WO2004059323A1 - 質量分析法を利用するペプチドｃ末端アミノ酸配列解析方法 - Google Patents

質量分析法を利用するペプチドｃ末端アミノ酸配列解析方法 Download PDF

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amino acid
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Kenji Miyazaki
Akira Tsugita
Kenichi Kamijo
Hiroaki Torii
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Nec Corporation
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    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method of analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide, and more specifically, to a peptide having a large number of amino acid residues, such as a peptide, for example, a protein, by a chemical method.
  • the present invention relates to a method for sequentially decomposing amino acids, determining the molecular weight of the reaction product by mass spectrometry, and elucidating the C-terminal amino acid sequence based on the molecular weight decrease caused by a series of sequentially removed amino acids.
  • the present invention relates to a method for analyzing a mass spectroscopy spectrum that can be used for identifying a species peak and elucidating a c-terminal amino acid sequence.
  • Identification of the amino acid sequence of peptide proteins obtained from nature is essential information when studying the biological properties and functions of powerful peptides and proteins.
  • the entire amino acid sequence of peptides and proteins is deduced based on the corresponding genetic information, that is, the genomic genes encoding these peptides and the nucleotide sequence of c-DNA prepared from m-RNA. Amino acid sequence.
  • knowledge of the partial amino acid sequence of the peptide is still necessary in order to identify the genomic gene encoding the peptide or the c-DNA prepared from m-RNA.
  • the N-terminal amino acid sequence and the C-terminal amino acid sequence of the peptide are considered to be particularly useful.
  • the target c-DNA is selected using the prepared nucleic acid probe based on the amino acid sequences at both ends. It is possible to do.
  • it is possible to selectively amplify a target c-DNA by applying a PCR method using an oligonucleotide nucleotide primer prepared based on the amino acid sequences at both ends.
  • a method of analyzing the N-terminal amino acid sequence of a peptide As a method of analyzing the N-terminal amino acid sequence of a peptide, a method has conventionally been used in which the N-terminal amino acid is sequentially degraded and the generated amino acid derivative is identified using the Edman degradation method.
  • the C-terminal amino acid is sequentially degraded by a chemical method, and the molecular weight difference between the shortened -peptide obtained as the reaction product and the original peptide is used.
  • a method for specifying the degraded C-terminal amino acid has already been proposed.
  • a high concentration aqueous solution of pentafluoropropanoic acid (CF 3 CF 2 COOH) is added to dried peptides while heating to 90 ° C, or Heptafluorobutanoic acid (CF 3 CF 2 CF 2 COOH)
  • the steam generated from a highly concentrated aqueous solution acts to selectively hydrolyze the C-terminal amino acid promoted by the perfluoroalkanoic acid.
  • Proposed methods have been proposed, rsugita, A. eta 1., Eur. J. Biochem. 206, 691-696 (1992)).
  • a method for selectively degrading the C-terminal amino acid has been proposed (Tsugita, A. eta 1 Chem. Lett. 1992, 235-238; Takamo to K. eta 1., Eu r. J. Bioche m. 228, 362-372 (1995)).
  • the selective decomposition reaction of the c-terminal amino acid proceeds sequentially, and after a predetermined processing time has elapsed, 1 to 10 amino acid residues are removed from the C-terminal of the original peptide, respectively.
  • a mixture containing a series of reaction products is obtained.
  • mass spectrometry By applying mass spectrometry to the mixture containing this series of reaction products and measuring the mass of the ion species derived from each reaction product, a series of peaks showing a mass difference reflecting the C-terminal amino acid sequence was obtained. Can be measured.
  • each reaction product is generated by a sequential C-terminal amino acid degradation reaction from the original peptide, resulting in several types of reaction products, for example, a reaction product in which several amino acid residues have been removed from the original peptide.
  • mass spectrometry for a series of reaction products, the mass of the corresponding ion species can be analyzed at once, and the C-terminal amino acid sequence of several powerful amino acid residues can be determined at once. it
  • the C-terminal amino acid sequence used for the preparation of nucleic acid probes and primers The sequence information is usually about 18 to 24 bases in length as a base sequence encoding a powerful amino acid sequence, and thus may be about 6 to 8 amino acids in length, and 10 amino acid residues
  • the elucidation of the C-terminal amino acid sequence up to is only required in very special cases. Therefore, the above-mentioned perfluoroalkanoic acid or perfluoroalkanoic anhydride vapor is supplied from the gas phase while acting on the dried peptide.
  • the peptide to be analyzed is a peptide having a large number of amino acid residues, such as a protein
  • the molecular weight of the original peptide itself exceeds the molecular weight range applicable to mass spectrometry, or For the large molecular weight of the original peptide itself,
  • a C-terminal peptide fragment derived from the original peptide and, in contrast, 1 to 10 amino acid residues from its C-terminal C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products removed from each other are included, and the mass of this original peptide and C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products is
  • a series of peaks showing a mass difference reflecting the C-terminal amino acid sequence can be obtained with sufficient molecular weight resolution. Can be measured.
  • the above-described method of reacting the dried peptide with supplying the vapor of perfluoroalnic acid or perfluoroalnic anhydride from the gas phase, which is available, is available.
  • it is a useful means for elucidating the c-terminal amino acid sequence when the peptide to be analyzed is, for example, a peptide having a large number of amino acid residues, such as a protein, etc. It has been found that some practical issues remain.
  • the first problem is to use the above-mentioned high-concentration aqueous solution of perfluoroalkanoic acid, for example, by heating to 90 ° C and applying perfluoroalkanoic acid vapor to the dried peptide.
  • the serine residue ⁇ NH—CH (CH 2 OH) —CO—
  • the acyl transfer reaction also proceeds, followed by hydrolysis, with the side reaction of cleavage of the peptide at the terminal end of the serine residue.
  • the perfluoroalkanoic anhydride vapor generated from this solution acts on the dried peptide.
  • the method is to avoid the occurrence of the above-mentioned secondary reaction because the system does not contain water molecules that evaporate from the solution. Have a point.
  • the perfluoroalkanoic anhydride used has high reactivity, and if the treatment temperature rises, it becomes difficult to effectively suppress unnecessary side reactions. For example, it must be kept at a low temperature, such as 18 ° C.
  • the second problem is that if the peptide to be analyzed is, for example, a peptide having a large number of amino acid residues, such as a protein, the cleavage site after performing a selective degradation reaction of the c-terminal amino acid It has been studied to adopt a form in which the enzymatic digestion treatment using a protease having specificity is added and the molecular weight of the resulting C-terminal peptide fragment is measured. A plurality of N-terminal peptide fragments, which are produced as byproducts, will be simultaneously observed on the measured mass spectrometry spectrum.
  • the peak derived from the original peptide and C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products and the peaks derived from other N-terminal peptide fragments are separated with high accuracy.
  • a measurement method that can more accurately determine the molecular weight of each of the peaks derived from the original peptide and C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products.
  • peaks of ion species derived from peptide fragments generated by enzymatic digestion are identified on the measured mass spectrometry spectrum, and then peaks of ion species derived from a plurality of N-terminal peptide fragments are identified. Proposal of effective mass spectrometry analysis method for highly accurate separation of ionic species peaks derived from the original peptide and C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products Is waiting.
  • the present invention solves the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to sequentially convert the above-mentioned C-terminal amino acid of a long peptide chain by utilizing a reaction mechanism via formation of an oxazolone ring structure.
  • an object of the present invention is to sequentially convert the above-mentioned C-terminal amino acid of a long peptide chain by utilizing a reaction mechanism via formation of an oxazolone ring structure.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of analyzing a C-terminal amino acid sequence more easily.
  • an ion species peak derived from a peptide fragment generated by the enzymatic digestion is identified on a mass spectrometry spectrum to be measured, and thereafter, the target In discriminating between peaks caused by a group of C-terminal peptide fragments derived from a peptide and a series of reaction products and peaks caused by a plurality of other enzymatically digested peptide fragments, such a discrimination is required.
  • An object of the present invention is to provide a mass spectrometry analysis method capable of improving the accuracy and analysis support software that can be used for a series of analysis processing operations based on the analysis method.
  • the present inventors have conducted intensive studies and studies in order to solve the above-mentioned problems, and found that using a high-concentration aqueous solution of perfluoroalkanoic acid, for example, heating the peptide to 90 ° C and drying the peptide
  • An unnecessary side reaction in the method of applying perfluoroalkanoic acid vapor to the surface is that perfluoroalkanoic acid and water molecules evaporate from the concentrated aqueous solution of perfluoroalkanoic acid in the system. Therefore, for example, in a serine residue (1-NH—CH (CH 2 OH) —CO—) in a peptide, an amino group at the ⁇ -position ( ⁇ - ⁇ ) and a hydroxy group at the 3-position ( ⁇ ).
  • the present inventors do not use an aqueous solvent as a supply source of water molecules into the system, and show high reactivity like perfluoroalkanoic anhydride It is possible to form an oxazolone ring structure as a reaction intermediate from the C-terminal amino acid without using a reagent, and then to perform a selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid accompanying the cleavage of this oxazolone ring. After searching for a suitable reaction condition, a mixture of a small amount of perfluoroalkanoic acid added to arnic acid anhydride was used, for example, from a gaseous phase, a vaporous par- tic acid supplied from this mixture was used.
  • alkanoic anhydride acts in the presence of perfluoroalkanoic acid in the presence of perfluoroalkanoic acid, and the O-acyllidation reaction proceeds preferentially and competitively inhibits the N, O-acyl rearrangement reaction I do.
  • the N-acylation reaction to the N-terminal amino group proceeds, and the amino group at the ⁇ -position of the lysine residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) -CO-) N-acylation of tyrosine residues (—NH—CH (CH 2 -C 6 H 4 -OH) -CO-) to phenolic hydroxy groups also progresses was also found.
  • reactive functional groups such as hydroxy and amino groups on side chains involved in rearrangement reactions such as N, O-acyl rearrangement reactions that induce cleavage during peptide cleavage are protected and modified.
  • an oxazolone ring structure is formed as a reaction intermediate from the target C-terminal amino acid, and only the C-terminal amino acid decomposition reaction accompanying the cleavage of this oxazolone ring is continued.
  • the treatment proceeds selectively at a processing temperature of 60 ° C. or lower.
  • the present inventors have made use of the above-mentioned perfluoroalkanoic acid and alkanoic anhydride to form an oxazolone ring structure, followed by the selective cleavage of the c-terminal amino acid accompanying the cleavage of this oxazolone ring.
  • the treatment proceeds selectively.
  • the gel electrophoresis even if the peptide is carried on such a gel carrier, it is subjected to a dehydration treatment to sufficiently remove the water impregnated in the gel carrier, and then to a dipolar aprotic
  • a solution prepared by dissolving perfluorinated arnic acid and arnic acid anhydride in a solvent is immersed in the gel carrier and the swelling of the gel is achieved, the same liquid phase reaction occurs in the gel carrier. Can be achieved.
  • the present inventors have proposed a method that involves O-acylation to a hydroxy group and N-acylation to an amino group to induce cleavage of a peptide in the middle and to participate in a rearrangement reaction such as an N, O-acylation rearrangement reaction.
  • a rearrangement reaction such as an N, O-acylation rearrangement reaction.
  • performing a selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid accompanying the cleavage of the oxazolone ring was more effective in avoiding unnecessary side reactions.
  • the peptide is carried on a gel carrier, it is subjected to a dehydration treatment to sufficiently remove the water impregnated in the gel carrier, and then the alkanoic acid is placed in a dipolar non-protonic solvent.
  • a solution prepared by dissolving the anhydride is immersed in the gel carrier and the gel is swelled, the N-acylation and o-acylation reactions in the same liquid phase are performed in the gel carrier. Found that it is possible.
  • the reactive intermediate associated with the formation of the oxazolone ring structure and the subsequent cleavage of the oxazolone ring also remains. It is necessary to subject the reactive intermediate to a hydrolysis treatment to restore the c-terminus of the reaction product to a form in which a carboxy group appears, for subsequent mass spectrometry.For example, a basic nitrogen-containing aromatic ring It was confirmed that the reaction was easily achieved by using an aqueous solution in which the compound or the tertiary amine compound was dissolved and bringing the reaction product into contact with such an aqueous solution.
  • the peptide chain of the reaction product generated by the decomposition reaction of the C-terminal amino acid also has an amino group at the N-terminus and an amino group at the side chain of a lysine residue that may be contained in the peptide chain. , N-acylation protection.
  • the present inventors have described the N-terminal amino group
  • the amino group of the side chain of lysine residue that may be contained in the peptide chain is treated with N-acylation protection.
  • N-acylation protection is applied to the amino group of the side chain of the residue, and the N-acylation is carried out. It was confirmed that peptide chains were not digested at lysine residues, and that the resulting peptide fragments were due to digestion at arginine residues.
  • a vigorous trypsin digestion process yields a common peptide fragment from a mixture of the original peptide chain and the peptide chain of a series of reaction products generated by the C-terminal amino acid degradation reaction.
  • a peptide fragment having a partial amino acid sequence containing one arginine residue at the C-terminus, and a series of peptide fragments derived from the C-terminal partial amino acid sequence and containing no arginine residue A group of C-terminal peptide fragments derived from the peptide chain of the reaction product will be obtained.
  • the average frequency of arginine residues contained in the peptide chain for example, in a long peptide chain of about 200 amino acids, at least 4 or more, at most 10 Only about arginine residues are present, and there is one arginine residue at the C-terminus, about 4 to 10 common peptide fragments, and C-terminus derived from the original peptide chain
  • the present inventors have conceived that the probability that the number of amino acids of the side peptide fragment is at least 15 amino acids or more and 50 amino acids or less is considerably high.
  • the present inventors have studied mass spectrometry of various peptide fragments, for example, MALD I-TO F-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Lime—of—Flight Mass Spectr ome try; Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry), when measuring the molecular weight with the cation species generated by the ionization treatment and the molecular weight measurement with the anion species, When cationic amino acid residues, especially arginine residues, are present, the peak intensity in the molecular weight measurement with a cationic species is significantly higher than the corresponding peak intensity in the molecular weight measurement with an anionic species.
  • MALD I-TO F-MS Microx Assisted Laser Desorption Ionization Lime—of—Flight Mass Spectr ome try
  • Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry when measuring the molecular weight with the cation species generated
  • a common peptide fragment containing one arginine residue at the C-terminus obtained by trypsin digestion is observed as a single peak with a large relative intensity in the molecular weight measurement by a cationic species, and at the same time,
  • the intensity of the peak corresponding to such a common peptide fragment is relatively weak, but it can be easily identified by comparing both measurement results, and conversely, the molecular weight measurement using anionic species Of the peaks observed at high relative intensities, originate from the partial amino acid sequence on the C-terminal side and do not contain arginine residues.
  • the group of incoming C-terminal peptide fragments can be easily identified as showing a series of peaks.
  • mass spectrometry in particular, MA LDI-TOF-MS, was performed to measure the molecular weight of the cation species generated in the ionization treatment and the molecular weight measurement of the anion species. Then, by comparing both measurement results, a series of reactions with the common peptide fragment containing one arginine residue at the C-terminus and the original peptide chain containing no arginine residue Discrimination from a group of C-terminal peptide fragments derived from the peptide chain of the product,
  • the present invention has a plurality of forms, which have the above-mentioned technical idea in common, but differ in specific forms due to the existence state of the target peptide chain.
  • the first form to be applied when the peptide to be analyzed is a previously isolated dry sample, and the peptide to be analyzed is separated by gel electrophoresis in advance. It has a second form that is applied when the sample is supported on a gel carrier.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the first aspect of the present invention is a method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide to be subjected to angular analysis. Preparing a mixture containing a series of reaction products obtained by sequentially decomposing C-terminal amino acids by means;
  • N-terminal amino group of the peptide and the amino group of the side chain of lysine residue which may be contained in the peptide are N-acylated by the acetyl group derived from the alkanoic anhydride.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and undergoes the decomposition of the C-terminal amino acid with the cleavage of the 5-oxazolone ring.
  • a water treatment comprising removing the basic nitrogen-containing organic compound and water molecules remaining in the mixture containing the series of reaction products, and performing a post-drying treatment for drying. And at least a process
  • trypsin is acted on in a buffer solution to the mixture containing the series of hydrolyzed reaction products after re-drying.
  • the peptide chain is subjected to a trypsin enzyme-specific digestion treatment to perform peptide fragmentation by selective cleavage of the C-terminal peptide bond of the arginine residue present in the peptide chain,
  • the recovered dry mixture containing the tryptic digested peptide fragment is subjected to the MALDI-TOF-MS method to measure the molecular weight of the cationic species generated in the ionization treatment, and to determine the molecular weight of the anionic species.
  • the molecular weight is measured, and the corresponding ionic species measured in the molecular weight measurement by the ionic species and the molecular weight measurement by the anionic species are:
  • the peak of the peptide fragment having an argien residue at the C-terminus generated by the trypsin digestion treatment is as follows:
  • the intensity in the molecular weight measurement by the cation species is judged to be a peak giving a relatively large intensity as compared with the intensity in the molecular weight measurement by the anion species,
  • the intensity in the molecular weight measurement using the anion species is determined to be a peak that gives a relatively large intensity compared to the intensity in the molecular weight measurement using the cation type,
  • a method of measuring the molecular weight decrease due to the sequential decomposition of the C-terminal amino acid based on a series of peaks giving a relatively large intensity is adopted. This is an amino acid sequence analysis method. In the analysis method according to the first embodiment of the present invention,
  • a symmetrical acid anhydride of an alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is preferable to use as the alkanoic anhydride contained in the mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the arnic acid anhydride.
  • a symmetrical acid anhydride of a linear alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is more preferable to use as the symmetrical acid anhydride of an alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • acetic anhydride as the alkanoic anhydride contained in the mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the arnic acid anhydride.
  • pKa of the perfluoroalkanoic acid is as follows: It is preferred to use a perfluoroalkanoic acid in the range of 0.3 to 2.5. At this time, it is more preferable to use perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as perfluoroalkanoic acid contained in the mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the alkanoic anhydride. preferable. For example, as the perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms, it is more preferable to use a linear perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • the content ratio of perfluoroalkanoic acid is such that the ratio of alkanoic anhydride to perfluoroalkanoic acid is It is desirable to select the amount in the range of 1 to 20% by volume based on the total volume of the above.
  • the drying atmosphere is more preferably a state in which oxygen has been removed in addition to moisture. For example, it is preferable that the dry atmosphere is achieved by evacuating the atmosphere in an airtight container.
  • the temperature should be a temperature selected from the range of 15 ° C to 50 ° C. Is more desirable.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the second aspect of the present invention is a method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide to be analyzed. Preparing a mixture containing a series of reaction products obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid by an appropriate means;
  • the peptide sample to be supported on the gel carrier is subjected to a temperature selected from a range of 30 ° C. to 80 ° C.
  • the gel is supported on the gel carrier.
  • a temperature selected in the range of 30 ° C to 80 ° C is selected in the range of 30 ° C to 80 ° C.
  • the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid act on the peptide sample of interest in a supported state by immersing the gel carrier in the mixed solution using the mixed solution dissolved in Let
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid) through a 5-oxazolone structure represented by the following formula: Perform a sequential decomposition,
  • the mixed solution used for the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid does not cause the gel-like substance to dissolve, and is mixed with the perfluoroalkanoic acid and the alkanoic anhydride, and the dipolar aprotic solvent. Diluting and removing a polar aprotic solvent having high affinity to stop the decomposition reaction and remove the reaction reagent;
  • a mixture containing a series of reaction products obtained by the reaction for sequentially decomposing the C-terminal amino acid is used while being supported on the gel carrier.
  • the mixture containing the series of reaction products after the hydrolysis treatment is supported on the gel carrier.
  • trypsin dissolved in a buffer solution to protect the N-terminal amino group of the peptide chain and the amino group of a lysine residue side chain that may be contained in the peptide chain with the N-acylich protection described above.
  • the peptide fragment is released from the gel carrier and eluted into the buffer solution. Thereafter, desalting treatment is performed to remove the buffer solution component, and the trypsin digested peptide fragment is removed. A process of collecting and drying,
  • the recovered dry mixture containing the tryptic digested peptide fragment is subjected to the MALDI-TOF-MS method to measure the molecular weight of the cation species generated in the ionization treatment, and to determine the molecular weight of the anion species.
  • the molecular weight measurement is performed, and for the corresponding ionic species measured in the molecular weight measurement by the ionic species and the molecular weight measurement by the anionic species,
  • the peak of a peptide fragment having an arginine residue at the C-terminus generated by the trypsin digestion treatment is as follows:
  • the intensity in the molecular weight measurement by the cation species is judged to be a peak giving a relatively large intensity compared to the intensity in the molecular weight measurement by the anion species,
  • the intensity in the molecular weight measurement using an anionic species is determined to be a peak that gives a relatively large intensity compared to the intensity in the molecular weight measurement using a cation species,
  • a method of measuring the molecular weight decrease due to the sequential decomposition of the C-terminal amino acid based on a series of peaks giving a relatively large intensity is adopted. This is an amino acid sequence analysis method.
  • the analysis method according to the second embodiment of the present invention is a method of measuring the molecular weight decrease due to the sequential decomposition of the C-terminal amino acid based on a series of peaks giving a relatively large intensity.
  • alkanoic anhydride contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small amount ratio to the alkanoic anhydride a symmetrical acid of alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms It is preferred to use an anhydride.
  • a symmetrical acid anhydride of a straight-chain alnic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetric acid anhydride of an arnic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • acetic anhydride as the alkanoic anhydride contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small ratio to the alkanoic anhydride.
  • the perfluoroalkanoic acid contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small ratio with respect to the arnic acid anhydride is represented by p represented by the perfluoroalkanoic acid. It is preferable to use perfluoroalkanoic acid in which Ka is in the range of 0.3 to 2.5. Further, as the perfluoroalkanoic acid contained in the mixed solution obtained by dissolving the perfluoroalkanoic acid in a small amount ratio to the alkanoic anhydride, a perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms is used. It is preferable to use. At this time, it is more preferable to use a linear perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the perfluoroalkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • the content ratio of the alkanoic anhydride to the perfluoroalkanoic acid is determined by the alkane It is more preferable to select the perfluoroalkanoic acid in the range of 1 to 20 volumes per 100 volumes of the acid anhydride.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of the peptide according to the present invention is a mixture of the process (5) described above: peptide fragment,
  • peptide fragment By measuring the molecular weight with the ionic species generated by the ionization treatment and the molecular weight with the anionic species by the MS method, and comparing the results of both measurements, one arginine residue at the C-terminus was obtained.
  • the common peptide fragment and the arginine residue-free The process of discriminating the peptide chain from a group of C-terminal peptide fragments derived from the peptide chain of a series of reaction products, and the subsequent process (6): discriminating the original peptide chain from the original one.
  • the MA LDI measured during the process of identifying the C-terminal amino acid sequence of a long peptide chain was The present inventors have found that a common technique can be selected for the molecular weight measurement using a cationic species by TOF-MS method and the analysis of a molecular weight measurement spectrum using an anionic species.
  • the mixture of peptide fragments to be measured includes, in addition to peptide fragments generated by trypsin digestion, self-digested peptide fragments derived from trypsin resulting from trypsin autolysis. After removing the ion species peak derived from the peptide fragment of trypsin, the remaining peptide peak contains at least one arginine residue at the C-terminal, and It can be distinguished from the C-terminal peptide fragment of the original peptide chain that does not contain ginine residues as a distinct peak,
  • arginine is added to the C-terminus by determining the presence or absence of ionic species peaks derived from the peptide chain of a series of reaction products accompanying the sequential decomposition of C-terminal amino acids.
  • a common peptide fragment containing one residue, and a group of c-terminal peptide fragments derived from the original peptide chain and a series of reaction product peptide chains that do not contain an arginine residue. can be distinguished with high rationality and reliability.
  • the target peptide chain is subjected to the N-acylation and O-acylation protection processes described in (1), the selective degradation reaction process of the C-terminal amino acid in (2), and the (3)
  • the hydrolysis treatment of the cyclic ester in the oxazolone ring structure and the deprotection process of protection by O-acylation result in unnecessary dehydration reactions, for example, despite the extra substitution of the acyl group.
  • the ionic species peak derived from the secondary peptide fragment that has undergone ancillary modification reaction may accompany the ionic species peak derived from the original peptide fragment.
  • the ion species peaks derived from the original peptide fragments can be highly rationalized. They have found that they can be specified by their reliability and reliability, and have completed the spectral analysis method of the present invention to which the above-mentioned determination criteria are also added.
  • the mass spectrometry method according to the present invention in particular, the method for measuring the molecular weight by the ionic species by the MALDI-TOF-MS method and the method for analyzing the spectrum by the molecular weight measurement by the anionic species are as follows:
  • the method can be used to measure the decrease in molecular weight due to the sequential degradation of C-terminal amino acid.
  • a mass spectrometry method in particular, a method for measuring a molecular weight by the ionic species by a MA LDI-TOF-MS method, and a method for analyzing a molecular weight measurement spectrum by an anionic species,
  • the analysis range is selected to have an m / z value of 40000 or less, and (Step 1) a peptide used in peptide fragmentation, accompanying the trypsin digestion treatment, is used.
  • a peptide used in peptide fragmentation, accompanying the trypsin digestion treatment is used.
  • the cationic species peak due to the peptide fragment derived from autolysis of trypsin is identified,
  • Step 2 In the molecular weight measurement results based on the cation species, the peak of the cation species derived from trypsin identified above was excluded, and the maximum value was obtained in the range where the m_z value was 40000 or less and 500 or more.
  • the maximum cation species peak having the peak intensity is specified, and the cation species peak having a peak intensity of 140 or more is selected based on the peak intensity of the maximum cation species peak.
  • the peak of the anionic species derived from the specified trypsin is excluded, and the maximum peak intensity having the maximum peak intensity is obtained in the range where the mZz value is equal to or less than 400 and equal to or more than 500.
  • An anion species peak is identified, and an anion having a peak intensity of 1 Z 40 or more based on the peak intensity of the peak of the maximum anion species is used as a reference. Identifying the main ion species peaks to form the first group of anion species peaks,
  • Step 3 In the molecular weight measurement results of the anion species, peaks corresponding to the anion species corresponding to each peak of the first cation species peak group are specified, and a second anion species peak group is formed.
  • peaks corresponding to the cation species corresponding to the peaks of the first anion species peak group are specified in the molecular weight measurement results of the cation species, and the second cation species peak group is identified. Identifying the counter ion species peak for the main ion species peak to be formed,
  • Step 4 The intersection of the first anion species peak group and the second anion species peak group is defined as a third anion species peak group, and at the same time, the first anion species peak group and the The union of the second anion species peak group is defined as a fourth anion species peak group, and then the intersection of the first cation species peak group and the second cation species peak group is defined as A third cation species peak group, and at the same time, a union of the first cation species peak group and the second cation species peak group is defined as a fourth cation species peak group,
  • a relative peak intensity is calculated based on the peak intensity of the maximum cation species peak, and For each peak of the anion species peak group, the relative peak intensity is calculated based on the peak intensity of the maximum anion species peak, and the relative peak intensities are compared with each other.
  • a cation species peak in which the relative peak intensity of each corresponding cation species peak is 3 to 2 or more is specified, and the fifth cation species peak is identified.
  • an anion species peak in which the relative peak intensity of each of the third anion species peak groups is 32 or more is specified, and a fifth anion species peak group is identified. Identifying the major ion species peak with significant counter ion species, forming
  • Step 5 Based on the z value of each cation species peak of the fourth cation species peak group, calculate the m / z value difference between adjacent peaks, At the same time, based on the m / z value of each anion species peak of the fourth anion species peak group, calculate the m / z value difference between adjacent peaks,
  • a cation species peak that satisfies any of the above requirements (5a-1) to (5a-3) is specified, and a sixth cation species peak group is formed.
  • An anion species peak that satisfies any of the requirements (5b-1) to (5b-3) is specified, and a sixth anion species peak group is formed,
  • the identified peak group of the sixth cationic species is derived from the peptide to be analyzed.
  • the sixth group of anion species peaks identified is the group of anion species peaks caused by peptide fragments derived from the peptide to be analyzed.
  • the peak is compared with the relative peak intensity of the associated cation species peak that satisfies any of the above requirements (5a-1) to (5a-3), and the relative peak of the peak is determined. Select the peaks that are superior in intensity,
  • the relative peak intensity is inferior to other peaks included in the group, and any one of the above-mentioned (5a-1) to (5a-3)
  • the peaks that do not become the incidental cation species peak satisfying the above are selected to form a seventh cation species peak group,
  • the peak is compared with the relative peak intensity of the associated anion species peak that satisfies any of the above (5b-1) to (5b-3), and the relative peak of the peak is determined. Select the peaks that are superior in intensity,
  • the relative peak intensity is inferior to other peaks included in the group, and any one of the above-mentioned (5b-1) to (5b-3)
  • the peaks that do not become the anion species peak satisfying the above are selected to form a seventh anion species peak group,
  • the identified seventh cationic species peak group is a group of the cationic species peaks of the peptide fragment itself derived from the peptide to be analyzed, and at the same time, the identified seventh anionic species peak group
  • Step 7 An anion species peak which is present in the fourth anion species peak group and corresponds to each cation species peak of the seventh cation species peak group is selected, and an eighth anion species peak is selected. Forming on-peaks,
  • the m / z value difference between adjacent peaks is found in a range smaller than 200 based on the m / z value of adjacent peaks based on the m / z value of adjacent peaks, which is calculated in step 5 above.
  • a group of anion species peaks existing in the group of anion species peaks is selected, and the m / z value difference between the peaks is determined by the natural chain ⁇ -amino acid residue: 100-CH (R) —CO — (R represents a side chain of the amino acid residue) or an acyl group obtained by substituting a hydroxyl group or an amino group on the side chain with the acyl group used for the N-acylation protection. Confirmed that there was no equivalent to the formula amount of the protected amino acid residue,
  • the eighth anion species peak group is a peptide fragment derived from the peptide to be analyzed, which is formed by trypsin digestion and has a peptide chain having an arginine at the C-terminal of the peptide chain.
  • Step 8 For each anion species peak included in the seventh anion species peak group, the mZz value between adjacent peaks calculated in the above step 5 based on the mZz value of the anion species peak Based on the difference, a group of anion species peaks existing in the fourth anion species peak group in which the m / z value difference between the peaks is found in a range smaller than 200 is selected,
  • the difference in mZz value between the peaks is the natural chain formula (3 ⁇ 4-amino acid residue: one NH—CH (R) —CO— (R represents the side chain of the amino acid residue) or There is an equivalent of the formula weight of an acylated protected ⁇ -amino acid residue in which a hydroxyl group or an amino group on the chain is substituted with an acyl group used for the N-acylic protection described above. Identify the anion species contained in the seventh anion species peak group, form a ninth anion species peak group,
  • the anion species peak having the largest ⁇ ⁇ value is selected, and the peak between the peaks is determined based on the mZ z value indicated by the anion species peak having the largest mZ z value.
  • a series of anion species peaks whose niZz value difference indicates an mZz value difference corresponding to the formula weight of the amino acid residue are sequentially specified from the tenth anion species peak group, and the trypsin digestion is performed.
  • the anion species of the C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acids Identification of peaks, analysis target peptides generated by trypsin digestion and identification of C-terminal peptide fragments of a series of reaction products,
  • Step 9) a series of C-terminal peptide fragments derived from the original peptide and the C-terminal amino acids obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid generated by the trypsin digestion treatment specified
  • the formula weight of the amino acid residue which corresponds to the difference in mZz value between the peaks of the anion species peaks specified in sequence based on the group of anion species peaks of the C-terminal peptide fragment derived from the reaction product A partial amino acid sequence that is sequentially degraded from the C-terminal according to
  • the cation species peak due to the peptide fragment derived from the self-quenching of trypsin which is identified in the molecular weight measurement result by the cation species, Determine the peak mZ z value and calculate its apparent full width at half maximum,
  • the determined peak mZ z value and the apparent full width at half maximum of the positive peak of the Yion species due to the peptide fragment derived from autolysis of trypsin were used. Based on the mZz value, a smoothing process capable of maintaining the asymmetry of the peak shape and the integrated peak intensity is performed. On the other hand, trypsin, which is specified in the molecular weight measurement result by the anionic species, is used. Determination of the peak m / z value at the peak of the anion species due to the peptide fragment derived from autolysis, and calculation of the full width at half maximum,
  • the noise-removed spectrum was used to calculate the determined peak m / z value and the apparent full width at half maximum of the cationic species peak due to the peptide fragment derived from autolysis of trypsin. It is preferable to provide a noise removal / smoothing process for performing a smoothing process capable of maintaining the asymmetry of the peak shape and the integrated peak intensity based on the two m / z values.
  • Step 1 the cation species peak due to the peptide fragment derived from the self-quenching of trypsin, which is identified in the molecular weight measurement result using the cation species.
  • the m / z value of the cation species is calculated based on the known molecular weight of the peptide fragment, compared with the peak m / z value on the spectrum, and based on the difference, the m / z value in the molecular weight measurement spectrum of the cation species is calculated. Perform systematic error correction for the z value,
  • the m / z value of the anion species is determined based on the known molecular weight of the peptide fragment. Calculate, compare with the peak mZz value on the spectrum, and based on the difference, correct the systematic error with respect to the mZz value in the molecular weight measurement spectrum by the anionic species.
  • the adjacent peak calculated in step 5 above is used. Based on the m / z value difference between the peaks, a fourth positive value in which the m / z value is larger than the mZ z value of the positive ion species peak and the m / z value difference is found in a range smaller than 200.
  • the cation species peak group present in the ionic species peak group is selected,
  • FIG. 1 is a process flow illustrating an example of a detailed operation procedure for a dried peptide sample in the process for sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a process flow illustrating an example of a detailed operation procedure for a dried peptide sample in the process for sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 illustrates an example of a detailed operation procedure for treating a peptide sample carried on a gel in a process for sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the second embodiment of the present invention. It is a figure showing a process flow.
  • FIG. 3 shows that the C-terminal amino acid of the globin-peptide chain of a dried sample of puma 'myoglobin was determined according to the treatment method of sequentially decomposing the C-terminal amino acid from the peptide according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a mass spectrometry spectrum obtained by measuring a peptide fragment obtained by trypsin digestion of a reaction product mixture obtained by sequentially decomposing the same in a cation species detection mode using a MA LDI-TOF-MS device. is there.
  • FIG. 4 shows the C-terminal amino acid of the globin-peptide chain of a dried sample of Pima 'myoglobin according to the treatment method for sequentially decomposing the C-terminal amino acid from the peptide according to the first embodiment of the present invention.
  • Figure 1 shows an example of a mass spectrometry spectrum obtained by using a MA LDI-TOF-MS device to measure a peptide fragment obtained by digesting a reaction product mixture obtained by successively decomposing DNA with trypsin in the anion species detection mode.
  • FIG. 5 shows a globin-peptide chain of a poma myoglobin sample supported on a gel according to a treatment method for sequentially decomposing a C-terminal amino acid from a peptide according to the second embodiment of the present invention.
  • Peptide fragment obtained by tryptic digestion of the reaction product mixture obtained by sequentially decomposing the C-terminal amino acid of the above was analyzed by mass spectrometry using a MA LDI-TOF-MS instrument in the cationic species detection mode. It is a figure showing an example of a toll.
  • FIG. 6 shows the results of the method for sequentially degrading the C-terminal amino acid from the peptide according to the second embodiment of the present invention.
  • Peptide fragments obtained by trypsin digestion of a reaction product mixture obtained by sequentially decomposing terminal amino acids were analyzed by mass spectrometry using a MA LDI-TOF-MS device in an anion species detection mode. It is a figure showing an example.
  • Fig. 7 shows the cleavage sites at the C-terminal peptide bond of arginine residues by trypsin, and N-acetylation, contained in the amino acid sequence of the globin peptide chain, which constitutes pima myoglobin. Indicates a lysine residue that, when protected, prevents cleavage at the C-terminal peptide bond.
  • FIG. 7 is a diagram showing a comparison between mass spectrometry spectra measured in the cation species detection mode (above) and the cation species detection mode (above).
  • FIG. 9 shows a list of the molecular weights (M + H) of the cationic species corresponding to fragments generated by autolysis of trypsin.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the present invention is basically performed by sequentially decomposing and removing the C-terminal amino acid of the peptide to be analyzed.
  • a series of reaction products in which the peptide was shortened was produced, and further, the series of reaction products and the peptide fragment obtained by trypsin digestion of the original peptide were used as the series of reaction products.
  • a method for identifying the removed amino acid is employed.
  • the C-terminal peptide fragment obtained by such trypsin digestion is cleaved at a cleavage site specific to the trypsin, and further, a C-terminal peptide derived from this series of reaction products
  • a MA LDI-TOF-MS instrument is used as a means of measuring the molecular weight of the fragment and the molecular weight of the C-terminal peptide fragment derived from the original peptide.
  • the amino acid residues constituting the C-terminal peptide fragment do not contain arginine residues and ricin residues, the stabilization mechanism of cationic species derived from such arginine residues and lysine residues However, when the results of measurement of the cationic species and those of the anion species were compared, the amino acid residues contained arginine residues and lysine residues. Compared to other peptide fragments, their relative intensities indicate a phenomenon that behaves differently from the peaks attributable to a series of C-terminal peptide fragments from multiple peaks measured by the MA LDI-TOF-MS instrument. Are used for identification and discrimination.
  • the biggest feature of the analysis method according to the present invention is that
  • the C-terminal peptide fragment derived from a series of desired reaction products is produced by MA LDI-TOF while preventing the generation of peptide fragments that are unnecessarily subdivided by making them occur only at peptide bonds.
  • Another major feature of the analysis method according to the present invention is that it can be within the molecular weight range suitable for MS measurement.
  • alkanoic anhydride is catalyzed by perfluoroalkanoic acid, which exhibits high proton donating ability.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and forms a 5-oxazolone structure, and the C-terminal is formed by cleavage of the 5-oxazolone ring. Utilizes a method of decomposing amino acids.
  • reaction formula (I) The reaction for the formation of the 5-oxazolone ring, as a whole, is represented by the reaction formula (I):
  • an intramolecular ester bond is formed between the exposed hydroxy group and the C-terminal carboxyl group to complete the 5-oxazolone ring.
  • an alkanoic anhydride is used as a reagent for activating a C-terminal carboxy group.
  • reaction formula (lb) The activated c-terminal carboxy group is converted to an asymmetric acid anhydride as exemplified in the above, and is assumed to be involved in the reaction. As a result, such a reaction proceeds even under mild temperature conditions.
  • a serine residue -NH-CH (CH 2 OH ) -CO-
  • a threonine residue (hydroxyl-CH (CH (CH 3 ) OH) -CO-) in which a hydroxy group ( ⁇ ) is present at the ⁇ -position
  • a reaction mechanism triggered by a similar N, O-acyl rearrangement A side reaction may occur in which peptide cleavage occurs at the N-terminal side of the leonine residue.
  • the lysine residue (one NH—CH ((CH 2 ) 3 —NH 2 ) —CO—) also has a lysine residue in a heated environment due to the amino group (one NH 2 ) on its side chain.
  • the sequential C-terminal amino acid decomposition reaction is carried out under a dry condition at a mild temperature condition
  • the serine residue (1-NH—CH (CH 2 OH) —CO—) and threonine residue Side reactions involving the group (one NH—CH (CH (CH 3 ) OH) —CO—) and lysine residues (one NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—)
  • a pretreatment step for N-acylation and O-acyluich protection is provided before the sequential C-terminal amino acid degradation reaction.
  • the pretreatment step for protecting by N-acylation and O-acylation is performed by subjecting a dry sample of the target peptide to a temperature of 10 ° C to 60 ° C in a dry atmosphere.
  • the alkanoic acid is reacted with vaporized alkanoic anhydride and alkanoic acid supplied from a mixture obtained by adding a small amount of alkanoic acid to alkanoic anhydride.
  • using the proton donating ability possessed by, alkanoic acid anhydride and an amino group (one NH 2) reaction of the hydroxy group (one OH) to promote and achieve N- Ashiru of the O- Ashiru of ing.
  • the proton donating ability of the alkanoic acid is inferior to the proton donating ability of perfluoroalkanoic acid. I can't.
  • the peptide sample supported on the gel is subjected to a dehydration treatment of the gel in advance, and then, in this pretreatment step, 30 ° C. to 80 ° C.
  • a solution prepared by dissolving an alkanoic anhydride in a dipolar nonprotonic solvent that can infiltrate into the gel-like substance and maintain a swelling state at a temperature selected in the range of By immersing the gel carrier in the alkanoic anhydride solution, alkanoic anhydride is allowed to act on the peptide sample of interest in the supported state. By doing so, N-acylation and O-acyli-dani have been achieved.
  • the liquid phase reaction in the dipolar aprotic solvent proceeds sufficiently without using the acid catalysis of alkanoic acid having a proton donating ability.
  • alkanoic acid is produced in the system accompanying the powerful liquid phase reaction, and its catalysis is added, and the reaction is gradually accelerated.
  • the proton-donating ability of the alkanoic acid derived in the system is inferior to the proton-donating ability of perfluoroalkanoic acid, so that the reaction to form the 5-year-old xazozone ring at the C-terminal of the peptide chain proceeds. Does not reach.
  • an amino group ( ⁇ 2 ) at the ⁇ -position of a lysine residue (—NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—) is added.
  • a lysine residue —NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ) —CO—
  • the conditions under which ⁇ -acinolation can be achieved even for the ⁇ -terminal amino group of the peptide chain for example, in the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid, the C-terminal carboxy group When activation is performed, it is possible to prevent a situation in which an accidental reaction with the ⁇ -terminal amino group of an adjacent peptide chain occurs.
  • a lysine residue (an NH- CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2) -CO-) of ⁇ -position of the amino group (an Nyuita 2 )
  • ⁇ -acylation protection for the amino group at the ⁇ terminus of the peptide chain is achieved by selecting hydrolysis conditions that do not cause deprotection.
  • the amino acid group on the side chain of the lysine residue is subjected to a trypsin digestion step in a state where the amino group on the side chain is protected, so that the peptide chain is converted to arginine.
  • Digestion at two cleavage sites, a residue and a lysine residue avoids unnecessary fragmentation, and at the same time, by trypsin digestion of arginine residues contained in the peptide chain at a moderate frequency
  • the long peptide chain can be split into multiple peptide fragments, and the resulting C-terminal peptide fragments can take advantage of the advantage of being in the molecular weight range compatible with MALD I-TOF-MS measurement. ing.
  • a MA LDI-TOF-MS device to measure the molecular weight of the ionic species derived from the mixture of peptide fragments obtained by trypsin digestion.
  • the peptide fragments recovered and dried by desalting after trypsin digestion do not form various salts, but are used as the original peptide portion alone.
  • a cation species with proton (H +) added and an anion species with proton (H +) desorbed can be generated. By selecting the measurement mode, The cation species and the anion species are measured individually.
  • the peptide fragment generated by trypsin digestion is derived from the N-terminal amino acid sequence common to the original peptide chain and the reaction product generated by the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid.
  • a fragment containing a guanidino group having a guanidino group rich in proton (H +) ability is present at the C-terminus of the fragment.
  • the arginine residue is not present in the C-terminal peptide fragment, and the proton species (H +) due to the arginine residue is not stabilized. Does not happen.
  • the common N having an arginine residue at the C-terminal of the fragment thereof in the mass spectrometry spectrum of the cationic species measured by the MA LDI-TOF- 'MS instrument The peak intensity derived from a series of peptide fragments derived from the terminal amino acid sequence becomes relatively strong.
  • a carboxy group (1-COOH) which has the ability to donate protons (H +) is present at the C-terminal.
  • the peak intensity attributable to the C-terminal peptide fragment group becomes relatively strong.
  • the desalted and dried peptide fragment is subjected to measurement with a MA LDI-TOF-MS apparatus, and the mass spectrometry spectrum of the cation species and the anion species are used.
  • a series of peptide fragments derived from a common N-terminal amino acid sequence that has an arginine residue at the C-terminus by utilizing the difference in relative intensity when compared with the mass spectrometry spectrum In the mass spectrometry spectrum of the anionic species, the N-terminal is shared between the original peptide chain and the reaction product generated by the sequential decomposition of the C-terminal amino acid. Side amino acid sequence Peaks originating from a series of C-terminal peptide fragments derived from the group can be easily identified.
  • the decrease in the molecular weight due to the sequential decomposition of the amino acid at the terminal is measured, and the type of the amino acid giving the corresponding change in the molecular weight is assigned.
  • c-terminal peptide fragment not present in the force Cal arginine residues at least, depending on trypsin digestion process, has an amino group of the ⁇ -position of the ⁇ -terminal amino acid residue (an ⁇ 2), Since the corresponding peak is also shown on the mass spectrometry spectrum of the cation species, the assignment result of the amino acid type is calculated using the molecular weight of the corresponding peak observed in the mass spectrometry spectrum of the cation species. You can also verify.
  • the steps (1) to (3) are the same as those described in the above (1) to (6), which characterize the present invention.
  • a dry sample of the peptide that has been previously isolated and processed The following processing is performed for
  • the amino group at the ⁇ -terminal of the peptide and the amino group at the side chain of the lysine residue which may be contained in the peptide are determined in advance.
  • a pre-treatment step of subjecting the compound to acylation with an acyl group derived from the alkanoic anhydride is performed.
  • the protection of the amino group in the side chain of lysine residue from peracylation is carried out as described above.
  • the deprotection does not proceed in the lysine residue side chain in the hydrolysis treatment described below, but the dialysis protection is performed simultaneously.
  • a dry sample of a peptide is supplied as a vapor from a gaseous phase, and is subjected to ⁇ -acylation and ⁇ -acylation reaction.
  • a reaction reagent capable of carrying out the reaction a combination of an alkanoic anhydride as an electrophilic acylating agent and an alkanoic acid as a catalyst for promoting the acylation reaction by its proton donating ability is used. We are using.
  • the alkanoic anhydride and alkanoic acid used in this pretreatment step are supplied as steam at a constant partial pressure ratio under a dry atmosphere to act on the peptide chain.
  • the mixture is made to evaporate from a mixture of alkanoic anhydride and a small amount of alkanoic acid added. That is, a material capable of achieving a desired partial pressure at a temperature selected in the range of 10 ° C.
  • alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms and alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms
  • a symmetrical acid anhydride derived from 4 alkanoic acids it is more preferable to use a straight-chain alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms, and a symmetrical anhydride derived from the straight-chained alnic acid having 2 to 4 carbon atoms.
  • the alkanoic anhydride is more preferably a symmetrical anhydride derived from alkanoic acid added in a small amount.
  • alkanoic anhydride and alkanoic acid are supplied as vapor to a dry peptide sample to proceed with the reaction.
  • the same arnic acid anhydride as that used in the subsequent step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid can be suitably used.
  • this alkanoic anhydride under a dry atmosphere, at a temperature selected in the range of 10 ° C. to 60 ° C., may cause unnecessary side reactions such as cleavage of peptides, etc. Since its reactivity is sufficiently low, coexist with such pretreatment.
  • Alkanoic acid has a much lower acid catalysis than perfluoroalkanoic acid, and it is possible to provide N-acylation protection without causing unnecessary side reactions. Become.
  • a peptide having a long amino acid sequence of interest such as a protein
  • a peptide chain that does not exhibit the secondary structure is subjected to a defolding process in advance.
  • the amino group of any lysine residue side chain present in the peptide can be protected by N-acylation protection.
  • the o-acylation reaction proceeds at the serine residue and the hydroxy group on the side chain of the threonine residue in the peptide to protect them.
  • phenolic hydroxy groups on the side chains of tyrosine residues present in peptides are partially o-acylated, although their reactivity is different.
  • the amino group of the side chain of the lysine residue, the serine residue and the hydroxy group of the side chain of the threonine residue are all protected and modified. However, they can no longer participate in unnecessary side reactions.
  • the combination of alkanoic anhydride and alkanoic acid used in the pretreatment step has almost no fear of causing unnecessary side reactions, for example, cleavage in the middle of the peptide.
  • the reaction temperature is selected to be in the range of 10 ° C. to 60 ° C., more preferably, the reaction temperature is selected to be around room temperature or slightly higher than room temperature. More specifically, it is preferable to select the temperature in the range of 15 ° C. to 50 ° C.
  • the addition ratio of alkanoic acid is 2 to the total volume of alkanoic anhydride and alkanoic acid. It is preferable to select the content in the range of 10 to 10% by volume, specifically, 5% by volume.
  • the reaction time of the N-acylation reaction in this pretreatment step depends on the partial pressure (gas phase concentration) of the alkanoic anhydride and alkanoic acid used and the reaction temperature.
  • the reaction time is desirably appropriately selected mainly according to the reaction temperature. For example, when the reaction temperature is selected to be 50 ° C., the reaction time is selected within 1 hour, for example, 30 minutes. It is also possible to complete the acylation.
  • a catalytic amount of pyridine for example, 0.1 to 1.0 with respect to the total of the alkanoic anhydride and the alkanoic acid. More preferably, volume% of pyridine is added. Since such a pyridine base functions as a proton acceptor, for example, removal of a proton to be eliminated due to acylation to an amino group is performed more quickly.
  • the peptide of interest forms, for example, an oxidized single S—S— bond with the cysteine of an adjacent peptide, or a single S—S single bond in the same molecule.
  • a conventional reduction treatment is performed in advance to eliminate such cross-linking, and the peptide is converted into a peptide containing reduced cysteine.
  • the reduced cysteine present in the peptide the sulfanyl group on the side chain
  • (-SH) is subjected to carboxymethylation, pyridylethylation, etc., and its protection is performed in advance. More specifically, when a peptide having a long amino acid sequence of interest, such as a protein, has a secondary structure or a tertiary structure, a defolding treatment is applied thereto in advance to obtain the multi-dimensional structure. If there is a possibility that the protein contains a cysteine that forms a single SS bond in the same molecule during the process of converting it into a peptide chain that does not show Treatment is carried out to eliminate such cross-links and convert to a peptide containing reduced cysteine.
  • a reaction procedure in such a pretreatment step is as follows. A liquid mixture obtained by adding a small amount of arnic acid to arnic acid anhydride is placed in a reaction vessel capable of forming an airtight state, and the liquid mixture is once cooled and steam With the pressure reduced, the reaction vessel is evacuated, sealed, heated to the reaction temperature, and alkanoic anhydride is evaporated in the vessel. Adopting such a procedure also has the advantage that moisture can be prevented from entering the reaction vessel.
  • the system is evacuated so that oxygen does not remain in the reaction system, for example, among the amino acid residues constituting the target peptide, oxygen present in the methionine is converted to oxygen by oxygen.
  • oxygen present in the methionine is converted to oxygen by oxygen.
  • the reaction reagent remaining in the reaction vessel is removed, and then the process proceeds to a reaction step for sequentially decomposing the next c-terminal amino acid.
  • the pretreatment step is followed by a 15 ° C drying test on a dry sample of the N-acylated protected peptide.
  • a temperature selected in the range of C to 60 ° C is selected in the reaction for successively decomposing the C-terminal amino acid.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and undergoes the decomposition of the C-terminal amino acid with the cleavage of the 5-oxazolone ring.
  • the ratio of enol-type is increased by allowing vaporized perfluoroalkanoic acid to function as a proton donor for the dried peptide.
  • reaction temperature can be selected in the range of 15 ° C to 60 ° C.
  • the reaction temperature is preferably selected around room temperature or within a range slightly higher than room temperature, and more specifically, in the range of 15 ° C to 50 ° C. Is more preferable.
  • the alkanoic acid anhydride is added to the N-terminal amino group of the peptide. Since N-acylation usually occurs, N-acylation protection is performed in the system, but it is more preferable to perform pretreatment for N-acylation protection in advance.
  • the first aspect of the present invention utilizes the high protein donating ability of the perfluoroalkanoic acid used, and the pKa of the perfluoroalkanoic acid is 0.3. It is preferable to use perfluoroalkanoic acid, which is in the range of ⁇ 2.5. In addition, the perfluoroalkanoic acid must be supplied to the dried peptide sample as a vapor, and at the temperature selected in the range of 15 ° C. to 60 ° C., a volatile vapor having a desired vapor pressure can be obtained. Desirably, it is a perfluoroal carboxylic acid having excellent properties.
  • perfluoroalkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms are more suitable, and linear perfluoroalkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms are more suitable.
  • the alkanoic anhydride used as the above-mentioned activating reagent is consumed according to the reaction. Therefore, the reaction is performed while maintaining the vapor pressure of the alkanoic anhydride supplied as a vapor state within a predetermined range. It is desirable to carry out.
  • a method for stabilizing the vapor pressure of the alkanoic anhydride present in the system by putting the system in which the reaction takes place in an air-tight state can be mentioned. More specifically, a liquid mixture obtained by adding a small amount of perfluoroalnic acid to alkanoic anhydride is placed in a reaction vessel that can be made airtight, and the liquid mixture is once cooled to reduce the vapor pressure.
  • the reaction vessel is evacuated, sealed, heated to the reaction temperature, and alkanoic anhydride is evaporated in the vessel.
  • Adopting such a procedure also has the advantage of preventing water from entering the reaction vessel.
  • evacuation is performed so that oxygen does not remain in the reaction system, for example, among the amino acid residues constituting the target peptide, io present in methionine is subjected to oxygen by oxygen.
  • the formula can be prevented from changing its molecular weight In the method according to the invention, which is based on the determination of the quantity, suppressing strong oxidation is more favorable for achieving higher accuracy.
  • various alkanoic anhydrides can be used as long as they generate an appropriate vapor pressure when heated to the reaction temperature.
  • the reaction temperature is selected in the above-mentioned preferable range, for example, in the range of 15 ° C. to 50 ° C., it is preferable that the reaction temperature be sufficient to provide a sufficient vapor pressure.
  • a symmetrical acid anhydride of an alkanoic acid it is more preferable to use a symmetrical acid anhydride of a straight-chain alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetrical acid anhydride, and particularly, a symmetrical acid anhydride of a straight-chain alkanoic acid having 2 carbon atoms.
  • acetic anhydride can be suitably used. Since such alkanoic anhydride is used for activating the C-terminal carboxy group, it is preferable that the alkanoic acid anhydride does not cause steric hindrance. In that respect, anhydrous acetic acid and the like described above are more preferable. It is.
  • the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used in this decomposition reaction are both vaporized and are allowed to act on the dried peptide sample.
  • the reaction is carried out in a dry atmosphere to avoid being returned by water that has entered from outside. From this viewpoint, it is generally desirable to perform such a reaction in a closed reaction vessel.
  • the mixture of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid initially supplied into the reaction vessel is a liquid mixture at room temperature, and the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid are uniformly mixed. State.
  • a mixture of this alkanoic anhydride and a small amount of perfluoroalkanoic acid can be used in a small amount because the perfluoroalkanoic acid used as a catalyst is not consumed in principle during the reaction. it can. More specifically, it should be noted that perfluoroalkanoic acid, which is present as a vapor in the gas phase, can have a relatively low concentration as compared to acetic anhydride which also exists as a vapor. means.
  • the desired partial pressure ratio in the gas phase (gas phase concentration ratio ) Is appropriately used in a liquid mixture having a mixing ratio capable of achieving the above.
  • the content ratio of perfluoroalkanoic acid in the compound obtained by adding a small amount of perfluoroalkanoic acid to the above-mentioned alkanoic anhydride is as follows. It is desirable to select the amount in the range of 1 to 20% by volume, more preferably in the range of 3 to 10% by volume, based on the total volume with the polyalkanoic acid.
  • reaction formula (′) for example, from a 5-oxazolone ring formed from:
  • the resulting reaction product is an intermediate product of 5-oxazo, other than those having a carboxy group at the C-terminus as shown in the above reaction formula (II).
  • those that remain in the Ron ring structure, or as a form of the reaction intermediate also include those in which the C-terminal has reached an asymmetric acid anhydride.
  • the reaction in the vigorous sequential selective decomposition process of the C-terminal amino acid includes at least the process of forming a 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula (Ib) and the reaction formula ( ⁇ ). It consists of a two-step elementary reaction with the exemplified process of separating the terminal amino acid by cleavage of the 5-oxazolone ring structure. Therefore, although the overall reaction rate depends on both the reaction rates of each of these processes, it is mainly based on the vapor partial pressure (gas phase concentration) of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used and the reaction rate. Depends on temperature.
  • the treatment time in the successive step of selectively decomposing the C-terminal amino acid is mainly determined by the vapor partial pressure (gas phase concentration) of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used, and It is appropriately selected according to the reaction temperature and also in consideration of the target amino acid length of the C-terminal amino acid sequence to be analyzed.
  • reaction intermediate having no carboxy group at the C-terminus as exemplified in the above reaction formula ( ⁇ ′) takes the form of a reaction intermediate, but for the purpose of restoring the form having a carboxy group at the C-terminus.
  • a water treatment step is provided as a post-treatment step. That is, in the first embodiment of the present invention, in the step of hydrolyzing, the remaining alcoholic acid is added to the mixture containing a series of reaction products obtained in the step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid.
  • a post-drying treatment is performed in which the basic nitrogen-containing organic compound and water molecules remaining in the mixture containing the series of reaction products are removed and dried.
  • the peptide chain of a series of reaction products with the original peptide has the amino group on the side chain of lysine residue protected with N-acylation, and the carboxy group at the C-terminal is exposed. After that, it is subjected to a trypsin digestion treatment described later.
  • the vapor-form basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used for such a hydrolysis treatment is, for example, ′ This is preferable because no bond is formed, and a uniform solution can be obtained when the aqueous solution is used.
  • a monocyclic nitrogen-containing aromatic ring compound that can give an appropriate vapor pressure is preferable.
  • pyridine can be more preferably used.
  • the mine compound preferably has a basicity similar to the relatively weak basicity of the pyridine base, for example, DMAE ((CH 3 ) 2 N-CH 2 CH 2 OH) is preferable. Available.
  • pyridine when used, it is preferable to select pyridine in the range of 5 to 15% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution.
  • DMAE dimethylamino ethanol
  • DMAE is adjusted to a range of 1 to 20% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution. It is preferable to select.
  • a pretreatment step, a selective decomposition reaction step for a C-terminal amino acid, and a post-treatment step are continuously performed in the same reactor. It is more preferable to carry out in the form described above.
  • An example of the flow of such a process is illustrated in FIG.
  • each peptide sample is provided with a dry-up operation to avoid the reagent used in that step remaining. This dry-up operation is generally performed by distillation under reduced pressure, and in this case, removal of decomposed terminal amino acids and the like generated by the reaction may be performed at the same time.
  • the process flow illustrated in FIG. 1 shows an example in which alkanoic anhydride to be used is acetic anhydride, which is readily available in a very high purity.
  • the processing time in the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid is 1 in the longest case as the amino acid length of the C-terminal amino acid sequence which is shortened during the powerful step.
  • the ratio of acetic anhydride and fluoroalkanoic acid used is also illustrated. In general, when the ratio of fluoroalkanoic acid is increased and the processing temperature is set higher, the reaction rate is lower, and a shorter processing time can be used to prepare a series of reaction products that achieve the longest target amino acid sequence shortening. It becomes.
  • N-acetylation of the N-terminal amino group of the peptide is carried out using acetic anhydride and acetic acid in a vapor state.
  • the activation reaction of the C-terminal carboxy group represented by the above reaction formula (Ia) and the secondary reaction resulting therefrom may be induced.
  • a small amount of pyridine vapor coexists and the pyridine base forms a weak addition salt to the C-terminal carboxy group of the peptide, thereby protecting against unnecessary side reactions. It is possible to have an effect.
  • the protection of the addition salt type is achieved by providing a dry-up operation at the end of the pretreatment step and distilling off the pyridine base under reduced pressure, whereby the deprotection is easily carried out, and the C-terminal amino acid at the next stage is protected. There is no problem in the selective decomposition reaction process. From these viewpoints, it is preferable to add a small amount of a nitrogen-containing heteroaromatic compound, such as pyridine base, which can be easily distilled off under reduced pressure and has low basicity, for protection of the addition salt type.
  • the addition salt-type protection since the addition salt-type protection has a protective function for the carboxy group of the amino acid side chain, it is possible to effectively and simultaneously suppress unnecessary side reactions caused by the carboxy group of the amino acid side chain. Become.
  • the difference between the molecular weight of a series of reaction products prepared by the sequential removal of the C-terminal amino acid and the molecular weight of the original peptide is determined by using the results of mass spectrometry. And determine the amino acid corresponding to the difference in molecular weight. Therefore, it is usually desirable that the original peptide remains in the mixture subjected to the measurement by the powerful mass spectrometry, to the extent that its molecular weight can be specified.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the first embodiment of the present invention is applied to the analysis of a C-terminal amino acid sequence up to about 10 amino acids in length. It is desirable that the content ratio of a series of reaction products corresponding to a maximum of 10 species corresponding to the minimum content ratio should not be less than at least about 1/10 of the maximum content ratio . Also, the remaining amount of the original peptide It is desirable to keep the reaction product having a large content ratio at least not lower than about 110. On the other hand, the required C-terminal amino acid sequence information is often within 10 amino acids. it can.
  • the series of reaction products corresponding to (4) to (6) Analyzing the difference in molecular weight from the other peptide by mass spectrometry, and measuring the molecular weight decrease associated with the sequential decomposition of the C-terminal amino acid; and sequentially measuring the molecular weight difference based on a series of measured molecular weight decreases.
  • the step of identifying a series of degraded amino acids and arranging them from the C-terminus to obtain amino acid sequence information at the C-terminus will be described in further detail.
  • the use of a MALDI-TOF-MS apparatus for measuring the molecular weight enables the molecular weight of a high-molecular-weight peptide chain to be accurately measured.
  • a MA LDI-TOF-MS instrument suitable for measuring high molecular weight molecules such as strong peptides is used, there is naturally an upper limit on the molecular weight at which ionization can be effectively achieved.
  • the maximum amino acid length of a peptide is
  • the corresponding amino acids are identified based on the difference in molecular weight, so that amino acid residues with a difference in formula weight of 1, such as Asn and Asp, and Gin and Glu, can be distinguished from each other with high precision.
  • the longest peptide serving as a reference that is, the C-terminal amino acid should not be removed; the molecular weight of the peptide does not exceed 400, more preferably, it exceeds 300. It is more preferable that it is not in the range. If this is converted to amino acid length,
  • the specificity of the cleaved amino acid sequence site is determined before performing mass spectrometry. Specific tryptic cleavage of the peptide chain using trypsin, a protein with excellent enzymatic reaction efficiency, and the C-terminal amino acid using the resulting C-terminal peptide fragment. The difference between the molecular weight of a series of reaction products prepared by sequential removal of You.
  • the mixture containing the series of reaction products that have been subjected to the hydrolysis treatment is treated with trypsin in a buffer solution, and the amino group at the N-terminal of the peptide chain is treated.
  • the peptide chain is subjected to a trypsin enzyme-specific digestion treatment that retains N-acylation protection for the amino group of the side chain of a lysine residue that may be contained in the peptide chain.
  • the total number of peptide fragments obtained can reach a considerable number, resulting in an average amino acid length of each fragment that is shorter, narrower, Peaks due to a significant number of peptide fragments tend to cluster in the molecular weight range. If peaks due to a considerable number of peptide fragments are clustered, it may be an obstacle in identifying a target group of C-terminal peptide fragments from among them.
  • the C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products obtained by sequentially degrading the C-terminal amino acid has a smaller dietary ratio as the number of amino acids to be removed increases,
  • the presence of other peptide fragments can be a major obstacle in identifying the desired C-terminal peptide fragment.
  • the selective cleavage of the c-terminal peptide bond of the arginine residue present in the peptide chain is used, it is possible to avoid that the total number of the obtained peptide fragments becomes larger than necessary.
  • the amino acid length of the target C-terminal peptide fragment can be within the range of an appropriate number of amino acids when using the above-described MALDI-TOF-MS device. ⁇
  • the dried mixture is subjected to molecular weight measurement using a cation species generated by the ionization treatment and measurement of a molecular weight using an anion species.
  • the present invention utilizes a MA LDI-TOF-MS device. Accordingly, based on the results of the molecular weight measurement using the cationic species and the molecular weight measurement using the anionic species,
  • the peak of the corresponding ionic species due to the argine residue has an intensity of anion in the molecular weight measurement by a cationic species. Compared to the intensity in the molecular weight measurement by the species, it is determined that the peak gives a relatively large intensity,
  • the intensity in the molecular weight measurement by the anion species is determined to be a peak giving a relatively large intensity compared to the intensity in the molecular weight measurement by the ionic species
  • leucine having the same formula weight is used to identify amino acids that are sequentially removed based on the difference in molecular weight.
  • it is impossible to discriminate between (Leu) residue and isoleucine (lie) residue and this is the same as the conventional C-terminal amino acid sequence analysis using mass spectrometry.
  • glutamine (G in) residue and the lysine (L ys) residue have the same formula weight, N-alkanoylation is applied to the side chain of the lysine (L ys) residue. Discrimination of both is possible.
  • alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid are allowed to act.
