腿 R(CDC13) δ： 3.85 (C3. _0CH3， s)， 3.88 (C7, - 0CH3， s)， 3.98 (C3 - 0C ， s), 6.
36 (C6-H, d， /=2.4) , 6.44(C8— H， d, 2.4), 7.09(C5, - H, d, =8.8)， 7.67(C
6, -H, dd, J=8.8, 2.0) , 7.70 (C2, - H, d， J=2.0
13C - NMR (CDC13) δ : 55.8 (C3, - 0CH3)， 56.1 (C7- 0CH3) , 60.2 (C3 - 0C )， 92.2 (C- 8) , 97.8 (C-6) , 106.0(010), 110.9 (C- 2' ), 114.6 (C - 5' ), 122.4(C - 1， ）， 122.7 (C - 6， ), 138.8(C-3), 146.3(C-3' ), 148.3(C-4' ), 155.9(C-2), 156.7(C-5), 162.0(C-9), 165.4(C-7), 178.7 (C- 4)
実施例 6 : 5-ヒドロキシ— 3' ，4' ，7—トリメトキシフラボン （化合物卜 23) の 単離
中国産生薬の独角柑 Striga asiaticaの ±茸、 約 300 gをメタノールで二時間還 流抽出し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 6.8 gのうち、 5.0 gを中圧ク 口マトグラフィ一によりへキサンで溶出した後 （A画分） 、 へキサン-酢酸ェチル
(4:1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出して （C画分） 、 更 にメタノールで溶出した （D画分） 。 得られた B画分 480 mgを遠心クロマトグラフ ィ一により 254 nmにてモニターしながらクロ口ホルムで溶出した後、 クロ口ホル ム-メタノール （9:1) 混合溶液、 メタノールの順に溶出し、 9画分を得た。 クロ 口ホルムで溶出された B3および B4画分 （各 42.3 mg) を高速液体クロマトグラフ ィ一 (Mightysil RP-18 GP、 6.0 X 250 mni、 ァセトニトリル -メタノール-水の
(45:5:50) 混合溶液で溶出） で分析し、 保持時間 16.5分のピークを分取した。 この化合物の分析結果は次の通りである。
MS (ESI) m/z: 329[M+H]+
'Η—匪 R(CDC13) δ： 3.89, 3.97, 3.99 (C7, C3. , C4, - 0C¾， s), 6.38(C6-H, d, J= 2.4), 6.50(C8-H, d， 7-2.4), 6.59(C3-H, s), 6.98(C5. -H, d, ' /=8.8) , 7.34(C r -H, d, 7=2.4), 7.53 (C6. -H, dd, /=8.8, 2.4), 12.79(C5-OH, s)
13C-NMR(CDC13) 6： 55.8 (C7-0CH3) , 56.1 (C3. - 0CH3. C4. -0C¾)， 92.7(C-2), 98.1 (C-8), 104.7(C-3), 105.6 C— 10)， 108.9(C- 2， ), 111.2(C-5' )， 120.1 (C - 6， ), 123.8(C-1' ), 149.3(C-3' ), 152.3(C-4' )， 151.7(C-4' )， 157.7 (C- 9), 162.2(C-2), 164.0(C-5), 165.5 (C- 7), 182.4(C-4)
実施例 7 ： 3,3' ,4' ,5， 6, 7, 8—ヘプタメトキシフラボン （化合物 1 - 24) および
3' ,4' ,5， 6—ペンタメトキシフラボン （化合物卜 25) の単離
中国産生薬の橘皮 Citrus tangerinaの^^) 約 2Kgをメタノールで二時間還流 抽出し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 356.5 gのうち、 35.2 gを中圧 クロマトグラフィーによりへキサンで溶出した後 （A画分） 、 へキサン-酢酸ェチ ル （4:1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出して （C画分） 、 更にメタノールで溶出した （D画分） 。 得られた C画分 556 mgを中圧シリカゲル力 ラムクロマトグラフィにより 254 nmにてモニタ一しながらクロ口ホルムで溶出し た後、 クロ口ホルム-メタノール （98:2) 混合溶液、 同 （95:5) 混合溶液、 メタ ノールの順に溶出し 10画分を得た。 クロ口ホルムで溶出された C3および C4画分
(計 230 mg) を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより 254 nmにてモニタ 一しながらへキサンで溶出した後、 へキサン -酢酸ェチル （19:1) 混合溶液、 同
(9:1) 、 （8:2) 、 （7:3) 、 （5:5) 、 (1:2) 混合溶液、 酢酸ェチル、 メタノ ールの順に溶出し 10画分を得た。 へキサン-酢酸ェチル （5:5) 混合溶液で溶出さ れた C23G画分 （90.0 mg) および （1:2) 混合溶液で溶出された C23J画分 （5.2 m g) を高速液体クロマトグラフィー （Mightysil RP-18 GP、 6.0X 250腿、 ァセ トニトリル- 5%蟻酸-メタノール-水の （30:10:20:40) 混合溶液で溶出） で分析し た結果、 保持時間 18.3分 （化合物 1-24) および 10· 6分 （化合物卜 25) のピークを 示す画分が得られた。 この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物 1-24
MS (ESI) m/z: 433 [M+H] +
'H- MR(CDC13) δ： 3.91(0CH3, s), 3.96(0CH3, s), 3.98(OCH3X2, s), 3.99(0CH 3, s), 4.02(OCH3, s), 4.11 (0C¾， s), 7.03(C5. - H， d, 7=8.3), 7.82(C -H, d, 7=2.4), 7.85(C6.一 H， dd, 7=8.3, 2.4)
