WO2004050884A2 - Neue neomycin-phosphotransferase-gene und verfahren zur selektion von hochproduzierenden rekombinanten zellen - Google Patents

Neue neomycin-phosphotransferase-gene und verfahren zur selektion von hochproduzierenden rekombinanten zellen Download PDF

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WO2004050884A2
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neomycin phosphotransferase
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Kerstin Sautter
Ralf Otto
Jürgen FIEDER
Klaus Bergemann
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    • C12Y207/01095—Kanamycin kinase (2.7.1.95), i.e. neomycin-kanamycin phosphotransferase

Definitions

  • the invention relates to new modified neomycin phosphotransferase genes and their use in selection processes for high-production recombinant cells. Accordingly, the present invention also relates to new expression vectors which contain a modified neomycin phosphotransferase gene according to the invention, preferably in combination with a gene of interest in functional association with a heterologous promoter. The invention further relates to methods for producing heterologous gene products with the aid of the corresponding high-production recombinant cells.
  • Mammalian cells are the preferred host cells for the production of complex biopharmaceutical proteins, since the modifications carried out post-translationally are human-compatible both functionally and pharmacokinetically.
  • Primarily relevant cell types are hybridomas, myelomas, CHO (Chinese Hamster Ovary) cells and BHK (Baby Hamster Kidney) cells.
  • Host cells are increasingly cultivated under serum and protein-free production conditions. The reasons for this are the associated reduction in costs, the lower interference in the purification of the recombinant protein and the reduction in the potential for introducing pathogens (e.g. prions, viruses).
  • pathogens e.g. prions, viruses.
  • the use of CHO cells as host cells is becoming increasingly widespread, since these cells can be adapted to suspension growth in serum and protein-free medium and are also viewed and accepted as safe production cells by the regulatory authorities.
  • the heterologous gene is usually shared with one selectable marker gene, such as neomycin phosphotransferase (NPT), introduced into the desired cell line by transfection.
  • the heterologous gene and the selectable marker gene can be expressed in a host cell, starting from a single or from separate, co-transfected vectors. Two to three days after the transfection, the transfected cells are transferred to medium containing a selective agent, for example G418 using the neomycin phosphotransferase gene (NPT gene), and cultured for a few weeks under these selective conditions.
  • the high-growing resistant cells that have integrated the exogenous DNA can be isolated and examined for the expression of the desired gene product (the GOI).
  • a major problem in establishing cell lines with high expression of the desired protein arises from the arbitrary and undirected integration of the recombinant vector into transcriptionally active or inactive loci of the host cell genome. This results in a population of cells which have completely different expression rates of the heterologous gene, the productivity of the cells generally following a normal distribution.
  • To identify cell clones that have a very high expression of the heterologous gene of interest a large number of clones must therefore be checked and tested, resulting in a high expenditure of time, labor and costs.
  • Optimizations of the vector system used for transfection are therefore aimed at increasing the proportion of high producers in the transfected cell population by means of suitable selection strategies and thus reducing the effort involved in clone identification.
  • the development of such an expression system is the subject of the present invention.
  • the aminoglycoside-3 ' -phosphotransferase II enzyme (neomycin-phosphotransferase) (EC 2.7.1.95), whose gene is 5-associated in Escherichia coli transposon, is used as a selection marker in a variety of organisms (e.g. bacteria, yeasts, plants, mammalian cells) uses.
  • This enzyme mediates resistance to various aminoglycosidic antibiotics such as neomycin, kanamycin and G418 by inactivating the antibiotics by transferring the terminal phosphate from ATP to the 3-hydroxyl group of the aminohexose ring I.
  • neomycin phosphotransferase In addition to wild-type neomycin phosphotransferase (wt NPT), several mutants are known which have a reduced phosphotransferase activity and thus a reduced resistance to aminoglycosidic antibiotics in bacteria (Bläzquez et al., 1991; Kocabiyik et al., 1992; Yenofsky et al ., 1990) and in leaf slices of tobacco (Yenofsky et al., 1990).
  • Glu182Asp was used as a marker for the selection of rat embryonic stem cells, the neomycin phosphotransferase gene being integrated into the c-myc gene via targeted homologous recombination (gene targeting) (Hanson et al., 1995). The authors limit themselves to the use of the modified enzyme for gene targeting.
  • the patent application WO 99/53046 describes the expression of a modified neomycin phosphotransferase gene (Asp261Asn) in production-relevant mammalian cells.
  • the authors describe a non-cloning method for the expression of a gene of interest in mammalian cells.
  • cells By co-transfecting the cells with three individual DNA fragments which code for a promoter element, a gene of interest and a selection marker coupled with an IRES ("internal ribosomal entry site") element, cells can be used in a targeted manner under selection pressure, in which all three DNA fragments have been combined as a functional bicistronic transcription unit (promoter gene of interest-IRES-neomycin phosphotransferase gene)
  • the elements are only arranged in the transfected cell, so that only a few cells show the correct arrangement of the elements
  • no high producer clones can be generated The cells generated showed a maximum of 6 pg protein per cell and day (6 pg / cell / day) after multiple selection and gene amplification.
  • neomycin phosphotransferase genes particularly useful for providing a high expression vector system for mammalian cells that enables the development of high-production cells for the production of recombinant biopharmaceutical proteins that contain one or contain several complete functional transcription units both for one or more genes of interest and for a modified neomycin phosphotransferase gene with reduced antibiotic resistance.
  • the DNA construct described in WO 99/53046 contains only a promoterless neomycin gene functionally linked to the gene for dihydrofolate reductase (DHFR).
  • new modified, highly selective neomycin phosphotransferase genes could be generated and identified which are distinguished by their particular suitability for the selection of highly producing cells.
  • the present invention provides new modified neomycin phosphotransferase genes. Surprisingly, it was found that when the modified neomycin phosphotransferase genes described below were used as selection markers, enrichment of transfected mammalian cells with high expression rates of the co-integrated gene of interest could be achieved. In comparison to the use of wild-type neomycin phosphotransferase as a selection marker, the cells after transfection with one of the novel neomycin phosphotransferase genes according to the invention had a protein (antibody) increased by a factor of 1.4 to 14.6.
  • the modified neomycin phosphotransferase genes according to the invention are preferably mutants which code at amino acid position 91, 182, 198, 227, 240 or 261 for an amino acid other than the wild-type gene.
  • the neomycin phosphotransferase gene according to the invention is the mutant Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Asn, Asp261Gly or Phe240lle.
  • mutants Trp91Ala, Asp227Val, Asp261Asn, Asp261Gly and Phe240lle turned out to be particularly suitable for the selection of highly producing mammalian cells, the mutants Asp227Val and Asp261GIy again leading to cell clones with the highest productivity and are therefore particularly preferred.
  • the production of the high-production cells was achieved by using a eukaryotic expression vector which contains a heterologous gene of interest in functional association with a heterologous promoter and a modified neomycin phosphotransferase gene according to the invention.
  • Expression vector preferably contains further regulatory elements, for example one or more enhancers in functional connection with the promoter or promoters. Expression vectors which additionally include a are also preferred
  • IVS internal ribosome binding site
  • Gene of interest is under the control of the ubiquitin / S27a promoter.
  • the invention also relates to expression vectors which, instead of the gene of interest, have a multiple cloning site for inserting such a gene, ie a sequence region with multiple recognition sequences for restriction endonucleases.
  • Another aspect of the invention relates to recombinant mammalian cells which contain one of the modified neomycin phosphotransferase genes according to the invention described above.
  • the present invention further relates to recombinant mammalian cells which have been transfected with one of the expression vectors according to the invention. These are preferably recombinant rodent cells, with recombinant hamster cells such as CHO cells or BHK cells being particularly preferred.
  • said recombinant cells are additionally transfected with the gene for an amplifiable selection marker, for example with the gene of dihydrofolate reductase (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the invention further relates to a method for the enrichment of recombinant mammalian cells which express a modified neomycin phosphotransferase gene, characterized in that (i) a pool of mammalian cells is transfected with a gene for a modified neomycin phosphotransferase which is compared to the wild type Neomycin phosphotransferase has only 1 to 80%, preferably only 1 to 60%, more preferably only 1.5 to 30%, even more preferably only 1.5 to 26% of the activity and / or has one of the modifications described above; (ii) the mammalian cells are cultured under conditions that allow expression of the modified neomycin phosphotransferase gene; and (iii) the mammalian cells are cultured in the presence of at least one selection agent that is selective for the growth of mammalian cells, and prefers those cells in growth that express the neomycin phosphotransferase gene.
  • Also according to the invention is a method for the expression of at least one gene of interest in recombinant mammalian cells, characterized in that (i) a pool of mammalian cells is transfected with at least one gene of interest and one gene for a modified neomycin phosphotransferase which is compared to the Wild-type neomycin phosphotransferase has only 1 to 80%, preferably only 1 to 60%, more preferably only 1.5 to 30%, even more preferably only 1.5 to 26% of the activity and / or one of the modifications described above ; (ii) the cells are cultured under conditions that allow expression of the gene (s) of interest and the modified neomycin Allow phosphotransferase gene; (iii) the mammalian cells are cultured in the presence of at least one selection agent which is selective for the growth of mammalian cells and prefers those cells in growth which express the neomycin phosphotransferase gene; and (iv) the protein (s) of
  • the present invention relates to a method for obtaining and selecting recombinant mammalian cells which express at least one heterologous gene of interest, which is characterized in that (i) recombinant mammalian cells are transfected with an expression vector according to the invention which, in addition to the gene of interest and encodes the modified neomycin phosphotransferase gene for a fluorescent protein; (ii) the mammalian cells are cultured under conditions that allow expression of the gene (s) of interest, the gene encoding a fluorescent protein, and the modified neomycin phosphotransferase gene; (iii) the mammalian cells are cultured in the presence of at least one selection agent which acts selectively on the growth of mammalian cells and prefers those cells in growth which express the neomycin phosphotransferase gene; and (iv) the mammalian cells are sorted by flow cytometric analysis.
  • the mammalian cells additionally have a gene for an amplifiable selection marker gene, e.g. transfected with the DHFR gene, it is possible to cultivate the mammalian cells under conditions under which the amplifiable selection marker gene is also expressed and to add a selection agent to the culture medium which results in the amplification of the amplifiable selection marker gene.
  • a gene for an amplifiable selection marker gene e.g. transfected with the DHFR gene
  • the methods according to the invention are preferably carried out with mammalian cells which are adapted to the growth in suspension, that is to say with mammalian cells which are cultivated in suspension culture. Further embodiments relate to methods in which the mammalian cells, preferably those which are adapted to the growth in suspension, are cultivated under serum-free conditions. Description of the pictures
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the base vectors that were used to express the recombinant proteins in CHO-DG44 cells.
  • P / E is a combination of CMV enhancer and hamster ubiquitin / S27a promoter
  • P is only a promoter element
  • T is a termination signal for transcription that is used to polyadenylate the transcribed
  • the position and direction of the transcription initiation within each transcription unit is indicated by an arrow.
  • mcs restriction endonucleases
  • the amplifiable selection marker dihydrofolate reductase is abbreviated “dhfr” and the selection marker neomycin phosphotransferase is abbreviated to “npt” (npt wild type or npt mutant).
  • the "IRES” element derived from the encephalomyocarditis virus serves as an internal ribosome binding site within the bicistronic transcription unit and enables translation of the subsequent green fluor escalating protein "GFP".
  • Figure 2 shows a schematic representation of the eukaryotic expression vectors which code for a single-chain protein ( Figure 2A) or each for a subunit of a monoclonal antibody ( Figure 2B) and which were used for the transfection of CHO-DG44 cells.
  • "P / E” is a combination of CMV enhancer and hamster ubiquitin / S27a promoter, "P” is only a promoter element and "T” is a termination signal for transcription that is used to polyadenylate the transcribed
  • the position and direction of the transcription initiation within each transcription unit is indicated by an arrow.
  • the amplifiable selection marker dihydrofolate reductase is abbreviated “dhfr” and the selection marker neomycin phosphotransferase is abbreviated to "npt”.
  • the "IRES" element originating from the encephalomyocarditis virus serves as an internal ribosome binding site within the bicistronic transcription unit and enables the translation of the subsequent green fluorescent protein "GFP".
  • GFP green fluorescent protein
  • MCP-1 encodes the monocyte chemoattractant protein-1
  • HC and “LC” encode the heavy or light chain of a humanized monoclonal IgG2 antibody.
  • Figure 3 shows the sequence section of the neomycin phosphotransferase (npt) gene, in which the point mutations were introduced by PCR with mutagenic primers.
  • Capital letters denote the nucleotide sequence of the NPT coding region, small letters, however, the flanking non-coding nucleotide sequences.
  • the amino acid sequence (3-letter code) predicted from the nucleotide sequence is indicated above the coding nucleotide sequence.
  • Figure 4 shows conserved domains and the position of the introduced NPT mutations within the NPT amino acid sequence.
  • sequence homologies between different aminoglycoside-modifying enzymes different conserved domains within the NPT protein sequence were identified (highlighted in gray).
  • the three motifs in the C-terminal region of the enzyme obviously have special functions. Motifs 1 and 2 are presumably at the catalytic transfer of the terminal phosphate in the ATP Catalysis or nucleotide binding is involved, whereas motif 3 is assigned a function in ATP hydrolysis and / or the change in conformation in the enzyme-aminoglycoside complex.
  • Amino acids that are found in at least 70% of the aminoglycoside-modifying enzymes are highlighted in bold.
  • the simply underlined amino acids are assigned to the same group based on their similarity and occur in at least 70% of the aminoglycoside-modifying enzymes. Amino acids marked with an asterisk reflect the position of the mutation sites.
  • Figure 5 shows the influence of the NPT mutations on the selection of stably transfected MCP-1 expressing cells.
  • CHO-DG44 cells were transfected with the vectors pBIN-MCP1, pKS-N5-MCP1 and pKS-N8-MCP1 (Fig. 2A), which either select the NPT wild type (WT) or the NPT mutants Glu182Asp or Asp227Gly included.
  • WT NPT wild type
  • Glu182Asp or Asp227Gly included 400 ⁇ g / mL or 800 ⁇ g / mL G418 was added to the medium as a selective agent.
  • the concentration of the recombinant protein MCP-1 produced in the cell culture supernatant was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day was calculated. Each bar represents the mean of the specific productivity or the titer from 18 pools in each case across four cultivation passages in 6 well dishes.
  • NPT gene wild type or mutant
  • concentration of the Recombinant monoclonal IgG2 antibody produced in the cell culture supernatant was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day was calculated. A total of 5 to 9 pools were set up for each vector combination. The bars represent the mean values of the specific productivity or the titer of all pools in the test from 6 cultivation passages in 75 cm 2 bottles. To calculate the relative titers and the relative specific productivities, the mean values of the pools selected with the NPT wild-type gene were set as 1.
  • Figure 7 shows the accumulation of cells with higher GFP expression in transfected cell pools by using the NPT mutants according to the invention as a selection marker.
  • the pBIDG vectors also contained the GFP as a marker gene. After a two to three week selection of the transfected cell pools in HT-free medium with the addition of G418, the GFP fluorescence was measured by FACS analysis. Each graph, with the exception of the non-transfected CHO-DG44 cells serving as negative control, represents the mean value of the GFP fluorescence from the pools which had been transfected with the same plasmid combination.
  • Figure 8 shows the increase in mAb productivity through dhfr-mediated gene amplification using the example of a cell pool, which results from the transfection of CHO-DG44 with the vector combination pBIDG-HC / pBIN-LC (NPT wild type) or pBIDG-HC / pBIN5-LC (NPT mutant D227V) was obtained.
  • a dhfr-mediated gene amplification was carried out by adding 100 nM and subsequently carried out from 500 nM MTX to the culture medium.
  • the concentration of the mAb in the cell culture supernatant of the pools was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day (pg / cell * day) was calculated. Each data point represents the average of six cultivation passages in 75 cm 2 bottles.
  • Figure 9 shows the enzyme activity of the NPT mutants according to the invention in comparison with the NPT wild type in a dot assay.
  • cell extracts from two different mAb-expressing cell pools were produced, either with the NPT wild-type gene (SEQ ID NO: 1) or with the NPT mutants E182G (SEQ ID NO: 3), E182D (SEQ ID NO: 19), W91A (SEQ ID NO: 5), V198G (SEQ ID NO: 7), D227A (SEQ ID NO: 9), D227V (SEQ ID NO: 11), D227G (SEQ ID NO: 21) D261G (SEQ ID NO: 13), D261N (SEQ ID NO: 15) and F240I (SEQ ID NO: 17) had been transfected and selected.
  • Untransfected CHO-DG44 cells served as a negative control.
  • G418 was used as the substrate in the phosphorylation assay.
  • the extracts were filtered in a 96 well vacuum manifold through a sandwich of P81 phosphocellulose and nitrocellulose membranes. Proteins phosphorylated by protein kinases and non-phosphorylated proteins bind to the nitrocellulose, while phosphorylated and non-phosphorylated G418 pass through the nitrocellulose and bind to the phosphocellulose (Fig. 9A).