  • the multi-acetylated product and the deacetylated product will The molecular weight difference is an integer multiple of the formula weight of 42, specifically, 84, 126, and 168 are formula weights of serine residues (one NH—CH (CH 2 OH) —CO—) 87, glutamine residues (one Formula of NH—CH (CH 2 CH 2 —CONH 2 ) -CO-) 128, Formula of glutamic acid residue (one NH—CH (CH 2 CH 2 —COOH) —CO—) 129, N-Acetyllysine residue
  • the formula (170) of the group (1-NH—CH (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH—COCH 3 ) —CO—) is similar to 170, and in some cases, it is mistaken for a polyacetylene to be the main beak, There is a concern that the deace
  • the post-processing step In the hydrolysis treatment in, sufficient conditions have been taken to address such concerns by selecting conditions under which deprotection of o-acylation protection at serine and threonine residues proceeds sufficiently.
  • the analytical accuracy that allows the measured molecular weight to be distinguished from glutamine residues and daltamate residues with a formula weight difference of 1
  • the difference between the number of remaining acetyl groups described above and the amino acid residue having a similar formula weight is 2-3, and in many cases, the force difference is large. The possibility of such misconceptions has been eliminated.
  • the liquid reagent for the reaction or the component / liquid reagent of the kit can be stored, and a predetermined amount of the liquid reagent for the reaction is added to the peptide sample held in the sample container.
  • the reaction container which has a liquid reagent holding mechanism capable of maintaining a state in which they do not come into direct contact with each other and which can store the sample container therein can be evacuated, and the remaining reaction after the reaction is completed. It is preferable that the liquid reagent used for the reaction can be distilled off under reduced pressure, and the reaction can be carried out in an airtight structure.
  • faucets used for the sealing operation are preferably made of a material such as Teflon.
  • the present invention is directed to a peptide supported on the gel carrier. Therefore, for a peptide supported on a gel carrier, the reaction method in the solid phase using a vapor-like reaction reagent is effectively applied for the reaction to sequentially degrade the C-terminal amino acid. Since this is not possible, the method has been changed to a method in which the corresponding reaction reagent is infiltrated into the gel carrier and a liquid phase reaction is performed.
  • the C-terminal amino acid is sequentially decomposed by chemical means from the target peptide corresponding to (1) to (3).
  • the C-terminal amino acid is successively added to the peptide sample while the peptide of interest is not isolated from the gel carrier in advance and remains on the gel carrier. The reaction which decomposes
  • Separation by gel electrophoresis is performed in advance, and in the pretreatment step of performing the acyl reaction in the next stage on the peptide sample to be supported on the gel carrier, water which is an obstacle is removed in advance.
  • the water solvent impregnated in the gel carrier is diluted and removed by using a polar non-protonic solvent which does not cause dissolution of the gel substance and has an affinity for water.
  • a step of performing a dehydration treatment of the gel carrier is provided, and a pretreatment step of providing acylation protection, a step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid, and a post-treatment step of subjecting the reaction product to a hydrolysis treatment are performed as described below.
  • the gel substance to be used is to separate individual spots (or bands) for multiple types of peptides corresponding to a specific molecular weight range.
  • the conditions shown, specifically, the content ratio of polyacrylamide constituting the gel are selected, and the gap size inside the fine hole structure formed inside the gel is adjusted.
  • the separated spots (or bands) for example, in the SDS-PAGE method, peptides having different electrophoretic velocities due to differences in the molecular weight of the peptide chain and the amount of charge on the surface are localized. I have.
  • Such a peptide is held inside a fine hole structure formed in the gel, and when removing water impregnated in the gel-like substance, it does not cause dissolution of the gel-like substance, and By using a method in which only a water solvent is diluted and eluted in the polar aprotic solvent using a polar aprotic solvent having compatibility with the solvent, even if such a dehydration operation is completed, the objective is achieved.
  • the peptide can be maintained on the gel carrier at the separated spot (or band) position.
  • the polar non-protonic solvent used for the above-mentioned dehydration treatment generally has inferior affinity to a gel-like substance such as polyacrylamide constituting the gel than an aqueous solvent.
  • a polar aprotic solvent used in the dehydration treatment for example, when polyacrylamide gel is used, a suitable polar aprotic solvent, such as acetonitrile (CH 3 CN), which has high affinity for water, is used. Examples thereof include nitrinoles having 4 or less carbon atoms and ketones having 4 or less carbon atoms such as acetone.
  • the polar aprotic solvent used in these dehydration treatments evaporates more easily than water, and when evaporated and dried, its bulk volume is reduced and it becomes a contracted gel carrier.
  • the pretreatment step of protecting the peptide chain with acylation comprises, after the dehydration treatment, the peptide sample to be carried on the gel carrier.
  • the peptide sample to be carried on the gel carrier.
  • a solution obtained by dissolving an alkanoic anhydride in a dipolar aprotic solvent that can be infiltrated into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state is added to the alkanoic anhydride solution.
  • an alkanoic anhydride is allowed to act on the target peptide sample in a supported state, and the N-terminal amino group of the target peptide and the peptide contained in the peptide are contained.
  • the amino group on the side chain of the lysine residue which is likely to be subjected to N-acylation protection with an alkyl group derived from the alkanoic acid constituting the alkanoic anhydride is applied in advance.
  • the N-acylation protection for the amino group in the side chain of lysine residue is achieved by the above-described final binding of the lysine residue to the C-terminal peptide when trypsin digestion is performed.
  • the deprotection does not proceed in the N-acylation protection on the side chain of the lysine residue, but in the O-acylation protection performed simultaneously, It is desirable to select an acyl group for which deprotection proceeds sufficiently.
  • the alkanoic anhydride which is an electrophilic acylating agent, undergoes intramolecular polarization in a dipolar non-protonic solvent due to the solvent.
  • N-acylation and O-acylation reactions proceed with respect to an amino group and a hydroxy group.
  • the alkanoic acid derived from the alkanoic anhydride is produced as a by-product accompanying the N-acylation and O-acylation reactions
  • N-acylation and O-acylation are performed by the catalytic action of the alkanoic acid.
  • the reaction is accelerated. That is, in the second embodiment of the present invention, the fact that the diffusion and dissipation of the alkanoic acid by-produced in the gel carrier does not proceed quickly does not take place. Since the generated alkanoic acid can be used as a catalyst for accelerating the reaction, only alkanoic anhydride is used as a reaction reagent.
  • the alkanoic anhydride used in this pretreatment step has a N-acylation protection reaction against the amino group of the side chain of lysine residue at a temperature selected in the range of 30 ° C to 80 ° C.
  • symmetrical acid anhydrides derived from alkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms are preferably used.
  • the intramolecular polarization of alkanoic anhydride is induced and acts on the amino group of the peptide as an electrophilic reagent.
  • the reaction proceeds.
  • a reaction temperature of 50 ° C or higher, but in general, such a reaction is performed in a closed reaction vessel, so that the mechanical strength in the reaction vessel is increased. In consideration of this, it is desirable to select the temperature within the range of 100 ° C. or less.
  • Alkanic acid is produced along with the N-acylsig reaction, but in a small amount.
  • the secondary reaction caused by the proton donating ability of the alkanoic acid and the coexisting alkanoic anhydride is as follows.
  • the alkanoic acid generated in the system has, for example, a much lower acid catalysis and a smaller abundance than perfluoroalkanoic acid.
  • C powders using the above-mentioned perfluoroalnic acid and arlic anhydride are used.
  • the above-mentioned dipolar aprotic solvent which causes the gel to re-swell can infiltrate into the gel-like substance and be maintained in a swollen state, has a relatively small molecular size, and has a gel-like substance.
  • Organic solvents having an excellent affinity for are preferred.
  • alkanoic acid is highly dipolar and can induce the intramolecular polarization of alkanoic anhydride, and alkanoic acid is a reaction by-product.
  • the solvent is preferably an excellent solvent.
  • a dipolar aprotic solvent which is less likely to evaporate and evaporate is more preferable.
  • formamide (HCONH 2 ) is more preferable when a polyacrylamide gel is used. It fully satisfies all the stated requirements.
  • the alkanoic anhydride in the gel carrier is removed to stop the reaction, so that the dissolution of the gel-like substance is not caused, and alkanoic anhydride and
  • the entire gel carrier is washed with a polar aprotic solvent having an affinity for a dipolar aprotic solvent. That is, by washing with the polar aprotic solvent, the arnic acid anhydride and the dipolar aprotic solvent that have infiltrated the gel carrier are diluted and removed by diffusion.
  • polar aprotic solvents satisfying the above-mentioned requirements suitable for washing applications include nitriles having 4 or less carbon atoms such as acetonitrile (CH 3 CN), and carbon atoms such as acetone. Ketones of the number 4 or less can be mentioned.
  • the polar aprotic solvent used for the dilution and washing it is preferable to use the polar aprotic solvent used in the above-mentioned dehydration treatment step.
  • the polar aprotic solvent used in these washing treatments evaporates more easily than water, and when evaporated and dried, its bulk volume is reduced and it becomes a contracted gel carrier.
  • the step of sequentially decomposing the C-terminal amino acid also usually takes a form in which the reaction reagent solution is infiltrated into the shrinked gel carrier which does not contain water to start the reaction. Therefore, after pretreatment for N-acylsig protection, the gel carrier At a temperature selected from the range of 30 ° C. to 80 ° C. for the peptide sample of interest carried on top,
  • Perfluoroalkanoic acid is dissolved in a dipolar aprotic solvent that can be infiltrated into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state, in a small amount ratio to alkanoic anhydride.
  • a dipolar aprotic solvent that can be infiltrated into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state, in a small amount ratio to alkanoic anhydride.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and a C-terminal amino acid is sequentially generated with the cleavage of the 5-oxazolone ring. Perform a spatial decomposition.
  • the perfluoroalkanoic acid functions as a proton donor in the peptide chain carried in the hole of the gel carrier, so that the ratio of the enol form is obtained. Is increasing.
  • the catalytic action of perfluoroalkanoic acid utilizes its proton donating ability, and the pKa of the perfluoroalkanoic acid is 0.3 to It is preferred to use perfluoroalkanoic acid in the range of 2.5.
  • perfluoroalkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms which can be uniformly dissolved in the dipolar aprotic solvent to be used at the above-mentioned reaction temperature, are more suitable.
  • Perfluoroalkanoic acids having 2 to 4 carbon atoms are more suitable, specifically, trifluoroacetic acid (CF 3 COOH), pentafluoropropanoic acid (CF 3 CF 2 COOH), heptafluorolob It is more desirable to use tanoic acid (CF 3 CF 2 CF 2 COOH).
  • the alkanoic anhydride used for activating the C-terminal carboxy group depends on the reaction temperature. When the temperature is raised to a certain level, it is preferable to give an appropriate reactivity. Therefore, it is preferable to use a symmetrical acid anhydride of an alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms. Above all, it is more preferable to use a symmetrical acid anhydride of a straight-chain alkanoic acid having 2 to 4 carbon atoms as the symmetrical acid anhydride.
  • Anhydride that is, acetic anhydride can be suitably used.
  • a strong alkanoic anhydride is preferably one that does not cause steric hindrance in its orientation. In this respect, it is more preferable to use acetic anhydride.
  • the reaction with the peptide is carried out in advance in a dipolar nonprotonic solvent used for swelling of the gel. It is desirable to dissolve a large excess amount with respect to the amount consumed in the process, and to suppress the concentration decrease.
  • the content ratio of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid is 100 per volume of alkanoic anhydride and 1 perfluoroalkanoic acid. ⁇ 20 volume, and the alkanoic anhydride content in the dipolar aprotic solvent is more preferably selected in the range of 10-30% (vol%). .
  • the reaction time depends on the reaction temperature, the concentration of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid contained in the dipolar aprotic solvent, and in addition to the dehydration treatment using the polar aprotic solvent, It is desirable to select an appropriate one in consideration of the time required for swelling of the contracted gel carrier.
  • a polyacrylamide gel (12.5% by mass) is subjected to a dehydration treatment using acetonitrile, and then immersed in a dipolar aprotic solvent such as formamide described below.
  • the time required to achieve re-swelling of the gel carrier is, for example, about 3 hours at 40 ° C, so that the entire reaction time is desired after the re-swelling of the vigorous gel carrier is completed.
  • the time required to achieve the selective degradation of the C-terminal amino acid is, for example, about 3 hours at 40 ° C, so that the entire reaction time is desired after the re-swelling of the vigorous gel carrier is completed.
  • the above-mentioned dipolar aprotic solvent that causes the gel to re-swell can infiltrate into the gel-like substance and can be maintained in a swollen state, has a relatively small molecular size, and Organic solvents with good affinity are preferred.
  • the ratio of the enol form It is preferably a solvent that exhibits high dipolarity and can maintain the ratio, and is an excellent solvent for alkanoic anhydride, perfluoroalkanoic acid, and alkanoic acid as a reaction by-product of solute molecules.
  • a dipolar aprotic solvent that is less likely to evaporate and evaporates is more preferable.
  • formamide (HCONH 2 ) is described above when a polyacrylamide gel is used. All requirements are fully satisfied.
  • the dipolar aprotic solvent that provides excellent solubility in the above-described alkanoic anhydride, perfluoroalkanoic acid, and alkanoic acid as a reaction by-product easily converts water molecules. It is possible to dissolve. Therefore, at the time of the reaction treatment in the mixed solution using the dipolar aprotic solvent, the reaction system is preferably kept in a dry atmosphere from which water has been removed.
  • the c-terminal carboxy group which is converted into a reaction intermediate represented by the above formula (I b) or an asymmetric acid anhydride, undergoes hydrolysis when water molecules enter the reaction system. The original terminal force returns to the lipoxy group.
  • the reaction system is preferably maintained in a state where water is removed.
  • the amino present in methionine may be oxidized by oxygen mixed into the system, and the formula amount may be changed. Preventing this oxygen-induced acidity is more preferable in the method of the present invention based on the measurement of molecular weight in suppressing such oxidation in order to achieve higher accuracy.
  • the reaction system is kept airtight to prevent water and oxygen from entering from outside the system, and It is also desirable that the injection and discharge operations of the gas be performed in an atmosphere of a dried inert gas, for example, nitrogen.
  • a dried inert gas for example, nitrogen.
  • the 5-oxazolone ring formed from the 5-oxazolone ring may be, for example, a reaction represented by a reaction formula ( ⁇ ): It is presumed that through the reaction of (n,), etc., the elimination of the amino acid at the c-terminal and the formation of the next reaction intermediate progress, and the sequential selective decomposition of the C-terminal amino acid proceeds. Therefore, after the completion of the reaction, the reaction product obtained is an intermediate product of 5-oxazo other than those having a carboxy group at the C-terminus as shown in the above-mentioned reaction formula (II). Those that remain in the Ron ring structure, or those in which the C-terminus has led to an asymmetric acid anhydride as one form of a reaction intermediate, are mixed.
  • Such a sequential C-terminal amino acid decomposition reaction is at least due to the formation of the 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula (lb) and the cleavage of the 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula ( ⁇ ). It consists of a two-step elementary reaction with the terminal amino acid separation process. Therefore, the overall reaction rate depends on both the reaction rates of each of these processes, but mainly on the concentrations of the alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used and the reaction temperature.
  • the processing time in the vigorous sequential C-terminal amino acid selective decomposition treatment step depends mainly on the concentrations of alkanoic anhydride and perfluoroalkanoic acid used and the reaction temperature. In addition, it is appropriately selected in consideration of the target amino acid length of the C-terminal amino acid sequence to be analyzed.
  • the sequential termination of the selective decomposition reaction of the C-terminal amino acid lowers the temperature of the reaction system and dilutes the reaction reagent infiltrating into the gel carrier, that is, dilutes the perfluoroalkanoic acid and alkanoic anhydride. It is done by removing. Specifically, the mixed solution used for the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid does not cause the gel-like substance to be dissolved, and the perfluoroalkanoic acid and the alkanoic anhydride; and The decomposition reaction is stopped and the reaction reagent is removed by diluting and removing using a polar aprotic solvent having an affinity for the dipolar aprotic solvent.
  • the dipolar aprotic solvent used for the preparation of the mixed solution can be used to dilute and remove the reaction reagent, but the formation of the 5-oxazolone ring structure exemplified by the reaction formula (lb) can be used.
  • perfluoroalkanoic acids and alkanoic anhydrides and dipolar aprotic compounds are used, which utilize polar non-protonic solvents that contribute little to the stability of the phenolic intermediate It is more desirable to use a solvent removal step. At least at the final stage of the reaction reagent dilution / removal step, a dilution / removal operation using a polar aprotic solvent is provided.
  • polar aprotic solvents satisfying these conditions include nitriles having 4 or less carbon atoms such as acetonitrile (CH 3 CN), and carbon atoms having 4 or less carbon atoms such as acetone. And the like ketones.
  • a series of reaction products obtained by a reaction for sequentially decomposing the C-terminal amino acid is subjected to a hydrolysis treatment, and the post-treatment step also includes a peptide containing these series of reaction products.
  • the reaction is carried out while the mixture is supported on the gel carrier.
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound undergoes a hydrolysis reaction of the 5-oxazolone ring structure shown in the reaction formula ( ⁇ ) and the next-stage reaction intermediate (acid anhydride). Although it itself catalyzes, it itself functions as a suitable base catalyst without reacting with a 5-year-old xazolone ring structure or a reaction intermediate (an acid anhydride) to produce an unnecessary by-product.
  • a carboxy group appears at the C-terminal of the peptide chain of the reaction product.
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used in the above-mentioned hydrolysis treatment reacts with, for example, the remaining C-terminal which has reached an asymmetric acid anhydride to form an amide bond. It is preferable because it can be made into a uniform solution when it is made into an aqueous solution.
  • a monocyclic nitrogen-containing aromatic ring compound having high solubility in a polar aprotic solvent is preferable.
  • pyridine can be more preferably used.
  • the tertiary amine compound that can be used preferably has the same basicity as the relatively weak basicity of the pyridine base.
  • DMAE ((CH 3 ) 2 N—CH 2 CH 2 OH)
  • pyridine it is preferable to select pyridine in the range of 5 to 15% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution.
  • DMA E (dimethylamino) ethanol
  • DMA E is selected in the range of 1 to 20% by volume, more specifically, 10% by volume, based on the total volume of the aqueous solution. Is preferred.
  • the main purpose of the hydrolysis treatment using an aqueous solution containing an organic base is to expose a lipoxy group at the C-terminus of the peptide chain of the reaction product.
  • the deprotection of the O-acylation protection performed in the pretreatment step also proceeds at the same time.
  • the deprotection occurs. You have been chosen not to progress.
  • the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used for the hydrolysis When the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used for the hydrolysis is left, a compound in which the nitrogen base forms an addition salt with respect to the carboxy group at the C-terminal of the reaction product is mixed. Diluting the aqueous solution impregnated in the gel carrier using a polar aprotic solvent that does not cause the gel substance to dissolve and has an affinity for water It is preferable that the gel carrier is subjected to a re-dehydration treatment, and the basic nitrogen-containing aromatic ring compound or tertiary amine compound used for the water treatment is diluted and removed together with water.
  • the polar aprotic solvent used in this re-dehydration step has a high solubility even for a basic nitrogen-containing aromatic ring compound or a tertiary amine compound.
  • the polar aprotic solvent for the re-dehydration step that satisfies these conditions includes nitriles having 4 or less carbon atoms, such as acetonitrile (CH 3 CN), and acetone. And ketones having 4 or less carbon atoms.
  • the above-mentioned hydrolysis treatment involves, after the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid, once diluting the reaction reagents arnic anhydride and perfluoroalkanoic acid using a polar aprotic solvent. Not only after the removal operation has been completed, but also the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid and the hydrolysis treatment can be performed continuously. Specifically, the sequential decomposition reaction of the c-terminal amino acid is carried out by lowering the reaction temperature and adding an aqueous solution containing an organic base while terminating the reaction.
  • reaction reagent which is a combination of low alkanoic acids
  • elution from the gel occur, stopping the sequential decomposition reaction of the C-terminal amino acid and inactivating * removing the reaction reagent.
  • the reaction product can be subjected to a hydrolysis treatment.
  • the alkane corresponding to the alkanoic anhydride can be obtained together with the aqueous solution containing the organic base. Since acid, perfluoroalkanoic acid, and dipolar aprotic solvent are removed and dehydration is performed, once a washing / removal operation using a polar aprotic solvent is provided in the middle, There is no difference.
  • the step of measuring the molecular weight decrease due to the sequential degradation of the C-terminal amino acid trypsin digestion is performed to fragment a peptide chain having a long amino acid length, and the recovered tryptic digested peptide fragment is recovered.
  • trypsin digestion is performed to fragment a peptide chain having a long amino acid length, and the recovered tryptic digested peptide fragment is recovered.
  • the molecular weight of the dried mixture containing is measured by the cation species generated in the ionization treatment, and the molecular weight is measured by the anion species in (1).
  • one of the features of the second embodiment of the present invention is that the mixture containing the series of reaction products having been subjected to the hydrolysis treatment is subjected to a re-dehydration treatment, and is then supported on the gel carrier.
  • the step of such trypsin digestion treatment is performed. Specifically, after the re-dehydration treatment, for the mixture containing the series of reaction products after the hydrolysis treatment,
  • trypsin that dissolves in a buffer solution is acted on, and an amino group at the N-terminus of the peptide chain and a lysine residue that may be contained in the peptide chain
  • the peptide chain is subjected to a trypsin enzyme-specific digestion treatment, which retains the N-acylation protection for the amino group of the chain, to obtain a C-terminal fragment of the arginine residue present in the peptide chain.
  • Peptide fragmentation is performed by selective cleavage of peptide bonds.
  • gel carriers used for molecular weight separation by gel electrophoresis such as two-dimensional electrophoresis and SDS-PAGE, use peptide chains having an amino acid length exceeding a certain range due to the pore structure in the gel. Although it has the function of retaining the protein in the gel, it gives a clear difference in the electrophoresis speed, but when the amino acid length of the peptide chain becomes smaller than the strong threshold molecular weight, the function of retaining in the pore structure in the gel rapidly Lost.
  • the specificity of the gel carrier used for the gel electrophoresis by utilizing the specificity of the gel carrier used for the gel electrophoresis, a peptide chain having a long amino acid length is maintained while being supported on the gel carrier.
  • a series of reaction products are prepared by sequentially decomposing and removing the terminal amino acids, followed by fragmentation of the peptides by trypsin digestion to obtain a target group of C-terminal peptides. Fragments can be easily eluted from the gel carrier and recovered.
  • the group of target C-terminal peptide fragments usually has a fraction of the amino acid length of the original peptide chain, and thus is released from the gel carrier and eluted into the trypsin solution.
  • other peptide fragments are similarly eluted in the trypsin solution, but when the buffer solution and the gel carrier are separated, various released peptide fragments are recovered in the buffer solution. Thereafter, a desalting treatment is performed to remove the buffer solution components, and the peptide fragment digested with dribsin is recovered and dried.
  • the method for analyzing the C-terminal amino acid sequence of a peptide according to the second embodiment of the present invention can be performed, for example, by using a two-dimensional electrophoresis method or an SDS-PAGE method from a sample containing various proteins.
  • a two-dimensional electrophoresis method or an SDS-PAGE method from a sample containing various proteins.
  • the approximate molecular weight can be estimated. Even if such proteins are isolated and recovered from the separated spots (or bands), the number of amino acids is large.
  • a group of peptide fragments on the C-terminal side is used, and then the operation up to molecular weight measurement and determination of the C-terminal amino acid sequence based on the measurement results
  • the separated spots (or bands) can be used instead.
  • a series of chemical treatments are performed while the gel carrier is cut out and held on the gel carrier. It is possible to omit the operation of isolating and recovering such a protein from a previously separated spot (or band), and furthermore, in the isolation and recovery process.
  • the C-terminal amino acid sequence can be determined with the same accuracy without being affected by the recovery yield.
  • the peptide sample of interest was a linear peptide, which was separated by gel electrophoresis in advance, and was supported on the gel carrier.
  • the gel electrophoresis method performs not only the conventional SDS-PAGE method in which electrophoresis is performed in one-dimensional direction, but also swims two-dimensionally on the gel, resulting in higher resolution.
  • the two-dimensional electrophoresis method may be applied.
  • the peptide sample separated by the method according to the second aspect of the present invention can be separated from the peptide sample by a method according to the second embodiment of the present invention, even if the sample is free from contaminants and has a smaller sample amount. Amino acid sequencing is now possible.
  • cysteine residues in the molecule may be included in the target peptide.
  • S-S— bond is formed by 2-sulfanylethanol (HS—C 2 H 2 —OH: 2-mercaptoethanol), DTT (dithiothreitol: threo 1,4—disulfanilous 2,3
  • a reducing reagent such as (butanediol) and perform electrophoresis in a reduced state to form a single spot.
  • one S—S— bond between cysteine residues in the molecule is reduced in advance, and the reduced cysteine is modified by carboxymethylation using acetic acid or the like. It is preferable to perform single spotting.
  • trypsin digestion can be performed more efficiently by forming a linear peptide without forming a single S—S— bond between cysteine residues in the molecule.
  • the mass spectrometry according to the present invention in particular, the method of measuring the molecular weight by the ionic species by the MA LDI-TOF-MS method, and the method of analyzing the molecular weight measurement spectrum by the anionic species will be described in more detail. .
  • the molecular weight of ionic species derived from peptide fragments generated by trypsin digestion is measured by using a MA LDI-TOF-MS device to measure high molecular weight peptide chains.
  • a MA LDI-TOF-MS device measures high molecular weight peptide chains.
  • a long peptide chain subjected to trypsin digestion treatment has its N-terminal amino group and the amino group on the side chain of lysine residue substituted with the alkanoyl group introduced in the N-acylation protection treatment. Because arginine It undergoes selective cleavage only at the C-terminal peptide bond of the residue.
  • the long peptide chain to be analyzed does not include a plurality of peptide fragments having one arginine residue at the C-terminus and the same number of arginine residues as the number of arginine residues contained.
  • the C-terminal fragment of the original peptide chain is divided into fragments.
  • the peptide chain of a series of reaction products prepared by successive removal of amino acids at the C-terminus also contains a plurality of common peptide fragments containing an arginine residue at the C-terminus and arginine residues. Not, it is split into peptide fragments on the C-terminal side of the peptide chain.
  • the molecular weight was measured by the cation species generated by the ionization treatment and the molecular weight was measured by the anion species by the MA LDI-TOF-MS method.
  • the fragment group is the main ionic species, and a small amount of ionic species derived from the corresponding peptide fragment in which the above-mentioned alkyl group is excessively substituted is not rare.
  • a small amount of an ionic species derived from the corresponding peptide fragment substituted with the above-mentioned perfluoroalkanoyl group may be accompanied.
  • the g-self digestion product of trypsin to be used that is, a peptide fragment derived from trypsin cleaved by another trypsin is necessarily mixed into the mixture of the peptide fragments.
  • the trypsin amino Since the acid sequence is known, it is known in advance what molecular weight and m / z value of the ionic species derived from the peptide fragment of the autolysate of trypsin are measured. Needless to say, the ion species derived from the peptide fragment of the autolysate of trypsin is not accompanied by the ionic species in which the alkanoyl group is substituted.
  • the major peptide fragments generated from long peptide chains with analytical symmetry have one arginine residue at the C-terminus, multiple common peptide fragments, and do not contain arginine residues in the middle A series of C-terminal peptide fragments that reflect the sequential removal of C-terminal amino acids.
  • Proton (H +)-added cation species and proton (H +)-desorbed anion species can be generated from the fragment.
  • the measurement mode the cation species and anion species can be generated. And can be measured individually.
  • the common peptide fragments with one arginine residue at the C-terminus have an arginine residue with a guanidino group rich in proton (H +) receptivity at the C-terminus of the fragment.
  • H + proton
  • the C-terminal peptide fragment of the original peptide chain itself may have an arginine residue at the C-terminal by chance, but it is derived from the remaining series of reaction products. C-terminal peptide fragments do not have arginine residues. Also, In these peptide fragments at the C-terminal side, an amino group having proton (H +) accepting ability is present at the N-terminal of the peptide, and a carboxy group (--COOH) having proton (H +) donating ability is present at the C-terminal. Gives a peak of an anionic species having a significant peak intensity on a molecular weight measurement spectrum by an anion species, and at the same time, has a significant peak intensity on a molecular weight measurement spectrum by a cationic species Give seed peak.
  • the ionic species derived from the accompanying peptide fragment described above that is, ionic species having an increased molecular weight corresponding to an extra alkanoyl group, ionic species exhibiting lack of a molecular weight corresponding to a water molecule, and
  • the peak intensity of an ionic species showing an increase in molecular weight corresponding to the lack and addition of an extra alkanoyl group is significantly smaller than that of the ionic species derived from the main peptide fragment.
  • the cation species derived from these accompanying peptide fragments have a significant peak intensity on the molecular weight measurement spectrum by the cation species
  • the cation species on the molecular weight measurement spectrum by the anion species even if the peak intensity of the corresponding anion species is low, a close examination should confirm its presence.
  • the anionic species derived from these accompanying peptide fragments have a significant peak intensity on the molecular weight measurement spectrum by the anionic species
  • the molecular weight measurement spectrum by the cationic species above, the peak of the corresponding cation species, even though its peak intensity is weak, should be confirmed by close inspection.
  • peptide fragments are collected, dried, and then subjected to trypsin digestion treatment using a MA LDI-TOF-MS device.
  • the ionic species derived from the mixture of peptide fragments are measured.
  • the feature of this MA LDI-TOF-MS method is that the ionization process of each peptide fragment consists of a cation species to which a proton (H + ) is added and an anion species to which a proton (H +) is released.
  • secondary ionization processes are induced, and the generation of daughter ion species in which large fragments have been dropped from the parent ion species is suppressed.
  • the daughter ion species in which a large fragment (atomic group) corresponding to the formula weight of one amino acid residue has been removed from the ion species derived from each peptide fragment itself, is regarded as a peak showing significant peak intensity. It is very unlikely to be measured.
  • ionic species derived from these C-terminal peptide fragments themselves Is measured as a group of peaks arranged in order, with the m / z value of that peak being the m / z value difference corresponding to the formula weight of any one of the amino acid residues.
  • the lysine residue of the specific cleavage site is protected by N-alkanoylation at the side chain amino group.
  • trypsin digestion is assumed to occur only with arginine residues.
  • the C-terminal peptide fragment obtained by performing specific cleavage of the peptide chain using trypsin has a length of not more than 40 amino acids, preferably not more than 30 amino acids. Have been.
  • ionic species derived from a series of C-terminal peptide fragments that reflect the sequential removal of the desired C-terminal amino acid were analyzed for molecular weight by cation species using the measured MA LDI-TOF-MS method.
  • anion species it is possible to limit the analysis region to a range not usually exceeding 400.
  • the sequential removal of C-terminal amino acids is required when determining at least the partial sequence of 3 to 4 amino acid residues from the C-terminal. It is desirable that the shortest C-terminal peptide fragment of the reaction product be at least 5 to 6 amino acids in length. Therefore, it is desirable that at least one of the ionic species derived from a series of C-terminal peptide fragments be found with a clear peak intensity in the range where the m / z value of the peak is 500 or more. No.
  • the method for measuring a molecular weight using a cationic species by the MA LDI-TOF-MS method and a method for analyzing a molecular weight measurement vector using an anionic species according to the present invention are described in the first aspect of the present invention described above.
  • the ionic species derived from a series of C-terminal peptide fragments, which give a molecular weight decrease accompanying the sequential decomposition of the C-terminal amino acid are classified into MA LDI-TOF —
  • MA LDI-TOF This is a method in which both the molecular weight measurement vector based on the cation species and the molecular weight measurement vector based on the anion species by the MS method are cross-referenced and analyzed.
  • the characteristic point caused by fragmentation by the sequential removal reaction of C-terminal amino acids and trypsin digestion treatment described above is used.
  • the analysis is performed while cross-referencing both.
  • the advance At that time, for the reason described above, the analysis work of the spectrum does not usually pose a problem even if the analysis range is selected to have an m / z value of 400 or less.
  • Step 1 tryptic autolysis is carried out in the measured molecular weight spectrum of the cationic species by the MA LDI-TOF-MS method and the molecular weight measurement spectrum of the anionic species. Since peaks of ionic species derived from the peptide fragment derived from the contaminants are contaminated, specify them. Peptide fragments derived from autolysis of trypsin are N-terminal fragments with lysine or arginine residues at the C-terminus and C-terminal fragments, but their molecular weights have been determined. Based on the known molecular weights, each peptide has an mZz value of less than 400 and less than 500. Identify the peak of the cation species from which the proton (H +) is added and the peak of the anion species from which the proton (H +) has been removed.
  • ion species peaks derived from trypsin can also be used as internal standard peaks for calibrating the systematic error of the mZz value, for example.
  • the peak m / z value of the internal standard peak and the full width at half maximum can be referred to and used as a reference for removing noise peaks.
  • an ion species peak having a clear peak intensity is selected. Specifically, excluding trypsin-derived ionic species peaks, the remaining ionic species peaks contain multiple arginine residues at the C-terminus, multiple common peptide fragments, and sequential C-terminal amino acids of interest Ionic species derived from a series of C-terminal peptide fragments that reflect the dynamic removal are the largest in the molecular weight measurement spectra using the cationic and anionic species. Should show the peak intensity of
  • the largest cation species peak having the maximum peak intensity is specified in the molecular weight measurement results by the cation species, and the peak intensity of the largest cation species peak is determined as a reference.
  • a cation species peak having a peak intensity of 1 Z 40 or more is selected to form a first cation species peak group.
  • the first cationic species peak group includes at least a cationic species peak group derived from a plurality of common peptide fragments containing one arginine residue at the C-terminus.
  • the largest anion species peak having the maximum peak intensity is identified in the molecular weight measurement results by the anion species, and the peak intensity of the maximum anion species peak is determined.
  • an anion species peak having a peak intensity of 140 or more is selected to form a first anion species peak group.
  • this first group of anionic species peaks is usually a series of C that reflects at least the sequential removal of the C-terminal amino acid of interest.
  • the peak groups include all the anion species peak groups derived from peptide fragments having 5 or less removed amino acid residues.
  • Step 3 first, although a clear peak intensity is given in the molecular weight measurement result by the cation species, the generation ratio of the corresponding anion species is low, and a clear peak is found in the molecular weight measurement result by the anion species. In consideration of the fact that some do not show the intensity, for the first cationic species peak group that gives a clear peak intensity, the corresponding anionic species peak is specified, and the second anionic species peak group is identified. I do.
  • Cation species that exhibit a loss of molecular weight corresponding to water molecules, and cation species that exhibit an increase in molecular weight corresponding to the loss of water molecules and the addition of extra alkanol groups, are generally Although the peak intensity is significantly smaller than that of the cation species derived from the main peptide fragment, even if it belongs to the first cation species peak group, the peaks associated with these cation species peaks are not affected.
  • the corresponding, associated anion species peak has a much lower peak intensity and is often not included in the first anion species peak group. These corresponding associated anion species peaks are confirmed to be significant anion species peaks in the operation of specifying the second anion species peak group.
  • the corresponding cation species peak is specified, and this is defined as the second cation species peak group.
  • the anion species peaks associated with the anion species peaks derived from a series of C-terminal peptide fragment groups reflecting the sequential removal of the desired C-terminal amino acid are generally Although the peak intensity is significantly lower than that of the anion species derived from the non-peptide fragment, even if it belongs to the first anion species peak group, it corresponds to these accompanying anion species peaks, Accompanying cation species peaks have even lower peak intensities and are often not included in the first cation species peak group. These corresponding accompanying cation species peaks are confirmed to be significant cation species peaks in the operation of identifying this second cation species peak group.
  • Step 4 shows an intersection of the first anion species peak group and the second anion species peak group, that is, a clear peak intensity on the molecular weight measurement spectrum by the anion species, and
  • the corresponding anion species also sets a third anion species peak group, which is a group of anion species that are observed at a clear peak intensity on the molecular weight measurement spectrum by the cation species.
  • the anion species derived from the peptide fragment having a large abundance is the third species. Included in the peak group of anionic species.
  • the union of the first anion species peak group and the second anion species peak group is set as a fourth anion species peak group.
  • This fourth group of anion species peaks comprises at least one common peptide fragment with one arginine residue at the C-terminus and a series of sequences reflecting the sequential removal of the desired C-terminal amino acid. It contains anionic species peaks derived from the C-terminal peptide fragments and many of the anionic species peaks associated with the anion species peaks derived from these peptide fragments.
  • a third cation species peak group is set, which is a group of cation species observed at a clear peak intensity on the molecular weight measurement spectrum of the anionic species.
  • This fourth group of cationic species peaks is a series of at least one common peptide fragment containing one arginine residue at the C-terminus, and a series of sequences that reflect the sequential removal of the desired C-terminal amino acid. It contains anionic species peaks derived from the C-terminal peptide fragments and many of the cation species peaks associated with the cation species peaks derived from those peptide fragments.
  • the relative peak intensity is calculated based on the peak intensity of the maximum anion species peak, and each corresponding anion species peak is calculated.
  • the ion species peak calculate the relative peak intensity based on the peak intensity of the largest cation species peak. Then, when the relative peak intensities are compared with each other, it is verified whether the corresponding cation species peak is relatively stronger or conversely, whether the corresponding cation species peak is relatively stronger.
  • the present invention specifies a cation species peak in which the relative peak intensity of each corresponding cation species peak is 32 or more with respect to each peak of the third anion species peak group, Forming a group of cation species peaks of
  • This fifth cationic species peak group includes at least a cationic species peak derived from the peptide fragment itself containing one arginine residue at the C-terminus, while a fifth anionic species peak is included.
  • the group contains at least the peak of the anion species derived from the C-terminal peptide fragment, which has a relatively high abundance ratio, from a series of C-terminal peptide fragments that do not contain arginine residues. .
  • the peaks of the accompanying ion species which show a clear peak intensity are also included. That is, the fifth cation species peak group and the fifth anion species peak group specify the main ionic species peaks having significant counter ion species.
  • the fifth cation species peak group and the fifth anion species peak group are identified as the main ion species peaks having significant counter ion species.
  • the common peptide fragments with a high abundance ratio, one C-terminal arginine residue, and a series of C-terminal peptide fragments that do not contain arginine residues Among them, in the C-terminal peptide fragment with a relatively high abundance ratio, in addition to the ion species peak derived from the main peptide fragment itself, a clear peak intensity among the accompanying ion species peaks is obtained.
  • the peak used for the N-acylation protection A cationic species peak having a large m / Z value corresponding to the excess of the formula weight of the sil group,
  • the fifth cation species peak may be any of the cation species peaks having a large m / z value of the molecular weight corresponding to the combination, and any of the above-mentioned cation species peaks (5a-l) to (5a-3).
  • the “parent cation species peaks” present in the group are selected to form the sixth cation species peak group.
  • the cation species peak included in the sixth cation species peak group is derived from a peptide fragment that is generated from the peptide chain to be analyzed by trypsin digestion and has a high abundance ratio.
  • the peak of the anion species having a large m / z value of the molecular weight corresponding to the combination of the above, and any of the peaks of the anion species accompanying the above (5b-1) to (5b-3) are also the fifth anion.
  • the “parent anion species peak” existing in the ion species peak group is selected to be a sixth anion species peak group.
  • the anion species peak included in the sixth anion species peak group is derived from a peptide fragment which is generated from the peptide chain to be analyzed by trypsin digestion and has a high abundance ratio.
  • the m / z value difference between adjacent peaks is calculated based on the mZz value difference between each ion species peak. At that time, those with low peak intensity, which include uncertainties in the determination of the m / z value itself of the ion species peak, are eliminated, and the significant amount generated by trypsin digestion from the peptide chain to be analyzed. Only peaks of ionic species derived from peptide fragments are targeted in the analysis work described later. Therefore, for the fourth cation species peak group, the m / z value difference between adjacent peaks is calculated based on the m / z value of each cation species peak, and for the fourth anion species peak group. The mZz value difference between adjacent peaks is calculated based on the m / z value of each anion species peak.
  • the relative peak intensity of the “parent cation species peak” is generally higher than the relative peak intensity of the remaining associated cation species peak. Comparing the “parent anion species peak” with its associated anion species peak, which is greater than the peak intensity, the relative peak intensity of the “parent anion species peak” is generally It is larger than the relative peak intensity of the seed peak.
  • Step 6 by comparing the relative peak intensities described above, for each peak of the sixth cation species peak group, the peak corresponding to the “parent cation species peak” is selected, Similarly, a peak corresponding to the “parent anion species peak” is selected for each peak of the sixth anion species peak group, and the seventh anion species peak is selected. Group.
  • any of the accompanying cation species peaks (5a-l) to (5a-3) are included in the force S and the fifth cation species peak group, these (5a-1) to (5a-1)
  • the associated cation species peak of 5a-3) is also included in the sixth cation species peak group.
  • the accompanying cation species peaks (5a-1) to (5a-3) are removed, which corresponds to a "parent cation species peak". In other words, it is possible to select only the peak of the cation species of the peptide fragment itself derived from the peptide to be analyzed.
  • the accompanying cation species peaks (5a-l) to (5a-3) are included in the force S and the fifth cation species peak group
  • these (5a-1) to (5a-1) The associated cation species peak of 5a-3) is also included in the sixth cation species peak group.
  • the accompanying cation species peaks (5a-1) to (5a-3) are removed, which corresponds to a "parent c
  • any of the associated anion species peaks (5b-1) to (5b-3) are included in the fifth anion species peak group, these (5b-1) to (5b-1)
  • the anion species peak accompanying 3) is also included in the sixth anion species peak group.
  • the accompanying anion species peaks of (5b-1) to (5b-3) are removed, and the peaks are converted into the “parent anion species peak”. Only the relevant one, that is, only the peak of the anion species of the peptide fragment itself derived from the peptide to be analyzed can be selected.
  • the seventh cationic species peak group mainly contains one arginine residue at the C-terminus. And the peak of the cation species of the peptide fragment itself derived from the peptide chain to be analyzed. At that time, if an Argyun residue is present at the C-terminal of the peptide chain itself to be analyzed, the C-terminal peptide fragment containing one arginine residue at the C-terminal generated by trypsin digestion The derived cation species peak is also included in the seventh cation species peak group, similarly to the cation species peak derived from another peptide fragment containing one arginine residue at the C-terminus. You.
  • the C-terminal peptide fragment containing one arginine residue at the C-terminus is accompanied by a C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products due to the sequential degradation of the C-terminal amino acid.
  • the other peptide fragments produced by tryptic digestion do not have c-terminal peptide fragments derived from the reaction products that have undergone the sequential degradation of c-terminal amino acid.
  • the C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products accompanying the sequential decomposition of the C-terminal amino acid usually has a superior relative peak intensity of the corresponding anion species peak, and the molecular weight measurement spectrum of the anion species indicates ⁇ , such a corresponding Yion species peak should be found.
  • an anion species peak corresponding to each cation species peak of the seventh cation species peak group, which is present in the fourth anion species peak group, is selected, and an eighth anion species peak is selected.
  • Forming a group, the corresponding peak of the anionic species being associated with the peak of the anionic species from the C-terminal peptide fragment from a series of reaction products, following the sequential degradation of the C-terminal amino acid, Consider whether or not.
  • the natural chain-form ⁇ -amino acid residue (1) NH—CH (R) —CO— (R represents a side chain of the amino acid residue) or used for the above N-acylation protection for a hydroxy group or an amino group on the side chain.
  • R represents a side chain of the amino acid residue
  • the presence or absence of an anionic species peak showing a difference in mZz value corresponding to the formula weight of the acylated protected ⁇ -amino acid residue resulting from substitution of the acyl group is examined.
  • the fourth anion species peak in which the difference in mZz value between the peaks is smaller than 200 for each anion species peak included in the eighth anion species peak group, A group of anion species peaks present in the group is selected.
  • the acetyl group used for N-acylsig protection is an acetyl group In such a case, the presence or absence of anion species peaks having mZz value differences between the peaks, which corresponds to the formula quantities shown in Table 1 below, is verified.
  • the peptide fragment derived from the peptide to be subjected to corner mutagenesis was identified. Then, it is determined to be a group of anion species peaks of a peptide fragment having arginine at the C-terminus of the peptide chain generated by trypsin digestion.
  • the difference in m / z value corresponding to the formula amount of the amino acid residue shown in Table 1 above was due to the sequential decomposition process of the C-terminal amino acid of the present invention at the peak of the anion species derived from the main C-terminal peptide fragment.
  • O-acylation is also carried out on the side chain hydroxy groups of serine and threonine, O-acylation of the side chain hydroxy group of serine or threonine in the hydrolysis treatment step prior to dani is deprotected, so that the corresponding formula weight of the corresponding o-acylated amino acid residue is reduced.
  • the anion species peak showing the corresponding m / z value difference is measured as the accompanying anion species peak, and does not include the formula weight of the O-acylated amino acid residue.
  • those with N-acylation at the histidine residue and those with 0-acylation at the tyrosine residue are not sufficiently deprotected in the hydrolysis step, and are the major C-terminal peptide fragments. This leaves a possibility that a considerable amount may be mixed into the peak of the anionic species derived from the water.
  • conditions in which the lysine residue is N-acylated and protected are selected so as not to undergo deprotection.
  • the lysine residue subjected to trypsin digestion at the C-terminal peptide bond usually results in a difference in the m / Z value between the peaks of the anionic species derived from the major c-terminal peptide fragment. It does not correspond to the formula weight of lysine residues.
  • the above Table 1 naturally includes those corresponding to the formula weight of proline residues. Absent.
  • the seventh anion species peak group generally contains at least the anion species peak of the C-terminal peptide fragment itself derived from the peptide chain to be analyzed.
  • the c-terminal peptide fragment of the peptide chain to be analyzed is accompanied by a c-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products accompanying the sequential degradation of the C-terminal amino acid.
  • Main peaks are also included in the seventh anion species peak group.
  • each anion species peak of the seventh anion species peak group is converted to a C-terminal peptide fragment derived from a series of reaction products due to the sequential decomposition of C-terminal amino acid.
  • This review is the seventh
  • an anion species peak present in the fourth anion species peak group in which the z value difference between the peaks is found in a range smaller than 200 For example, if the acyl group used for N-acylation protection is an acetyl group, the difference between peaks in m / z value corresponding to the formula weight shown in Table 1 above is calculated. The presence or absence of the peak of the anion species is verified.
  • a ninth anion species peak group is formed after confirming that there is an anion species peak showing an mZ z value difference corresponding to the formula weight of an amino acid residue.
  • the anion species peak which is not included in the seventh anion species peak group, but is presumed to be an anion species peak derived from a series of reaction product-derived C-terminal peptide fragments
  • a union with the ninth anion species peak group is formed to form a tenth anion species peak group.
  • This tenth anion species peak group contains a row of anion species peaks derived from the C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products accompanying the sequential degradation of the C-terminal amino acids.
  • anion species peak with the largest m / z value is selected, and then the difference in mZ z value between each peak is the mZ z value corresponding to the formula weight of the amino acid residue.
  • a row of anion species peaks showing a value difference can be sequentially specified from the tenth anion species peak group.
  • the peak m / z value and the peak intensity of the molecular weight measurement spectrum using the cationic species and the molecular weight measurement using the anionic species using the MA LDI-TOF-MS method are used.
  • the MA LDI-TOF-MS instrument generally integrates (integrates) the number of ions incident on the detector and plots the corresponding m / z value (integral minute interval) on a digital plot. are doing. Therefore, the apparent peak intensity and the peak mZz value can be determined, and the apparent full width at half maximum can be easily calculated.
  • spike-like noise signals are often superimposed on the spectrum. It is desirable to remove such spike-like noise signals prior to analysis.
  • Step 1 it is used as a criterion to determine whether the peak is an actual signal peak or a noise peak It is possible to take advantage of the fact that the apparent full width at half maximum of a noisy peak is extremely narrow compared to the actual signal peak.
  • Step 1 an apparent full width at half maximum is calculated for an ion species peak due to a peptide fragment derived from autolysis of trypsin, and this value is used as a reference width.
  • a peak whose apparent full width at half maximum is extremely narrow as compared with the reference width can be determined as a noise peak.
  • the MALD I-TOF-MS instrument due to the measurement mechanism of the MALD I-TOF-MS instrument, it often shows systematic peak spread.
  • the systematic peak spread was evaluated using the ionic species peak due to the peptide fragment derived from autolysis of trypsin, and after performing a smoothing treatment capable of maintaining the asymmetry of the peak shape and the integrated peak intensity. It is preferable to determine the peak intensity and the peak mZz value of the actual signal peak.
  • the molecular weight measurement using a cationic species by the MALD I-TOF-MS method and the molecular mass measurement using an anionic species are included in the present invention. Since there is an internal standard peak, it is possible to refer to these and perform the same for both spectra.
  • the molecular weight measurement using a cationic species by the MALD I-TOF-MS method and the method for analyzing a molecular weight measurement spectrum using an anionic species according to the present invention involve a series of steps involving the sequential decomposition of C-terminal amino acids.
  • the purpose of this study is to identify the main anion species peaks derived from the C-terminal 'peptide fragment derived from the reaction product of step 1. Species peaks are also identified. Specifically, in (Step 5), the “anionic species "
  • anion species peaks of (5b-1) to (5b_3) have been identified. Therefore, regarding the molecular weight measurement spectrum by anionic species, in addition to the row of major anionic species peaks derived from C-terminal peptide fragments derived from a series of reaction products accompanying the sequential decomposition of C-terminal amino acids, Attribution of the anion species peak accompanying them is also performed at the same time.
  • R 1 represents the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide
  • R 2 represents a side chain of an amino acid residue located immediately before the C-terminal amino acid), and once forms a 5-oxazolone structure, and the C-terminal amino acid is associated with the cleavage of the 5-oxazolone ring. Decomposing;
  • the C-terminal carboxy group is regenerated by opening the remaining 5-oxazolone structure.
  • the peptide chain is selectively fragmented at the arginine residue site by trypsin digestion to obtain a tryptic digested peptide fragment.
  • the alkanoic anhydride used in the pretreatment step of N-acylation protection and the step of decomposing the C-terminal amino acid are both acetic anhydride ((CH 3 CO) 2 O).
  • perfluoroalkanoic acid is described on the assumption that trifluoroacetic acid (CF 3 COOH) is used.
  • the sequential degradation products of the C-terminal amino acids that are actually obtained mainly include secondary reactions in the process of degrading the C-terminal amino acids and the subsequent hydrolysis process. Derived by-products are mixed.
  • the cleavage reaction in the middle of the peptide chain is effective for this step of decomposing the C-terminal amino acid.
  • the C-terminal amino acid of the peptide fragment undergoes sequential degradation for convenience. Unplanned by-products are excluded from the following considerations.
  • N-terminal fragment N-terminal amino group is acetylated, C-terminal amino acid is Argien; fragment at both ends by trypsin digestion
  • Intermediate fragment a fragment in which the N-terminal amino group is not acetylated and the amino acid at the C-terminal is argyun; and a C-terminal fragment group: the N-terminal amino group is not acetylated, and
  • the amino acid sequence is a series of fragments that have undergone sequential degradation.
  • the peptide fragment obtained from the original peptide will The sum of the above-mentioned c-terminal fragments is approximately the same as that of the N-terminal fragment and the intermediate fragment.
  • these peptide fragments are likely to have at least ancillary products (ii) to (iv) in addition to (i) the ideal reaction product
  • the abundance ratio among these four reaction products (i) to (iv) is not necessarily constant, and varies depending on each individual peptide fragment, its amino acid sequence, and reaction conditions. For example, when there is no surplus amino acid residue In this case, the incidental products of (ii) and (iv) will not be produced at all.
  • the efficiency of anion and cation species generation from each peptide fragment is determined by the amino acid sequence and amino acid residue of each peptide fragment.
  • the peak is recognized on the measured spectrum of the anion species detection mode or the spectrum of the cation species detection mode, and the apparent peak position (mZZ) and the peak intensity are read.
  • the ion species peaks derived peptides are generally isotopes of the constituent atoms, for example, forces its intensity ratio is accompanied by isotope peaks containing 1 3 C against 1 2 C is generally in a constant .
  • the main peak of the ionic species consisting only of light atoms there are multiple isotope ion species whose mass numbers increase by 1, but the isotope peak is 1 to 1 C As the mass number difference increases to 1, 2, and 3, almost in proportion to the natural abundance of 3 C, its intensity decreases in geometric progression.
  • the intensity of the isotope peak whose mass number difference increases to 1, 2, and 3 is calculated based on the above assumption, and the isotope is located at the position where the peak position (m / Z) increases by 1 mass number. If a peak originating from another ion species exists that overlaps the peak, Correct the apparent peak intensity of. For each peak to be recognized, including these corrections, a peak shape fitting operation is performed to recognize the ion species consisting only of light atoms, read the peak position (mZZ), and read the peak intensity.
  • Each peak resulting from the ionic species composed only of light atoms is referred to as P i in the order of the peak position (mZZ).
  • Step 1 Removal of peaks of fragment ion species derived from autolysis of tribsine
  • peptide fragments caused by autolysis of the enzyme protein trypsin used are also formed. Peak position of the I-one species peaks derived from tryptic autolysis fragments, since known in advance, the peak set A, to remove a set A t ion species peaks derived from trypsin autolysis fragments, peptides derived be the set a P of the ionic species peak of come.
  • FIG. 9 shows a list of peak positions of ion species peaks derived from tryptic autolysed fragments.
  • Step 3 Specify the m / Z range to be analyzed
  • Sub-step 3-1 Select significant peaks with peak intensity above threshold
  • Each of the C-terminal fragment group, the N-terminal fragment, and the intermediate fragment to be analyzed is at least one of the ion species derived from the four reaction products (i) to (iv).
  • a significant peak on the spectrum is an essential requirement in the analysis described below.
  • peaks were selected peaks with a maximum peak intensity, the peak intensity and I MAX.
  • the basis of this I MAX set the threshold peak intensity I th.
  • At least the threshold peak intensity I th is set to 1/40 or more of I MAX .
  • the set A P peak, peak intensity, and selecting the threshold value I th or more peaks constitute the main peak set M.
  • Sub-step 3 2 Specify or reset the mZZ range for analysis
  • the mass number difference between them is usually in the range of 600 to 1200 It is estimated to be.
  • the peak P Mmax having the maximum peak position (m / Z) and the peak P Mmin having the minimum peak position (mZZ) are determined. select. Confirm that the difference in mass number between the peak P Mmax and the peak P Mmin ( ⁇ ) exceeds at least 600.
  • the m / Z range of the analysis target is set to the upper limit of m / Z, which is 100 masses larger than the peak position of peak P Mmax (m max ), and the lower limit is lower than the peak position of peak P Mmin (m min ).
  • monovalent ion species peaks included in main peak set M divalent ion species peaks corresponding to cation species (m + 1/1) and anion species (m-1-1); d.
  • the cation species (m + SZS) and the divalent anion species (! 11-2 / 2) are! ! ⁇ / ⁇ ⁇ It may appear in the range of m ra i n / 2.
  • the abundance ratio of the divalent ion species peak corresponding to the monovalent ion species peak is significantly reduced, or the divalent ion species peak is not often found, Considering this, the presence or absence of a peak corresponding to the divalent ion species peak is checked in advance.
  • Step 4 Classification and assignment of ion species peaks derived from tryptic peptide fragments of the four reaction products (i) to (iv)
  • a peptide fragment in which a trifluoroacetyl group has been introduced in place of the acetyl group is also supposed, but its occurrence frequency is considered to be sufficiently low. It is excluded here from consideration.
  • S (0) a set of ion species peaks caused by the peptide fragment in the state of (i);
  • S (+ Ac) a set of ion species peaks caused by the peptide fragment in the state of (ii);
  • S (+ Ac, -H 2 0) ( a set of ion species peaks derived from the peptide fragments of the state of iv); and definition I do.
  • the peaks of the ionic species resulting from the peptide fragments in the four states (i) to (iv) are composed of the same amino acid sequence and are close to each other and constitute a set of peak groups. there's a possibility that.
  • Sub-step 4-1 Identification of ion species peaks resulting from peptide fragments in four states (i) to (iv)
  • the set of peaks to be analyzed including S.
  • the following subsets are constructed.
  • Classification 6 Two types of peaks of (i) and (ii) are observed: Classification 1 1. Two types of peaks (iii) and (iv) are observed:
  • Class 6 (ii) peak or Class 11 (iv) peak G ⁇ S (42) ⁇ [S (Ac) 1 US (Ac) 2 US (Ac) 3 US (Ac— H 2 O) 1 US (Ac — H 2 0) 4 US (A c -H 2 0) 5 ] ⁇ ⁇ ⁇ S (Ac) 6 US (Ac—H 2 0) X 1 ⁇ S (Ac) 6
  • Class 6 (i) peak or Class 11 (iii) peak e ⁇ S (0, 42) ⁇ [S (0)! US (0) 2 US (0) 3 US (-H 2 O) (-H 2 0)
  • the peaks related to the distance 60 are the surplus in each of the categories 1, 2, 5, and 9.
  • the peaks related to the distance 42 are the acetylated peaks and ideal peaks in each of the classifications 1, 2, 3, and 6, and the acetylated peaks in each of the classifications 1, 4, 5, and 11 + Dehydration peak and dehydration peak.
  • Each peak of category 1 is given by (13) to (16).
  • Each peak of category 2 is given as a difference set from (1), (9), (11), (13) to (16).
  • Each peak of category 3 is given as a difference set from (5), (6), (10), (13) to (16).
  • Each peak of category 4 is given as a difference set from (3), (7), (12), (13) to (16).
  • Each peak of category 5 is given as a difference set from (2), (4), (8), (13) to (16).
  • Class 9 peaks
  • Class 10 peaks
  • classifications 12 to 15 are all observed as a single peak, and are included in any of the subsets in the process of forming the subsets (a) to (d) above. It is left as something that cannot be done. However, it cannot be determined at this stage which of these single peaks corresponds to any of classifications 12 to 15.
  • S (0) p a set of ion species peaks attributable to the peptide fragment in the state of (i), having additional peaks;
  • Classifications 6 and 11 are classified as Class 6 instead of Class 1 in consideration of probability.
  • S (0) 7 US (Ac) 8 The peak belonging to S (0) p and S (+ Ac) p are classified into both, and the peak belonging to S (-H 2 O) 7 US (Ac-- H 2 0) 8 is represented by S (_H 2 0) P and S (+ Ac, are classified into both the -H 2 O) P.
  • S (0) PM a set of ionic species peaks attributable to peptide fragments in the state of (i) classified into S (0) P in the main peak set M;
  • S (+ Ac) PM a set of ionic species peaks attributable to the peptide fragment in the state of (ii), which is classified into S (+ Ac) P in the main peak set M; S (+ Ac) PM ⁇ ⁇ S (+ Ac) P ⁇
  • S (—H 2 O) PM a main peak set M, a set of ion species peaks classified as S (—H 2 O) p and originating from the peptide fragment in the state of (iii);
  • S (+ Ac, — H 2 O) PM Main peak set A set of ionic species peaks that are classified as S (+ Ac, — H 2 O) P in M and originate from peptide fragments in the (iv) state S (+ Ac, ⁇ 20 ) ⁇ ⁇ ⁇ S (+ Ac, — H 2 0) P ⁇
  • the average peak intensity of the peak included in each category is calculated.
  • I is the average intensity of peaks belonging to S (0) p.
  • the average intensity of the peak belonging to S (+ Ac) P is defined as IAc .
  • the average intensity of the peak belonging to S (one H 2 0) P is defined as I— H20 .
  • the average intensity of the peak belonging to S (+ Ac, one H 20 ) p is defined as I Ac- 1H20 .
  • the set of ⁇ single peaks '' that are not assigned are classified into categories 12 to 15, such as peaks derived from ideal fragments without side reactions that give incidental peaks. Each peak is included.
  • Step 5 Select the main peak to be analyzed
  • Substep 5 1. Identify associated trifluoroacetylated peaks and exclude them from analysis
  • the peak further includes an ion species peak derived from.
  • step 4 above the remaining peaks that could not be assigned were classified into categories 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, etc., and peptide fragments in the state of (ii) (excess acetylated form)
  • the presence or absence of an ion species peak due to the peptide fragment in the above-mentioned state (V) or (vi) is determined based on the ion species peak caused by the above.
  • the presence or absence is determined by comparing at least the peak intensity of the ion species peak caused by the peptide fragment (excess acetylated compound) in the state (ii), and confirming that the peak intensity is at least low.
  • step 4 If an ion species peak caused by the peptide fragment in the above (V) or (vi) state is specified, a set of peaks undergoing excess trifluoroacetylation: S (CF) On the other hand, in step 4 described above, the peaks remaining without being assigned are removed from the set of peaks and excluded from the subsequent analysis.
  • representative peaks in each set are selected and used as the main peaks to be analyzed. Specifically, since the reliability and accuracy of the peak position (the center value of the peak) read in advance usually increases as the peak intensity increases, the difference in the molecular weight (peak position) due to the decomposed amino acids is increased. As the representative peaks in each set to be used for the analysis of (difference in
  • the combined peak intensities for each set are used in subsequent analyses. Use. Specifically, in order to search for amino acids that are sequentially desorbed from the C-terminus, the distance between peaks is calculated by focusing other accompanying peaks on the peak with the largest signal, Such a search is performed.
  • the peak intensity of the ionic species derived from the peptide fragment having the amino acid residue undergoing excess acetylation and the amino acid residue undergoing “dehydration” may have the highest peak intensity. The nature is low, so it is not considered here. That is, I A x (Io, IAc , I— H20 , IAcH20 ).
  • This overlapping operation is performed in the following procedures.
  • a pair of peaks (P i, P j) related to a distance of 18: For all dij 18, translate the peak on the low mass side of the set S (—18) by 18 to the high mass side in parallel. , Superimpose on the peak on the higher mass side of the set S (0, — 18). As a result of this superposition operation, the two types of peaks, ie, the “dehydrated” peak of (iii), the “dehydrated” peak of (iv), and the peak accompanied by excessive acetylation, have each been subjected to the “dehydrated” level. Superposition is made to the corresponding peak.
  • the set of peaks (P i, P j): du The peak on the low mass side of S (0, 60) is translated to the high mass side by 60, and superimposed on the peak on the high mass side of the set S (60) (Acetylui Danigata peak). In this operation, only the “dehydrated” peak of (iii) that is included in the set s (0, 60) but not included in the set S ( ⁇ 18) is superimposed.
  • Peak pair (P i, P j) related to a distance of 4 2: In di ⁇ 4 2, the peak on the high mass side of the set S (4 2) is translated by 4 2 on the low mass side Then, superimpose on the peak on the low mass side of the set S (0, 42). As a result, the peak with superfluous acetylation of (ii) superimposed on the peak with excessive acetylation and the peak with superfluous acetylation in (iv) and the peak with superfluous acetylation in (iv) The peak with dehydration and excess acetylenic is superimposed together to the (dehydration) peak in (iii).
  • the peak on the high mass side of the set S (24) is translated by 24 to the low mass side, and the low peak of the set S ( ⁇ , 2 4) Superimpose on the peak on the mass side. Therefore, in the classification in which the “dehydration” peak of (iii) does not exist, the peak accompanied by “dehydration” and excess acetylation in (iv) is superimposed on the ideal peak in (i). You.
  • the classification having the ideal peak of (i) results in the ideal of (i)
  • the additional peak that occurs is superimposed on the new peak.
  • the peak subjected to the translation operation is the peak set S to be analyzed. Remove sequentially.
  • the classification having the ideal peak of (i) only the ideal peak of (i) as a representative is selected as the peak to be analyzed. At that time, with the superimposition operation, the peak intensity is concentrated on the ideal peak (i), which is a representative.
  • the peak set S is obtained by the above superposition operation.
  • the set of peaks to be analyzed which is obtained by removing the peak subjected to the parallel movement operation while leaving the representative peak selected, and used for the subsequent analysis, is denoted by S i.
  • Substep 5-3 Calculation of index of probability of peak derived from sample protein Peak set S.
  • an index of the probability as a peak derived from the sample protein is calculated as follows.
  • S (0) PM a set of peaks of ion species attributable to peptide fragments in the state of (i) classified into S (0) p in the main peak set M;
  • S (+ Ac) PM a set of ionic species peaks attributable to the peptide fragment in the state of (ii), which is classified into S (+ Ac) P in the main peak set M;
  • S (- H 2 0) PM in the main peak set M, are classified as S (-H 2 0) P, the ion species peaks derived from the peptide fragments of the state of (iii) set;
  • S (+ Ac, -H 2 0) PM Main peak set A set of ion species peaks classified as S (+ Ac, — H 2 0) P and originating from peptide fragments in the (iv) state ; S (+ Ac, -H 2 0) PM ⁇ ⁇ S (+ A c, — H 2 0) P ⁇
  • S (0) P a collection of ion species peaks attributable to the peptide fragment in the state of (i), having additional peaks;
  • step 4 is regarded as “single peak”, for the peak Pi included in the main peak set M, the probability index r i is calculated as follows.
  • step 6 for each peak contained in the peak set Si to be analyzed, in order to search for amino acids that are sequentially desorbed from the C-terminus, when calculating the distance between the peaks, the corresponding cation species correspond to each other.
  • the analysis of the peak assumed to be an anion species is prioritized at least within a range where the above-mentioned probability index ri can be confirmed to be 1 or more.
  • Substep 6 1. Identify peaks from tryptic digestion, N-terminal fragment, then ⁇ middle fragment
  • the N-terminal fragment and the intermediate fragment obtained by trypsin digestion did not undergo amino acid elimination, and at least the above-mentioned superposition operation was performed on the spectrum measured in the positive mode.