13C-NMR(CDC13) δ： 56.6, 56.7 (C3. , C4, - 0C¾) , 60.5， 62.4, 62.5, 62.7, 63.0 (C3， C5， C6， C7, C8-0CH3) , 107.4(C-2' ), 111.7(C-5' ), 115.2(C - 10), 122.7 (C-6' ), 124. KC-r ), 138.6(C-8), 141.5 (C- 6), 144.6(C-3), 147.4 (C - 5), 1 48.9(C-9), 149.5 (C— 3， )， 151.8 (C- 2)， 152.0(C-7), 1— 53.8(C-4， ), 174.6 (C-
4) 化合物 1-25
MS (ESI) m/z: 373[M+H]+, 371 [M - H]—
— NMR(CDC13) δ : 3.93 (OCH3, s), 3.96 (OCH3, s)， 3.98 (OCH3, s)， 3.99(0CH3X 2， s), 6.60(C3-H, s)， 6.80(C8 - H, s), 6.97(C5，- H, d, 8.8), 7.33 (C2. -H, d, /=2.0) , 7.51 (C6.— H， 8.3, 2.0)
13C-匪 R(CDC13) δ : 56.3, 56.3, 56.5(C7， C3, , C4, _0CH3), 61.7, 62.5(C5， C6_ 0CH3) , 96.4(C— 8), 107.6(C-3), 108.8(C_2， )， 111.3 (C- 5， )， 112.9(C_10)， 1 19.8 (C - 6， ）， 124.3(C-1' ), 140.4(06)， 139.3 (C - 3， )， 152.0(C— 4， ）， 152.6 (C— 9)， 154.7 (C— 5)， 157.8 (C- 7), 161.3 (C - 2)， 177.4 (C - 4)
実施例 8 ： 5-ヒ ドロキシ一 6， 7 -ジメ トキシフラボン一 4' —ダルコシド (化合物 1-26) の単離
北海道産のチシマァザミ の茎葉 55.0 gをメタノールで一週間室温抽出し、 抽出 液を減圧乾固した。 得られたエキス 13.5 gのうち、 5.1 gを中圧クロマトグラフ ィ一によりへキサンで溶出した後 (A画分） 、 へキサン-酢酸ェチル （4:1) 混合 溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出して （C画分） 、 更にメタノー ルで溶出した （D画分） 。 得られた D画分 3.8 gのうち 2. Ogを中圧シリカゲルカラ ムクロマトグラフィにより 254 nmにてモニターしながらクロロホノレムで溶出した 後、 クロ口ホルム-メタノール （9:1) 混合溶液、 同 （8:1) 、 （3:7) 混合溶液、 メタノールの順に溶出し 10画分を得た。 クロ口ホルム-メタノール （9:1) 混合溶 液で溶出された D4画分 1, 34gをクロ口ホルムにて再結晶し、 白色結晶を得た。 高 速液体クロマトグラフィー (Mightysil RP- 18 GP、 6.0X250 匪、 ァセトニトリ ル-水の （20:80) 混合溶液で溶出） で分析した結果、 保持時間 27.6分のピークを 示す化合物が得られた。 この化合物の分析結果は次の通りである。
MS (ESI) m/z: 477[M+H]+
¾-NMR(DMS0-d6) δ： 3.74(C7-CH3, s), 3, 94 (C6,— CH3， s)， 4· 59 t， ^5.6)， 5.0 4(d, /=7.8) , 5.06 (d, J=5.6) , 5.13 (d, ,=4.4), 5.37 (d, /=4.6)， 6.98 (C8— H, s), 6.96(C3-H, s), 7.20(C3. -H, C5.— H, d, J=9.0), 8.07(C2，-H, C6. - H, d, J= 9.0), 12.9(C OH, s)
13C-NMR(DMS0-d6) δ： 56.5 (Cr0CH3) , 60.0 (C6- 0CH3)， 60.6(C- 6， ， ), 69.6 (C- 4， ， ), 73. KC-2' ， )， 76.5(C-3' ' ), 77.2(C - 5' ' ), 91.7(C - 8), 99.8(C - 1， ' ), 103.6(C-3), 105.2 C- 10)， 116.6(C-3' , C - 5， ), 123.8(C-1' ), 128. 2(C - 2， , C_6， ), 131.9(C-6), 152.0(C-5), 152.7(C-9), 158.7(C-7), 160.3 (C - 4， ), 163.4(C-2), 182.3(C-4)
実施例 9 ： 5—ヒドロキシー 7—メトキシフラボン一 4 '一ダルコシド (化合 物 1-27) の製造
化合物 1-1 (5,4' —ジヒドロキシ— 7—メトキシフラボン） (lOOmg) をァセト ンに溶解し、 これにひ - D-ァセトブロモグルコース (647mg) と炭酸カリウム (23 lmg) を加え、 激しく攪拌しながら一昼夜煮沸還流した。 濾過により不溶物を除 き、 濾取物をクロ口ホルムで洗浄し、 濾洗液を合し、 これを減圧下濃縮乾固し た。 残留物をクロ口ホルム/メ夕ノール系でシリカゲルク口マトグラフィ一にて 精製した。 これを無水メタノールに懸濁し、 28%Na0Meを滴下し、 室温で 0.5h攪 拌した。 反応混合物に水を加え、 イオン交換樹脂 （スルホン酸- ¾型） で中和し た。 樹脂を濾過により除き、 溶媒を減圧下濃縮乾固し、 クロ口ホルム/メタノ一 ル系でシリカゲルクロマトグラフィーにて精製して、 目的物を得た （収量 10mg: 収率 6%)
淡黄色結晶、 MS (ESI) w/z： 447 [M+H] +
'H- MR(DMS0-d6) S3.18(1H， t， J =91 ）， 3.28(1H, t, J=9Hz), 3.32 (1H, t, J=9 Hz), 3.41 (1H, m), 3.50 (1H, dd， J=6Hz, 12Hz), 3.71 (1H, dd, J=2Hz, 11Hz), 3.88(3H, s), 5.04(1H, d, J=7Hz), 6.40(1H, d， J=2Hz), 6.83(1H, d, J=2Hz),