  • the radioactive signals were detected and quantified using a phospho imager.
  • the signals obtained with 5 ⁇ g extract were used to calculate the percentage enzyme activity.
  • the percentage enzyme activities represent the mean value of the NPT mutants from each 2 mAb-expressing cell pools, the enzyme activity of the wild-type NPT being set as 100% (FIG. 9B).
  • Figure 10 shows the Northern blot analysis of NPT expression and the number of NPT gene copies in the transfected cell pools.
  • total RNA was produced from two different mAb-expressing cell pools, either with the NPT wild-type gene (SEQ ID NO: 1) or with the NPT mutants E182G (SEQ ID NO: 3), E182D (SEQ ID NO: 19 ), W91A (SEQ ID NO: 5), V198G (SEQ ID NO: 7), D227A (SEQ ID NO: 9), D227V (SEQ ID NO: 11), D227G (SEQ ID NO: 21), D261G (SEQ ID NO: 13), D261N (SEQ ID NO: 15) and F240I (SEQ ID NO: 17) and had been selected.
  • Untransfected CHO-DG44 cells served as a negative control.
  • 30 ⁇ g of RNA was hybridized with a FITC-dUTP-labeled PCR product which comprised the coding region of the NPT gene.
  • a specific singular NPT transcript of approximately 1.3 kb was detected in all transfected cells.
  • genomic DNA was isolated from the above-mentioned mAb-expressing cell pools in a dot blot analysis.
  • Figure 11 shows the isolation of highly expressing mAb cell pools by GFP-based selection using FACS using the example of two cell pools (cell pools 5 and 8). These cell pools, obtained from the co-transfection with the vectors pBID-HC and pBING-LC, were subjected to a sequential GFP-based FACS sorting. The concentration of the IgG2 antibody in the cell culture supernatant of the pools was determined by ELISA after each sorting step and the specific productivity per cell and day (pg / cell * day) was calculated. A total of 6 sortings were carried out, the 5% cells with the highest GFP fluorescence being sorted out. Each data point represents the average of at least six cultivation passages in 75 cm 2 bottles.
  • Figure 12 shows the increases in mAb productivity achieved by combining a GFP-based selection with an MTX amplification step using the example of cell pools 5 and 8 (see Fig. 11).
  • a dhfr-mediated gene amplification was carried out by adding 100 nM methotrexate (MTX) to the culture medium.
  • the concentration of the mAb in the cell culture supernatant of the pools was determined by ELISA and the specific Productivity calculated per cell and day (pg / cell * day). Each data point represents the average of at least six cultivation passages in 75 cm 2 bottles.
  • Figure 13 shows the correlation between antibody productivity and GFP fluorescence using the example of cell pools 5 and 8 (see Fig. 11). These cell pools were obtained from the transfection of CHO-DG44 with the vector combination pBID-HC and pBING-LC. They were subjected to a sequential GFP-based FACS sorting, the 5% cells with the highest GFP fluorescence being sorted out in each case. After each sorting step, the concentration of the IgG2 antibody in the cell culture supernatant of the pool was determined by ELISA and the specific productivity per cell and day (pg / c * d) was calculated. Each data point represents the average of at least six cultivation passages in 75 cm 2 bottles.
  • amino acid positions relate in each case to the position of the amino acid as it is encoded by the wild-type neomycin phosphotrasferase gene with SEQ ID NO: 1.
  • a “modified neomycin phosphotransferase gene” means a nucleic acid which codes for a polypeptide with neomycin phosphotransferase activity, the polypeptide at least at one of the amino acid positions specified in the description which corresponds to the Willdtyp protein with the SEQ ID NO: 2 are homologous, have a different amino acid than the wild-type protein.
  • homologous means that the sequence region carrying the mutation is known using standard alignment algorithms, such as "BLAST” (Altschul , SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W. & States, DJ (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search.” Nature Genet. 3: 266-272; Madden, TL, Tatusov, RL & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST Server” Meth. Enzymol 266: 131-141; Zhang, J.
  • the present invention provides new modified neomycin phosphotransferase genes and methods for the production and selection of mammalian cell lines which enable high expression of heterologous gene products, preferably biopharmaceutical relevant polypeptides or proteins.
  • the methods according to the invention are based primarily on the selection of cells which, in addition to the gene of interest, express a neomycin phosphotransferase gene according to the invention which gives the transfected cells a selection advantage over non-transfected cells.
  • mNPT genes modified neomycin phosphotransferase genes according to the invention described here has a considerable selective advantage over the wild-type neomycin phosphotransferase gene (wtNPT gene). This applies in particular to the use of mutants which have a lower enzyme activity compared to wtNPT.
  • modified NPT genes which code for an NPT which has only 1 to 80%, preferably 1 to 60%, of the enzyme activity of the wtNPT has proven particularly suitable. NPT mutants which only have 1% to 30% of the enzyme activity of the wtNPT are more preferred, those which have only 1.5% to 26% of the enzyme activity of the wtNPT are particularly preferred.
  • the enzyme activity of an NPT can be exemplified in a how Determine the "dot assay" described in Example 4 and given as Method 5.
  • a “wild-type neomycin phosphotransferase” refers to a neomycin phosphotransferase gene that codes for the aminoglycoside-3 ' -phosphotransferase II enzyme (EC 2.7.1.95), the gene of which is naturally 5-associated in Escherichia coli transposon, and eg contains or is encoded by the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 1, which encodes resistance to various aminoglycosidic antibiotics such as neomycin, kanamycin and G418 by inhibiting the antibiotics by transferring the terminal phosphate from ATP is inactivated on the 3-hydroxyl group of the aminohexose ring I.
  • WTNPT should also be understood to mean all NPTs which have a comparable enzyme activity to the NPT coded by SEQ ID NO: 1. This includes in particular those NPTs in which the enzymatically active center , which catalyzes the transfer of a terminal phosphate from ATP to a substrate, in identical or approximately identi conformation (Shaw et al., 1993; Hon et al., 1997; Burk et al., 2001) and thus has a comparable enzyme activity to an enzyme which contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a wtNPT has a comparable enzyme activity if it shows approximately 81 to 150%, preferably 90 to 120% of the enzyme activity which has an NPT defined by SEQ ID NO: 2, the activity being described in Example 4 and as Method 5 “Dot assay can be determined.
  • mutants in which the reduction in the enzyme activity compared to the wtNPT is based on a modification of the amino acid sequence, for example on substitution, insertion or deletion of at least one or more amino acids.
  • Deletion, insertion and substitution mutants can be generated by means of "site-specific mutagenesis” and / or "PCR-based mutagenesis techniques". Appropriate methods are described by Lottsspeich and Zorbas (1998) (Chapter 36.1 with further references).
  • neomycin phosphotransferase mutants as selection markers, in which at least the amino acid tryptophan at amino acid position 91, the amino acid glutamic acid at amino acid position 182, the amino acid valine at amino acid position 198, the amino acid aspartic acid at amino acid position 227, the amino acid aspartic acid at amino acid position 261 or the amino acid phenylalanine at amino acid position 240 has been changed compared to wtNPT, a particularly effective enrichment of transfected mammalian cells with high expression rates of the co-integrated gene of interest can be achieved.
  • mutants which relate to the amino acids at position 91, 182, 198, 227, 261 and / or 240 are preferred.
  • Substitution mutants are particularly advantageous here, ie mutants in which the amino acid correspondingly occurring in the wild type at this point has been replaced by another amino acid.
  • Corresponding substitution mutants in which a change in the corresponding amino acid to a reduction in the enzyme activity in comparison to the wt NPT to 1 to 80%, preferably to 1 to 60%, more preferably to 1.5 to 30%, are still further preferred preferably leads to 1.5% to 26%.
  • Modified NPT genes are particularly preferred in which the amino acid 91, 227, 261 and / or 240 has been modified accordingly, so that the enzyme activity compared to the wt NPT is only 1 to 80%, preferably only 1 to 60%, more preferred is only 1.5 to 30%, more preferably only 1.5% to 26%. Most preferred is a substitution mutant in which the amino acid at amino acid position 227 has been modified in such a way that the enzyme activity of the modified NPT is less than 26%, preferably between 1 and 20%, even more preferably between 1 and 16% compared to wt -NPT is.
  • mutants are advantageous which code for glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine or tyrosine in comparison to wtNPT at amino acid position 91, 182 or 227.
  • the glutamic acid at amino acid position 182 can also be replaced by aspartic acid, asparagine, glutamine or any other preferably negatively charged amino acid.
  • modified NPT genes are preferred which are located at amino acid position 198 compared to the wtNPT for Encode glycine, alanine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine or tryptophan.
  • modified NPT genes are preferred which code at amino acid position 240 compared to wtNPT for glycine, alanine, valine, isoleucine, tyrosine or tryptophan.
  • Modified NPT genes are also preferred which code at amino acid position 261 compared to the wtNPT for glycine, alanine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, asparagine, glutamine or aspartic acid.
  • mutants Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn and Phe240lle as selection markers, enrichment of transfected mammalian cells with high expression rates of the co-integrated gene was achieved, so that these were of interest Mutants are particularly preferred. Even more preferred are the mutants Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn, Phe240lle and Trp91Ala, with which the best enrichment rates could be achieved.
  • the mutant Asp227Val is particularly preferred.
  • Asp190Gly and Asp208Gly mutants proved to be unsuitable markers for the selection of transfected CHO-DG44 cells under serum-free culture conditions. Due to the presumably very reduced enzyme function of these mutants (Asp190Gly, Asp208Gly), only a few cells were obtained after the selection phase, which were also severely impaired in growth and vitality.
  • the amino acids at position 182 and 227 are non-concentrated amino acids which are located outside the three conserved motifs in the C-terminal region of the aminogiycoside 3 ' phosphotransferases.
  • the amino acid at position 91 also belongs to the non-conserved amino acids and lies outside one of the conserved motifs in the N-terminal region of the aminoglycoside-3 ' -phosphotransferases.
  • the amino acids at positions 198 and 240 are conserved amino acids in the C-terminal region of the NPT, but are outside the conserved motifs.
  • the amino acid at position 261 is a conserved amino acid in the third conserved motif of the C-terminal region (Shaw et al., 1993; Hon et al., 1997; Burk et al., 2001).
  • the cells had a factor of 1.4-2.4 in the case of the Glu182Gly, Glu182Asp and Val198Gly mutants, and a factor of 1.6-4.1 in the case of the Asp227Gly mutant , in the case of the Asp227Ala or Trp91Ala mutant a factor of 2.2 or 4, in the case of the Phe240ll or Asp261Asn mutant a factor of 5.7 or 7.3 and in the case of the Asp261Gly or Asp227Val mutant even increased productivity by a factor of 9.3 or 14.6.
  • a co-transfection was carried out to express the multi-chain protein (an antibody).
  • the two protein chains were each expressed from their own vector, one vector additionally coding for the NPT gene and the other vector for the amplifiable selectable dihydrofolate reductase gene.
  • the present invention thus relates to a method for the enrichment of recombinant mammalian cells which contain a modified neomycin phosphotransferase
  • a pool of mammalian cells is transfected with a gene for a modified neomycin phosphotransferase which, compared to the wild-type neomycin phosphotransferase, is more preferably only 1 to 80%, preferably only 1 to 60% only 1.5 to 30%, even more preferably 1.5 to 26% and / or one of the modifications described here;
  • the mammalian cells are cultured under conditions that a
  • the mammalian cells are cultured in the presence of at least one selection agent that is selective for the growth of mammalian cells, and prefers those cells in growth that express the neomycin phosphotransferase gene.
  • a corresponding method is particularly preferred if a modified NPT gene described in more detail in this application is used, in particular if the modified NPT gene used codes for a modified NPT which, in comparison to the wild-type gene, at amino acid position 91 for alanine, at amino acid position 182 for glycine or aspartic acid, at amino acid position 198 for glycine, at amino acid position 227 for alanine, glycine or valine, at amino acid position 261 for glycine or asparagine or at amino acid position 240 encoded for isoleucine.
  • NPT genes which, in comparison to the wild-type gene, code for amino acid at position 227 for valine and / or at amino acid position 261 for glycine and / or asparagine.
  • Particularly preferred are those NPT genes which code for an isoleucine at amino acid position 240 in comparison with the wild-type gene or for a valine at amino acid position 227, an NPT gene which codes for valine at amino acid position 227 in comparison with the wild-type gene is particularly preferred.
  • the present invention also includes modified NPT genes and the use according to the invention of modified NPT genes which have a combination of the corresponding amino acid exchanges.
  • the present invention further relates to eukaryotic expression vectors which contain (i) a heterologous gene of interest in functional association with a heterologous promoter and (ii) a modified neomycin phosphotransferase gene according to the invention described here, which codes for a neomycin phosphotransferase which im Compared to wild-type neomycin phosphotransferase has a low enzyme activity.
  • a “low” or “lower” enzyme activity in the sense of the invention is to be understood as an enzyme activity which corresponds to at most 80%, preferably 1 to 80%, more preferably only 1 to 60% of the enzyme activity of the wtNPT.
  • “lower enzyme activity” means an enzyme activity of 1 to 30%, preferably 1.5 to 26%, in comparison to the wild-type neomycin phosphotransferase.
  • a preferred expression vector contains a modified NPT gene which codes for a modified NPT which has only 1 to 80%, preferably only 1 to 60%, of the enzyme activity of the wtNPT.
  • Expression vectors with modified NPT genes which code for mutants which have only 1 to 30% of the enzyme activity of the wtNPT are further preferred. Particular preference is given to those expression vectors which contain a modified NPT gene which code for mutants which have only 1.5 to 26% of the enzyme activity of wtNPT, the activity being described in the “dot-” described under Example 4 and as Method 5 Assay "is determined.
  • the expression vectors contain genes from modified NPT which have been modified compared to the wtNPT at amino acid position Trp91, Glu182, Val198, Asp227, Phe240 or at position Asp261.
  • NPT mutants which are modified at position Trp91, Glu182, Val198, As ⁇ 227, Phe240 or Asp261 and only over 1 to 80%, preferably only over 1 to 60%, more preferably only over 1.5 to 30 %, and particularly preferably have only 1.5 to 26% of the enzyme activity of the wtNPT.
  • the amino acids Tryp91, Glu182, or Asp227 can preferably each be replaced by glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine or tyrosine at the corresponding position.
  • the glutamic acid at 182 can also be replaced by aspartic acid, asparagine, glutamine or another preferably negatively charged amino acid.
  • Modified NPT genes are also preferred which code at amino acid position 198 in comparison to wtNPT for glycine, alanine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine or tryptophan.
  • modified NPT genes are preferred which code at amino acid position 240 compared to wtNPT for glycine, alanine, valine, isoleucine, tyrosine or tryptophan.
  • Modified NPT genes are also preferred which code at amino acid position 261 compared to the wtNPT for glycine, alanine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, asparagine, glutamine or aspartic acid.
  • Expression vectors which contain modified NPT genes which code for a Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn or Phe240lle mutant in the mutant are particularly preferred the Glu182Gly mutant the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, in the case of the Glu182Asp mutant the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, in the case of the Trp91Ala mutant the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, in the case of the Val198Gly mutant that Amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, in the case of Asp227Ala mutant the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, in the case of the Asp227Val mutant the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, in the case of the Asp227Gly mutant the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, in the case of the Asp261Gly mutant
  • an expression vector using an Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn, Phe240ll or Trp91Ala mutant especially if it is the one in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 6 or in addition, if it is replaced by the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 5 is encoded or contains the specified nucleic acid sequence.
  • the present invention for the first time provides modified neomycin phosphotransferase genes and their gene products which, in comparison to the wtNPT at amino acid position Trp91, Val198 or Phe240, code for a different amino acid than the wt amino acid.
  • the present invention in particular provides for the first time Trp91, Val198 or Phe240 mutants which have a lower enzyme activity than the wtNPT.
  • the NPT described here and modified within the scope of the invention preferably code at amino acid position 91 for alanine, at position 198 for glycine and at position 240 for isoleucine.
  • the present invention for the first time provides NPT mutants which, in comparison to the wt NPT, code for position 182 for glycine, position 227 for alanine or valine and position 261 for glycine. Both the genes and the gene products (enzymes) are made available for the first time in the context of the present invention.
  • the present invention provides for the first time modified NPT with the amino acid sequences according to SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 18 are available.
  • the present invention provides modified NPT genes with the DNA sequences according to SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO: 13 , and SEQ ID NO: 17 are available.
  • the gene of interest contained in the expression vector according to the invention comprises a nucleotide sequence of any length which codes for a product of interest.