  • the peak set S to be analyzed is observed as a peak included in the main peak set M. That is, since arginine is present at the C-terminus, the rate of formation of cationic species is usually significantly higher than the rate of formation of the corresponding anionic species, so the spectrum measured in positive mode Above, it is included in the intersection ⁇ s 1 nM ⁇ of the peak set Si and the main peak set M.
  • a low mass side or a low mass side peak having a molecular weight difference corresponding to the desorption of amino acids is found in the peak set Si.
  • the peaks that are not emitted are selected to produce a subset P 2 .
  • Te spectrum on odor measured in negative 'mode to identify the peak of the anionic species corresponding to each peak of the subset positive S 2, making the parts content set negative S 2.
  • molecular weight difference corresponding to elimination of Amino acids having a ( ⁇ [i]) the peak of the low mass side or high mass side, not found in peak set peak the were sorted to produce a further part partial set negative S 3.
  • the peak derived from the C-terminal fragment group is included in the difference set ⁇ Si ⁇ negative s 3 ⁇ obtained by removing the subset negative S 3 from the peak set. .
  • the peak having the maximum peak position (m / Z) in the difference set ⁇ Si negative S 3 ⁇ is defined as P- max .
  • Origin such P_ max P- as (0), the molecular weight difference corresponding to elimination of amino acids having a ([Delta] [alpha] [i]), the presence of the peak on the low mass side, searches in peak set S.
  • the difference in molecular weight corresponding to the desorption of one amino acid Assume that a series of peak trains is observed, indicating At this time, the molecular weight difference ( ⁇ [i]) corresponding to the desorption of amino acids is in the range of 57 to 191 as described above, and the low mass side where the peak position difference ( ⁇ ) is in the range of 200 or less.
  • the peak set Si is classified and assigned as described above, and includes “assigned peaks” that have been superimposed and “single peaks” that have not been superimposed.
  • the molecular weight difference ( ⁇ [) corresponding to the desorption of amino acids is taken into account, taking into account the presence or absence of excess acetylation and “dehydration” based on each assignment. i]) is determined.
  • “Single peak” is judged for all the possibilities of classifications 12 to 15.
  • the “daughter fragment” power S “parent fragment” is found to have excess acetylation and “elimination of amino acids that have not undergone dehydration J”, it is likely that this is a likely choice.
  • the dehydration of an amino acid having "dehydration” in the side chain has occurred, it can be determined that the selection is less probable.
  • the surplus acetic acid has been eliminated from the amino acid, it is determined that the probability is low.
  • the "daughter fragment” found has excess acetylation or amino acid removal without “dehydration” with respect to the "parent fragment", it can be determined that the selection is probable.
  • the dehydration of an amino acid having “dehydrated” in the side chain has occurred, it can be determined that the selection is low in probability. It should be noted that if the excess acetylated amino acid is eliminated, the probability is judged to be low.
  • the peak having the maximum peak position (mZZ) is defined as P- max .
  • P- max As P— (0), the presence or absence of a low mass side peak having a molecular weight difference ( ⁇ [i]) corresponding to the elimination of amino acid is searched in the peak set. If no equivalent to P (1) is found, the peak having the peak position (m / Z) next to P— max in the difference set ⁇ S negative S 3 ⁇ is started from: P— (0) and proceed with the same search.
  • step 6 the N-terminal fragment and intermediate fragment obtained by trypsin digestion and the C-terminal fragment group were discriminated from the N-terminal fragment, and Since the fragment in the middle has arginine at the C-terminus of the fragment, the discrimination is proceeding by comparing both the positive mode and the negative mode when measuring the spectrum.
  • Another method is to trace the time course of the elimination reaction, and use the peaks of the change due to the difference in the reaction time as the peaks of the C-terminal fragment group for these selections. There is also. That is, when the reaction time is prolonged, the peak of the C-terminal fragment group in which a larger number of amino acids are decomposed is obtained, but the original C-terminal fragment itself, which serves as a starting point in the analysis of the amino acid sequence, occurs. Therefore, it is easy to identify the peaks of the C-terminal fragment group in which a larger number of amino acids have been decomposed while comparing with a sample in which the reaction time is relatively short. 'At that time, the N-terminal fragment and the fragment in the middle part are common to both spectra, and the peak intensity ratio is essentially independent of the difference in the reaction time.
  • TaSDoflDi (+ HD 2 ) ⁇ F 2 ⁇ 1 0 1 ⁇
  • each subset is partitioned so that it does not include elements that are common to each other.
  • the subsets S (0) P , S (+ Ac) P , and S (-H 20 ) P are derived from peptide fragments having ancillary peaks. Either a peak belonging to either of these is observed, or it is observed as a “single peak”. Therefore, even if peaks belonging to the subset S (+ Ac, — H 2 0) P are excluded from consideration, the subset S (0) P , which is a peak derived from a peptide fragment having a remaining incidental peak, There is no problem because peaks belonging to either S (+ Ac) P or S (-H 2 O) p are considered.
  • the possible peak shift value d derived from one amino acid elimination is a subset of the following peak shifts.
  • Type 10 peaks • Pair d eD 0 U ( ⁇ 1 (one) UD 2 (+) )
  • Type 1 1 peak • Pair dsD 3 (+)
  • Type 1 3 peaks • Pair d GD 0 U (D 2 (+) UD 3 (+) )
  • Type 1 4 peaks • Pair d eD 0 U (D 2 (one) UD 3 (—))
  • Type 16 peaks • Pair d eD 0 U (D x (one) UD 2 (one)) In practice, this may be a peak pair observed between peaks of the c-terminal fragment group.
  • the two peaks P belonging to one of the subsets S (0) P S (+ Ac) P S (one H 2 0) P S (single) as a peak pair Therefore, for each type, only those peak subsets that contain the peak position difference ( ⁇ / ⁇ ) in the subset of possible peak shift values d are selected for the subsequent analysis. And a set of peak 'pairs (P i, ⁇ .
  • the peak position difference ( ⁇ / ⁇ ) is caused for each peak 'pair included in the set of peak' pairs (P / Pj) 'to be analyzed in the subsequent analysis created by the above selection. Estimate the type of amino acid residue to be removed. At this time, based on the peak position difference ( ⁇ ) and the type of the peak pair, the k value corresponding to the type of the desorbed amino acid residue is as follows.

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Abstract

本発明の提供する、アミノ酸長の長いペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する際、ペプチド途中におけるペプチド結合の切断などの好ましくない副次反応を抑制でき、その処理を汎用性の富む条件で実施することが可能な、逐次的Ｃ末端アミノ酸の分解反応手段を利用したペプチドのＣ末端アミノ酸配列解析方法においては、アミノ酸長の長いペプチドの乾燥試料に対して、予めＮ−アシル化処理を施し、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用し、穏和な条件でＣ末端アミノ酸の分解を行い、加水処理をした後、トリプシン消化により、アルギニン残基部位で選択的に断片化を行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ装置により、一連の反応産物に由来するＣ末側断片の分子量減少を測定し、Ｃ末端アミノ酸配列を特定する。

Description

明 細 書
質量分析法を利用するべプチド c末端ァミノ酸配列解析方法 技術分野
本発明は、 ペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法に関し、 より具体的 には、 ペプチド、 例えば、 タンパク質などのアミノ酸残基数の多いペプチドに関 して、 化学的方法により該ペプチドの C末端アミノ酸を逐次的に分解して、 その 反応産物の分子量を質量分析により決定し、 逐次的に除去される一連のアミノ酸 に起因する分子量減少に基づき、 C末端アミノ酸配列を解明する方法に関する。 特には、 該ペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法において、 測定される 質量分析スぺクトルに基づき、逐次的に除去される一連のアミノ酸に起因する分 子量減少を示す反応産物由来のイオン種ピークを特定し、 c末端アミノ酸配列を 解明する際に利用可能な、 質量分析スぺクトルの解析手法に関する。 背景技術
天然より採取されるぺプチドゃタンパク質に関して、 そのァミノ酸配列の同定 は、 力かるペプチドやタンパク質の生物学的性質、 機能を研究する際、 不可欠な 情報である。 現在、 ペプチドやタンパ 質の全アミノ酸配列は、 対応する遺伝子 情報、 すなわち、 これらのペプチドをコードしているゲノム遺伝子や m— R NA より調製された c—D NAの塩基配列に基づき、 推断されるアミノ酸配列として 決定されている。 その際、 該ペプチドをコードしているゲノム遺伝子や m— R N Aより調製されだ c一 D N Aを特定する上では、 ぺプチドの部分的なァミノ酸配 列の知見は、 依然として必要である。
このぺプチドの部分的なァミノ酸配列の知見としては、 一般に、 ぺプチドの N 末端アミノ酸配列と C末端アミノ酸配列とが、 特に有用とされている。 具体的に は、 例えば、 多数の m—R NAより調製された c _ D N Aライブラリーから、 目 的とするペプチドをコードしている c—D NAを選別する際、 仮に、 N末端アミ ノ酸配列と C末端アミノ酸配列とが判明していると、 かかる両末端のアミノ酸配 列に基づき、 作製された核酸プローブを利用して、 目標とする c一 D NAを選別 することが可能となる。 あるいは、 両末端のアミノ酸配列に基づき作製されたォ リゴヌクレオチド 'プライマーを利用して、 PCR法を適用して、 目標とする c -DNAを選択的に増幅することも可能となる。
ペプチドの N末端アミノ酸配列を解析する手法としては、 従来から、 エドマン 分解法を利用して、 N末端アミノ酸を逐次的に分解しつつ、 生成するアミノ酸誘 導体を同定する手法が利用されている。 一方、 ペプチドの C末端アミノ酸配列を 解析する手段として、 化学的手法により C末端アミノ酸を逐次的に分解し、 その 反応産物として得られる短縮され-た-ベプチドと元のぺプチドとの分子量差から、 分解された C末端アミノ酸を特定する方法が既に提案されている。 例えば、 化学 的手法により C末端アミノ酸を逐次的に分解する手段として、 90°Cに加熱しつ つ、 乾燥したペプチドにペンタフルォロプロパン酸 （CF3CF2COOH) 高濃 度水溶液、 あるいは、 ヘプタフルォロブタン酸 （CF3CF2CF2COOH) 高 濃度水溶液から発生した蒸気を作用させて、 前記パーフルォロアルカン酸により 促進される、 C末端アミノ酸の選択的な加水分解を行わせる方法が提案されてい る 、 r s u g i t a, A. e t a 1. , Eu r. J. B i o c h e m. 206, 691 -696 ( 1992 ))。 加えて、 前記パーフルォロア ルカン酸高濃度水溶液に代えて、 無水ペンタフルォロプロパン酸 （（CF3CF2 CO) 20) のァセトニトリル溶液、 無水ヘプタフルォロブタン酸 （（CF3CF2 CF2CO) 20) のァセトニトリル溶液を利用し、 例えば、 一 18°Cに冷却しつ つ、 この溶液から発生した蒸気を乾燥したペプチドに作用させて、 前記パーフル ォロアルカン酸無水物により促進される、 C末端アミノ酸の選択的な分解を行わ せる方法が提案されている （T s u g i t a, A. e t a 1 Ch e m. Le t t. 1992, 235-238 ; Ta k amo t o K. e t a 1. , Eu r. J . B i o c h e m. 228， 362-372 (1995) )。
前記の乾燥したペプチドに、 蒸気として供給されるパーフルォロアルカン酸、 あるいは、 パーフルォロアルカン酸無水物を作用させ、 C末端アミノ酸の選択的 な分解を行う手法では、 下記する反応式 （I) で表記される脱水反応：
Figure imgf000004_0001
により、 c末端アミノ酸から反応中間体として、 ォキサゾロン環構造が一端形成 され、 次いで、 パーフルォロアルカン酸がこのォキサゾロン環に作用し、 次に示 す反応式 （II) で表記される反応：
Figure imgf000004_0002
が生じ、 結果的に、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成されると報告され ている。
上記の c末端アミノ酸の選択的な分解反応は逐次的に進み、 所定の処理時間が 経過した時点で、 元のペプチドに対して、 1〜1 0数アミノ酸残基がその C末端 からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物が得られる。 この一連の反 応産物を含む混合物に対して、 質量分析法を適用して、 各反応産物に由来するィ オン種の質量を測定すると、 C末端アミノ酸配列を反映した質量差を示す一連の ピークが測定できる。 具体的には、 各反応産物は、 元のペプチドから逐次的な C 末端アミノ酸分解反応で生成される結果、 例えば、 元のペプチドから数アミノ酸 残基が除去された反応産物までの、 数種の一連の反応産物群に関して、.質量分析 法を利用することで、 対応するイオン種の質量を一括して分析することができ、 力かる数アミノ酸残基分の C末端アミノ酸配列を一括して決定できる。
なお、 例えば、 核酸プローブやプライマーの作製に利用する C末端アミノ酸配 列の情報は、 通常、 力かるアミノ酸配列をコードする塩基配列として、 1 8塩基 長〜 2 4塩基長程度、 従って、 6アミノ酸〜 8アミノ酸程度であってもよく、 1 0数ァミノ酸残基に達する C末端ァミノ酸配列の解明を必要とするのは、 極めて 特殊な場合のみである。 従って、 上記のパーフルォロアルカン酸またはパーフル ォロアルカン酸無水物の蒸気を気相から供給しつつ、 乾燥したペプチドに作用さ せて、 逐次的な C末端アミノ酸分解反応により、 例えば、 1 0アミノ酸残基の除 去に達する一連の反応産物を同時に含有する処理試料を調製するこれらの手段 は、 前記の用途に適合したものである。 発明の開示
一方、 解析対象のペプチドが、 例えば、 タンパク質などのアミノ酸残基数の多 いペプチドである場合には、 元のペプチド自体の分子量が、 質量分析法の適用可 能な分子量範囲を超える、あるいは、元のぺプチド自体の大きな分子量に対して、
1アミノ酸残基の式量変化が相対的に少なく、 分子量差の測定精度の低下を起こ すため、 下記の工夫が検討されている。 具体的には、 上記の C末端アミノ酸の選 択的な分解反応で得られる、 元のぺプチドに対して、 1〜 1 0数ァミノ酸残基が その C末端からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物に対して、 特定 のアミノ酸部位において、 選択的なペプチド鎖の切断が可能な、 切断部位特異性 を有するプロテアーゼ、 例えば、 トリプシンを利用し、 長いペプチド鎖の酵素消 化を施した上で、 そのペプチド断片について、 質量分析を行う形態を利用してい る。 すなわち、 かかる酵素消化を施して得られるペプチド断片の混合物中には、 元のペプチドに由来する C末側ペプチド断片と、 それに対して、 1〜1 0数アミ ノ酸残基がその C末端からそれぞれ除去された一連の反応産物に由来する C末 側ぺプチド断片群が含まれており、 この元のぺプチド、 ならびに一連の反応産物 に由来する C末側ぺプチド断片群に対して、 質量分析法を適用して、 各反応産物 に由来する C末側ぺプチド断片群イオン種の質量を測定すると、 C末端アミノ酸 配列を反映した質量差を示す一連のピ一クを、 十分な分子量分解能で測定できる。 それに対して、 上述のパーフルォ口アル力ン酸またはパーフルォ口アル力ン酸 無水物の蒸気を気相から供給しつつ、 乾燥したペプチドに作用させる手法は、 有 用な c末端アミノ酸配列の解明手段ではあるものの、 解析対象のペプチドが、 例 えば、 タンパク質などのアミノ酸残基数の多いペプチドである場合に、 汎用の手 段として利用を進める際、 以下に記載する幾つか実用上の課題を残すことが判明 した。
第一の課題としては、 上述するパーフルォロアルカン酸高濃度水溶液を利用し、 例えば、 90°Cに加熱しつつ、 乾燥したペプチドにパーフルォロアルカン酸蒸気 を作用させる手法では、 ペプチド中のセリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) において、 α位のアミノ基 （一 ΝΗ_) と ] 3位のヒドロキシ基 （一 Ο Η) の間で、 Ν, Ο—ァシル転位反応も進行し、 引き続き、 加水分解が進行し、 セリン残基の Ν末側でぺプチドの切断が生じるという副反応が存在する。 また、 条件に依っては、 位にヒドロキシ基 （一 ΟΗ) が存在しているトレォニン残基 (-NH-CH (CH (CH3) OH) -CO-) においても、 同様の機構によ る加水分解が進行し、 トレオニン残基の N末側でぺプチドの切断が生じるという 副反応が存在する。 さらには、 ペプチド中のァスパラギン酸残基 （一 NH— CH (CH2COOH) -CO-) において、 C末のカルボキシ基から 位のカルボ キシ基へのペプチド結合の転位と、 それに引き続く加水分解が進行し、 ァスパラ ギン酸残基の C末側でぺプチドの切断が生じるという副反応が存在する。
これら副次反応により、 長いペプチド鎖の切断が生じると、 その N末側ぺプチ ド断片に対しても、 C末端アミノ酸の選択的な分解が同時に進行することになる。 これらの副次反応に由来する反応産物が共存すると、 場合によっては、 目的とす る反応産物の質量分析に際して、 その測定を阻害する要因ともなる。
さらには、 元のペプチド鎖の切断に至らなくとも、 J3位のヒドロキシ基 （一O H)へ N末側部分ぺプチドが連結された分岐型ぺプチドとなると、その部位では、 アミド結合が失われており、 ォキサゾロン環構造の形成がなされず、 C末端アミ ノ酸の選択的な分解反応がそれ以上進行しないものとなる。
それに対して、 上述するパーフルォロアルカン酸無水物のァセトニトリル溶液 を利用し、 例えば、 一 18°Cに冷却しつつ、 この溶液から発生したパーフルォロ アルカン酸無水物蒸気を乾燥したぺプチドに作用させる手法は、 系内 (こ溶液から 蒸発する水分子を含まないので、 前記の副次的反応の発生を有効に回避できる利 点を有している。 ただし、 利用しているパーフルォロアルカン酸無水物の反応性 が高く、 処理温度が上昇すると、 不要な副次的反応を効果的に抑制することが困 難となるため、 処理温度を、 例えば、 一 1 8 °Cのような低温に維持する必要があ る。 .換言すれば、 処理温度の調整が不十分であると、 不要な副反応が進行する可 能性が高く、 その観点では、 汎用性になお難点を残し、 更なる改良の余地を有す る手法ともいえる。 加えて、 冷却に伴って水分の結露を起こすと、 かかる水分に より、 利用している試薬の劣化、 すなわち、 パーフルォロアルカン酸無水物の劣 化が起こり、 結果として、 反応性の低下を引き起こすこともあり、 実用上の問題 になる懸念もある。
第二の課題としては、 解析対象のペプチドが、 例えば、 タンパク質などのアミ ノ酸残基数の多いぺプチドである場合には、 c末端アミノ酸の選択的な分解反応 を行った後、切断部位特異性を有するプロテアーゼを利用する酵素消化処理を付 加し、 得られる C末側べプチド断片の分子量測定を行う形態を採用することが検 討されているが、 その際、 かかる酵素消化で必然的に副生される、 N末側のぺプ チド断片複数も、 測定される質量分析スぺク トル上に、 同時に観測されることに なる。 すなわち、 元のペプチド、 ならびに一連の反応産物に由来する C末側ぺプ チド断片群に起因するピークと、 それ以外の N末側のぺプチド断片複数に起因す るピークとを高い確度で分別した上で、 目的とする、 元のペプチド、 ならびに一 連の反応産物に由来する C末側ぺプチド断片群に起因するピークの各分子量を より精度よく決定可能な、 測定手法の提案が待たれている。 特には、 測定される 質量分析スぺク トル上において、 酵素消化で生成するペプチド断片に由来するィ オン種ピークを特定し、 その後、 N末側のペプチド断片複数に由来するイオン種 ピーク群と、 元のペプチド、 ならびに一連の反応産物に由来する C末側ペプチド 断片群に由来するイオン種ピーク群とを高い確度で分別する上で、 有効な質量分 析スぺク トルの解析手法の提案が待たれている。
本努明は前記の課題を解決するもので、 本発明の目的は、 上述する長いべプチ ド鎖の C末端アミノ酸を、 ォキサゾロン環構造の形成を経由する反応機構を利用 して、 逐次的に分解する際、 ペプチド鎖途中におけるペプチド結合の断裂などの 好ましくない副次反応を抑制でき、 同時にかかる化学的な処理自体は、 汎用' の 富む条件で実施することが可能な、逐次的 C末端ァミノ酸の分解反応手段を提供 するとともに、 元のペプチド、 ならびに調製される一連の反応産物を、 切断部位 特異性を有するプロテアーゼを利用する酵素消化処理を行った後、 これら酵素消 化ペプチド断片複数を質量分析する際、 目的とする、 元のペプチド、 ならびに一 連の反応産物に由来する C末側ペプチド断片群に起因するピークと、 その他の酵 素消化ペプチド断片複数に起因するピークとの弁別をより容易とするプロテア ーゼを利用する酵素消化処理と、 前記逐次的 C末端アミノ酸の分解反応手段とを 組み合わせて、 長いべプチド鎖の C末端ァミノ酸配列をより簡便に解析可能な方 法を提供することにある。 さらには、 前記 C末端アミノ酸配列の解析に際し、 測 定される質量分析スぺク トル上において、 酵素消化処理で生成するペプチド断片 に由来するイオン種ピークを特定し、 その後、 目的とする、 元のペプチド、 なら びに一連の反応産物に由来する C末側ぺプチド断片群に起因するピークと、 その 他の酵素消化ぺプチド断片複数に起因するピークとの弁別を図る上で、 かかる弁 別の確度を高めることを可能とする質量分析スぺク トルの解析手法、 ならびに、 該解析手法に基づき、 一連の解析処理操作に利用可能な解析支援ソゥトウェアを 提供することにある。 本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意検討と研究を繰り返したところ、 パーフルォロアルカン酸高濃度水溶液を利用し、 例えば、 9 0 °Cに加熱しつつ、 乾燥したペプチドにパーフルォロアルカン酸蒸気を作用させる手法における不 要な副次的反応は、 系内にパーフルォロアルカン酸高濃度水溶液から蒸発する、 パーフルォロアルカン酸と水分子が存在するため、 例えば、 ペプチド中のセリン 残基 （一 NH— C H (C H 2 OH) - C O -) において、 α位のアミノ基 （一 Ν Η -) と ]3位のヒドロキシ基 （一 Ο Η) .の間で、 Ν， Ο—ァシル転位反応が前記 加熱条件下で促進を受け、 さらに、 生成するエステルの加水分解も系内に存在す る水分子により促進を受ける結果と結論された。 一方、 パーフルォロアルカン酸 無水物のァセトエトリル溶液を利用し、 例えば、 一 1 8 °Cに冷却しつつ、 乾燥し たぺプチドにパーフルォロアルカン酸無水物蒸気を作用させる手法では、 系内に 水分子は存在しないものの、 パーフルォ口アル力ン酸無水物自体の高い反応性に 起因して、 処理温度の上昇とともに、 不要な副次的反応の頻度が急速に増すこと が確認されている。
以上の知見に基づき、 本発明者らは、 系内への水分子の供給源となる水溶媒を 使用すること.なく、 また、 パーフルォロアルカン酸無水物の如く、 高い反応性を 示す試薬を使用することなく、 C末端アミノ酸から反応中間体として、 ォキサゾ ロン環構造を形成し、 引き続き、 このォキサゾロン環の開裂に伴う、 C末端アミ ノ酸の選択的な分解反応を行うことが可能な反応条件を探索したところ、 少量の パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に添加した混合物を利用して、 例え ば、 気相から、 この混合物から供給される、 蒸気状のパーフルォロアルカン酸と アルカン酸無水物とを乾燥したペプチドに作用させると、 例えば、 60°C以下の 処理温度においても、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続き、 このォキサゾロン 環の開裂に伴う、 C末端ァミノ酸の選択的な分解反応が進行することを見出した。 加えて、 アルカン酸無水物は、 パーフルォロアルカン酸無水物と比較し、 その反 応性は大幅に穏やかであり、 パーフルォロアルカン酸共存下においても、 ぺプチ ドの途中切断を引き起こすには至らないことをも見出した。 具体的には、 ぺプチ ド中のセリン残基（一 NH— CH (CH2OH) -CO-)ゃトレオニン残基 （一 NH-CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対して、 パーフルォロアルカン酸の共存下、 アルカン酸無水物が作用して、 O—ァシルイ匕 反応が優先的に進行し、 N, O—ァシル転位反応を競争的に阻害する。 同時に、 N末端のァミノ基への N—ァシル化反応が進行し、 また、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァシ ル化反応、 チロシン残基 （— NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) の フエノール性ヒドロキシ基への O—ァシル化反応なども進行することも判明し た。 結果的に、 ペプチドの途中切断を誘起する、 N, O—ァシル転位反応等の転 位反応に関与する側鎖上のヒドロキシ基、 アミノ基などの反応性官能基は、 保 護 ·修飾を受けるため、 不要な副次反応は回避しつつ、 目的とする C末端アミノ 酸から反応中間体として、 ォキサゾロン環構造を形成し、 引き続き、 このォキサ ゾロン環の開裂に伴う、 C末端アミノ酸の分解反応のみが、 例えば、 60°C以下 の処理温度において選択的に進行することを見出した。 加えて、 本発明者らは、 上記のパーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物と を利用する、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続き、 このォキサゾロン環の開裂 に伴う、 c末端アミノ酸の選択的な分解反応は、 系内に水分子が存在しない状態 とし、 双極性非プロトン性溶媒中にパーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物 とを溶解させて、対象となるペプチドに液相で作用させた場合も、例えば、 4 0 °C 程度の処理温度においても、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続き、 このォキサ ゾロン環の開裂に伴う、 C末端ァミノ酸の選択的な分解反応が進行することを見 出した。 加えて、 ヒドロキシ基に対して、 パーフルォロアルカン酸の共存下、 ァ ルカン酸無水物が作用して、 O—ァシル化反応が優先的に進行し、 N, ひーァシ ル転位反応を競争的に阻害する効果、ならびに、ァミノ基への N—ァシル化反応、 フエノール性ヒドロキシ基への O—ァシル化反応なども進行することも判明し た。 結果的に、 ペプチドの途中切断を誘起する、 N， O—ァシル転位反応等の転 位反応に関与する側鎖上のヒドロキシ基、 アミノ基などの反応性官能基は、 保 護 ·修飾を受けるため、 不要な副次反応は回避しつつ、 目的とする C末端アミノ 酸から反応中間体として、 ォキサゾロン環構造を形成し、 引き続き、 このォキサ ゾロン環の開裂に伴う、 C末端アミノ酸の分解反応のみが、 例えば、 4 0 °C以下 の処理温度においても、 選択的に進行することを見出した。 例えば、 ゲル電気泳 動後、 かかるゲル担体上に担持されているペプチドであっても、 予め、 ゲル担体 中に含浸される水分を十分に除去する脱水処理を施した後、 双極性非プロトン性 溶媒中にパーフルォ口アル力ン酸とアル力ン酸無水物とを溶解させてなる溶液 を、 ゲル担体内に浸入させ、 ゲルの膨潤を図ると、 ゲル担体中においても、 同等 の液相反応を達成できることを見出した。
加えて、 本発明者らは、 ヒドロキシ基に対する O—ァシル化、 ァミノ基への N —ァシル化による、 ペプチドの途中切断を誘起する、 N, O—ァシル転位反応等 の転位反応に関与する側鎖上のヒドロキシ基、 アミノ基などの反応性官能基の保 護 ·修飾を予め施した後、 上記のパーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物と を利用する、 ォキサゾロン環構造の形成、 引き続き、 このォキサゾロン環の開裂 に伴う、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応を実施すると、 不要な副次反応の回 避には、 より有効であることを確認した。 具体的には、 ペプチドの乾燥試料に対 して、 乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度において、 アル力 ン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のァ ルカン酸無水物とアル力ン酸とを作用させると、 該ぺプチド N末端のァミノ基な らびに、該ぺプチドに含有されている可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基に 対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシル基による N—ァシル化、 ならびに、 側鎖上のヒドロキシ基に対する O—ァシル化を予め施すことが可能であること を見出した。 また、 ゲル担体上に担持されているペプチドであっても、 予め、 ゲ ル担体中に含浸される水分を十分に除去する脱水処理を施した後、 双極性非プロ トン性溶媒中にアルカン酸無水物を溶解させてなる溶液を、 ゲル担体内に浸入さ せ、ゲルの膨潤を図ると、ゲル担体中においても、同等の液相での N—ァシル化、 o—ァシル化反応を行わせることが可能であることを見出した。
また、 本発明者らは、 上述の C末端アミノ酸の分解反応を終えた時点では、 ォ キサゾロン環構造の形成、 引き続く、 このォキサゾロン環の開裂に伴う反応性中 間体も残留しており、 これら反応性中間体に加水処理を施し、 反応産物の c末端 は、 カルボキシ基の表出する形態に復することが、 その後の質量分析を行う上で 必要であり、 例えば、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を溶解 する水溶液を利用し、 反応産物をかかる水溶液に接触させることで、 容易になさ れることが確認された。 また、 力かる有機塩基の触媒作用を利用する加水処理で は、 ォキサゾロン環構造中の環状エステルへの加水反応に加えて、 o—ァシル化 保護されているヒドロキシ基におけるエステルへの加水反応、 すなわち、 ヒドロ キシ基における脱保護も進行すること、 一方、 より安定な N—ァシル化保護にお ける脱保護の達成には至らないことも見出された。 すなわち、 かかる加水処理を 施すと、 元のペプチド鎖に対して、 その N末端のアミノ基、 ならびに、 ペプチド 鎖に含有される可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基には、 N—ァシル化保護 がなされたものとなる。 また、 C末端アミノ酸の分解反応で生成した反応産物の ペプチド鎖も、 同じく、 その N末端のアミノ基、 ならびに、 該ペプチド鎖に含有 される可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基には、 N—ァシル化保護がなされ たものとなる。
以上の知見に加えて、 本発明者らは、 前述するその N末端のアミノ基、 ならび に、 ペプチド鎖に含有される可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基には、 N— ァシル化保護がなされた、 長いべプチド鎖に対して、 トリプシン消化処理を施す と、 リシンまたアルギニン残基の C末端側べプチド結合を開裂するトリブシンの 切断部位特異性のうち、 リ〕ンン残基側鎖のァミノ基には、 N—ァシル化保護がな されており、 その N—ァシルイ匕リシン残基では、 ペプチド鎖の消化は起こらず、 得られるペプチド断片は、 アルギニン残基における消化に因るものとなることを 確認した。 より具体的には、 力かるトリプシン消化処理を施すと、 元のペプチド 鎖と、 C末端ァミノ酸の分解反応で生成した一連の反応産物のぺプチド鎖との混 合物から、 共通するペプチド断片として、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれ る部分アミノ酸配列を有するペプチド断片、 ならびに、 C末端側の部分アミノ酸 配列に由来し、 アルギニン残基を含んでいない、 元のペプチド鎖と一連の反応産 物のペプチド鎖に由来する一群の C末端側ペプチド断片が得られることになる。 その際、 ぺプチド鎖中に含有されるアルギニン残基の平均的な存在頻度を考慮す ると、 例えば、 200アミノ酸程度の長いペプチド鎖中には、 少なくとも、 4個 以上、 多くとも、 10個程度のアルギニン残基が存在するのみであり、 前記の C 末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片は、 4〜10個程 度、 また、 元のペプチド鎖に由来する C末端側ペプチド断片のアミノ酸数は、 少 なくとも 15アミノ酸以上、 50アミノ酸以下の範囲となる確度が相当に高いこ とに、 本発明者らは想到した。
その上、 本発明者らは、 種々のペプチド断片について、 質量分析法、 例えば、 MA LD I -TO F -MS (Ma t r i x As s i s t e d La s e r D e s o r p t i o n I o n i z a t i o n l i me— o f — F l i g h t Ma s s S p e c t r ome t r y ;マトリクス支援レーザー脱離ィオン化飛 行時間型質量分析） 法を利用し、 該イオン化処理で生じる陽イオン種による分子 量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行った際、 C末端にカチォニッ クなアミノ酸残基、 特には、 アルギニン残基が存在する場合、 陽イオン種による 分子鼍測定におけるピーク強度は、 陰イオン種による分子量測定における対応ピ ーク強度よりも、 有意にその相対強度は大きく、 一方、 C末端にカチォニックな アミノ酸残基が存在していない場合、 陰イオン種による分子量測定におけるピー ク強度は、 陽イオン種による分子量測定における対応ピーク強度よりも、 有意に その相対強度は大きくなるという、 一般的傾向が明確に存在することを、 実験的 に再検証した。さらには、この実験的に再検証を行った一般的傾向を利用すると、
MA L D I — T O F—M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる陽イオン種によ る分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行った際、 前記の C末端 にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片と、 C末端側の部分ァ ミノ酸配列に由来し、 アルギニン残基を含んでいない、.元のペプチド鎖と一連の 反応産物のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側べプチド断片とを、 合理的に弁 別することが可能であることを確認した。 すなわち、 トリプシン消化で得られる C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片は、 単一なピー クとして、 陽イオン種による分子量測定において、 大きな相対強度で観測され、 同時に、 陰イオン種による分子量測定において、 かかる共通するペプチド断片に 対応するピークの強度は相対的に弱いものの、 双方の測定結果を対比することで、 容易に特定できるため、 逆に、 陰イオン種による分子量測定において、 大きな相 対強度で観測されるピークのうち、 C末端側の部分アミノ酸配列に由来し、 アル ギニン残基を含んでいない、 元のぺプチド鎖と一連の反応産物のぺプチド鎖に由 来する一群の C末端側ペプチド断片は、 一連のピークを示すものとして、 容易に 特定することが可能となる。
本発明者らは、 これらの一連の知見に基づき、
( 1 ) 対象とするペプチド鎖に対して、 N—ァシル化、 O—ァシル化による保 護を施し、
( 2 ) 対象とするペプチド鎖の存在状態に応じて、 適正な選択された穏和な反 応条件によって、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応を行い、
( 3 ) 前記分解反応後、 穏和な条件で、 ォキサゾロン環構造中の環状エステル への加水反応、 ならびに、 O—ァシル化による保護の脱保護反応を行い、
( 4 ) N—ァシルイ匕保護は維持されている、 元のペプチド鎖ならびに、 C末端 ァミノ酸の選択的な分解反応で得られる一連の反応産物のぺプチド鎖を含む混 合物に対して、 トリプシン消化処理を施して、 C末端にアルギユン残基が一つ含 まれる、 それらに共通するペプチド断片、 ならびに、 C末端側の部分アミノ酸配 列に由来し、 アルギニン残基を含んでいない、 元のペプチド鎖と一連の反応産物 のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド断片を調製し、
( 5 ) これらペプチド断片の混合物を、 質量分析法、 特には、 MA L D I— T O F -M S法を利用し、 該ィオン化処理で生じる陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行った上で、 双方の測定結果を対比する ことによって、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 該共通するペプチド断 片と、 アルギニン残基を含んでいない、 元のペプチド鎖と一連の反応産物のぺプ チド鎖に由来する一群の C末端側べプチド断片との弁別を行い、
( 6 ) 上記の手法で弁別される、 元のペプチド鎖と一連の反応産物のペプチド 鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド断片の分子量差に基づき、 長いべプチド鎖 の C末端アミノ酸配列を特定する、
力かる一連の工程を採用することで、 種々のタンパク質などを構成する、 長い ぺプチド鎖についても、 その C末端ァミノ酸配列をより簡便に解析することが可 能となることを見出し、また、その有用性を検証し、本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 上記する技術的な思想上の共通性を有するものの、 対象 とするぺプチド鎖の存在状態に由来して、 具体的な形態に相違が生じている複数 の形態を有しており、 例えば、 解析対象とするペプチドが、 予め単離された乾燥 試料である場合に適用する第一の形態、 ならびに、 解析対象とするペプチドが、 予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の試料 である場合に適用する第二の形態を有している。
本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法は、 角军析対象とするペプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法であって、 対象とするぺプチドより、 化学的手段により C末端アミノ酸を逐次的に分解し て得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法により 分析し、 力かる C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程と、 測定された一連の分子量減少量に基づき、逐次的分解された一連のアミノ酸を 特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを具え、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、 対象とする前記ペプチドの乾燥試料に対して、 乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °C の範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にアル力ン酸を少量添加してなる混合物より供給される、 蒸 気状のアル力ン酸無水物とアル力ン酸とを作用させ、
該ぺプチド N末端のァミノ基ならびに、該ぺプチドに含有されている可能性の あるリシン残基側鎖のァミノ基に対して、 前記アル力ン酸無水物由来のァシル基 による N—ァシル化を施す、 N—ァシル化保護を施す前処理工程と、
前記 N—ァシル化保護済みの、 対象とするペプチドの乾燥試料に対して、 乾燥 雰囲気下、 1 5 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物より 供給される、 蒸気状のアル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを作用させ、 ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000015_0001
(式中、
R 1は、 ぺプチドの C末端ァミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末 端アミノ酸の分解を行う工程と、
前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程で得られる一連の反応生成物を 含む混合物に対して、
残余する前記アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを乾燥状態にお いて除去する後処理を施し、
次いで、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液 を利用し、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物と水分子 を供給して、
前記塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 前記反応生成物べプチドに水分子 を作用させ、
前記の加水処理を施した後、 かかる一連の反応生成物を含む混合物に残余する、 前記塩基性の窒素含有有機化合物と水分子を除去、 乾燥する再乾燥後処理を行う ことからなる加水処理の工程とを、 少なくとも含んでなり、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再乾燥後処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、 緩衝溶液中において、 トリプシンを作用させ、 該ペプチド鎖の N末端のァミノ 基ならびに、 該ぺプチド鎖に含有されている可能性のあるリシン残基側鎖のアミ ノ基に対する上記 N—ァシル化保護が保持されている、 該ぺプチド鎖のトリプシ ン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断によるべプチド断片化を行い、
脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化処理済みべ プチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混 合物について、 MA L D I — T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる 陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行い、 前記陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定にお いて測定される、 対応するイオン種において、
前記トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギェン残基を有するぺプチ ド断片のピークは、
陽イオン種による分子量測定における強度は、 陰ィオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
前記トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端のぺ プチド断片ならびに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生 成物に由来する C末端のぺプチド断片のピークは、
陰ィオン種による分子量測定における強度は、 陽ィオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連の ピークに基づき、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する手法 を採用することを特徴とするぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法である。 この本発明の第一の形態にかかる解析方法では、 .
前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物 に含まれるアルカン酸無水物として、 炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型酸無水 物を用いることが好ましい。 その際、 前記炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型酸 無水物として、 炭素数 2〜4の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることが より好ましい。 例えば、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量 添加してなる混合物に含まれるアルカン酸無水物として、 無水酢酸を用いること がより好ましい。
一方、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混 合物に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該パーフルォロアルカン酸の 示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用いるこ とが好ましい。 その際、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量 添加してなる混合物に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4の パーフルォロアルカン酸を用いることがより好ましい。 例えば、 前記炭素数 2〜 4のパーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4の直鎖パーフルォロアルカン 酸を用いることがより好ましい。
さらには、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してな る混合物中における、 パーフルォロアルカン酸の含有比率は、 アルカン酸無水物 とパーフルォロアルカン酸との合計体積に対して、 1〜2 0体積％の範囲に選択 することが望ましい。 また、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を 少量添加してなる混合物を利用する処理に際して、 前記乾燥雰囲気は、 水分に加 えて、 酸素も除去された状態であることが一層好ましい。 例えば、 前記乾燥雰囲 気は、 気密容器内において、 その内部の大気を真空排気することで、 達成されて いることが好適である。 なお、 前記アルカン酸無水物にパーフルォロアルカン酸 を少量添加してなる混合物を利用する処理に際して、 その温度は、 1 5 °C〜5 0 °Cの範囲に選択される温度とすることがより望ましい。 —方、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 解析対象とするぺプチドの C末端アミノ酸配列を解析する方法であって、 対象とするぺプチドより、 化学的手段により C末端ァミノ酸を逐次的に分解し て得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法によ り分析し、 かかる C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程 と、
測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のアミノ酸を 特定し、 C末端より配列させて、 C末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを具え、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の対 象とするぺプチド試料に対して、
前記ゲル担体中に含浸される水溶媒を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 か つ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去するこ とにより、 該ゲル担体の脱水処理を行う工程と、
前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプチ ド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶 媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水物溶 液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺプチド 試料にアルカン酸無水物を作用させ、 対象とするぺプチドの N末端のァミノ基な らびに、 該ぺプチド中に含有される可能性のあるリシン残基側鎖上のアミノ基に、 予め、 前記アルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するァシル基による N —ァシル化保護を施し、
次いで、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記アルカン酸無水物、 な らぴに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒 を用いて、 希釈除去することにより、 N—ァシル化反応の停止と反応試薬の除去 を行う前処理工程と、
前記 N—ァシル化保護の前処理を施した後、該ゲル担体上に担持された状態の 対象とするペプチド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度にお いて、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン '["生溶 媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で 溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬することによ り、担持された状態の対象とするぺプチド試料にアルカン酸無水物とパーフルォ ロアルカン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000019_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するァミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末 端アミノ酸の逐次的分解を行い、
前記 C末端アミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、該ゲル状物質の 溶解を引き起こさず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶 媒を用いて、 希釈除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去を行う 工程と、
さらに、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生 成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、
塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合物 の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 次いで、 前記ゲル担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起 こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すこと力 らなる、 付加的な加 水処理と再脱水処理の工程とを有し、
前記 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再脱水処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態で、緩衝溶液中に溶解するトリプシンを作用さ せ、 該ペプチド鎖の N末端のァミノ基ならびに、 該ペプチド鎖に含有されている 可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基に対する上記 N—ァシルイヒ保護が保持 されている、 該ぺプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプ チド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側べプチド結合の選択的な切断によ るペプチド断片化を行って、
かかるゲル担体上から該ぺプチド断片の遊離と、 前記緩衝溶液中への溶出を行 レ、、 その後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化 処理済みペプチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混 合物について、 MA L D I— T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる 陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行い、 前記陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定にお いて測定される、 対応するイオ 種において、
前記トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチ ド断片のピークは、
陽イオン種による分子量測定における強度は、 陰イオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
前記トリプシン消化処理で生成する、 元となるペプチドに由来する C末端のぺ プチド断片ならびに、 C末端ァミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生 成物に由来する C末端のぺプチド断片のピークは、
陰イオン種による分子量測定における強度は、 陽イオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、 該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連の ピークに基づき、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する手法 を採用することを特徴とするぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法である。 この本発明の第二の形態にかかる解析方法では、
前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比率で 溶解してなる混合溶液に含まれるアルカン酸無水物として、 炭素数 2〜4のアル カン酸の対称型酸無水物を用いることが好ましい。 その際、 前記炭素数 2〜4の アル力ン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4の直鎖アル力ン酸の対称型酸 無水物を用いることがより好ましい。 例えば、 前記パーフルォロアルカン酸をァ ルカン酸無水物に対して少量となる比率で溶解してなる混合溶液に含まれるァ ルカン酸無水物として、 無水酢酸を用いることがより好ましい。
—方、 前記パーフルォロアルカン酸をアル力ン酸無水物に対して少量となる比 率で溶解してなる混合溶液に含まれるパーフルォロアルカン酸として、 当該パー フルォロアルカン酸の示す p K aは、 0 . 3〜2 . 5の範囲であるパーフルォロ アルカン酸を用いることが好ましい。 また、 前記パーフルォロアルカン酸をアル 力ン酸無水物に対して少量となる比率で溶解してなる混合溶液に含まれるパー フルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸を用いるこ とが好ましい。 その際、 前記炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸として、 炭 素数 2〜4の直鎖パーフルォロアルカン酸を用いることがより好ましい。
なお、 前記パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる比 率で溶解してなる混合溶液中における、 アル力ン酸無水物とパーフルォロアル力 ン酸との含有比率は、 アルカン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロアルカン 酸 1〜 2 0容の範囲に選択することがより好ましい。
加えて、 本発明かかるペプチドの C末端アミノ酸配列解析方法、 第一の形態と 第二の形態のいずれにおいても共通する、 上述する （5 ) の過程：ペプチド断片 の混合物について、 MA L D I— T O F— M S法によって、 該イオン化処理で生 じる陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行つ た上で、 双方の測定結果を対比することによって、 C末端にアルギニン残基が一 つ含まれる、 該共通するペプチド断片と、 アルギニン残基を含んでいない、 元の ぺプチド鎖と一連の反応産物のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチド 断片との弁別を行う過程、 ならびに、 それに続く （6 ) の過程：弁別された、 元 のぺプチド鎖と一連の反応産物のぺプチド鎖に由来する一群の C末端側ぺプチ ド断片の分子量差に基づき、 長いべプチド鎖の C末端ァミノ酸配列を特定する過 程、 において、 測定された MA L D I—T O F— M S法による陽イオン種による 分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定スぺクトルの解析処理は、 共 通した手法を選択できることを、 本発明者らは見出した。
より具体的には、 測定されるペプチド断片の混合物中には、 トリプシン消化処 理で生成するぺプチド断片に加えて、 トリプシンの自己消化に起因するトリプシ ンに由来するき己消化ペプチド断片も含まれており、 このトリプシンのペプチド 断片に由来するイオン種ピークを除去した後、 残るイオン種ピーク中、 少なくと も、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 該共通するペプチド断片と、 アル ギニン残基を含んでいない、 元のペプチド鎖の C末端側ペプチド断片とは、 明確 なピークとして識別可能であり、
さらには、 これら明確に識別可能なイオン種ピークに関して、 C末端アミノ酸の 逐次的分解に伴う、 一連の反応産物のペプチド鎖に由来するイオン種ピークの有 無を判定することで、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 該共通するぺプ チド断片と、 アルギニン残基を含んでいない、 元のペプチド鎖と一連の反応産物 のぺプチド鎖に由来する一群の c末端側ぺプチド断片との弁別を、 高い合理性と 信頼性で実施できることを見出した。
その際、 対象とするペプチド鎖は、 上述する （1 ) の N—ァシル化、 O—ァシ ル化による保護過程、 （2 ) の C末端アミノ酸の選択的な分解反応過程、 （3 ) の ォキサゾロン環構造中の環状エステルへの加水処理、 ならびに、 O—ァシル化に よる保護の脱保護過程を経るため、 例えば、 余分にァシル基の置換がなされたも の、不要な脱水的反応が生じているものなど、同じペプチド鎖は保持するものの、 付随的な修飾反応を受けた副次的なペプチド断片に由来するイオン種ピークが、 本来のペプチド断片に由来するイオン種ピークに随伴することが多く、 逆に、 かかる随伴するイオン種ピークの有無、 ならびに、 そのピーク強度の相対 比を参照することで、 本来のペプチド断片に由来するイオン種ピークを高い合理 性と信頼性で特定できることを見出し、 前記の判定基準をも付加した、 本発明の スぺク トルの解析方法を完成させた。
すなわち、 本発明にかかる、 質量分析法、 特には、 MA L D I— T O F— M S 法による陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定ス ぺクトルの解析方法は、
上述する本発明の第一の形態、 または第二の形態にかかるぺプチドの C末端ァ ミノ酸配列解析方法において、 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を 測定する際に利用可能な質量分析法、 特には、 MA L D I— T O F—M S法によ る前記陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定スぺ クトルの解析方法であって、
該スぺク トルの解析作業は、 解析範囲を m/ z値が 4 0 0 0以下に選択して、 (工程 1 ) ペプチド断片化に利用する、 トリプシン消化処理に付随して、 ぺプ チド断片を含む乾燥混合物中に混入する既知の分子量を有するトリプシンの自 己消化に由来するべプチド断片に関して、
陽イオン種による分子量測定結果中の、 m/ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0以上の 範囲において、 トリプシンの自己消化に由来するペプチド断片による陽イオン種 ピークを特定し、
次いで、 陰イオン種による分子量測定結果中の、 mZ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0 以上の範囲において、 トリプシンの自己消化に起因するぺプチド断片による対応 陰イオン種ピークを特定する、 トリプシン由来の内部標準ピークの特定工程、
(工程 2 ) 陽イオン種による分子量測定結果中、 前記特定されるトリプシン由 来の陽イオン種ピークを除外し、 m_ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0以上の範囲にお いて、 最大のピーク強度を有する最大陽イオン種ピークを特定し、 該最大陽ィォ ン種ピークのピーク強度を基準として、 その 1 4 0以上のピーク強度を有する 陽イオン種ピ^ "クを選別し、 第一の陽イオン種ピーク群を形成し、
次いで、 陰イオン種による分子量測定結果中、 前記特定されるトリプシン由来の 陰イオン種ピークを除外し、 mZ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0以上の範囲において、 最大のピーク強度を有する最大陰イオン種ピークを特定し、 該最大陰イオン種ピ ークのピーク強度を基準として、 その 1 Z 4 0以上のピーク強度を有する陰ィォ ン種ピークを選別し、 第一の陰イオン種ピーク群を形成する、 主要なイオン種ピ ークの特定工程、
(工程 3 ) 陰イオン種による分子量測定結果中において、 前記第一の陽イオン 種ピーク群の各ピークに対応する陰イオン種に相当するピークを特定し、 第二の 陰イオン種ピーク群を形成し、
次いで、 陽イオン種による分子量測定結果中において、 前記第一の陰イオン種ピ ーク群の各ピークに対応する陽ィオン種に相当するピークを特定し、 第二の陽ィ オン種ピーク群を形成する、 主要なイオン種ピークに対する対イオン種ピークの 特定工程、
(工程 4 ) 前記第一の陰ィオン種ピーク群と第二の陰ィオン種ピーク群との積 集合を、 第三の陰イオン種ピーク群とし、 同時に、 第一の陰イオン種ピーク群と 第二の陰イオン種ピーク群との和集合を、 第四の陰イオン種ピ一ク群とし、 次いで、 前記第一の陽イオン種ピーク群と第二の陽イオン種ピーク群との積集合 を、 第三の陽イオン種ピーク群とし、 同時に、 第一の陽イオン種ピーク群と第二 の陽イオン種ピーク群との和集合を、 第四の陽イオン種ピーク群とし、
前記第三の陰ィオン種ピーク群の各ピークに対応する各陽ィオン種ピークに 関して、 前記最大陽イオン種ピークのピーク強度を基準とする、 相対ピーク強度 を算定し、 同時に、 前記第三の陰イオン種ピーク群の各ピーク関して、 前記最大 陰イオン種ピークのピーク強度を基準とする、 相対ピーク強度を算定し、 相互に 相対ピーク強度を比較した上で、
前記第三の陰イオン種ピーク群の各ピークに対して、 対応する各陽イオン種ピー クの相対ピーク強度が 3ノ 2以上となる陽イオン種ピークを特定し、 第五の陽ィ オン種ピーク群を形成し、 一方、
対応する各陽イオン種ピークに対して、 前記第三の陰ィオン種ピーク群各ピーク の相対ピーク強度が 3 2以上となる陰イオン種ピークを特定し、 第五の陰ィォ ン種ピーク群を形成する、 有意な対イオン種を有する主要なイオン種ピークの特 定工程、
(工程 5 ) 前記第四の陽ィオン種ピーク群の各陽ィオン種ピークの z値に 基づき、 隣接ピーク間の m/ z値差を算定し、 同時に、 前記第四の陰ィオン種ピーク群の各陰ィオン種ピークの m/ z値に基づ き、 隣接ピーク間の m/z値差を算定し、
更に、 第五の陽イオン種ピーク群の各ピークに関して、
(5 a— 1) 該ピーク m/z値に対して、 水分子の欠失に相当する分子量 18小 さい m/z値を有する陽イオン種ピーク力 該第五の陽イオン種ピーク群中に存 在するか、
(5 a— 2) 該ピーク mZz値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰に相当する分子量大きな mZz値を有する陽イオン種ピ ークが、 該第五の陽イオン種ピーク群中に存在するか、
(5 a— 3) 該ピーク m/z値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰ならびに水分子の欠失に相当する分子量 18の減少の組 み合わせに相当する分子量の大きな m/z値を有する陽イオン種ピーク力 該第 五の陽イオン種ピーク群中に存在するか、
前記 （5 a— 1) 〜 （5 a— 3) のいずれかの要件を満足する陽イオン種ピーク を特定し、 第六の陽イオン種ピーク群を形成し、
一方、 第五の陰イオン種ピーク群の各ピークに関して、
(5 b— 1) 該ピーク mZz値に対して、 水分子の欠失に相当する分子量 18小 さい mZ z値を有する陰ィオン種ピークが、 該第五の陰ィオン種ピーク群中に存 在するか、
(5 b— 2) 該ピーク m/z値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰に相当する分子量大きな mZ z値を有する陰ィオン種ピ ークが、 該第五の陰イオン種ピーク群中に存在するか、
(5 b— 3) 該ピーク mZz値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰ならびに水分子の欠失に相当する分子量 18の減少の組 み合わせに相当する分子量の大きな m/z値を有する陰イオン種ピークが、 該第 五の陰イオン種ピーク群中に存在するか、
前記 （5 b— 1) 〜 （5 b— 3) のいずれかの要件を満足する陰イオン種ピーク を特定し、 第六の陰イオン種ピーク群を形成し、
特定された第六の陽イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするぺプチドに由来す るペプチド断片に起因する陽イオン種ピークの群であり、 同時に、 特定された第 六の陰イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするペプチドに由来するペプチド断 片に起因する陰イオン種ピークの群であると判定する、 解析対象とするペプチド に由来するペプチド断片に起因する主要なイオン種ピークの判定工程、
(工程 6 ) 前記第六の陽ィオン種ピーク群の各ピークに関して、
該ピークに対して、 前記 （5 a— 1 ) 〜 （5 a— 3 ) のいずれかの要件を充足す る付随陽イオン種ピークの相対ピーク強度との対比を行い、 該ピークの相対ピー ク強度が優っているピークを選別し、
さらに、 選別されたピークの群において、 該群に含まれる他のピークに対して、 相対ピーク強度が劣っている、 前記 （5 a— l ) 〜 （5 a— 3 ) のいずれかの要 件を充足する付随陽ィオン種ピークとならないピークを選別し、 第七の陽ィオン 種ピーク群を形成し、
一方、 前記第六の陰イオン種ピーク群の各ピークに関して、
該ピークに対して、 前記 （5 b— 1 ) 〜 （5 b— 3 ) のいずれかの要件を充足す る付随陰イオン種ピークの相対ピーク強度との対比を行い、 該ピークの相対ピー ク強度が優っているピークを選別し、
さらに、 選別されたピークの群において、 該群に含まれる他のピークに対して、 相対ピーク強度が劣っている、 前記 （5 b— 1 ) 〜 （5 b— 3 ) のいずれかの要 件を充足する付随陰イオン種ピークとならないピークを選別し、 第七の陰イオン 種ピーク群を形成し、
特定された第七の陽イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするぺプチドに由来す るペプチド断片自体の陽イオン種ピークの群であり、 同時に、 特定された第七の 陰イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするぺプチドに由来するべプチド断片自 体の陰イオン種ピークの群であると判定する、解析対象とするペプチドに由来す るペプチド断片自体のイオン種ピークの判定工程、
(工程 7 ) 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する、 前記第七の陽イオン種ピ ーク群の各陽イオン種ピークに対応する陰イオン種ピークを選別し、 第八の陰ィ オン種ピーク群を形成し、
該第八の陰ィオン種ピーク群に含まれる各陰ィオン種ピークに関して、該陰ィォ ン種ピークの m/ z値を基準として、 上記工程 5で算出される隣接ピーク間の m 値差に基づき、 ピーク間の m/ z値差が 2 0 0より小さな範囲に見出される、 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する陰イオン種ピークの群を選別し、 そのピーク間の m/ z値差が、天然の鎖式 α—アミノ酸残基：一ΝΗ— C H (R) — C O— (Rは、 該アミノ酸残基の側鎖を示す） あるいは、 該側鎖上のヒドロキ シ基、 アミノ基に対して、 上記 N—ァシル化保護に利用されるァシル基が置換し てなるァシル化保護ひ一アミノ酸残基の式量に相当するものが存在しないこと を確認し、
該第八の陰イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするぺプチドに由来するぺプチ ド断片であって、 トリプシン消化処理で生成する、 そのペプチド鎖 C末端にアル ギニンを有するペプチド断片の陰イオン種ピーク群と判定する、 トリプシン消化 で生成するべプチド鎖 C末端にアルギニンを有するぺプチド断片の特定工程、
(工程 8 ) 第七の陰ィオン種ピーク群に含まれる各陰ィオン種ピークに関して、 該陰イオン種ピークの mZ z値を基準として、 上記工程 5で算出される隣接ピー ク間の mZ z値差に基づき、 ピーク間の m/ z値差が 2 0 0より小さな範囲に見 出される、 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する陰イオン種ピークの群を選別 し、
そのピーク間の mZ z値差が、天然の鎖式 (¾—アミノ酸残基：一 NH— C H (R) — C O— （Rは、 該ァミノ酸残基の側鎖を示す） あるいは、 該側鎖上のヒドロキ シ基、 アミノ基に対して、 上記 N—ァシルイヒ保護に利用されるァシル基が置換し てなるァシル化保護 α—アミノ酸残基の式量に相当するものが存在している、 第 七の陰イオン種ピーク群に含まれる陰イオン種を特定し、 第九の陰イオン種ピー ク群を形成し、
該第九の陰イオン種ピーク群の各陰イオン種ピークと、 前記特定操作において、 ピーク間の m " z値差が、 前記ァミノ酸残基の式量に相当することが確認された 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する陰イオン種ピークとの和集合を、 第十の 陰イオン種ピーク群とし、
該第十の陰イオン種ピーク群中、 πιΖ ζ値が最大の陰イオン種ピークを選択し、 該 mZ z値が最大の陰イオン種ピークが示す mZ z値を基準として、 各ピーク間 の niZ z値差が上記ァミノ酸残基の式量に相当する mZ z値差を示す、 一連の陰 ィオン種ピークを該第十の陰ィオン種ピーク群中より順次特定し、 前記トリプシ ン消化処理で生成する、 元となるペプチドに由来する C末端のペプチド断片なら ぴに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物に由来する C末端のペプチド断片の陰イオン種ピーク群と判定する、 トリプシン消化で生成 する解析対象べプチドと一連の反応生成物の C末端側べプチド断片群の特定ェ 程、
(工程 9 ) 前記工程 8において、 特定される前記トリプシン消化処理で生成す る、 元となるペプチドに由来する C末端のペプチド断片ならびに、 C末端アミノ 酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物に由来する C末端のぺプチド 断片の陰イオン種ピーク群に基づき、順次特定されている陰イオン種ピークの各 ピーク間の mZ z値差に相当する、 上記アミノ酸残基の式量に従って、 C末端よ り逐次的に分解されている部分アミノ酸配列を特定する、 C末端アミノ酸配列の 特定工程、
上記 （工程 1 ) 〜 （工程 9 ) を有することを特徴とする、 MA L D I— T O F— M S法による陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測 定スぺク トルの解析方法である。
その際、 前記 （工程 1 ) のトリプシン由来の内部標準ピークの特定工程後、 陽イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの自己消 化に由来するペプチド断片による陽イオン種ピークについて、 該ピーク mZ z値 の決定と、 その見かけの半値全幅を算定し、
前記算定される見かけの半値全幅を基準幅として、 該基準幅の 1 / 4以下の見か け半値全幅を示すノィズ性ピークを除去する処理を、 該陽ィオン種による分子量 測定スぺク トルに施し、
次いで、 ノイズ除去処理済みスペク トルに対して、 トリプシンの自己消化に由来 するペプチド断片による陽ィォン種ピークにおける、 前記決定されたピーク mZ z値と、 前記見かけの半値全幅の算定に用いた二つの mZ z値に基づき、 該ピ ク形状の非対称性と、 積分ピーク強度とを保持可能なスムージング処理を施し、 一方、 陰イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの 自己消化に由来するペプチド断片による陰イオン種ピークにおいて、該ピーク m / z値の決定と、 その半値全幅を算定し、