6.94(1H, s), 7.2K2H, d， J=9Hz), 8.07(2H， d， J=9Hz)
実施例 10 : 4H，8H—べンゾ [1,2— b:3,4— b' ；]ジピラン一 4-オン， 2— (2, 4—ジヒ ドロキシフエニル）一 5—ヒドロキシ一 8， 8—ジメチルー 3—（3—メチル _ 2—ブテ ニル） （化合物 1-28) の単離
タイ産生薬の Jack Fruit Tree (Artocarpus heterop!iyllus(Di ^) 169gをメタ ノールで一週間室温抽出し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 8.1 gのう ち、 4.7 gを中圧クロマトグラフィーによりへキサンで溶出した後 （A画分） 、 へ キサン-酢酸ェチル （4:1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出 して （C画分） 、 更にメタノールで溶出した （D画分） 。 得られた C画分 3.2gを中 圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより 254 nmにてモニターしながらクロロ ホルムで溶出した後、 クロ口ホルム-メタノール （98:2) 混合溶液、 同 （19: 1) 、 (9:1) 、 (4:1) 、 (2:1) 、 (1:1) 混合溶液、 メタノールの順に溶出し 1 0画分を得た。 クロ口ホルムで溶出された C4画分 （217 mg) を高速液体クロマト グラフィ一 （Mightysil RP-18 GP、 6.0X 250 mm、 ァセトニトリル-水の （70:3 0) 混合溶液で溶出） で分析し、 保持時間 9.8分 （化合物 1-28) のピークを分取し た。 この化合物の分析結果は次の通りである。 .
化合物 1-28
MS (ESI) m/z: 421[M+H]+, 419[M_H]一
-丽 R(CD30D) δ : 1.36(C , s), 1.43(CH3X2, s), 1.58(C¾, s), 3.08 (H, d, J=6.8), 5.09(H, tt, /=6.8, 3.9), 5.66(C9-H, d， 7-9.8), 6.25(C6-H, s), 6. 39 (C5. -H, dd, 7=8.3, 2.4), 6.40(C3. - H, s)， 6.67(C10-H, d, 7=9.8), 7.06(C 6， 一 H, d, 7=8.3)
13C-醒 R(CD30D) (5 : 24.6 (CH3) , 25.6(CH3), 28.3 (CS-CH3X 2) , 78.7(C— 8), 95.4 (C- 6), 103.5(C-3' ), 105.8, 107.7 (C-9), 113.0(C-1' )， 116. l(C-5' )， 121. 8 (C-3) , 122.5, 132.2 (C-10), 132.5, 157.0, 157.5 (C-2' )， 158.7(C - 4， )， 16 0.3(C-7), 161.7(C-2), 163.4(C-5), 183.6 (C— 4)
実施例 1 1 : 2， ,4' ,5—トリヒドロキシー 7—メトキシ 6_ (3—メチル—1ーブテ 二レ）一 3— (3—メチルー 2—ブテニル）ーフラボン （化合物卜 29) の単離 タイ産生薬の Jack Fruit Tree {Artocarpus heterophyl lusDi$V) 169gをメタ ノールで一週間室温抽出し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 8.1 gのう ち、 4.7 gを中圧クロマトグラフィーによりへキサンで溶出した後 （A画分） 、 へ キサン-酢酸ェチル （4:1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出 して （C画分） 、 更にメタノールで溶出した （D画分） 。
クロ口ホルムで溶出された C4画分 （217 mg) を高速液体クロマトグラフィー （Mi ghtysil RP-18 GP、 6.0X250 ram, ァセトニトリル -水の （70:30) 混合溶液で溶 出） で分析し、 保持時間 8.5分 （化合物 1-29) のピークを分取した。 この化合物 の分析結果は次の通りである。
化合物 1-29
MS (ESI) m/z: 437[M+H]+， 435 [M+H]"
¾-NMR(CD30D) 5： 1.02(C17,' C18— CH3， d， ら.83)， 1.33 (C12— CH3， s)， 1.52 (C13 - CH 3， s)， 2.33 (C16-H, m), 3.02, 3.04(C9— CH2， s) ， 3.77 (C7— 0CH3， s), 5.04(C10 - H， tt， ^5.4, 1.5), 6.33 (C8-H, s)， 6.34(C5,— H， d， J=9.3) , 6.36(C3. - H， d, ^3.4), 6.43(C14-H, dd, =16.1， 1.0)， 6.56 (C15-H, dd， ^16.1， 7.3)， 7.02 (C6. - H, /=8.3)
13C-NMR(CD30D) δ： 18.5 (C— 13), 24.1 (C - 17, C - 18)， 25· 8 (C - 9), 26.7 (C— 12)， 3 5.2(C-16), 57.3 (Cr0CH3) , 91.5 (C - 8), 104.6 (C— 3， ), 106.7 (C - 4a)， 108.8 (C- 5， )， 111.2 (C— 6)， 114.1(C - 1' )， 118.0(C— 14)， 122.9 (C— 3), 123.7 (C— 10), 13 3.4 (C - 11)， 133.5 (C— 6， )， 143.5 (C— 15)， 158.6 (C- 2' )， 158.6(C_8a)， 160.4 (C— 5)， 162.6 (C- 4， )， 164.3(C-2), 165.0(C - 7), 184.6 (C - 4)