  • the gene product or "product of interest” is usually a
  • Protein polypeptide, peptide or fragment or derivative thereof. But it can also
  • RNA or antisense RNA can be in full length, in truncated form, as a fusion gene or as a labeled gene. It can be genomic DNA or preferably cDNA or corresponding fragments or
  • the gene of interest may represent the native gene sequence, may be mutated or otherwise modified. Such modifications include
  • Codon optimizations to adapt to a specific host cell and one
  • the gene of interest can e.g. code for a secreted, cytoplasmic, nucleus-localized, membrane-bound or cell surface-bound polypeptide.
  • nucleotide sequence or “nucleic acid sequence” denotes an oligonucleotide, nucleotides, polynucleotides and their fragments as well as DNA or RNA of genomic or synthetic origin, which are present as a single or double strand and can represent the coding or the non-coding strand of a gene.
  • Standard techniques such as e.g. site-specific mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis (e.g. described in Sambrook et al., 1989 or Ausubel et al., 1994).
  • Coding means the property or capability of a specific sequence of nucleotides in a nucleic acid, for example a gene in a chromosome or an mRNA, as a template for the synthesis of other polymers and macromolecules such as rRNA, tRNA, mRNA, other RNA Molecules, cDNA or polypeptides serve in a biological process. Accordingly, a gene encodes a protein if, by transcription and subsequent translation of the mRNA, the desired protein in a cell or other biological System is produced.
  • Both the coding strand can be coding for a product or protein.
  • a nucleic acid encoding a protein also includes nucleic acids that have a different sequence of nucleotides due to the degenerate genetic code, but result in the same amino acid sequence of the protein. Nucleic acid sequences that code for proteins can also contain introns.
  • cDNA denotes deoxyribonucleic acids which are produced by reverse transcription and synthesis of the second strand of DNA from an mRNA or other RNA produced by a gene. If the cDNA is present as a double-stranded DNA molecule, then it contains both a coding as well as a non-coding strand.
  • intron denotes non-coding nucleotide sequences of any length. They occur naturally in many eukaryotic genes and are removed from a previously transcribed mRNA precursor by a process called splicing. For this, an exact cutting out of the intron at 5 ' - and 3 ' end and a correct connection of the resulting mRNA ends is required so that a mature processed mRNA is produced with the correct reading frame for the successful protein synthesis. Many of the splice donor and splice acceptor involved in this splicing process Locations, that is, the sequences present directly at the exon-intron or intron-exon boundaries, have been characterized in the meantime, for an overview see Ohshima et al., 1987.
  • Biopharmaceutical proteins / polypeptides include, but are not limited to, antibodies, enzymes, cytokines, lymphokines, adhesion molecules, receptors and their derivatives or fragments. Generally are significant all polypeptides that act as agonists or antagonists and / or can find therapeutic or diagnostic use.
  • polypeptides is used for amino acid sequences or proteins and denotes polymers of amino acids of any length. This term also includes proteins which are post-translationally modified by reactions such as, for example, glycosylation, phosphorylation, acetylation or protein processing.
  • the structure of the polypeptide can be, for example, by substitutions , Deletions or insertions of amino acids, fusion with other proteins, while maintaining its biological activity.
  • the expression polypeptides thus also includes, for example, fusion proteins consisting of an immunoglobulin component, for example the Fc component, and a growth factor, for example an interleukin.
  • therapeutic proteins are insulin, insulin-like growth factor, human growth hormone (hGH) and other growth factors, tissue plasminogen activator (tPA), erythropoietin (EPO), cytokines, for example interleukins (IL) such as IL-1, IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 , IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN) -alpha, beta, gamma, omega or tau, tumor necrosis factor (TNF) such as TNF-alpha, beta or gamma, TRAIL, G-CSF, GM- CSF, M-CSF, MCP-1 and VEGF.
  • IL interleukins
  • IFN interferon
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • antibodies are monoclonal, polyclonal, multispecific and single chain antibodies and fragments thereof, such as Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fc and Fc 'fragments, light (L) and heavy (H) immunoglobulin chains and their constant, variable or hypervariable regions as well as Fv and Fd fragments (Chamov et al., 1999).
  • the antibodies can be of human or non-human origin. Humanized and chimeric antibodies are also suitable.
  • fragment antigen-binding Fab
  • fragment antigen-binding Fab
  • fragment antigen-binding Fab
  • They can be generated from conventional antibodies, for example, by treatment with a protease, such as papain, for example but also by DNA cloning.
  • Other antibody fragments are F (ab ') 2 fragments, which can be produced by proteolytic digestion with pepsin.
  • variable region of the heavy and light chain are frequently linked to one another by means of a short peptide fragment of approx. 10-30 amino acids, particularly preferably 15 amino acids. This creates a single polypeptide chain in which VH and VL are linked by a peptide linker.
  • scFv single-chain Fv fragment
  • multimeric scFv derivatives have been developed in recent years to produce multimeric scFv derivatives.
  • the intention is to generate recombinant antibodies with improved pharmacokinetic properties and increased binding avidity.
  • these are produced as fusion proteins with multimerization domains.
  • multimerization domains e.g. the CH3 region of an IgG or coiled coil structure act like the leucine zipper domains.
  • the interaction between the VH and VL regions of the scFv fragment is used for multimerization (eg slide , Tri- and pentabodies).
  • a person skilled in the art refers to a bivalent homodimeric scFv derivative as “diabody”.
  • the shortening of the peptide linker in the scFv molecule to 5-10 amino acids results in the formation of homodimers by superposition of VH ⁇ L chains.
  • the diabodies can additionally be stabilized by introduced disulfide bridges Examples of diabodies can be found in the literature, for example in Perisic et al. (1994).
  • the person skilled in the art refers to a bivalent, homodimeric scFv derivative as “minibody”. It consists of a fusion protein which contains the CH3 region of an immunoglobulin, preferably IgG, particularly preferably IgG1, as a dimerization region. This connects the scFv fragments via a hinge. Region, also from IgG, and a linker region, examples of such minibodies are described in Hu et al. (1996).
  • trimers the person skilled in the art describes a trivalent homotrimeric scFv derivative (Kortt et al., 1997). The direct fusion of VH-VL without using a linker sequence leads to the formation of trimers.
  • fragments which the person skilled in the art calls mini-antibodies and which have a bi-, tri- or tetravalent structure are also derivatives of scFv fragments.
  • the multimerization is achieved via di-, tri- or tetrameric "coiled coil” structures (Pack et al., 1993 and 1995; Lovejoy et al., 1993).
  • the expression vector according to the invention contains a gene coding for a fluorescent protein, preferably in functional association with the gene of interest.
  • the transcription of both genes is preferably carried out under the control of a single heterologous promoter, so that the protein / product of interest and the fluorescent protein are encoded by a bicistronic mRNA. This enables identification of cells that produce the protein / product of interest in large quantities via the expression rate of the fluorescent protein.
  • the fluorescent protein can be, for example, a green, blue-green, blue, yellow or other-colored fluorescent protein.
  • GFP green fluorescent protein
  • a special example is the green fluorescent protein (GFP) from Aequorea victoria or Renilla reniformis and mutants developed from it; see, for example, Bennet et al. (1998); Chalfie et al. (1994); WO 01/04306 and the literature cited there. Further fluorescent proteins and genes coding therefor are described in WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 and WO 01/27150, which are incorporated herein by reference.
  • fluorescent proteins are fluorophores from non-bioluminescent organisms of the species Anthozoa, for example from Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp. "Red”, Discosoma sp. "Green”, Discosoma sp. “Magenta”, Anemonia sulcata.
  • the fluorescence proteins used according to the invention also include natural or genetically engineered mutants and variants, their fragments, derivatives or e.g. Variants fused with other proteins or peptides.
  • the mutations introduced can change, for example, the excitation or emission spectrum, the formation of chromophores, the extinction coefficient or the stability of the protein. Codon optimization can also improve expression in mammalian cells or other species.
  • the fluorescent protein can also be used in fusion with a selection marker, preferably with an amplifiable selection marker such as, for example, dihydrofolate reductase (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the fluorescence emitted by the fluorescent proteins enables the detection of the proteins e.g. by flow cytometry with a fluorescence activated cell sorter (FACS) or by fluorescence microscopy.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the expression vector contains at least one heterologous promoter which enables expression of the gene of interest and preferably also that of the fluorescent protein.
  • a “promoter” is a polynucleotide sequence which enables and controls the transcription of the genes or sequences functionally linked to it Promoter contains recognition sequences for the binding of the RNA polymerase and the initiation site of the transcription (transcription initiation site). In order to express a desired sequence in a certain cell type or a host cell, a suitable, functional promoter must be selected in each case. Those skilled in the art know a variety of promoters from various sources, including constitutive, inducible and repressible promoters. They are stored in databases, eg GenBank, and can be obtained from commercial or individual sources as independent or cloned elements within polynucleotide sequences.
  • inducible promoters the activity of the promoter can be reduced or enhanced in response to a signal.
  • An example of an inducible promoter is the tetracycline (tet) promoter. This contains tetracycline operator sequences (tetO) which can be induced by a tetracycline-regulated transactivator protein (tTA). The binding of tTA to tetO is inhibited in the presence of tetracycline.
  • tetO tetracycline operator sequences
  • tTA tetracycline-regulated transactivator protein
  • further inducible promoters are the jun, fos, metallothionine and heat shock promoters (see also Sambrook et al., 1989; Gossen et al., 1994).
  • promoters that are particularly well suited for high expression in eukaryotes are, for example, the ubiquitin / S27a promoter of the hamster (WO 97/15664), the SV40 early promoter, the adenovirus major late promoter, and the mouse metallothionin-I Promoter, the long terminal repeat region of the Rous Sarcoma virus, the early promoter of the human cytomegalovirus.
  • heterologous mammalian promoters are the actin, immunoglobulin or heat shock promoter (s).
  • a corresponding heterologous promoter can be brought into functional relationship with other regulatory sequences in order to increase / regulate the transcription activity in an expression cassette.
  • the promoter can be functionally linked to enhancer sequences in order to increase the transcription activity.
  • One or more enhancers and / or several copies of an enhancer sequence can be used for this, for example a CMV or SV40 enhancer.
  • enhancer denotes a polynucleotide sequence which acts in cis localization on the activity of a promoter and thus stimulates the transcription of a gene functionally linked to this promoter.
  • the action of the enhancers is position and orientation independent and can thus be positioned in front of or behind a transcription unit, within an intron or even within the coding region.
  • the enhancer can be located both in the immediate vicinity of the transcription unit and at a considerable distance from the promoter. A physical and functional overlap with the promoter is also possible.
  • enhancers are known to the person skilled in the art from various sources (and are stored in databases such as GenBank, for example SV40 enhancer, CMV enhancer, polyoma enhancer, adenovirus enhancer) and are available as independent elements or elements cloned within polynucleotide sequences r (e.g. deposited at ATCC or from commercial and individual sources).
  • a variety of promoter sequences also include enhancer sequences, e.g. the commonly used CMV promoter.
  • the human CMV enhancer is one of the strongest enhancers identified to date.
  • An example of an inducible enhancer is the metallothionein enhancer, which can be stimulated by glucocorticoids or heavy metals.
  • the promoter sequences can also be combined with regulatory sequences which allow control / regulation of the transcription activity. In this way, the promoter can be made repressible / inducible. This can be done, for example, by linking to sequences that represent binding sites for positive or negative regulating transcription factors.
  • the above-mentioned transcription factor SP-1 for example, has a positive influence on the transcription activity.
  • Another example is the binding site for the activator protein AP-1, which can have a positive as well as a negative effect on the transcription.
  • the Ak- AP-1 activity can be controlled by a variety of factors, such as growth factors, cytokines and serum (Faisst et al., 1992, and references therein).
  • the transcription efficiency can also be increased by changing the promoter sequence by mutation (substitution, insertion or deletion) of one, two, three or more bases and then determining in a reporter gene assay whether this increases the promoter activity.
  • the additional regulatory elements include heterologous promoters, enhancers, termination and polyadenylation signals and other expression control elements. Both inducible and constitutive regulatory sequences are known for the different cell types.
  • Transcription regulatory elements usually include a promoter upstream of the gene sequence to be expressed, transcription initiation and termination sites, and a polyadenylation signal.
  • transcription initiation site refers to a nucleic acid in the construct that corresponds to the first nucleic acid that is incorporated into the primary transcript, i.e., the mRNA precursor.
  • the transcription initiation portions can overlap with the promoter sequences.
  • transcription termination site refers to a nucleotide sequence that is normally present at the 3 'end of the gene of interest or of the gene segment to be transcribed and which causes the transcription to be terminated by RNA polymerase.
  • polyadenylation signal is a signal sequence which causes the cleavage at a specific site at the 3 'end of the eukaryotic mRNA and the post-transcriptional incorporation of a sequence of about 100-200 adenine nucleotides (polyA tail) at the cleaved 3' end.
  • the polyadenylation signal comprises the sequence AATAAA approximately 10-30 nucleotides upstream of the cleavage site and a downstream sequence.
  • adenylation elements known, for example tk polyA, SV40 late and early polyA or BGH polyA for example described in US Pat. No. 5,122,458).
  • each transcription unit has a promoter or a promoter / enhancer element, a gene of interest and / or a marker gene, and also a transcription termination element.
  • the transcription unit contains further translation regulatory units.
  • Translation regulatory elements include a translation initiation site (AUG), a stop codon, and a polyA signal for each polypeptide to be expressed.
  • AUG translation initiation site
  • stop codon a polyA signal for each polypeptide to be expressed.
  • the gene of interest usually contains a signal sequence encoding a signal precursor peptide that transports the synthesized polypeptide to and through the ER membrane, often, but not always, at the amino acid terminus of the secreted protein and is cleaved by signal peptidases after the protein has been passed through the ER membrane.
  • the gene sequence will usually, but not necessarily, contain its own signal sequence. If the native signal sequence is not present, a heterologous signal sequence can be introduced in a known manner. Numerous such signal sequences are known to the person skilled in the art and are stored in sequence databases such as GenBank and EMBL.
  • IRES internal ribosome binding site
  • the "IRES element” comprises a sequence which translational initiation is independent of a 5'-terminal methylguanosinium cap (CAP structure) and the upstream gene functionally accomplished and enables the translation of two cistrons (open reading frame) from a single transcript in an animal cell.
  • the IRES element provides an independent ribosome binding site for the translation of the open reading frame immediately downstream.
  • bacterial mRNA which can be multicistronic, ie can code for several different polypeptides or products that are successively translated by the mRNA, most animal cell mRNAs are monocistronic and code only for a single protein or product.
  • a multicistronic transcript in a eukaryotic cell For a multicistronic transcript in a eukaryotic cell, translation would be initiated from the translation initiation site closest upstream and terminated by the first stop codon, whereupon the transcript would be released from the ribosome. In translation, only the first polypeptide or product encoded by the mRNA would result.
  • a multicistronic transcript with an IRES element that is functionally linked to the second or further open reading frames in the transcript enables the subsequent translation of the downstream open reading frame so that in the eukaryotic cell two or more polypeptides encoded by the same transcript or products are produced.
  • the IRES element can be of different lengths and of different origins and e.g. from the encephalomyocarditis virus (EMCV) or other picomaviruses.
  • EMCV encephalomyocarditis virus
  • Various IRES sequences and their use in the construction of vectors have been described in the literature; see e.g. Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996, Mosser et al., 1997.
  • the gene sequence located downstream is functionally linked to the 3 'end of the IRES element, ie the distance is chosen so that the expression of the gene is not influenced or is influenced only marginally or has an expression sufficient for the purpose.
  • the optimal and permissible distance between the IRES element and the start codon of the downstream gene for a still sufficient expression can be found in simple experiments by varying the Determine the distance and determine the expression rate as a function of the distance using reporter gene assays.
  • the measures described can be used to obtain an optimized expression cassette which is of great benefit for the expression of heterologous gene products.
  • An expression cassette obtained by one or more such measures is therefore also the subject of the invention.
  • the expression vector according to the invention contains the hamster ubiquitin / S27a promoter, preferably in functional linkage with the gene of interest and more preferably in functional linkage with the gene of interest and the gene which codes for a fluorescent protein.
  • the hamster ubiquitin / S27a promoter is a strong homologous promoter which is described in WO 97/15664.
  • a promoter preferably has at least one of the following features: GC-rich sequence region, Sp1 binding site, polypyrimidine element, absence of a TATA box.
  • a promoter which has an Sp1 binding site in the absence of a TATA box is particularly preferred.
  • such a promoter is preferred which is constitutively activated and is equally active, in particular, under serum-containing, serum-poor and serum-free cell culture conditions.
  • it is an inducible promoter, in particular a promoter that is activated by serum withdrawal.
  • a particularly advantageous embodiment is a promoter with a nucleotide sequence which is contained in FIG. 5 of WO 97/15664.
  • Promoter sequences are particularly preferred in which the sequence from position -161 to - 45 of FIG. 5 is contained.