前記算定される見かけの半値全幅を基準幅として、 該基準幅の 1 Z 4以下の見か け半値全幅を示すノイズ性ピークを除去する処理を、 該陰イオン種による分子量. 測定スぺク トルに施し、
次いで、 ノイズ除去処理済みスペク トルに対して、 トリプシンの自己消化に由来 するぺプチド断片による陽イオン種ピークにおける、 前記決定されたピーク m/ z値と、 前記見かけの半値全幅の算定に用いた二つの m/ z値に基づき、 該ピー ク形状の非対称性と、 積分ピーク強度とを保持可能なスムージング処理を施す、 ノイズ除去' スムージング処理工程を設けることが好ましい。
また、 前記 （工程 1 ) のトリプシン由来の内部標準ピークの特定工程後、 陽イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの自己消 化に由来するペプチド断片による陽イオン種ピークについて、 該ペプチド断片の 既知の分子量に基づき該陽イオン種の m/ z値を計算し、 スぺクトル上のピーク m/ z値と比較し、 その差異に基づき、 陽イオン種による分子量測定スペクトル における m/ z値に対する系統的誤差の捕正を行い、
一方、 陰イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの 自己消化に由来するペプチド断片による陰イオン種ピークについて、 該ペプチド 断片の既知の分子量に基づき該陰イオン種の m/ z値を計算し、 スぺクトル上の ピーク mZ z値と比較し、 その差異に基づき、 陰イオン種による分子量測定スぺ クトルにおける mZ z値に対する系統的誤差の補正を行う、
ピーク mZ z値に対する系統的な誤差補正の工程を設けることが好ましい。
加えて、 前記 （工程 9 ) の C末端アミノ酸配列の特定工程において、
特定された C末端より逐次的に分解されている部分アミノ酸配列が、 その C末端 アミノ酸がアルギニンである場合、
該部分アミノ酸配列の特定における基準とする、 第十の陰イオン種ピーク群中の m/ z値が最大の陰ィオン種ピークについて、 陽ィオン種による分子量測定結果 中における、 その対応陽イオン種ピークに対して、
該陽イオン種ピークの m/ z値を基準として、 上記工程 5で算出される隣接ピー ク間の m/ z値差に基づき、 該陽ィオン種ピークの mZ z値よりも m/ z値が大 きく、 m/ z値差が 2 0 0より小さな範囲に見出される、 第四の陽イオン種ピー ク群中に存在する陽イオン種ピークの群を選別し、
そのピーク間の m_ z値差が、天然の鎖式 α—アミノ酸残基：一 NH— C H (R) 一 C O— （Rは、 該アミノ酸残基の側鎖を示す） あるいは、 該側鎖上のヒドロキ シ基、 アミノ基に対して、 上記 N—ァシルイヒ保護に利用されるァシル基が置換し てなるァシル化保護 α—アミノ酸残基の式量に相当するものが存在しないこと を確認する、 ぺプチド鎖 C末端にアルギニンを有するぺプチド断片であることの 再確認工程を更に設けることがより好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドから C末端ァミノ酸を逐次的に 分解する処理における、 ぺプチド乾燥試料を対象とする際の詳細操作手順の一例 を例示する工程フローを示す図である。
図 2は、 本発明の第二の形態にかかるペプチドから C末端アミノ酸を逐次的に 分解する処理における、 ゲル上に担持されたぺプチド試料を対象とする際の詳細 操作手順の一例を例示する工程フローを示す図である。
図 3は、 本発明の第一の形態にかかるペプチドから C末端アミノ酸を逐次的に 分解する処理方法に従って、 ゥマ ' ミオグロビンの乾燥試料について、 そのグロ ビン ·ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸を逐次的に分解して得られる反応産物混合物 をトリプシン消化して得られるペプチド断片を、 MA L D I— T O F— M S装置 において、 陽イオン種検出モードで測定した質量分析スぺクトルの一例を示す図 である。
図 4は、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドから C末端ァミノ酸を逐次的に 分解する処理方法に従って、 ゥマ ' ミオグロビンの乾燥試料について、 そのグロ ビン ·ぺプチド鎖の C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる反応産物混合物 をトリプシン消化して得られるペプチド断片を、 MA L D I— T O F— M S装置 において、 陰イオン種検出モードで測定した質量分析スぺクトルの一例を示す図 、あ Q0 図 5は、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドから C末端ァミノ酸を逐次的に 分解する処理方法に従って、 ゲル上に担持されたゥマ · ミオグロビン試料につい て、 そのグロビン ·ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸を逐次的に分解して得られる反 応産物混合物をトリプシン消化して得られるぺプチド断片を、 MA L D I— T O F— M S装置において、 陽イオン種検出モードで測定した質量分析スペク トルの 一例を示す図である。
図 6は、 本発明の第二の形態にかかるペプチドから C末端アミノ酸を逐次的に 分解する処理方法に従って、 ゲル上に担持されたゥマ · ミオグロビン試料につい て、 そのグロビン ·ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸を逐次的に分解して得られる反 応産物混合物をトリプシン消化して得られるペプチド断片を、 MA L D I— T O F— M S装置において、 陰イオン種検出モードで測定した質量分析スぺクトルの 一例を示す図である。
図 7は、 ゥマ · ミォグロビンを構成する、 グロビン ·ぺプチド鎖のァミノ酸配 列中に含まれる、 トリプシンによる、 アルギニン残基の C末側ペプチド結合での 切断部位、 ならびに、 N—ァセチル化保護を施した際、 その C末側ペプチド結合 での切断が防止されるリシン残基を示す。
図 8は、 参考例に記載する、 C末端にアルギニン残基を有する単離乾燥べプチ ド、 N—ァセチル化 G 1 u 1— F i b r i n oペプチド断片に対して、 本発明に 採用される C末端ァミノ酸を逐次的に分解する処理条件に従って、該ぺプチド鎖 の C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる反応産物混合物を、 MA L D I— T O F— M S装置において、 陰イオン種検出モード （下） と陽イオン種検出モー ド （上） で測定した質量分析スぺク トルの対比を示す図である。
図 9は、 トリプシンの自己消化によって生成する、 断片に相当する陽イオン種 の分子量 （M+H) の一覧を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明をより詳しく説明する。
本発明にかかるペプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 基本的【こは、 解析 対象のぺプチドに対して、 そのぺプチドの C末端ァミノ酸を逐次的に分解除去し て、 ペプチドが短縮された一連の反応産物を作製し、 さらに、 この一連の反応産 物と、 元となるぺプチドとをトリプシン消化して得られるぺプチド断片のうち、 該一連の反応産物に由来する C末端側べプチド断片の分子量と、 元となるぺプチ ドに由来する C末端側ペプチド断片の分子量との差異に基づき、 除去されたアミ ノ酸を特定する手法を採用している。 より具体的には、 かかるトリプシン消化し て得られる C末端側べプチド断片は、 そのトリプシンに特異的な切断部位で切断 されており、 さらには、 この一連の反応産物に由来する C末端側ペプチド断片の 分子量と、 元となるぺプチドに由来する C末端側ぺプチド断片の分子量の測定手 段として、 MA L D I— T O F—M S装置を利用するが、 そのイオン化過程は、 ペプチド断片にプロトン （H+) が付加された陽イオン種と、 ペプチド断片から プロトン （H+) が離脱された陰イオン種とをそれぞれ測定することを可能とし ている。 その際、 C末端側ペプチド断片を構成するアミノ酸残基中にはアルギニ ン残基ゃリシン残基が含まれていないため、 かかるアルギニン残基やリシン残基 に由来する陽イオン種の安定化機構はなく、 陽イオン種を測定した結果と、 陰ィ オン種を測定した結果とを比較した際、 アミノ酸残基中にはァ ギニン残基ゃリ シン残基が含まれている、 トリプシン消化による他のペプチド断片とは、 その相 対強度は、 異なる挙動を示す現象を、 MA L D I— T O F— M S装置によって測 定される複数種のピーク中より、 一連の C末端側ペプチド断片に起因するピーク の特定，弁別に利用している。
すなわち、 本発明にかかる解析方法における最大の特徴は、
ぺプチドの C末端アミノ酸を逐次的に分解除去する工程において、 そのぺプチド 鎖の途中でのぺプチド結合分断という副次的反応を効果的に回避することで、 前 記トリプシン消化処理後に得られるぺプチド断片の混合物中に、 元のぺプチドを トリプシン消化した際に生じる、 共通的な N末側のペプチド断片、 ならびに目的 とする一連の反応産物に由来する C末端側ぺプチド斬片以外に、 副次的なぺプチ ド結合分断反応に由来するぺプチド断片が混入することを抑制する点にある。加 えて、 かかるぺプチド鎖の途中でのぺプチド結合分断という副次的反応を回避す る上で、 予め対象とするペプチド鎖に対して、 N—アシノレ化、 O—ァシル化によ る保護を施して、 この保護をも利用し、 さらには、 最終的なトリプシン消化の処 理に先立ち、 O—ァシルイ匕による保護の脱保護は行うものの、 リシン残基上の N 一ァシル化保護を保持する状態とすることで、 トリプシン消化による断片化が、 アルギニン残基の C末側ぺプチド結合でのみ生じるようにし、 不必要に細分^ f匕さ れたぺプチド断片の生成を回避しつつ、 目的とする一連の反応産物に由来する C 末端側ペプチド断片は、 MA L D I—T O F— M S測定に適合する分子量範囲内 とできる点も、 本発明にかかる解析方法における大きな特徴である。
その際、 本発明に利用される、 対象とするペプチドの C末端アミノ酸を逐次的 に分解除去する反応では、 水分を除去した環境とした上で、 比較的に低い加熱条 件において、
反応試薬として、 アルカン酸無水物に、 少量のパーフルォロアルカン酸を組み 合わせたものを利用して、 高いプロトン供与能を示すパーフルォロアルカン酸の 触媒作用によって、 アルカン酸無水物をべプチド鎖 C末端のカルボキシ基の活性 化試薬として作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000033_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するァミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を一旦形成し、該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴 い C末端アミノ酸の分解を行う方法を利用している。
かかる 5—ォキサゾロン環形成の反応は、 全体として見ると、 反応式 （ I ) ：
Figure imgf000034_0001
として表記されるものの、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法で は、
先ず、 下記する反応式 （l a ) :
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000034_0003
で示されるケトーエノール互換異性化の過程を、 少量存在しているパーフルォロ アルカン酸を乾燥したペプチドに対して、 プロトン供与体として機能させること で、 エノーノレ型をとる比率を高めている。
次いで、 ェノール型において、 表出されているヒドロキシ基と C末端カルボキ シ基の間で、 分子内エステル結合を形成し、 5—ォキサゾロン環を完成させる。 その際、 本発明にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法では、 C末端カルボ キシ基の活性化を行う試薬として、 アルカン酸無水物を利用し、 例えば、 下記の 反応式 （l b ) :
Figure imgf000035_0001
で例示されるような、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された c末端カルボ キシ基が反応に関与するものとしている。 その結果、 かかる反応は、 穏和な温度 条件でも進行する。一方、系内には、水分が存在しない環境に維持するとともに、 反応性の相対的に低いアルカン酸無水物を利用するため、 ぺプチド鎖の途中に存 在するぺプチド結合の開裂反応の進行は、 かかる穏和な温度条件では抑制されて いる。 また、 本発明にかかる c末端アミノ酸の選択的な分解方法においては、 一 且形成された 5—ォキサゾロン環から、 例えば、 反応式 （ΙΓ) で表記される反 応：
Figure imgf000035_0002
等の反応を経て、 C末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行し て、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。
なお、 ペプチド鎖中のセリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) 一 CO—）、 ト レオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) では、 その側鎖 上のヒドロキシ基 （一OH) に起因して、 加熱環境下では、 例えば、 セリン残基 (-NH-CH (CH2OH) -CO-) の α位のアミノ基 （一 ΝΗ—) と β位 のヒドロキシ基 （一 ΟΗ) の間で、 Ν， Ο—ァシル転位反応が生じると、 引き続 き、 生成するエステル結合の分解が進行し、 セリン残基の Ν末側でペプチドの切 断が生じるという副反応、 また、条件に依っては、 β位にヒドロキシ基（一ΟΗ) が存在しているトレォニン残基 （一 ΝΗ— CH (CH (CH3) OH) -CO-) においても、 同様の N, O—ァシル転位反応が契機となる反応機構によって、 ト レオニン残基の N末側でぺプチドの切断が生じるという副反応が生じる可能性 がある。 また、 リシン残基（一 NH— CH ((CH2) 3— NH2) -CO-) でも、 その側鎖上のアミノ基（一 NH2) に起因して、加熱環境下では、 リシン残基（一 NH-CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の α位のアミノ基 （一 Ν Η-) と ε位のアミノ基（一 ΝΗ2) の間で、 アミ ド結合の交換反応が生じると、 引き続き、 生成する Ε位のアミド結合の分解が進行し、 リシン残基の Ν末側でぺ プチドの切断が生じるという副反応が懸念される。
本発明においては、 逐次的な C末端アミノ酸の分解反応は、 乾燥状態、 穏和な 温度条件で行われるものの、 前記のセリン残基 （一NH— CH (CH2OH) 一 CO―)、 トレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) — CO— )、 リ シン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) が関与する 副反応をより確実に回避するため、 逐次的な C末端アミノ酸の分解反応に先立ち、 予め、 N—ァシル化、 O—ァシルイヒによる保護を施す前処理工程を設けている。 この N_ァシル化、 O—ァシルイ匕による保護を施す前処理工程は、 本発明にか かる第一の形態では、 対象とするペプチドの乾燥試料に対して、 乾燥雰囲気下、 10°C〜60°Cの範囲に選択される温度において、 アルカン酸無水物にアルカン 酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のアルカン酸無水物とアル カン酸とを作用させることで、 アルカン酸の有するプロトン供与能を利用して、 アルカン酸無水物とアミノ基 （一 NH2)、 ヒドロキシ基 （一 OH) との反応を促 進して、 N—ァシル化、 O—ァシル化を達成している。 その際、 アルカン酸の有 するプロトン供与能は、 パーフルォロアルカン酸の示すプロトン供与能よりも劣 るため、 ぺプチド鎖の C末端における 5—ォキサゾロン環を形成する反応を進行 させるには至らない。
また、 本発明にかかる第二の形態では、 ゲル上に担持された状態のペプチド試 料に対して、 予めゲルの脱水処理を施した後、 この前処理工程において、 30°C 〜 80°Cの範囲に選択される温度において、 該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状 態に維持可能である、 双極性非プロ トン性溶媒中に、 アルカン酸無水物を溶解し てなる溶液を用いて、該ァルカン酸無水物溶液中に該ゲル担体を浸漬することに より、 担持された状態の対象とするぺプチド試料にアル力ン酸無水物を作用させ ることで、 N—ァシル化、 O—ァシルイ匕を達成している。 この双極性非プロトン 性溶媒中での液相反応は、 プロトン供与能を有するアルカン酸の酸触媒作用を利 用しなくとも、 十分に進行する。 また、 力かる液相反応に付随して、 系内で、 ァ ルカン酸の生成がなされ、 その触媒作用も付加され、 徐々に反応の促進がなされ る。 但し、 系内で派生するアルカン酸の有するプロトン供与能は、 パーフルォロ アルカン酸の示すプロトン供与能よりも劣るため、 ペプチド鎖の C末端における 5—才キサゾ口ン環を形成する反応を進行させるには至らない。
加えて、 本発明では、 かかる前処理工程において、 リシン残基 （― NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基 （一ΝΗ2) に加 えて、 ペプチド鎖の Ν末端のァミノ基に対しても、 Ν—アシノレ化が達成できる条 件を選択することで、 例えば、 C末端アミノ酸の逐次的な分解反応において、 そ の C末端カルボキシ基の活性化がなされた際、 誤って、 隣接するペプチド鎖の Ν 末端のァミノ基と反応を起こす事態を予め防止することもできている。 さらには、 後処理工程において、 加水処理を施した際に、 リシン残基 （一 NH— CH (CH 2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基 （一 ΝΗ2) ならびにぺ プチド鎖の Ν末端のアミノ基に対する、 Ν—ァシル化保護は、 脱保護を生じない 加水処理条件を選択する結果、 最終的に、 トリプシン消化処理を施す際、 側鎖上 のァミノ基が Ν—ァシル化保護されているリシン残基の C末側では、 トリプシン による酵素的消化反応は進まず、 トリプシン消化で得られるペプチド断片は、 ァ ルギニン残基の C末側での消化によるものに限定される。
本発明では、 このリシン残基側鎖上のアミノ基に対して、 Ν—ァシルイ匕保護が なされた状態で、 最終的に、 トリプシン消化処理を施す工程を実施することで、 ペプチド鎖が、 アルギニン残基とリシン残基の二種の切断部位で消化され、 不必 要に多くの断片化を受けることを回避し、 同時に、 ペプチド鎖中に適度な頻度で 含有されるアルギニン残基におけるトリプシン消化によって、長いべプチド鎖は 複数のペプチド断片に分割でき、 結果として、 得られる C末端側ペプチド断片の 分子量は、 MALD I—TOF— MS測定に適合する分子量範囲内とできる利点 を積極的に利用している。
加えて、 本発明においては、 トリプシン消化処理後、 脱塩処理し、 ペプチド断 片を回収し、 乾燥した後、 MA L D I—T O F— M S装置を利用して、 トリプシ ン消化処理を施して得られるぺプチド断片の混合物に由来するイオン種の分子 • 量を測定する。 なお、 トリプシン消化処理後、 脱塩処理を行うことで、 回収、 乾 燥されるペプチド断片は、 各種の塩を形成するものではなく、 本来のペプチド部 分単体とされている。 そのイオン化過程では、 各ペプチド断片に対して、 プロト ン （H+) が付加された陽イオン種と、 プロトン （H+) が離脱された陰イオン種 .とが生成でき、 測定モードを選択することにより、 陽イオン種と陰イオン種とを それぞれ個別に測定する。 本発明においては、 トリプシン消化処理で生成するべ プチド断片として、 元のペプチド鎖と、 C末端アミノ酸の逐次的な分解反応で生 成する反応産物とで共通する N末側アミノ酸配列に由来する、 一連のペプチド断 片群では、 その断片 C末端に、 プロトン （H+) 受容能に富むグァニジノ基を持 つアルギェン残基が存在しており、 プロトン （H+) が付カ卩された陽イオン種の 安定化が図られるが、 一方、 C末端側ペプチド断片では、 かかるアルギニン残基 は存在しておらず、 アルギニン残基に因るプロトン （H+) が付加された陽ィォ ン種の安定化は起こらない。 前記する相違点に付随して、 MA L D I— T O F— ' M S装置で測定される、 陽イオン種の質量分析スぺク トル中では、 その断片 C末 端にアルギニン残基を有する、 共通する N末側アミノ酸配列に由来する、 一連の ペプチド断片群に起因するピーク強度が、 相対的に強くなる。 一方、 アルギニン 残基の存在してない C末端側ペプチド断片では、 プロトン （H+) 供与能を示す カルボキシ基 （一 C O OH) がその C末端に存在しており、 MA L D I— T O F 一 M S装置で測定される、 陰イオン種の質量分析スペク トル中において、 かかる C末端側べプチド断片群に起因するピーク強度が、 相対的に強くなる。
本発明では、 脱塩処理を施され、 乾燥されたペプチド断片を、 MA L D I— T O F一 M S装置での測定に供することに伴う、 前記の陽イオン種の質量分析スぺ クトルと陰イオン種の質量分析スぺクトルとを対比した際の、相対的強度の相違 を利用して、 その断片 C末端にアルギニン残基を有する、 共通する N末側ァミノ 酸配列に由来する、 一連のペプチド断片群に^ g因するピークを弁別し、 さらに、 陰イオン種の質量分析スペク トル中において、 元のペプチド鎖と、 C末端アミノ 酸の逐次的な分解反応で生成する反応産物とで共通する N末側ァミノ酸配列に 由来する、 一連の C末端側ペプチド断片群に起因するピークを、 容易に特定する ことができる。
該陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える一連の ピークに基づき、 ς末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定し、 対応 する分子量変化を与えるアミノ酸種類の帰属を行う。 なお、 力かるアルギニン残 基の存在してない c末端側ペプチド断片は、 少なくとも、 トリプシン消化処理に よって、 その Ν末端アミノ酸残基の α位のアミノ基 （一 ΝΗ 2) を有しており、 陽イオン種の質量分析スペク トル上でも、 対応するピークを示すので、 アミノ酸 種類の帰属結果を、 陽イオン種の質量分析スぺク トルで観察される対応するピー クの分子量を利用して、 検証することもできる。
以下に、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法、 ならびに本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法 について、 個々により詳しく説明する。
先ず、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法で は、 上述する本発明を特徴付ける （1 ) 〜 （6 ) の工程中、 （1 ) 〜 （3 ) に相 当する、 対象とするペプチドより、 化学的手段により C末端アミノ酸を逐次的に 分解して得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程では、 予め単離 処理されているペプチドの乾燥試料を対象として、 下記する処理を行う。
C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応工程に先立って、 予め、 該ペプチド Ν 末端のァミノ基ならびに、 該ぺプチドに含有されている可能性のあるリシン残基 側鎖のアミノ基に対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシル基による Ν—ァシ ル化を施す、 Ν—ァシル化保護を施す前処理工程を実施する。 この前処理工程に おいて施される、 リシン残基側鎖のアミノ基に対する Ν—ァシル化保護は、 上述 する最終的に、 トリプシン消化処理を行った際、 リシン残基の C末側ペプチド結 合での切断を防止する目的を有するため、 後述する加水処理において、 リシン残 基側鎖上の Ν—ァシル化保護では、 脱保護が進行しないものの、 同時になされる Ο—ァシル化保護にぉレヽては、 脱保護が十分に進行するァシル基を選択すること が望ましい。 従って、 本発明の第一の形態においては、 ペプチドの乾燥試料に対 して、 気相から蒸気として供給して、 Ν—ァシル化、 ならびに Ο—ァシル化反応 を行うことができる反応試薬として、 求電子的なァシル化剤であるアルカン酸無 水物と、そのプロトン供与能によって、該ァシル化反応の促進を図る触媒として、 アル力ン酸との組み合わせを利用している。
この前処理工程で使用される、 アルカン酸無水物とアルカン酸は、 乾燥雰囲気 下、 一定の分圧比において蒸気として供給して、 ペプチド鎖に作用させるため、 気密状態の反応容器内で、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度に反応容器全 体を加熱、 保温することで、 アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる 混合物から蒸散させる形態とする。 すなわち、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択され る温度で、 所望の分圧を達成できるもの、 具体的には、 炭素数 2〜 4のアルカン 酸、 ならびに、 該炭素数 2〜4のアルカン酸由来の対称型酸無水物を利用するこ とが好ましい。 特には、 炭素数 2〜4の直鎖アルカン酸、 ならびに、 該炭素数 2 〜 4の直鎖アル力ン酸由来の対称型無水物を利用することがより好ましく、.その 際、 対称型の前記アルカン酸無水物は、 少量添加されるアルカン酸に由来する対 称型無水物であることがさらに好ましレ、。 すなわち、 アルカン酸無水物と、 少量 添カ卩されるアルカン酸とを同一種とすると、 かかる N—アルカノィル化、 O—ァ ルカノィルイヒ反応の進行する間に、 仮にァシル基交換反応が生じても、 最終的に 得られる、 N—アルカノィル化、 O—アルカノィルイ匕保護に、 異なるアルカノィ ル基が混在することは無い。 従って、 仮に、 後述する加水処理において、 O—ァ ルカノィル化保護の脱保護が達成されないもの力 残留した場合にも、 脱保護の 達成されたものとの分子量差は、 予め判明しており、 かかる夾雑物に由来するピ ークの同定はより簡単なものとなる。 この N—ァシル化保護を施す前処理工程で は、 通常、 無水酢酸と酢酸の組み合わせを利用することがより望ましい。
具体的には、 かかる N—ァシル化保護を施す前処理反応も、 アルカン酸無水物 とアルカン酸とを蒸気として、 ペプチドの乾燥試料に供給して、 反応を進めるた め、 適正な蒸気圧を得る上では、 その後に実施する前記 C末端アミノ酸を逐次的 に分解する工程で利用する前記アル力ン酸無水物と、 同じアル力ン酸無水物は好 適に利用できる。 加えて、 このアルカン酸無水物は、 乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度では、 ぺプチドの切断等の不要な副次反応を引き起 こすには、 その反応性は十分に低いので、 かかる前処理においては、 共存させる アルカン酸は、 パーフルォロアルカン酸と比較して、 その酸触媒作用は格段に劣 るので、 さらに、 不要な副次反応を引き起こすことなく、 N—ァシル化保護を施 すことが可能となる。
加えて、 対象とする長いアミノ酸配列のペプチド、 例えば、 タンパク質など、 二次構造、 三次構造を構成している場合には、 予め、 デフォールディング処理を 加えて、 該多次構造を示さないペプチド鎖に変換しておくことで、 その N末端の ァミノ基を N—ァシルイ匕保護する条件では、 ぺプチド中に存在する何れのリシン 残基側鎖のァミノ基に対しても、 N—ァシルイ匕保護が同時に進行する。 さらには、 ぺプチド中に存在するセリン残基ならびにトレオニン残基側鎖のヒドロキシ基 においても o—ァシル化反応が進み、 その保護がなされる。 その他、 ペプチド中 に存在するチロシン残基側鎖のフエノール性ヒドロキシ基も、 その反応性は相違 するものの、 部分的に o—ァシル化がなされる。 これらの複数のァシル化保護も なされる前処理工程を設ける結果として、 リシン残基側鎖のァミノ基、 セリン残 基ならびにトレオニン残基側鎖のヒドロキシ基は、 何れも保護修飾を受けたもの となり、 最早不要な副次反応に関与できないものとなる。
なお、 この前処理工程で使用する、 アルカン酸無水物とアルカン酸との組み合 わせは、 不要な副次反応、 例えば、 ペプチドの途中での切断を生じる懸念はほと んどないものであるが、 その反応温度は、 1 0 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温 度、 より好ましくは、 かかる反応温度は、 室温付近、 あるいは、 室温より僅かに 高い範囲内に選択することが好ましく、 より具体的には、 1 5 °C~ 5 0 °Cの範囲 に選択することが好ましい。 また、 前記アル力ン酸無水物にアル力ン酸を少量添 加してなる混合物中における、 アルカン酸の添加比率は、 アルカン酸無水物とァ ルカン酸との合計した体積に対して、 2〜1 0体積％の範囲、 具体的には、 5体 積％に選択することが好ましい。
なお、 この前処理工程における N—ァシル化反応の反応速度は、 利用されるァ ルカン酸無水物とアルカン酸の分圧 （気相濃度） ならびに反応温度に依存するた め、 かかる前処理工程の反応時間は、 主に反応温度に応じて、 適宜選択すること が望ましい。 例えば、 反応温度を 5 0 °Cに選択する際には、 反応時間を 1時間以 内、 例えば、 3 0分間に選択することで、 ペプチドの N末端アミノ基に対する N 一ァシル化を完了することも可能である。 その際、 アルカン酸無水物とアルカン 酸とによるァシル化反応を促進する目的で、 触媒量のピリジン、 例えば、 アル力 ン酸無水物とアルカン酸の合計に対して、 0 . 1〜1 . 0体積％のピリジンを添 加することがより好ましい。 かかるピリジン塩基はプロトン受容体として機能す るため、 例えば、 ァミノ基へのァシル化に伴い離脱すべきプロ トンの除去がより 速やかになされる。
さらには、 対象とするペプチドが、 例えば、 隣接するペプチドのシスティンと の間で、 酸化型の一 S— S—結合を形成する、 あるいは、 同一分子内で一 S— S 一結合を形成しているシスティンを含む場合には、 予め常用の還元処理を施し、 かかる架橋を解消し、 還元型のシスティンを含むペプチドに変換する。 また、 ぺ プチド中に存在する還元型のシスティンに対しては、 その側鎖のスルファニル基
(- S H) にカルボキシメチル化やピリジルェチル化などを施し、 予めその保護 を行う。 より具体的には、 対象とする長いアミノ酸配列のペプチド、 例えば、 タ ンパク質など、 二次構造、 三次構造を構成している場合には、 予め、 デフオール ディング処理を加えて、 該多次構造を示さないぺプチド鎖に変換しておく処理を なす過程で、 かかるタンパク質同一分子内で一 S— S—結合を形成しているシス ティンを含む可能性を有する場合には、 予め常用の還元処理を施し、 かかる架橋 を解消し、 還元型のシスティンを含むペプチドに変換する。 加えて、 該ペプチド 中に存在する還元型のシスティンに対しては、 その側鎖のスルファニル基 （一 S H)にカルボキシメチル化やピリジルェチル化などを施し、予めその保護を行う。 その他、 かかる前処理工程における反応手順は、 気密状態とできる反応容器内 に、 アル力ン酸無水物にアル力ン酸を少量添加した液状混合物を入れ、 この液状 混合物を一旦冷却して、 蒸気圧を低下した状態で、 反応容器内を排気し、 密閉し て、 反応温度まで昇温し、 容器内にアルカン酸無水物を蒸発させる手法が挙げら れる。 かかる手順を採用すると、 反応容器内への水分の混入を防止できる利点も ある。加えて、反応.系内に酸素が残留しないように、真空排気を行うと、例えば、 対象とするぺプチドを構成するアミノ酸残基のうち、 メチォニンに存在するィォ ゥが、 酸素により酸ィ匕を受け、 その式量が変化することを防止でき、 分子量の測 定を基礎とする本発明の方法においては、 力かる酸化を抑制することは、 より高 い確度を達成する上で、より好ましいものとなる。前処理工程の反応を終えた後、 反応容器内に残余する反応試薬を除去した後、 次の c末端アミノ酸を逐次的に分 解する反応工程に移行する。
本発明の第一の形態では、 この C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応では、 前処理工程に引き続き、 N—ァシル化保護済みのペプチドの乾燥試料に対して、 乾燥雰囲気下、 1 5 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物より 供給される、 蒸気状のアル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを作用させ、 ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000043_0001
(式中、
R 1は、 ぺプチドの C末端ァミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末 端アミノ酸の分解を行う。
かかる 5—ォキサゾロン環形成の反応では、 乾燥雰囲気下、 先ず、 下記する反 応式 ( l a ) :
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0002
で示されるケト一エノール互換異性化の過程において、 蒸気状のパーフルォロア ルカン酸を乾燥したペプチドに対して、 プロトン供与体として機能させることで、 エノーノレ型をとる比率を高めている。
次いで、 ェノール型において、 表出されているヒドロキシ基と C末端カルボキ シ基の間で、 分子内エステル結合を形成し、 5—ォキサゾロン環を完成させる。 その際、 恐らくは、 蒸気状のパーフルォロアルカン酸は、 このエステル化反応に おいても、 プロトン. ドナーとして作用し、 酸触媒下におけるエステル化反応を 誘起していると推定される。 本発明の第一の形態では、 C末端カルボキシ基の活 性化を行い試薬として、 アルカン酸無水物を利用し、 例えば、 下記の反応式 （I b ) ：
Figure imgf000044_0003
で例示されるような、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された C末端カルボ キシ基が反応に関与するものとしている。 その結果、 かかる反応は、 穏和な温度 条件で進行でき、 反応温度を 1 5 °C〜 6 0 °Cの範囲に選択することが可能となつ ている。 なお、 かかる反応温度は、 室温付近、 あるいは、 室温より僅かに高い範 囲内に選択することが好ましく、 より具体的には、 1 5 °C〜 5 0 °Cの範囲に選択 することがより好ましい。
加えて、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してなる 混合物を利用する処理の間に、 ペプチドの N末端のアミノ基に対して、 前記アル カン酸無水物によって、 N—ァシル化が通常起こるため、 系内において、 N—ァ シル化保護がなされるものの、 予め、 N—ァシル化保護を目的とする前処理を施 す方がより望ましい。
従って、 本発明の第一の形態は、 利用されるパーフルォロアルカン酸の高いプ 口トン供与能を利用するものであり、 該パーフルォロアルカン酸の示す pK aは、 0. 3〜2. 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用いることが好ましレ、。 加えて、 このパーフルォロアルカン酸は、 蒸気状態として、 乾燥ペプチド試料へ 供給する必要があり、 15°C〜60°Cの範囲に選択する前記温度において、 所望 の蒸気圧を得られる揮発性に優れたパーフルォロアル力ン酸であることが望ま しい。 その観点からも、 炭素数 2〜 4のパーフルォロアルカン酸は、 より適する ものであり、 さらには、 直鎖状の炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸が、 よ り適するものであり、 具体的には、 トリフルォロ酢酸 （CF3COOH)、 ペンタ フルォロプロパン酸 （CF3CF2COOH)、 ヘプタフルォロブタン酸 （CF3 CF2CF2COOH) を利用することがより望ましい。
また、 上記する活性化試薬として利用される、 アルカン酸無水物は、 反応に従 つて、 消費されるため、 蒸気状態として供給するアルカン酸無水物の蒸気圧を所 定の範囲に維持しつつ反応を行うことが望ましい。 例えば、 その手段としては、 反応を行う系を気密状態とし、 系内に存在するアルカン酸無水物の蒸気圧を安定 化する方法が挙げられる。 より具体的には、 気密状態とできる反応容器内に、 ァ ルカン酸無水物にパーフルォロアル力ン酸を少量添加した液状混合物を入れ、 こ の液状混合物を一旦冷却して、 蒸気圧を低下した状態で、 反応容器内を排気し、 密閉して、 反応温度まで昇温し、 容器内にアルカン酸無水物を蒸発させる手法が 挙げられる。 かかる手順を採用すると、 反応容器内への水分の混入を防止できる 利点もある。 なお、 反応系内に酸素が残留しないように、 真空排気を行うと、 例 えば、 対象とするペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、 メチォニンに存在す るィォゥが、 酸素により酸ィヒを受け、 その式量が変化することを防止でき、 分子 量の測定を基礎とする本発明の方法においては、 力かる酸化を抑制することは、 より高い確度を達成する上で、 より好ましいものとなる。
一方、 利用されるアルカン酸無水物は、 反応温度まで昇温した際、 適正な蒸気 圧を生じる限り、 種々のものが利用可能である。 ただし、 反応温度を前記する好 適な範囲、 例えば、 1 5 °C〜5 0 °Cの範囲に選択する際に、 十分な蒸気圧を与え るものが好ましく、 従って、 炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型酸無水物を用い ることが好ましい。 なかでも、 前記対称型酸無水物として、 炭素数 2〜4の直鎖 アルカン酸の対称型酸無水物を用いることがより好ましく、 特には、 炭素数 2の 直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、 すなわち、 無水酢酸が好適に利用できる。 か かるアルカン酸無水物は、 C末端カルボキシ基の活性ィ匕に利用されるため、 その 際、 立体障害を生じることの少ないものが好ましく、 その点でも、 前記例示の無 水酢酸などがより好適である。
この分解反応に利用される、 アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とは、 ともに蒸気状として、 乾燥ペプチド試料に対して作用させ、 一且形成された 5— ォキサゾロン環が、 系外から進入した水分により、 加水されて、 元に戻ることを 回避するため、 反応は乾燥雰囲気下で行う。 その観点から、 一般に、 密閉された 反応容器内でかかる反応を行うことが望ましい。 なお、 反応容器内に当初供給さ れる、 アルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との混合物は、 室温では液状 混合物とし、 アルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とが均一に混合された 状態とする。 このアルカン酸無水物にパーフルォロアルカン酸を少量添加してな る混合物は、 触媒として利用するパーフルォロアルカン酸は、 反応の間、 原則的 に消費されないので、 少量とすることができる。 より具体的には、 気相中に蒸気 として存在するパーフルォロアルカン酸は、 同じく、 蒸気として存在するアル力 ン酸無水物と対比して、 相対的に低い濃度とすることができることを意味する。 逆には、 利用するアルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸の種類によって、 例えば、 反応温度における、 その飽和蒸気圧に応じて、 目的とする気相中の分圧 比 （気相濃度比） を達成できる混合比率の液状混合物を適宜利用する。 例えば、 前記アル力ン酸無水物にパーフルォロアル力ン酸を少量添加してなる?昆合物中 における、 パーフルォロアルカン酸の含有比率は、 アルカン酸無水物とパーフル ォロアルカン酸との合計体積に対して、 1〜2 0体積％の範囲、より好ましくは、 3〜1 0体積％の範囲に選択することが望ましい。
また、 本発明の第一の形態においては、 一且形成された 5—ォキサゾロン環か ら、 例えば、 反応式 （ΙΙ' ) で表記される反応：
Figure imgf000047_0001
等の反応を経て、 C末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行し て、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。 従って、 かか る反応を終えた後、 得られる反応産物は、 上述する反応式 （Π) に示される、 C 末端にカルボキシ基が表出されているもの以外に、 中間産物である 5—ォキサゾ ロン環構造に留まるもの、.あるいは、 反応中間体の一形態として、 C末端が非対 称型酸無水物に至ったものも混入したものとなる。
力かる逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程における反応は、 少な くとも、 反応式 （I b ) で例示される 5—ォキサゾロン環構造の形成過程と、 反 応式 （ΙΓ ) で例示される 5—ォキサゾロン環構造の開裂による末端アミノ酸の 分離過程との二段階の素反応から構成される。 そのため、 全体の反応速度は、 こ れら各過程の反応速度の双方に依存するものの、 主に、 利用するアルカン酸無水 物とパーフルォロアルカン酸の蒸気分圧 （気相濃度） ならびに反応温度に依存し ている。 加えて、 一連の反応産物は、 逐次的な反応で形成されるため、 得られる 一連の反応産物において達成される、 短縮される C末端アミノ酸配列の最大長は、 処理時間が長くなるとともに、 延長される。 従って、 かかる逐次的な C末端アミ ノ酸の選択的な分解処理工程における処理時間は、 主に、 利用するアルカン酸無 水物とパーフルォロアルカン酸の蒸気分圧 （気相濃度） ならびに反応温度に応じ て、また、解析すベき C末端アミノ酸配列の目檩とするアミノ酸長をも考慮して、 適宜選択するものである。
また、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程において生成される、 上記反応式 （Π ' ) に例示される C末端にカルボキシ基が表出されていない反応 中間体の形態をとるものをも、 C末端にカルボキシ基が表出されている形態に復 する目的で、 後処理工程として、 加水処理の工程を設ける。 すなわち、 本発明の 第一の形態では、 この加水処理の工程において、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に 分解する工程で得られる一連の反応生成物を含む混合物に対して、 残余するアル 力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを乾燥状態において除去する後処理 を施した上で、塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を溶解する水 溶液を利用し、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物と水 分子を供給して、 これら塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 前記反応生成物 ペプチドに水分子を作用させて、 5—ォキサゾロン環内のエステル結合、 ならび に、反応中間体の一形態である、 C末端の非対称型酸無水物構造を加水処理して、 それぞれ、 C末端のアミノ酸残基にカルボキシ基 （一 C O O H) を再生させる。 さらに、 塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 水分子を作用させると、 前処理 工程において o—ァシルイ匕保護を施した、 ペプチド鎖中に存在するセリン残基と トレオニン残基側鎖のヒドロキシ基、 ならびにチ口シン残基側鎖のフエノール性 ヒドロキシ基では、 その脱保護も進行する。 一方、 リシン残基側鎖のアミノ基、 ならびにぺプチド鎖 N末端のアミノ基に対する N—ァシル化保護は、 脱保護を受 けず、 残留される。 この加水処理を施した後、 かかる一連の反応生成物を含む混 合物に残余する、 前記塩基性の窒素含有有機化合物と水分子を除去、 乾燥する再 乾燥後処理を行う。 この加水処理を施すことで、 元のペプチドと一連の反応産物 のペプチド鎖は、 リシン残基側鎖のアミノ基は、 N—ァシル化保護されており、 C末端にカルボキシ基は表出した形態とした上で、 後述するトリプシン消化処理 に供される。
かかる加水処理に利用する、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァ ミン化合物は、 例えば、'残留している C末端が非対称型酸無水物に至ったものと 反応して、 アミド結合を形成することがなく、 また、 水溶液とした際、 均一な溶 液とできるので、 好ましいものである。 利用可能な、 塩基性含窒素芳香環化合物 としては、 適用な蒸気圧を与えることができる、 単環式の含窒素芳香環化合物が 好ましく、 例えば、 ピリジンはより好適に利用できる。 また、 利用可能な第三ァ ミン化合物は、 前記ピリジン塩基が示す比較的に弱い塩基性と同程度の塩基性を 有するものが好ましく、 例えば、 DMA E ( (C H 3) 2 N- C H 2 C H 2 O H) な どが好適に利用できる。 例えば、 ピリジンを利用する際には、 水溶液全体の体積 に対して、 ピリジンを、 5〜1 5体積％の範囲、 より具体的には、 1 0体積％に 選択することが好ましい。 また、 （ジメチルァミノ） エタノール （DMA E) を 利用する際には、 水溶液全体の体積に対して、 DMA Eを、 1〜2 0体積％の範 囲、 より具体的には、 1 0体積％に選択することが好ましい。
これら単環式の含窒素芳香環化合物や第三ァミン化合物は、 水分子とともに、 蒸気として、 上記反応産物を含む乾燥混合試料に作用させる。 この後処理も、 一 般に、 密閉された反応容器内でかかる反応を行うことが望ましい。 また、 かかる 後処理では、 水分子を利用するため、 その蒸気圧を一定以上とすることが必要と なるので、 例えば、 6 0 °C以上の温度、 但し、 反応容器内の機械的強度を考慮す ると、 1 0 0 °C以下の範囲に選択することは望ましい。 速やかに、 加水処理を完 了するためには、 1 0 0 °Cまたは、 それより若干低い温度を選択することが望ま しい。
例えば、 本発明の第一の形態にかかる C末端アミノ酸の選択的な分解方法では、 前処理工程、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応工程、 後処理工程を、 同一の反 応器内で連続した形態で実施することが、 一層好ましいものである。 かかる工程 のフローの一例を、 図 1に例示する。 各工程を終えた段階で、 ペプチド試料に、 その工程で利用した試薬の残留を回避するため、 それぞれ、 ドライ ·アップ操作 を設けている。 このドライ ·アップ操作は、 減圧留去でなされるのが一般的であ り、 その際、 反応により派生する分解された末端アミノ酸等の除去を同時に実施 できる場合もある。 図 1に例示する工程フローでは、 利用するアルカン酸無水物 として、極めて高い純度のものが容易に入手可能な無水酢酸を利用する事例を示 している。
一方、 図 1に例示する工程フローでは、 C末端アミノ酸の選択的な分解反応ェ 程における処理時間は、 力かる工程中に短縮される C末端アミノ酸配列のァミノ 酸長として、 最長の場合、 1 0数アミノ酸長、 最小では、 3アミノ酸長を目標と する際、 利用する無水酢酸とフルォロアルカン酸の比率、 ならびに処理温度に応 じて、 選択される処理時間の範囲を例示している。 一般に、 フルォロアルカン酸 の比率を増し、 かつ処理温度をより高く設定すると、 反応速度は增し、 より短い 処理時間で、 目標とする最長のアミノ酸配列短縮量を達成した一連の反応産物の 調製が可能となる。
また、 前処理工程においては、 蒸気状の無水酢酸と酢酸を利用して、 ペプチド の N末端のァミノ基への N—ァセチル化を実施しているが、 この無水酢酸と酢酸 の組み合わせにおいても、 場合によっては、 極僅かでであるが、 上記反応式 （I a ) で表記される C末端カルボキシ基の活性化反応、 それに起因する副次反応が 誘起されることが懸念される。 この副次的な反応を抑制する目的で、 少量のピリ ジン蒸気を共存させ、 ペプチドの C末端カルボキシ基に対して、 ピリジン塩基が 弱い付加塩を形成させることで、 不要な副次反応に対する保護効果を持たせるこ とが可能である。 この付加塩型の保護は、かかる前処理工程を終える際、 ドライ · アップ操作を設けて、 減圧下、 ピリジン塩基の留去を行うことで、 簡便に脱保護 され、 次段の C末端アミノ酸の選択的な分解反応工程において、 問題を生じるこ とはない。 これらの観点力 ら、 この付加塩型の保護には、 ピリジン塩基など、 減 圧下に簡単に留去可能で、 塩基性も弱い、 含窒素複素芳香環化合物を少量添加す ることが好ましい。 また、 この付加塩型の保護は、 アミノ酸側鎖のカルボキシ基 に対する保護機能を有するため、 アミノ酸側鎖のカルボキシ基に起因する、 不要 な副次反応をも同時に効果的に抑制することが可能となる。
本発明の第一の形態では、 上記の C末端アミノ酸の逐次的な除去により調製さ れる一連の反応産物の分子量と、 元のペプチドの分子量との差異を、 質量分析法 による測定結果を利用して決定し、 その分子量差に相当するアミノ酸を特定する。 従って、 通常、 力かる質量分析法による測定に供する混合物中に、 元のペプチド も、 その分子量の特定が可能な程度残存する状態とすることが望ましい。
具体的には、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析 方法は、 C末端アミノ酸配列として、 最大 1 0数アミノ酸長程度までの解析に適 用するが、 その際、 対応する最大 1 0数種に及ぶ一連の反応産物の含有比率は、 その最小の含有比率のものは、 最大含有比率のものの、 少なくとも、 1 / 1 0程 度を下回らない状態とすることが望ましい。 また、 元のペプチドの残存量も、 最 大含有比率の反応産物に対して、 少なくとも、 1 1 0程度を下回らない状態と することが望ましい。 一方、 必要とする C末端アミノ酸配列情報は、 1 0ァミノ 酸以内となることが多く、 1 0アミノ酸程度の分解が進む程度に処理時間を選択 すると、 前記の含有比率に関する条件を満足することができる。
次に、本発明の第一の形態における、上述する本発明を特徴付ける（1 )〜（6 ) の工程中、 （4 ) 〜 （6 ) に相当する、 前記一連の反応生成物と、 元となるぺプ チドとの分子量差を、 質量分析法により分析し、 かかる C末端アミノ酸の逐次的 分解に伴う分子量減少を測定する工程と、 測定された一連の分子量減少量に基づ き、 逐次的分解された一連のアミノ酸を特定し、 C末端より配列させて、 C末端 のアミノ酸配列情報を得る工程に関して、 さらに詳しく説明する。
本発明では、 分子量の測定に、 MA L D I—T O F— M S装置を利用すること で、 高分子量のペプチド鎖に関しても、 その分子量を精度よく測定することを可 能としている。 但し、 力かるペプチドなどの高分子量分子の測定に適する、 MA L D I— T O F— M S装置を利用しても、 有効にイオン化を達成できる分子量に は、自ずから上限があり、高い精度で測定可能なぺプチドのアミノ酸長の最大は、
3 0〜5 0アミノ酸を超えないことが望ましレ、。 加えて、 分子量差に基づき、 対 応するアミノ酸の特定を行うので、 例えば、 A s nと A s p、 G i nと G l uの 如く、 式量の差異が 1のアミノ酸残基相互の区別を高い精度で行う上では、 基準 となる、 最長のペプチド、 すなわち、 C末端アミノ酸の除去がなされていないべ ；プチドの分子量は、 4 0 0 0を超えない範囲、 より好ましくは、 3 0 0 0を超え ない範囲であることがより好ましい。これをアミノ酸長に換算すると、長くとも、
4 0アミノ酸、 より好ましくは、 3 0アミノ酸を超えない範囲とすることが好ま しい。
本発明の第一の形態では、 前記のァミノ酸長を遥かに超えるタンパク質などの 長いアミノ酸長のペプチドへの適用を容易にするため、 質量分析の実施に先立ち、 切断アミノ酸配列部位の特異性を有し、 かつ、 その酵素反応効率に優れるプロテ ァーゼである、 トリプシンを利用して、 ペプチド鎖の特異的な分断処.理を行い、 得られる C末端べプチド断片を利用して、 C末端アミノ酸の逐次的な除去により 調製される一連の反応産物の分子量と、 元のぺプチドの分子量との差異を測定す る。
このトリプシン消化処理は、 再乾燥後処理後、 前記加水処理済みの一連の反応 生成物を含む混合物に対して、 緩衝溶液中において、 トリプシンを作用させ、 該. ぺプチド鎖の N末端のァミノ基ならびに、 該ぺプチド鎖に含有されている可能性 のあるリシン残基側鎖のアミノ基に対する N—ァシル化保護が保持されている、 該ペプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施している。 その際、 リシン 残基側鎖のァミノ基に対する N—ァシル化保護が保持されているため、 N—ァシ ル化保護リシン残基の C末側ぺプチド結合の切断は生じず、該ぺプチド鎖中に存. 在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断が起こる。
例えば、 リシン残基とアルギニン残基の双方で切断が起こると、 得られるぺプ チド断片の総数は相当な数に達し、 その結果、 各断片の平均的なアミノ酸長は短 くなり、 狭い,分子量範囲に、 相当な数のペプチド断片に起因するピークが密集す る傾向となる。 相当な数のペプチド断片に起因するピークが密集すると、 その中 から、 目的とする一群の C末側ペプチド断片を特定する上で、 障害となる場合も ある。 特に、 C末端アミノ酸の逐次的な分解を施した、 一連の反応産物に由来す る C末側ペプチド断片は、 除去されるアミノ酸数が多くなると、 その食有比率は 小さくなり、 近接して、 他のペプチド断片が存在すると、 目的とする C末側ぺプ チド断片を特定する上で、 大きな障害となる場合もある。 本発明では、 該ぺプチ ド鎖中に存在するアルギニン残基の c末側ペプチド結合の選択的な切断を利用 するので、 得られるペプチド断片の総数は必要以上に多くなることを'回避でき、 同時に、 目的とする C末側ペプチド断片のアミノ酸長は、 上述する MA L D I— T O F—M S装置を利用する際、 適当とされるアミノ酸数の範囲内とすることが 可能である。 ·
該トリプシン消化処理後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該 トリプシン消化処理済みペプチド断片を回収し、 乾燥した後、 この回収された該 トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混合物について、 MA L D I— T O F -M S法を利用し、 該ィオン化処理で生じる陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行う。
既に説明したように、 本発明では、 MA L D I— T O F—M S装置を利用する ことに伴い、 その陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子 量測定の結果に基づき、
トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチド断 片では、 該アルギェン残基に起因して、 その対応するイオン種のピークは、 陽イオン種による分子量測定における強度は、 陰イオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端のぺプチ ド断片ならびに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物 に由来する C末端のペプチド断片にはアルギニン残基が存在しないので、 その対 応するイオン種のピークは、
陰ィオン種による分子量測定における強度は、 陽ィオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
陰イオン種による分子量測定において、 相対的に大きな強度を与える、 一連の
C末端ぺプチド断片に対応する陰イオン種の分子量に基づき、 C末端アミノ酸の 逐次的分解に伴う分子量減少を測定する手法を採用している。
なお、 本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法で は、 分子量の差異に基づき、 逐次的に除去されたアミノ酸を特定するため、 同一 の式量を有する、 ロイシン （L e u ) 残基とイソロイシン （ l i e ) 残基とを弁 別することは原理的に不可能であり、 この点は、 従来の質量分析法を利用する C 末端アミノ酸配列解析手法と同様である。 一方、 グルタミン （G i n ) 残基とリ シン （L y s ) 残基も同一の式量を有するものの、 リシン （L y s ) 残基の側鎖 に N—アルカノィル化を施すため、本発明では、両者の弁別が可能となっている。 また、 C末端アミノ酸を除去する反応では、 反応式 （l b ) に例示するように、 アミド結合のェノール型への変換と、 それに続く、 5—ォキサゾロン環構造の形 成が必須であり、 アミド結合を構成するカルボニル基 （C =〇） とィミノ基 （一 NH-) が存在しない環状アミノ酸プロリン （P r o ) が C末端アミノ酸となつ た時点で、 それ以上の分解反応は進 fi1しない。 逆には、 処理時間を延長した際、 それ以上の C末端ァミノ酸の除去が起きないことを確認すること.で、 その要因と なるアミノ酸残基は、 環状アミノ酸プロリン （P r o ) と推定することが可能で ある。
一方、 本'発明において、 ペプチドより化学的手段により C末端アミノ酸を逐次 的に分解して、 一連の反応生成物を得る反応では、 アルカン酸無水物とパーフル ォロアルカン酸を作用させるため、 仮に、 ペプチド中のセリン残基 （一 NH— C H (CH2OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) 〇 H) -CO-) に存在するヒドロキシ基、 N末端のアミノ基、 リシン残基 （一 N H-CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-)の ε位のアミノ基に対して、 予め Ο—ァシル化、 Ν—ァシル化保護を行う前処理工程を実施しなくとも、 かか る C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応条件では、 これら Ο—ァシル化、 Ν- ァシル化反応も併行的に進行する。 そのため、 セリン残基 （― NH— CH (CH 2OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) — C O—） に存在するヒドロキシ基に起因する、 N, O—ァシル転位反応等の副次反 応に対する、 競争的な阻害効果が達成される。 し力 しながら、 本発明では、 最終 的にペプチド断片の分子量を測定するため、 ペプチド中のセリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基などに起因するペプチド鎖途中での断 裂をより確実に防止する必要があり、 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する反応ェ 程に先立ち、 予め O—ァシル化、 N—ァシル化保護を行う前処理工程を実施する 構成を選択している。
仮に、 最終的に得られる反応産物において、 セリン残基ゃトレオニン残基にァ セチルイ匕がなされたものが多数混入していると、 かかる多ァセチル化体と、 脱ァ セチルがなされたものとの分子量差は、 式量 42の整数倍、 具体的には、 84、 126、 168は、 セリン残基 （一 NH—CH (CH2OH) -CO-) の式量 87、 グルタミン残基 （一 NH— CH (CH2CH2-CONH2) -CO-) の 式量 128、 グルタミン酸残基 （一 NH— CH (CH2CH2— COOH) -CO -) の式量 129、 N—ァセチルリシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH2 CH2NH-COCH3) -CO-) の式量 170と類似しており、場合によって は、 多ァセチルイ匕体を主なビークと誤認し、 脱ァセチルがなされたものを、 前記 するアミノ酸の除去がなされたものとする懸念がある。 本発明では、 後処理工程 における加水処理において、 セリン残基やトレオニン残基における o—ァシル化 保護に対する脱保護が十分に進行する条件を選択することで、 かかる懸念に対す る十分な対策もなされている。 加えて、 ペプチド断片化を行った後、 分子量の測 定を行うことで、 測定される分子量を、 式量差が 1であるグルタミン残基とダル タミン酸残基との弁別が可能な分析精度の測定がなされる範囲としており、 上述 する残留しているァセチル基数の差と、 類似する式量を示すアミノ酸残基の間で は、 式量差が 2〜3であり、 多くの場合、 力かる誤認を生じる可能性は払拭して いる。
なお、 前記反応用の液状試薬、 あるいはそのコンポーネント ·キットの液状試 薬それぞれを収納でき、 前記試料容器中に保持されるペプチド試料に対して、 前 記反応用の液状試薬を一定量づっ加え、 しかもそれらを直接接触しない状態を維 持可能な液状試薬の保持機構を具え、 前記試料容器をその内部に収納可能な反応 容器は、 その内部を真空排気でき、 また、 反応終了後、 残余する反応用の液状試 薬を、 減圧下、 留去することができ、 反応時には、 気密構造とできる形態とする ことが好ましい。 また、 かかる反応容器内で、 試薬の蒸気を発生する際、 容器壁 と反応を生じることのない材質とすることが必要である。 従って、 化学反応の反 応容器に利用されるガラス材料を利用したものが好適である。 また、 密閉操作に 利用されるコック類は、 テフロンなどの材質のものが好適に利用される。
引き続き、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方 法について、 より詳しく説明する。
先ず、 本発明の第二の形態は、 上述する本発明の第一の形態が対象とする、 予 め単離処理されているぺプチドの乾燥試料に代えて、 予めゲル電気泳動法による 分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態のペプチドを対象としている。 従 つて、 ゲル担体上に担持された状態のペプチドに対しては、 C末端アミノ酸を逐 次的に分解する反応に際して、'蒸気状の反応試薬を利用する固相における反応手 法を有効に適用できないため、 ゲル担体中に、 相当する反応試薬を浸潤させ、 液 相反応を行わせる丰法に変更している。 その際、 上述する本発明を特徴付ける ( 1 ) 〜 （6 ) の工程中、 （1 ) 〜 （3 ) に相当する、 対象とするペプチドより、 化学的手段により C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成 物を含む混合物を調製する工程では、 対象とするペプチドを、 ゲル担体から予め 単離処理せず、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、 ペプチド試料に対して、 その C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応を可能としている。
すなわち、 本発明の第二の形態では、 本発明を特徴付ける （1 ) 〜 （6 ) のェ 程中、 （1 ) 〜 （3 ) に相当する工程として、 かかる C末端アミノ酸を逐次的に 分解する工程では、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の対 象とするぺプチド試料に対して、 次段のァシルイヒ反応を行う前処理工程において、 その障害となる水分を予め除去するため、 ゲル担体中に含浸される水溶媒を、 該 ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロ トン性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 該ゲル担体の脱水処理を行うェ 程を設け、 下記するァシル化保護を施す前処理工程、 C末端アミノ酸の逐次的な 分解工程、 反応産物に対する加水処理を行う後処理工程を行う。
なお、 予めゲル電気泳動法による分離を行う際、 利用されるゲル状物質は、 特 定の分子量範囲に相当する複数種のペプチドに関して、 それぞれ個別な、 分離さ れたスポット （又は、 パンド） を示す条件、 具体的には、 ゲルを構成するポリア クリルアミドの含有比率を選択し、 ゲル内部に形成される微細な穴構造内部の間 隙サイズを調整する。 その結果、 分離されたスポット （又は、 バンド） は、 例え ば、 S D S— P A G E法では、 それぞれペプチド鎖分子量、 表面の電荷量の差異 に起因する電気泳動速度の相違するぺプチドが局在している。 かかるぺプチドは、 ゲル中に形成される微細な穴構造内部に保持されており、 ゲル状物質中に含浸さ れる水を除去する際、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親 和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 水溶媒のみを該極性非プロトン性 溶媒中に希釈 ·溶出する手法を利用すると、 かかる脱水処理操作を終えた後も、 目的とするペプチドは、 分離されたスポット （又は、 パンド） 位置のゲル担体上 に担持された状態に維持できる。 すなわち、 上述の脱水処理に利用する極性非プ 口トン性溶媒は、 ゲルを構成するポリアクリルアミドなどのゲル状物質との親和 性は、 水溶媒より一般に劣っているため、 ゲル状物質中の微細な穴構造の間隙サ ィズを維持していた、 間隙表面に対して溶媒和している水溶媒の除去とともに、 嵩体積の減少が進む。 該脱水処理に利用する極性非プロトン†生溶媒として、 例え ば、ポリアクリルアミド 'ゲルを用いる際、好適な極性非プロトン性溶媒として、 水に対して親和性に富む、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以下の 二トリノレ類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類などを挙げることができる。 また、これら脱水処理に利用する極性非プロトン性溶媒は、水よりも蒸散し易く、 蒸散 ·乾固すると、 嵩体積が減少し、 収縮したゲル担体となる。
本発明の第二の形態においては、 ぺプチド鎖にァシル化保護を施す前処理工程 は、 前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプ チド試料に対して、 3 0 ° (〜 8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶 媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水物溶 液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺプチド 試料にアルカン酸無水物を作用させ、 対象とするぺプチドの N末端のァミノ基な らびに、該ぺプチド中に含有される可能性のあるリシン残基側鎖上のァミノ基に、 予め、 前記アルカン酸無水物を構成するアルカン酸に由来するァシル基による N —ァシル化保護を施す。 この前処理工程において施される、 リシン残基側鎖のァ ミノ基に対する N—ァシル化保護は、 上述する最終的に、 トリプシン消化処理を 行った際、 リシン残基の C末側べプチド結合での切断を防止する目的を有するた め、 後述する加水処理において、 リシン残基側鎖上の N—ァシル化保護では、 脱 保護が進行しないものの、 同時になされる O—ァシルイ匕保護においては、 脱保護 が十分に進行するァシル基を選択することが望ましい。 その際、 本発明の第二の 形態においては、 求電子的なァシル化剤であるアルカン酸無水物は、 双極性非プ 口トン性溶媒中では、 かかる溶媒に因る分子内の分極がなされ、 ペプチドに対し て作用させた際、 ァミノ基と、 ヒドロキシ基に対して、 N—ァシル化、 ならびに O—ァシル化反応が進行する。 かかる N—ァシル化、 ならびに O—ァシル化反応 に付随して、 該アルカン酸無水物由来のアルカン酸が副生すると、 そのアルカン 酸の示す触媒作用によって、 N—ァシル化、 ならびに O—ァシル化反応の促進が なされる。 つまり、 本発明の第二の形態では、 ゲル担体内で副生するアルカン酸 の拡散 ·散逸は速やかには進まない点を利用し、 ゲル担体中に留まっている、 副 生するアルカン酸を反応の促進を図る触媒として利用できるので、 反応試薬とし て、 アルカン酸無水物のみを使用している。
この前処理工程で使用される、 アルカン酸無水物は、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に 選択される温度で、 リシン残基側鎖のァミノ基に対する N—ァシル化保護の反応 が可能な反応性を示すもの、 具体的には、 炭素数 2〜4のアルカン酸由来の対称 型酸無水物を利用することが好ましレ、。 特には、 炭素数 2〜 4の直鎖アルカン酸 由来の対称型無水物を利用することがより好ましい。 すなわち、 対称型のアル力 ン酸無水物を利用すると、 副生するアルカン酸も同一種となるので、 かかる N— アルカノィル化、 O—アルカノィル化反応の進行する間に、 仮にァシル基交換反 応が生じても、 最終的に得られる、 N—アルカノィル化、 O—アルカノィル化保 護に、 異なるアルカノィル基が混在することは無い。 従って、 仮に、 後述する加 水処理において、 O—アルカノィル化保護の脱保護が達成されないものが、 残留 した場合にも、 脱保護の達成されたものとの分子量差は、 予め判明しており、 か かる夾雑物に由来するピークの同定はより簡単なものとなる。 この N—ァシル化 保護を施す前処理工程では、 通常、 無水酢酸を利用することがより望ましい。 双極性非プロトン性溶媒中では、 アルカン酸無水物の分子内分極が誘起され、 求電子反応試薬として、該ペプチドのァミノ基に作用する結果、 3 0 °C以上でも、 十分にかかる N—ァシル化反応は進行する。 通常、 反応の促進を図るためには、 反応温度を 5 0 °C以上に選択することが好ましいが、 一般に、 密閉された反応容 器内でかかる反応を行うため、 反応容器内の機械的強度を考慮すると、 1 0 0 °C 以下の範囲に選択することが望ましい。 N—ァシルイヒ反応に付随して、 アルカン 酸が生成するが、 その量は僅かであり、 かかるアルカン酸の示すプロトン供与能 と、共存するアル力ン酸無水物とに起因する副次的反応は、上述の温度範囲では、 通常問題とはならない。より具体的には、系内に生成するアルカン酸は、例えば、 パーフルォロアルカン酸と比較して、 その酸触媒作用は格段に劣り、 かつ、 その 存在量も少ないため、 上述する温度条件では、 パーフルォロアルカン酸とアル力 ン酸無水物とを利用する C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程における主な 反応、 5—ォキサゾロン環構造の形成反応が副次的に起こるまでには至らなレ、。 更には、 上述するパーフルォロアル力ン酸とアル力ン酸無水物とを利用する C末 端アミノ酸を逐次的に分解する工程においてすら、抑制されている種々の副次反 応、 例えば、 ペプチド主鎖アミ ド結合 (- C O NH-) の開裂は、 かかるア^^カ ン酸無水物のみを利用する前処理工程においては、 なお一層の抑制がなされてい る。
—方、 上記のゲルの再膨潤を起こさせる双極性非プロトン性溶媒は、 該ゲル状 物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 比較的に分子サイズが小さく、 かつ、 ゲル状物質に対する親和性に優れた有機溶媒が好ましい。 カロえて、 上述す る N—アルカノィル化、 O—アルカノィル化の反応過程において、 アルカン酸無 水物の分子内分極を誘起可能な、 高い双極性を示すとともに、 反応副生成物であ るアルカン酸に対して、 優れた溶媒であることが好ましい。 なお、 上記反応温度 において、 揮発 ·蒸散することの少ない双極性非プロトン性溶媒が、 より好まし く、 例えば、 ホルムアミド （H C O NH 2) などは、 ポリアクリルアミ ド ·ゲル を用いる際、 以上に述べた要件全てを十分に満足するものである。
所定の反応時間が経過した時点で、 ゲル担体中のアル力ン酸無水物を除去して、 反応を停止するため、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 アルカン酸無 水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン 性溶媒を用いて、 ゲル担体全体を洗浄する。 すなわち、 該極性非プロトン性溶媒 による洗浄により、 ゲル担体中に浸潤していたアル力ン酸無水物、 双極性非プロ トン性溶媒は.、拡散によって、希釈、除去される。例えば、ポリアクリルアミド ' ゲルを用いる際、 上述する洗浄用途に適する要件を満足する極性非プロトン性溶 媒としては、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以下の二トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類などを挙げることができる。 通常、 この 希釈、 洗浄に利用する極性非プロトン性溶媒として、 上述する脱水処理工程で使 用する極性非プロ トン性溶媒を利用することが好ましい。 また、 これら洗浄処理 に利用する極性非プロトン性溶媒は、 水よりも蒸散し易く、 蒸散，乾固すると、 嵩体積が減少し、 収縮したゲル担体となる。
本発明の第二の形態における、 C末端アミノ酸の逐次的な分解工程も、 通常、 水分を含まず、 収縮したゲル担体に対して、 反応試薬溶液を浸潤させて、 反応を 開始させる形態をとるため、 N—ァシルイヒ保護の前処理を施した後、 該ゲル担体 上に担持された状態の対象とするペプチド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲 に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶 媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる比率で 溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬することによ り、 担持された状態の対象とするぺプチド試料にアル力ン酸無水物とパーフルォ ロアルカン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000060_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末 端ァミノ酸の逐次的分解を行う。
このパーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物とを利用する、 5—ォキサゾ ロン環形成の反応は、 先ず、 下記する反応式 （l a ) :
Figure imgf000060_0002
で示されるケトーエノール互換異性ィヒの過程において、 ゲル担体の穴中に担持さ れているペプチド鎖に、 パーフルォロアルカン酸をプロトン供与体として機能さ せることで、 ェノール型をとる比率を高めている。
次いで、 このエノール型に対して、 C末端カルボキシ基の活性化を行い試薬と して、 アルカン酸無水物を利用し、 その C末端カルボキシ基を、 例えば、 下記の 反応式 （l b) :
Figure imgf000061_0001
で例示されるような、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された c末端カルボ キシ基と、 ェノール型のヒドロキシ基との反応などが、 5—ォキサゾロン環形成 の促進に関与している。 双極性非プロトン性溶媒中には、 アルカン酸無水物は、 パーフルォロアルカン酸と比較して、 高い濃度で含有させておくことで、 かかる 反応は、 穏和な温度条件で進行でき、 反応温度を 30 °C〜 80 °Cの範囲に選択す ることが可能となっている。
一方、 本発明の第二の形態でも、 パーフルォロアルカン酸の触媒作用は、 その プロトン供与能を利用するものであり、 該パーフルォロアルカン酸の示す pK a は、 0. 3〜2. 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用いることが好まし い。 なお、 前記の反応温度において、 利用する双極性非プロトン性溶媒中に均一 に溶解可能な、 炭素数 2〜 4のパーフルォロアルカン酸は、 より適するものであ り、 さらには、 直鎖状の炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸が、 より適する ものであり、 具体的には、 トリフルォロ酢酸 （CF3COOH)、 ペンタフルォロ プロパン酸 （CF3CF2COOH)、 ヘプタフルォロブタン酸 （CF3CF2CF 2 COOH) を利用することがより望ましい。
また、 C末端カルボキシ基の活性化に利用されるアルカン酸無水物は、 反応温 度まで昇温した際、 適正な反応性を与えるものが好ましく、 従って、 炭素数 2〜 4のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることが好ましい。 なかでも、 前記対称 型酸無水物として、 炭素数 2〜4の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いるこ とがより好ましく、 特には、 炭素数 2の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、 すな わち、 無水酢酸が好適に利用できる。 力かるアルカン酸無水物は、 C末端カルボ キシ基の活性化を図り、 さらに、 5—才キサゾロン環形成に適する配置を採る上 で、 その配向における立体障害を生じることの少ないものが好ましく、 その点で も、 無水酢酸を利用するとより好適である。
また、 上記する活性化試薬として利用される、 アルカン酸無水物は、 反応に従 つて、 消費されるため、 予め、 ゲルの膨潤に利用する双極性非プロ トン性溶媒中 に、 ペプチドとの反応に消費される量に対して、 大過剰量を溶解しておき、 その 濃度低下を抑制することが望ましい。 具体的には、 ゲルの膨潤に用いる混合溶液 中において、 アルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との含有比率は、 アル カン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロアルカン酸 1〜2 0容の範囲に選択 し、 その際、 双極性非プロトン性溶媒中における、 アルカン酸無水物の含有濃度 は、 1 0〜 3 0 % (体積％)の範囲に選択することがより望ましい。反応時間は、 反応温度、 双極性非プロトン性溶媒中に含有されるアルカン酸無水物とパーフル ォロアルカン酸の含有濃度に依存し、 加えて、 極性非プロトン性溶媒を利用する 脱水処理に伴って、 収縮したゲル担体の膨潤に要する時間をも考慮して、 適宜選 択することが望ましい。 例えば、 ポリアクリルアミド ·ゲル （ 1 2. 5質量％) に对して、 上述のァセトニトリルを利用して脱水処理を施した後、 後述のホルム アミドなどの双極性非プロトン性溶媒中に浸漬して、 ゲル担体の再膨潤を達成す るに要する時間は、 例えば、 4 0 °Cでは、 3時間程度であるため、 全体の反応時 間は、 力かるゲル担体の再膨潤を終えた後、 所望のアミノ酸残基数、 C末端アミ ノ酸の選択的な分解を達成するに要する時間を加えたものに選択する。
一方、 上記のゲルの再膨潤を起こさせる双極性非プロトン性溶媒は、 該ゲル状 物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 比較的に分子サイズが小さく、 かつ、 ゲル状物質に対する親和性に優れた有機溶媒が好ましい。 加えて、 上述す る式 （I a ) のケト一エノール互換異性ィヒの過程において、 そのエノール体の比 率を維持可能な、 高い双極性を示すとともに、 溶質分子のアルカン酸無水物、 パ 一フルォロアルカン酸、 ならびに、 反応副生成物であるアルカン酸に対して、 優 れた溶媒であることが好ましい。 なお、 上記反応温度において、 揮発 '蒸散する ことの少ない双極性非プロトン性溶媒が、 より好ましく、 例えば、 ホルムアミド (H C O NH 2) などは、 ポリアクリルアミ ド ·ゲルを用いる際、 以上に述べた 要件全てを十分に満足するものである。
なお、 上述するアルカン酸無水物、 パーフルォロアルカン酸、 ならびに、 反応 副生成物であるアルカン酸に対して、優れた溶解性をもたらす双極性非プロトン 性溶媒は、 水分子をも容易に溶解することが可能である。 従って、 前記双極性非 プロトン性溶媒を用いる混合溶液中での反応処理に際して、 前記反応系は、 水分 を除去した、 乾燥雰囲気下に保たれることが好ましい。 すなわち、 上記の式 （I b ) に示される反応中間体、 非対称型酸無水物へと変換し、 活性化された c末端 カルボキシ基は、 反応系内に水分子が混入すると、 加水分解を受け、 元の末端力 ルポキシ基へと戻ってしまう。 かかる失活性化過程を回避するため、 反応系は、 水分を除去した状態を維持することが好ましい。
例えば、 対象とするペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、 メチォニンに存 在するィォゥが、 系内に混入する酸素により酸化を受け、 その式量が変化するこ ともある。 この酸素による酸ィヒを防止することは、 分子量の測定を基礎とする本 発明の方法においては、 かかる酸化を抑制することは、 より高い確度を達成する 上で、 より好ましいものとなる。
例えば、 反応系を、 水分に加えて、 酸素も除去された乾燥雰囲気下に保つ手段 としては、 反応を行う系を気密状態とし、 系外からの、 水分、 酸素の浸入を防止 するとともに、 液の注入、 排出操作も、 乾燥処理した不活性気体、 例えば、 窒素 雰囲気下で行うことが望ましい。
また、 本発明の第二の形態においても、 ー且形成された 5—ォキサゾロン環か ら、 例えば、 反応式 （Ι ) で表記される反応：
Figure imgf000064_0001
(n，） 等の反応を経て、 c末端のアミノ酸の離脱と、 次段の反応中間体の形成を進行し て、 逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解が進むと推断される。 従って、 かか る反応を終えた後、 得られる反応産物は、 上述する反応式 （II) に示される、 C 末端にカルボキシ基が表出されているもの以外に、 中間産物である 5—ォキサゾ ロン環構造に留まるもの、 あるいは、 反応中間体の一形態として、 C末端が非対 称型酸無水物に至つたものも混入したものとなる。
かかる逐次的な C末端アミノ酸の分解反応は、 少なくとも、 反応式 （l b ) で 例示される 5—ォキサゾロン環構造の形成過程と、 反応式 （Ι ) で例示される 5—ォキサゾロン環構造の開裂による末端アミノ酸の分離過程との二段階の素 反応から構成される。 そのため、 全体の反応速度は、 これら各過程の反応速度の 双方に依存するものの、 主に、 利用するアルカン酸無水物とパーフルォロアルカ ン酸の濃度ならびに反応温度に依存している。 カロえて、 一連の反応産物は、 逐次 的な反応で形成されるため、 得られる一連の反応産物において達成される、 短縮 される C末端アミノ酸配列の最大長は、 処理時間が長くなるとともに、 延長され る。 従って、 力かる逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解処理工程における処 理時間は、 主に、 利用するアルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸の濃度な らびに反応温度に応じて、 また、 解析すべき C末端アミノ酸配列の目標とするァ ミノ酸長をも考慮して、 適宜選択するものである。