実施例 1 2 ： 2H, 6H—べンゾ [1， 2— b:5，4— b， ]ジピラン一6—オン， 7， 8—ジヒ ド 口一 5—ヒ ドロキシ一8— (4—ヒ ドロキシフエ二ノレ）_2， 2—ジメチノレー 10—（3—メ チルー 2—ブテュル) (化合物 2 - 3) の単離
タイ ^ の Albizzia myriophyllaの枝 60.0 gをメタノールで一週間室温抽出 し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 4.4 gのうち、 3.80 gを中圧クロマ トグラフィ一によりへキサンで溶出した後 （A画分） 、 へキサン-酢酸ェチル （4: 1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出して （C画分） 、 更にメ タノ一ルで溶出した （D画分） 。 得られた B画分 1.2 gを高速液体クロマトグラフ ィ一 （Mightysil RP-18 GP、 6.0X 250 mm, ァセトニトリル-水の （70:30) 混合 溶液で溶出） で分析した結果、 保持時間 15.2分のピークを示す画分が得られた。 この化合物の分析結果は次の通りである。
MS (ESI) m/z: 407[M+H]+, 405 [M-H]"
-NMR(CDCl3) δ : 1.43, 1.45 (C2，， '— C X 2， s), 1.65 (C3,， -C¾X 2， s), 2.80 (C3-H, dd, 7=17.1, 3.2) , 3.39(C3-H, dd， 7=17.1, 2.9), 3.21 ( ， -¾, d， 7-7.3), 5.14 (C2.. -H, t, /=7.3), 5.34(C2-H, dd, 7=12.7, 2.9)， 5.50 (C3- '， ' H, d， 7=10.0), 6.63(C4, , ,-H, d， 7=10.0), 6.87(C3. -H, C5， -H, d, J= 8.8), 7.32(C2. -H, C6， -H, d， J=8.8)
I3C-NMR(CDC13) δ： 17.8(C - 5，，一 C¾)， 21.5(C-1' ， ）， 25.8 (C4..— C¾)， 28.3 (C. 6, , ,-CH3), 28.4(C— 5... - CH3)， 43.2(C-3), 78.KC-2' ' ， ）， 78.5(C-2), 102. 7(C - 10)， 102.8(C-6), 108.6(C-8), 115.5(C - 3' ， C- 5， ), 115.7(C-4' ， ， ), 122.5(C-2' ' ), 126.0(C-1' )， 127.7(C-2' , C - 6， ), 131. KC-3' ' ' ), 15 5.8(C-4' ), 156.6 C- 9)， 159.3(C-5), 160.0(C-7), 196.4(C-4)
実施例 13 ： 6 711-[1]べンゾピラノ[4,3— 1)] [1]べンゾピラン一7_ォン，3,8，10 —トリヒドロキシ _9_ (3-メチル-卜ブテニル）一 6—（2-メチル—1—プロべニル)
(化合物 5 - 1) の単離
タイ産生薬の Jack Fruit Tree (Artocarpus 力 e/erop力 W/ の木部) 169gをメタ ノールで一週間室温抽出し、 抽出液を減圧乾固した。 得られたエキス 8。 1 gのう ち、 4.7 gを中圧クロマトグラフィーによりへキサンで溶出した後 (A画分) 、 へ キサン-酢酸ェチル （4:1) 混合溶液で溶出し （B画分） 、 続いて酢酸-ェチル溶出 して （C画分） 、 更にメタノールで溶出した （D画分） 。 得られた C画分 3. ½を中 圧シリカゲルカラムクロマトグラフィにより 254 nmにてモニターしながらクロ口 ホルムで溶出した後、 クロ口ホルム -メタノール （98:2) 混合溶液、 同 （19: 1) 、 (9:1) 、 (4:1) 、 (2:1) 、 (1:1) 混合溶液、 メタノールの順に溶出し 1 0画分を得た。 クロロホルムで溶出された C3画分を高速液体ク口マトグラフィー (Mig tysil RP-18 GP、 6.0X 250腿、 ァセトニトリル-水の (70:30) 混合溶液 で溶出） で分析し、 保持時間 10.8分 （化合物 5-1) のピークを分取した。
この化合物の分析結果は次の通りである。
化合物 5 - 1
MS (ESI) m/z: 421[M+H] +
¾-丽 R(CD30D) δ :1.92(CH3X2， d, 7=6.6), 1.70(CH3, d, 7=1.2), 1.95(CH3, d， 1.2), 2.4KCH, m), 5.40 (CH=, dt, /=9.5, 1.2), 6.14(C6-H, d, 7=9.3), 6.30(CrH, d, 7=2.2), 6.42(Cn-H, s)， 6.50(C4-H, dd, J=8.5, 2.2), 6.53(= CH, dd, 7=16.1, 1.0), 6.68(CH=, dd, 16.1， 7.0), 7.59(C H, d, J=8.5) 13C-NMR(CD30D) δ :19.3(CH3), 23.9(CH3X2), 26.6(CH3), 35.0, 67.3, 71.3, 9 5.0(C-11), 105.6(C-4), 106.0, 109.3, 110.9, 111.6, 118.0(C - 2)， 123.2, 12 6.8(C— 5)， 140.4, 143.2, 156.9, 157.6 (C-5), 160.1, 161.2(C-8), 163.6 (C- 3), 165.3(C-10), 180.4(C-7)
実施例 14 ： SN- 38耐性 A549細胞の樹立
ヒト非小細胞肺癌 A549細胞は、 10% FBS、 100 U/mlペニシリンおよび 100 g/ml ストレプトマイシンを含有した Ham' s F- 12培地 （10% FBS/Ham' s F-12) を使用 して 5% C02, 37°C 条件下で継代培養した。 SN-38耐性 A549細胞は、 A549細胞を培 地中の SN- 38濃度を段階的 （4〜10 ng/ml) に増加させて 2ヶ月間継代培養して選 択した。 さらに、 この SN - 38耐性 A549細胞から限界希釈法によるクローン化を行 い、 6株のクローン化 SN-38耐性 A549細胞 (A549/SN- 38- 1〜6) を樹立した。