  • the promoters used in the examples of the present patent specification each contain a DNA molecule with the sequence from positions 1923 to 2406 of SEQ ID NO: 55 of the enclosed sequence listing. This sequence corresponds to fragment - 372 to + 111 from FIG. 5 of WO 97/15664 and represents the preferred promoter, ie a preferred promoter should encompass this sequence region.
  • Another suitable promoter fragment contains the sequence from position 2134 to 2406 (corresponds to - 161 to + 111 in FIG. 5 of WO 97/15664).
  • a promoter which only contains the sequence from position 2251 to 2406 is no longer functional (corresponds to position - 45 to + 111 in FIG. 5 of WO 97/15664). An extension of the promoter sequence in the 5 'direction starting from position 2134 is possible.
  • a modified promoter preferably has a transcription activity which corresponds to that of the promoter fragment from positions 1923 to 2406 of the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 55 (- 372 to + 111 from FIG. 5 of WO 97/15664 ) corresponds.
  • a modified promoter proves to be suitable for the purposes of the invention if it has a transcription activity which is at least 50%, better at least 80%, even better at least 90%, and even more preferably at least 100% of the activity of the 1923 to 2406 fragment ( - 372 to + 111 fragments) in a comparative reporter gene assay.
  • Modified promoters which have a minimal sequence homology to the wild-type sequence SEQ ID NO: 55 of the hamster ubiquitin / S27a promoter of at least 80%, better at least 85%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% and particularly preferred are particularly preferred have at least 97% and have a corresponding promoter activity in a comparative reporter gene assay.
  • the promoter fragments to be tested including the reference sequence, are each cloned in front of a promoterless reporter gene which codes, for example, for luciferase, secreted alkaline phosphatase or green fluorescent protein (GFP).
  • promoter sequence + reporter gene are then introduced into the test cells, for example CHO-DG44, by means of transfection and the induction of reporter gene expression by the respective promoter fragment is determined by determining the protein content of the reporter gene.
  • a corresponding test can also be found, for example, in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, updated.
  • the promoter sequence of the hamster ubiquitin / S27a promoter as well as the modified promoters, which may also include, for example, the 5 ' untranslated region or selected fragments thereof, and the coding region and the 3 ' untranslated region of the ubiquitin / S27a gene or Selected fragments thereof can be obtained by a person skilled in the art with knowledge of the sequence described in WO 97/15664 using various standard methods, such as, for example, in Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994. Starting from the sequence described in WO 97/15664, for example a suitable section can be selected and an oligonucleotide probe can be chemically synthesized which contains the sequence of this section.
  • the ubiquitin / S27a gene or its 5 'untranslated region or other fragments can be cloned, for example, by hybridization from a hamster genomic library.
  • the reporter gene assay described above the person skilled in the art is able to identify promoter-active fragments without considerable effort and to use them in the sense of the present invention.
  • the 5 ' untranslated region or special fragments thereof can also be easily obtained by PCR amplification with appropriate primers from genomic DNA or a genomic library. Fragments of the 5 ' untranslated region can also be obtained from larger DNA fragments by limited exonuclease III digestion.
  • Such DNA molecules can also be chemically synthesized or generated from chemically synthesized fragments by ligation.
  • “Homologous” in the sense of the invention are genes, provided that their nucleotide sequence shows at least 70%, better at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% and particularly preferably at least 97% agreement with the nucleotide sequence of the gene to which it is homologous is.
  • the measures described can be used to obtain an optimized expression cassette which is of great benefit for the expression of heterologous gene products.
  • An expression cassette obtained by one or more such measures is therefore also the subject of the invention.
  • the expression vector according to the invention can in principle be prepared by conventional methods known to the person skilled in the art, such as, for example, in Sambrock et al. (1989). There is also a description of the functional components of a vector, for example suitable promoters (in addition to the hamster ubiquitin / S27a promoter), enhancers, termination and polyadenylation signals, antibiotic resistance genes, selection markers, starting points for replication and spitting signals.
  • suitable promoters in addition to the hamster ubiquitin / S27a promoter
  • enhancers in addition to the hamster ubiquitin / S27a promoter
  • termination and polyadenylation signals antibiotic resistance genes
  • selection markers starting points for replication and spitting signals.
  • cloning vectors can be used for the production, for example plasmids, bacteriophages, phagemids, cosmids or viral vectors such as baculovirus, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses and herpes simplex virus, but also artificial ones Chromosomes / mini-chromosomes.
  • the eukaryotic expression vectors typically also contain prokaryotic sequences such as, for example, the origin of replication and antibiotic resistance genes, which enable the multiplication and selection of the vector in bacteria.
  • a variety of eukaryotic expression vectors containing multiple cloning sites for the introduction of a polynucleotide sequence are known and some are commercially available from various companies such as Stratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, Wl, USA or BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA available.
  • the heterologous promoter, the gene of interest, and the modified neomycin phosphotransferase gene and, if appropriate, the gene coding for a fluorescent protein, additional regulatory elements such as the internal ribosome binding site (IRES), enhancer or a polyadenylation signal are added in a manner familiar to the skilled worker introduced the expression vector.
  • An expression vector according to the invention minimally contains a heterologous promoter, the gene of interest and a modified neomycin phosphotransferase gene.
  • the expression vector preferably also contains a gene coding for a fluorescent protein.
  • an ubiquitin / S27a promoter is according to the invention.
  • An expression vector is particularly preferred in which the heterologous promoter, preferably an ubiquitin / S27a promoter, the gene of interest and the gene which codes for a fluorescent protein are functionally linked or are functionally linked and the neomycin phosphotransferase and Gene is located in the same or in a separate transcription unit.
  • the heterologous promoter preferably an ubiquitin / S27a promoter
  • a promoter / enhancer is functionally linked to a coding gene sequence if it can control or modulate the transcription of the linked gene sequence in the cis position.
  • a functionally linked promoter is generally upstream of the coding gene sequence, it does not necessarily have to be closely adjacent.
  • Enhancers also do not have to be in close proximity, as long as they favor transcription of the gene sequence. For this purpose, they can be both upstream and downstream of the gene sequence, possibly at some distance.
  • a polyadenylation site is functionally linked to a gene sequence if it is positioned at the 3 'end of the gene sequence in such a way that the transcription proceeds via the coding sequence up to the polyadenylation signal.
  • the linkage can be carried out by customary recombinant methods, for example by means of the PCR technique, by ligation at suitable restriction sites or by splicing. If no suitable restriction sites are available, synthetic oligonucleotide linkers or adapters can be used in a manner known per se. According to the invention, the functional link is preferably not made via intron sequences.
  • the heterologous promoter preferably an ubiquitin / S27a promoter
  • the gene of interest and the gene coding for a fluorescent protein are functionally linked to one another. This means, for example, that both the gene of interest and that for a fluorescent one
  • Protein coding gene can be expressed starting from the same heterologous promoter.
  • the functional linkage takes place via an IRES element, so that a bicistronic mRNA is synthesized by both genes.
  • the expression vector according to the invention can additionally
  • Promoter preferably the ubiquitin / S27a promoter or a modified form thereof, with an enhancer element, e.g. a SV40 enhancer or a CMV
  • Enhancer element that is linked.
  • the genes can be expressed within an expression vector from one or more transcription units.
  • a region that contains one or more genes to be transcribed is defined as a “transcription unit”.
  • the genes within a transcription unit are functionally linked to one another such that all genes within such a unit are under the transcriptional control of the same promoter or promoter / enhancer.
  • IRES elements or introns can be used for the functional linking of the genes within a transcription unit.
  • the expression vector can contain a single transcription unit for expressing the gene of interest, the modified NPT gene and optionally the gene which codes for the fluorescent protein. Alternatively, these genes can also be arranged in two or more transcription units. Different combinations of the genes are possible within a transcription unit. In a further embodiment of the present invention, more than one expression vector, consisting of one, two or more transcription units, can be introduced into a host cell by co-transfection or in successive transfection in any order. Any combination of regulatory elements and genes on any vector can be chosen as long as sufficient expression of the transcription units is ensured. If necessary, other regulatory elements and genes such as e.g. additional genes of interest or selection markers on which expression vectors are positioned.
  • an expression vector according to the invention containing a gene of interest and a gene which codes for a modified neomycin phosphotransferase, can both genes in one or in two separate transcription units contain. Each transcription unit can transcribe and express one or more gene products. If both genes are contained in a transcription unit, they are under the control of the same promoter or promoter / enhancer, preferably using an IRES element to ensure the functional linkage of all components. If the gene encoding modified neomycin phosphotransferase and the gene of interest are contained in two separate transcription units, they can be under the control of the same or different promoters / enhancers.
  • a weaker heterologous promoter for example the SV40 early promoter, is preferably used for the modified NPT gene, and preferably no enhancer is used.
  • Expression vectors with two separate transcription units are preferred in the context of the invention.
  • One (bicistronic) transcription unit contains the gene of interest and possibly a gene coding for a fluorescent protein, while the other transcription unit contains the modified NPT gene.
  • Each transcription unit is preferably delimited at the 3 'end by a sequence which codes for a polyA signal, preferably BGH-polyA or SV40 polyA.
  • Expression vectors which instead of the gene of interest have only one multiple cloning site which enables the gene of interest to be cloned via recognition sequences for restriction endonucleases are also according to the invention.
  • Numerous recognition sequences for a wide variety of restriction endonucleases and the associated restriction endonucleases are known in the prior art. Sequences are preferably used which consist of at least 6 nucleotides as the recognition sequence. A list of suitable recognition sequences can be found, for example, in Sambrook et al., (1989).
  • Eukaryotic host cells are used for transfection with the expression vector according to the invention, preferably mammalian cells and in particular rodent cells such as, for example, mouse, rat and hamster cell lines.
  • the successful one Transfection of the corresponding cells with an expression vector according to the invention results in transformed, genetically modified, recombinant or transgenic cells, which are also the subject of the present invention.
  • Host cells preferred within the scope of the invention are hamster cells such as BHK21, BHK TK “ , CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 and CHO-DG44 cells or derivatives / derivatives of these cell lines.
  • CHO-DG44, CHO are particularly preferred -DUKX, CHO-K1 and BHK21 cells, in particular CHO-DG44 and CHO-DUKX cells, mouse myeloma cells, preferably NS0 and Sp2 / 0 cells and derivatives / descendants of these cell lines are also suitable.
  • hamster and mouse cells examples include human, mouse, rat, monkey, rodent, or eukaryotic cells, including but not limited to yeast, insect, and plant cells, can also be used as host cells Production of biopharmaceutical proteins can be used.
  • the eukaryotic host cells are transfected with a polynucleotide or one of the expression vectors according to the invention by customary methods (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Suitable transfection methods are, for example, liposome-mediated transfection, calcium phosphate coprecipitation, electroporation, polycations (eg DEAE-dextran) -mediated transfection, protoplast fusion, microinjection and viral infections.
  • a stable transfection is preferably carried out, the constructs either being integrated into the genome of the host cell or an artificial chromosome / minichromosome or are contained in a stable manner episomally in the host cell.
  • each sequence or gene that is introduced into a host cell is referred to as a “heterologous sequence” or “heterologous gene” with respect to the host cell. Even if the sequence or gene to be introduced is identical to an endogenous sequence or an endogenous gene of the host cell.
  • a hamster Aktingen that is introduced into a hamster host cell is by definition a heterologous gene.
  • mammalian cells preferably rodent cells, particularly preferably hamster cells, such as CHO or BHK cells that were transfected with one of the expression vectors according to the invention described here.
  • heteromeric proteins such as monoclonal antibodies (mAb)
  • mAbs monoclonal antibodies
  • the transfection of suitable host cells can in principle be carried out in two different ways.
  • Such mAbs are made up of several subunits, the heavy and light chains. Genes encoding these subunits can be placed in independent or multicistronic transcription units on a single plasmid, which is then used to transfect the host cell. This is to ensure the stoichiometric representation of the genes after integration into the genome of the host cell.
  • independent transcription units it must be ensured that the mRNAs responsible for encode different proteins that have the same stability, transcription and translation efficiency.
  • the expression of the genes within a multicistronic transcription unit is carried out by a single promoter and only one transcript is produced.
  • the use of IRES elements enables a quite efficient internal translation initiation of the genes in the second and subsequent cistrons. Nevertheless, the expression rates for these cistrons are lower than that of the first cistron, whose translation initiation via a so-called “cap” -dependent pre-initiation complex is much more efficient than the IRES-dependent translation initiation.
  • additional intercistronic elements are introduced which, in cooperation with the IRES elements, ensure uniform expression rates (WO 94/05785).
  • Another possibility preferred according to the invention for the simultaneous production of several heterologous proteins is co-transfection, in which the genes are integrated separately into different expression vectors.
  • This has the advantage that certain ratios of the genes and gene products to one another can be set, as a result of which differences in the mRNA stability and in the transcription and translation efficiency can be compensated for.
  • the expression vectors are more stable and easier to handle both in cloning and in transfection.
  • the host cells are therefore additionally transfected, preferably co-transfected, with one or more vectors with genes which code for one or more other proteins of interest.
  • the further vector or vectors used for co-transfection encode e.g. for the other protein (s) of interest under the control of the same promoter / enhancer combination as well as for at least one other selection marker, e.g. the dihydrofolate reductase.
  • the host cells are preferably established, adapted and cultivated under serum-free conditions, if appropriate in media which are free of animal proteins / peptides.
  • media which are free of animal proteins / peptides.
  • Examples of commercially available media are Harn's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle 's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove 's Modified Dulbecco 's medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serum-free CHO medium (Sigma) and protein-free CHO medium (Sigma).
  • Each of these media can optionally be supplemented with various compounds, e.g. hormones and / or other growth factors (e.g. insulin, transferrin, epidermal growth factor, insulin-like growth factor), salts (e.g. sodium chloride, calcium, magnesium, phosphate), buffers (e.g. HEPES) , Nucleosides (eg adenosine, thymidine), glutamine, glucose or other equivalent nutrients, antibiotics and / or trace elements.
  • growth factors e.g. insulin, transferrin, epidermal growth factor, insulin-like growth factor
  • salts e.g. sodium chloride, calcium, magnesium, phosphate
  • buffers e.g. HEPES
  • Nucleosides eg adenosine, thymidine
  • glutamine glucose or other equivalent nutrients
  • antibiotics and / or trace elements e.g., antibiotics and / or trace elements.
  • serum-free media are preferred according to the invention, media which have been
  • a “selection agent” is a substance that affects the growth or survival of host cells with a deficiency for the respective selection marker gene.
  • Geneticin G4128 is preferably used as a medium additive for the selection of heterologous host cells which contain a modified neomycin phosphotransferase G418 concentrations between 100 and 800 ⁇ g / ml medium are preferably used, particularly preferably 300 to 400 ⁇ g / ml medium Should the host cells be transfected with several expression vectors, eg if several genes of interest are separated into the Host cell should be introduced, so they usually have different selection marker genes.
  • a “selection marker gene” is a gene which enables the specific selection of cells which receive this gene by adding an appropriate selection agent to the culture medium.
  • an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker. Only cells that contain this Gen transformed, can grow in the presence of the corresponding antibiotic and thus selected. Non-transformed cells, on the other hand, cannot grow or survive under these selection conditions.
  • the selection markers used in this invention include genetically engineered mutants and variants, fragments, functional equivalents, derivatives, homologues and fusions with other proteins or peptides, as long as the selection marker maintains its selective properties.
  • Such derivatives have considerable homology in the amino acid sequence in the regions or domains to which the selective property is ascribed.
  • selection marker genes including bifunctional (positive / negative) markers, have been described in the literature (see, for example, WO 92/08796 and WO 94/28143).
  • selection markers commonly used in eukaryotic cells include the genes for aminoglycoside phosphotransferase (APH), hygromycin phosphotransferase (HYG), dihydrofolate reductase (DHFR), thymidine kinase (TK), glutamine synthetase, asparagine synthetase and genes that confer resistance to neomycin (G418), puromycin, histidinol D, bleomycin, phleomycin and zeocin.
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • HAG hygromycin phosphotransferase
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • TK thymidine kinase
  • G418 puromycin,
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • bacterial ß-galactosidase cell surface markers or fluorescent proteins (e.g. green fluorescent protein (GFP) and its variants of Aequorea victoria and Renilla reniformis or other species; red fluorescent proteins and proteins fluorescent in other colors and their variants of non- bioluminescent organisms such as Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.) are used for the selection of transformed cells.
  • GFP green fluorescent protein
  • red fluorescent proteins and proteins fluorescent in other colors and their variants of non- bioluminescent organisms such as Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.
  • the term "gene expression” refers to the transcription and / or translation of a heterologous gene sequence in a host cell.
  • the expression rate can be determined here generally, either on the basis of the amount of the corresponding mRNA that is present in the host cell or on the basis of the one produced Amount of gene product encoded by the gene of interest
  • the amount of mRNA generated by transcription of a selected nucleotide sequence can be determined, for example, by Northern blot hybridization, ribonuclease RNA protection, in situ hybridization of cellular RNA or by PCR methods ( Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994)
  • Proteins which are encoded by a selected nucleotide sequence can also be obtained by various methods, such as, for example, by ELISA, Western blot, radioimmunoassay, immunoprecipitation, detection of the biological activity of the protein or by immunostaining the protein with subsequent FACS analysis, b be determined (Sambrook
  • High expression level (rate) means the persistent and sufficiently high expression or synthesis of a heterologous sequence introduced into a host cell, for example a gene coding for a therapeutic protein, designated.