逐次的な C末端アミノ酸の選択的な分解反応の停止は、反応系の温度を低下す るとともに、 ゲル担体中に浸潤している反応試薬、 すなわち、 パーフルォロアル カン酸とアルカン酸無水物を希釈，除去することで行う。 具体的には、 C末端ァ ミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こ さず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 ならびに双極性 非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去を行う。 なお、 かかる反 応試薬の希釈 ·除去に、 混合溶液の調製に利用する双極性非プロトン†生溶媒を利 用することも可能であるが、 反応式 （l b ) で例示される 5—ォキサゾロン環構 造の形成過程を停止する上では、 ェノール型中間体の安定ィヒに寄与の少ない極性 非プ P トン性溶媒を利用する、 パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 な らびに双極性非プロトン性溶媒の除去工程とすることがより望ましい。 少なくと も、 反応試薬の希釈 ·除去工程の最終段では、 極性非プロトン性溶媒を利用する 希釈 '除去の操作を設ける。 例えば、 ポリアクリルアミド'ゲルを用いる際、 こ れらの条件を満足する極性非プロトン性溶媒としては、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以下の二トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン 類などを挙げることができる。
本発明の第二の形態では、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得ら れる一連の反応生成物に対する加水処理を行う、 後処理工程も、 これら一連の反 応生成物を含むペプチド混合物を、 該ゲル担体上に担持された状態としたまま、 実施する。 すなわち、 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の 反応生成物を含む混合物に対して、 該ゲノレ担体上に担持された状態のまま、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合物 の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施す。
この加水処理において、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物は、 反応式 （ΙΓ ) に示される 5—ォキサゾロン環構造、 ならびに、 次段の反応中間 体 （酸無水物体） の加水分解反応を触媒するものの、 それ自体が、 5—才キサゾ ロン環構造または反応中間体 （酸無水物体） と反応して、 不要な副生物を生じる ことがなく、 好適な塩基触媒として機能する。 具体的には、 反応式 （ΙΓ ) に示 される 5—ォキサゾロン環構造、 ならびに、 次段の反応中間体 （酸無水物体） の 加水分解反応では、 下記反応式 （IV) に示すように、 反応産物のペプチド鎖の C 末端にカルボキシ基が表出する。
Figure imgf000066_0001
上記の加水処理に利用する、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合 物は、例えば、残留している C末端が非対称型酸無水物に至ったものと反応して、 アミド結合を形成する.ことがなく、 また、 水溶液とした際、 均一な溶液とできる ので、 好ましいものである。 利用可能な、 塩基性含窒素芳香環化合物としては、 極性非プロトン性溶媒に高い溶解性を示す、 単環式の含窒素芳香環化合物が好ま しく、 例えば、 ピリジンはより好適に利用できる。 また、 利用可能な第三アミン 化合物は、 前記ピリジン塩基が示す比較的に弱い塩基性と同程度の塩基性を有す るものが好ましく、 例えば、 DMA E ( (C H 3) 2 N— CH 2 C H 2 OH) などが 好適に利用できる。 例えば、 ピリジンを利用する際には、 水溶液全体の体積に対 して、 ピリジンを、 5〜1 5体積％の範囲、 より具体的には、 1 0体積％に選択 することが好ましい。 また、 （ジメチルァミノ） エタノール （DMA E) を利用 する際には、 水溶液全体の体積に対して、 DMA Eを、 1〜2 0体積％の範囲、 より具体的には、 1 0体積％に選択することが好ましい。
これら単環式の含窒素芳香環化合物や第三アミン化合物は、 水溶液として、 上 記反応産物を担持しているゲルに作用させる。 この後処理においては、 親水性に 富むゲル状物質中に、 かかる有機塩基を含有する水溶液は、 速やかに浸潤する。 なお、 速やかに加水反応を完了するためには、 反応温度を 6 0 °C以上に選択する ことが好ましいが、 一般に、 密閉された反応容器内でかかる反応を行うため、 反 応容器内の機械的強度を考慮すると、 1 0 0 °C以下の範囲に選択することが望ま しい。
この有機塩基を含有する水溶液を用いた加水処理は、 反応産物のぺプチド鎖の C末端に力ルポキシ基を表出させることを主な目的としているが、 その条件は、 前処理工程でなされた O—ァシル化保護の脱保護も同時に進行するが、 一方、 N 末端のアミノ基、 ならびに、 リシン残基側鎖上のアミノ基に対する N—ァシルイ匕 保護では、 脱保護が進行しないように選択されている。
なお、加水 理に利用する塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物 が残余すると、 反応産物の表出した C末端にカルボキシ基に対して、 かかる窒素 塩基が付加塩を形成したものが混在する状態となるため、 ゲル担体中に含浸され る水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 水に対して親和性を有 する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去することにより、 該ゲル担体の再 脱水処理を施すとともに、加水処理に利用する塩基性含窒素芳香環化合物または 第三アミン化合物を水とともに、 希釈除去することが好ましい。 従って、 この再 脱水処理の工程において利用する極性非プロトン性溶媒は、 塩基性含窒素芳香環 化合物または第三ァミン化合物に対しても、 高い溶解性を有するものがより好ま しい。例えば、ポリアクリルアミド 'ゲルを用いる際、これらの条件を満足する、 再脱水処理工程用の極性非プロトン性溶媒としては、 ァセトニトリル （C H 3 C N) などの炭素数 4以下の二トリル類、 アセトンなどの炭素数 4以下のケトン類 などを挙げることができる。
加えて、 上述する加水処理は、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応の後、 一旦、 反応試薬のアル力ン酸無水物ならびにパーフルォロアルカン酸に対する、 極性非 プロトン性溶媒を利用する希釈 ·除去の操作を終えた後に実施するだけでなく、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応と該加水処理とを、 連続して実施することも可 能である。 具体的には、 c末端アミノ酸の逐次的分解反応は、 その反応温度を下 げて、 その反応停止を図りつつ、 有機塩基を含有する水溶液を加えると、 アル力 ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸の組み合わせてなる反応試薬の失活、 ゲル 中からの溶出が生じ、 C末端アミノ酸の逐次的分解反応の停止と、 反応試薬の失 活*除去がなされる。 引き続き、 反応産物に対する加水処理も行うことができ、 最終的に、 極性非プロトン性溶媒を利用する再脱水処理工程を施すことで、 有機 塩基を含有する水溶液とともに、 アルカン酸無水物に対応するアルカン酸とパー フルォロアルカン酸、双極性非プロトン性溶媒の除去と、再脱水がなされるため、 一旦極性非プロトン性溶媒を利用する洗浄'除去操作を中間に設ける際と、 実質 的に差異を持たないものとなる。
既に説明した本発明の第一の形態と同じく、 本発明の第二の形態においても、
C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 トリプシン 消化処理を施して、 .アミノ酸長の長いべプチド鎖を断片化して、 回収された該ト リプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混合物について、 MA L D I - T O F -M S法を利用し、 該ィオン化処理で生じる陽イオン種による分子量測定、 ならぴに陰ィオン種による分子量測定を行う。
その際、 本発明の第二の形態における特徴の一つは、 前記加水処理済みの一連 の反応生成物を含む混合物に対して、 再脱水処理後、 該ゲル担体上に担持された 状態で、 かかるトリプシン消化処理の工程を行う点にある。 具体的には、 再脱水 処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、
該ゲル担体上に担持された状態で、 緩衝溶液中に溶解するトリプシンを作用さ せ、 該ペプチド鎖の N末端のァミノ基ならびに、 該ペプチド鎖に含有されている 可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基に対する上記 N—ァシル化保護が保持 されている、 該ぺプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプ チド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断によ るぺプチド断片化を行っている。
そもそも、 二次元電気泳動法や S D S— P A G E法などの、 ゲル電気泳動法に よる分子量分離に利用するゲル担体は、 一定範囲以上のアミノ酸長を有するぺプ チド鎖は、 そのゲル内の穴構造に保持する機能を有し、 電気泳動速度に明確な差 異を与えるものの、 ペプチド鎖のアミノ酸長が、 力かる閾値分子量より小さくな ると、 ゲル内の穴構造中に保持する機能は急速に失われる。 本発明の第二の形態 では、 このゲル電気泳動に利用されるゲル担体の特異性を利用して、 アミノ酸長 の長いペプチド鎖を、 そのゲル担体上に担持された状態を維持したまま、 C末端 アミノ酸を逐次的に分解除去し、 一連の反応産物を調製する工程を行った後、 ト リプシン消化処理によつてぺプチドの断片化を行うことで、.目的とする一群の C 末端側ペプチド断片を、 容易にゲル担体から溶出させ、 回収することを可能とし ている。
本発明の第二の形態でも、 このトリプシン消化処理を行う際、 前記加水処理済 みの一連の反応生成物を含む混合物では、 該ぺプチド鎖の N末端のァミノ基なら びに、 該ぺプチド鎖に含有されている可能性のあるリシン残基側鎖のァミノ基に 対する N—ァシル化保護が保持されているので、 N—ァシル化保護リシン残基の C末側ぺプチド結合の切.断は生じず、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基 の C末側べプチド結合の選択的な切断が起こる。 既に説明した通り、 該ぺプチド 鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断を行うと、 アミノ酸長の長いペプチド鎖から、 複数個のペプチド断片が生成し、 その際、 目 的とする一群の C末端側ペプチド断片は、 通常、 元のペプチド鎖の、 数分の 1の アミノ酸長となるため、 ゲル担体から遊離し、 トリプシン溶液中に溶出する。 勿 論、 トリプシン溶液中には、 その他のペプチド断片も、 同じように溶出するが、 緩衝溶液とゲル担体とを分離すると、 遊離した種々のペプチド断片は、 緩衝溶液 中に回収される。 その後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該ド リブシン消化処理済みペプチド断片を回収し、 乾燥する。
これ以降の工程、 すなわち、 回収された該トリプシン消化処理済みペプチド断 片を含む乾燥混合物について、例えば、 MA L D I— T O F— M S法を利用して、 分子量測定、 その測定結果に基づく、 C末端アミノ酸配列の決定までの操作は、 上述する本発明の第一の形態と同じである。
すなわち、 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方 法は、 多種のタンパク質を含む試料中から、 例えば、 二次元電気泳動法や S D S —P AG E法などの、 ゲル電気泳動法によって分離されたタンパク質に関しては、 そのおおよその分子量は推定できており、 仮に、 分離されたスポット （又は、 パ ンド） からかかるタンパク質を単離回収しても、 そのアミノ酸数が大きく、 上述 する、 本発明の第一の形態にかかる手法を利用して、 一群の C末端側ペプチド断 片とした上で、 分子量測定、 その測定結果に基づく、 C末端アミノ酸配列の決定 までの操作を行う必要のある場合に、予め、分離されたスポット （又は、バンド） 力^かかるタンパク質を単離回収する代わりに、 分離されたスポット （又は、 ンド） 部のゲル担体を切り出し、 ゲル担体上に保持した状態で、 一連の化学的処 理を行うものである。 予め、 分離されたスポット （又は、 パンド） からかかるタ ンパク質を単離回収する操作を省くことができ、 しかも、 単離回収工程における 回収収率に影響されることなく、 同等の確度で、 C末端アミノ酸配列の決定を実 施することが可能である。
なお、 本発明の第二の形態にかかる方法を適用する際、 対象とするペプチド試 料は、 鎖状ペプチドとし、 予.めゲル電気泳動法による分離を行い、 該ゲル担体上 に担持された状態の単一スポットとするが、 該ゲル電気泳動法は、 一次元方向に 電気泳動をなす従来の S D S— P A G E法は勿論のこと、 ゲル上で二次元的に泳 動を行い、 より高い分離を行う、 二次元泳動法を適用したものでもよい。 かかる 二次元泳動法を適用して、 分離されるペプチド試料は、 夾雑物の混入がなく、 よ り少ないサンプル量であっても、 本発明の第二の形態にかかる方法によって、 そ の C末端アミノ酸配列決定が可能となる。 また、 予めゲル電気泳動法による分離 を行う場合、 対象とするペプチド中に、 分子内におけるシスティン残基相互間で
- S - S—結合を形成するものは、 2—スルファニルェタノール (H S— C 2 H 2 — O H : 2—メルカプトエタノール）、 D T T (ジチオトレイトール： トレオー 1 , 4—ジスルファ二ルー 2 , 3—ブタンジオール） などの還元性試薬を添カロし て、 還元状態で電気泳動を行い、 単一のスポット化を行うことが好ましい。 ある いは、予め、分子内におけるシスティン残基相互間での一 S— S—結合を還元し、 さらには、 還元型のシスティンに対して、 ョード酢酸などを用いたカルボキシメ チル化などの修飾を施し、単一のスポット化を行うことが好ましい。このように、 分子内におけるシスティン残基相互間での一 S— S—結合を形成してなく、 鎖状 ペプチドとすることで、 トリプシン消化もより効率的になされる。
次に、 本発明にかかる質量分析法、 なかでも、 MA L D I—T O F— M S法に よる陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定スぺク トルの解析方法に関して、 より詳しく説明する。
本発明では、 トリプシン消化処理で生成するぺプチド断片に由来するイオン種 の分子量、 すなわち、 m/ z値の測定に、 MA L D I— T O F— M S装置を利用 することで、 高分子量のペプチド鎖に関しても、 その分子量を精度よく測定する ことを可能としている。 トリプシン消化処理を施す長いぺプチド鎖は、 その N末 端のアミノ基、 ならびに、 リシン残基側鎖のアミノ基は、 上記 N—ァシル化保護 処理で導入されるアルカノィル基が置換した状態とされているため、 アルギニン 残基の C末側ペプチド結合のみで選択的な切断を受ける。 従って、 解析対象の長 いペプチド鎖は、 含有されるアルギニン残基数と同じ個数の、 C末端にアルギニ ン残基が一つ含まれるぺプチド断片複数と、 途中にアルギェン残基を含んでいな レ、、 元のペプチド鎖の C末端側ぺ °チド断片とに分割される。 また、 C末端アミ ノ酸の逐次的な除去により調製される一連の反応産物のペプチド鎖も、 C末端に アルギェン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片複数と、 アルギニン残基 を含んでいない、 そのべプチド鎖の C末端側ぺプチド断片とに分割される。
その他に、 上述する N—ァシル化保護処理の際、 セリン残基ゃトレオニン残基 などのヒドロキシ基における 0—ァシル化保護も進行し、 加水処理において、 そ の o—ァシル化に対する脱保護も十分に進行する条件を選択するものの、 一部、 o—ァシル化に対する脱保護が達成されないものが、 少量混入することが少なく ない。 さらには、 C末端アミノ酸の逐次的な除去反応の際、 ァシル基交換反応等 の副次的反応も僅かに存在し、 利用するパーフルォロアルカン酸に由来するパー フルォロアルカノィル基が導入され、 残留するものが、 僅かな量混入することも ある。
すなわち、 上述するトリプシン消化処理で生成するぺプチド断片の混合物につ いて、 MA L D I— T O F— M S法によって、 該イオン化処理で生じる陽イオン 種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行った際、 C末端 にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片複数、 ならびに、 途中 にアルギニン残基を含んでいない、 C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一 連の C末端側ペプチド断片群が、 その主要なイオン種であるが、 上述するアル力 ノィル基が余分に置換されている対応のペプチド断片に由来するイオン種も少 量随伴することが少なくない。 あるいは、 場合によっては、 アルカノィル基に代 わり、 上述するパーフルォロアルカノィル基が置換されている対応のぺプチド断 片に由来するイオン種も僅かな量随伴することもある。
さらに、 C末端アミノ酸の逐次的な除去反応において、例えば、 下記式（V) ：
Figure imgf000072_0001
で示される、 側鎖上のカルパモイル基 （一C O— NH 2) からシァノ基 （ への変換反応や、 下記式 （V I ) :
Figure imgf000072_0002
で示される、 側鎖上のァセチルォキシ基の脱離に由来する、 セリン残基側鎖、 ト レオニン残基側鎖上での脱ヒドロキシ反応などの脱水が生じると、水分子の脱落 に相当する分子量減少が起こる。 この種の副次的な脱水反応も生じているぺプチ ド断片に由来するイオン種も少量随伴することが少なくない。 加えて、 アルカノ ィル基の余分な置換と同時に、 副次的な脱水反応も生じているペプチド断片に由 来するイオン種も少量随伴することが少なくない。
また、 トリプシン消化処理を行う際、 利用するトリプシンの g己消化産物、 す なわち、 他のトリプシンによって切断されたトリプシン由来のぺプチド断片も、 該ペプチド断片の混合物中に必然的に混入している。 なお、 トリプシンのァミノ 酸配列は既知であるため、 これらトリプシンの自己消化産物ペプチド断片に由来 するイオン種は、 いかなる分子量、 m/ z値で測定されるかは、 予め判明してい る。 勿論のことであるが、 トリプシンの自己消化産物ペプチド断片に由来するィ オン種は、 上述するアルカノィル基が置換されているイオン種が随伴することは ない。
—方、 解析対称の長いペプチド鎖から生成される主要なペプチド断片は、 C末 端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片複数、 ならびに、 途 中にアルギニン残基を含んでいない、 C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する 一連の C末端側ペプチド断片群であるが、 MA L D I— T O F— M S装置を利用 して測定される、 その主要なイオン種を考察すると、 各ペプチド断片に対して、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種と、 プロトン （H+) が離脱された陰ィ オン種とが生成でき、 測定モードを選択することにより、 陽イオン種と陰イオン 種とをそれぞれ個別に測定できる。
まず、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、共通するぺプチド断片複数は、 その断片 C末端に、 プロ トン （H+) 受容能に富むグァニジノ基を持つアルギニ ン残基が存在しており、 プロトン （H+) が付カ卩された陽イオン種の安定化が図 られる結果、 陽イオン種による分子量測定スペク トル上において、 明確なピーク 強度で観察される。 同時に、 C末端にアルギニン残基を有するものの、 プロトン (H+)供与能を示すカノレポキシ基（一 C O O H)がその C末端に存在しており、 陰イオン種による分子量測定スぺクトル上においても、 有意なピーク強度を有す る陰イオン種ピークを与える。
一方、 途中にアルギ-ン残基を含んでいない、 C末端アミノ酸の逐次的な除去 を反映する一連の C末端側ペプチド断片群は、 それら個々の量の総和は、 前記 C 末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通する各ペプチド断片の量と等しいも のの、 一連の C末端側ペプチド断片群を構成する断片個々の量は、 C末端アミノ 酸の逐次的な除去反応の段数に応じて、 相対的には少ないものとなる。 これらの C末端側ぺプチド断片群では、 元のぺプチド鎖自体の C末端側ぺプチド断片は、 偶々、 C末端にアルギニン残基が存在することはあるものの、 残る一連の反応産 物由来の C末端側ぺプチド断片群は、アルギニン残基を有することはない。また、 これら C末端側ペプチド断片群のペプチド N末端には、 プロトン （H+) 受容能 を有するァミノ基が、 C末端には、 プロトン （H+) 供与能を示すカルボキシ基 (― C O OH) がそれぞれ存在しており、 陰イオン種による分子量測定スぺクト ル上において、 有意なピーク強度を有する陰イオン種ピークを与え、 同時に、 陽 イオン種による分子量測定スペクトル上においても、 有意なピーク強度を有する 陽イオン種ピークを与える。
—方、 上述する随伴するペプチド断片由来のイオン種、 すなわち、 余分なアル カノィル基に相当する分子量が増しているイオン種、 水分子に相当する分子量の 欠落を示すイオン種、 ならびに、 水分子の欠落と余分なアルカノィル基の付加に 相当する分子量の増加を示すイオン種などは、 一般に、 前記主なペプチド断片由 来のイオン種よりもそのピーク強度は有意に小さくなる。 伹し、 これらの随伴す るペプチド断片由来の陽イオン種が、 陽イオン種による分子量測定スぺクトル上 において、 有意なピーク強度を有する際には、 陰イオン種による分子量測定スぺ クトル上でも、対応する陰イオン種のピークは、そのピーク強度は弱いとしても、 精査すれば、 その存在が確認されるはずである。 同様に、 これらの随伴するぺプ チド断片由来の陰イオン種が、 陰イオン種による分子量測定スぺクトル上におい て、 有意なピーク強度を有する際には、 陽イオン種による分子量測定スぺクトル 上でも、 対応する陽イオン種のピークは、 そのピーク強度は弱いとしても、 精査 すれば、 その存在が確認されるはずである。
加えて、 本発明においては、 トリプシン消化処理後、 脱塩処理し、 ペプチド断 片を回収し、 乾燥した後、 MA L D I— T O F— M S装置を利用して、 トリプシ ン消化処理を施して得られるペプチド断片の混合物に由来するイオン種を測定 している。 この MA L D I— T O F—M S法の特徴は、 そのイオン化過程は、 各 ペプチド断片に対して、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種と、 プロトン (H+) が離脱された陰イオン種とが生成されるものの、 さらに、 二次的なィォ ン化過程を引き起こし、 親ィオン種から大きなフラグメントが脱落した娘ィオン 種の生成は抑制されている。 この特徴をも考慮すると、 MA L D I— T O F— M S装置を利用して、 ペプチド断片の混合物について.、 測定モードを選択すること により、 陽イオン種と陰イオン種とをそれぞれ個別に測定した際、 C末端にアル ギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片複数に関しては、 各ペプチド 断片自体に由来するイオン種、 ならびに、 それと同じ部分アミノ酸配列を示す、 上記の随伴するペプチド断片由来のイオン種以外に、 例えば、 親イオン種から大 きなフラグメント （原子団） が脱落した娘イオン種が、 有意なピーク強度を示す ピークとして測定されることは回避される。 つまり、 各ペプチド断片自体に由来 するイオン種に対して、 アミノ酸残基一つ分の式量に相当する大きなフラグメン ト （原子団） が脱落した娘イオン種が、 有意なピーク強度を示すピークとして測 定される可能性は極めて低い。 一方、 途中にアルギニン残基を含んでいない、 C 末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末端側ぺプチド断片群に関し ては、 これら一連の C末端側ペプチド断片自体に由来するイオン種は、 そのピー クの m/ z値が、 アミノ酸残基何れか一つ分の式量に相当する m/ z値差で、 順 次配列されているピーク群として測定される。
本発明では、 トリプシン消化処理により断片化する際、 その特異的な切断部位 である、 リシン残基とアルギニン残基のうち、 リシン残基に関しては、 その側鎖 アミノ基を N—アルカノィル化保護した状態とすることで、 トリプシン消化はァ ルギニン残基のみで生じる形態とされている。その結果、 トリプシンを利用して、 ペプチド鎖の特異的な分断処理を行った際に得られる C末端べプチド断片は、 長 くとも、 4 0アミノ酸、好ましくは、 3 0アミノ酸を超えない範囲とされている。 従って、 目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末端側ぺ プチド断片群に由来するイオン種を、 測定された MA L D I— T O F— M S法に よる陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定スぺク トルの解析処理により特定する際、 その解析領域を、 通常、 4 0 0 0を超えない 範囲に限定することが可能である。
また、 C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末端側ペプチド断片 群に関して、 少なくとも、 C末端から 3〜4アミノ酸残基の部分配列を決定する 場合、 C末端アミノ酸の逐次的な除去がなされた最短の反応産物の C末端べプチ ' ド断片は、 少なくとも、 5〜6アミノ酸長とすることが望ましい。 従って、 一連 の C末端側ペプチド断片群に由来するイオン種の少なくとも一つは、 そのピーク の m/ z値が 5 0 0以上の範囲に、 明確なピーク強度で見出されることが望まし い。
また、 本発明にかかる MA L D I一 T O F— M S法による陽イオン種による分 子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定スぺク トルの解析方法は、 上述 する本発明の第一の形態、 または第二の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸 配列解析方法において、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を与える、 一連の C末端側ペプチド断片群に由来するイオン種を、 MA L D I— T O F— M S法による陽イオン種による分子量測定スぺク トル、 ならびに陰イオン種による 分子量測定スぺク トルの双方を相互参照しつつ、 解析することによって特定する 方法である。 その解析にあたって、 上で説明した、 C末端アミノ酸の逐次的な除 去反応とトリプシン消化処理により断片化に起因する特徴点を利用している。 先ず、 ペプチド断片の混合物について、 MA L D I— T O F— M S装置でィォ ン種の mZ z値を測定する際、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通す るペプチド断片複数、 ならびに目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映 する一連の C末端側ぺプチド断片群は、各ぺプチド断片に由来する、プロトン（H +) が付加された陽イオン種と、 プロ トン （H+) が離脱された陰イオン種とを生 成するものの、陽イオン種と陰イオン種との生成比率は、それぞれ異なっており、 陽イオン種による分子量測定スぺクトル、 または、 陰イオン種による分子量測定 スぺクトルの一方のみを利用する解析では、 明確なピーク強度を有するピークと して特定できない懸念があるため、 本発明のスぺク トルの解析方法では、 双方を 相互参照しつつ、 解析を進める。 その際、 上に説明する理由から、 該スぺクトル の解析作業は、 解析範囲を m/ z値が 4 0 0 0以下に選択しても、 通常問題とな らない。
まず、 （工程 1 ) では、 測定される MA L D I—T O F— M S法による陽ィォ ン種による分子量測定スぺクトル、 ならびに陰イオン種による分子量測定スぺク トル中には、 トリプシンの自己消化に由来するペプチド断片由来のイオン種ピー クが混入するので、 それらを特定する。 トリプシンの自己消化に由来するぺプチ ド断片は、 その C末端にリシン残基またはアルギニン残基を有している N末側の 断片群と、 C末端側の断片であるが、 その分子量は判明しており、 その既知の分 子量に基づき、 mZ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0以上の範囲において、 各ペプチド 断片に由来する、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種ピークと、 プロトン (H+) が離脱された陰イオン種ピークとを特定する。
これらトリプシンに由来するイオン種ピークは、 例えば、 mZ z値の系統的誤 差の較正を行う上で、 内部標準ピークとして利用することもできる。 さらには、 この内部標準ピークのピーク m/ z値と、 半値全幅とを参照して、 ノイズ性ピー クを除去する上での基準に利用することもできる。
次いで、 （工程 2 ) の主要なイオン種ピークの特定工程では、 トリプシン由来 のイオン種ピークを除外した後、 明確なピーク強度を示すイオン種ピークを選別 する。 具体的には、 トリプシン由来のイオン種ピークを除外すると、 残るイオン 種ピーク中では、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断 片複数、 ならびに目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C 末端側ペプチド断片群に由来するイオン種のいずれかが、 陽イオン種による分子 量測定スぺク トル、 ならびに陰イオン種による分子量測定スぺク トルにおいて、 最大のピーク強度を示すはずである。
従って、 トリプシン由来の陽イオン種ピークを除外した後、 陽イオン種による 分子量測定結果中、 最大のピーク強度を有する最大陽イオン種ピークを特定し、 該最大陽イオン種ピークのピーク強度を基準として、 その 1 Z 4 0以上のピーク 強度を有する陽イオン種ピークを選別し、 第一の陽イオン種ピーク群を形成する。 この第一の陽イオン種ピーク群は、 少なくとも、 C末端にアルギニン残基が一つ 含まれる、 共通するペプチド断片複数に由来する陽イオン種ピーク群を含むもの となる。
一方、 トリプシン由来の陰イオン種ピークを除外した後、 陰イオン種による分 子量測定結果中、 最大のピーク強度を有する最大陰イオン種ピークを特定し、 該 最大陰イオン種ピークのピーク強度を基準として、 その 1 4 0以上のピーク強 度を有する陰イオン種ピークを選別し、 第一の陰イオン種ピーク群を形成する。 例えば、 C末端アミノ酸の逐次的な除去が、最大 5アミノ酸残基となる反応条件、 時間を選択すると、 この 5アミノ酸残基が除去された反応産物の含有比率は、 1 Z 5 0程度は超えるものとなり、 従って、 この第一の陰イオン種ピーク群は、 通 常、 少なくとも、 目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C 末端側べプチド断片群のうち、 除去ァミノ酸残基数が 5以下のぺプチド断片に由 来する陰イオン種ピーク群を全て含むものとなる。
(工程 3 ) では、 先ず、 陽イオン種による分子量測定結果においては、 明確な ピーク強度を与えるものの、 対応する陰イオン種の生成比率が低く、 陰イオン種 による分子量測定結果中では、 明確なピーク強度を示さないものも存在する点を 考慮して、 明確なピーク強度を与える第一の陽イオン種ピーク群について、 その 対応する陰イオン種ピークを特定し、 第二の陰イオン種ピーク群とする。
C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するべプチド断片複数に由来す る陽イオン種ピークに随伴している陽イオン種ピーク、 すなわち、 余分なアル力 ノィル基に相当する分子量が増している陽イオン種、 水分子に相当する分子量の 欠落を示す陽イオン種、 ならびに、 水分子の欠落と余分なアルカノィル基の付カロ に相当する分子量の増加を示す陽イオン種などは、 一般に、 前記主なペプチド断 片由来の陽イオン種よりもそのピーク強度は有意に小さくなるものの、 第一の陽 イオン種ピーク群に属する場合であっても、 これら随伴している陽イオン種ピー クに対応する、 随伴している陰イオン種ピークは、 さらにピーク強度が小さく、 第一の陰イオン種ピーク群に含まれていない場合も多い。 これらの対応する、 随 伴している陰イオン種ピークは、 この第二の陰イオン種ピーク群を特定する操作 において、 有意な陰イオン種ピークであることが確認される。
次いで、 陰イオン種による分子量測定結果においては、 明確なピーク強度を与 えるものの、 対応する陽イオン種の生成比率が高くなく、 陽イオン種による分子 量測定結果中では、 明確なピーク強度を示さないものも存在する点を考慮して、 明確なピーク強度を与える第一の陰イオン種ピーク群について、 その対応する陽 イオン種ピークを特定し、 第二の陽イオン種ピーク群とする。
目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末端側ぺプチ ド断片群のうち、 その存在比率が少ないものは、 その C末端側ペプチド断片に由 来する陰イオン種ピークは、 第一の陰イオン種ピーク群に属する場合であっても、 対応する陽イオン種ピークは、 さらにピーク強度が小さく、 第一の陽イオン種ピ ーク群に含まれていない場合も多い。 これら存在比率が少ない C末端側ぺプチド 断片の対応する陽イオン種ピークは、 この第二の陽イオン種ピーク群を特定する 操作において、 有意な陰イオン種ピークであることが確認される。 さらには、 目 的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末端側べプチド断 片群に由来する陰イオン種ピークに随伴している陰イオン種ピークは、 一般に、 前記主なぺプチド断片由来の陰イオン種よりもそのピーク強度は有意に小さく なるものの、 第一の陰イオン種ピーク群に属する場合であっても、 これら随伴し ている陰イオン種ピークに対応する、 随伴している陽イオン種ピークは、 さらに ピーク強度が小さく、 第一の陽イオン種ピーク群に含まれていない場合も多い。 これらの対応する、 随伴している陽イオン種ピークは、 この第二の陽イオン種ピ 一ク群を特定する操作において、 有意な陽イオン種ピークであることが確認され る。
(工程 4 ) では、 第一の陰イオン種ピーク群と第二の陰イオン種ピーク群との 積集合、 すなわち、 陰イオン種による分子量測定スぺクトル上で明確なピーク強 度を示し、 且つ、 対応する陽イオン種も、 陽イオン種による分子量測定スぺクト ル上で明確なピーク強度で観測されている陰イオン種の群である、 第三の陰ィォ ン種ピーク群を設定する。 通常、 目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反 映する一連の C末端側ぺプチド断片群のうち、 その存在比率が大きなぺプチド断 片に由来する陰イオン種は、 この第三の陰イオン種ピーク群中に含まれる。
同時に、 第一の陰イオン種ピーク群と第二の陰イオン種ピーク群との和集合を、 第四の陰イオン種ピーク群として設定する。 この第四の陰イオン種ピーク群は、 少なくとも、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片複 数、 ならびに、 目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末 端側ぺプチド断片群に由来する陰イオン種ピークと、 それらのぺプチド断片に由 来する陰ィオン種ピークに随伴する陰イオン種ピークの多くを含むものとなる。 一方では、 第一の陽ィオン種ピーク群と第二の陽ィオン種ピーク群との積集合、 すなわち、 陽イオン種による分子量測定スぺクトル上で明確なピーク強度を示し、 且つ、 対応する陰イオン種も、 陰イオン種による分子量測定スペクトル上で明確 なピーク強度で観測されている陽イオン種の群である、 第三の陽イオ 種ピーク 群を設定する。 通常、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するぺプチ ド断片複数と、 目的とする C末端ァミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末 端側べプチド断片群のうち、 その存在比率が大きなぺプチド断片に由来する陽ィ オン種は、 この第三の陽イオン種ピーク群中に含まれる。
同時に、 第一の陽イオン種ピーク群と第二の陽イオン種ピーク群との和集合を、 第四の陽イオン種ピーク群として設定する。 この第四の陽イオン種ピーク群は、 少なくとも、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる、 共通するペプチド断片複 数、 ならびに、 目的とする C末端アミノ酸の逐次的な除去を反映する一連の C末 端側べプチド断片群に由来する陰イオン種ピークと、 それらのぺプチド断片に由 来する陽ィォン種ピークに随伴する陽イオン種ピークの多くを含むものとなる。 さらに、 前記第三の陰イオン種ピーク群中に含まれる、 各陰イオン種ピークに ついて、 最大陰イオン種ピークのピーク強度を基準として、 相対ピーク強度を算 定し、 また、 対応する各陽イオン種ピークについて、 最大陽イオン種ピークのピ ーク強度を基準として、 相対ピーク強度を算定する。 そして、 この相対ピーク強 度を相互比較した際、 対応する陽イオン種ピークが相対的により強いか、 逆に、 対応する陽ィオン種ピークが相対的により強いかを検証する。
上でも説明したように、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれるペプチド断片 では、 その断片。末端に、 プロトン （H+) 受容能に富むグァニジノ基を持つァ ルギニン残基が存在しており、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種の安定 化が図られる結果、 陽イオン種の生成比率は、 対応する陰イオン種の生成比率よ りも、 明確に高いものとなる。 一方、 アルギニン残基を含まない、 C末端側ぺプ チド断片群では、 ペプチド N末端には、 プロトン （H+) 受容能を有するァミノ 基が存在するものの、 C末端には、 プロトン （H+) 供与能を示すカルボキシ基 (- C O O H) が存在しており、 陰イオン種の生成比率は、 対応する陽イオン種 の生成比率よりも、 有意に高いものとなる。
この規範に従って、 本発明では、 第三の陰イオン種ピーク群の各ピークに対し て、 対応する各陽イオン種ピークの相対ピーク強度が 3 2以上となる陽イオン 種ピークを特定し、 第五の陽イオン種ピーク群を形成し、 一方、
対応する各陽イオン種ピークに対して、 前記第三の陰イオン種ピーク群各ピーク の相対ピーク強度が 3 Z 2以上となる陰イオン種ピークを特定し、 第五の陰ィォ ン種ピーク群を形成する。 この第五の陽イオン種ピーク群は、 少なくとも、 C末端にアルギニン残基が一 つ含まれるぺプチド断片自体に由来する陽イオン種ピークを含むものとなり、 一 方、 第五の陰イオン種ピーク群は、 少なくとも、 アルギニン残基を含まない、 一 連の C末端側ぺプチド断片群のうち、 比較的に存在比率の高い C末端側べプチド 断片に由来する陰イオン種ピークを含むものとなる。 また、 前記の主要なぺプチ ド断片自体に由来するィォン種ピークに加えて、 その随伴しているイオン種ピー クのうち、 明確なピーク強度を示すものも含まれる。 すなわち、 かかる第五の陽 イオン種ピーク群と、 第五の陰イオン種ピーク群とは、 有意な対イオン種を有す る主要なイオン種ピークを特定したものとなる。
次に、 （工程 5 ) では、 第五の陽イオン種ピーク群と、 第五の陰イオン種ピー ク群とは、 有意な対ィオン種を有する主要なィオン種ピークを特定したものとな つているが、 上述するように、 その存在比率の高い、 C末端にアルギニン残基が 一つ含まれる共通のペプチド断片複数、 ならびに、 アルギニン残基を含まない、 一連の C末端側べプチド断片群のうち、 比較的に存在比率の高い C末端側べプチ ド断片においては、 主要なペプチド断片自体に由来するイオン種ピークに加えて、 その随伴しているイオン種ピークのうち、 明確なピーク強度を示すものも含まれ ているので、 それらに随伴しているイオン種ピークを除いて、 存在比率の高い、 c末端にアルギニン残基が一つ含まれる共通のペプチド断片複数、 ならびに、 了 ルギニン残基を含まない、 一連の c末端側ペプチド断片群のうち、 比較的に存在 比率の高い C末端側ペプチド断片に由来するイオン種ピークのみを選別する。 具体的には、 上記の随伴しているイオン種ピークは、 さらに、 このイオン種ピ ークに随伴しているイオン種ピーク、 例えば、 余剰なアルカノィル基が二つ残留 しているイオン種ピークなどが存在しているとしても、 これらの二次的な随伴ィ オン種ピークの強度は、 一層小さく、 第五の陽イオン種ピーク群と、 第五の陰ィ オン種ピーク群とに含まれる可能性は、 皆無に等しい。
従って、 第五の陽イオン種ピーク群のうちから、
( 5 a - 1 ) 該ピーク m/ z値に対して、 水分子の欠失に相当する分子量 1 8小 さい mZ z値を有する陽イオン種ピーク、
( 5 a— 2 ) 該ピーク mZ z値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰に相当する分子量大きな m/Z値を有する陽イオン種ピ ーク、
(5 a— 3) 該ピーク m/z値に対して、 前記 N—ァシルイヒ保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰ならびに水分子の欠失に相当する分子量 18の減少の組 み合わせに相当する分子量の大きな m/ z値を有する陽イオン種ピーク、 前記 （5 a— l) 〜 （5 a— 3) の随伴する陽イオン種ピークのいずれかも、 第 五の陽イオン種ピーク群中に存在する 「親陽イオン種ピーク」 を選別して、 第六 の陽イオン種ピーク群とする。 この第六の陽イオン種ピーク群に含まれる陽ィォ ン種ピークは、 解析対象のペプチド鎖からトリプシン消化処理で生成され、 かつ 高い存在比率を示すペプチド断片に由来している。
同様に、 第五の陰イオン種ピーク群のうちから、
(5 b- 1) 該ピーク m/z値の対して、 水分子の欠失に相当する分子量 18小 さい mZ z値を有する陰イオン種ピーク、
(5 b— 2) 該ピーク m/z値の対して、 前記 N—ァシルイヒ保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰に相当する分子量大きな m/z値を有する陰イオン種ピ
(5 b— 3) 該ピ"ク mZz値の対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰ならぴに水分子の欠失に相当する分子量 18の減少の組 み合わせに相当する分子量の大きな m/z値を有する陰イオン種ピーク、 前記 （5 b— 1) 〜 （5 b— 3) の随伴する陰イオン種ピークのいずれかも、 第 五の陰イオン種ピーク群中に存在する 「親陰イオン種ピーク」 を選別して、 第六 の陰イオン種ピーク群とする。 この第六の陰イオン種ピーク群に含まれる陰ィォ ン種ピークは、 解析対象のぺプチド鎖からトリプシン消化処理で生成され、 かつ 高い存在比率を示すぺプチド断片に由来している。
上記の判定を行うに先立ち、 各イオン種ピーク相互の mZz値差を算定する上 で、 その基礎とする隣接ピーク間の m/z値差を算定する。 その際、 ピーク強度 が小さく、 そのイオン種ピークの m/ z値自体の決定に不確実性を含むものを排 除するとともに、 解析対象のぺプチド鎖からトリプシン消化処理で生成される、 有意なぺプチド断片に由来するイオン種ピークのみが、 後述の解析作業で対象と するので、 第四の陽イオン種ピーク群に関して、 各陽イオン種ピークの m/z値 に基づき、 隣接ピーク間の m/z値差を算定し、 また、 第四の陰イオン種ピーク 群に関して、 各陰イオン種ピークの m/z値に基づき、 隣接ピーク間の mZz値 差を算定する。
加えて、 「親陽イオン種ピーク」 とその随伴する陽イオン種ピークとを比較す ると、 一般に、 「親陽イオン種ピーク」 の相対ピーク強度は、 残る随伴する陽ィ オン種ピークの相対ピーク強度よりも大きく、 同様に、 「親陰イオン種ピーク」 とその随伴する陰イオン種ピークとを比較すると、 一般に、 「親陰イオン種ピー ク」 の相対ピーク強度は、 残る随伴する陰イオン種ピークの相対ピーク強度より も大きい。 従って、 （工程 6) では、 前記の相対ピーク強度の対比を行って、 前 記第六の陽イオン種ピーク群の各ピークについて、 「親陽イオン種ピーク」 に相 当するものを選別し、 第七の陽イオン種ピーク群とし、 同様に、 前記第六の陰ィ オン種ピーク群の各ピークについて、 「親陰イオン種ピーク」 に相当するものを 選別し、 第七の陰イオン種ピーク群とする。
例えば、 （5 a— l) 〜 （5 a— 3) の随伴する陽イオン種ピークのいずれも 力 S、 第五の陽イオン種ピーク群に含まれる場合、 これら （5 a— 1) 〜 （5 a— 3) の随伴する陽イオン種ピークも、 第六の陽イオン種ピーク群に含まれること になる。 しかしながら、 上述する相対ピーク強度の対比を行うことで、 （5 a— 1) 〜 （5 a— 3) の随伴する陽イオン種ピークを除去して、 「親陽イオン種ピ ーク」 に相当するもののみ、 すなわち、 解析対象とするペプチドに由来するぺプ チド断片自体の陽イオン種ピークのみを選別することが可能となる。 同じく、
(5 b— 1) 〜 （5 b— 3) の随伴する陰イオン種ピークのいずれもが、 第五の 陰イオン種ピーク群に含まれる場合、 これら （5 b— l) 〜 （5 b— 3) の随伴 する陰イオン種ピークも、 第六の陰イオン種ピーク群に含まれることになる。 し かしながら、 上述する相対ピーク強度の対比を行うことで、 （5 b— 1) 〜 （5 b-3) の随伴する陰イオン種ピークを除去して、 「親陰イオン種ピーク」 に相 当するもののみ、 すなわち、 解析対象とするペプチドに由来するペプチド断片自 体の陰ィオン種ピークのみを選別することが可能となる。
前記第七の陽イオン種ピーク群は、 主に、 C末端にアルギニン残基が一つ含ま れ、 かつ解析対象とするぺプチド鎖に由来するべプチド断片自体の陽ィオン種ピ ークを含んでいる。 その際、 たまたま、 解析対象とするペプチド鎖自体の C末端 にアルギユン残基が存在する場合には、 トリプシン消化によって生成する、 C末 端にアルギニン残基が一つ含まれる C末端側ペプチド断片に由来する陽イオン 種ピークも、 C末端にアルギニン残基が一つ含まれる他のペプチド断片に由来す る陽ィオン種ピークと同様に、 該第七の陽ィオン種ピーク群に含まれることにな る。
一方、 かかる C末端にアルギニン残基が一つ含まれる C末端側ぺプチド断片は、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の C末端側ぺプチド断 片を伴っているが、 トリプシン消化によって生成する他のペプチド断片は、 c末 端ァミノ酸の逐次的分解を受けた反応産物由来の c末端側べプチド断片を伴つ ていない。 また、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の C 末端側ペプチド断片は、 通常、 対応する陰イオン種ピークの相対ピーク強度が優 つており、 陰イオン種による分子量測定スペクトル上 ίこ、 かかる対応する陰ィォ ン種ピークが見出されるはずである。
その観点から、 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する、 前記第七の陽イオン 種ピーク群の各陽イオン種ピークに対応する陰イオン種ピークを選別し、 第八の 陰イオン種ピーク群を形成し、 この対応する陰イオン種ピークが、 C末端アミノ 酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の C末端側ぺプチド断片に由来する 陰イオン種ピークを伴っている力、 否かを検討する。 具体的には、 第八の陰ィォ ン種ピーク群に含まれる各陰ィオン種ピークに対して、 C末端ァミノ酸の逐次的 分解に起因して、天然の鎖式 α—アミノ酸残基：一 NH— C H (R)— C O— (R は、 該アミノ酸残基の側鎖を示す） あるいは、 該側鎖上のヒドロキシ基、 ァミノ 基に対して、 上記 N—ァシル化保護に利用されるァシル基が置換してなるァシル 化保護 α—アミノ酸残基の式量に相当する mZ z値差を示す、 陰イオン種ピーク が存在するか否かを検討する。 この検討は、 第八の陰イオン種ピーク群に含まれ る各陰イオン種ピークに対して、 ピーク間の mZ z値差が 2 0 0より小さな範囲 に見出される、 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する陰イオン種ピークの群を 選別し、 例えば、 N—ァシルイヒ保護に利用されるァシル基が、 ァセチル基である 場合には、 下記表 1に示す式量に相当する、 ピーク間の mZ z値差を有する陰ィ オン種ピークの有無を検証する。
表 1
Figure imgf000085_0001
これらのァミノ酸残基の式量に相当する mZ z値差を示す、 陰ィオン種ピーク を伴っていないことを確認した上で、角牟析対象とするペプチドに由来するぺプチ ド断片であって、 トリプシン消化処理で生成する、 そのペプチド鎖 C末端にアル ギニンを有するペプチド断片の陰イオン種ピーク群と判定する。
なお、 上記表 1に示すアミノ酸残基の式量に相当する m/ z値差は、 主要な C 末端側ペプチド断片に由来する陰イオン種ピークでは、 本発明の C末端アミノ酸 の逐次的分解過程では、 N—ァシル化保護過程において、 セリン、 トレオニンの 側鎖のヒドロキシ基に対しても、 O—ァシル化がなされているが、 トリプシン消 ィ匕に先立つ、 加水処理工程において、 かかるセリン、 トレオニンの側鎖のヒドロ キシ基に対する O—ァシル化は、 脱保護されるため、 対応する o—ァシル化され たァミノ酸残基の式量に相当する m/ z値差を示す陰ィオン種ピークは、 随伴す る陰イオン種ピークとして測定される結果、 O—ァシル化されたアミノ酸残基の 式量は含めていない。 伹し、 ヒスチジン残基に N—ァシルイ匕されたもの、 チロシ ン残基に 0—ァシル化されたものは、 加水処理工程において、 十分に脱保護を受 けず、 主要な C末端側べプチド断片に由来する陰イオン種ピークに相当量混入す る可能性を残すものではある。 逆に、 本発明では、 加水処理工程において、 リシ ン残基に N—ァシル化保護されたものは、 脱保護を受けない条件を選択し、 加え て、 仮に、 N—ァシル化保護の脱保護がなされたリシン残基においては、 その C 末側ペプチド結合において、 トリプシン消化を受ける結果、 通常、 主要な c末端 側ぺプチド断片に由来する陰イオン種ピーク相互で、 その m/ Z値差がリシン残 基の式量に相当することはない。 また、 本発明の C末端アミノ酸の逐次的分解過 程では、 プロリン残基の除去は本来生じないので、 当然に、 上記表 1には、 プロ リン残基の式量に相当するものは含まれない。
一方、 第七の陰イオン種ピーク群には、 一般に、 少なくとも、 解析対象とする ぺプチド鎖に由来する C末端側ぺプチド断片自体の陰イオン種ピークが含まれ ている。 その際、 解析対象とするペプチド鎖の c末端側ペプチド断片は、 C末端 ァミノ酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の c末端側ぺプチド断片を伴 つており、 これらの陰イオン種ピークの主なものも、 同様に該第七の陰イオン種 ピーク群に含まれることになる。
しかしながら、 一連の反応産物に由来する C末端側ペプチド断片のうち、 その 存在比率が低いもの、 例えば、 C末端アミノ酸の逐次的分解段数が多いものは、 かかる C末端側べプチド断片に由来する陰イオン種ピークは観測されているも のの、 対応する陽イオン種ピークは、 ノイズレベルであり、 特定されていない場 合もある。
(工程 8 ) では、 第七の陰イオン種ピーク群の各陰イオン種ピークが、 C末端 ァミノ酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の C末端側ぺプチド断片に由 来する陰イオン種ピークを伴っている力、 否かを検討する。 この検討は、 第七の 陰ィオン種ピーク群に含まれる各陰ィオン種ピークに対して、 ピーク間の z 値差が 2 0 0より小さな範囲に見出される、 第四の陰イオン種ピーク群中に存在 する陰イオン種ピークの群を選別し、 例えば、 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基が、 ァセチル基である場合には、 上記表 1に示す式量に相当する、 ピーク 間の m/ z値差を有する陰ィオン種ピークの有無を検証する。
検証の結果、 アミノ酸残基の式量に相当する mZ z値差を示す、 陰イオン種ピ ークを伴っていることを確認した上で、 第九の陰イオン種ピーク群を形成する。 その際、 第七の陰イオン種ピーク群には含まれないが、 一連の反応産物由来の C 末端側べプチド断片に由来する陰イオン種ピークと推定される、 陰ィォン種ピー クと、 前記第九の陰イオン種ピーク群との和集合を形成し、 第十の陰イオン種ピ ーク群とする。 この第十の陰イオン種ピーク群は、 C末端アミノ酸の逐次的分解 に伴う、 一連の反応産物由来の C末端側ぺプチド断片に由来する陰イオン種ピー クの列を含有している。 この一連の陰イオン種ピークの列では、 m/ z値が最大 の陰イオン種ピークを選択し、 引き続き、 各ピーク間の mZ z値差が上記アミノ 酸残基の式量に相当する mZ z値差を示す陰イオン種ピークの列を、 該第十の陰 イオン種ピーク群中より順次特定することができる。
最終的に、 （工程 9 ) では、 （工程 8 ) において選択された一連の陰イオン種ピ ークの列に基づき、 それらのピーク間の m/ z値差が、 上記アミノ酸残基の式量 に従っていること、 つまり、 C末端より逐次的に分解されている部分アミノ酸配 列を反映することを再確認して、 一連のスペクトル解析作業を終了する。
上記のスぺクトルの解析工程では、 MA L D I—T O F—M S法による陽ィォ ン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定スぺクトルのピー ク m/ z値と、 ピーク強度を利用するが、 この MA L D I—T O F— M S装置で は、 一般に、 検出器に入射するイオン数の積算 （積分） を行い、 対応する m/ z 値 （積分微小区間） に対して、 デジタルィヒプロットしている。 従って、 見かけの ピーク強度、 該ピーク mZ z値の決定と、 その見かけの半値全幅を簡便に算定す ることができる。 一方、 スペクトル上には、 スパイク状のノイズ信号が重畳され ることも少なくない。 解析に先立ち、 かかるスパイク状のノイズ信号を除去する ことが望ましい。 実際の信号ピークか、 ノイズ性のピークかを判定する基準とし て、 ノイズ性のピークでは、 その見かけの半値全幅が、 実際の信号ピークと比較 して、 極端に狭いことを利用することが可能である。 例えば、 前記 （工程 1) の トリプシン由来の内部標準ピークの特定工程後、 トリプシンの自己消化に由来す るペプチド断片によるイオン種ピークについて、 見かけの半値全幅を算出し、 こ の値を基準幅として、 該基準幅と比較して、 見かけの半値全幅が極端に狭いピー クは、 ノィズ性のピークと判定することも可能である。
また、 MALD I—TOF— MS装置の測定機構上、 システマチックなピーク 広がりを示すことが多い。 トリプシンの自己消化に由来するペプチド断片による イオン種ピークを利用して、 システマチックなピーク広がりを評価し、 該ピーク 形状の非対称性と、積分ピーク強度とを保持可能なスムージング処理を施した上 で、 実際の信号ピークについて、 そのピーク強度、 該ピーク mZz値の決定を行 うことが好ましい。
これらノイズ性ピークを除去する処理、 スムージング処理は、 MALD I— T OF— MS法による陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分 子量測定スぺクトノレには、 本発明ではトリプシン由来の内部標準ピークが存在し ているので、 これらを参照して、 双方のスペク トルに対して、 同等に行うことが 可能である。
加えて、 MALD I— TOF— MS装置の測定機構上、 システマチックなピー ク広がりに加えて、 ピーク m/z値にも系統的誤差を有する場合もある。 解析に 先立ち、 かかる m/Z値の系統的誤差の補正を施すことが望ましい。 この mZz 値の系統的誤差の補正も、 前記 （工程 1) のトリプシン由来の内部標準ピークの 特定工程後、 トリプシンの自己消化に由来するペプチド断片によるイオン種ピー クを利用して行うことが可能である。
本発明にかかる MALD I—TOF— MS法による陽イオン種による分子量 測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定スペク トルの解析方法では、 上述す るように、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の C末端側 'ぺプチド断片に由来する主要な陰ィオン種ピークの列を特定することを目的と するが、 その解析過程で、 これら主要な陰イオン種ピークに随伴する陰イオン種 ピークをも特定している。 具体的には、. （工程 5) において、 「親陰イオン種ピー ク」 に対して、
( 5 b— 1 ) 水分子の欠失に相当する分子量 1 8小さい mZ z値を有する陰ィォ ン種ピーク、
( 5 b— 2 ) N—ァシル化保護に利用されるァシル基の式量分の余剰に相当する 分子量大きな m/ z値を有する陰イオン種ピーク、
( 5 b— 3 ) N—ァシル化保護に利用されるァシル基の式量分の余剰ならぴに水 分子の欠失に相当する分子量 1 8の減少の組み合わせに相当する分子量の大き な mZ z値を有する陰イオン種ピーク、
前記 （5 b— 1 ) 〜 （5 b _ 3 ) の随伴する陰イオン種ピークの特定がなされて いる。 従って、 陰イオン種による分子量測定スペク トルに関して、 C末端アミノ 酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の C末端側ぺプチド断片に由来する 主要な陰イオン種ピークの列に加えて、 それらに随伴する陰イオン種ピークの帰 属も同時に行われる。
さらには、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う、 一連の反応産物由来の C末端 側ペプチド断片に由来する主要な陰イオン種ピークの列の特定に付随して、 それ 以外の、 トリプシン消化で生成する主要な陰イオン種ピーク群、 それに随伴する 陰イオン種ピークの帰属も可能となる。 最終的には、 陽イオン種による分子量測 定スぺクトルにおける、 主要な陽イオン種ピークとの対応をも確認されており、 MA L D I— T O F— M S法による陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰ィ オン種による分子量測定スぺク トルの双方の解析がなされたこととなる。
質量分析スペクトルから、 C末端のアミノ酸配列を決定する際に、 解析対象と なるペプチドに由来するピークの特定と、 その帰属を進める手順の一例を示す。 下記する説明では、
ペプチド N末端のァミノ基ならびに、 ペプチドに含有されている可能性のある リシン残基側鎖のアミノ基に対して、 アルカン酸無水物由来のァシル基による N 一了シル化を施す、 N—ァシル化保護を施す前処理工程と、
穏和な条件で、 アルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸少量とを組み合わ せた反応試薬を利用し、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000090_0001
(式中、
R 1は、 ぺプチドの C末端ァミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端ァミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を一旦形成し、該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴 い C末端アミノ酸の分解を行う工程と、
アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬 を除去 ·不活性化後、 残余する前記 5—ォキサゾロン構造の開環による C末カル ボキシ基の再生を図る、 加水処理を行う工程と、
加水処理後、 トリプシン消化により、 ペプチド鎖をアルギニン残基部位で選択 的に断片化を行って、 トリプシン消化済べプチド断片を得る工程を施した後、 例えば、 MA L D I一 T O F— M S装置により測定される、 陰イオン種検出モー ドで測定した質量分析スペク トル、 ならびに、 陽イオン種検出モードで測定した 質量分析スぺクトル上に出現する一価イオン種ピークのうち、 対象のペプチド鎖 に起因するイオン種ピークの帰属における判断基準と、 その判断プロセスを示す。 なお、 具体的な条件として、 N—ァシル化保護を施す前処理工程ならびに C末端 アミノ酸の分解を行う工程で利用するアルカン酸無水物は、共に、無水酢酸（（C H 3 C O) 2 O) であり、 パーフルォロアルカン酸は、 トリフルォロ酢酸 （C F 3 C O O H) を利用する場合を想定して、 説明を行う。
上述する条件において理想的な処理が進むと、 N—ァセチル化保護を施す前処 理工程、 C末端アミノ酸の分解を行う工程、 その後の加水処理を行う工程が終了 した時点では、 N末端アミノ基とリシン残基側鎖のァミノ基とでは、 N—ァセチ ルイ匕が保持されており、 それ以外の、 セリン残基側鎖のヒドロキシ基、 トレオニ ン残基側鎖のヒドロキシ基、 チロシン残基側鎖上のフエノール"生ヒドロキシ基等 に対して、 付随的に生じている O—ァセチルイ匕保護は、 全て脱保護されており、 同時に、 C末端の 5—才キサゾ口ン構造から C末端力ルポキシ基の再生がなされ る。
し力、しながら、 実際に得られる C末端アミノ酸の逐次的な分解産物中には、 主 に、 C末端アミノ酸の分解を行う工程、 その後の加水処理を行う工程における、 副次的な反応に由来する副産物が混入する。
加水処理において、 セリン残基側鎖のヒ ドロキシ基、 トレオニン残基側鎖のヒ ドロキシ基に対して、 付随的に生じている o—ァセチル化保護の脱保護が不足す ると、 これらアミノ酸残基上に余剰のァセチル基置換を有する副産物となる。 一 方、 加水処理に際して、 C末端の 5—ォキサゾロン構造から C末端カルボキシ基 の再生が達成されないと、 C末端に 「脱水」 がなされた状態の副産物となる。
C末端アミノ酸の分解を行う工程においては、
例えば、 下記式 (V) ：
Figure imgf000091_0001
で示される、 側鎖上のカルパモイル基 （一 C O— NH 2) からシァノ基 （一 C N) への変換反応に由来する、ァスパラギン残基側鎖、グルタミン残基側鎖上での「脱 水」 ；あるいは、 下記式 （V I ) :
Figure imgf000092_0001
で示される、 側鎖上のァセチルォキシ基の脱離に NH由来する、 セリン残基側鎖、 ト レオニン残基側鎖上での 「脱水」 などが生じている副 HN産物も生成する。
—方、 N—ァセチル化保護を施す前処理工程、 C末端アミノ酸の分解を行うェ 程において、 チロシン残基側鎖上のフエノール性ヒドロキシ基、 ヒスチジン残基 側鎖上のイミダゾーノレ環上のイミノ窒素 （一N H—） に対しても、 ァセチル化が 進行すると、 加水処理に際して、 脱保護は十分には進まず、 これらアミノ酸残基 上に余剰のァセチル基置換を有する副産物となる。
従って、 実際の反応産物では、
(i) 理想的な反応産物；に加えて、 しばしば、
(ii) 余剰なァセチル化を受けている付随的な産物；
(iii) 「脱水」 を受けている付随的な産物；
(iv) 「脱水」 を受け、 更に、 余剰なァセチル化を受けている付随的な産物；が 付随的に生成している。
その他、 ァセチル基に代えて、 トリフルォロ酢酸に由来するトリフルォロアセ チル基が導入されると、 十分な脱保護がなされず、 余剰なトリフルォロアセチル 化を受けている付随的な産物も、 僅かに共存する場合もある。 従って、
( v ) 佘剰なトリフルォロアセチルイヒを受けている付随的な産物；
(vi) 「脱水」 を受け、 更に、 余剰なトリフルォロアセチル化を受けている付随 的な産物も僅かに共存する場合もある。
なお、 C末端アミノ酸の分解を行う工程においては、 従来の反応条件では、 G 1 y - G 1 yの間、 A s pの C末側、 特には、 A s p - P r oの間、 S e rと T h rの N末側の各部位などにおいて、 ある頻度で開裂反応が進行するが、 本発明 では、 この C末端アミノ酸の分解を行う工程に対して、 ペプチド鎖の途中での開 裂反応を有効に抑制する反応条件を設定するため、 便宜上、 反応産物中には、 ぺ プチド鎖の途中での開裂反応が生じた後、 更に、 そのペプチド断片の C末端アミ ノ酸が逐次的な分解を受けた予定外の副産物は、 以下の考慮からは除外する。 本発明では、 N—ァセチル化保護を施す前処理工程、 C末端アミノ酸の分解を 行う工程において、 前記 （V ) ならびに （vi) の付随的な産物の生成を有効に回 避する条件を選択するものの、 （i) 理想的な反応産物に加えて、 （ii)〜 （iv) の 付随的な産物に関しては、 しばしばある程度の量が存在する。 質量分析スぺタト ルの測定に先立ち、 N末端アミノ基とリシン残基側鎖のァミノ基とは、 N—ァセ チル化が保持されている反応産物を、 トリプシン消化により、 ペプチド鎖をアル ギニン残基部位で選択的に断片化を行う結果、 N末側断片： N末ァミノ基にァセ チル化がなされ、 C末のアミノ酸はアルギェンである断片；両端がトリプシン消 化で生成される中間部の断片： N末ァミノ基はァセチル化がなされてなく、 C末 のアミノ酸はアルギユンである断片；ならびに、 C末側断片群： N末アミノ基は ァセチル化がなされてなく、 C末のアミノ酸配列は逐次的な分解を受けている一 連の断片群とされている。
本発明では、 C末端アミノ酸の分解を行う工程においては、 便宜上、 ペプチド 鎖の途中での開裂反応は考慮から除外すると、 十分なトリプシン消化時間を設定 すると、 元のペプチドから得られるペプチド断片に関して、 前述の c末側断片群 の総和は、 N末側断片、 ならびに中間部の断片それぞれと、 概ね同数となる。 加 えて、 これらのペプチド断片は、 上述するように、 （i) 理想的な反応産物に加え て、少なくとも、 （ii)〜（iv)の付随的な産物を伴っている可能性が高いものの、 これら （i ) 〜 （iv) の四種の反応産物間の存在比率は、 必ずしも一定しておら ず、 個々のペプチド断片毎、 そのアミノ酸配列、 反応条件に依存して変化する。 例えば、 余剰なァセチルイ匕を受けることが可能なアミノ酸残基が存在しない場合 には、 （ii) ならびに （iv) の付随的な産物は、 全く生成しないものとなる。 カロ えて、 例えば、 MA L D I— T O F— M S装置により測定する際、 各ペプチド断 片に由来する陰イオン種と陽イオン種の生成効率も、 個々のペプチド断片のアミ ノ酸配列、ァミノ酸残基に対する修飾の相違、ィオン化条件などに依存しており、 陰イオン種検出モードで測定した質量分析スぺクトル、 ならびに、 陽イオン種検 出モードで測定した質量分析スぺクトル上に出現する一価イオン種ピークにお いて、 （i ) 〜 （iv) の四種の反応産物に由来するイオン種のうち、 有意な強度 を有するピークとして観測されないものも存在する。 例えば、 そもそも、 存在比 率が低い上に、 陽イオン種の生成効率が極端に大きい場合には、 陰イオン種検出 モードで測定した質量分析スぺク トル上では、 対応する陰イオン種は、 有意な強 度を有するピークとして観測されないものとなる。
以下に、 上述するような、 場合によって起こる、 種々な状況を可能な限り考慮 に入れて、 （i ) 〜 （iv) の四種の反応産物に由来するイオン種のうち、 その一 部のみが観測にかかる場合であっても、 より確実に、 （i ) 〜 （iv) の四種の反 応産物に由来するイオン種のうち、 有意な強度を有するピークの帰属を図る手順 の一例を示す。
(ステップ 0 ) スぺクトル上のピーク認識工程
測定された陰イオン種検出モードのスペクトル、 ないしは、 陽イオン種検出モ ードスペクトル上において、 ピークを認識し、 その見かけ上のピーク位置 （mZ Z) ならびに、 ピーク強度の読み取りを行う。
なお、ぺプチド由来のイオン種ピークは、一般に、構成原子の同位体、例えば、 1 2 Cに対して1 3 Cを含む同位体ピークを伴っている力 その強度比率は、概ね一 定である。具体的には、軽原子のみで構成されるイオン種の主なピークに対して、 質量数が 1づっ増す複数個の同位体ィオン種は存在するものの、 同位体ピークは、 1 2 Cに対する1 3 Cの天然存在比率にほぼ比例して、質量数差が 1、 2、 3と増す につれ、 等比級数的にその強度は減少する。
認識される各ピークに関して、 前記の仮定に基づき、 質量数差が 1、 2、 3と 増す同位体ピークの強度を算出し、ピーク位置（mノ Z )が質量数 1増す位置に、 同位体ピークと重複して、 他のイオン種に起因するピークが存在する際には、 そ の見かけ上のピーク強度に対して、 補正を施す。 これらの補正を含め、 認識され る各ピークに関して、 ピーク形状のフィット操作を施し、 軽原子のみで構成され るイオン種の認識、 ピーク位置 （mZZ) ならびに、 ピーク強度の読み取りを行 う。
軽原子のみで構成されるイオン種に起因する各ピークは、ピーク位置（mZZ) 順に、 P iと呼ぶことにする。
認識した全てのピークの集合： A A≡ {P i I f o r v i }
(ステップ 1) トリブシン自己消化由来の断片イオン種ピークの除去 トリプシン消化の工程では、 用いる酵素タンパク質トリプシンの自己消化に起 因する、 ペプチド断片も形成される。 このトリプシン自己消化断片に由来するィ オン種ピークのピーク位置は、 予め判明しているので、 ピーク集合 Aから、 トリ プシン自己消化断片に由来するイオン種ピークの集合 A tを除去し、 ペプチド由 来のイオン種ピークの集合 APとする。
トリプシン自己消化由来のピーク集合： At
ぺプチド由来のイオン種ピークの集合： AP≡A\At
なお、 トリプシン自己消化断片に由来するイオン種ピークのピーク位置は、 図 9にその一覧を示す。
(ステップ 2) ピーク間距離の算出
集合 Apに含まれるピークについて、 全てのピーク間の距離を計算する。
ピーク P 5と P jの間の距離 （Δπι/Ζ) ： d i〗
なお、 ステップ 0において、 ピーク位置 （m/Z) 順に、 Piを並べてあり、 隣接するピーク間 Piと Pi + 1間の距離： d i i + 1を算出した上で、 dij = {d i { + 1+ · - +d として、 算出する手法を採用することが望ましい。
(ステップ 3) 解析対象の m/Z範囲の特定
サブステップ 3—1 ピーク強度が閾値以上の有意なピークの選択
解析の対象である C末側断片群、 N末側断片、 ならびに中間部の断片のそれぞ れは、 （i) 〜 （iv) の四種の反応産物に由来するイオン種のうち、 少なくとも 一つは、 スペク トル上で有意なピークを示すことが、 後述の解析において必須な 要件となる。 ピークの集合 APにおいて、 最大のピーク強度を有するピークを選別し、 その ピーク強度を IMAXとする。 この IMAXを基準として、 閾値ピーク強度 I thを設 定する。少なくとも、閾値ピーク強度 I thを、 I MAXの 1/40以上に設定する。 ピークの集合 APにおいて、 ピーク強度が、 前記閾値 I th以上のピークを選別 して、 メインピーク集合 Mを構成する。
i f ピーク P iの強度 I； > I th → P i e M
サブステップ 3— 2 解析対象の mZZ範囲の特定または再設定
C末端よりアミノ酸残基数として、 7残基程度が逐次的に分解されている C末 側断片群の解析を目標とする際、 その間の質量数差は、 通常、 600〜1200 の範囲にあると推定される。
この点を考慮して、 メインピーク集合 Mに含まれるピーク中、 最大のピーク位 置 （m/Z) を有するピーク PMmaxと、 最少のピーク位置 （mZZ) を有するピ ーク PMminとを選択する。 ピーク PMmaxとピーク PMminと間の距離（ΔιηΖΖ) について、 質量数差が、 少なくとも 600を超えていることを確認する。
ピーク PMmaxとピーク PMrainと間の距離 （Am/Z) について、 質量数差が 前記の要件を満たさない場合は、 サブステップ 3— 1における、 閾値 I thをより 小さな値に設定して、 メインピーク集合 Mの選別をやり直し、 かかる要件を満足 させる再設定を行う。
最終的に解析対象の m/Z範囲は、ピーク PMmaxのピーク位置（mmax)より、 質量数 100大きな m/Zを上限とし、 下限は、 ピーク PMminのピーク位置 （m min) よりも質量数 100小さな m/Z、 あるいは、 ピーク PMmaxのピーク位置
(mmax) より、 質量数 1000小さな m/Zのいずれか小さな値に設定する。 ピークの集合 APにおいて、 ピーク位置が、 ここで設定される解析対象の m/Z 範囲に含まれるピークを選び出し、 ピークの集合 S。を構成する。 以下の解析で は、 メインピーク集合 Mと、 それを含む解析対象ピークの集合 S。の要素ピーク を解析の対象とする。
但し、メインピーク集合 Mに含まれる、一価のイオン種ピーク；陽イオン種（m + 1/1) や陰イオン種 （m— 1ノ1) に対応する、 二価のイオン種ピーク ；ニ 価陽イオン種 （m+SZS) や二価陰イオン種 （!11—2/2) は、 ！!^^/^〜 mra i n / 2の範囲に出現する可能性がある。前記角率析対象ピークの集合 S。のうち、 メインピーク集合 Mに含まれる、一価のイオン種ピークに対応する、 二価のィォ ン種ピークに相当するピークの有無を予め確認する。 具体的には、一価のイオン 種ピークに対応する、 二価のイオン種ピークはその存在比率は、 大幅に小さくな る、 あるいは、 二価のイオン種ピークは見出されないことも少なくないので、 こ れを考慮の上で、 二価のイオン種ピークに相当するピークの有無を予め確認する。
(ステップ 4 ) ( i ) 〜 （iv) の四種の反応産物のトリプシン消化ペプチド 断片由来するイオン種ピークの分類と帰属
上述するように、 実際の反応産物では、
(i) 理想的な反応産物；に加えて、 しばしば、
(ii) 余剰なァセチル化を受けている付随的な産物；
(iii) 「脱水」 を受けている付随的な産物；
(iv) 「脱水」 を受け、 更に、 余剰なァセチノレ化を受けている付随的な産物； が付随的に生成していることが少なくない。 但し、 トリプシン消化を施して得ら れる、 C末側断片群、 N末側断片、ならびに中間部の断片を考慮すると、例えば、 余剰なァセチルイヒを受けるアミノ酸残基は、 N末側断片には存在するが、 C末側 断片群には、 そもそも存在していないなど、
各べプチド断片のァミノ酸配列に応じて、 個々のぺプチド断片においても、
( i ) 理想的な産物：余剰なァセチル化を受けているアミノ酸残基ならびに 「脱 水」 を受けているアミノ酸残基を有していないペプチド断片；
(ii) 余剰なァセチル化を受けているアミノ酸残基を含むが、 「脱水」 を受けて レ、るアミノ酸残基を有していないペプチド断片；
(iii) 「脱水」 を受けているアミノ酸残基を含むが、 余剰なァセチル化を受けて いるアミノ酸残基を有していないペプチド断片；
(iv) 余剰なァセチルイ匕を受けているアミノ酸残基ならびに 「脱水」 を受けてい るアミノ酸残基を有しているペプチド断片；
上記の四種のうち、 その一部し力 4辱られない場合もある。
なお、 上で説明したように、 ァセチル基に代えて、 トリフルォロアセチル基が 導入されているペプチド断片も想定されるが、 その存在頻度は、 十分に低いと推 定されるので、 ここでは、 考慮から除外する。
従って、 トリプシン消化されたペプチド断片由来するイオン種ピーク中に、 同 一のアミノ酸配列からなる、 前記四種の状態のぺプチド断片に起因するイオン種 ピークのレ、ずれが出現している力 分類と帰属を行う手順の一例を示す。
上述する （i) 〜 （iv) の四種の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピー クの集合を、 それぞれ、
S (0) ： ( i ) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合； S ( + Ac) ： (ii) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合； S (― H20) ： (iii) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合； S ( + Ac, -H20) ： (iv) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピーク の集合； と定義する。
( i) 〜 （iv) の四種の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークは、 表 2に示すように、 同一のアミノ酸配列からなり、 互いに近接する、 各一組のピー ク群を構成する可能性がある。 表 2
(i) 〜 （iv) の四種の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピーク副反応 により生じる特異的なピークシフトの値
Figure imgf000098_0001
なお、 上述する表 1に示す C末ァミノ酸の逐次的分解反応に付随する分子量減 少には、 これら 18、 24、 42、 60に相当するものは存在していない。
スぺクトル上に、 前記 （i) 〜 （iv> の四種の状態のペプチド断片に起因する イオン種ピークのいずれが出現しているかを分類すると、 下記の 15に分類され る。
1. (i) 〜 （iv) の四種のピークが観測されている ；
2. ( i)、 （ii)、 (iii) の三種のピークが観測されている ：余剰なァセチルイ匕な らびに 「脱水」 の確率が低く、 双方が生じている （i V) のピークは、 測定限界 以下の場合、 あるいは、 式 （V I) のような 「脱水」 過程での、 中間体に相当す る余剰なァセチル化体と 「脱水」 体の双方が含まれている場合；
を受けているアミノ酸残基を有している
3. (i)、 （ii)、 (iv) の三種のピークが観測されている ：余剰なァセチルイ匕体 が主となっており、 余剰なァセチル化体に 「脱水」 がなされたものは、 観測にか かるが、元々少量しか残留していない理想的な断片に「脱水」がなされたものは、 測定限界以下の場合；
4. ( i)、 (iii), (iv) の三種のピークが観測されている ： 「脱水」 体が主とな つており、 「脱水」 体に余剰なァセチルイ匕がなされたものは、 観測にかかるが、 元々少量しか残留していな 、理想的な断片に余剰なァセチル化がなされたもの は、 測定限界以下の場合；
5. (ii)、 (iii), (iv) の三種のピークが観測されている ： 「脱水」 体と余剰な ァセチルイヒ体がともに主となっており、 これら副次的反応が生じていない理想的 な断片は、 測定限界以下の場合；
6. (i)、 (ii) の二種のピークが観測されている ：余剰なァセチルイ匕が生じる アミノ酸残基は存在するが、 「脱水」 が生じるアミノ酸残基は元々含まれていな い場合；
7. (i)、 (iii) の二種のピークが観測されている ： 「脱水」 が生じるアミノ酸 残基は存在するが、 余剰なァセチルイヒが生じるアミノ酸残基は元々含まれていな い場合、 あるいは、 余剰なァセチル化が生じるアミノ酸残基、 「脱水卜が生じる アミノ酸残基は存在していないが、 C末端の 5—ォキサゾロン構造の加水が完了 していないものが残留している場合；
8. (ii), (iv) の二種のピークが観測されている ：余剰なァセチルイ匕体が主と なっており、余剰なァセチノレ化体に「脱水」がなされたものは、観測にかかるが、 理想的な断片、 「脱水」 体は、 測定限界以下の場合；
9. (ii)、 (iii) の二種のピークが観測されている：余剰なァセチル化が生じる アミノ酸残基は存在していないものの、 式 （V I) のような 「脱水」 過程が高い 頻度で進行しており、 さらに、 その中間体に相当する余剰なァセチル化体に対す る加水処理が十分でなく、 理想的な断片に再生されたものが極僅かで、 測定限界 以下の場合；
10. (i)、 (iv) の二種のピークが観測されている ：
1 1. (iii), (iv) の二種のピークが観測されている ：「脱水」 体が主となって おり、 「脱水」 体に余剰なァセチル化がなされたものは、 観測にかかるが、 理想 的な断片、 余剰なァセチル化体は、 測定限界以下の場合；
12. ( i ) のピークのみが観測されている：元々、 余剰なァセチル化が生じる アミノ酸残基、 「脱水」 が生じるアミノ酸残基が存在していない場合：
13. (ii) のピークのみが観測されている：「脱水」 が生じるアミノ酸残基が存 在していなく、 余剰なァセチル化が極めて高い頻度で生じており、 理想的な断片 に再生されたものが極僅かで、 測定限界以下の場合；
14. (iii) のピークのみが観測されている：余剰なァセチルイ匕が生じるァミノ 酸残基が存在していなく、 式 （V I) のような 「脱水」 が極めて高い頻度で生じ ており、 残留する中間体や理想的な断片に再生されたものが極僅かで、 測定限界 以下の場合；
15. (iv) のピークのみが観測されている：「脱水」 と、 余剰なァセチルイ匕とが 過度に進行しており、 その他のものは、 極僅かで、 測定限界以下の場合； 以上のように、 それぞれ分類について、 想定される状況 （要因） の代表例を併せ て示してある。
サブステップ 4一 1 ： (i) 〜 （iv) の四種の状態のペプチド断片に起因する イオン種ピークの特定
先ず、 含む角军析対象ピークの集合 S。の要素ピークに関して、 下記の各部分集 合を構成する。
(a) 距離 42の関係にあるピークのペアのうち、 高質量側にあるピークの集合 を S (42)， 低質量側にあるピークの集合を S (0， 42) とする。 (b) 距離 18の関係にあるピークのペアのうち、 低質量側にあるピークの集合 を S (—18)， 高質量側にあるピークの集合を S (0, —18) とする。
(c) 距離 24の関係にあるピークのペアのうち、 高質量側にあるピークの集合 を S (24), 低質量側にあるピークの集合を S (0, 24) とする。
(d) 距離 60の関係にあるピークのペアのうち、 高質量側にあるピークの集合 を S (60)， 低質量側にあるピークの集合を S (0， 60) とする。
上述する分類 1〜1 1の分類においては、 一組として観測されている 2〜4の 本のピークは、 前記 （a) 〜 （d) の部分集合を構成する過程で、 いずれかの部 分集合に含むものとして選択されている。
具体的には、 下記するようになる。
分類 1. (i) 〜 （iv) の四種のピークが観測されている ：
分類 1の （ii) のピーク G {S (60) Π S (42) Π S (0， 18)} ≡ S (Ac) ！
分類 1の （iv) のピーク e {S (42) Π S (24) Π S (18)} ≡S (A c -H20) 1
分類 1の （i) のピーク G {S (0， 42) Π S (0, 24) Π S (0, 18)} ≡S (0) !