実施例 15 ： A549/SN- 38細胞の抗癌剤感受性試験
A549または A549/SN- 38- 1〜6の各細胞を 10% FBS/Ham' s F - 12に懸濁し、 96ゥェ ルマイクロプレートに播種して 5% C02、 37°C条件下で培養した （2 103 cells/ 50 l/well) 。 一晩培養後、 抗癌剤を溶解した 10% FBS/Ham' s F-12を 50 l加 え、 5% C02 37°C条件下で 48時間培養した。 培養後、 生細胞測定用試薬 [TetraC olor ONE (商標名） 、 生化学工業製〕 を使用して、 添付の操作手順に従って生細 胞数を測定した。 各種抗癌剤に対する A549細胞および A549/SN- 38細胞 6株の感受 性を表 6および図 1に示す。 なお、 IC5Q値は細胞増殖を 50%抑制する抗癌剤の濃度 である。 また、 相対耐性度は、 A549/SN-38細胞における IC5。値を A549細胞におけ る I C5。値で除した値であり、 この値が大きいほど耐性獲得が大きいことを意味す る。 A549/SN- 38細胞は、 BCRPの基質である SN-38およびミトキサントロンに対し て特に強い耐性を示した。
¾ 6
抗癌剤 A549 A549/SN-38 _ _
1 2 3 4 5 6
IC5。 ^g/ral
(相対耐性度）
SN-38 0.013 0.12 0.10 0.13 0.10 0.10 0.10
(9.2) (7.5) (9.7) (7.7) (7.7) (7.4) ハ。クリタキセル 0.0049 0.0098 0.012 0.013 0.014 0.0061 0.0071
(2.0) (2.4) (2.7) (2.8) (1.2) (1.4) エトホ。シト、、 0.90 0.27 0.80 1.6 3.5 2.3 1.0
(0.3) (1.0) (1.9) (4.0) (2.7) (1.1) シスフ。ラチン 18.6 15.1 16.5 15.1 17.0 15.9 16.8
(0.8) (0.9) (0.8) (0.9) (0.9) (0.9)
5-フ Mロウラシル 2.1 4.3 1.3 0.69 0.91 1.7 1.0
(2.0) (0.6) (0.3) (0.4) (0.8) (0.5) ゲムシタビン 0.0090
(0.4) (0.6) (0.4) (0.4) (0.4) (0.4) ドキリルビシン 0.10 0.19 0.14 0.12 0.22 0.057 0.049
(1.9) (1.4) (1.3) (2.3) (0.6) (0.5) マ仆マイシン C 0.11 0.13 0.11 0.0029 0.15 0.11 0.047
(1.2) (1.1) (0.3) (1.4) (1.0) (0.4) 実施例 16 A549/SN- 38細胞の RT- PCR解析 A549細胞、 A549/SN - 38細胞 6株および BCRPを発現していることが知られるヒト 乳癌 MCF-7細胞における各種薬剤輸送蛋白質の mRNAの発現を RT-PCR法により解析 した。 細胞より RNA抽出用試薬 〔I S0GEN (商標名） 、 二ツボンジーン製〕 を用い て全 RNAを抽出し、 RT - PCR用試薬 〔Ready -To "Go RT-PCR Beads (商標名） 、 ァ マシャム フアルマシア バイオテク （Amersham Pharmac i a b i ot ech) 製〕 およ びサ一マルサイクラ一 〔i Cyc l er (商標名） 、 バイオ，ラッド （BI0-RAD) 製〕 を 使用して添付の操作手順に従って RT-PCRを行った （全 RNA : 0. 5 g) 。 PCR産物 は、 2%ァガロースゲルを用いて電気泳動後、 ェチジゥムブ口マイド染色を施して トランスイルミネーターにて検出した。 また、 リアルタイム RT-PCR用試薬 〔SYBR Green RT-PCR Reagent s (商標名） 、 アプライド バイオシステムズ （Appl i ed Bi osys tems) 製〕 および PCRプロダクト自動検出/定量システム 〔ABI PRISM 700 0 (商標名） 、 アプライド バイオシステムズ製〕 を使用して添付の操作手順に 従ってリアルタイム RT- PCR法を行い、 定量的な解析を行った （全 RNA Ο Λ g) 。 なお、 BCRP、 MDR1、 MRP 1、 MRP2、 MRP3および内在性コントロール遺伝子の G 3PDHに対する各 PCRプライマ一は、 それぞれ公知の mRNA塩基配列 （ァクセッショ ン番号 o. AF09895 K AF016535, L05628, U63970, AF009670, M33197) よりデ ザインした。 RT-PCRの結果を図 2に、 リアルタイム RT-PCRの結果を図 3に示す。 A5 49細胞に比較して A549/SN-38細胞 6株では全てにおいて BCHPの発現が顕著に増加 していた。 一方、 BCRPと同じく SN- 38を基質とする MRP2の発現量に大きな違いは 認められなかった。 また、 その他の薬剤輸送蛋白質についても A549細胞および A5 49/SN- 38細胞間で発現量に違いは認められなかつた。 これらの結果から、 BCRPが A549/SN-38細胞の抗癌剤耐性機構に関与することが示唆された。 なお、 本 RT- PCR 解析で、 ヒト乳癌 MCF- 7細胞における BCRP発現も確認された。 一方、 薬剤輸送蛋 白質の発現の他にも、 トポイソメラ一ゼ- 1、 トポイソメラ一ゼ -1 1、 Be卜 2、 Bax および I κ Β αの発現をウエスタンブロット法により、 トポイソメラーゼ- 1活性に ついて DM弛緩反応を指標に検討したが、 これらが A549/SN - 38細胞の抗癌剤耐性 機構に関与することを示唆するデータは得られなかった。
実施例 1 7 ： A549/SN- 38細胞の抗癌剤蓄積量