  • Enhanced or high expression or a high expression level (rate) or high productivity is present if a cell according to the invention is cultivated without gene amplification according to a method according to the invention described here, and if this cell is at least more than approximately 0.5 pg of the desired gene product produced per day (0.5 pg / cell / day).
  • Enhanced or high expression or a high level (s) of expression or high productivity is also present if the cell according to the invention produces at least more than approximately 1.0 pg of the desired gene product per day without prior gene amplification (1.0 pg / cell / day).
  • An increased or high expression or A high expression level (s) or high productivity is also present in particular if the cell according to the invention produces at least more than 1.5 pg of the desired gene product per day without prior gene amplification (1.5 pg / cell /Day).
  • Enhanced or high expression or a high expression level (rate) or high productivity is present in particular if the cell according to the invention produces at least more than approximately 2.0 pg of the desired gene product per day without prior gene amplification (2.0 pg / cell / day).
  • a particularly enhanced or high expression or a particularly high expression level (rate) or a particularly high productivity is present if the cell according to the invention without prior gene amplification at least more than about 3.0 pg of the desired gene product per Day produced (3.0 pg / cell / day).
  • the productivities can be increased by at least a factor of 2 to 10, so that in relation to a cell that has undergone a gene amplification step, a “high expression "," enhanced expression “or” high productivity "speaks if this cell produces at least more than about 5 pg of the desired gene product per day (5 pg / cell / day), preferably at least more than about 10 pg / cell / day , particularly preferably at least more than about 15 pg / cell / day, still more preferably at least more than about 20 pg / cell / day, or at least more than about 30 pg / cell / day.
  • a high or increased expression, a high productivity or a high expression level (rate) can be achieved both by using one of the expression vectors according to the invention and by using one of the methods according to the invention.
  • modified NPT enables a more efficient selection of stably transfected host cells with high expression of the heterologous gene of interest compared to wtNPT.
  • the invention thus also relates to a method for expressing at least one gene of interest in recombinant mammalian cells, characterized in that (i) a pool of mammalian cells with at least one gene of interest and one gene for a modified neomycin phosphotransferase is transfected in comparison to the wild-type neomycin phosphotransferase has only 1 to 80% of the activity, preferably only 1 to 60%, more preferably only 1.5 to 30%, in particular 1.5% to 26%; (ii) the cells are cultured under conditions that allow expression of the gene (s) of interest and the modified neomycin phosphotransferase gene; (iii) the mammalian cells are cultivated in the presence of at least one selection agent, preferably G418, which acts selectively on the growth of the mammalian cells, and prefers those cells in growth which express the modified neomycin phosphotransferase gene; and (iv) the protein (s) of interest are obtained from the ma
  • the invention also relates to a method for selecting recombinant mammalian cells which express at least one gene of interest, wherein
  • neomycin phosphotransferase has only 1 to 80% of the activity, preferably only 1 to 60%, more preferably only 1, 5 to 30%, in particular 1.5% to 26%; (ii) the mammalian cells are cultured under conditions that allow expression of the gene (s) of interest and the modified neomycin phosphotransferase gene; and (iii) the
  • Mammalian cells are cultivated in the presence of at least one selection agent, preferably G418, which acts selectively on the growth of the mammalian cells, and those cells in growth which prefer the modified neomycin
  • Methods for expressing at least one gene of interest and for selecting recombinant cells which express a corresponding gene of interest are particularly preferred if a modified NPT gene described in more detail in this application is used, in particular if a modified NPT gene is used , which compared to the wild-type gene at amino acid position 182 for glycine or aspartic acid, at amino acid position 91 for alanine, at amino acid position 198 for glycine, at amino acid position 227 for alanine, glycine or valine, at amino acid position 261 for glycine or asparagine or at amino acid position 240 for Encoded isoleucine.
  • the cells which express a gene of interest and a modified NPT gene are selected, for example, by adding G418 as a selection agent.
  • G418 as a selection agent.
  • other aminoglycosidic antibiotics such as neomycin or kanamycin.
  • the cultivation and selection of the cells according to the invention in 200 to 800 ⁇ g G418 per ml culture medium is preferred.
  • the addition of 300 to 700 ⁇ g G418 per ml culture medium has proven to be particularly preferred.
  • the addition of approximately 400 ⁇ g of G418 per ml of culture medium is the most preferred embodiment. With a corresponding method, recombinant cells with a particularly high expression rate could be selected.
  • the cells after selection with 400 ⁇ g G418 per mL culture medium had a factor of 1.4-2.4 in the case of the Glu182Gly, Glu182Asp and Val198Gly mutants, and one in the case of the Asp227Gly mutant by factor 1, 6-4.1, in the case of the Asp227Ala or Trp91Ala mutant one by a factor of 2.2 or 4, in the case of the Phe240lle or Asp261Asn mutant one by a factor of 5.7 or 7, 3 and in the case of the Asp261Gly or Asp227Val mutant, an increase even by a factor of 9.3 or 14.6 Productivity on.
  • the specific productivities for the respective modified NPT genes are shown in Fig.6.
  • the corresponding methods can be combined with a FACS-assisted selection of recombinant host cells which contain, for example, one (or more) fluorescent protein (s) (e.g. GFP) or a cell surface marker as a further selection marker.
  • fluorescent protein e.g. GFP
  • Other methods of achieving increased expression, and a combination of different methods is also possible, are based, for example, on the use of (artificial) transcription factors, treatment of the cells with natural or synthetic agents for upregulating endogenous or heterologous gene expression, improvement of the stability (half-life) of the mRNA or the protein, improvement of the mRNA translation initiation, increase of the gene dose by using episomal plasmids (based on the use of viral sequences as the origin of replication, for example of SV40, polyoma, adenovirus, EBV or BPV), use of amplification-promoting sequences (Hemann et al., 1994) or in vitro amplification systems based on DNA concateners
  • Coupled transcription of the gene of interest and the gene encoding the fluorescent protein has been found to be particularly effective in connection with the use of a modified NPT gene as a selection marker. Both the protein / product of interest and the fluorescent protein are expressed from the resulting bicistronic mRNA. Because of this coupling of the expression of the protein of interest and the fluorescent protein, it is easily possible according to the invention to identify and isolate high-producing recombinant host cells via the expressed fluorescent protein, e.g. by sorting using a fluorescence activated cell sorter (FACS).
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • the selection of recombinant host cells that show a high vitality and an increased expression rate of the desired gene product is a multi-stage process.
  • the host cells transfected with the expression vector according to the invention or optionally a further vector, for example co-transfected, are listed under Cultivated conditions that allow selection of the cells that express the modified NPT, for example by culturing in the presence of a selection agent such as G418 in concentrations of 100, 200, 400, 600, 800 ⁇ g or more G418 / mL culture medium.
  • the corresponding cells are then examined at least for the expression of the gene which is coupled to the gene of interest and which codes for a fluorescent protein, in order to identify and sort out the cells / cell population which show the highest expression rates of fluorescent protein.
  • the cells that belong to the 10-20% cells with the highest expression rate of fluorescent protein are sorted out and further cultivated.
  • the brightest 5%, preferably the brightest 3%, or even the brightest 1% of the fluorescent cells of a cell mixture can be sorted out and multiplied.
  • only the brightest 0.5% or the brightest 0.1% of the fluorescent cells are sorted out and multiplied.
  • the selection step can be carried out on cell pools or with pre-sorted cell pools / cell clones.
  • One or more, preferably two or more and in particular three or more sorting steps can be carried out, with the cells between the individual sorting steps over a certain period of time, e.g. about two weeks at pools, cultivated and propagated.
  • Figures 11 and 12 show specific productivities after FACS-based sorting with and without a gene amplification step as an example for the mutant Asp227Gly.
  • the invention thus also relates to a method for obtaining and selecting recombinant mammalian cells which express at least one heterologous gene of interest, characterized in that (i) recombinant mammalian cells are transfected with an expression vector according to the invention; (ii) the transfected cells are cultured under conditions that allow expression of the gene (s) of interest, the gene encoding a fluorescent protein, and the modified neomycin phosphotransferase gene; (iii) the mammalian cells cultivated in the presence of at least one selection agent which acts selectively on the growth of mammalian cells, and prefers those cells in growth which express the modified neomycin phosphotransferase gene; and (iv) the mammalian cells are sorted out by means of flow cytometric analysis, which show a particularly high expression of the fluorescent gene.
  • steps ii) - iv) can be repeated one or more times with the cells obtained after step iv).
  • a corresponding method is preferred, which is characterized in that the sorted mammalian cells have an average specific productivity without additional gene amplification step of greater than 0.5pg of the desired one
  • Gene products (gene products) per day and cell 0.5 pg / cell / day), preferably greater than 1 pg / cell / day, particularly preferably greater than 2 pg / cell / day, more preferably greater than 3 pg / cell / day , even more preferably greater than 4, pg / cell / day, for example greater than 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc., greater than 15, 20,
  • the selected high-producing cells are preferably grown in a serum-free culture medium and preferably in suspension culture under conditions which allow expression of the gene of interest.
  • the protein / product of interest is preferably obtained from the cell culture medium as a secreted gene product. If the protein is expressed without a secretion signal, the gene product can also be isolated from cell lysates. In order to obtain a pure, homogeneous product which is essentially free of other recombinant proteins and host cell proteins, usual cleaning steps are carried out. To do this, cells and are often removed first Cell debris from the culture medium or lysate.
  • the desired gene product can then be freed from contaminating soluble proteins, polypeptides and nucleic acids, for example by fractionation on immunoaffinity and ion exchange columns, ethanol precipitation, reverse phase HPLC or chromatography on Sephadex, silica or cation exchange resins such as DEAE.
  • Methods which lead to the purification of a heterologous protein expressed by recombinant host cells are known to the person skilled in the art and are described in the literature, for example in Harris et al. (1995) and Scopes (1988).
  • the cells according to the invention can optionally also be subjected to one or more gene amplification steps in which they are cultivated in the presence of a selection agent which leads to an amplification of an amplifiable selection marker gene.
  • This step can be carried out both with cells which express a fluorescent protein and which have preferably been sorted one or more times using FACS (preferably in one of the ways described here) and with unsorted cells.
  • the host cells are additionally transfected with a gene that codes for an amplifiable selection marker. It is conceivable that the gene which codes for an amplifiable selection marker is present on one of the expression vectors according to the invention or is introduced into the host cell with the aid of a further vector.
  • the amplifiable selection marker gene usually encodes an enzyme necessary for the growth of eukaryotic cells under certain cultivation conditions.
  • the amplifiable selection marker gene can code for dihydrofolate reductase (DHFR).
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the gene is amplified if a host cell transfected with it is cultivated in the presence of the selection agent methotrexate (MTX).
  • MTX selection agent methotrexate Table 2 below gives examples of other amplifiable selection marker genes which can be used according to the invention and the associated selection agents, which are described in an overview by Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-566 (1990).
  • a gene which codes for a polypeptide with the function of DHFR is preferred as the amplifiable selection marker gene, e.g. for DHFR or a fusion protein from the fluorescent protein and DHFR.
  • DHFR is required for the biosynthesis of purines. Cells that lack the DHFR gene cannot grow in purine-deficient media. The DHFR gene is therefore a useful selection marker for the selection and amplification of genes in cells which are cultivated in a purine-free medium.
  • the selection agent used in conjunction with the DHFR gene is methotrexate (MTX).
  • the present invention therefore includes a method for the production and selection of recombinant mammalian cells which comprises the following steps: (i) transfection of the host cells with genes which encode at least one protein / product of interest, a modified neomycin phosphotransferase and DHFR; (ii) culturing the cells under conditions that allow expression of the various genes; and (iii) the amplification of these co-integrated genes by culturing the cells in the presence of a selection agent which allows the amplification of at least the amplifiable selection marker gene, such as methotrexate.
  • a selection agent which allows the amplification of at least the amplifiable selection marker gene, such as methotrexate.
  • the transfected cells are preferably cultivated in hypoxanthine / thymidine-free medium in the absence of serum and with the addition of increasing concentrations of MTX.
  • concentration of MTX in the first amplification step is preferably at least 5 nM.
  • concentration of MTX can also be at least 20 nM or 100 nM and gradually up to 1 ⁇ M be increased. In individual cases, concentrations of over 1 ⁇ M can also be used, for example 2 ⁇ M.
  • the corresponding cells are additionally transformed with a gene for a fluorescent protein
  • these cells can be identified and sorted out using a fluorescence-activated line sorting device (FACS), and then in a gene amplification step in the presence of at least 20, preferably in the presence of 50 or Cultivate and amplify 100 nM MTX.
  • FACS fluorescence-activated line sorting device
  • the productivity can be increased considerably to over 20pg of gene product per cell and day, preferably to over 21, 22, 23, 24, 25, etc., 30, 35, 40, etc.
  • the host cells can be subjected to one or more gene amplification steps in order to increase the copy number of at least the gene of interest and the amplifiable selection marker gene.
  • the achievable high productivity is linked to an effective preselection via a neomycin phosphotransferase-mediated resistance to aminoglycosidic antibiotics such as neomycin, kanamycin and G418. It is therefore possible to reduce the number of gene amplification steps required and e.g. perform only one gene amplification.
  • the present invention thus also relates to methods for obtaining and selecting recombinant mammalian cells which express at least one heterologous gene of interest and are characterized in that (i) recombinant mammalian cells are transfected with an expression vector according to the invention and the gene for an amplifiable selection marker gene become; (ii) the mammalian cells are cultured under conditions that allow expression of the gene (s) of interest, the modified neomycin phosphotransferase gene and the gene encoding a fluorescent protein; (iii) the mammalian cells are cultured in the presence of at least one selection agent which acts selectively on the growth of mammalian cells and prefers those cells in growth which express the neomycin phosphotransferase gene; (iv) the mammalian cells are sorted out by means of flow cytometric analysis, which show a high expression of the fluorescent protein; (v) the sorted cells are cultivated under conditions under which the amplifiable selection
  • a corresponding method is particularly preferred if the modified neomycin phosphotransferase genes described in this invention are used. Also preferred is a method in which only one amplification step is carried out. Also preferred is a corresponding method that leads to recombinant mammalian cells that have an average specific productivity of greater than 20pg, preferably of over 21, 22, 23, 24, 25, etc., 30, 35, 40, etc., of the Show desired gene product (gene products) per cell and day.
  • Mammalian cells preferably mouse myeloma and hamster cells, are preferred host cells for the use of DHFR as an amplifiable selection marker.
  • the cell lines CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) and CHO-DG44 (Urlaub et al., 1983) are particularly preferred since, due to the mutation, they do not have their own DHFR activity.
  • a mutated DHFR gene can be used in the transfection, which codes for a protein with a reduced sensitivity to methotrexate (Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982).
  • the DHFR marker is particularly well suited for selection and subsequent amplification, since these cells do not express endogenous DHFR and therefore do not grow in a purine-free medium. Therefore, the DHFR gene can be used as the dominant selection marker and the transformed cells are selected in hypoxanthine / thymidine-free medium.
  • BSA bovine serum albumin
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • GFP green fluorescent protein
  • IRES intemal ribosomal entry site kb: Kilobase mAb: monoclonal antibody
  • MCP-1 monocyte chemoattractant protein-1
  • NPT neomycin phosphotransferase
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the cells CHO-DG44 / dhff / _ (Urlaub et al., 1983) were permanently suspended cells in serum-free CHO-S-SFMII medium supplemented with hypoxanthine and thymidine (Invitrogen GmbH, Düsseldorf, DE) in Cell culture flasks cultivated at 37 ° C in a humid atmosphere and 5% C0 2 .
  • the cell numbers and the viability were determined using a CASY1 Cell Counter (Schaerfe System, DE) or by trypan blue staining, and the cells were then sown in a concentration of 1-3 ⁇ 10 5 / mL and passaged every 2-3 days.
  • Lipofectamine Plus reagent (Invitrogen GmbH) was used to transfect CHO-DG44.
  • a total of 1 ⁇ g plasmid DNA, 4 ⁇ L lipofectamine and 6 ⁇ L plus reagent according to the manufacturer's instructions were mixed and mixed in a volume of 200 ⁇ L with 6 ⁇ 10 5 exponentially growing CHO-DG44 cells in 0.8 mL HT- supplemented CHO-S-SFMII medium. After three hours of incubation at 37 ° C in a cell incubator, 2 mL of HT-supplemented CHO-S-SFMII medium was added.
  • the cells were transferred 2 days after transfection into HT-supplemented CHO-S-SFMII with G418 (Invitrogen), the medium being changed every 3 to 4 days.