分類 1の （iii) のピーク G {S (18) Π S (0, 60) Π S (0, 24)} ≡S (一 H20) !
分類 2. (i)、 (ii), (iii) の三種のピークが観測されている ：
分類 2の （ii) のピーク≡ {[S (60) ΓΊ S (42)] \ [S (60) Π S (4 2) Π S (0, 18)]} ≡S (Ac) 2
分類 2の （ i ) のピーク G {[S (0, 42) ΓΊ S (0, 18)] \ [S (Ο,' 42) ΓΊ S (0, 24) Π S (0, 18)]} ≡ S (0) 2
分類 2の （iii) のピーク G {[S (0, 60) Π S (0, 18)] \ [S (1
8) n s (o, 60) n s (o， 24)]} ≡s (— H2O) 2
分類 3. (i)、 （ii)、 (iv) の三種のピークが観測されている：
分類 3の （ii) のピ ク G {[S (42) Π S (0, 18)] \ [S (60) Π S (42) Π S (0, 18)]} ≡S (Ac) 3 分類 3の （iv) のピーク E {[S (24) Π S (18)] \ [S (42) ΓΊ S (2 4) ΓΊ S (18)]} ≡ S (Ac— H20) a
分類 3の （i) のピーク G {[S (0, 42) Π S (0, 24)] \ [S (0， 42) Π S (0， 24) Π S (0, 18)]} ≡ S (0) 3
分類 4. (i)、 (iii), (iv) の三種のピークが観測されている ：
分類 4の （iv) のピーク G {[S (42) Π S (24)] \ [S (42) Π S (2 4) Π S (1 8)]} ≡S (Ac— H2O) 4
分類 4の （ i ) のピーク≡ {[S (0, 42) Π S (0， 18)] \ [S (0， 42) n S (0， 24) n S (0, 18)]} ≡ S (0) 4
分類 3の （iii) のピーク≡ {[S (18) ΓΊ S (0, 42)] \ [S (18) n s (o, 60) n s (o, 24)]} ≡ s (-H2O) 4
分類 5. (ii)、 (iii), (iv) の三種のピークが観測されている ：
分類 5の （ii) のピーク≡ {[S (60) Π S (0， 18)] \ [S (60) Π
S (42) ΓΊ S (0, 18)]} ≡ S (Ac) 5
分類 5の （iv) のピーク G {[S (42) Π S (18)] \ [S (42) Π S (2
4) Π S (18)]} ≡S (Ac— H20) 5
分類 5の （iii) のピーク G {[S (0， 60) ΓΊ S (0, 42)] \ [S (1
8) n s (o, 60) n s (o, 24)]} ≡s (— H2O) 5
分類 9. (ii), (iii) の二種のピークが観測されている ：
分類 9の （ii) のピーク≡ {S (60) \ [S (Ac) XU S (Ac) 2U S (A c) 5]} ≡S (Ac) 9
分類 9の （iii) のピーク G {S (0, 60) \ [S (— H20) ,U S (— H2 O) 2U S (- H2O) 5]} ≡S (— H20) 9
分類 10. (i)、 (iv) の二種のピークが観測されている ：
分類 10の （i) のピーク G {S (0， 24) \ [S (0) XU S (0) 3U S (0) 4]} ≡S (0) 10
分類 1 0の （iv). のピーク e {S (24) \ [S (Ac— H2O) XU S (Ac — H20) 3U S (Ac— H2O) 4]} ≡S (Ac - H20) 10
分類 6. (i)、 (ii) の二種のピークが観測されている ： 分類 1 1. (iii)、 (iv) の二種のピークが観測されている：
分類 6の （ii) のピーク、 ないしは分類 1 1の （iv) のピーク G {S (42) \ [S (Ac) 1 U S (Ac) 2U S (Ac) 3U S (Ac— H2O) 1 U S (Ac — H20) 4U S (A c -H20) 5]} ≡ {S (Ac) 6U S (Ac—H20) X 1} = S (Ac) 6
分類 6の （i) のピーク、 ないしは分類 1 1の （iii) のピーク e {S (0, 42) \ [S (0) ！ U S (0) 2U S (0) 3U S (― H2O) (― H20)
4U S (— H20) 5]} ≡ {S (0) 6U S (-H2O) X 1} ^ S (0) 6 なお、 分類 1 1において、 「脱水」 反応がほぼ完全に進行することは、 本発明 においては、 極めて稀有である。 一方、 分類 6のように、 理想的な断片に、 余剰 なァセチル化体が残留することは、 十分な蓋然性で予想される。
分類 7. ( i)、 (iii) の二種のピークが観測されている：
分類 8. (ii), (iv) の二種のピークが観測されている：
分類 7の （iii) のピーク、 ないしは分類 8の （iv) のピーク G {S (18) \ [S (-H20) ！ U S (_H20) 2U S (— H2O) 4U S (Ac— H20) 1 U S (Ac -Η2θ) 3U S (Ac— H20) 5]} ≡ {S (— H20) 7U S (Ac — H20) 8}
分類 7の （i) のピーク、 ないしは分類 8の （ii) のピーク S {S (0， 18) \ [S (0) 1 U S (0) 2U S (0) 4U S (Ac) 1 U S (Ac) 3U S (Ac) 5]} ≡ {S (0) 7U S (Ac) 8}
分類 7のような、 理想的な断片に起因する主なピークに、 その 「脱水」 体に相 当する付随的なピークが存在することは、 十分な蓋然性で予想される。 一方、 余 剰なァセチル化に加えて、 「脱水」 も高い頻度で生じている、 分類 8のような状 態は、 本発明においては、 相当に稀有ではある。 但し、 S (— H20) 7U S (A c— H2O) 8と S (0) 7U S (Ac) 8とについて、 それぞれ、 S (— H20) 7と S (Ac— H20) 8、 S (0) 7と (Ac) 8に更に区分 （分離） すること はできない （これ以上、 細かな判定はできない）。
上述の分類では、 下記する一連の集合演算の結果を利用している。
(d) 距離 60の関係にあるピークは、 分類 1, 2， 5， 9各における余剰な ァセチル化ピークと脱水ピークである。
S (60) =S (Ac) 1 U S (Ac) 2U S (Ac) 5U S (Ac) 9
S (0, 60) =S (— H20) J U S (-H20) 2U S (— H2O) 5U S (—
H20) 9
(c) 距離 24の関係にあるピークは、 分類 1， 3， 4， 10各における余剰 なァセチル化 +脱水ピークと理想的なピークである。
S (0, 24) =S (0) 1 U S (0) 3U S (0) 4U S (0) 10
S (24) =S (Ac -Η2θ) x U S (Ac— H20) 3U S (Ac— H2O) 4 U S (Ac— H2O) 10
(a) 距離 42の関係にあるピークは、 分類 1， 2， 3, 6各におけるァセチ ル化ピークと理想的なピーク、 ならびに、 分類 1， 4， 5, 1 1各におけるァセ チル化 +脱水ピークと脱水ピークである。
S (42) = {S (Ac) 1 U S (Ac) 2U S (Ac) 3U S (Ac) 6} U {S (Ac— H20) 1 U S (Ac— H20) 4U S (Ac_H20) 5U S (Ac— H2 O) X 1}
S (0， 42) = {S (0) XU S (0) 2U S (0) 3U S (0) 6} U {S (- H20) 1 U S (一 H20) 4 U S (— H20) 5 U S (— H20) X 1}
(b) 距離 18の関係にあるピークは、 分類 1， 2, 4， 7各における脱水ピ ークと理想的なピーク、 ならびに、 分類 1， 3, 5, 8における余剰なァセチル 化ピークと余剰なァセチル化 +脱水ピークである。
S (18) = {S (一 H20) ！ U S (一 H2O) 2U S (— H20) 4U S (― H2 O) 7} U {S (Ac -H20) ! U S (Ac— H20) 3U S (Ac— H20) 5U S (Ac-H20) 8}
S (0, 18) = {S (0) ! U S (0) 2U S (0) 4U S (0) 7} U {S (A c) ! U S (Ac) 3U S (Ac) 5U S (Ac) 8}
積集合を調べると、 次のようになる ：
(1) S (60) Π S (42) = (S (Ac) ：分類 1の + A cピーク） U (S (Ac) 2 ：分類 2の + Acピーク）
(2) S (60) Π S (0， 18) = (S (Ac) ：分類 1の + A cピーク） U (S (Ac) 5 ：分類 5の + Acピーク）
(3) S (4 2) Π S (24) = (S (Ac— H2O) 1 :分類 1の + Ac— H 2Oピーク） U (S (Ac— H20) 4 ：分類 4の + Ac— H20ピーク）
(4) S (42) Π S (18) = (S (Ac— H2O) 分類 1の + Ac— H 2Oピーク） U (S (A c -Η2θ) 5 ：分類 5の + Ac— H2Oピーク）
(5) S (42) Π S (0， 18) ― (S (Ac) ：分類 1の + A cピーク） U (S (Ac) 3 ：分類 3の + Acピーク）
(6) S (24) Π S (1 8) = (S (Ac— H2O) 分類 1の + Ac— H 20ピーク） U (S (Ac— H20) 3：分類 3の + Ac— H20ピーク） （7) S (18) Π S (0， 42) = (S (— H20) ：分類 1の一 H20ピーク） U (S (_H20) 4：分類 4の一 H20ピーク）
(8) S (0, 60) ΓΊ S (0, 42) = (S (— H20) ! ：分類 1の一 H2 Oピーク） U (S (-H20) 5 ：分類 5の一 H20ピーク）
(9) S (0, 60) Π S (0, 18) = (S (_H20) i：分類 1の— H2 Oピーク） U (S (一 H20) 2 ：分類 2の一 H20ピーク）
(1 0) S (0, 42) Π S (0, 24) = (S (0) 1 分類 1の理想的な ピーク） U (S (0) 3 ：分類 3の理想的なピーク）
(1 1) S (0, 42) n S (0, 1 8) = (S (0) X 分類 1の理想的な ピーク） U (S (0) 2：分類 2の理想的なピーク）
(1 2) S (0, 24) Π S (0, 1 8) = (S (0) X 分類 1の理想的な ピーク） U (S (0) 4 ：分類 4の理想的なピーク）
さらには、 '
(13) S (60) n S (42) n S (0, 18) = (S (Ac) 分類 1 の + Acピーク）
(14) S (42) Π S (24) Π S (18) = (S (AcJ-H20) ：分類 1の + Ac— H2Oピーク）
(1 5) S (0， 42) Π S (0, 24) ΓΊ S (0, 1 8) = (S (0) 1 分類 1の理想的なピーク）
(16) S (1 8) n S (0, 60) n S (0， 24) 二 (s .(— H2O) ! ： 分類 1の一 H20ピーク）
なお、 これ以外の組み合わせによる積集合は、 全て空集合となる
分類 1の各ピークは、 （13) 〜 （16) で与えられる。
分類 2， 3， 4, 5の各ピークを求める際には、
分類 2の各ピークは、 （1), (9), (11)， （13) 〜 （16) より、 それぞ れ差集合として与えられる。
分類 3の各ピークは、 （5), (6), (10), (13) 〜 （16) より、 それぞ れ差集合として与えられる。
分類 4の各ピークは、 （3)， (7), (12), (1 3) 〜 （16) より、 それぞ れ差集合として与えられる。
分類 5の各ピークは、 （2), (4)， （8), (13) 〜 （16) より、 それぞれ 差集合として与えられる。
分類 9の各ピーク、 分類 10の各ピーク、
分類 6、 分類 1 1の各ピーク、
分類 7、 分類 8の各ピークに関しては、 順次、 差集合として、 与えられる。 なお、 分類 1 1の起こる頻度が、 事実上無視できるとすれば、
S (Ac) 6 U S (Ac -H20) X 1 = S (Ac) 6
S (0) 6U S (-H20) X1 ^ S (0) 6
となる。
勿論、 残る分類 1 2〜15に関しては、 いずれも単一のピークとして観測され るので、 上述の （a) 〜 （d) の部分集合を構成する過程で、 いずれかの部分集 合にも含まれないものとして、 残される。 但し、 これら単一のピークが、 分類 1 2〜15の何れに相当するかは、 この段階では判定できない。
以上、分類 1〜 1 1のいずれかに分類された、付随的なピークを有するものを、 さらに、 下記するように類別する。
S (0) p：付随的なピークを有する、 （i) の状態のペプチド断片に起因するィ オン種ピークの集合；
S (0) P≡S (0) XU S (0) 2U S (0) 3U S (0) 4U S (0) 8U S (0) 6U S (0) 10U [S (0) 7U S (Ac) 8] S ( + Ac) p：付随的なピークを有する、 （ii) の状態のペプチド断片に起因す るイオン種ピークの集合；
S ( + Ac) P≡S (Ac) ！ U S (Ac) 2U S (Ac) 3U S (Ac) 5U S (A c) 6U S (Ac) gU [S (0) 7U S (Ac) 8]
S (— H20) p：付随的なピークを有する、 （iii) の状態のペプチド断片に起因 するイオン種ピークの集合；
S (― H2O) P≡S (-H20) ！ U S (— H20) 2U S (— H2O) 4U S (- H20) 5U S (一 H2O) 9U [S (— H20) 7U S (Ac— H20) 8]
S ( + Ac， 一 H2O) p：付随的なピークを有する、 （iv) の状態のペプチド断 片に起因するイオン種ピークの集合；
S ( + Ac， — H20) P≡S (Ac -H20) 1 U S (Ac— H20) 3U S (A c -H2O) 4U S (A c -H20) 5U S (Ac— H20) 10U [S (_H2O) 7 U S (Ac— H20) 8]
と定義する。
なお、 分類 6と分類 1 1に関しては、 蓋然性を考慮の上、 分類 1 1ではなく、 分類 6であるとして、 類別する。 一方、 分類 7と分類 8に関しても、 その蓋然性 を考慮すると、 分類 8ではなく、 分類 7の可能性が遥かに高いが、 更なる判定は 行わず、 S (0) 7U S (Ac) 8に属するピークは、 S (0) pと S (+Ac) p との双方に類別し、 また、 S (― H2O) 7U S (Ac— H20) 8に属するピーク は、 S (_H20) Pと S ( + Ac， -H2O) Pとの双方に類別している。
上述の類別される部分集合の構成によって、 解析対象の mZ Z範囲において、 付随的なピークを有するものとして認識されるピークの帰属が完了する。
次いで、 メインピーク集合 Mに含まれるピークのうち、 前記の四種の類別部分 集合に含まれるものを選別する。
S (0) PM：メインピーク集合 M中、 S (0) Pに類別される、 （i ) の状態のぺ プチド断片に起因するイオン種ピークの集合；
S (0) ΡΜ≡ {ΜΠ S (0) P}
S (+Ac) PM：メインピーク集合 M中、 S ( + Ac) Pに類別される、 （ii) の 状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合； S ( + Ac) PM≡ {ΜΠ S ( + Ac) P}
S (— H2O) PM：メインピーク集合 M中、 S (— H2O) pに類別される、 （iii) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合；
S (-H20) PM≡ {ΜΓΊ S (— H20) P}
S ( + Ac, — H2O) PM：メインピーク集合 M中、 S ( + Ac, — H2O) Pに 類別される、 （iv) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合； S ( + Ac， 一 Η20) ΡΜ≡ {ΜΠ S (+Ac, — H20) P}
この類別される部分集合の構成によって、 解析対象の m/Z範囲において、 付 随的なピークを有するものとして認識される「メインピーク」の帰属が完了する。 平均的なピーク強度の算出
各々の類別に含まれるピークの平均的なピーク強度を算出する。
S (0) pに属するピークの平均強度を I。とする。
S ( + Ac) Pに属するピークの平均強度を I Acとする。
S (一 H20) Pに属するピークの平均強度を I—H20とする。
S (+Ac，一 H20) pに属するピークの平均強度を I Ac一 H20とする。
上記の帰属作業において、 帰属されずに残されている 「単独のピーク」 の集合 には、 付随的なピークを与える副反応が生じていない理想的な断片由来のピーク など、 分類 12〜15の各ピークが含まれている。
その他、 これらについては、 平均強度 Iが最大となる状態と推定する。
(ステップ 5) 解析対象とする主要なピークの選択
上記の分類と帰属を行った結果、 トリプシン消化されたぺプチド断片由来する イオン種ピーク中に、 同一のアミノ酸配列からなる、 前記四種の状態のペプチド 断片に起因するイオン種ピークの二以上が組となって出現している、 分類:！〜 1 1のいずれかに分類され、 その状態の帰属がなされたものに関して、 各組中の代 表的なピークを選別し、 解析対象とする主要なピークとする。 具体的には、 各組 中の代表的なピークとして、 そのピーク強度が最大のものを選択する 9
サブステップ 5— 1. トリフルォロアセチル化がなされた付随ピークの特定 と、 解析対象からの排除
C末端アミノ酸の逐次的分解反応に付随して、 副反応として、 余剰のァセチル 化がなされている付随的なイオン種ピークを含む分類 1、 2、 3、 5、 6、 8、 9などでは、 ァセチル基に代えて、 共存させているトリフルォロ酢酸に由来する トリフルォロアセチルイ匕がなされた付随ピークが場合によっては、 スぺクトル上 に存在する可能性がある。 すなわち、
( V ) 余剰なトリフルォロアセチル化を受けているアミノ酸残基を含むが、 「脱 水」 を受けているアミノ酸残基を有していないペプチド断片；
(vi)余剰なトリフルォロアセチル化を受けているアミノ酸残基ならぴに「脱水」 を受けているアミノ酸残基を有しているペプチド断片；
に由来するイオン種ピークをさらに含む可能性を有する。
前記ステップ 4において、 帰属できずに残っているピークについて、 分類 1、 2、 3、 5、 6、 8、 9などに分類された、 （ii) の状態のペプチド断片 （余剰 なァセチル化体） に起因するイオン種ピークを基準に、前記（V ) ないしは （vi) の状態のぺプチド断片に起因するイオン種ピークの有無を判別する。 その際、 (ii) の状態のペプチド断片 （余剰なァセチル化体） に起因するイオン種ピーク のピーク強度と比較し、 少なくとも、 ピーク強度が低いことを確認した上で、 有 無を判別する。
仮に、 前記 （V ) ないしは （vi) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピ ークが特定された際には、 余剰なトリフルォロアセチル化を受けているピークの 集合： S ( C F ) とし、 一方、 前記ステップ 4において、 帰属できずに残ってい るピークの集合から、 除去して、 以降の解析対象からの排除する。
サブステップ 5— 2 . 解析対象とする主要なピークの選択
分類 1〜1 1のいずれかに分類され、 その状態の帰属がなされたものに関して、 各組中の代表的なピークを選別し、 解析対象とする主要なピークとする。 具体的 には、 予め読み取られているピーク位置 （ピークの中心値） の信頼度，精度は、 通常、 ピーク強度が大きいほど高くなるので、 分解されたアミノ酸に起因する分 子量差（ピーク位置の差異）の解析に利用する、各組中の代表的なピークとして、 そのピーク強度が最大のものを選択する。
選択されるピーク以外に存在している付随的なピークに関して、 それらのピー ク強度の寄与を含め、 各組について、 集積したピーク強度として、 以後の解析に 利用する。 具体的には、 C末端より逐次的に脱離されるアミノ酸の探索のため、 相互のピーク間距離の算出には、 他の付随するピークを最もシグナルの大きなピ ークに集中させた上で、 かかる探索を行う。
そこで以下のように場合分けを行い、 選択される代表的なピークに対して、 他 の付随するピークを集中する操作の一例を示す。
なお、 （iv) 余剰なァセチル化を受けているアミノ酸残基ならびに 「脱水」 を 受けているアミノ酸残基を有しているペプチド断片に由来するイオン種ピーク 力 ピーク強度が最大のものとなる可能性は低く、 ここでは考慮から外す。 つま り、 IA
Figure imgf000110_0001
x ( I o， I Ac, I— H20， I Ac H20) となる場合はないと仮 定する。
(a) (ii) 余剰なァセチル化を受けているアミノ酸残基を含むが、 「脱水」 を受けているアミノ酸残基を有していないべプチド断片に由来するイオン種ピ ークが顕著な場合：
1 f I A c =M a X \ I 0J I AC I— H20， A Ac— H20
→全てのペプチド断片のピークを、 （ii) の余剰なァセチルイ匕体ピークに重ね合 わせる。
この重ね合わせ操作は、 それぞれ下記する手順でおこなう。
a-1 ： (iii) の 「脱水」 化ピークならびに （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセ チル化を伴うピークについての重ね合わせ操作
距離 18の関係にあるピークのペア （P i , P j ) ： d i j = 18の全てについ て、 集合 S (—18) の低質量側にあるピークを、 高質量側に 18だけ平行移動 して、 集合 S (0, — 18) の高質量側にあるピークに重ね合わせる。 この重ね 合わせ操作により、 （iii) の 「脱水」 化ピークならびに （iv) の 「脱水」 化と余 剰なァセチルイ匕を伴うピークの 2種類のピークは、 それぞれ 「脱水」 化を受けて いなレヽ対応のピークへと重ね合わせがなされる。
次に、 集合 S (-18) に含まれていない （iii) の 「脱水」 化ピークに対し て、 距離 60の関係にあるピークのペア （P i , P j ) ： d u=について、 集合 S ( 0， 60) の低質量側にあるピークを、 高質量側に 60だけ平行移動して、 集合 S (60) の高質量側にあるピーク（ァセチルイ匕体ピーク）に重ね合わせる。 この操作では、 集合 s (0， 60) に含まれるが、 集合 S (—18) に含まれて いない （iii) の 「脱水」 化ピークのみについて、 重ね合わせ処理がなされる。
a— 2 ： ( i ) 理想的な産物：余剰なァセチル化を受けているアミノ酸残基な らびに 「脱水」 を受けているアミノ酸残碁を有していないペプチド断片に由来す るピークについての重ね合わせ操作
距離 42の関係にあるピークのペア （P i , P j ) ： d i j = 42について、 集 合 S (0， 42)の低質量側にあるピークを、高質量側に 42だけ平行移動して、 集合 S (42)の高質量側にあるピーク （ァセチル化体ピーク）に重ね合わせる。 この操作により、 （i) の理想的なペプチド断片由来するピークが、 （ii)のァセ チル化体ピークに重ね合わせがなされる。
a— 3 ： (iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチルイヒを伴うピークに関して 既に、 a— 1の重ね合わせ操作において、 （ii)のァセチル化体ピークに重ね合 わせがなされている。
上述する a— 1、 a— 2、 a— 3の順序で重ね合わせ操作を進めることで、 (iii) の 「脱水」 化ピークの大半は、 一旦、 （i) の理想的なピークに重ね合わ せ、 さらに、 （i) の理想的なピークとともに、 （ii)のァセチル化体ピークに重 ね合わせがなされる。 結果として、 代表となる、 （ii)のァセチル化体ピークに対 して、 起こる付随的なピークが重ね合わされる。 なお、 平行移動操作が施される ピークは、 解析対象のピーク集合 S。より順次除去する。 最終的に、 （ii)のァセ チル化体ピークを有する分類では、 その代表とする（ii)のァセチル化体ピークの みが、 解析対象のピークとして選択される。 その際、 重ね合わせ操作に伴い、 代 表とする（ii)のァセチル化体ピークに対して、 ピーク強度の集中がなされる。
(b) (iii) 「脱水」 を受けているアミノ酸残基を含むが、 余剰なァセチル ィ匕を受けているアミノ酸残基を有していないペプチド断片に由来するイオン種 ピークが顕著な場合：
1 f 丄 ー H20 = Ma X 、 I o， I Ac' I -H20， I Ac- H20,
^全てのぺプチド断片のピークを、 （iii)の「脱水」化体ピークに重ね合わせる。 この重ね合わせ操作は、 それぞれ下記する手順でおこなう。
b— 1 ： ( i ) の理想的なピークならびに （ii) の余剰なァセチル化を伴うピ ークについての重ね合わせ操作
距離 1 8の関係にあるピークのペア （P i , P j ) ： d！ 1 8の全てについ て、 集合 S ( 0， 一 1 8 ) の高質量側にあるピークを、 低質量側に 1 8だけ平行 移動して、 集合 S (— 1 8 ) の低質量側にあ.るピークに重ね合わせる。 この重ね 合わせ操作により、 （i )の理想的なピークは、 （iii)の「脱水」ィ匕ピークへ、 （ii) の余剰なァセチルイヒを伴うピークは、 （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチル化を 伴うピークへと重ね合わせがなされる。
b— 2 ： (ii) の余剰なァセチルイ匕を伴うピークならびに （iv) の 「脱水」 化 と余剰なァセチル化を伴うピークについての重ね合わせ操作
距離 4 2の関係にあるピークのペア （P i， P j ) ： d i〗= 4 2のうち、 集合 S ( 4 2 ) の高質量側にあるピークを、 低質量側に 4 2だけ平行移動して、 集合 S ( 0， 4 2 ) の低質量側にあるピークに重ね合わせる。 その結果、 （iv) の 「脱 水」 ィ匕と余剰なァセチル化を伴うピークに前記の b— 1で重ね合わされている (i i) の余剰なァセチル化を伴うピークと、 （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチ ルイヒを伴うピークとは、 併せて、 （iii) の 「脱水」 ィヒピークへと重ね合わせがな される。
なお、 （iii) の 「脱水」 化ピークが存在しない分類では、 （ii) の余剰なァセ チル化を伴うピークが、 ( i ) の理想的なピークへと重ね合わせがなされる。 b— 3 ：残る （iv) の 「脱水」 ィ匕と余剰なァセチルイ匕を伴うピークについての 重ね合わせ操作
なお、 （iii) の 「脱水」 化ピークが存在しない分類では、 b— 1、 b— 2の操 作後も、 まだ、 （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチルイ匕を伴うピークが残されて いる。
距離 2 4の関係にあるピークのペアのうち、 集合 S ( 2 4 ) の高質量側にある ピークを、 低質量側に 2 4だけ平行移動して、 集合 S (◦, 2 4 ) の低質量側に あるピークに重ね合わせる。 従って、 （iii) の 「脱水」 化ピークが存在しない分 類では、 （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチル化を伴うピークが、 （i ) の理想的 なピークへと重ね合わせがなされる。
上述する b— 1、 b— 2、 b— 3の順序で重ね合わせ操作を進めることで、 (iii) の 「脱水」 化ピークを有する分類では、 結果として、 代表となる、 （iii) の 「脱水」 化ピークに対して、 起こる付随的なピークが重ね合わされる。 なお、 平行移動操作が施されるピークは、解析対象のピーク集合 S。より順次除去する。 最終的に、 （iii) の 「脱水」 化ピークを有する分類では、 その代表とする （iii) の 「脱水」 化ピークのみが、 解析対象のピークとして選択される。 その際、 重ね 合わせ操作に伴い、 代表とする （iii) の 「脱水」 化ピークに対して、 ピーク強 度の集中がなされる。
(c) (i) 理想的な産物：余剰なァセチルイ匕を受けているアミノ酸残基な らびに 「脱水」 を受けているアミノ酸残基を有していないペプチド断片に由来す るイオン種ピークが顕著な場合：
1 f I 0一 ^ Itl X o Ac I— H20 I Ac— H20)
全てのペプチド断片のピークを、 （i ) の理想的なピークに重ね合わせる c一 1 ： (iii) の 「脱水」 化ピークならびに （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセ チル化を伴うピークについての重ね合わせ操作
距離 18の関係にあるピークのペア （P i , P j ) ： d； j = 18の全てについ て、 ピーク集合 s (— 18) の低質量側にあるピークを、 高質量側に 18だけ平 行移動して、 集合 S (0, — 18) の高質量側にあるピークに重ね合わせる。 こ の重ね合わせ操作により、 （iii) の 「脱水」 ィ匕ピークは、 （i) の理想的なピー クに、 （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチル化を伴うピークは、 （ii) の余剰なァ セチル化を伴うピークへと重ね合わせがなされる。
c-2 ： (ii) の余剰なァセチル化を伴うピークについての重ね合わせ操作 距離 42の関係にあるピークのペア （P i , Ρ ί ) : (1 = 42のうち、 集合 S (42) の高質量側にあるピークを、 低質量側に 42だけ平行移動して、 集合 S (0， 42) の低質量側にあるピークに重ね合わせる。 その結果、 （ii) の余 剰なァセチルイヒを伴うピークに前記の b— 1で重ね合わされている （iv) の 「脱 水」 ィ匕と余剰なァセチル化を伴うピークと、 （ii) の余剰なァセチル化を伴うピ ークとは、 併せて、 （i) の理想的なピークへと重ね合わせがなされる。
なお、 （ii) の余剰なァセチルイ匕を伴うピークが存在しない分類では、 （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチルイ匕を伴うピークは、 前段階において、 （iii) の 「脱 水」 化ピークが既に重ねあわせで、 排除を受けている結果、 重ね合わせがなされ なレ、。
c - 3 ：残る （iv) の 「脱水」 ィ匕と余剰なァセチル化を伴うピークついての重 ね合わせ操作
なお、 （iii) の 「脱水」 化ピークが存在しない分類、 あるいは、 （ii) の余剰 なァセチル化を伴うピークが存在しない分類では、 c— 1、 c— 2の操作後も、 まだ、 （iv) の 「脱水」 化と余剰なァセチルイヒを伴うピークが残されている。 距離 2 4の関係にあるピークのペアのうち、 集合 S ( 2 4 ) の高質量側にある ピークを、 低質量側に 2 4だけ平行移動して、 集合 S ( 0， 2 4 ) の低質量側に あるピークに重ね合わせる。 従って、 （iii) の 「脱水」 化ピークが存在しない分 類、 あるいは、 （ii) の余剰なァセチル化を伴うピークが存在しない分類では、
(iv) 'の 「脱水」 化と余剰なァセチル化を伴うピークが、 この段階で、 （i ) の 理想的なピークへと重ね合わせがなされる。
上述する c一 1、 c— 2、 c一 3の順序で重ね合わせ操作を進めることで、 ( i ) の理想的なピークを有する分類では、 結果として、 代表となる、 （i ) の 理想的なピークに対して、 起こる付随的なピークが重ね合わされる。 なお、 平行 移動操作が施されるピークは、 解析対象のピーク集合 S。より順次除去する。 最 終的に、 （i ) の理想的なピークを有する分類では、 その代表とする （i ) の理 想的なピークのみが、 解析対象のピークとして選択される。 その際、 重ね合わせ 操作に伴い、 代表とする （i ) の理想的なピークに対して、 ピーク強度の集中が なされる。
さらに、 以上の重ね合わせ操作によって、 ピーク集合 S。に対して、 選択され る代表的なピークを残し、 平行移動操作施されるピークを除去して得られる、 以 降の解析に利用する、 解析対象のピークの集合を、 S iとする。
サブステップ 5 - 3 . 試料タンパク質に由来するピークの蓋然性の指標算出 ピーク集合 S。ならびに、 前述の重ね合わせ操作処理後の、 解析対象のピーク 集合 S iに含まれる各ピークについて、 試料タンパク質に由来するピークである 蓋然性の指標を以下のように算出する。
上述のステップ 4の分類 ·帰属の結果に基づき、 選別される部分集合： S (0) PM：メインピーク集合 M中、 S (0) pに類別される、 （i ) の状態のぺ プチド断片に起因するイオン種ピークの集合；
S (0) PM≡ {Mf! S (0) p}
S (+Ac) PM：メインピーク集合 M中、 S ( + Ac) Pに類別される、 （ii) の 状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合；
S ( + Ac) PM≡ {ΜΠ S ( + Ac) P}
S (— H20) PM:メインピーク集合 M中、 S (-H20) Pに類別される、 （iii) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合；
S (- H2O) PM≡ {MD S (- H2O) p}
S ( + Ac, -H20) PM：メインピーク集合 M中、 S ( + Ac, — H20) Pに 類別される、 （iv) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合； S ( + Ac， -H20) PM≡ {ΜΠ S (+A c， — H20) P}
のいずれかに含有されるピーク P iについては、 蓋然性の指標 r iを
i f P i^ S (0) PM → r ;= 3
i f P j e S ( + A c) PM → r { = 3
i f P ^ S (— H20) PM → r i = 3
i f P ,≡ S ( + Ac, — H20) PM → r ; = 3
とする。
また、 前記 （v) ないしは （vi) の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピ ークと特定された、 余剰なトリフルォロアセチルイ匕を受けているピークの集合： S (CF) に含有されピーク については、 蓋然性の指標 r iを
i f P； e S (CF) → r； = 2
とする。
なお、 メインピーク集合 Mには含まれないものの、
S (0) P：付随的なピークを有する、 （i ) の状態のペプチド断片に起因するィ オン種ピークの集合；
S ( + Ac) P：付随的なピークを有する、 （ii) の状態のペプチド断片に起因す るイオン種ピークの集合；
S (一 H2O) P：付随的なピークを有する、 （iii) の状態のペプチド断片に起因 するイオン種ピークの集合；
S ( + Ac, -H2O) p：付随的なピークを有する、 （iv) の状態のペプチド断 片に起因するイオン種ピークの集合；
のいずれかに含有されるピーク P iについては、 蓋然性の指標 r. iを
i f P； e S (0) p → r； = 2
i f P； e S ( + A c) p → r； = 2
i f P ;es (— H20) p → r； = 2
i f P； e S ( + Ac, — H20) P → r； = 2
とする。
さらには、 上述のステップ 4の分類'帰属では 「単独のピーク」 と認定される ものの、 メインピーク集合 Mには含まれているピーク Piについては、 蓋然性の 指標 r iを、
i f ≡M → r 1
とする。
それ以外の場合、 蓋然性の指標 r iを、 r ; = 0とする。
下記するステップ 6において、 解析対象のピーク集合 Siに含まれる各ピーク について、 C末端より逐次的に脱離されるアミノ酸の探索のため、 相互のピーク 間距離の算出する際、 互いに対応する陽イオン種または陰イオン種と想定される ピークは、 少なくとも、 上述する蓋然性の指標 r iが 1以上であることを確認で きる範囲で解析を優先して進める。
(ステップ 6) C末端より逐次的に脱離されるアミノ酸の探索
サブステップ 6— 1. トリプシン消化を施して得られる、 N末側断片、 なら ぴに中間部の断片に由来するピークの特定
トリプシン消化を施して得られる、 N末側断片、 ならびに中間部の断片は、 ァ ミノ酸の脱離は生じてなく、 少なくとも、 ポジティブ 'モードで測定したスぺク トル上、前述の重ね合わせ操作処理後の、解析対象のピーク集合 Sェにおいては、 メインピーク集合 Mに含まれるピークとして観測される。すなわち、 C末端には、 アルギニンを有するので、 陽イオン種の生成比率は、 対応する陰イオン種の生成 比率よりも、 通常、 有意に高いので、 ポジティブ ·モードで測定したスぺクトル 上、 ピーク集合 Siとメインピーク集合 Mとの積集合 {s1nM} のうちに含まれ る。
ポジティブ 'モードで測定したスぺクトル上の積集合 {SiflM} の各ピーク に関して、 アミノ酸の脱離に相当する分子量差を有する、 低質量側または髙質量 側のピークが、 ピーク集合 Si中に見出されないピークを選別して、 部分集合ポ ジ S 2を作製する。 次いで、 ネガティブ 'モードで測定したスペク トル上におい て、 該部分集合ポジ S2の各ピークに対応する陰イオン種のピークを特定し、 部 分集合ネガ S2を作製する。 かかる部分集合ネガ S2の各ピークに関して、 ァミノ 酸の脱離に相当する分子量差 （ΔΑ [ i]) を有する、 低質量側または高質量側 のピークが、 ピーク集合 中には見出されないピークを選別して、 さらなる部 分集合ネガ S 3を作製する。
この部分集合ネガ S 3は、 対応する陽イオン種、 陰イオン種の双方とも、 アミ ノ酸の脱離は生じた 「娘断片」 を持たず、 また、 ポジティブ 'モードで測定した スぺクトル上でメインピークとして観測されるという、 トリプシン消化を施して 得られる、 N末側断片、 ならびに中間部の断片に由来するピークの必要条件を満 足するものである。 従って、 トリプシン消化を施して得られる、 N末側断片、 な らぴに中間部の断片に由来するピークの集合と特定する。 アミノ酸の脱離に相当する特異的なピークシフトの値
厶 A [i]
0 G 57
1 S氺 69 ：「脱水」 を受けたセリン残基
2 A 71
3 T氺 83 ：「脱水」 を受けたトレオニン残基
4 s 87
(5 P 9 8 )：環状ァミノ酸プリンの脱離は、本発明では起きない。
6 V 99
7 τ 10 1
8 c 103 9 L 113
10 I 1 1 3
11 D 1 1 5
12 N 1 1 6
13 E 1 2 7
14 K 1 2 8
15 s- A c 1 2 9 ：余剰なァセチル化がなされたセリン残基
16 Q 1 3 0
17 M 1 3 1
18 H 1 3 7
19 H* 1 3 8 ：水素付加のヒスチジン残基
20 T- Ac 1 4 3 ：余剰なァセチル化がなされたトレオユン残基
21 F 1 4 7
22 Y 1 4 8
23 R 1 5 6
24 K- Ac 1 7 0 ：側鎖の Ν—ァセチル保護されたリシン
25 H- A c 1 7 9 ：余剰なァセチル化がなされたヒスチジン残基
26 W 1 8 6
27 Y— Ac 1 9 1 ：余剰なァセチル化がなされたチロシン残基 ズステ
サ: •、ソ "~/ ( 2 C末側断片群に由来するピークの特定
ネガティブ ·モードで測定したスぺク トル上において、 C末側断片群に由来す るピークは、 ピーク集合 から、 前記部分集合ネガ S3を除いた差集合 {Si\ ネガ s3} に含まれる。
該差集合 {Si ネガ S3} 中において、 最大のピーク位置 （m/Z) を有する ピークを、 P一 maxとする。 かかる P_maxを起点： P— (0) として、 アミノ酸の 脱離に相当する分子量差 (ΔΑ [i]) を有する、 低質量側のピークの有無を、 ピーク集合 S 中で探索する。 すなわち、 C末端からアミノ酸が逐次的に分解さ れる C末側断片群では、 一つアミノ酸の脱離に相当する分子量差 （ΔΑ [i]) を示す、 一連のピーク列が観測されていると仮定する。 その際、 アミノ酸の脱離 に相当する分子量差 （ΔΑ [ i]) は、 上述する通り、 57〜1 91の範囲にあ り、 ピーク位置差 （ΔπιΖΖ) が 200以下の範囲にある低質量側のピークにつ いて、 探索を順次進める。
ピーク集合 Si中には、 上述の分類 ·帰属がなされ、 さらに、 重ね合わせが施 された 「帰属済ピーク」 と、 重ね合わせが施されていない 「単独ピーク」 が含ま れるが、 「帰属済ピーク」 相互のピーク位置差 （Δπι/Ζ) の算出では、 それぞ れの帰属に基づく、 余剰なァセチル化、 「脱水」 の有無を考慮の上、 アミノ酸の 脱離に相当する分子量差 （ΔΑ [ i]) に相当するか否かを判定する。 なお、 「単 独ピーク」 は、 分類 12〜15の可能性すべてについて、 判定する。
(a) 起点ピークが （ii) の余剰なァセチルイ匕体ピークの場合
P (0) から距離 ΔΑ [i] ( i =0， 1， ···， 27) だけ低質量側に、 ピー ク集合 Si中のピークが存在していないか検索する。 もし、 存在していれば、 そ れを P (1) とする。 複数個見つかった場合には、 先に定義した r iの大きなピ ークを優先して、更なるアミノ酸の脱離が進むピーク列の探索を進める。その後、 他の P (1) についても、 同様にピーク列の探索を進める。
最終的に、 可能性のあるピーク列複数が得られた時点で、 各ピーク列を構成す る各ピークの蓋然性の指標 r iに加えて、 アミノ酸の脱離が進む 「娘断片」 に由 来するピークも、 （ii) の余剰なァセチル化体ピークである蓋然性が高いなどの 事項も考慮に入れ、 より可能性の高いピーク列を選別する。
a-0： (ii) の余剰なァセチル化体ピークしか、低質量側、 ピーク位置差（Δ m/Z) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (.0) から距離 Δ A [i] ( i =0, 1， ···， 27) だけ低質量側に、 ピ ークが存在していないか検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 「親断片」 に対して、 余剰なァセチルイ匕がなさ れているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低い選択と判断できる。 ま た、 側鎖に 「脱水」 が生じているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低 い選択と判断できる。 なお、 余剰なァセチル化、 「脱水」 が生じていないァミノ 酸の脱離が生じている場合、 より蓋然性が高いと判断される。 a— 1 : (i) の理想的なピークし力 低質量側、 ピーク位置差 （Am/Z) が 200以下の範囲に存在していない場合
Ρ (0) から距離 ΔΑ [i].+ 42 (i =0, 1， …， 27) だけ低質量側 に、 ピークが存在していないか検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 力 S 「親断片」 に対して、 余剰なァセチル化がなさ れているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が高い選択と判断できる。 一 方、 側鎖に 「脱水」 が生じているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低 い選択と判断できる。 また、 余剰なァセチル化、 「脱水」 が生じていないァミノ 酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低レ、と判断される。
a-2 ： (iii) の 「脱水」 化体のピークしか、 低質量側、 ピーク位置差 （厶 m
/Z) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (0) から距離 Δ A [i] +60 (i =0， 1， ···, 27) だけ低質量側 にピークが存在していないか検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 が 「親断片」 に対して、 余剰なァセチル化がなさ れているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性はある選択と判断できる。 一 方、 側鎖に 「脱水」 が生じているアミノ酸の脱離が生じている場合、 より蓋然性 が低い選択と判断できる。 また、 余剰なァセチル化、 「脱水」 が生じていないァ ミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低いと判断される。
(b) 起点ピークが （i) の理想的なピークの場合
P (0) から距離 ΔΑ [i] ( i =0, 1, ···, 27) だけ低質量側に、 ピー ク集合 中のピークが存在していないか検索する。 もし、 存在していれば、 そ れを P (1) とする。 複数個見つかった場合には、 先に定義した r；の大きなピ ークを優先して、更なるアミノ酸の脱離が進むピーク列の探索を進める。その後、 他の P (1) についても、 同様にピーク列の探索を進める。
最終的に、 可能性のあるピーク列複数が得られた時点で、 各ピーク列を構成す る各ピークの蓋然性の指標 r iに加えて、 アミノ酸の脱離が進む 「娘断片」 に由 来するピークも、 （i) の理想的なピークである蓋然性が高いなどの事項も考慮に 入れ、 より可能性の高いピーク列を選別する。
b— 0 ： (i) の理想的なピークし力、 低質量側、 ピーク位置差 （ΔπιΖΖ) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (0) から距離 ΔΑ [i] (i =0， 1， ···， 27) だけ低質量側に、 ピ ークが存在していないか検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 力 S 「親断片」 に対して、 余剰なァセチル化、 「脱 水」 が生じていないアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が高い選択と判断 できる。 一方、 側鎖に 「脱水」 が生じているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低い選択と判断できる。 また、 余剰なァセチル化がなされているアミノ 酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低いと判断される。
b-1 ： (iii) の 「脱水」 化体のピークしか、 低質量側、 ピーク位置差 （Am ZZ) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (0) から距離 ΔΑ [i] +18 ( i =0, 1， ···, 27) だけ低質量側 にピークが存在していないか検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 力 S 「親断片」 に対して、 余剰なァセチル化、 「脱 水 J が生じていないアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性はある選択と判断 できる。 一方、 側鎖に 「脱水」 が生じているアミノ酸の脱離が生じている場合、 より蓋然性が低い選択と判断できる。 また、 余剰なァセチルイ匕がなされているァ ミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低いと判断される。
b-2： (ii) の余剰なァセチルイ匕体ピークし力、、 低質量側、 ピーク位置差 （厶 m/Z) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (0) から距離 Δ A [ i] -42 ( i =0, 1， …， 27) だけ低質量側 に、 ピークが存在していないか検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 が 「親断片」 に対して、 余剰なァセチル化、 「脱 水」 が生じていないアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性がある選択と判断 できる。 また、 側鎖に 「脱水」 が生じているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低い選択と判断できる。 なお、 余剰なァセチル化がなされているアミノ 酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低いと判断される。
(c) 起点ピークが （iii) の 「脱水」 化体のピークの場合
P (0) から距離 ΔΑ [i] (i =0, 1, ···, 27) だけ低質量側に、 ピー ク集合 S 中のピークが存在していないか検索する。 もし、 存在していれば、 そ れを P (1) とする。 複数個見つかった場合には、 先に定義した r iの大きなピ ークを優先して、更なるアミノ酸の脱離が進むピーク列の探索を進める。その後、 他の P (1) についても、 同様にピーク列の探索を進める。
最終的に、 可能性のあるピーク列複数が得られた時点で、 各ピーク列を構成す る各ピークの蓋然性の指標 r iに加えて、 アミノ酸の脱離が進む 「娘断片」 に由 来するピークも、 （iii) の 「脱水」 化体のピークである蓋然性が高いなどの事項 も考慮に入れ、 より可能性の高いピーク列を選別する。
c— 0 ： (iii) の 「脱水」 化体のピークしか、 低質量側、 ピーク位置差 （Am /Z) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (0) から距離 ΔΑ [ i] ( i =0, 1， ···， 27) だけ低質量側にピー クが存在していなレ、か検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 力 S 「親断片」 に対して、 余剰なァセチル化、 「脱 水」 が生じていないアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性は高い選択と判断 できる。 一方、 側鎖に 「脱水」 が生じているアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低い選択と判断できる。 また、 余剰なァセチル化がなされているアミノ 酸の脱離が生じている場合、 より蓋然性が低いと判断される。
c-1 ： (i) の理想的なピークしか、 低質量側、 ピーク位置差 （Am/Z) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (0) から距離 Δ A [i] -18 (i =0, 1， ···， 27) だけ低質量側 に、 ピークが存在していないか検索する。
但し、 見出される 「娘断片」 が 「親断片」 に対して、 側鎖に 「脱水」 が生じて レ、るアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が高い選択と判断できる。 一方、 余剰なァセチル化、. 「脱水」 が生じていないアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性がある選択と判断できる。 また、 余剰なァセチル化がなされているアミノ 酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低いと判断される。
c-2 ： (ii) の余剰なァセチルイ匕体ピークしカ、低質量側、 ピーク位置差（Δ m/Z) が 200以下の範囲に存在していない場合
P (0) から距離 ΔΑ [i] -60 (i =0, 1， ···， 27) だけ低質量側 に、 ピークが存在していないか検索する。 但し、 見出される 「娘断片」 が 「親断片」 に対して、 側鎖に 「脱水」 が生じて いるアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性がある選択と判断できる。 また、 余剰なァセチル化、 「脱水」 が生じていないアミノ酸の脱離が生じている場合、 蓋然性が低い選択と判断できる。 なお、 余剰なァセチル化がなされているアミノ 酸の脱離が生じている場合、 より蓋然性が低いと判断される。
なお、 該差集合
Figure imgf000123_0001
中において、 最大のピーク位置 （mZZ) を 有するピークを、 P— maxとする。 かかる P一 maxを起点： P— (0) として、 アミ ノ酸の脱離に相当する分子量差 （ΔΑ [i]) を有する、 低質量側のピークの有 無を、 ピーク集合 中で探索して、 P (1) に相当するものが見出されない場 合、 該差集合 {S ネガ S3} 中の、 P— maxに次ぐ、 ピーク位置 （m/Z) を 有するピークを起点： P— (0) として、 同様な探索を進める。
一方、 距離 ΔΑ [i] (i =0， 1， …， 27) だけ低質量側に、 ピーク集合 Si中のピークが存在していないか検索する際、 低質量側の 「単独のピーク」 に 対して判断を行う過程では、 「単独のピーク」 が分類 12〜15の全ての可能性 があり、 それに伴い、 ピーク位置差が、 複数の解釈が可能な場合がある。 この複 数の解釈 （縮退） について、 以下に纏めて示す。 表 3
ピークシフトの縮退
厶 ra ( i ) の理想 (iii)の 「脱 (ii) の余剰 (iv) の 「脱水 的なピーク 水」 化体のピ なァセチル化 化と余剰なァセ ーク 体のピーク チル化を有する ピ一ク
69 S* S
81 V G
83 T* T
95 I or L A
98 (P) N
99 V G
111 S-Ac S* S
113 I or L M
125 T-Ac T* T
127 E C 129 S-Ac F S
130 Q Y
137 H I or し
138 H* R
140 (P) N
143 T-Ac T
152 K-Ac K
161 H - Ac
170 K-Ac K
172 Q Y
173 Y-Ac M
179 H-Ac H
180 H* R 上記の一例では、 ステップ 6において、 トリプシン消化を施して得られる、 N 末側断片、 ならびに中間部の断片と、 C末端断片群との弁別に、 N末側断片、 な らびに中間部の断片では、 その断片の C末端にアルギニンを持つので、 スぺクト ルの測定の際、 ポジモードとネガモードの双方を比較することで、 その判別を進 めている。
別の方法としては、 脱離反応の経時変化をトレースすることで、 反応時間の差 異に起因する変化の顕著なピークは、 C末端断片群のピークとして、 これらの選 択に利用するという方法もある。 すなわち、 反応時間を長くすると、 より多くの アミノ酸数が分解された C末端断片群のピークが得られるものの、 そのアミノ酸 配列の解析における起点となる、 元の C末端断片自体の減少が起こる。 従って、 反応時間を比較的に短い段階の試料と、'対比しつつ、 より多くのアミノ酸数が分 解された C末端断片群のピークを特定することが容易となる。'その際、 N末側断 片、ならびに中間部の断片は、双方のスぺクトルに共通し、そのピーク強度比は、 本質的に、 反応時間の差異に依存しないものである。
なお、 C末端断片群のピークを特定し、 逐次的に分解されるアミノ酸種の特定 を進める手順においては、 下記する A〜Eの各過程に基づき、 一連の解析を実施. することが可能である。
A. C末端断片群のピーク間において観測されるピーク位置差 （A m/ Z ) の 可能な値
上述する 「ピークシフトの縮退」 をも考慮に入れて、 C末端断片群のピークに 基づき、 c末端アミノ酸配列をより高い確度で決定する解析手法の一例を示す。 仮に、 逐次的にアミノ酸が分解される c末端断片群が、 いずれも （i) の理想的 な断片のピークに加えて、 （ii)の余剰なァセチル化体ピークと （iii)の「脱水」 化体のピークを伴っている場合、 それらのピーク間で観測されるピーク位置差
(Δπι/Ζ) の可能な値は、 下記する集合で示すことができる。
具体的には、
アミノ酸の脱離に相当する特異的なピークシフトの値 Δ A [ i ] に相当する ： D0≡ {ΔΑ [ i ] ： i =0, 1 , '··, 2 7}
( i ) の理想的な断片のピークと （iii) の 「脱水」 化体のピークとの間で観測 されるピーク位置差 （ΔπιΖΖ) に由来する：
Dx (+) ≡ {ΔΑ [ i ] + 1 8 ： i =0, 1 , '··, 2 7}
D - ) ≡ {AA [ i ] - 1 8 : i =0， 1, …， 27}
(i) の理想的な断片のピークと （ii) の余剰なァセチル化体ピークとの間で観 測されるピーク位置差 （ΔπιΖΖ) に由来する：
D2 (+) ≡ {ΔΑ [ i ] +42 ： i =0, 1, ···, 2 7}
D2 (— ) ≡ {AA [ i] — 42 : i =0, 1， ···, 2 7}
(ii) の余剰なァセチル化体ピークと （iii) の 「脱水」 化体のピークとの間で 観測されるピーク位置差 （Διη/Ζ) に由来する ：
D3 (+) {AA [ i ] + 60 : i =0， 1， ···， 27}
D3 (— ) ≡ {AA [ i ] — 60 : i =0， 1， ···， 27}
また、前記 7種の集合； D0、 Ό, (+)、 Ό, (― )、 D2 (+)、 D2 (― )、 D3 (+)、 D3 (一) の和集合として、
D≡D。U (Dx (+) UDX ( ) U (D 2 (+) U D 2 (― )) U (D 3 (+) U D 3 (一)） を定義する。
一方、 これら 7種の集合の積集合を考慮してみると、
(1) 5種以上の集合の積集合において、 要素を有するものは無い。
(2) 4種の集合の積集合において、 要素を有するもの HD2 (+) HD3 (+) = { 1 29}
n D 2 (一） r D (- ) = {8 7}
F3≡DonD (+ nD3 (一） riD3 (+) { 1 3 1 }
(3) 3種の集合の積集; 合において、 要素を有するもの
T^DoHD! (_ (1D2 (+) \FX= { 1 1 3}
T2≡DonDx (- Π D 3 ( -） = {6 9、 8 3}
TaSDoflDi (+ HD2卜） \F2= { 1 0 1 }
T4≡D0nD1 (+ 门 D3 (+) { 14 7}
T5≡D0nD (- nD3 (一) { 7 1 }
Tfi≡DnnD (+ f!D。 （+) = { 1 4 3}
T7≡D1 (— ) AD (+) DD (一) = { 1 1 9}
T8 =≡Dn (一) nD (+) nD +) = {161}
T 9≡ D ! (_) n D 2 (+) Π D 3 (+) = { 1 1 9}
(4) 2種の集合の積集合において、 要素を有するもの
[T UTsU FJ = {9 8、 1 30、 1 38
Figure imgf000126_0001
[T3UT4U F2U F3] = { 1 1 6、 1 48、 5 6 } W3≡D。nD2 (- ) \ [T3UT5UF2] = {55、 128、 137
W4≡D。flD。（+) \ [T^ UTeU Fj = {9 9、 1 70、 1 79
W=≡DnnD (+)
[Τ.υΤ6υΡχυΡ3] = { 1 9 1 }
W6≡Di ( ） （1D2 (- ) = { 8 5、 9 5}
W7≡O1 (_) flD2 (+) \ [T9U Fj = { 1 1 1、 1 25}
W8≡ D i (— ) Π D 3 (— ) \ [T 2 U T 7] = { 3 9、 5 3、 1 1 0}
W9≡DX c+) HD2 M \ [T3U F2] = {8 9 1 0 5、 149}
W10≡D1 (+) flD2 (+) { 1 4 5、 1 5 5}
W11 = O1 +) ΠΌ3 {+) [T4UT8U F3] = { 1 1 7、 1 8 8、 L 9 7}
W12≡D。（+) nD3 (+) [T6UT9U FJ = { 1 5 ls 1 88、 90、 98}
W13≡D2 (一） flD3 (一) [T5U F3] = {27、 4 1、 45、 5 6、 8 8、 6} (5) 「縮退」 のないピークシフトの値
Sh。≡D。\ ([Wj UW2UW3UW4UW5] U [T x U T 2 U T 3 U T4 U T 5] U
Figure imgf000127_0001
= {103、 115、 127、 186}
S h ! (+)≡DX (+) \ ([W2UW9UW10UW11] U [T3UT4UT7UT8] U [F2U F3]) = {75、 121、 133、 134、 146、 165、 166、 174、 204、 209}
S h ! (_)≡DX (_) \ ([Wi UW6 UW7 UW8] U [ΤχυΤ2υΤ7υΤ8υΤ 9] U [Fj) = {51、 65、 80、 81、 97、 109、 112、 120、 152、 168}
S h2 (+) ≡D2 (+) \
Figure imgf000127_0002
U [TJ U T6 U T9] U [F
J) = {140, 141、 169、 171、 172、 180、 185、 212、
221、 228、 233}
Sh2 (— )≡D2 (— ) \ ([W3UW6UW9UW13] U [T3UT5] U [F2]) =
{15、 29、 59、 61、 73、 74、 86、 106、 114、 144}
S h3 (+)≡D3 (+) \ ([W5UW12] U [T4UT6UT8UT9] U [F ! U F
3]) = {159、 163、 175、 176、 187、 203、 207、 208、
216、 230、 239、 251、 256}
Sh3 (— )≡D3 (_) \ ([W8UW13] U [T2UT5UT7] U [F2UF3]) =
{(—3)、 9、 11、 23、 38、 67、 68、 70、 77、 78、 126} 以上の手順では、 互いに共通する要素を含まないように、 各部分集合は区分され ている。
以上に示すように、 ピーク位置差'（AmZZ) 力 上述する和集合 Dの要素 d (deD) の一つと一致する場合であっても、 一義的には解釈できない。 具体的 には、 和集合 Dの要素 d (deD) に対して、
( i ) d = AA [k] となる kの値： k。 （d)
(i i) d =厶 A [k] +18 となる kの値： (d)
d = AA [k] - 18 となる kの値： k （d)
(i i i) d = AA [k] +42 となる kの値： k2+ (d)
d = AA [k] — 42 となる kの値： k2— (d) ( i v) d = AA [k] +60 となる kの値： k3 + (d) d =厶 A [k] — 60 となる kの値： k3— (d)
の関係を満足する、 k。 （d)、 kx + (d)、 k （d)、 k2 + (d)、 k2— (d)、 k3+ (d)、 k3- (d) のうち、 2以上が存在する場合がある。 すなわち、 逐次 的に分解除去を受けるアミノ酸の種類 (ΔΑ [i]： i =0, 1， …， 27) に 関して、 単に、 ピーク位置差 （Δπι/Ζ) のみの情報に基づき解析を進めると、 複数の解釈の可能性が残る場合がある。
勿論、 「縮退」 のないピークシフトの値の部分集合に関しては、
(1) d E S h。に対して、 k0 (d)
(2) d e S h！ (+)に .対して、 (d)
d e S h ! (-)に .対して、 k (d)
(3) d e S h 2 (+)に .対して、 k2 + (d)
d e S 2 (-)に .対して、 k2" (d)
(4) d e S h 3 (+)に .対して、 k3 + (d)
d e S h 3 (―)に -対して、 k3一 (d)
と、 それぞれ単一の k値が対応している。 それ以外の 「積集合」 として定義され ている各部分集合に関しては、
deWiに対しては、 k0 (d) と - (d)
6) d W2に対しては、 k0 (d) と (d)
7) dew3に対しては、 k0 (d) と k2一 (d)
8) dGW4に対しては、 k0 (d) と (d)
9) dGW5に対しては、 k0 (d) と (d)
10) d ew6に対しては、
11) dEW7に対しては、 (d) と k2+ (d)
12) d GW8に対しては、 ki— (d) と k3— (d)
13) dGW9に対しては、 (d) と k2— (d)
14) dGW10に対しては、 1^+ (d) と k2+ (d)
15) dGWnに対しては、 1^+ (d) と k3+ (d)
16) dew12に対しては、 k2+ (d) と k3 + (d) (17) dewi3に対しては、 k 2— (d) と k3一 (d)
(1 8) d ΕΤ に対しては、 k0 (d)、 kT (d) と k2 + (d)