A549細胞または A549/SN-38- 4細胞 (4 x 106 cel l s/ml) を懸濁した 10% FBS/RP MI 1640 1mlに SN-38 DMS0溶液 1 1 (最終濃度: 300 ng/ml) を加えて 37°Cにて 60 分間インキュベート後、 遠心 （2°C、 1 , 400 X g、 1 min) して上清を除去した。 沈殿した細胞に氷冷 PBSを加えて再懸濁後、 遠心 （2°C、 1, 400 X g、 1 min) して 細胞を洗浄した。 この洗浄操作をさらに 1回行った後、 PBS 375 x lを加えて超音 波処理により細胞を破壊した。 この細胞破壊液にメ夕ノ一ル 375 1および 10%硫 酸亜鉛溶液 15 lを加えて攪拌後、 遠心 （2°C、 12, 500 x g、 5 min) して上清を 回収した。 蛍光強度測定用の白色 96ウェルマイク口プレートに回収した上清を分 注後 （200 / we l l) 、 マイクロプレート蛍光光度計 [SPECTRA max GEMINI XS
(商標名） 、 モレキュラー デバイス（Molecul ar Devi ces)製〕 により上清中の S N- 38および SN-38グルクロン酸抱合体量を測定し （SN-38：励起波長 380 nm、 測定 波長 560 nm； SN- 38グルクロン酸抱合体：励起波長 370 亂 測定波長 430 nm) 、 細胞内の蓄積量を算出した。 その結果、 図 4に示すように、 A549/SN- 38- 4細胞の S N-38蓄積量は A549細胞におけ蓄積量に比較して約 1/5に減少していた。 この結果 は A549/SN- 38細胞の抗癌剤耐性機構に BCRPが関与することを支持するものであ る。 一方、 SN- 38グルクロン酸抱合体は両細胞においてほとんど検出されず、 グ ルク口ン酸抱合活性の耐性機構への関与はないことが示された。
実施例 1 8 ： フラボノィド化合物による A549/SN- 38細胞の抗癌剤耐性に対する克 服作用
A549細胞または A549/SN- 38- 4細胞を 10% FBS/Ham' s F- 12に懸濁し、 96ゥエル マイクロプレートに播種して 5% C02、 37°C条件下で培養した （2 103 ce l l s/50 l/we l l) 。 ー晚培養後、 フラボノイド化合物および SN - 38を溶解した 10% FBS/H am' s F- 12をそれぞれ 25 1加え、 5% C02、 37°C条件下で 48時間培養した。 培養 後、 Tet raCo lor ONEを使用して、 添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。 各フラポノイド化合物の耐性克服効果を表 7に EC5。値で示す。 なお、 EC5。値は、 相 対耐性度を 50%低下させる時のフラボノイド化合物の濃度である。 その結果、 フ ラボノィド化合物は A549/SN- 38-4細胞の SN-38耐性に対して強力な克服作用を示 した。 一方、 濃度依存的に耐性を克服する濃度範囲において、 フラポノイド化合 物自体は A549細胞および A549/SN- 38- 4細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。 この 結果は、 本発明のフラポノイド化合物が BCRPを阻害し、 癌細胞の抗癌剤耐性を克 服することを示唆するものである。
oc
•0 H-l
OAOO •0 sz-i
,0 u-\
•0 u-\
9A •0 OH
310 •0 61-1 n •0 81-1
090 •0 L\-\
860 •0 91-1
91 •0 Sl-l
8A00 •0 n-i
Π •0 εΐ-ι O •0 Ζΐ-ΐ
91 •0 Π-ΐ l\ •0 οι-ι l\ •0 6-1
9 •0 8-1
ST '0 L-\
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180 •0 S-ΐ οεο •0 -ΐ
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1-26 0.14
1-27 0.042
1-28 2.0
1-29 0.23
2-1 0.15
2-2 0.48
2-3 0.067
3-1 0.040
3-2 0.23
3-3 0.16
3-4 0.023
3-5 0.040
3-6 0.0074
3-7 0.65
3-8 0.79
3-9 0.94
3-10 0.97
4-1 0.33
4-2 0.84
5 1 0.18 実施例 19 ： フラボノィド化合物による MCF- 7細胞の抗癌剤に対する感受性増強 作用
BCRPを発現していることが知られるヒト乳癌 MCF - 7細胞 (Blood 99, 3763-3770 (2002) ) を用いて、 癌細胞の抗癌剤に対する感受性に及ぼすフラポノイド化合 物の作用を検討した。 MCF-7細胞を 10% FBS/RPMI1640に懸濁し、 96ウェルマイク 口プレートに播種して 5 C02、 37°C条件下で培養した （3 X 103 eel ls/50 / 1/we 11) 。 ー晚培養後、 フラポノイド化合物および SN- 38を溶解した 10% FBS/RPMI164 0をそれぞれ 25 1加え、 5% C02、 37°C条件下で 48時間培養した。 培養後、 TetraC olor ONEを使用して、 添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。 表 8にフラ ポノイド化合物による MCF- 7細胞の SN- 38に対する感受性の変化を、 IC5Q値 （細胞 増殖を 50%抑制する SN- 38の濃度） で表した。 その結果、 フラポノイド化合物は MC F-7細胞の SN-38に対する感受性を増強した。 一方、 濃度依存的に感受性を増強す る濃度範囲において、 フラポノィド化合物自体は MCF- 7細胞の増殖に影響を及ぼ さなかった。 この結果は、 本発明のフラポノイド化合物が BCRPを阻害し、 抗癌剤 に対する癌細胞の感受性を増強することを示唆するものである。
表 8 化合物 化合物濃度 （ g/ml)
0 0.1 1.0
SN-38: IC50 ( g/ml)
1-1 0.021 0.014 0.0063