  • G418 Invitrogen
  • 400 ⁇ g / mL G418 was added for selection, although in some experimental series the concentration was also reduced to 200 ⁇ g / mL or increased to 500, 600 or 800 ⁇ g / mL.
  • DHFR- and NPT-based selection in the case of a co-transfection, in which one expression vector contained a DHFR and the other expression vector a neomycin phosphotransferase selection marker, the cells were placed in CHO-S-SFMII medium 2 days after transfection transferred without the addition of hypoxanthine and thymidine and G418 (Invitrogen) also added to the medium in a concentration of 400 ⁇ g / mL.
  • DHFR-based gene amplification of the integrated heterologous genes can be achieved by adding the selection agent MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) in a concentration of 5 - 2000 nM to an HT-free CHO-S-SFMII medium.
  • eukaryotic expression vectors were used which are based on the pAD-CMV vector (Werner et al., 1998) and which mediate the constitutive expression of a heterologous gene via the combination CMV enhancer / hamster ubiquitin / S27a promoter (WO 97/15664). While the base vector pBID contains the dhfr minigen, which serves as an amplifiable selection marker (see, for example, EP-0-393-438), the dhfr minigen in the vector pBIN has been replaced by a neomycin phosphotransferase resistance gene (Fig. 1).
  • the selec- tion marker neomycin phosphotransferase including SV40 early promoter and TK polyadenylation signal, isolated from the commercial plasmid pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, USA) as a 1640 bp Bsu36l fragment. After a filling reaction of the fragment ends by Klenow DNA polymerase, the fragment was ligated with the 3750 bp Bsu36l / Stul fragment of the vector pBID, which was also treated with Klenow DNA polymerase.
  • the IRES-GFP gene region was isolated from the vector plRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, USA) and brought under the control of the CMV enhancer / promoter in the vector pBID, that the multiple cloning site between promoter region and IRES element was preserved.
  • the procedure was as follows. In a PCR mutagenesis, using the plasmid plRES2-EGFP as a template, on the one hand the HindILL interface AAGCTT within the IRES sequence was converted into the sequence sequence ATGCTT by using mutagenic primers and thus removed.
  • an Xbal interface was introduced by means of a primer with complementarity to the 5 ' end of the IRES sequence or a Spel interface with complementarity to the 3 ' end of the GFP sequence.
  • the resulting PCR fragment which included the complete IRES and GFP sequence, was digested with Xbal and Spei and cloned into the singular Xbal site at the 3 ' end of the multiple cloning site of the vector pBID.
  • the IRES-GFP gene region from the vector plRES2-EGFP was brought under the control of the CMV enhancer / hamster ubiquitin / S27a promoter in the vector pBIN. This resulted in the bicistronic base vector pBING (Fig. 1).
  • the human MCP-1 cDNA (Yoshimura et al., 1989) was cloned as a 0.3 kb HindIII / EcoRI fragment into the corresponding sites of the vector pBIN, resulting in the vector pBIN-MCP1 (Fig. 2A).
  • the heavy chain was cloned as a 1.5 kb BamHI / HindIII fragment into the vector pBID or pBIDG digested with BamHI and HindIII, the vector pBID-HC or pBIDG-
  • HC resulted (Fig. 2B).
  • the light chain was rated as 0.7 kb BamHI / HindIII Fragment cloned into the corresponding interfaces of the vector pBIN or pBING, whereby the vector pBIN-LC or pBING-LC (Fig. 2B) was created.
  • FACS The flow cytometric analyzes and sorting were carried out using a Coulter Epics Altra device.
  • the FACS is equipped with a helium-argon laser with an excitation wavelength of 488 nm.
  • the fluorescence intensity is recorded at a wavelength that is adequate for the fluorescence protein and processed using the connected software Coulter Expo32.
  • the sorting is carried out by default at a rate of 8000 - 10000 events / second.
  • the suspended cells can be centrifuged off (5 min at 180xg) and adjusted to a cell concentration of 1 - 1.5 x10 7 / mL in HBSS.
  • the cells can then be sorted according to their fluorescent protein signal.
  • the cells are taken up in tubes with the culture medium provided, centrifuged off and, depending on the number of cells sorted out, sown into appropriate culture vessels or placed directly in microtiter plates.
  • the MCP-1 titers in supernatants from stably transfected CHO-DG44 cells were quantified by ELISA using the OptEIA Human MCP-1 Set kit according to the manufacturer's protocol (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, DE).
  • the IgG2 mAb in the supernatants of stably transfected CHO-DG44 cells was quantified by means of ELISA according to standard protocols (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, updated), using a goat anti-human IgG Fc fragment (Dianova , Hamburg, DE) and on the other hand an AP-conjugated goat anti human kappa light chain antibody (Sigma) was used. Purified IgG2 antibody served as the standard.
  • Productivities (pg / cell / day) were calculated using the formula pg / ((Ct-Co) t / In (Ct-Co)), where Co and Ct indicate the number of cells when sowing or harvesting and t the cultivation time.
  • the protein concentration in the cell extracts was determined by means of a Bradford assay using the BIO-RAD protein assay (Bio-Rad Laboratories GmbH, Kunststoff, DE), BSA serving as the standard protein (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994 , updated).
  • BIO-RAD protein assay Bio-Rad Laboratories GmbH, Kunststoff, DE
  • BSA serving as the standard protein
  • a dot assay based on the protocol of Platt et al. 1987. For this purpose, 5 ⁇ g, 2.5 ⁇ g and 1, 25 ⁇ g protein with extraction buffer were brought to a final volume of 20 ⁇ L, with a total protein content of 5 ⁇ g each being made up with cell extract from non-transfected CHO-DG44 cells.
  • the extracts were then carried out in a 96-well vacuum manifold (Schleicher & Schull, Dassel, DE) through a sandwich of one layer each of Whatman 3MM paper, P81 phosphocellulose membrane (Whatman Laboratory Division, Maidstone, Great Britain) and nitrocellulose membrane (Schleicher & Schüll) filtered. Proteins phosphorylated by protein kinases and non-phosphorylated proteins bind to the nitrocellulose, while phosphorylated G418 passes through the nitrocellulose and binds to the phosphocellulose. After washing three times with deionized H 2 0, the membranes were removed from the apparatus, washed again with H 2 0 and then air-dried. The radioactive signals were quantified using a phospho imager (Molecular Dynamics, Krefeld, DE).
  • RNA isolation was carried out with the TRIZOL reagent according to the manufacturer's instructions (Invitrogen GmbH, Düsseldorf, DE) and the gel electrophoretic separation of 30 ⁇ g RNA each and the transfer to a Hybond N + nylon membrane (Amersham Biosciences, Freiburg, DE) after the Standard protocol for Glyoxal / DMSO denatured RNA (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, updated).
  • the plasmid pBIN-LC was used as the standard (320 pg, 160 pg, 80 pg, 40 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, 2.5 pg).
  • a PCR product that was labeled with the Geneimages random prime labeling Kit was used to label the coding region of the NPT gene included, used according to the manufacturer.
  • the chemiluminescence signals were quantified using an ImageMaster VDS-CL (Amersham Biosciences).
  • Glu182Gly (SEQ ID NO: 3), Trp91Ala (SEQ ID NO: 5), Val198Gly (SEQ ID NO: 7), Asp227Ala (SEQ ID NO: 9), Asp227Val (SEQ ID NO: 11 ), Asp261Gly (SEQ ID NO: 13), Asp261Asn (SEQ ID NO: 15), Phe240lle (SEQ ID NO: 17), Glu182Asp (SEQ ID NO: 19), Asp227Gly (SEQ ID NO: 21), Asp190Gly (SEQ ID NO: 23) and Asp208Gly (SEQ ID NO: 25) required base substitutions in the wild-type NPT gene were carried out by means of PCR using mutagenic primers (FIG.
  • the vector pBIN (Fig. 1) or pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, USA) served as a template for the PCR mutagenesis.
  • the 5 ' and 3 ' portions of the respective mutants were produced in separate PCR batches.
  • primer combinations were used for the amplification, consisting of Neofor ⁇ (SEQ ID NO: 27) and the respective mutagenic reverse (rev) primer or from Neorev ⁇ ( SEQ ID NO: 28) and the respective mutagenic forward (for) primer:
  • NPT mutant Glu182Gly (SEQ ID NO: 3) from Neofor ⁇ (SEQ ID NO: 27) and E182Grev (SEQ ID NO: 32) or from Neorev ⁇ (SEQ ID NO: 28) and E182Gfor (SEQ ID NO : 31);
  • Glu182Asp (SEQ ID NO: 19) from Neofor ⁇ (SEQ ID NO: 27) and E182Drev (SEQ ID NO: 48) or from Neorev ⁇ (SEQ ID NO: 28) and E182Dfor (SEQ ID NO : 47);
  • Trp91Ala SEQ ID NO: 5
  • Neofor ⁇ SEQ ID NO: 27
  • W91Arev SEQ ID NO: 34
  • Neorev ⁇ SEQ ID NO: 28
  • W91Afor SEQ ID NO: 33
  • D190Gfor (SEQ ID NO: 49); - In the case of NPT mutant Asp208Gly (SEQ ID NO: 2 ⁇ ) from Neofor ⁇ (SEQ ID NO: 27) and D208Grev (SEQ ID NO: ⁇ 2) or from Neorev ⁇ (SEQ ID NO: 28) and D208Gfor (SEQ ID NO : ⁇ 1);
  • D227Gfor (SEQ ID NO: ⁇ 2).
  • primer combinations were used for the amplification, consisting of Neofor2 (SEQ ID NO: 29) and the respective mutagenic reverse (rev) primer or from IC49 (SEQ ID NO: 30 ) and the respective mutagenic forward (for) primer:
  • NPT mutant Phe240lle (SEQ ID NO: 17) from Neofor2 (SEQ ID NO: 29) and F240lrev (SEQ ID NO: 46) or from IC49 (SEQ ID NO: 30) and
  • the coding strand of the ⁇ ' portion and the complementary strand of the 3 ' portion of the respective mutants were combined by hybridization in the overlap region which is formed by the mutagenic primer sequences, the single-strand regions were filled in and the entire product was again PCR-processed with the primers Neofor ⁇ (SEQ ID NO: 27) and Neorev ⁇ (SEQ ID NO: 28) or Neofor2 (SEQ ID NO: 29) and IC49 (SEQ ID NO: 30).
  • PCR products were with Stul / Rsrll (Neofor ⁇ / Neorev ⁇ PCR products of the mutants Glu182Gly, Trp91Ala and Val198Gly), Stul / BstBI (Neofor ⁇ / Neorev ⁇ PCR products of the mutants Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly and Asp227Glys / Asp107Gly2 / Rll49 / Rly) / DrlllP / NeL49 / Rly -Products of the mutants Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn and Phe240lle) digested.
  • Stul / Rsrll Neofor ⁇ / Neorev ⁇ PCR products of the mutants Glu182Gly, Trp91Ala and Val198Gly
  • Stul / BstBI Neofor ⁇ / Neorev ⁇ PCR products of the mutants
  • the expression vectors pBIN1-LC, pBIN2-LC, pBIN3-LC, pBIN4-LC, pBIN ⁇ -LC, pBIN6-LC, pBIN7-LC and pBIN8-LC were generated, which the NPT mutants Glu182Gly, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn or Phe240lle included (Fig. 2B).
  • NPT mutants were isolated as a 1640 bp Bsu36l fragment from the modified pBK-CMV, the ends of the fragments were filled in with Klenow DNA polymerase and with the 37 ⁇ 0 bp Bsu36l / Stul fragment of the vector pBID, which also contains Klenow DNA Polymerase was treated, ligated.
  • the expression vectors pKS-N ⁇ , pKS-N6, pKS-N7 and pKS-N8 were generated, which contain the NPT mutants Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly and Asp227Gly, respectively.
  • the human MCP-1 cDNA was then cloned into these expression vectors in each case as a 0.3 kb HindIII / EcoRI fragment (FIG. 2A) or the light chain of the humanized IgG2 antibody as a 0.7 kb HindIII / BamHI fragment (FIG. 2B ).
  • the mutations introduced in neomycin phosphotransferase are, on the one hand, substitutions of more (Val198Gly, Phe240lle) or less (Trp91Ala, Glu182Gly, Glu182Asp, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly) conserved amino acids, such as the conserved domains 1, such as the conserved domains 1 , 2 and 3 (Shaw et al., 1993), flank (Fig. 4).
  • the mutations lie within the conserved motif 1 (Asp190Gly), 2 (Asp208Gly) or 3 (Asp261Gly, Asp261Asn) and concern a conserved amino acid.
  • Example 2 Influence of the NPT mutations on the selection of stably transfected MCP-1 expressing cells
  • MCP-1 was chosen as an example for the expression of a single-chain protein in CHO cells.
  • CHO-DG44 were transfected with pKS-N ⁇ -MCP1, pKS-N6-MCP1, pKS-N7-MCP1, pKS-N8-MCP1 and pBIN-MCP1 (Fig. 2A). Double batches were carried out in each case. Two days after transfection, the cells were sown in a 96-well plate (2000 cells / well) and selected with 400 ⁇ g / ml G418 in HT-supplemented CHO-S-SFMII medium.
  • Example 3 Influence of the NPT mutations on the selection of stably transfected mAb-expressing cells
  • CHO-DG44 cells were first of all combined with the plasmid combination pBIDG-HC / pBIN-LC (NPT wild type), pBIDG-HC / pKS-N ⁇ -LC (Glu182Asp NPT mutant) or pBIDG-HC / pKS- N8-LC (Asp227Gly NPT mutant) transfected (Fig. 2B).
  • the two protein chains of a humanized IgG2 antibody are each expressed by a separate vector which additionally codes for a DHFR or neomycin selection marker in a separate transcription unit.
  • the expression of the product genes is mediated by a CMV enhancer / hamster ubiquitin / S27a promoter combination.
  • Comparable data can also be obtained, for example, with a CMV enhancer / promoter, an SV40 enhancer / hamster ubiquitin / S27a promoter or other promoter combinations.
  • a total of four transfection series with 6 pools per plasmid combination were carried out. In contrast to the cell populations in which selection was carried out with a wild type NPT gene, fewer cells in the cell populations which had been transfected with a mutated NPT survived the initial selection with G418.
  • the antibody titer in the cell culture supernatants was determined by ELISA over several passages (6-8) .
  • the cells selected with the Glu182Asp mutant showed an average increase in productivity and titer by 86% and 77%, respectively, and the cells selected with the Asp227Gly mutant even one Increase productivity and of the titer by 126% and 107% respectively.
  • an NPT mutant with reduced enzyme activity it was possible to selectively enrich cells with up to twice the basic productivity.
  • CHO-DG44 cells with the plasmid combinations pBIDG-HC / pBIN-LC NPT wild type
  • pBIDG-HC / pBIN1-LC Glu182Gly NPT mutant
  • pBIDG-HC / pBIN2-LC Trp91Ala NPT mutant
  • pBIDG- HC / pBIN3-LC Val198Gly NPT mutant
  • pBIDG-HC / pBIN4-LC Asp227Ala
  • pBlDG- HC / pBIN ⁇ -LC Asp227Val NPT mutant
  • pBIDG-HC / pBIN6- LC Asp261Gly NPT mutant
  • pBIDG-HC / pBIN7-LC Asp261Asn NPT mutant
  • pBIDG-HC / pBIN8-LC Phe240lle NPT mutant
  • the two protein chains of a monoclonal humanized IgG2 antibody are each expressed by a separate vector which additionally codes for a DHFR or neomycin selection marker in a separate transcription unit.
  • ⁇ pools were transfected for each plasmid combination. In contrast to the cell populations in which selection was carried out with a wild type NPT gene, fewer cells in the cell populations which had been transfected with a mutated NPT survived the initial selection with G418.
  • Fig. 6B summarizes the mean values of the determined titers and productivities from the respective pools in the test. Compared to the use of an NPT wild-type gene as a selection marker, all cell pools which had been selected with an NPT mutant showed an increase in productivity and titer by a factor of 1.4-14.6 and 1.4-10, on average. 8 on (Fig. 6B). The best selective enrichment of cells with higher basic productivity could be achieved with the NPT mutants Asp227Val and Asp261Gly, with increases in average productivity by a factor of 14.6 and 9.3.
  • GFP Another selection marker, the GFP, is contained in the vector pBIDG-HC.
  • the GFP is transcriptionally linked to the heavy chain via an IRES element.
  • the resulting correlation between the expression of the target protein and the selection marker GFP therefore also enables a rapid assessment of the level and the distribution of the expression levels in the transfected cell populations on the basis of the GFP fluorescence determined in FACS analyzes.
  • FACS analysis FACS analysis
  • the productivity of the cells could be increased even further by inducing dhfr-mediated gene amplification.