(1 9) d ΕΤ2に対しては、 k0 (d)、 kx- (d) と k2— (d)
(2 0) dGT3に対しては、 k0 (d)、 kx + (d) と k2- (d)
(2 1) deT4に対しては、 k0 (d)、 k,+ (d) と k3 + (d)
(2 2) dGT5に対しては、 k0 )、 k2- (d) と k3一 (d)
(2 3) deT6に対しては、 k0 (d)、 k2 + (d) と k3 + (d)
(2 4) d GT7に対しては、 k. - (d)、 (d) と k3 - (d)
(2 5) d eT8に対しては、 kx - (d)、 kx + (d) と k3 + (d)
(2 6) deT9に対しては、 - (d)、 k2 + (d) と k3 + (d)
(27) deFiに対しては、 k。 （d)、 kx- (d)、 k2+ (d) と k3 + (d)
(28) dEF2に対しては、 k。 （d)、 k : + (d)、 k2- (d) と k3— (d)
(29) dGF3に対しては、 k。 （d)、 k (d)、 k3— (d) と k3+ (d) 上記 （5) 〜 （29) に示す、 復数種の k値が想定可能である。
B. C末端断片群のピーク間において観測されるピーク 'ペアの類型 ペプチド由来のイオン種ピークの集合： AP≡A\At
に含まれるピークについて、 上述する手順に従ってトリプシン消化べプチド断片 由来するイオン種ピークの分類と帰属を進めると、 付随するピークの存在に基づ き、
S (0) p：付随的なピークを有する、 （i) 理想的な反応産物の状態のペプチド 断片に起因するイオン種ピークの集合；
S ( + Ac) p： (ii) 余剰なァセチル化を受けている付随的な産物の状態のぺプ チド断片に起因するイオン種ピークの集合；
S (― H20) p： (iii) 「脱水」 を受けている付随的な産物の状態のペプチド断 片に起因するイオン種ピークの集合；
S ( + Ac， 一 H20) p： (iv) 「脱水」 を受け、 更に、 余剰なァセチル化を受け ている付随的な産物の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合； が特定される。 その他に、 付随的な産物に由来するピークを伴っていない 「単独 ピーク」 を示すペプチド断片に起因するイオン種ピークの集合： S (single) が 存在している。
集合： APに含まれるピーク Piが、 これら 5種の部分集合のいずれかに含まれ る際、 その帰属 （類型） を示す指標 r i typeとして、
(1) P i^S (0) p → r i type=0
(2) P i^S ( + Ac) p → r i type= 1
Figure imgf000130_0001
(4) P ;es (single) P → r i type=3
(5) P i^S ( + Ac， -Η2θ) p → r i type=4
によって、 示すことにする。
少なくとも、 C末端断片群のピークに関しては、 付随的なピークを有するぺプ チド断片に由来するピークとして、 部分集合 S (0) P、 S ( + Ac) P、 S (一 H20) Pのいずれかに属するピークが観測されるか、 あるいは、 「単独ピーク」 として観測されるかのいずれかである。 従って、 部分集合 S ( + Ac, — H20) Pに属するピークを考慮から除外しても、 残る付随的なピークを有するペプチド 断片に由来するピークである、 部分集合 S (0) P、 S ( + Ac) P、 S (一 H2 O) pのいずれかに属するピークに関して、 考慮されるので問題はない。
具体的には、部分集合 S (0) P、 S ( + Ac) P、 S (一 H20) P、 S (single) のいずれかに属する二つのピーク Pい Ρ〗の対に関して、 その類型は以下の通り となる。
ピーク位置 m/Zの高い側のピークを Pjとする際、 ピーク 'ペア （Pi， Pj) の類型を示す指標 を、
ピーク Piの帰属 （類型） を示す指標 r i type
ピーク P jの帰属 （類型） を示す指標 r j t y p e
を利用して、 Rij≡ (r i type, r j type) と表記することにする。
(1) 類型 1のピーク ·ペア
P ;es (0) p, PjGS (0) p → Ri j= (0, 0)
(2) 類型 2のピーク 'ペア
P i^S ( + Ac) p, P j es ( + Ac) p → R; j= (1, 1) (3) 類型 3のピーク ·ペア
P S (一 H20) p, P j e S ( R (2, 2)
(4) 類型 4のピーク ·ペア
P； e S (single), P j e S (sin Ru= (3， 3)
(5) 類型 5のピーク ·ペア
P S (+A c) p, P = e S (0) → Ru= (1， 0)
(6) 類型 6のピーク ·ペア
P S (0) p, P j ES ( + Ac) p → R； j = (0, 1)
(7) 類型 7のピーク ·ペア
P i^S (— H20) p, Pj eS (0) p → Ru= (2, 0)
(8) 類型 8のピーク ·ペア
P S (0) p, P j e S (_H20) p → Ri = (0， 2)
(9) 類型 9のピーク ·ペア
P i E S (single), P j e S (0) P R (3， 0)
(1 0) 類型 1 Qのピーク .ペア
P
Figure imgf000131_0001
(0， 3)
(1 1) 類型 1 1のピーク ·ペア
P ;e S (— H20) p, P} -≡ S ( + A c ) Ri i= (2, 1)
(1 2) 類型 1 2のピーク ·ペア
P S ( + Ac) p, P }≡S (— H20) RH= (1， 2)
(1 3) 類型 1 3のピーク ·ペア
P i e S (single), P j e S ( + Ac) P 〗= (3, 1)
(14) 類型 14のピーク ·ペア
P； e S ( + A c ) p, P} -≡S (single) R (1， 3)
(1 5) 類型 1 5のピーク ·ペア
P； e S (-H20) p, P j e S (single )
Figure imgf000131_0002
(2， 3)
(1 6) 類型 1 6のピーク ·ペア
P S (single), P S (— H2O) R (3, 2) c. c末端断片群のピーク間において観測される、 各類型のピーク 'ペアにお いて生じ得る、 一個のアミノ酸脱離に由来するピークシフトの値
次に、 部分集合 S (0) P、 S ( + Ac) P、 S (_H20) P、 S (single) の いずれかに属する二つのピーク Pi， Pjの対に関して、 その類型を考慮して、 そ のピーク位置差 （ΔπιΖΖ) 1S 一個のアミノ酸脱離に由来するピークシフトの 値に該当するか否かを判定する。 換言すれば、 一個のアミノ酸脱離に由来するピ ークシフトの値に該当する可能性の無いピーク位置差 （ΔπιΖΖ) を示すピー ク 'ペア （Pi, Ρ を先ず排除する。
上述する類型 1〜1 6のピーク' 'ペアにおいて、 可能性のある、 一個のァミノ 酸脱離に由来するピークシフトの値 dは、 下記のピークシフトの部分集合のもの となる。
類型 1のピーク ペア dGD0
類型 2のピーク ペア deD0
類型 3のピーク ペア deD0
類型 4のピーク •ペア deD (全ての可能性が残る）
類型 5のピーク ペア d eD2 (- )
類型 6のピーク ペア deD2 (+)
類型 7のピーク ペア deD! (+)
類型 8のピーク ペア d eDx (_)
類型 9のピーク ペア d eD0U (Di (+) UD2 (一))
類型 1 0のピ一ク •ペア d eD0U (Ό1 (一） UD2 (+))
類型 1 1のピ一ク •ペア dsD3 (+)
類型 1 2のピ ク •ペア d ED3 (- )
類型 1 3のピ一ク •ペア d GD0U (D2 (+) UD3 (+))
類型 1 4のピ一ク •ペア d eD0U (D2 (一） UD3 (— ))
類型 1 5のピ一ク .ペア d eD0 U (D 1 (+) UD2 (+))
類型 1 6のピ ク •ペア d eD0U (Dx (一） UD2 (一)) 実際には、 c末端断片群のピーク間において観測されるピーク ·ペアである可 能性を有する、 ピーク ·ペアとして、部分集合 S (0) P S ( + Ac) P S (一 H20) P S (single) のいずれかに属する二つのピーク P ; Pjの対全てに関 して、 その類型毎に、 上記の可能性のあるピークシフトの値 dの部分集合に、 そ のピーク.位置差 （Διη/Ζ) が含まれるもののみを選択し、 以降の解析の対象と する、 ピーク 'ペア （P i , Ρ の集合とする。
D. 各類型のピーク 'ペアにおいて生じ得る、 一個のアミノ酸脱離に由来する ピークシフトの値に基づく、 対応する脱離アミノ酸残基の種類の推定
前記の選択によって作製される、 以降の解析の対象とする、 ピーク 'ペア (P い Pj) の集合に含まれる各ピーク 'ペアに関して、 そのピーク位置差 （Διη/ Ζ) の起因となっている脱離アミノ酸残基の種類の推定を進める。 その際、 ピー ク位置差 （ΔπχΖΖ) と該ピーク ·ペアの類別に基づき、 脱離 Τミノ酸残基の種 類に相当する k値は、 下記する種類となる。
まず、 d のピークシフトの値について、 そのピークシフトの値 dを示す可 能性を有するピーク ·ペアの類型 P typ eを、 より細かに区分して示すと、以下の ようになる。 なお、 ピーク ·ペアの類型 4は、 形式的には、 全ての可能性を有す るので、 下記の区分では、 その記載を省いてある。
d G S h。 の場合、 p
x t p e 1
des h x (+) の場合、 P
t yp e 7
d≡S h1 (-) の場合、 P
t yp e 8
d e S h 2 (+) の場合、 p t yp e 6
d e S h 2 (-) の場合、 p t yp e 5
d e S h 3 (+) の場合、 p t yp e 1 1
d e S h 3 (一） の場合、 p ^ t y e 1 2 d≡W の場合、
P t y p e 1 3 8,
9 1 3 14 1 5 (但し、 dGD。の時)
1 0 1 6 (伹し、 deDoUDi (一）の時） 16748
d ew2 の場合、
P t y p e ： 1〜3、 7
3、 14、 1 6 (伹し、 d 。の時)
(但し、 deDoUDi (+)の時）
dew3 の場合、
： 1〜 3、 5
1 0、 1 3、 1 5 (伹し、 dGD。の時）
9、 1 4、 1 6 (但し、 deD。UD2 (― )の時)
d≡W の場合、
： 1 ~3, 6
9、 1 4 6 (但し、 dGD。の時)
1 0、 1 (但し、 deD0UD2 (+)の日;
≡W5 の場合、
Ptyp ： 1〜 3、 1 1
9、 1 0、 1 4、 1 5、 1 6 (但し、 d eD。の時) 1 3 (但し、 d eD。UD3 (+)の時）
d≡We の場合、
P… ： 5、 8
1 0 (但し、 d (― )の時）
9、 14 (但し、 deD2 (― )の時）
1 0、 1 5 (但し、 dEDi (― ) UD2 (― )の時）
d≡W の場合、
P y P e ： 6、 8
1 6 (但し ά≡Ό1 (― )の時）
1 3、 1 5 (但し、 dED2 (+)の時）
1 0 (但し d eDx (_) UD2 (+)の時)
の場合、
P y P e : 8, 1 2
10、 16 (但し、 dGD, (― )の時） 1 4 (伹し、 dED3 (― )の時）
d≡W9 の場合、
P type ： 5, 7
1 5 (但し、 dED (+)の時） 1 4、 1 6 (但し、 dGD2卜）の時） 9 (但し、 d (+) UD2 (― )の時） deW10 の場合、
Ptype ： 6、 7
9 (但し、 dEDi (+)の時）
1 0, 1 3 (但し、 d≡D2 (+)の時） • 1 5 (但し、 dEDi (+) UD2 (+)の時） d≡W,！ の場合、
P type ： 7, 1 1
9、 1 5 (但し、 d (+)の時）
1 3 (但し、 dED3 (+)の時） dewi 2 の場合、
P type ： 6, 1 1
1 0, 1 5 (但し、 d≡Ό2 (+)の時）
1 3 (但し、 dED2 (+) UD3 (+)の時） d ew, 3 の場合、
9、 1 6 (但し、 deD2 (一）の時）
14 (但し、 dGD2 (_) UD3 (― )の時） ά≡Ύ1 の場合、
Ptype ·· 1〜3、 6、 8
9, 14 (但し、 deD。の時）
1 6 (但し、 dEDoUD (― )の時） 1 3、 1 5 (但し、 deD。UD2 (+)の時) 10 (但し、 dGDoUDi (― ) UD2 (+)の時) d≡T2 の場合、
P t y p e ： ト 3、 8、 12
9、 13、 15 (但し、 dGD。の時）
10、 16 (伹し、 dGDoUD 卜）の時）
14 (但し、 d GD。UD3 (+)の時） deT3 の場合、
P t yp e ： 1〜3、 5、 7
10, 13 (伹し、 deD。の時）
15 (但し、 deDoUDi (+)の時）
14、 16 (但し、 dED。UD2 (― )の時） 9 (但し、 dGDoUDi (+) UD2 (_)の時） deT4 の場合、
P t yp e： 1〜3、 Ί 1 1
10、 14、 16 (但し、 deD。の時）
9、 15 (但し、 dEDoUDi (+)の時）
1 3 (但し、 d GD。U D3 (+)の時） deT5 の場合、
P t yp e： ト 3、 5、 12
10、 13、 15 (但し、 dGD。の時）
. 9、 16 (但し、 dGD。UD2 (一）の時）
14 (伹し、 dGD。UD2 (― ) UD3 (一）の時) deT6 の場合、
P typ e ： 1〜3、 6, 1 1
9、 14、 16 (但し、 d eD0の時）
10、 15 (但し、 dGD。UD2 (+)の時） 13 (但し、 dGD。リ D2 (+) UD3 (+)の時) deT7 の場合、
P t yp e ： 7, 8, 12 10, 1 6 (但し、 d (— )の時)
9、 1 5 (但し、 dEDi (+)の時）
14 (但し、 ά≡Ό3 {~]の時）
dGT8 の場合、
P
上 t p e ： ： 7, 8 、 1 1
1 0、 1 6 (但し、 d 0 卜）の時）
9、 1 5 (伹し、 dGDi (+)の時）
1 3 (但し、 d ED3 (+)の時）
dET9 の場合、
P
yp e ; ： 6, 8 、 1 1
1 6 (但し、 ά≡Ό, (― )の時）
1 5 (但し、 d eD3 (+)の時）
1 0 (但し、 ά≡Ό1 {-) Όζ +)の時)
1 3 (但し、 deD2 (+) UD3 (+)の時) d GF の場合、
P t. ： ：!〜 3、 6、 8、 1 1
9、 14 (但し、 d 。の時）
1 6 (伹し、 dGD。UD, (一）の時)
1 5 (但し、 deD。UD (+)の時)
1 0 (但し、 deDoUDi (― ) UD3 (+)の時) 1 3 (但し、 dGD。UD2 (+) UD3 (+)の時) d≡F2 の場合、
P… ： ：!〜 3、 5、 7、 1 1
10 (但し、 dGD。の時）
1 5 (伹し、 deDoUD (+)の時） 14、 1 6 (伹し、 dED0UD2 (― )の時） 9 (但し、 dGDnUDi (+) UD2 (― )の時）
1 3 (但し、 deD0UD (一)の時) 16 (伹し、 d 。の時）
5 (但し、 deDoUD! (+)の
(但し、 deD。UD3 (+)の時）
(伹し、 dGD。UD3 (― )の時） これら deDのピークシフトの値について、 そのピークシフトの値 dを示す可 能性を有するピーク ·ペアの類型 Ptypeを、細区分された部分集合に関して、 ま とめ直した結果と、 上述する考察過程 Aで既に示した、 各細区分された部分集合 において、 可能性のある kの値とを関連付けて、 ピークシフトの値と該ピーク ' ペアの類別との各組み合わせに対して、 可能性を有する脱離アミノ酸残基の種類 に相当する k値は、 下記する種類として示すことができる。
d E S h。 P y p e 1 3 4の場合、 k0 (d)
d e S h x (+)
p ' p e · • 7 ' ·> 4の場合、 (d)
des hi (一）
, p e : 8 4の場合、 kT (d)
d e S h 2 (+)
pい , p e 6 4の場合、 k2 + (d)
d e S h 2 (-)
p r p e ' 5 4の場合、 k2— (d)
d e S h 3 (+)
, p e · 11 4の場合、 k3 + (d)
d e S h 3 (一）
p ^ p e 1 4の場合、 k3一 (d) d^Wx の場合、
t y p e · k0 (d)
8 kT (d)
10 k。 （d) 又は k d≡W2 の場合、
→ k。 （d)
k (d)
kn (d) 又は k d eW3 の場合、
p yp e : ： 1〜3、 10、 13、 15 ― > k0 (d)
5 → k2" (d)
9、 14、 16、 4 → k0 (d) 又は k2— (d) dew4 の場合、
p t p e : ： 1〜3、 9、 14、 16 ― ► k0 (d)
6 → k2 + (d)
10、 15 → k。 （d) 又は k2+ (d) d ew5 の場合、
p丄 t y e ： 1〜3、 9、 10、 14〜： 16 → k。 （d)
11 → k3+ (d)
13 → k。 （d) 又は k3 + (d) dew6 の場合、
p t yp e : ： 5、 10 → k2- (d)
8、 9、 14 → k (d)
16, 4 → k2— (d) 又は l^— (d) dew7 の場合、
p t y p e ,： 5、 13、 15 → k2+ (d)
8、 16 → kx- (d)
10、 4 → k2 + (d) 又は l^— (d) dew8 の場合、
p ■*· t p e ： 8、 10、 16 → k (d)
12、 14 → k3 - (d)
4 → k (d) 又は k3— (d) d GW9 の場合、
p x t p e ： 5、 14、 16 → k2- (d)
7、 15 → k,+ (d)
9、 4 → (d) 又は k2— (d) dew9 の場合、 5 1 4 1 6 k2- (d)
7 1 5 (d)
9 4 k (d) 又は k2— (d) d eW10 の場合、
P y P e 6 1 0 1 3 k2 + (d)
7 9 k (d)
1 5 4 k x + (d) 又は k2 + (d) d≡Wt l の場合、
P t ' 7 9 1 5 kx + (d)
k3 + (d)
4 k !+ (d) 又は k3+ (d) d≡W12 の場合、
P y P e 6 1 0 1 5 k2 + (d)
1 1 k3 + (d)
1 3、 4 k2 + (d) 又は k3 + (d) dew13 の場合、
P t 5、 9、 1 6 k2 - （d)
1 2 k3一 (d)
14, 4 k2— (d) 又は k3— (d) d eT, の場合、
P t y p - 1 ~3, 9 1 4 k0 (d)
6 → k2 + (d)
Figure imgf000140_0001
1 6 k。 （d) 又は l^— (d)
1 3, 1 5 k。 （d) 又は k2+ (d)
1 0 4 kn (d)、 k " (d) 又は k deT2 の場合、
P t y p e： 1〜 3 9 1 3 1 5 k。 （d) 一 (d)
- (d)
(d) 又は l^— (d)
(d) 又は k 3— (d)
(d)、 k (d) 又は k 3— (d)
→ k。 （d)
- (d)
+ (d)
(d) 又は k (d)
(d) 又は k 2— (d)
(d)、 k x + (d) 又は k 2— (d)
→ k。 （d)
+ (d)
+ (d)
(d) 又は k i+ (d)
(d) 又は k 3+ (d)
(d)、 k x + (d) 又は k 3 + (d)
→ k。 （d)
一 (d)
― (d)
(d) 又は k 2_ (d)
(d)、 k 2_ (d) 又は k 3— (d)
→ k 0 (d)
+ (d)
+ (d) 10、 15 → k0 (d) 又は k2+ (d)
1 3 、 4 → k0 (d)、 k2+ (d) 又は k3 + (d) d eT7 の場合、
p ^ t y p s： 7、 9、 15 → k,+ (d) .
8、 10、 16 → kT (d)
1 2、 14 → k3- (d)
4 → kT (d)、 ka + (d) 又は k3— (d) の場合、
p t y p . Ί、 9、 15 → k,+ (d)
8、 10、 16 → kT (d)
11, 13 → k3 + (d)
4 → k (d)、 kx + (d) 又は k3 + (d) d≡T9 の場合、
p 2： 6、 15 → k2 + (d)
8、 16 → k (d)
1 1 → k3 + (d)
10 → kT (d) 又は k2+ (d)
13 → k2 + (d) 又は k3+ (d)
4 → kT (d)、 k2+ (d) 又は k3_ (d) d≡F 1 の場合、
p 1 t y p ί 1〜3、 9、 14 → k。 （d)
6 → k2 + (d)
8 → k,一 (d)
. 1 1 → k3 + (d)
16 → k0 (d) 又は k (d)
15 → k0 (d) 又は k2+ (d)
10 → k0 (d)、 k (d) 又は k2 + (d)
13 → k0 (d)、 k2 + (d) 又は k3 + (d) → k k2+ l^—又は k3+ (d) d e F 2 の場合、
t y p e O → k。 （d)
5 → k2" (d)
7 → k j+ (d)
11 → k3 + (d)
15 → k：。 （d) 又は k (d)
14 16 → k。 （d) 又は k2— (d)
13 → k。 （d) 又は k3+ (d)
9 → k。 （d)、 k (d) 又は k2— (d)
4 → k k2—又は k3+ (d) d e F 3 の場合、
p t : 1 3 → k。 （d)
7 → (d)
1 1 → k3 + (d)
12 → k3- (d)
9 15 → k。 （d) 又は ki+ (d)
13 → k。 (d) 又は k3+ (d)
14 → k。 （d) 又は k3_ (d)
→ k k^ k3—又は k3+ (d) 以上に示す考察結果を利用することで、 ピークシフトの値と該ピーク，ペアの 類別との各組み合わせに従って、 可能性を有する脱離アミノ酸残基の種類に相当 する k値は、 それぞれ限定したものとなる。 具体的には、 上述する過程 Cにおい て、 C末端断片群のピーク間において観測されるピーク ·ペアである可能性を有 する、 ピーク 'ペアとして、 部分集合 S (0) P S ( + Ac) P S (— H20) P S (single) のいずれかに属する二つのピーク Pい Ρ〗の対全てに関して、 その類型毎に、 上記の可能性のあるピークシフトの値 dの部分集合に、 そのピー ク位置差 (厶 mZZ) が含まれるもののみを選択し、 以降の解析の対象とする、 ピーク .ペア （P i， p .) の集合について、 この集合に含まれる各ピーク 'ペア
(Pi, Pj) が有するピークシフトの値に該当する脱離アミノ酸残基の種類 (k 値） を、 特定できる、 あるいは、 限られた 4種以内に限定ができる。
E. 逐次的なアミノ酸分解に起因する、 ピーク位置差 （ΔπιΖΖ) の減少を示 す一連のピーク列群の抽出
上述する過程 Cにおいて、 部分集合 S (0) P、 S ( + Ac) P、 S (— H20) P、 S (single) のいずれかに属する二つのピーク P i , Pjの対全ての中から、 このピーク 'ペア間のピーク位置差 （Δηι/Ζ) 力 一アミノ酸の分解に由来す るピークシフトの値 dに該当しているものを既に選別している。 次に、 このピー ク 'ペア （Pi， Ρ)) の集合： PD≡ {(Pi, Ρ)) ： d GD、 P i, PjE (S (0) PU S ( + Ac) PU S (— H2O) P) U S (single)} のうちから、 逐次 的なアミノ酸分解を反映する、 一連のピーク列の群を選別する。 ' このピーク 'ペア （Pi, Pj) の集合： PDから、
各ペアのピーク位置の高い側のピーク Piの集合： Spa i r— h0≡ {Pj ： (Pi, P j) ePD} と、
各ペアのピーク位置の低い側のピーク P iの集合： Spa i r— 10≡ {Pi ： (P i( P j) epD} とを構成する。 次に、 集合： Spa i r_h0と集合： Spa i r— 10との積集 合： c。≡spa i r一 h0nspa i r— 10を形成する。 この積集合： c。は、 一つのピー ク ·ペアにおいては、 該ペアのピーク位置の高い側のピークであって、 同時に、 別のピーク 'ペアにおいては、 該ペアのピーク位置の低い側のピークであるピー クの集合となっている。
さらに、
差集合 B。を、 B。三 Spa i r一 h0\C。 と、
差集合 F。を、 F。≡Spa i r— 10\C。 と、 それぞれ構成する。
この差集合 B。に含まれるピークは、 そのピークよりもピーク位置の高い側に は、 集合： PDに含まれるようなピーク 'ペアを構成できるようなピークを有し ていないことを意味する。 一方、 差集合 F。に含まれるピークは、 そのピークよ りもピーク位置の低い側には、 集合： PDに含まれるようなピーク 'ペアを構成 できるようなピークを有していないことを意味する。 なお、 積集合： C。に含ま れるピークは、 一アミノ酸の分解に由来するピークシフトの値 dに該当するピー ク位置差 （Am/Z) で、 少なくとも、 3つ以上のピークからなる列の中間点と なっているピークである。
(E-2) 3つ以上のピークからなるピーク列とならないピーク 'ペアの排 除
先ず、 ピーク位置の高い側のピークとして、 差集合 B。に含まれるピークを、 ピーク位置の低い側のピークとして、 差集合 F。に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集合 PB0— F0三 {(Pi, Pj) ： PiEF0、 Ρ〗ΕΒ0} を形成し、集合： PDとこの集合 PB0_F。との積集合： pDnpB0— F0を作製する。 その後、 集合： Pdから、 この積集合： pDnpB0— F0を除去した、 差集合： p- D x≡pD\ (pDnpB0_F0) を作製する。 この差集合 pD1は、 逐次的なアミノ酸 分解を反映する一連のピーク列を構成する可能性のないピーク ·ペアは含まれな いものとなっている。 一方、 前記積集合： pDnpB0_F0は、 ピーク列とならな いピーク 'ペアの集合に相当する。 今一度、 このピーク 'ペア （Pi， Pj) の集合： PD1から、
各ペアのピーク位置の高い側のピーク Pjの集合： spa i r— hl≡ {Pj ： (Pi, P i) EPd1} と、
各ペアのピーク位置の低い側のピーク Piの集合： Spa i r— ≡ {Pj： (P;, P i) ePD1} とを構成する。 次に、 集合： Spa i r一 hlと集合： Spa i r— との積 集合:
Figure imgf000145_0001
Spair— を形成する。 この積集合： C は、 一つのピ ーク 'ペアにおいては、該ペアのピーク位置の高い側のピークであって、同時に、 別のピーク 'ペアにおいては、 該ペアのピーク位置の低い側のピークであるピー クの集合となっている。
また、
差集合 を、 BiESpair— Ci と、
差集合 を、 FiESpair— u Ci と、 それぞれ構成する。
この差集合 に含まれるピークは、 そのピークよりもピーク位置の高い側に は、 集合： PD1に含まれるようなピーク 'ペアを構成できるようなピークを有し ていないことを意味する。 従って、 一アミノ酸の分解に由来するピークシフトの 値 dに該当するピーク位置差 （Δπΐ//Ζ) で、 少なくとも、 3つ以上のピークか らなるピーク列における、 最もピーク位置の高いピーク （始点ピーク） の集合に 相当する。 一方、 差集合 に含まれるピークは、 そのピークよりもピーク位置 の低い側には、 集合： P D iに含まれるようなピーク♦ペアを構成できるようなピ ークを有していないことを意味する。 従って、 一アミノ酸の分解に由来するピー クシフトの値 dに該当するピーク位置差 （ΔπιΖΖ) で、 少なくとも、 3つ以上 のピークからなるピーク列における、最もピーク位置の低レヽピーク （終点ピーク） の集合に相当する。 なお、 積集合： 〇ェは、 前記の始点ピークと終点ピークとを 末端とする、 一アミノ酸の分解に由来するピークシフトの値 dに該当するピーク 位置差 （AmZZ) で連なる、 少なくとも、 3つ以上のピークからなるピーク列 の中間点ピークの集合である。
(E-2) 始点ピーク→中間点ピーク→終点ピークの、 3つのピークからな るピーク列の特定
次に、 ピーク位置の高い側のピークとして、 差集合 に含まれるピークを、 ピーク位置の低い側のピークとして、 積集合 に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集合 PB1― C1≡ {(Ρ;, Pj) ：
Figure imgf000146_0001
い PjGB を形成し、 集合： pD1とこの集合 pB1— C1との積集合： pD1npB1_clを作製す る。 得られたピーク 'ペア （Pi, Pj) の積集合 pD1npB1—clから、 各ペアの ピーク位置の低い側のピーク Piの集合： Spa i r_12三 {P i ： (Pi， Pj) ep D1npB1_cl} とを構成する。 すなわち、 この集合 spa i r— 12は、 差集合 に 含まれるピークに対する、 積集合 中の 「リンク先」 ピークの集合に相当して いる。
—方、 ピーク位置の低い側のピークとして、 差集合 に含まれるピークを、 ピーク位置の高い側のピークとして、 積集合 に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集合 PC1一 F1≡ {(P^ Pj PiEFい PjGC を形成し、 集合： Pd1とこの集合 PC1— F1との積集合： pD1npcl— F1を作製す る。 得られたピーク 'ペア （Pi, p j) の積集合： pD1n pcl_F1から、 各ペア のピーク位置の高い側のピーク Pjの集合： Spa i r—h2≡ {Ρ〗 ： （Pi, Pj) ≡
PD1npcl—F1} を構成する。 すなわち、 この集合 spai r— h2は、 差集合 F に 含まれるピークに対する、 積集合 Ci中の 「リンク元」 ピークの集合に相当して いる。
次に、 集合 spai r_h2と集合 spa i r— 12との積集合： c2E Spa ir—h2nspa i r_12を形成する。 この積集合は、 前記の始点ピークと終点ピークとを末端とす る、 一アミノ酸の分解に由来するピークシフトの値 dに該当するピーク位置差 (厶 mZZ) で連なる、 3つのピークからなるピーク列の中間点ピークの集合で ある。 さらに、 ピーク位置の低い側のピークとして、 差集合 F に含まれるピー クを、 ピーク位置の高い側のピークとして、 積集合 C2に含まれるピークを選択 して、 構成されるピーク 'ペアの集合 PC2— F1三 {(P;, Ρ』） ： PiEFい Pj ec2} を形成し、 集合： pD1とこの集合 pC2_F1との積集合 pD1npC2_F1を 作製する。 得られたピーク 'ペア （Pi， Pj) の積集合 pD1npC2— F1から、 各 ペアのピーク位置の低い側のピーク Ρ〗の集合： FC2≡ {Pi ： (P;, P j) ≡P
D1npC2一 F1} を構成する。 この集合 FC2は、 集合 c2に含まれるピークに対す る、 差集合 F 中の 「リンク先」 ピークの集合に相当している。 また、 ピーク位 置の高い側のピークとして、 差集合 に含まれるピークを、 ピーク位置の低い 側のピークとして、積集合 c2に含まれるピークを選択して、構成されるピーク · ペアの集合 PB1_C2三 {(Pi, P .) ： PiGC2、
Figure imgf000147_0001
を形成し、 集合：
Pd1とこの集合 PB1— C2との積集合： pD1npB1_C2を作製する。 得られたピー ク 'ペア い Pj) の積集合： pD1npB1—C2から、 各ペアのピーク位置の高 い側のピーク Pjの集合： BC2≡ {Pj ： (ρ Pj) epD1npB1_C2} を構成 する。 この集合 BC2は、 集合 C2に含まれるピークに対する、 差集合 中の 「リ ンク元」 ピークの集合に相当している。 その結果、 集合 BC2中の始点ピーク→集 合 C 2中の中間点ピ ク→集合 FC2中の終点ピークからなる、 3つのピークから なるピーク列が特定される。
( E— 3 ) 始点ピーク→第一の中間点ピーク→第二の中間点ピーク→終点ピ ークの、 4つのピークからなるピーク列の特定
先ず、 ピーク位置の高い側のピークとして、 集合 S p a i r_I 2に含まれるピーク を、 ピーク位置の低い側のピークとして、 積集合 に含まれるピークを選択し て、 構成されるピーク 'ペアの集合 psl2一 C1≡ {(p ., Pj) ： P - ec^ P〗 espa i r_12} を形成し、 集合： PD1とこの集合 Psl 2— C1との積集合 pD1np S12— C1を作製する。 得られたピーク 'ペア （p Pj) の積集合 pD1nps l 2一 から、 各ペアのピーク位置の低い側のピーク の集合： spa i r— 13≡ {P i ： (p i, P j) ≡ΡΌ1 n PS12_C1} を構成する。 すなわち、 この集合 spa！ r一.1 3 は、 集合 spa ir— 12に含まれるピークに対する、 積集合 中の 「リンク先」 ピ ークの集合に相当している。 さらに、 集合 spa i r— 13と集合 spa i r— h2との積集 合： c3/2≡spa i r— 13n spa i r— h2を形成する。
さらに、ピーク位置の低い側のピークとして、差集合 F！に含まれるピークを、 ピーク位置の高い側のピークとして、積集合 c3/2に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集合 Pc3/2一 F1≡ Pい Pj) ： P い P〗
3/2} を形成し、 集合： Pd1とこの集合 PC3/2— F1との積集合 pD1npC3/2— F を作製する。 得られたピーク 'ペア い Ρ;) の積集合 pD1npC3/2_F1か ら、 各ペアのピーク位置の低い側のピーク Piの集合： FC3≡ {Pi： (Pi, Pj) epD1npC3/2_F1.} を構成する。 この集合 FC3は、 集合 c3/2に含まれるピー クに対する、 差集合 中の 「リンク先」 ピークの集合に相当している。
一方、 ピーク位置の低い側のピークとして、 集合 Spa i r_h2に含まれるピーク を、 ピーク位置の高い側のピークとして、 積集合 Ctに含まれるピークを選択し て、 構成されるピーク 'ペアの集合 Pcl_Sh2≡ {(Pi, Ρ』） ： PieSpa i r— h
2、 p jecj を形成し、 集合： pD1とこの集合 pcl_Sh2との積集合 pD1npc Sh2を作製する。 得られたピーク 'ペア （Pi, Ρ3) の積集合 pD1npcl一 Sh
2から、各ペアのピーク位置の高い側のピーク P〗の集合： s pa i r_h3≡ {P】：（P i, Pj) epD1npcl_Sh2} を構成する。 すなわち、 この集合 spa i r一 h3は、 集合 spa i r— h2に含まれるピークに対する、 積集合 中の 「リンク元」 ピーク の集合に相当している。 さらに、 集合 spai r_h3と集合 spai r_12との積集合： c3/1≡spai r— h3nspair— 12を形成する。
さらに、ピーク位置の高い側のピークとして、差集合 に含まれるピークを、 ピーク位置の低い側のピークとして、積集合 C3/1に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク ·ペアの集合 PB1—C3/1≡ {(Ρ,, Pj)： PiGC3 /い Pje
F を形成し、 集合： pD1とこの集合 pB1_C3/1との積集合： pD1npB1—C3 ハを作製する。 得られたピーク 'ペア （Pi, Ρ】） の積集合 pD1npB1_C3/1 力 ら、 各ペアのピーク位置の高い側のピーク Pjの集合： BC3≡ {Pj ： (ρ;, Pj) EpD1npB1— C3/1} を構成する。 この集合 BC3は、 集合 c3/1に含まれ るピークに対する、 差集合 中の 「リンク元」 ピークの集合に相当している。 結果として、 集合 BC3中の始点ピーク→集合 C3/1中の第一の中間点ピーク→ 集合 C3/2中の第二の中間点ピーク—集合 FC3中の終点ピークからなる、 4つの ピークからなるピーク列が特定される。
(E-4) 始点ピーク→第一の中間点ピーク→第二の中間点ピーク→第三の 中間点ピーク→終点ピークの、 5つのピークからなるピーク列の特定
先ず、 ピーク位置の高い側のピークとして、 集合 Spa — 13に含まれるピーク を、 ピーク位置の低い側のピークとして、 積集合 Ciに含まれるピークを選択し て、 構成されるピーク 'ペアの集合 psl3一 C 1≡ {(p i r p }y：
Figure imgf000149_0001
い ρ) espa ir_13} を形成し、 集合： pD1とこの集合 psl3_clとの積集合 pD1np S 13一 C1を作製する。 得られたピーク 'ペア （ρ Ρ;) の積集合 pD1npsl 3一 C1から、各ペアのピーク位置の低い側のピーク の集合： spair— 14≡ {ρ; ： (Pi, P e pD1npsl3_cl} を構成する。 すなわち、 この集合 spai r— 14 は、 集合 Spa i r_13に含まれるピークに対する、 積集合 中の 「リンク先」 ピ ークの集合に相当している。 さらに、集合 spai r— 14と集合 spa i r_h2との積集 合： c4/3三 spair一 14n spa i r_h2を形成する。
さらに、ピーク位置の低い側のピークとして、差集合 に含まれるピークを、 ピーク位置の高い側のピークとして、積集合 C4/3に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集合 PC4/3_F1≡ {(Pi; Pj) ：
Figure imgf000149_0002
い P j eC
4/3} を形成し、 集合： Pd1とこの集合 PC4/3— F1との積集合 pD1npC4/3_F を作製する。 得られたピーク .ペア （Pi， Pj) の積集合 pD1npC4/3— F1か ら、 各ペアのピーク位置の低い側のピーク P iの集合： FC4三 {P i： (P i， Pj) ePDinPC 4/3-Fi} を構成する。 この集合 FC4は、 集合 C4/3に含まれるピー クに対する、 差集合 中の 「リンク先」 ピークの集合に相当している。
—方、 ピーク位置の低い側のピークとして、 集合 spair_h3に含まれるピーク を、 ピーク位置の高い側のピークとして、 積集合 に含まれるピークを選択し て、 構成されるピーク 'ペアの集合 Pcl-sh3三 {(Pi, Pj)： Piespa i r— h
3、 P を形成し、 集合： pD1とこの集合 pcl_Sh3との積集合 pD1npc i-s を作製する。 得られたピーク 'ペア （P i， P j) の積集合 pD1npcl—Sh
3から、各ペアのピーク位置の高い側のピーク Pjの集合： Spa i r_h4三 {Pj： (P い Pj) e pD1npcl_Sh3} を構成する。 すなわち、 この集合 spai r_h4は、 集合 spa i r— h3に含まれるピークに対する、 積集合 中の 「リンク元」 ピーク の集合に相当している。 さらに、 集合 spa i r_h4と集合 spa i r_12との積集合：
C4/l≡ S pa； r-h4 Π S pa i 2を开成する。
さらに、ピーク位置の高い側のピークとして、差集合 B iに含まれるピークを、 ピーク位置の低い側のピークとして、積集合 c4/1に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク ·ペアの集合 PB1_C4/1≡ {(P i( Pj) ： P ;eC4/1 PjG
F } を形成し、 集合： pD1とこの集合 pB1—C4/1との積集合： pD1npB1_C4 ハを作製する。 得られたピーク 'ペア （Pi, Pj) の積集合 pD1npB1— C3/1 から、各ペアのピーク位置の高い側のピーク Ρ〗の集合： BC4/1≡ {Pj ： (Pi, Pj) ePDinPB1_C4/1} を構成する。 この集合 BC4は、 集合 C4/1に含まれ るピークに対する、 差集合 中の 「リンク元」 ピークの集合に相当している。 加えて、 集合 spair—h3と集合 spair_13との積集合： c4/2≡spa ir—h3n spa ir— 13を形成する。 この積集合 c4/2に含まれるピークは、 集合 spair一 h 2 に含まれるピークに対する、 集合 spa ir— 13中の 「リンク元」 ピークであり、 か つ、集合 Spa i r— 12に含まれるピークに対する、集合 Spa i r_h3中の「リンク先」 ピークである、 中間点ピークの集合に相当する。
結果として、 集合 BC4中の始点ピーク→集合 C4/1中の第一の中間点ピーク→ 集合 c4/2中の第二の中間点ピーク→集合 C4/3中の第三の中間点ピーク→集合 F c 4中の終点ピークからなる、 5つのピークからなるピーク列が特定される。
(E— 5) 6以上のピークからなるピーク列の特定
6以上のピークからなるピーク列に関しても、 上述する E— 3， E— 4に記載 する手順に準じて、 順次、 段数を増しつつ、 複数段の中間点ピーク、 対応する始 点ピーク、 終点ピークの各集合を特定することができる。 最終的には、 N段数目 の増加 （N+1個のピークからなるピーク列） に達した際、 始点ピーク側から連 結してきた、 「リンク先」 のピーク集合 s p a i r— 1 Nは、 ゼロ集合、 また、 終点ピ ーク側から連結してきた、 「リンク元」 のピ ^ク集合 s p a i r一 h Nも、 ゼロ集合と なるので、 その前段階、 （N— 1 ) 段数目の増加 （N個のピークからなるピーク 列） 力 最長のピーク列を与えるものとなる。
勿論、 理想的な C末アミノ酸の逐次的な分解反応が達成されている場合には、 上記ピーク 'ペア （P i , P j ) の集合 P D 1には、 （N— 1 ) 段数からなる、 C末 端からの逐次的なアミノ酸分解に起因する、 一連の C末断片ペプチドに由来する ピーク .ペアしか含まれないので、 上に記載する E— 2 , E— 3， E— 4の各過 渡的な段階では、 N個のピークからなるピーク列ではないものは、 原則的に見出 されない。 そして、 （N— 1 ) 段数目の増加 （N個のピークからなるピーク列） に際して、 一義的な C末端からの逐次的なァミノ酸分解シリーズを反映するもの が初めて選択される。
但し、 例えば、 C末アミノ酸の逐次的な分解反応に際して、 ヘプチド鎖の途中 での断裂が生じたものが副生すると、 この副生されたペプチド断片より、 その C 末ァミノ酸の逐次的な分解反応が進行した、 一連のぺプチド断片産物が副生する。 そのため、 （N— 1 ) 段数からなる、 一連の C末断片ペプチドに由来する主なピ ーク列以外に、 数段の段数からなる副次的なピーク列群も、 特定される場合もあ る。 その場合、 各ピーク列群について、 既に、 個々のピーク 'ペアに関しては、 可能性を有する脱離アミノ酸残基の種類に相当する k値は、 考察しており、 その 脱離アミノ酸残基の種類に相当する k値を利用して、 始点ピーク→ (複数段の中 間点ピーク） →終点ピークに相当する、 脱離アミノ酸残基シリーズを特定した上 で、 その C末端のアミノ酸の種類、 ピーク強度をも参照して、 副次的なピーク列 群を排除する。 すなわち、 ヘプチド鎖の途中での断裂は、 ある程度の頻度で発生 はするものの、 一般に、 その種の副次反応に由来するペプチド断片の総量は、 主 なペプチド断片の総量と比較すると、 少なくなつており、 観測されるピーク強度 も相対的に小さなものとなる。 そのため、 各段数の異なるピーク列群における、 観測される各ピーク強度に基づき、 各段数の異なるピーク列群のピーク強度の総 和を算出し、 その合計したピーク強度の相対比較を行い、 より合計ピーク強度の 大きなピーク列群を選択する。 (E— 7) 特定された N個のピークからなるピーク列群における、 個々のピー ク列の特定
例えば、 上述する E— 4で特定された集合 B c 4中の始点ピーク→集合 C 4/ i中 の第一の中間点ピーク—集合 C4/2中の第二の中間点ピーク→集合 C4/3中の第 三の中間点ピーク→集合 FC4中の終点ピークからなる、 5つのピークからなるピ ク列群を例に採り、 個々のピーク列の特定手順を示す。
先ず、 ピーク位置の高い側のピークとして、集合 BC4に含まれる一つの始点ピ ーク Pj。を、 ピーク位置の低い側のピークとして、 積集合 C4/1に含まれるピー クを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集合 PBC4-C4/1 (P j 0) ≡ {(P i, P i 0) ： P ieC4/1 Pj。eBC4} を形成し、 集合： PD1とこの集合 P BC4-C4
/! (Pj 0) との積集合 pD1npBC4—C4/1 (pj 0)を作製する。得られたピーク · ペア （p pj 0) の積集合 pD1npBC4一 C4/1 (pj 0) 力 >ら、 各ペアのピーク 位置の低い側のピーク P iの集合： c4/1 (p j 0) ≡ {P i : (P p j 0) epD inpBC4-c4/i ( jo)) を構成する。 すなわち、 この集合 c4/1 (pj 0) は、 集合 BC4に含まれる一つの始点ピーク 。に対する、第一の中間点ピーク集合 C
4/1中の 「リンク先」 ピークの集合に.相当している。
次いで、 ピーク位置の高い側のピークとして、 集合 c4/1 (p j 0) に含まれる
—つの第一の中間点ピーク PjC4/1 (Pj 0) を、 ピーク位置の低い側のピークと して、 積集合 c4/2に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集 Pc4/1— C4/2 (1 j C4/l) = {(I i ' j C4/l (1 j O Ρ ί j C
4/1 (P j o) C4/1 (P j o)} を形成し、 集合： PD1とこの集合 P C4/1-C4/2
(pj C4/i) との積集合 PD1npC4/1— C4/2 (pjC4/1) を作製する Q 得られた ピーク .ペア （P i, P jC4/l (pj 0)) の積集合 pD1npC4/1_C4/2 (pjC4/
1) から、各ペアのピーク位置の低い側のピーク p；の集合： c4/2 (pj 0) ≡ {P i ： (Pi, PjC4/1 (Pj 0)) epDinPC4/1_C4/2 (Pi C4/i)} を構成する。 すなわち、 この集合 C4/2 (P j 0) は、 集合 C4/1 (Pj 0) に含まれる一つの第 一中間点ピーク PjC4/1 (Pj 0) に対する、 第二の中間点ピーク集合 c4/2中の
「リンク先」 ピークの集合に相当している。
更に、 ピーク位置の高い側のピークとして、 集合 C4/2 (Pj 0) に含まれる一 つの第二の中間点ピーク PjC4/2 (Pj (3) を、 ピーク位置の低い側のピークとし て、 積集合 c4/3に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク ·ペアの集合 C4/2-C4/3 j C4/2) = {(1 i P j C4/2 jo)) '·
Figure imgf000153_0001
し 4/3 1 j C4/
2 (Pj 0) ≡c4/2 (Pj 0)} を形成し、 集合： PD1とこの集合 P C4/2-C4/3 (P j C4/2) と
Figure imgf000153_0002
D 1 P C /2-C4/3 (P j C4/2 ) を作製する。 得られたピー ク 'ペア （P i, pjC4/2 (pj 0)) の積集合 pD1npC4/2一 C4/2 (pjC4/2) から、各ペアのピーク位置の低い側のピーク p iの集合： c4/3 (pj0)ョ {Pi (Pi, Pj C4/2 (Pj 0)) epD1npC4/2_C4/3 (Pj C4/2)} を構成する。 す なわち、 この集合 C4/3 (P j 0) は、 集合 C4/2 (Pj 0) に含まれる一つの第二 中間点ピーク pjC4/2 (pj0)に対する、第三の中間点ピーク集合 c4/3中の「リ ンク先」 ピークの集合に相当している。
最後に、 ピーク位置の高い側のピークとして、 集合 C4/3 (P j 0) に含まれる 一つの第三の中間点ピーク p.jC4/3 (pj 0) を、 ピーク位置の低い側のピークと して、 集合 FC4に含まれるピークを選択して、 構成されるピーク 'ペアの集合 P C4/3-FC4 ] j C4/3) = i ' I j C4/3 j 0 ) ) Pi 4 ^ j C4/3 j0) eC4/3 (Pj 0)} を形成し、 集合： PD1とこの集合 PC4/3- FC4 (P j C4/
3) との積集合 pD1npC4/3一 FC4 (pjC4/3) を作製する。 得られたピーク 'ぺ ァ （Pi, Pj C4/3 (Pj 0)) の積集合 PD1npC4/3一 FC4 (Pj C4/3) 力 ら、 各 ペアのピーク位置の低い側のピーク P iの集合： FC4 (Pj 0) ョ {Pi (Pi, pj C 4/3 (Pj 0)) epD1npC4/4_FC4 (pjC4/3 を構成する。 すなわち、 この集合 FC4 (Pj 0) は、 集合 C4/3 (Pj 0) に含まれる一つの第三中間点ピー ク Pj C4/3 (Pj 0) に対する、 終点ピーク集合 FC4中の 「リンク先」 ピークの集 合に相当している。
以上に示す、 「リンク先」 ピークの特定操作を行った結果、 5つのピークから なるピーク列群より、始点ピーク P j。 G B c 4を始点とするピーク列群を特定でき る。 なお、 始点ピーク Pj。GBC4に対して、 付随するピークを始点ピークとして も、 同様な中間点ピークを経由するピーク列群を特定できる。 この始点ピークよ り、 中間点ピークを経由し、 終点ピークに到る、 「リンク先」 ピークの特定操作 は、先に述べた、最もピーク位置の高いピークを起点 （親ペプチド断片のピーク） として、 逐次的にアミノ酸の分解する反応産物に由来する 「娘ペプチド断片のピ ーク」 を特定する解析と等価である。
—方、 予め、 集合 B C 4中の始点ピーク→集合 C 4/ 1中の第一の中間点ピーク→ 集合 C 4/ 2中の第二の中間点ピーク→集合 C 4/3中の第三の中間点ピーク—集合 F C 4中の終点ピークからなる、 5つのピークからなるピーク列群の抽出がなされ ているので、 対応する手順を採用して、 集合 F C 4中の終点ピークを起点として、 中間点ピークを経由し、 始点ピークに到る、 「リンク元」 ピークの特定操作とす ることも可能である。勿論、 この「リンク元」 ピークの特定操作も、原理的には、 「リンク先」 ピークの特定操作と、 同様の結果を与えることになる。
いずれの操作を採用する場合も、 一連のピーク列群中、 付随的な産物に由来す るピークを伴っていない 「単独ピーク」 に関しては、 主には、 （i ) 理想的な反 応産物の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピークと仮定して、解析を進め ることが望ましい。 一方、 「単独ピーク」 を、 （ii) 余剰なァセチル化を受けてい る付随的な産物の状態のペプチド断片に起因するイオン種ピーク、 あるいは、 (iii) 「脱水」 を受けている付随的な産物の状態のペプチド断片に起因するィォ ン種ピークと判断し、理想的な反応産物の状態のぺプチド断片に起因するイオン 種ピークは、 観測下限以下のピーク強度であると推定する際には、 例えば、 その
「リンク元」 ピークにおいても、 少なくとも、 （i ) 理想的な反応産物由来のィ オン種ピークと比較して、 対応する （ii) 余剰なァセチル化体に由来するイオン 種ピークまたは （iii) 「脱水」 体に由来するイオン種ピークが、 同様により大き なピーク強度を示すことを確認する必要がある。 実施例
以下に、 実施例を挙げて、 本発明をより具体的に説明する。 なお、 かかる実施 例は、 本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、 本発明はかかる具 体例の形態により限定を受けるものではない。
(実施例 1 )
本発明の第一の形態にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法の有用 性を検証する目的で、 1 5 3アミノ酸からなるヘムタンパク質、 ゥマ由来のミオ グロビンについて、 そのタンパク質部分グロビン ·ぺプチド鎖の C末端アミノ酸 配列の解析を行った。
本実施例で利用する、 解析対象試料となるゥマ · ミオグロビンのグロビン ·ぺ プチド鎖が有するァミノ酸配列は既に判明しており、 本発明にかかる解析方法で 特定される C末端アミノ酸配列の特定精度を検証した。 図 1に、 本実施例 1にお ける C末端ァミノ酸の逐次的な分解工程の工程フローを示す。
(単離、 乾燥ペプチド粉末試料の調製）
先ず、 市販されているゥマ ' ミオグロビン標品について、 1. O^ gZ Lの 濃度でグロビン ·ぺプチド鎖部分のみを含有するぺプチド溶液を調製する。 前記 ぺプチド溶液を試験管に採り、凍結乾燥して、乾燥べプチド粉末試料を調製する。
(前処理操作）
次いで、 この乾燥ペプチド試料を収納したパイアルを、 テフロン製コックバル プ封止される真空排気用のポートを具えた、 共栓付き気密試験管型のガラス製反 応容器内に装着し、 このガラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量 入れる。前処理用の試薬として、酢酸を 5体積％添加した無水酢酸（ 300 μ L) を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥べプチド試料を収納したバイアルを収納 した後、 冷却下、 反応容器内を真空排気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 50°C、 2時間保温して、 容器内の液状試薬 力 供給される、 蒸気状の無水酢酸と酢酸を、 乾燥ペプチド試料に作用させる。 このァシル化試薬として、 無水酢酸を酢酸共存下で、 乾燥べプチド試料に作用さ せることで、 ぺプチドの N末端アミノ基に選択的なァセチル化反応が進行する。 加えて、 ペプチド鎖内に含有される、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2C H2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化、 同時に、 セ リン残基 （一 NH— CH (CH2OH) —CO—) ゃトレオユン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対する O—ァ セチル化、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) の フエノール性ヒドロキシ基への O―ァセチル化がなされる。
力かる前処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や酢酸等 を減圧留去するとともに、 得られる保護 ·修飾されたグロビン ·ぺプチド鎖の乾 燥を行う。
( C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
次いで、 得られるァセチル基による修飾 ·保護を施したグロビン ·ぺプチド鎖 を保持しているバイアルを、 同じく共栓付き気密試験管型のガラス製反応容器内 に装着した状態で、 このガラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量 入れる。
この C末端アミノ酸の選択的分解反応用の液状試薬として、 ヘプタフルォロブ タン酸（H F B A： C 3 F 7 C O O H) を 1体積0 /0添加した無水酢酸（3 0 0 μ L) を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥試料を収納したバイアルを収納した後、 冷却下、 反応容器内を真空排気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 4 0 °C、 3時間保温して、 容器内の液状試薬 力 ら供給される、 蒸気状の無水酢酸と H F B Aを、 乾燥ペプチド試料に作用させ る。 その間、 ペプチド鎖 C末端に対して、 H F B Aと無水酢酸とを前記加熱温度 で作用させることで、 上述する反応式 （I a ) 〜 （ΙΓ ) の反応経路を経て、 ぺ プチド鎖の C末端アミノ酸の逐次的分解反応が進行する。 その際、 かかる反応産 物のペプチド鎖 C末端は、 上述する 5—ォキサゾロン環あるいは、 カルボキシ基 の活性化が図られた非対称型酸無水物の形態となっている。
力かる C末端アミノ酸の選択的分解処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や H F B A等を減圧留去するとともに、 残余するァセチル化保 護 ·修飾されたグロビン ·ぺプチド鎖と得られる反応産物との混合物の乾燥を行 う。
(後処理操作）
次いで、 反応産物が含まれる混合物の乾燥試料を保持しているバイアルを、 同 じく共栓付き気密試験管型のガラス製反応容器内に装着した状態で、 このガラス 製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量入れる。
この後処理は、 主に、 前記混合物中では、 反応産物ペプチドの C末端は、 カル ボキシ基に変換されたもの以外に、 5—ォキサゾロン構造に留まったもの、 ある いは、 非対称型酸舞水物への変換まで進行したものも、 含まれた混合物状態とな つているため、 これらに加水処理を施し、 ペプチドの C末端は、 カルボキシ基と なった状態へと変換する処理である。 すなわち、 後処理用の液状試薬として、 D MAEを 10体積％溶解した水溶液 （300 μ L) を用い、 前記ガラス製反応容 器内に乾燥試料を収納したバイアルを収納した後、 冷却下、 反応容器内を真空排 気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 60°C、 1時間加熱して、 容器内の液状試薬 から供給される、 蒸気状の DMAEと水分子を、 乾燥試料に作用させる。 非対称 型酸無水物ならびに 5—ォキサゾロン構造は、 有機塩基である DMAEの共存下、 水分子を作用することで、 加水がなされ、 上述する反応式 （IV) に示すように、 C末端にカルボキシ基を有する形状に変換される。 加えて、 ァセチル基による修 飾'保護を施したペプチド鎖上、 セリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) — C O— ) ゃトレオニン残基 （一 NH—CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存 在するヒドロキシ基に対する O—ァセチル化保護は加水分解され、 脱保護がなさ れ、 また、 チロシン残基 （一 NH—CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) の フエノ一ル性ヒドロキシ基への O—ァセチル化保護の加水分解もほぼ全て進む。 但し、 用いる有機塩基の塩基性は高くないため、 N—ァセチル化保護の脱保護は 進まず、 最終的に後処理工程後には、 より高い選択性を持って、 N末端のァミノ 基に対する N—ァセチル化、 リシン残基（一 NH— CH (CH2CH2CH2CH2 NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化が残るものとなる。 場 合によっては、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエノール性ヒドロキシ基への O—ァセチルイ匕が僅かに残るものとなる。
力かる後処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 残余している水分子や DM A E等を減圧留去するとともに、 後処理済み反応産物の混合物の乾燥を行う。
(トリプシン消化によるべプチド断片化）
ゥマ 'ミオグロビンのグロビン 'ぺプチド鎖は、 153アミノ酸からなるため、 質量分析における、 適正な分子量範囲を逸脱しており、 トリプシン消化によるべ プチド断片化処理を行う。
具体的には、 前記後処理済み反応産物の混合物を乾燥した試料を容器内に入れ、 トリプシン含有水性溶液を加え、 ペプチド鎖の断片化を行う。 前記トリプシン含 有水性溶液は、 3 ^ピリジン酢酸緩衝液 (pH 7) 中に、 トリプシンを 0. 1 μ g Lの濃度で含有しており、 トリプシン消化は、 37°Cで、 攪拌しつつ、 8時間酵素反応を行う。
なお、 元のペプチド鎖、 反応産物は、 前記後処理工程における脱保護によって も、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基 （一 NH— CH (C H2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化は 保持された状態であり、 トリプシン消化によっては、 前記 N—ァセチル化リシン 残基の C末側ぺプチド結合の切断はなされず、 アルギニン残基の C末側ぺプチド 結合切断のみが進行する。 このゥマ ' ミオグロビンのグロビン'ぺプチド鎖が有 するアミノ酸配列は既に判明しており、 図 7に示す、 153アミノ酸からなる元 のぺプチド鎖は、アルギニン残基におけるトリプシン消化を受けると、 1— 31、 32— 139、 140- 153の各部分ァミノ酸配列を含む断片が生じる。 従つ て、 上述する C末端アミノ酸の逐次的分解処理で生成される一連の反応産物は、 前記 140—153アミノ酸の部分アミノ酸配列を含む C末断片とともに、 各 C 末端アミノ酸に相当する分子量差を示す、 一連の質量分析ピークを与える。
トリプシン消化後、反応液は、 Z i p T i pを利用して、脱塩処理、ならびに、 ぺプチド断片の分離 ·回収を行った後、 これらべプチド断片の凍結乾燥を行う。
(後処理、 トリプシン消化によるべプチド断片化済みの反応産物の特定） 以上の一連の処理を施して得られる、 後処理、 ペプチド断片化済みの反応産物 とグロビン.ペプチド鎖の C末断片との混合物について、 質量分析法により、 含 有される各ぺプチド断片の分子量の測定を行う。
本実施例では、 乾燥したペプチド断片混合物試料に対して、 MALD I— TO F-MS装置を利用し、 各ぺプチド断片の分子量を反映する主ィオン種ピークの 質量と、 その相対的な信号強度の測定、 比較を行う。 なお、 かかる MALD I— TOF— MS装置を利用する測定では、 イオン種の分別は、 負帯電イオン種を検 出器へ導く、所謂ネガティブ 'モードの測定と、正帯電イオン種を検出器へ導く、 所謂ポジティブ ·モードの測定との双方を行う。 すなわち、 各ペプチド断片の分 子量を反映する主イオン種として、 ポジティブ.モードの測定において、 ブロト ン （H+) が付加.された陽イオン種、 ネガティブ 'モードの測定において、 プロ トン （H+) が離脱さいた陰イオン種の、 対応する二種のスペクトルを得る。 図 3に示すポジテイブ 'モードの測定と、 図 4に示すネガテイブ 'モードの測 定とを対比すると、 ゥマ · ミオグロビンのグロビン 'ペプチド鎖に由来するトリ プシン消化断片に相当する主な二つのピークとして、 1— 3 1の部分アミノ酸配 列、 ならびに、 1 4 0— 1 5 3の部分アミノ酸配列を含む断片が、 かかる分子量 範囲に見出される。 図 3に示すポジティブ 'モードの測定において、 その強度は 相対的に大きなピークは、 C末端にアルギニン残基を有する 1一 3 1の部分アミ ノ酸配列の N末側ペプチド断片に相当し、 一方、 図 4に示すネガティブ 'モード の測定において、 その強度は相対的に大きなピークは、 アルギニン残基を含まな レヽ 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸配列の C末側ぺプチド断片に相当すると判定 される。 加えて、 3 2— 1 3 9の部分アミノ酸配列中、 N—ァセチル基の離脱さ れたリシン残基における切断で派生する、 7 8— 1 0 2の部分ァミノ酸配列に相 当するペプチド断片も見出され、 同じく、 図 3に示すポジティブ ·モードの測定 において、 その強度は相対的に大きなピークを示している。 その他、 トリプシン の自己消化で生じるペプチド断片も、 かかる分子量範囲で見出され、 同じく、 図 3に示すポジティブ 'モードの測定において、 その強度は相対的に大きなピーク を示している。
該トリプシンの自己消化で生じるぺプチド断片に由来するピークにおいて、 そ の半値全幅は 1 . 5程度を示しており、 この値よりも極端に半値全幅が小さなス パイクは、 スパイク状ノイズと判断して、 下記の解析において、 考慮から外して いる。 加えて、 最終的に測定される質量スぺクトル情報は、 デジタル化記録した 上で、 各ピークの中心値読み取りに先立ち、 前記スパイク状ノイズの除去と、 ピ ーク形状の整形処理を施している。その際、該トリプシン由来のピークにおける、 ピーク形状、半値全幅を損なわない整形処理（スぺクトル形状の関数近似化処理） を選択している。また、各ピークの中心値読み取り後、前記整形処理、あるいは、 使用している MA L D I— T O F— M S装置に依存した、 系統的読み取り誤差の 有無判定、 その較正は、 該トリプシン由来のピークの既知中心値に基づき、 自動 的にプログラム処理を施す方式を採用している。