1-2 0.014 0.013 く 0.003
1-4 0.037 0.012 0.0061
1-14 0.024 0.015 0.0077
1-19 0.021 0.014 0.0038
2-1 0.031 0.022 0.011
3-1 0.016 0.015 0.0085
3-4 0.032 0.013
3-6 0.059 0.023 0.011 実施例 20 ： フラポノイド化合物によるヒト BCRP遺伝子導入マウス白血病 P388 細胞の抗癌剤耐性に対する克服作用 マウス白血病 Π88細胞またはヒト BCRP遺伝子導入 P388細胞 （P388/BCRP細胞、 財団法人癌研究会癌化学療法センター 杉本芳一氏より入手） を 10% FBS/RPMI 16 40に懸濁して 96ウェルマイク口プレートに播種後 （1 X 104 cel l s/50 |i l/we l 1) 、 フラポノイド化合物および SN- 38を溶^した 10% FBS/RPNI1640をそれぞれ 25 l加え、 5% C02、 37°C条件下で 48時間培養した。 培養後、 Tet raColor ONEを使 用して、 添付の操作手順に従って生細胞数を測定した。 その結果を図 5に示す。 フラポノィド化合物は P388/BCRP細胞の SN-38耐性に対して強力な克服作用を示し た。 一方、 P388細胞の SN-38に対する感受性に対しては影響を及ぼさなかった。 この結果は、 本発明のフラボノィド化合物に BCRP阻害作用があることを確証づけ るものである。
実施例 2 1 ：フラボノィド化合物による MES- SA/DX5細胞の多剤耐性に及ぼす作用 ヒト子宮癌 MES- SA細胞または P-糖蛋白質を高発現して多剤耐性を獲得した MES- SA/Dx5細胞 (Cancer Res. 45, 4091-4096 (1985) ) を 10% FBS/DMEMに懸濁し、 9 6ウェルマイク口プレートに播種して 5% C02、 37°C条件下で培養した （3 X 103 ce l ls/50 ^ I/wel l) 。 ー晚培養後、 フラポノイド化合物およびパクリタキセルを溶 解した 10% FBS/DMEMをそれぞれ 25 加え、 5% C02、 37°C条件下で 48時間培養し た。 培養後、 TetraColor ONEを使用して、 添付の操作手順に従って生細胞数を測 定した。 各フラボノィド化合物の多剤耐性に及ぼす作用を表 9に EC5Q値で示す。 なお、 EC5。値は、 相対耐性度を 50%低下させる時のフラボノイド化合物の濃度で ある。 その結果、 検討した濃度範囲において、 フラボノイド化合物は MES- SA/Dx5 細胞のパクリ夕キセル耐性に影響を及ぼさなかった。 また フラボノィド化合物 自体は MES-SA細胞および HES-SA/DX5細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。 この結 果から、 本発明のフラボノイド化合物は P-糖蛋白質には作用せず、 BCRPに対して 特異性を有することが示された。 表 9 化合物 耐性克服作用
Figure imgf000037_0001
1-1 >1. 0
1-2 >1. 0
1-3 >1. 0
1-4 >1. 0
1-5 >1. 0
1-6 >1. 0
1-7 >1. 0
1-8 >1. 0
1-9 >1. 0
1-10 >1. 0
1-1 1 〉1. 0
1-12 >1. 0
1-13 〉1 0
1-14 >1 0
1-15 〉1 0
1-16 >1 0
1-17 >1 0
1-18 〉1 0
1-19 >1 0
1-20 >1 0
1-21 >1 0
2-1 >1 0
2-2 >1 . 0
3-1 >1 . 0 3-2 〉1. 0
3-3 >1. 0
3-4 >1. 0
3-5 〉1. 0
3-6 >1. 0
3-7 >1. 0
3-8 >1. 0
3-9 >1. 0
3-10 〉1. . 0
4-1 >1. 0
4-2 >1. , 0 実施例 2 2 ： フラポノイド化合物による BCRP発現細胞の抗癌剤蓄積量に及ぼす 作用
P388細胞および P388/BCRP細胞 (1 107 cel ls/ml) 、 または MCF-7細胞 (3 x 106 cel ls/ml) を懸濁した 10% FBS/RPMI 1640 1mlにフラポノイド化合物および S N - 38 (最終濃度： 500 ng/ml) を加えて 37°Cにて 60分間インキュベート後、 遠心 (2°C、 1, 400 X g、 1 min) して上清を除去した。 沈殿した細胞に氷冷 10%FBS/RP MI 1640を加えて再懸濁後、 遠心 （2 、 1 , 400 x g、 1 min) して細胞を洗浄し た。 この洗浄操作をさらに 1回行った後、 PBS 375 1を加えて超音波処理により 細胞を破壊した。 この細胞破壊液にメタノール 375 1および 10%硫酸亜鉛溶液 15 lを加えて攪拌後、 遠心 （2°C、 12, 500 X g、 5 min) して上清を回収した。 蛍 光強度測定用の白色 96ウェルマイク口プレートに回収した上清を分注後 (200 / wel l) 、 マイクロプレート蛍光光度計により上清中の SN-38量を測定し （SN- 38： 励起波長 380 nm、 測定波長 560 nm) 、 細胞内の蓄積量を算出した。 その結果、 図 6に示すように、 本発明のフラポノィド化合物は P388/BCRP細胞の SN 38細胞内蓄 積量を増加させた。 また、 図 7に示すように、 本発明のフラポノイド化合物は MC F-7細胞の SN-38蓄積量を増加させた。 この結果は、 本発明のフラボノイド化合物 が BCKPを阻害し、 抗癌剤の細胞内取り込み量を増加させることを示唆するもので ある。
実施例 2 3 ： フラポノイド化合物の in vivoにおける抗癌剤耐性克服効果
6週齢の CDF,系、 雌マウス （5匹/群） の腹腔内に、 P388細胞または P388/BCRP (1 X 106 c e l l s/mouse) を移植し、 フラボノイド化合物および塩酸イリノテカ ン （CPT-11) を腫瘍移植 1日後より 10日後まで 1日 1回、 計 10回腹腔内に投与し た。 なお、 フラボノィド化合物はエタノール、 ポリオキシエチレン（20)ソルビタ ンモノォレエート 〔Tween 80 (商標名） 、 東京化成工業製〕 および 5% ダルコ一 ス混合液 （エタノール I Tween 80 I 5% グルコース = 5 ： 5 ： 90) に懸濁 し、 CPT-11は生理食塩水に溶解して投与し、 対照群には溶媒のみを投与した。 腫 瘍移植後のマウスの生存日数を調べ、 次式より延命率 T/C (%) を求め、 抗腫瘍効 果を判定した。
延命率 T/C (%) =
(投与群マウスの平均生存日数） ÷ (対照群マウスの平均生存日数） X 100 結果を表 10に示す。 本発明のフラポノィド化合物は in vivoにおいても BCRPを 阻害し、 抗癌剤耐性克服効果を発揮することが示された。
表 10 化合物 投与量 （mg/kg/day)_ _生存日数 T/C
化合物 CPT-11 平均 土 （％)
: 標準偏差
1-14 100 20 18.4 土 4.5 153
1-15 100 20 18.2 土 3.9 152
3-5 100 20 18.4 土 0.5 153 溶媒 0 20 14.6 土 0.5 122 溶媒 0 0 12.0 土 0.7 100 実施例 24 ： 以下に示す成分を混和して、 その混和物を打錠した。
表 11 化合物 1-1 100 mg
乳糖 100 mg
バレイショデンプン 39 mg
微結晶セルロース 30 mg
合成ケィ酸アルミニウム 30 mg
ステアリン酸カルシウム 1 mg
全量 （1錠分） 300 mg 本発明によって、 BCRPが関与する抗癌剤耐性を克服することが可能となる。 ま た、 もとから BCRPを発現する癌に対して抗癌剤の効果を増強させることが可能で ある。 さらには抗癌剤のバイオアべィラビリティを向上させることも期待され、 癌化学療法における治療成績の向上につながることが期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 下記式 （1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 又は (5) ：
Figure imgf000041_0001
(1)
〔式中、 は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基又は低級アル キル基を示し、 7個の R2は同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基、 低級ァ ルコキシ基、 低級アルキル基、 低級アルケニル基又は糖残基を示すか、 或は隣接 する と共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよ く、 R3は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルキル基、 低級アルコキシ 基、 アミノ基又はニトロ基を示す。 〕
Figure imgf000041_0002
(2)
〔式中、 R4は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基、 低級アルキ ル基又は低級アルケニル基を示し、 7個の R5は同一でも異なってもよく、 水素原 子、 水酸基、 低級アルコキシ基又は低級アルキル基を示すか、 或は瞵接する二つ の R5は共に低級アルキル基で置換されていてもよいピラン環を形成してもよく、 R6は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基、 低級アルキル基、 ァ 又はニトロ基を示す。 〕
Figure imgf000042_0001
(3)
〔式中、 R7は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子、 低級アルコキシ基又は低級アル キル基を示し、 2個の R8は同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基、 低級ァ ルコキシ基又は低級アルキル基を示し、 R9は水素原子、 水酸基、 ハロゲン原子又 は低級アルコキシ基を示し、 5個の R1Qは同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基又は低級アルコキシ基を示す。 〕
Figure imgf000042_0002
(4)
〔式中、 3個の Ruは同一でも異なってもよく、 水素原子、 水酸基又は低級アル コキシ基を示す。 〕
Figure imgf000042_0003
(5)
〔式中、 R12は水素原子又は低級アルケニル基を示し、 RI Sは水素原子又は水酸基 を示し、 Ruは水素原子を示す。 〕 で表されるフラボノィド化合物、 又はその配糖体、 エステル若しくは塩を有効成 分とする乳癌耐性蛋白阻害剤。
2 . 請求項 1記載のフラポノイド化合物 （1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 又は (5)、 その配糖体、 エステル若しくは塩を有効成分とする、 BCRP関与の耐性を獲得した 癌に対する抗癌剤耐性克服剤又は BCRPを発現し、 抗癌剤に対して低感受性の癌に 対する抗癌剤効果増強剤。
3 . 請求項 1記載のフラポノイド化合物 （1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 又は (5)、 又はその配糖体、 エステル若しくは塩、 および BCRPの基質となり得る抗癌剤を含 有する抗癌剤。
4. 下記式 （6) ：
Figure imgf000043_0001
〔式中、 Rl5はァミノ基またはニトロ基を示す。 〕
で表されるフラボノィド化合物。
5 . 式 （6) において R15がニトロ基を示す請求項 4記載のフラポノイド化合 物。
6 . 式 （6) において R15がァミノ基を示す請求項 4記載のフラボノィド化合 物。
7 . BCRPを高発現する 7—ェチルー 10—ヒドロキシカンプ卜テシン (SN-38) 耐 性ヒト非小細胞 J!fii癌 A549細胞。
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