図 4に示すネガテイブ.モードの測定では、 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸配 列の C末側ぺプチド断片に加えて、 C末端ァミノ酸の逐次的分解処理を施した反 応産物に由来する一連の c末側ペプチド断片も、 その強度は相対的に大きく測定 されている。 表 4に、 図 3と図 4の測定結果に基づき、 対応するイオン種ピーク の特定を行った結果を示す。表 5に、測定されたピークの質量値、元のグロビン · ペプチド鎖の C末断片に起因するピークの質量値との差異、 ならびに、 それから 特定される、 各反応産物断片において除去されているアミノ酸、 および、 各反応 産物の形態を示す。 表 4
相対ピーク m/Z 相対ピーク強 帰属 強度 (M + H+) 度
931. 23 16. 03 ？ M=930
1123. 21 23. 71 ？ M=1122
1245. 74 4. 30 braall peak Mb C-terra 140-149
1302. 58 Trace Mb C-term 140-150
1388. 13 15. 14
1390. 15 89. 62 ？ M=1389
1391. 15 76. 71 +1 isotope
1392. 15 37. 31 +2 isotope
1449. 58 11. 22 ¾mall peak Mb C-term 140-151
1451. 51 6. 00
1559. 48 8. 76
1577. 56 90. 32 —1 (1578. 55) ？
1578. 55 100. 00 1579. 10 16. 93 Mb C-term 140-152
1579. 53 67. 34 +1 isotope
1616. 59 10. 91
1634. 61 44. 41 -1 (1635. 58) ？
1635. 58 59. 08 Small peak Mb C-term 140-153
1636. 55 42. 72 +1 isotope
1658. 63 27. 62
1659. 62 27. 39
1664. 37 3. 32
1741. 11 15. 68
2119. 11 3. 08
2230. 44 2. 44 2233. 15 14. 43
2250. 18 4. 16
2557. 20 4. 99
2597. 11 1. 62 2599. 28 8. 66
Figure imgf000161_0001
表 5
Figure imgf000161_0002
本実施例 1の蒸気状の試薬を利用する処理法では、 C末端ァミノ酸の逐次的分 解処理により、 C末端から 4アミノ酸；グリシン、 グルタミン、 フエ二ルァラ二 ン、 グリシンの除去された一連の反応産物が得られている。 なお、 図 4に示すネ ガテイブ 'モードの測定には、 前記 1 4 0— 1 5 3ァミノ酸の部分ァミノ酸配列 を含む C末端べプチド断片等のピーク以外に、 トリプシン消化により派生するべ プチド断片、 1 一 3 1アミノ酸部分、 7 8—1 0 2アミノ酸部分に相当する、 二 つのピーク （分子量： 2 9 9 6 . 1 8、 3 4 8 5 . 4 8 ) は観測されている力 7 8— 1 0 2ァミノ酸部分に相当するもの以外には、 リシン残基の脱保護に付随 して、 トリプシン消化により副生したと判定可能なペプチド断片は、 かかる分子 量範囲に見出されていない。 従って、 図 3に示すポジティブ 'モードの測定と、 図 4に示すネガティブ ·モードの測定とを対比することで、 トリプシン消化によ り派生する C末端にアルギニン残基を有するペプチド断片と、 N—ァセチルイ匕保 護の脱落したリシン残基を C末端に有するペプチド断片に対応しているイオン 種は容易に判別でき、 加えて、 リシン残基におけるトリプシン消化を受けたぺプ チド断片多種が、 かかる分子量範囲に混在していないため、 目的とする C末端べ プチド断片と、 付随する C末端アミノ酸の逐次的分解処理がなされている一連の C末端べプチド断片の弁別に際して、 その作業はより容易となる。
(実施例 2 )
本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列角军析方法の有効 性を検証する目的で、 ゲル担体上に担持されている 1 5 3アミノ酸からなるヘム タンパク質、 ゥマ由来のミオグロビンについて、 そのタンパク質部分グロビン ' ぺプチド鎖の C末端アミノ酸配列の解析を行った。
本実施例では、 解析対象試料となるゥマ ' ミオグロビンを、 ポリアクリルアミ ド ·ゲルを利用して、 S D S— P A G E法によりゲル電気泳動して、 単一スポッ トとして、 そのグロビン 'ペプチド鎖を分離した後、 本発明にかかる解析方法で 特定される C末端アミノ酸配列の特定精度を検証した。
(ゲル電気泳動法による単離）
先ず、 市販されているゥマ ' ミオグロビン標品について、 0 . 2 β / の 濃度でグロビン 'ぺプチド鎖部分のみを含有するべプチド溶液を調製する。なお、 該、 ゥマ · ミォグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖部分には、 ヒ ト ' ミォグロビン と異なり、 システィン残基は存在しないが、 仮に、 ヒト · ミオグロビンなどのよ うに、 システィン残基を内在するペプチドに対しては、 該システィン 基のスル ファニル基 （一 S H) の酸化による、 一S— S—結合の形成を回避するため、 2 一スルファニルエタノール（H S— C 2 H 2— O H : 2—メルカプトエタノール）、 D T T (ジチオトレイ トール： トレオ一 1 , 4—ジスルファニル一 2 , 3—プタ ンジオール） などの還元性試薬を添加するなどして、 予め酸化防止処理を施す。 このぺプチド溶液を、 ゲル濃度 1 2 . 5質量％のポリアクリルアミド ·ゲル上 にスポットし、 泳動処理後、 クーマシー '染色により、 目的とするグロビン 'ぺ プチド鎖のバンドを特定する。本例では、かかる染色パンド部のゲルを切り出し、 ゲル切片を以下の一連の操作に供する。
(ゲルの脱水処理）
ゲル切片を、 気密性を有するチューブ中に入れ、 ァセトニトリル l m 1を注 入し、 15分間攪拌する。 その後、 前記ァセトニトリルを棄て、 新たに、 ァセト 二トリル lmLを注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利用 する、ゲル中に含浸する水の抽出処理を、合計 3回行い、ゲルの脱水処理を行う。 脱水処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生じる。
(前処理操作）
次いで、 チューブ中で、 脱水処理済みのゲル切片に、 10体積％濃度の無水酢 酸のホルムアミド溶液 1 mLを注入する。 乾燥雰囲気下で、 蜜栓したチュー ブを攪拌しつつ、 該容器全体の温度を、 50°Cに加熱し、 かかる温度に、 3時間 保持する。
この加熱保持の間に、 当初、 体積収縮しているゲルは、 溶媒ホルムアミ ドの浸 潤に従って、 再膨潤し、 本来の体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持され ているグロビン'ペプチド鎖に対して、 溶質の無水酢酸が、 前記加熱温度で作用 する結果、 ペプチドの N末端アミノ基に選択的なァセチルイヒ反応が進行する。 加 えて、 ペプチド鎖内に含有される、 リシン残基 （一 NH—CH (CH2CH2CH 2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化、 同時に、 セリ ン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) ゃトレオニン残基 （一 NH— C H (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒドロキシ基に対する O—ァセ チル化、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフ ェノール性ヒドロキシ基への O—ァセチル化がなされる。
上記の N末端アミノ基の N—ァセチル化、 ならびに、 アミノ酸残基側鎖の N— ァセチル化、 O—ァセチル化による保護を施した後、 無水酢酸のホルムアミド溶 液を除去し、 チューブ容器中にァセトニトリル lmLを注入し、 15分間攪拌 する。 その後、 前記ァセトュトリルを棄て、 新たに、 ァセ小二トリル lmLを 注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利用する、 ゲル中に含浸 するホルムアミド溶液の抽出処理を、 合計 3回行い、 再膨潤ゲル中の脱溶媒 （ホ ルムアミド） 処理を行う。 脱溶媒処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生じ、 同時に、 ゲルの脱水処理もなされる。
( C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
次いで、 図 2に示す工程のように、 前記脱水処理によって、 収縮したゲルの再 膨潤と、反応試薬のゲル内への浸潤を行う。具体的には、前処理操作を終えた後、 得られるァセチル基による修飾 ·保護を施したグロビン ·ぺプチド鎖をゲル中に 担持されている状態の、 ゲル切片を入れた前記チューブ内に、 ヘプタフルォロブ タン酸 （H.F BA： C3F7COOH) 1体積0 /0、 無水酢酸 10体積0 /0のホルムァ ミド溶液 1 mLを注入する。 乾燥雰囲気下で、 蜜栓した容器を攪拌しつつ、 該容器全体の温度を、 40°Cに加熱し、 かかる温度に、 16時間保持する。 この加熱保持の間に、 当初、 体積収縮しているゲルは、 溶媒ホルムアミドの浸 潤に従って、 再膨潤し、 本来の体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持され ているぺプチド鎖 C末端に対して、 H F B Aと無水酢酸とを前記加熱温度で作用 させることで、 ぺプチド鎖の C末端ァミノ酸の選択的分解反応が進行する。 具体 的には、 ペプチドの C末端において、 上述する反応式 （I a) 〜 （ΙΓ) の反応 経路を経て、 5—ォキサゾロン環形成を介する、 ペプチド鎖の C末端アミノ酸の 逐次的分解反応が進行すると推定される。 かかる逐次的分解の各反応過程は、 双 極性溶媒であるホルムアミド中において、 プロトン' ドナーとして機能する HF B Aの触媒作用によって、 その反応の促進がなされている。
この C末端アミノ酸の逐次的な分解反応が進行し、 ゲル中には、 段階的に C末 端アミノ酸が除去された、 一連の反応産物と、 初段の 5—ォキサゾロン構造への 変換時点に留まっている、 ァセチル基による修飾 ·保護を施した元のぺプチド鎖 とが含まれた混合物が、 ゲル担体に担持された状態で残される。 かかる C末端ァ ミノ酸の逐次的分解処理を終えた後、 容器内に残留する、 未反応の無水酢酸や H FB A等を含むホルムアミド溶液を除去し、容器中にァセトュトリル lmLを 注入し、 15分間攪拌する。 その後、 前記ァセトエトリルを棄て、 新たに、 ァセ トニトリル lmLを注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利 用する、 ゲル中に含浸するホルムアミド溶液の抽出処理を、 合計 3回行い、 再膨 潤ゲル中の脱溶媒 （ ルムアミド） 処理を行う。 脱溶媒処理に伴い、 ゲル体積の 収縮が生じ、 同時に、 ゲルの脱水処理もなされる。
(後処理操作）
次いで、 反応産物が含まれる混合物が担持されている状態のゲル切片を入れた 前記容器内に、 DMAE ((CH3) 2N— CH2CH2〇H) 10体積0 /0濃度の水 溶液 1 mLを注入する。 蜜栓した該容器を攪拌しつつ、 容器全体の温度を、 60°Cに加熱し、 かかる温度に、 1時間保持する。 その際、 脱水処理されていた ゲルは、 溶媒水の浸潤に従って、 速やかに再膨潤し、 本来の体積に復する。 この 再膨潤したゲル中に担持されているペプチド鎖、 反応産物に対して、 塩基性窒素 含有有機化合物の存在下、 水分子を前記加熱温度で作用させることで、 加水処理 が進行する。
この後処理における加水処理は、 主に、 前記混合物中では、 反応産物ペプチド の C末端は、 カルボキシ基に変換されたもの以外に、 5—ォキサゾロン構造に留 まったもの、 あるいは、 非対称型酸無水物への変換まで進行したものも、 含まれ た混合物状態となっているため、これらに加水処理を施し、ペプチドの c末端は、 カルボキシ基となった状態へと変換する処理である。 加えて、 塩基性窒素含有有 機化合物が塩基触媒として機能することに伴い、 ァセチル基による修飾 ·保護を 施したペプチド鎖上に、 セリン残基 （一 NH— CH (CH2OH) -CO-) や トレオニン残基 （一 NH— CH (CH (CH3) OH) -CO-) に存在するヒ ドロキシ基に対する O—ァセチルイ匕保護は加水分解され、 脱保護がなされる。 ま た、 チロシン残基 （_NH_CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエノ 一ル性ヒドロキシ基への O—ァセチル化保護の加水分解も、 同様に進む。 但し、 用いる有機塩基の塩基性は高くないため、 N—ァセチル化保護の脱保護は進まず、 最終的に後処理工程後には、 より高い選択性を持って、 N末端のァミノ基に対す る N—ァセチル化、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2CH2CH2CH2NH2) -CO-) の ε位のアミノ基への N—ァセチル化が残るものとなる。 場合によつ ては、 チロシン残基 （一 NH— CH (CH2-C6H4-OH) -CO-) のフエ ノール性ヒドロキシ基への O—ァセチル化が、 極く僅かに残るものとなる。
かかる後処理工程を終えた後、 容器内に残留する水溶液を除去し、 容器中にァ セトニトリル lmLを注入し、 15分間攪拌する。 その後、 前記ァセトニトリ ルを棄て、 新たに、 ァセトニトリル lmLを注入し、 更に 15分間攪拌する。 このァセトニトリルを利用する、 ゲル中に含浸する水溶液の抽出処理を、 合計 3 回行い、 再膨潤ゲル中の脱水処理を行う。 脱水処理に伴い、 ゲル体積の収縮が生 じる。 (トリプシン消化によるべプチド断片化）
ゥマ 'ミオグロビンのグロビン'ペプチド鎖は、 153アミノ酸からなるため、 質量分析における、 適正な分子量範囲を逸脱しており、 トリプシン消化によるぺ プチド断片化処理を行う。 .
具体的には、前記の後処理を施し、脱水処理済みのゲル切片を入れた容器内に、 トリプシン含有水性溶液を加え、 ゲル担体上に担持されている状態のまま、 ぺプ チド鎖の断片化を行う。 前記トリプシン含有水性溶液は、 重炭酸アンモニゥム緩 衝液 （pH 8) 中に、 トリプシンを 0. 067 g/μ Lの濃度で含有してお り、 トリプシン消化は、 37°Cで、攪拌しつつ、 4時間酵素反応を行う。その際、 脱水処理されていたゲルは、 溶媒水の浸潤に従って、 速やかに再膨潤し、 本来の 体積に復する。 この再膨潤したゲル中に担持されているペプチド鎖、 反応産物に 対して、 前記緩衝液とともに、 ゲル中に浸入するトリプシンを前記加熱温度で作 用させることで、 トリプシンに特異的な酵素消化が進行する。
なお、 ペプチド鎖、 反応産物は、 前記後処理工程における脱保護によっても、 N末端のアミノ基に対する N—ァセチル化、 リシン残基 （一 NH— CH (CH2 CH2CH2CH2NH2) -CO-)の ε位のアミノ基への N—ァセチル化は保持 された状態であり、 トリプシン消化によっては、 前記 N—ァセチル化リシン残基 の C末側ぺプチド結合の切断はなされず、 アルギニン残基の C末側ぺプチド結合 切断が進行する。 このゥマ ' ミォグロビンのグロビン ·ぺプチド鎖が有するァミ ノ酸配列は既に判明しており、 図 7に示すようにアルギニン残基の C末側ぺプチ ド結合切断に伴い、 153アミノ酸からなる元のペプチド鎖は、 1— 31、 32 -139N 140—153の各部分アミノ酸配列を含む断片に、 トリプシン消化 を受ける。 なお、 図 7には、 前処理操作に伴い、 N—ァセチル化保護が施される リシン残基を網かけ表示で示し、 さらには、 トリプシン消化による、 アルギニン 残基の C末側ぺプチド結合切断で生じる、 N末側の 1— 3 1と C末側の 140— 153の各部分ァミノ酸配列を太字で示す。
トリプシン消化によって断片化されると、 これらのペプチド断片は、 ゲル担体 から溶出を生じ易くなり、 容器内のトリプシン溶液中に溶出する。 なお、 かかる トリプシン消化処理工程では、 前記 140— 153ァミノ酸の部分ァミノ酸配列 を含む C末断片とともに、 上述する C末端アミノ酸の逐次的分解処理で生成され る一連の反応産物に由来する C末断片も、 容器内のトリプシン溶液中に溶出する。 すなわち、 該トリプシン消化処理は、 長いアミノ酸長のペプチド鎖から、 その C 末部分を、 質量分析に適合する戸望の分子量範囲のぺプチド断片とするとともに、 かかるペプチド断片を、 ゲル中から高い収率で溶出、 回収することを可能として いる。
かかるトリプシン消化処理工程を終えた後、 ゲル中から容器内のトリプシン溶 液中に溶出する断片化されたぺプチドを回収する。 回収されたべプチド断片の混 合物を含む溶液について、 脱塩処理を施した後、 凍結乾燥処理を行う。
(後処理、 トリプシン消化によるぺプチド断片化済みの反応産物の特定） 以上の一連の処理を施して得られる、 後処理、 ペプチド断片化済みの反応産物 とグロビン♦ペプチド鎖の c末断片との混合物について、 質量分析法により、 含 有される各べプチド断片の分子量の測定を行う。
本実施例でも、 脱塩処理を施し、 上記乾燥処理を行ったペプチド断片混合物試 料に対して、 MA L D I— T O F— M S装置を利用し、 各ペプチド断片の分子量 を反映する主イオン種ピークの質量と、 その相対的な信号強度の測定、 比較を行 う。 なお、 かかる MA L D I—T O F— M S装置を利用する測定では、 イオン種 の分別は、 負帯電イオン種を検出器へ導く、 所謂ネガティブ ·モードの測定と、 正帯電イオン種を検出器へ導く、所謂ポジティブ 'モードの測定との双方を行う。 すなわち、 各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種として、 ポジティブ， モードの測定において、 プロトン（H+) が付加された陽イオン種、ネガティブ ' モードの測定において、 プロトン （H+) が離脱さいた陰イオン種の、 対応する 二種のスぺクトルを得る。
この実施例 2でも、 図 5に示すポジテイブ'モードの測定と、 図 6に示すネガ ティブ，モードの測定とを対比すると、 ゥマ ' ミオグロビンのグロビン 'ぺプチ ド鎖に由来するトリプシン消化断片に相当する主な二つのピークとして、 1一 3 1の部分ァミノ酸配列、 ならびに、 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸配列を含む断 片が、 かかる分子量範囲に見出される„ 図 5に示すポジティブ ·モードの測定に おいて、 その強度は相対的に大きなピークは、 C末端にアルギニン残基を有する 1 - 3 1の部分ァミノ酸配列の N末側べプチド断片に相当し、 一方、 図 6に示す ネガティブ ·モードの測定において、 その強度は相対的に大きなピークは、 アル ギニン残基を含まない 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸配列の C末側ぺプチド断 片に相当すると判定される。 加えて、. 3 2— 1 3 9の部分アミノ酸配列中、 N— ァセチル基の離脱されたリシン残基における切断で派生する、 7 8— 1 0 2の部 分アミノ酸配列に相当するペプチド断片も見出され、 同じく、 図 5に示すポジテ イブ ·モードの測定において、 その強度は相対的に大きなピークを示している。 その他、 トリプシンの自己消化で生じるペプチド断片も、 かかる分子量範囲で見 出され、 同じく、 図 5に示すポジティブ 'モードの測定において、 その強度は相 対的に大きなピークを示している。
図 6に示すネガテイブ.モードの測定では、 1 4 0— 1 5 3の部分ァミノ酸配 列の C末側ペプチド断片に加えて、 C末端アミノ酸の逐次的分解処理を施した反 応産物に由来する一連の C末側ぺプチド断片も、 その強度は相対的に大きく測定 されている。 表 6に、 測定されたピークの質量値、 元のグロビン 'ペプチド鎖の C末断片に起因するピークの質量値との差異、 ならびに、 それから特定される、 各反応産物断片において除去されているアミノ酸、 および、 各反応産物の形態を 示す。 表 6
Figure imgf000168_0001
本実施例 2の、 ゲル中での、 双極性非プロトン溶媒を用いた反応試薬溶液を利 用する処理法でも、 C末端アミノ酸の逐次的分解処理により、 C末端から二つの ァミノ酸、 グリシンとグルタミンが逐次的に分解された反応産物に由来するピー クが確認される。 すなわち、 解析対象である上述のゲル切片上のバンドとして分 離されるペプチド鎖は、 実際に、 グロビン 'ペプチド鎖であり、 C末端アミノ酸 の逐次的分解処理をゲル上に担持した状態で実施できることが、 検証される。 本発明の第二の形態にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法を利用 することで、 解析対象のペプチド鎖をゲル中に担持した状態で、 C末端アミノ酸 の逐次的分解を進めた際にも、 本質的に遜色のない解析確度が達成されているこ とが確認される。
(参考例 1 )
本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法では、 リシン残基側鎖 を N—ァシル化保護した状態で、 ペプチド鎖をトリプシン消化することで、 得ら れる N末側のアミノ酸配列に由来する共通のぺプチド断片は、 C末端にァ ギニ ン残基を有するぺプチド断片となることを利用して、 C末端側べプチド断片との 区別に利用している。 仮に、 元々、 解析対象試料となるペプチド鎖が、 その C末 端にアルギニンを有する場合であっても、 MA L D I— T O F— M S装置を利用 する測定において、 各ペプチド断片の分子量を反映する主イオン種として、 ポジ ティブ ·モードの測定により、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種、 ネガ ティブ.モードの測定により、 プロトン （H+) が離脱さいた陰イオン種の、 対 応する二種のスぺクトルを取得し、 その対比によって、 一連の反応産物に由来す る C末端側ぺプチド断片を特定可能であることを検証した。
本参考例では、 ペプチド鎖の N末ァミノ基を、 N—ァセチル化保護を施した、 1 4アミノ酸からなるぺプチド、 N—ァセチル化 G 1 u 1— F i b r i n oぺプ チド断片について、 その C末端アミノ酸配列の解析を行った。
(C末端ァミノ酸分解除去反応の操作）
予め、 N—ァセチル化処理して得られる前記ペプチド試料 （A c E GV ND N E E G F F S AR) の乾燥試料を保持しているパイアルを、 共栓付き気密試験 管型のガラス製反応容器内に装着レた状態で、 このガラス製反応容器内に別途、 下記する液状試薬を所定量入れる。
この C末端アミノ酸の選択的分解反応用の液状試薬として、 トリフルォロ酢酸 を 5体積％添加した無水酢酸 （3 0 0 Z L ) を用い、 前記ガラス製反応容器内に 乾燥試料を収納したバイアルを収納した後、 冷却下、 反応容器内を真空排気し、 気密状態に封止する。
この気密状態の反応容器全体を、 4 0 °C 1 6時間保温して、 容器内の液状試 薬から供給される、 蒸気状の無水酢酸とトリフルォロ酢酸を、 乾燥試料に作用さ せる。
なお、 力かる C末端アミノ酸の選択的分解処理を終えた後、 反応容器内に残留 する、 未反応の無水酢酸やトリフルォロ酢酸等を減圧留去するとともに、 残余す る N—ァセチル化 G 1 u 1— F i b r i n oペプチド試料と得られる反応産物と の混合物の乾燥を行う。
(後処理操作）
次いで、 N—ァセチル化 G 1 u X - F i b r i n oぺプチド断片と得られる反 応産物が含まれる混合物の乾燥試料を保持しているバイアルを、 同じく共栓付き 気密試験管型のガラス製反応容器内に装着した状態で、 このガラス製反応容器内 に別途、 下記する液状試薬を所定量入れる。
本参考例 1では、 加水後処理の液状試薬として、 ピリジンを 1 0体積％溶解し た水溶液 （3 0 0 At L) を用い、 前記ガラス製反応容器内に乾燥試料を収納した パイアルを収納した後、冷却下、反応容器內を真空排気し、気密状態に封止する。 この気密状態の反応容器全体を、 1 0 0 °C、 3 0分間加熱して、 容器内の液状 試薬から供給される、 蒸気状のピリジンと水分子を、 乾燥試料に作用させる。 前 記の条件では、 セリン残基の O—ァセチル化保護の脱保護はなされるものの、 N 末端の N—ァセチル化保護のアミ ド結合に対する加水分解は起こらないため、 得 られる後処理済みの反応産物は、 ぺプチドの N末端にァセチル基が修飾された N —ァセチル化体となる。
力かる後処理を終えた後、 反応容器内に残留する、 残余している水分子やピリ ジン等を減圧留去するとともに、 N—ァセチル化 G 1 u 1— F i b r i n oぺプ チド断片と得られる後処理済みの反応産物との混合物の乾燥を行う。
(後処理済みの反応産物の特定）
以上の一連の化学的処理を施して得られる、 後処理済みの反応産物と元のぺプ チド断片との混合物について、 MA L D I— T O F— M S装置を利用し、 各ぺプ チド断片の分子 *を反映する主ィオン種として、 ポジティブ ·モードの測定にお いて、 プロトン （H+) が付加された陽イオン種、 ネガティブ 'モードの測定に おいて、 プロトン （H+) が離脱さいた陰イオン種の、 対応する二種のスぺタト ルを得る。
図 8に示す、 二種のスぺクトルを対比すると、 ポジティブ ·モードの測定にお いて、 1— 1 4のァミノ酸配列を保持する元のぺプチド断片は、 その強度は相対 的に大きく、 アルギニン残基を含むことが確認される。 加えて、 ネガティブ 'モ ードの測定において、 この元のペプチド断片から、 アルギニン残基が分解除去さ れた分子量に相当するピークが観測されるものの、 一方、 ポジティブ 'モードの 測定においては、 対応するピークは、 明確には見出されない。 従って、 1— 1 4 のアミノ酸配列を保持する元のぺプチド断片は、 C末端にアルギニン残基を有し ており、ポジティブ 'モードの測定において、その強度は相対的に大きいものの、 ネガティブ ·モードの測定において、 付随する一連の反応産物に起因するイオン 種が見出され、 かつ、 アルギニン残基が分解除去された分子量に相当するピーク の存在するので、 C末端アミノ酸の逐次的な分解除去を受けていることが、 確認 される。 表 7に、 測定されたピークの質量値、 元のペプチド鎖に起因するピーク の質量値との差異、 ならびに、 それから特定される、 各反応産物断片において除 去されているアミノ酸、 および、 各反応産物の形態を示す。 表 7
Figure imgf000171_0001
すなわち、 仮に、 元のペプチド鎖のアミノ酸配列は、 C末端にアルギニンを有 する場合であっても、 トリプシン消化で得られる C末側ペプチド断片に付随して、 アルギニン残基の除去に相当する分子量減少を示すピークの有無を精査するこ とで、 C末側ペプチド断片であるか、 その他の N末側のアミノ酸配列に由来する ぺプチド断片であるかを、 高い確度で判定することが可能であることが検証され る。 産業上の利用の可能性
本発明にかかるぺプチドの C末端ァミノ酸配列解析方法は、 ぺプチドの C末端 アミノ酸を逐次的に分解除去する際、 対象とするペプチド鎖に対して、 予め、 ぺ プチド鎖の N末端アミノ基、 ならびに、 リシン残基側鎖のアミノ基に対して、 N 一ァシル化保護を行うことで、 同時に、 セリン残基 （一NH— C H (C H 2 O H) - C O -) ゃトレオニン残基 （― NH— C H ( C H (C H 3) OH) - C O -) に存在するヒドロキシ基に対しても、 O—ァシル化保護がなされた状態で、 乾燥 雰囲気下、 穏和な加熱温度において、 アルカン酸無水物に少量のパーフルォロア ルカン酸を組み合わせた反応試薬を作用させ、 5—才キサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末端アミノ酸の分解を行って、 一連の反応産 物を調製する手法を採用している。 かかる手法では、 利用するアルカン酸無水物 自体、 反応 I"生が低いため、 ペプチドの途中におけるアミド結合の分断等の不要な 副次反応を引き起こすことなく、 穏和な加熱条件で、 ペプチドの C末端アミノ酸 を逐次的に分解除去することが可能となる。 付随して、 ペプチドの途中における アミド結合の分断が無いので、 得られる反応産物中に、 前記アミド結合の分断に より派生するペプチド断片、 ならびに、 そのペプチド断片を起源とする反応産物 が混入することも回避できる。 さらには、 かかる穏和な条件での反応を利用する ことで、 得られる一連の反応産物に対して、 後処理において、 有機塩基性化合物 の存在下、 加水処理を行うことで、 C末端にカルボキシ基を有し、 O—ァシルイ匕 保護は脱保護されるものの、 ペプチド鎖の N末端アミノ基、 ならびに、 リシン残 基側鎖のアミノ基における N—ァシル化保護を保持するものとする。 最終的に、 トリプシン消化を施し、 N—ァシル化保護されているリシン残基の C末側での切 断を回避しつつ、 アルギニン残基の C末側での切断を行って、 アミノ酸長の長い ペプチド鎖より、 MA L D I— T O F— M S装置を利用する測定に適する分子量 範囲となる、 C末端側ペプチド断片を調製した上で、 該 C末端側ペプチド断片に おける一連の分子量減少に基づき、 C末端アミノ酸の逐次的な分解除去を受けて、 短縮される C末端ァミノ酸配列を高い精度で決定できる。
加えて、 上述する C末端アミノ酸の逐次的な分解除去の化学的処理においては、 そのペプチド鎖のアミノ酸長変化は、 多くとも 1 0アミノ酸程度であるので、 対 象とするペプチドを、 予めゲル電気泳動法による分離を行った後、 該ゲル担体上 に担持された状態を維持したまま、 これら化学的処理を進めることもできる。 一 方、 トリプシン消化を施して、 ペプチド断片化を行うと、 アミノ酸長が格段に短 いペプチド断片は、 ゲル担体上に最早安定に保持できず、 簡便にゲル担体上より 溶出させ、 回収することが可能となる。 従って、 このペプチドの C末端アミノ酸 を逐次的に分解除去する際の優れた制御性、ならびに、穏和な反応条件、例えば、 反応温度の許容される変動幅の広さの利点、 さらには、 アミノ酸長の長いぺプチ ド鎖に対しても、 その C末端アミノ酸配列解析を高い精度で実施できることから、 本発明にかかるぺプチドの C末端アミノ酸配列解析方法は、 より汎用性に富む解 析方法となる。

Claims

請求の範囲
1 . 解析対象とするペプチドの C末端アミノ酸配列を、 質量分析法の利用によ り解析する方法であって、
対象とするペプチドより、化学的手段により C末端アミノ酸を逐次的に分解し て得られる一連の反応生成物を含む混合物を調製する工程と、
前記一連の反応生成物と、 元となるペプチドとの分子量差を、 質量分析法により 分析し、 かかる C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程と、 測定された一連の分子量減少量に基づき、 逐次的分解された一連のアミノ酸を 特定し、 c末端より配列させて、 c末端のアミノ酸配列情報を得る工程とを具え、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
該ぺプチド N末端のァミノ基ならぴに、 該ぺプチドに含有されている可能性の あるリシン残基側鎖のァミノ基に対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシル基 による N—ァシル化を施す、 N—ァシル化保護を施す前処理工程と、
前記 N—ァシル化保護済みの、 対象とするペプチドの乾燥試料に対して、 触媒量のパーフルォロアルカン酸の存在下、 アル力ン酸無水物を作用させ、 ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000174_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末 端ァミノ酸の分解を行う工程と、
前記 C末端ァミノ酸を逐次的に分解する工程で得られる一連の反応生成物を 含む混合物に対して、
残余する前記アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを除去する後処 理を施し、 - 次いで、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を触媒.量共存させ た状態で、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させて、 加水処理を施す加水 処理の工程とを、 少なくとも含んでなり、
前記 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、
緩衝溶液中において、 トリプシンを作用させ、 該ペプチド鎖のトリプシン酵素 特異的な消化処理を施して、 該ぺプチド鎖中に存在するアルギニン残基の c末側 ぺプチド結合の選択的な切断によるべプチド断片化を行い、
脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化処理済みべ プチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混 合物について、 質量分析法を利用し、 該イオン化処理で生じる陽イオン種による 分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定を行い、
前記陽ィオン種による分子量測定、 ならびに陰ィオン種による分子量測定にお いて測定される、 対応するイオン種の質量分析スぺクトルについて、
前記トリプシン消化処理で生成する C末端にアルギニン残基を有するぺプチ ド断片のピークは、
陽ィオン種による分子量測定における強度は、 陰ィオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
前記トリプシン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端のぺ プチド断片ならびに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生 成物に由来する C末端のぺプチド断片のピークは、
陰イオン種による分子量測定における強度は、 陽イオン種による分子量測定にお ける強度と比較して、 相対的に大きな強度を与えるピークと判定し、
該陰ィオン種による分子量測定にぉ 、て、 相対的に大きな強度を与える一連の ピークに基づき、 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する手法 を採用した上で、
該スぺク トルの解析工程は、
該スぺク トルの解析作業は、 解析範囲を m/ z値が 4 0 0 0以下に選択して、 (工程 1 ) ペプチド断片化に利用する、 トリプシン消化処理に付随して.、 ぺプ チド断片を含む乾燥混合物中に混入する既知の分子量を有するトリプシンの自 己消化に由来するべプチド断片に関して、
陽イオン種による分子量測定結果中の、 m/ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0以上の 範囲において、 トリプシンの自己消化に由来するべプチド断片による陽ィオン種 ピークを特定し、
次いで、 陰イオン種による分子量測定結果中の、 m/ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0 以上の範囲において、 トリプシンの自己消化に起因するぺプチド断片による対応 陰イオン種ピークを特定する、 トリプシン由来の内部標準ピークの特定工程、
(工程 2 ) 陽イオン種による分子量測定結果中、 前記特定されるトリプシン由 来の陽イオン種ピークを除外し、 mZ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0以上の範囲にお いて、 最大のピーク強度を有する最大陽イオン種ピークを特定し、 該最大陽ィォ ン種ピークのピーク強度を基準として、 その 1 / 4 0以上のピーク強度を有する 陽イオン種ピークを選別し、 第一の陽イオン種ピーク群を形成し、
次いで、 陰イオン種による分子量測定結果中、 前記特定されるトリプシン由来の 陰イオン種ピークを除外し、 mZ z値が 4 0 0 0以下 5 0 0以上の範囲において 最大のピーク強度を有する最大陰イオン種ピークを特定し、 該最大陰イオン種ピ ークのピーク強度を基準として、 その 1 / 4 0以上のピーク強度を有する陰ィォ ン種ピークを選別し、 第一の陰イオン種ピーク群を形成する、 主要なイオン種ピ ークの特定工程、
(工程 3 ) 陰イオン種による分子量測定結果中において、 前記第一 陽イオン 種ピーク群の各ピークに対応する陰イオン種に相当するピークを特定し、 第二の 陰イオン種ピーク群を形成し、
次いで、 陽イオン種による分子量測定結果中において、 前記第一の陰イオン種ピ ーク群の各ピークに対応する陽イオン種に相当するピークを特定し、 第二の陽ィ オン種ピーク群を形成する、 主要なイオン種ピークに対する対イオン種ピークの 特定工程、
(工程 4 ) 前記第一の陰ィオン種ピーク群と第二の陰ィオン種ピーク群との積 集合を、 第三の陰イオン種ピーク群とし、 同時に、 第一の陰イオン種ピーク群と 第二の陰イオン種ピーク群との和集合を、 第四の陰イオン種ピーク群とし、 次いで、 前記第一の陽イオン種ピーク群と第二の陽イオン種ピーク群との積集合 を、 第三の陽イオン種ピーク群とし、 同時に、 第一の陽イオン種ピーク群と第二 の陽イオン種ピーク群との和集合を、 第四の陽イオン種ピーク群とし、
前記第三の陰ィオン種ピーク群の各ピークに対応する各陽イオン種ピークに 関して、 前記最大陽イオン種ピークのピーク強度を基準とする、 相対ピーク強度 を算定し、 同時に、 前記第三の陰イオン種ピーク群の各ピーク関して、 前記最大 陰イオン種ピークのピーク強度を基準とする、 相対ピーク強度を算定し、 相互に 相対ピーク強度を比較した上で、
前記第三の陰イオン種ピーク群の各ピークに対して、 対応する各陽イオン種ピー クの相対ピーク強度が 3ノ 2以上となる陽イオン種ピークを特定し、 第五の陽ィ オン種ピーク群を形成し、 一方、
対応する各陽イオン種ピークに対して、 前記第三の陰イオン種ピーク群各ピーク の相対ピーク強度が 3ノ 2以上となる陰イオン種ピークを特定し、 第五の陰ィォ ン種ピーク群を形成する、 有意な対イオン種を有する主要なイオン種ピークの特 定工程、
(工程 5 ) 前記第四の陽ィオン種ピーク群の各陽イオン種ピークの mZ z値に 基づき、 隣接ピーク間の m/ z値差を算定し、
同時に、 前記第四の陰イオン種ピーク群の各陰ィオン種ピークの m/ z値に基づ き、 隣接ピーク間の m/ z値差を算定し、
更に、 第五の陽イオン種ピーク群の各ピークに関して、
( 5 a— 1 ) 該ピーク m/ z値に対して、 水分子の欠失に相当する分子量 1 8小 さい m/ z値を有する陽イオン種ピーク力 該第五の陽イオン種ピーク群中に存 在するカゝ、
( 5 a— 2 ) 該ピーク mZ z値 対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰に相当する分子量大きな mZ z値を有する陽ィオン種ピ ークが、 該第五の陽イオン種ピーク群中に存在するか、
(5 a— 3) 該ピーク m/z値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰ならぴに水分子の欠失に相当する分子量 18の減少の組 み合わせに相当する分子量の大きな mZz値を有する陽イオン種ピークが、 該第 五の陽イオン種ピーク群中に存在するか、
前記 （5 a— 1) 〜 （5 a— 3) のいずれかの要件を満足する陽イオン種ピーク を特定し、 第六の陽イオン種ピーク群を形成し、
一方、 第五の陰イオン種ピーク群の各ピークに関して、
(5 b— 1) 該ピーク mZz値に対して、 水分子の欠失に相当する分子量 18小 さい mZz値を有する陰イオン種ピーク力 該第五の陰イオン種ピーク群中に存 在するか、
(5 b— 2) 該ピーク m/z値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰に相当する分子量大きな mZz値を有する陰イオン種ピ ークカ s、 該第五の陰イオン種ピーク群中に存在するか、
(5 b— 3) 該ピーク m/z値に対して、 前記 N—ァシル化保護に利用されるァ シル基の式量分の余剰ならびに水分子の欠失に相当する分子量 18の減少の組 み合わせに相当する分子量の大きな m/z値を有する陰イオン種ピークが、 該第 五の陰イオン種ピーク群中に存在するか、
前記 （5 b— 1) 〜 （5 b— 3) のいずれかの要件を満足する陰イオン種ピーク を特定し、 第六の陰イオン種ピーク群を形成し、
特定された第六の陽イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするペプチドに由来す るペプチド断片に起因する陽イオン種ピークの群であり、 同時に、 特定された第 六の陰イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするぺプチドに由来するぺプチド断 片に起因する陰イオン種ピークの群であると判定する、 解析対象とするペプチド に由来するぺプチド断片に起因する主要なイオン種ピークの判定工程、
(工程 6) 前記第六の陽イオン種ピーク群の各ピークに関して、
該ピークに対して、 前記 （5 a— 1) 〜 （5 a— 3) のいずれかの要件を充足す る付随陽イオン種ピークの相対ピーク強度との対比を行い、該ピークの相対ピー ク強度が優っているピークを選別し、 . さらに、 選別されたピークの群において、 該群に含まれる他のピークに対して、 相対ピーク強度が劣っている、 前記 （5 a— 1 ) 〜 （5 a— 3 ) のいずれかの要 件を充足する付随陽イオン種ピークとならないピークを選別し、 第七の陽イオン 種ピーク群を形成し、
一方、 前記第六の陰イオン種ピーク群の各ピークに関して、
該ピークに対して、 前記 （5 b— 1 ) 〜 （5 b— 3 ) のいずれかの要件を充足す る付随陰イオン種ピークの相対ピーク強度との対比を行い、 該ピークの相対ピー ク強度が優っているピークを選別し、
さらに、 選別されたピークの群において、 該群に含まれる他のピークに対して、 相対ピーク強度が劣っている、 前記 （5 b— 1 ) 〜 （5 b— 3 ) のいずれかの要 件を充足する付随陰イオン種ピークとならないピークを選別し、 第七の陰イオン 種ピーク群を形成し、
特定された第七の陽イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするペプチドに由来す るペプチド断片自体の陽イオン種ピークの群であり、 同時に、 特定された第七の 陰イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするペプチドに由来するペプチド断片自 体の陰イオン種ピークの群であると判定する、.解析対象とするペプチドに由来す るペプチド断片自体のイオン種ピークの判定工程、
(工程 7 ) 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する、 前記第七の陽イオン種ピ ーク群の各陽イオン種ピークに対応する陰イオン種ピークを選別し、 第八の陰ィ オン種ピーク群を形成し、
該第八の陰ィオン種ピーク群に含まれる各陰ィオン種ピークに関して、 該陰ィォ ン種ピークの m/ z値を基準として、 上記工程 5で算出される隣接ピーク間の m / z値差に基づき、 ピーク間の mZ z値差が 2 0 0より小さな範囲に見出される、 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する陰イオン種ピークの群を選別し、 そのピーク間の mZ z値差力 S、天然の鎖式 α—アミノ酸残基：一 NH—C H (R) — C O— ( Rは、 該ァミノ酸残基の側鎖を示す） あるいは、 該側鎖上のヒドロキ シ基、 アミノ基に対して、 上記 N—ァシル化保護に利用されるァシル基が置換し てなるァシル化保護 ーァミノ酸残基の式量に相当するものが存在しないこと を確認し、 該第八の陰イオン種ピーク群は、 当該解析対象とするぺプチドに由来するべプチ ド断片であって、 トリプシン消化処理で生成する、 そのペプチド鎖 C末端にアル ギユンを有するぺプチド断片の陰イオン種ピーク群と判定する、 トリプシン消化 で生成するべプチド鎖 C末端にアルギェンを有するぺプチド断片の特定工程、
(工程 8 ) 第七の陰ィオン種ピーク群に含まれる各陰ィオン種ピークに関して、 該陰ィオン種ピークの mZ z値を基準として、 上記工程 5で算出される隣接ピー ク間の m/ z値差に基づき、 ピーク間の niZ z値差が 2 0 0より小さな範囲に見 出される、 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する陰イオン種ピークの群を選別 し、
そのピーク間の m/ z値差が、天然の鎖式 α—アミノ酸残基：一NH— C H (R) - C O - (Rは、 該アミノ酸残基の側鎖を示す） あるいは、 該側鎖上のヒドロキ シ基、 アミノ基に対して、 上記 N—ァシル化保護に利用されるァシル基が置換し てなるァシル化保護 α—ァミノ酸残基の式量に相当するものが存在している、 第 七の陰イオン種ピーク群に含まれる陰イオン種を特定し、 第九の陰イオン種ピー ク群を形成し、
該第九の陰イオン種ピーク群の各陰イオン種ピークと、 前記特定操作において、 ピーク間の m/ z値差が、 前記ァミノ酸残基の式量に相当することが確認された 第四の陰イオン種ピーク群中に存在する陰イオン種ピークとの和集合を、 第十の 陰イオン種ピーク群とし、
該第十の陰イオン種ピーク群中、 mZ z値が最大の陰イオン種ピークを選択し、 該 mZ z値が最大の陰イオン種ピークが示す mZ z値を基準として、 各ピーク間 の m/ z値差が上記アミノ酸残基の式量に相当する m/ z値差を示す、 一連の陰 イオン種ピークを該第十の陰イオン種ピーク群中より順次特定し、 前記トリプシ ン消化処理で生成する、 元となるぺプチドに由来する C末端のぺプチド断片なら びに、 C末端アミノ酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物に由来する C末端のぺプチド断片の陰イオン種ピーク群と判定する、 トリプシン消化で生成 する解析対象べプチドと一連の反応生成物の C末端側ぺプチド断片群の特定ェ 程、
(工程 9 ) 前記工程 8において、 特定される前記トリプシン消化処理で生成す る、 元となるペプチドに由来する C末端のペプチド断片ならびに、 C末端アミノ 酸を逐次的に分解して得られる一連の反応生成物に由来する C末端のペプチド 断片の陰イオン種ピーク群に基づき、 順次特定されている陰イオン種ピークの各 ピーク間の m/ z値差に相当する、 上記アミノ酸残基の式量に従って、 C末端よ り逐次的に分解されている部分アミノ酸配列を特定する、 C末端アミノ酸配列の 特定工程、
上記 （工程 1 ) 〜 （工程 9 ) を有することを特徴とする、 質量分析法を利用する ぺプチド C末端ァミノ酸配列角军析方法。 2 . 前記 （工程 1 ) のトリプシン由来の内部標準ピークの特定工程後、 陽イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの自己消 化に由来するペプチド断片による陽イオン種ピークについて、 該ピーク mZ z値 の決定と、 その見かけの半値全幅を算定し、
前記算定される見かけの半値全幅を基準幅として、 該基準幅の 1ノ 4以下の見か け半値全幅を示すノイズ性ピークを除去する処理を、 該陽イオン種による分子量 測定スぺク トルに施し、
次いで、 ノイズ除去処理済みスペク トルに対して、 トリプシンの自己消化に由来 するペプチド断片による陽ィォン種ピークにおける、 前記決定されたピーク mZ z値と、 前記見かけの半値全幅の算定に用いた二つの m/ z値に基づき、 該ピー ク形状の非対称性と、 積分ピーク強度とを保持可能なスムージング処理を施し、 —方、 陰イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの 自己消化に由来するペプチド断片による陰イオン種ピークにおいて、 該ピーク m 値の決定と、 その半値全幅を算定し、
前記算定される見かけの半値全幅を基準幅として、 該基準幅の 1ノ 4 ^下の見か け半値全幅を示すノイズ 1·生ピークを除去する処理を、 該陰イオン種による分子量 測定スぺク トルに施し、
次いで、 ノイズ除去処理済みスペク トルに対して、 トリプシンの自己消化に由来 するペプチド断片による陽イオン種ピークにおける、 前記決定されたピーク mZ z値と、 前記見かけの半値全幅の算定に用いた二つの mZ z値に基づき、 該ピー ク形状の非対称性と、 積分ピーク強度とを保持可能なスムージング処理を施す、 ノイズ除去'スムージング処理工程を設けることを特徴とする、 請求の範囲 第
1項に記載の解析方法。 3 . 前記 （工程 1 ) のトリプシン由来の内部標準ピークの特定工程後、 陽イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの自己消 化に由来するペプチド断片による陽イオン種ピークについて、 該ぺプチド断片の 既知の分子量に基づき該陽イオン種の mZ z値を計算し、 スぺクトル上のピーク m/ z値と比較し、 その差異に基づき、 陽イオン種による分子量測定スペク トル における mZ z値に対する系統的誤差の補正を行い、
一方、 陰イオン種による分子量測定結果中において特定される、 トリプシンの 自己消化に由来するペプチド断片による陰イオン種ピークについて、 該ペプチド 断片の既知の分子量に基づき該陰イオン種の m/ z値を計算し、 スぺクトル上の ピーク πιΖ ζ値と比較し、 その差異に基づき、 陰イオン種による分子量測定スぺ クトルにおける m/ z値に対する系統的誤差の補正を行う、
ピーク mZ z値に対する系統的な誤差補正の工程を設けることを特徴とする、 請 求の範囲 第 1項または第 2項に記載の解析方法。
4 . 前記 （工程 9 ) の C末端アミノ酸配列の特定工程において、
特定された C末端より逐次的に分解されている部分アミノ酸配列が、 その。末端 アミノ酸がアルギニンである場合、
該部分アミノ酸配列の特定における基準とする、 第十の陰イオン種ピーク群中の m/ z値が最大の陰ィオン種ピークについて、 陽ィオン種による分子量測定結果 中における、 その対応陽イオン種ピークに対して、
該陽イオン種ピークの m/ z値を基準として、 上記工程 5で算出される隣接ピー ク間の mZ z値差に基づき、 該陽イオン種ピークの mZ z値よりも m/ z値が大 きく、 mZ z値差が 2 0 0より小さな範囲に見出される、 第四の陽イオン種ピー ク群中に存在する陽イオン種ピークの群を選別し、
そのピーク間の m/ z値差が、天然の鎖式ひ一アミノ酸残基：一 NH— C H (R) 一 C O— (Rは、 該アミノ酸残基の側鎖を示す） あるいは、 該側鎖上のヒドロキ シ基、 アミノ基に対して、 上記 N—ァシルイヒ保護に利用されるァシル基が置換し てなるァシル化保護ひ一ァミノ酸残基の式量に相当するものが存在しないこと を確認する、 ぺプチド鎖 C末端にアルギニンを有するぺプチド断片であることの 再確認工程を更に設けることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項〜第 3項のいず れか一項に記載の解析方法。
5 . 前記 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する際に利用す る質量分析スぺクトルは、
MA L D I— T O F— M S法による前記陽イオン種による分子量測定、 ならびに 陰イオン種による分子量測定結果であることを特徴とする、請求の範囲 第 1項 〜第 4項のいずれか一項に記載の解析方法。
6 . 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
対象とする前記ペプチドの乾燥試料に対して、 乾燥雰囲気下、 1 0 °C〜6 0 °C の範囲に選択される温度において、
アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、 蒸 気状のアル力ン酸無水物とアル力ン酸とを作用させ、
該ぺプチド N末端のァミノ基ならびに、 該ぺプチドに含有されている可能性の あるリシン残基側鎖のァミノ基に対して、 前記アルカン酸無水物由来のァシル基 による N—ァシル化を施す、 N—ァシル化保護を施す前処理工程と、
前記 N—ァシル化保護済みの、 対象とするペプチドの乾燥試料に対して、 乾燥 雰囲気下、 1 5 °C〜6 0 °Cの範囲に選択される温度において、
アル力ン酸無水物にパ^"フルォロアルカン酸を少量添加してなる混合物より 供給される、 蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを作用させ、 ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000184_0001
(式中、
R lは、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴い C末 端ァミノ酸の分解を行う工程と、
前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程で得られる一連の反応生成物を 含む混合物に対して、
残余する前記アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸とを乾燥状態にお いて除去する後処理を施し、
次いで、 塩基性含窒素芳香環化合物または第三アミン化合物を溶解する水溶液 を利用し、 蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物と水分子 を供給して、
前記塩基性の窒素含有有機化合物の共存下、 前記反応生成物べプチドに水分子 を作用させ、
前記の加水処理を施した後、 かかる一連の反応生成物を含む混合物に残余する、 前記塩基性の窒素含有有機化合物と水分子を除去、 乾燥する再乾燥後処理を行う ことからなる加水処理の工程とを、 少なくとも含んでなり、
前記 C末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再乾燥後処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、 緩衝溶液中において、 トリプシンを作用させ、 該ぺプチド鎖の N末端のァミノ 基ならびに、該ぺプチド鎖に含有されている可能性のあるリシン残基側鎖のアミ ノ基に対する上記 N—ァシルイ匕保護が保持されている、 該ぺプチド鎖のトリプシ ン酵素特異的な消化処理を施して、 該ペプチド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断によるべプチド断片化を行い、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化処理済みぺ プチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混 合物について、 MA L D I— T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる 陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行うこと を特徴とする、 請求の範囲 第 5項に記載の方法。
7 . 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する工程は、
予めゲル電気泳動法による分離がなされ、 該ゲル担体上に担持された状態の対 象とするペプチド試料に対して、
前記ゲル担体中に含浸される水溶媒を、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 か つ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈除去するこ とにより、 該ゲル担体の脱水処理を行う工程と、
前記脱水処理を施した後、 該ゲル担体上に担持された状態の対象とするぺプチ ド試料に対して、 3 0 ° (：〜 8 0 °Cの範囲に選択される温度において、
該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン性溶 媒中に、 アルカン酸無水物を溶解してなる溶液を用いて、 該アルカン酸無水物溶 液中に該ゲル担体を浸漬することにより、 担持された状態の対象とするぺプチド 試料にアルカン酸無水物を作用させ、 対象とするペプチドの N末端のァミノ基な らぴに、該ぺプチド中に含有される可能性のあるリシン残基側鎖上のァミノ基に、 予め、 前記アル力ン酸無水物を構成するアル力ン酸に由来するァシル基による N —ァシル化保護を施し、
次いで、 該ゲル状物質の溶解を引き起こさず、 かつ、 前記アルカン酸無水物、 な らびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒 を用いて、 希釈除去することにより、 N—ァシル化反応の停止と反応試薬の除去 を行う前処理工程と、
前記 N—ァシル化保護の前処理を施した後、該ゲル担体上に担持された状態の 対象とするペプチド試料に対して、 3 0 °C〜8 0 °Cの範囲に選択される温度にお いて、 該ゲル状物質内に浸潤でき、 膨潤状態に維持可能である、 双極性非プロトン'!"生溶 媒中に、 パーフルォロアルカン酸をアルカン酸無水物に対して少量となる比率で 溶解してなる混合溶液を用いて、 該混合溶液中に該ゲル担体を浸漬することによ り、 担持された状態の対象とするぺプチド試料にアル力ン酸無水物とパーフルォ ロアルカン酸とを作用させ、
ペプチドの C末端において、 下記する一般式 （III) ：
Figure imgf000186_0001
(式中、
R 1は、 ペプチドの C末端アミノ酸の側鎖を表し、
R 2は、 前記 C末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す） で表 記される 5—ォキサゾロン構造を経て、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に伴レ、 C末 端アミノ酸の逐次的分解を行い、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解反応に利用した混合溶液を、 該ゲル状物質の 溶解を引き起こさず、 かつ、 前記パーフルォロアルカン酸とアルカン酸無水物、 ならびに双極性非プロトン性溶媒に対して親和性を有する極性非プロトン性溶 媒を用いて、 希釈除去することにより、 分解反応の停止と反応試薬の除去を行う 工程と、
さらに、 前記 C末端アミノ酸を逐次的に分解する反応で得られる一連の反応生 成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態のまま、
塩基性含窒素芳香環化合物または第三ァミン化合物を溶解する水溶液を利用し、 該水溶液中にゲル担体を浸漬することにより、 前記塩基性の窒素含有有機化合物 の共存下、 前記反応生成物ペプチドに水分子を作用させ、 加水処理を施し、 次いで、 前記ゲル担体中に含浸される水溶液を、 該ゲル状物質の溶解を引き起 こさず、 かつ、 水に対して親和性を有する極性非プロトン性溶媒を用いて、 希釈 除去することにより、 該ゲル担体の再脱水処理を施すことからなる、 付加的な加 水処理と再脱水処理の工程とを有し、
前記 C末端ァミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を測定する工程では、 再脱水処理後、 前記加水処理済みの一連の反応生成物を含む混合物に対して、 該ゲル担体上に担持された状態で、 緩衝溶液中に溶解するトリプシンを作用さ せ、 該ペプチド鎖の N末端のァミノ基ならびに、 該ペプチド鎖に含有されている 可能性のあるリシン残基側鎖のアミノ基に対する上記 N—ァシル化保護が保持 されている、 該ペプチド鎖のトリプシン酵素特異的な消化処理を施して、 該ぺプ チド鎖中に存在するアルギニン残基の C末側ぺプチド結合の選択的な切断によ るペプチド断片化を行って、
かかるゲル担体上から該ぺプチド断片の遊離と、 前記緩衝溶液中への溶出を行 い、 その後、 脱塩処理を施し、 前記緩衝溶液成分を除去して、 該トリプシン消化 処理済みペプチド断片を回収し、 乾燥する工程を設け、
次いで、 前記回収された該トリプシン消化処理済みべプチド断片を含む乾燥混 合物について、 MA L D I— T O F— M S法を利用し、 該イオン化処理で生じる 陽イオン種による分子量測定、 ならびに陰イオン種による分子量測定を行うこと を特徴とする、 請求の範囲 第 5項に記載の方法。
8 . 前記 5—ォキサゾロン構造の形成と、 引き続き、 該 5—ォキサゾロン環の 開裂に伴い C末端アミノ酸の分解反応において使用する、 前記パーフルォロアル カン酸とアル力ン酸無水物の組み合わせにおいて、
該アルカン酸無水物として、 炭素数 2〜4のアルカン酸の対称型酸無水物を用い ることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項または第 7項に記載の方法。 9 . 前記炭素数 2〜 4のアル力ン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4の 直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 8 項に記載の方法。
1 0 . 前記 5—ォキサゾロン構造の形成と、 引き続き、 該 5—才キサゾロン環 の開裂に伴い C末端アミノ酸の分解反応において使用する、 前記パーフルォロア ルカン酸とアル力ン酸無水物の組み合わせにおいて、
該アルカン酸無水物として、 無水酢酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項または第 7項に記載の方法。
1 1 . 前記 5—ォキサゾロン構造の形成と、 引き続き、 該 5—ォキサゾロン環 の開裂に伴い C末端アミノ酸の分解反応において使用する、 前記パーフルォロア ルカン酸とアル力ン酸無水物の組み合わせにおいて、
該パーフルォロアルカン酸として、 当該パーフルォロアルカン酸の示す p K aは、 0 . 3 ~ 2 . 5の範囲であるパーフルォロアルカン酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項または第 7項に記載の方法。
1 2 . 前記 5—ォキサゾロン構造の形成と、 引き続き、 該 5—ォキサゾロン環 の開裂に伴い C末端アミノ酸の分解反応において使用する、 前記パーフルォロア ルカン酸とアル力ン酸無水物の組み合わせにおいて、
該パーフルォロアルカン酸として、 炭素数 2〜4のパーフルォロアルカン酸を用 いることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項または第 7項に記載の方法。
1 3 . 前記 5—ォキサゾロン構造の形成と、 引き続き、 該 5—ォキサゾロン環 の開裂に伴い C末端アミノ酸の分解反応において使用する、 前記パーフルォロア ルカン酸とアル力ン酸無水物の組み合わせにおいて、
アル力ン酸無水物とパーフルォロアルカン酸との含有比率は、 アル力ン酸無水物 1 0 0容当たり、 パーフルォロアルカン酸 1〜 2 0容の範囲に選択することを特 徴とする、 請求の範囲 第 6項または第 7項に記載の方法。
1 4 . 前記 N—ァシル化保護を施す前処理において使用するアルカン酸無水物 として、
炭素数 2〜 4のアル力ン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の 範囲 第 6項または第 7項に記載の方法。
1 5 . 前記炭素数 2〜 4のアル力ン酸の対称型酸無水物として、 炭素数 2〜 4 の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1 4項に記載の方法。
1 6 . 前記 N—ァシルイヒ保護を施す前処理において使用するアルカン酸無水物 として、
無水酢酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項または第 7項に記載の 方法。
1 7 . 前記 N—ァシル化保護を施す前処理において使用するアルカン酸無水物 と、
前記 5—才キサゾロン構造の形成と、 引き続き、 該 5—ォキサゾロン環の開裂に 伴い C末端アミノ酸の分解反応において使用する、 前記パーフルォロアルカン酸 とアルカン酸無水物の組み合わせにおけるアルカン酸無水物との、 いずれにも 無水酢酸を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 6項または第 7項に記載の 方法。
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