  • MTX selection agent methotrexate
  • the specific productivity in the cell pools which resulted from co-transfection with the plasmid combinations pBIDG-HC / pBIN ⁇ -LC (NPT mutant Asp227Val), pBIDG-HC / pBIN6-LC ( NPT mutant Asp261Gly), pBIDG-HC / pBIN7-LC (NPT mutant Asp261Asn) and pBIDG-HC / pBIN8-LC (NPT mutant Phe240lle) resulted in an increase by a factor of 2 to 4 and, depending on the pool, productivities between 4 and 14 pg / Cell / day can be achieved.
  • Figure 8 shows an example of a cell pool obtained from the co-transfection pBIDG-HC / pBIN ⁇ -LC (NPT mutant Asp227Val), which showed increases in the MTX addition (100 nM MTX followed by ⁇ OO nM MTX) Productivity shown at 27 pg / cell / day.
  • a dot assay for determining the NPT activity in cell extracts was based on the protocol of Platt et al. 1987 and shown in Fig. 9A for the NPT mutants Glu182Asp and Asp227Gly.
  • cell extracts from two different mAb-expressing cell pools were produced, either with the NPT wild-type gene (SEQ ID NO: 1) or with the NPT mutants Glu182Gly (SEQ ID NO: 3), Glu182Asp (SEQ ID NO: 19), Trp91Ala (SEQ ID NO: ⁇ ), Asp190Gly (SEQ ID NO: 23), Val198Gly (SEQ ID NO: 7), Asp208Gly (SEQ ID NO: 2 ⁇ ), Asp227Ala (SEQ ID NO: 9), Asp227Val (SEQ ID NO : 11), Asp227Gly (SEQ ID NO: 21), Asp261Gly (SEQ ID NO: 13), Asp261Asn (SEQ ID NO: 1 ⁇ ), or Phe240lle (SEQ ID NO: 17) had been transfected and selected.
  • NPT mutants were significantly reduced compared to the NPT wild type. On average, the NPT mutants only showed between 1.5% and 62% of the wild-type enzyme activity, the NPT mutants Asp261Gly and Asp261Asn with 3.1% and 1.5%, respectively, the least residual activity and the NPT mutants Val198Gly and Trp91Ala showed the highest residual activity with 61, 9% and 53.2% (Fig. 9B).
  • the signals obtained on the phosphocellulose were specific for the phosphorylation of G418 caused by the NPT enzyme activity. No activity on the phosphocellulose could be detected without adding the NPT substrate G418 to the assay buffer.
  • the signals obtained on the nitrocellulose membrane, which from the Protein kinases resulting in phosphorylated proteins within the cell extract were used as an internal control for equal sample application amounts.
  • the reduced enzyme activity of the NPT mutants compared to the NPT wild type was not due to a reduced gene expression.
  • Northern blot analyzes on total RNA showed that cell pools which had been transfected with the NPT wild-type and had a high NPT enzyme activity expressed less RNA than cell pools transfected with NPT mutants (FIG. 10). The only exception were cells that had been transfected with the NPT mutant Glu182Gly and expressed comparable amounts of NPT mRNA.
  • Example 5 Isolation of cells with high expression of a mAb by GFP-based FACS sorting
  • CHO-DG44 cells were transfected with the plasmid combination pBID-HC and pBING-LC, coding for a monoclonal humanized IgG2 antibody (Fig.2B).
  • the two protein chains of the antibody are each expressed by a separate vector which additionally codes for a DHFR or modified neomycin phosphotransferase selection marker (Asp227Gly mutant; SEQ ID NO: 21) in a separate transcription unit.
  • the vector pBING-LC also contains another selection marker, the GFP.
  • pool ⁇ and 8 were selected for the subsequent sequential FACS-based sorting, pool ⁇ having the highest productivity and pool 8 having a productivity corresponding to the average of all pools.
  • the ⁇ % cells with the highest GFP fluorescence were sorted out by FACS and further cultivated in the pool. This sorting was carried out up to six times in total, with a cultivation period of approximately two weeks between each sorting. Surprisingly, a good correlation between mAb productivity and GFP fluorescence could be shown (Fig.
  • the high expression levels of the fluorescent protein had no negative impact on cell growth and vitality.
  • the growth properties of the cells are also significantly influenced by the addition of MTX, especially when added in higher concentrations.
  • the pre-sorted cell pools showed a considerably more robust behavior compared to the rather high initial dose of 100 nM MTX. They survived the selection phase much better, that is, they were already 7 ⁇
  • a conventional step-by-step gene amplification strategy which generally comprises four amplification steps with increasing additions of MTX, can be reduced to approx. 6 weeks. This was achieved by the combined application of an enrichment of transfected cells with increased expression of the genes of interest, achieved by using a modified NPT selection marker with reduced enzyme activity, followed by a GFP-based FACS sorting with a subsequent gene amplification step.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gene, sowie deren Verwendung in einem Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren, die ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen sowie ein Gen von Interesse in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Promotor enthalten und ein Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten unter Verwendung dieser Expressionsvektoren.

Description

NEUE NEOMYCIN-PHOSPHOTRANSFERASE-GENE UND VERFAHREN ZUR SELEKTION VON HOCHPRODUZIERENDEN REKOMBINANTEN ZELLEN
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gene sowie deren Verwendung in Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch neue Expressionsvektoren, die ein erfindungsgemäßes modifiziertes Neomycin- Phosphotransferase-Gen enthalten, vorzugsweise in Kombination mit einem Gen von Interesse in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Promotor. Die Erfindung betrifft femer Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten mit Hilfe der entsprechenden hochproduzierenden rekombinanten Zellen.
Hintergrund der Erfindung
Säugerzellen sind die bevorzugten Wirtszellen zur Produktion komplexer biopharmazeutischer Proteine, da die post-translational durchgeführten Modifikationen sowohl in funktionaler als auch in pharmakokinetischer Hinsicht humankompatibel sind. Vornehmlich relevante Zelltypen sind Hybridomas, Myelomas, CHO- (Chinese Hamster Ovary) Zellen und BHK- (Baby Hamster Kidney) Zellen. Die Kultivierung der Wirtszellen erfolgt zunehmend unter serum- und proteinfreien Produktionsbedingungen. Gründe hierfür sind die damit verbundene Kosten red uktion, die geringere Interferenz bei der Aufreinigung des rekombinanten Proteins sowie die Reduktion des Potentials zur Einführung von Pathogenen (z.B. Prionen, Viren). Der Einsatz von CHO-Zellen als Wirtszellen findet immer weitere Verbreitung, da diese Zellen sich an Suspensionswachstum in serum- und proteinfreiem Medium adaptieren lassen und zudem von den regulatorischen Behörden als sichere Produktionszellen angesehen und akzeptiert werden.
Zur Erzeugung einer stabilen Säugerzelllinie, die ein heterologes Gen von Interesse (GOI) exprimiert, wird das heterologe Gen in der Regel gemeinsam mit einem selektierbaren Markergen, wie z.B. Neomycin-Phosphotransferase (NPT), durch Transfektion in die gewünschten Zelllinie eingebracht. Das heterologe Gen und das selektierbare Markergen lassen sich in einer Wirtszelle, ausgehend von einem einzelnen oder von separaten, co-transfizierten Vektoren, exprimieren. Zwei bis drei Tage nach der Transfektion werden die transfizierten Zellen in Medium überführt, das ein selektives Agens enthält, z.B. G418 bei Verwendung des Neomycin- Phosphotransferase-Gens (NPT-Gen), und für einige Wochen unter diesen selektiven Bedingungen kultiviert. Die hochwachsenden resistenten Zellen, die die exogene DNA integriert haben, können isoliert und hinsichtlich der Expression des gewünschten Genprodukts (des GOI) untersucht werden.
Ein großes Problem bei der Etablierung von Zelllinien mit hoher Expression des gewünschten Proteins ergibt sich aus der willkürlichen und ungerichteten Integration des rekombinanten Vektors in transkriptionsaktive oder -inaktive Loci des Wirtszellgenoms. Dadurch erhält man eine Population von Zellen, die völlig unterschiedliche Expressionsraten des heterologen Gens aufweisen, wobei die Produktivität der Zellen in der Regel einer Normalverteilung folgt. Zur Identifizierung von Zellklonen, die eine sehr hohe Expression des heterologen Gens von Interesse aufweisen, muss deshalb eine Vielzahl von Klonen überprüft und getestet werden, resultierend in einem hohen Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand. Optimierungen des zur Transfektion eingesetzten Vektorsystems zielen deshalb darauf ab, durch geeignete Selektionsstrategien den Anteil von Hochproduzenten in der transfizierten Zellpopulation zu erhöhen und somit den Aufwand in der Klonidentifizierung zu reduzieren. Die Entwicklung eines derartigen Expressionssystems ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Das Aminoglycosid-3'-Phosphotransferase II Enzym (Neomycin-Phosphotransferase) (EC 2.7.1.95), dessen Gen in Escherichia coli Transposon 5-assoziiert ist, wird als Selektionsmarker in einer Vielzahl von Organismen (z.B. Bakterien, Hefen, Pflanzen, Säugerzellen) verwendet. Dieses Enzym vermittelt Resistenz gegenüber verschiedenen aminoglykosidischen Antibiotika wie Neomycin, Kanamycin und G418, indem es die Antibiotika durch den Transfer des terminalen Phosphats von ATP auf die 3Ηydroxylgruppe des Aminohexose-Rings I inaktiviert. Neben der Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase (wt NPT) sind einige Mutanten bekannt, die eine reduzierte Phosphotransferase-Aktivität und damit eine verminderten Resistenz gegenüber aminoglykosidischen Antibiotika in Bakterien (Bläzquez et al., 1991 ; Kocabiyik et al., 1992; Yenofsky et al., 1990) und in Blattscheiben von Tabak (Yenofsky et al., 1990) aufweisen.
Eine dieser Mutanten (Glu182Asp) wurde als Marker zur Selektion embryonaler Stammzellen der Ratte verwendet, wobei das Neomycin-Phosphotransferase-Gen über gezielte homologe Rekombination (gene targeting) in das c-myc Gen integriert wurde (Hanson et al., 1995). Die Autoren beschränken sich auf die Verwendung des modifizierten Enzyms für Gentargeting.
In der Patentanmeldung WO 99/53046 wird die Expression eines modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens (Asp261Asn) in produktionsrelevanten Säugerzellen beschrieben. Die Autoren beschreiben hierbei eine Nicht- Klonierungsmethode zur Expression eines Gens von Interesse in Säugerzellen. Durch Co-Transfektion der Zellen mit drei individuellen DNA-Fragmenten, die für ein Promotorelement, ein Gen von Interesse und ein mit einem IRES („internal ribosomal entry site")-Element gekoppelten Selektionsmarker kodieren, lassen sich unter Selektionsdruck gezielt Zellen heranziehen, in denen alle drei DNA-Fragmente als funktioneile bicistronische Transkriptionseinheit kombiniert wurden (Promotor-Gen von Interesse-IRES-Neomycin-Phosphotransferase-Gen). Das Arrangement der Elemente erfolgt erst in der transfizierten Zelle, so dass lediglich wenige Zellen eine richtige Anordnung der Elemente zeigen. Ferner lassen sich nach Genamplifikation unter Verwendung eines amplifizierbaren selektierbaren Markers keine Hochproduzentenklone generieren. Die generierten Zellen zeigten nach mehrfacher Selektion und Genamplifikation maximal 6 pg Protein pro Zelle und Tag (6 pg/Zelle/Tag).
Keine der Publikationen offenbart modifzierte Neomycin-Phosphotransferase-Gene mit besonderer Eignung für die Bereitstellung eines Hochexpressionsvektorsystem für Säugerzellen, welches die Entwicklung von hochproduzierenden Zellen zur Herstellung rekombinanter biopharmazeutischer Proteine ermöglicht, die eine oder mehrere komplette funktionelle Transkriptionseinheiten sowohl für ein oder mehrere Gene von Interesse als auch für ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase- Gen mit verminderter Antibiotikaresistenz enthalten. Das in WO 99/53046 beschrieben DNA-Konstrukt enthält lediglich ein promotorloses Neomycin-Gen funktionell verknüpft mit dem Gen für die Dihydrofolat-Reduktase (DHFR).
Es besteht somit ein Bedarf geeignete modifizierte Neomycin-Phosphotransferase- Gene, insbesondere für die Entwicklung entsprechender Hochexpressions- vektorsysteme für biopharmazeutische Prozesse, zur Verfügung zu stellen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war von daher, entsprechende neue modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gene, Expressionsvektoren, die ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen und ein Gen von Interesse in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Promotor enthalten, ein Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen, vorzugsweise für Säugerzellen und ein Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten zur Verfügung zustellen.
Überraschenderweise konnten im Rahmen der vorliegenden Erfindung neue modifizierte hochselektive Neomycin-Phosphotransferase-Gene erzeugt und identifiziert werden, die sich durch ihre besondere Eignung zur Selektion von hochproduzierenden Zellen auszeichnen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue modifizierte Neomycin-Phosphotransferase- Gene zur Verfügung. Überraschenderweise wurde gefunden, dass bei Verwendung der im weiteren beschriebenen modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gene als Selektionsmarker eine Anreicherung von transfizierten Säugerzellen mit hohen Expressionsraten des co-integrierten Gens von Interesse erzielt werden konnte. Im Vergleich zur Verwendung der Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase als Selektionsmarker wiesen die Zellen nach Transfektion mit einer der erfindungsgemäßen neuen Neomycin-Phosphotransferase-Genen eine um Faktor 1,4 bis 14,6 erhöhte Produktivität eines Proteins (eines Antikörpers) auf. Bei den modifizierten erfindungsgemäßen Neomycin-Phosphotransferase-Genen handelt es sich vorzugsweise um Mutanten, die an Aminosäureposition 91, 182, 198, 227, 240 oder 261 für eine andere Aminosäure als das Wildtyp-Gen kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Neomycin-Phosphotransferase-Gen um die Mutante Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Asn, Asp261Gly oder Phe240lle. Als besonders geeignet zur Selektion von hochproduzierenden Säugerzellen stellte sich hierbei die Verwendung der Mutanten Trp91Ala, Asp227Val, Asp261Asn, Asp261Gly und Phe240lle heraus, wobei wiederum die Mutanten Asp227Val und Asp261GIy zu Zeilklonen mit der höchsten Produktivität führten und von daher besonders bevorzugt sind.
Die Herstellung der hochproduzierenden Zellen wurde durch die Verwendung eines eukaryontischen Expressionsvektors erreicht, der ein heterologes Gen von Interesse in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Promotor und ein erfindungsgemäßes modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen enthält. Der
Expressionsvektor enthält vorzugsweise weitere regulatorische Elemente, beispielsweise einen oder mehrere Enhancer in funktioneller Verknüpfung mit dem oder den Promotoren. Ferner sind Expressionsvektoren bevorzugt, die zusätzlich ein
Gen für ein fluoreszierendes Protein enthalten, welches funktioneil mit dem Gen von
Interesse und dem heterologen Promotor verknüpft ist, vorzugsweise über eine interne Ribosomenbindungsstelle (IRES), welche eine bicistronische Expression des
Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des Gens, das für ein Pro- tein/Produkt von Interesse kodiert, unter der Kontrolle des heterologen Promotors ermöglicht. Besonders geeignet sind Expressionsvektoren, bei dem das heterologe
Gen von Interesse unter der Kontrolle des Ubiquitin/S27a-Promotors steht.
Die Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren, die anstelle des Gens von Interesse eine multiple Klonierungsstelle zum Einbau eines solchen Gens aufweisen, d.h. einen Sequenzbereich mit multiplen Erkennungssequenzen für Restriktions- endonukleasen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft rekombinante Säugerzellen, die eines der oben beschriebenen erfindungsgemäßen modifizierten Neomycin- Phosphotransferase-Gene enthalten. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante Säugerzellen, die mit einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transfiziert wurden. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um rekombinante Nagerzellen, wobei rekombinante Hamsterzellen wie z.B. CHO-Zellen oder BHK-Zellen besonders bevorzugt sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die besagten rekombinanten Zellen zusätzlich mit dem Gen für einen amplizifierbaren Selektionsmarker transfiziert, z.B. mit dem Gen der Dihydrofolat-Reduktase (DHFR).
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung von rekombinanten Säugerzellen, die ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gens exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass (i) ein Pool an Säugerzellen mit einem Gen für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase transfiziert wird, die im Vergleich zur Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase lediglich 1 bis 80%, vorzugsweise lediglich 1 bis 60%, weiter bevorzugt lediglich 1 ,5 bis 30%, noch weiter bevorzugt lediglich 1,5 bis 26% der Aktivität aufweist und/oder eine der oben beschriebenen Modifikationen aufweist; (ii) die Säugerzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens erlauben; und (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren.
Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Expression von mindestens einem Gen von Interesse in rekombinanten Säugerzellen, dadurch gekennzeichnet, dass (i) ein Pool von Säugerzellen mit mindestens einem Gen von Interesse und einem Gen für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase transfiziert wird, die im Vergleich zur Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase lediglich 1 bis 80%, vorzugsweise lediglich 1 bis 60%, weiter bevorzugt lediglich 1 ,5 bis 30%, noch weiter bevorzugt lediglich 1 ,5 bis 26% der Aktivität aufweist und/oder eine der oben beschriebenen Modifikationen aufweist; (ii) die Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens (Gene) von Interesse und des modifizierten Neomycin- Phosphotransferase-Gens erlauben; (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das Neomycin- Phosphotransferase-Gen exprimieren; und (iv) das (die) Protein(e) von Interesse aus den Säugerzellen oder dem Kulturüberstand gewonnen wird (werden).
Im Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung und Selektion von rekombinanten Säugerzellen, die mindestens ein heterologes Gen von Interesse exprimieren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass (i) rekombinante Säugerzellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfiziert werden, der neben dem Gen von Interesse und dem modifizierten Neomycin- Phosphotransferase-Gen für ein fluoreszierendes Protein kodiert; (ii) die Säugerzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens (e) von Interesse, des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens ermöglicht; (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren; und (iv) die Säugerzellen mittels flowzytometrischer Analyse sortiert werden.
Sofern die Säugerzellen zusätzlich mit einem Gen für ein amplifizierbares Selektionsmarkergen, z.B. dem DHFR-Gen transfiziert wurden, ist es möglich, die Säugerzellen unter Bedingungen zu kultivieren, unter denen auch das amplifizierbare Selektionsmarkergen exprimiert wird, und dem Kulturmedium ein Selektionsmittel zuzugeben, das die Amplifikation des amplifizierbaren Selektionsmarkergens zur Folge hat.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Verfahren mit Säugerzellen durchgeführt, die an das Wachstum in Suspension adaptiert sind, also mit Säugerzellen, die in Suspensionskultur kultiviert werden. Weitere Ausführungsformen betreffen Verfahren, bei denen die Säugerzellen, bevorzugt solche, die an das Wachstum in Suspension adaptiert sind, unter serumfreien Bedingungen kultiviert werden. Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Basisvektoren, die zur Expression der rekombinanten Proteine in CHO-DG44 Zellen verwendet wurden. Bei „P/E" handelt es sich um eine Kombination aus CMV-Enhancer und Hamster- Ubiquitin/S27a-Promotor, bei „P" lediglich um ein Promotorelement und bei „T" um ein Terminationssignal für die Transkription, das zur Polyadenylierung der transkribierten mRNA benötigt wird. Die Position und Richtung der Transkriptionsinitiation innerhalb jeder Transkriptionseinheit wird durch einen Pfeil angezeigt. Zur Klonierung der heterologen Gene ist nach dem Promotorelement ein Sequenzbereich mit multiplen Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen (multiple cloning sites - mcs) eingefügt. Der amplifizierbare Selektionsmarker Dihydrofolat- Reduktase ist mit „dhfr" und der Selektionsmarker Neomycin-Phosphotransferase mit „npt" (npt-Wildtyp oder npt-Mutante) abgekürzt. Das aus dem Encephalomyocarditis- Virus stammende „IRES"-Element dient als interne Ribosomenbindungsstelle innerhalb der bicistronischen Transkriptionseinheit und ermöglicht die Translation des nachfolgenden grünen fluoreszierenden Proteins „GFP".
Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der eukaryontischen Expressionsvektoren, die für ein einzelkettiges Protein (Abbidung 2A) oder jeweils für eine Untereinheit eines monoklonalen Antikörpers kodieren (Abbildung 2B) und zur Transfektion von CHO-DG44 Zellen eingesetzt wurden. Bei „P/E" handelt es sich um eine Kombination aus CMV-Enhancer und Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor, bei „P" lediglich um ein Promotorelement und bei „T" um ein Terminationssignal für die Transkription, das zur Polyadenylierung der transkribierten mRNA benötigt wird. Die Position und Richtung der Transkriptionsinitiation innerhalb jeder Transkriptionseinheit wird durch einen Pfeil angezeigt. Der amplifizierbare Selektionsmarker Dihydrofolat-Reduktase ist mit „dhfr" und der Selektionsmarker Neomycin-Phosphotransferase mit „npt" abgekürzt. Die NPT-Mutanten E182G (SEQ ID NO:3), E182D (SED ID NO:19), W91A (SEQ ID NO:5), D190G (SEQ ID NO:23), V198G (SEQ ID NO:7), D208G (SEQ ID NO:25), D227A (SEQ ID NO:9), D227V (SEQ ID NO-11), D227G (SEQ ID NO-21), D261G (SEQ ID NO:13), D261N (SEQ ID NO: 15) und F240I (SEQ ID NO: 17) enthalten dabei eine Punktmutation, die an der indizierten Position in einer veränderten Aminosäure (in 1 -Buchstaben-Code angegeben) resultiert. Das aus dem Encephalomyocarditis-Virus stammende „IRES"- Element dient als interne Ribosomenbindungsstelle innerhalb der bicistronischen Transkriptionseinheit und ermöglicht die Translation des nachfolgenden grünen fluoreszenten Proteins „GFP". „MCP-1" kodiert für das Monocyte Chemoattractant Protein-1 , wohingegen „HC" und „LC" für die schwere bzw. leichte Kette eines humanisierten monoklonalen lgG2 Antikörpers kodieren.
Abbildung 3 zeigt den Sequenzausschnitt des Neomycin-Phosphotransferase (npt)- Gens, in dem durch PCR mit mutagenen Primern die Punktmutationen eingeführt wurden. Großbuchstaben kennzeichnen hierbei die Nukleotidsequenz der NPT- Kodierregion, kleine Buchstaben hingegen die flankierenden nicht-kodierenden Nukleotidsequenzen. Die aus der Nukleotidsequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz (3-Buchstaben-Code) ist oberhalb der kodierenden Nukleotidsequenz angegeben. Pfeile geben die Richtung, Länge und Position der verwendeten Primer an, wobei Pfeile mit geschlossener Linie die mutagenen forward Primer, mit gebrochener Linie die mutagenen reverse Primer, mit gepunkteter Linie die stromaufwärts vom npt-Gen bzw. dem Mutationsort liegenden Primer Neoforδ (SEQ ID NO:27) bzw. Neofor2 (SEQ ID NO:29) und mit Strichpunkt-Linie die stromabwärts vom npt-Gen bzw. dem Mutationsort liegenden Primer Neorevδ (SEQ ID NO:28) bzw. IC49 (SEQ ID NO:30) anzeigen. Die gegenüber der Wildtyp-Sequenz ausgetauschten Nukleotide sind jeweils ober- bzw. unterhalb der Pfeile hervorgehoben.
In Abbildung 4 sind konservierte Domänen und die Position der eingeführten NPT- Mutationen innerhalb der NPT-Aminosäuresequenz dargestellt. Auf Basis von Sequenzhomologien zwischen verschiedenen Aminoglykosid-modifizierenden Enzymen wurden verschiedene konservierte Domänen innerhalb der NPT- Proteinsequenz identifiziert (grau unterlegt). Die drei Motive im C-terminalen Bereich des Enzyms haben dabei offensichtlich spezielle Funktionen. Motiv 1 und 2 sind vermutlich am katalytischen Transfer des terminalen Phosphats bei der ATP- Katalyse bzw. der Nukleotidbindung beteiligt, wohingegen Motiv 3 eine Funktion bei der ATP-Hydrolyse und/oder der Konformationsänderung im Enzym-Aminoglykosid- Komplex zugeschrieben wird. Aminosäuren, die in mindestens 70% der Aminoglykosid-modifizierenden Enzymen vorkommen, sind durch Fettdruck hervorgehoben. Die einfach unterstrichenen Aminosäuren werden auf Basis der Ähnlichkeit der gleichen Gruppe zugeordnet und kommen in mindestens 70% der Aminoglykosid-modifizierenden Enzymen vor. Mit einem Stern markierte Aminosäuren geben die Position der Mutationsorte wieder.
Abbildung 5 zeigt den Einfluss der NPT-Mutationen auf die Selektion von stabil transfizierten MCP-1 exprimierenden Zellen. Dazu wurden CHO-DG44 Zellen mit den Vektoren pBIN-MCP1, pKS-N5-MCP1 bzw. pKS-N8-MCP1 transfiziert (Abb. 2A), die als Selektionsmarker entweder den NPT-Wildtyp (WT) oder die NPT-Mutanten Glu182Asp bzw. Asp227Gly enthielten. Zur Selektion von stabil transfizierten Zellen wurde dem Medium 400 μg/mL oder auch 800 μg/mL G418 als selektives Agens hinzugefügt. Die Konzentration des produzierten rekombinanten Proteins MCP-1 im Zellkulturüberstand wurde durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag berechnet. Jeder Balken stellt dabei den Mittelwert der spezifischen Produktivität bzw. des Titers aus jeweils 18 Pools über vier Kultivierungspassagen in 6 Well-Schalen hinweg dar.
In Abbildung 6 wurde der Einfluss der NPT-Mutationen auf die Selektion von stabil transfizierten mAk exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden CHO-DG44 Zellen mit den Plasmidkombinationen pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-Wildtyp), pBIDG- HC/pKS-N5-LC (NPT-Mutante Glu182Asp) oder pBIDG-HC/pKS-N8-LC (NPT- Mutante Asp227Gly) (Abb. 6A) bzw. mit den Kombinationen pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-Wildtyp), pBIDG-HC/pBIN1-LC (NPT-Mutante Glu182Gly), pBIDG-HC/pBIN2- LC (NPT-Mutante Trp91Ala), pBIDG-HC/pBIN3-LC (NPT-Mutante Val198G), pBIDG- HC/pBIN4-LC (NPT-Mutante Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC (NPT-Mutante Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (NPT-Mutante Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC (NPT-Mutante Asp261Asn) oder pBIDG-HC/pBIN8-LC (NPT-Mutante Phe240lle) transfiziert (Abb. 6B), die sich lediglich in dem als Selektionsmarker verwendeten NPT-Gen (Wildtyp oder Mutante) voneinander unterschieden. Die Konzentration des produzierten rekombinanten monoklonalen lgG2 Antikörpers im Zellkulturüberstand wurde durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag berechnet. Insgesamt wurden für jede Vektorkombination 5 bis 9 Pools angesetzt. Die Balken repräsentieren die Mittelwerte der spezifischen Produktivität bzw. des Titers aller Pools im Test aus 6 Kultivierungspassagen in 75cm2 Flaschen. Zur Berechnung der relativen Titer bzw. der relativen spezifische Produktivitäten wurden die Mittelwerte der mit dem NPT-Wildtypgen selektionierten Pools als 1 gesetzt.
Abbildung 7 zeigt die Anreicherung von Zellen mit höherer GFP-Expression in transfizierten Zellpools durch Verwendung der erfindungsgemäßen NPT-Mutanten als Selektionsmarker. Dazu wurden CHO-DG44 Zellen mit den Plasmidkombinationen pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-Wildtyp), pBIDG-HC/pKS-N5-LC (NPT-Mutante Glu182Asp), pBIDG-HC/pKS-N8-LC (NPT-Mutante Asp227Gly), pBIDG-HC/pBIN1-LC (NPT-Mutante Glu182Gly), pBIDG-HC/pBIN2-LC (NPT- Mutante Trp91Ala), pBIDG-HC/pBIN3-LC (NPT-Mutante Val198G), pBIDG- HC/pBIN4-LC (NPT-Mutante Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC (NPT-Mutante Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (NPT-Mutante Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC (NPT-Mutante Asp261Asn) oder pBIDG-HC/pBIN8-LC (NPT-Mutante Phe240lle) transfiziert (jeweils 5 bis 9 Pools), die sich lediglich in dem als Selektionsmarker verwendeten NPT-Gen (Wildtyp oder Mutante) voneinander unterschieden. Außerdem enthielten die pBIDG-Vektoren auch noch das GFP als Markergen. Nach einer zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools in HT-freiem Medium mit Zusatz von G418 wurde die GFP-Fluoreszenz per FACS-Analyse gemessen. Jeder Graph, mit Ausnahme der als Negativkontrolle dienenden nicht- transfizierten CHO-DG44 Zellen, stellt dabei den Mittelwert der GFP-Fluoreszenz aus den Pools, die mit der gleichen Plasmidkombination transfiziert worden waren, dar.
In Abbildung 8 ist die Steigerung der mAk-Produktivität durch dhfr-vermittelte Genamplifikation am Beispiel je eines Zellpools dargestellt, der aus der Transfektion von CHO-DG44 mit der Vektorkombination pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-Wildtyp) bzw. pBIDG-HC/pBIN5-LC (NPT-Mutante D227V) erhalten wurde. Nach der ersten Selektion in Hypoxanthin/Thymidin-freiem CHO-S-SFMII-Medium in Anwesenheit von G418 wurde eine dhfr-vermittelte Genamplifikation durch Zusatz von 100 nM und nachfolgend von 500 nM MTX zum Kultivierungsmedium durchgeführt. Die Konzentration des mAks im Zellkulturüberstand der Pools wurde durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/Zelle*Tag) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus sechs Kultivierungspassagen in 75cm2 Flaschen dar.
Abbildung 9 zeigt die Enzymaktivität der erfindungsgemäßen NPT-Mutanten im Vergleich zum NPT-Wildtyp in einem Dot-Assay. Hierzu wurden Zellextrakte aus jeweils zwei verschiedenen mAk exprimierenden Zellpools (Pool 1 und 2) hergestellt, die entweder mit dem NPT-Wildtypgen (SEQ ID NO:1) oder mit den NPT-Mutanten E182G (SEQ ID NO:3), E182D (SEQ ID NO:19), W91A (SEQ ID NO:5), V198G (SEQ ID NO:7), D227A (SEQ ID NO:9), D227V (SEQ ID NO:11), D227G (SEQ ID NO: 21) D261G (SEQ ID NO:13), D261N (SEQ ID NO:15) und F240I (SEQ ID NO:17) transfiziert und selektioniert worden waren. Nicht-transfizierte CHO-DG44 Zellen dienten als Negativkontrolle. Als Substrat im Phosphorylierungsassay wurde G418 eingesetzt. Die Extrakte wurden in einem 96 Well Vakuum Manifold durch einen Sandwich aus P81 Phosphocellulose- und Nitrocellulose-Membran filtriert. Durch Proteinkinasen phosphorylierte Proteine sowie nicht-phosphorylierte Proteine binden an die Nitrocellulose, während phosphoryliert.es und nicht-phosphoryliertes G418 die Nitrocellulose passiert und an die Phosphocellulose bindet (Abb. 9A). Die Detektion und Quantifizierung der radioaktiven Signale erfolgte mittels eines Phospho Imagers. Zur Berechnung der prozentualen Enzymaktivität wurden die Signale, die mit 5 μg Extrakt erhalten wurden, herangezogen. Die prozentualen Enzymaktivitäten stellen dabei den Mittelwert der NPT-Mutanten aus jeweils 2 mAk-exprimierenden Zellpools dar, wobei die Enzymaktivität der Wildtyp-NPT als 100% gesetzt wurde (Abb. 9B). .
Abbildung 10 zeigt die Northern Blot Analyse der NPT-Expression sowie die Zahl der NPT-Genkopien in den transfizierten Zellpools. Hierzu wurde Gesamt-RNA aus jeweils zwei verschiedenen mAk exprimierenden Zellpools hergestellt, die entweder mit dem NPT-Wildtypgen (SEQ ID NO:1) oder mit den NPT-Mutanten E182G (SEQ ID NO:3), E182D (SEQ ID NO: 19), W91A (SEQ ID NO:5), V198G (SEQ ID NO:7), D227A (SEQ ID NO:9), D227V (SEQ ID NO: 11), D227G (SEQ ID NO: 21), D261G (SEQ ID NO: 13), D261N (SEQ ID NO: 15) und F240I (SEQ ID NO: 17) transfiziert und selektioniert worden waren. Nicht-transfizierte CHO-DG44 Zellen dienten als Negativkontrolle. Es wurde jeweils 30 μg RNA mit einem FITC-dUTP-markierten PCR-Produkt, das die Kodierregion des NPT-Gens umfasste, hybridisiert. In allen transfizierten Zellen wurde ein spezifisches singuläres NPT-Transkript von ca. 1 ,3 kb detektiert. Zur Bestimmung der npt-Genkopienzahl wurde in einer Dot Blot Analyse genomische DNA aus den oben erwähnten mAk exprimierenden Zellpools isoliert. Es wurden jeweils 10 μg, 5 μg, 2,5 μg, 1 ,25 μg, 0,63 μg bzw. 0,32 μg genomische DNA mit einem FITC-dUTP-markierten PCR-Produkt, das die Kodierregion des NPT-Gens umfasste, hybridisiert. Nicht-transfizierte CHO-DG44 Zellen dienten als Negativkontrolle. Als Standard wurde das Plasmid pBIN-LC eingesetzt (320 pg, 160 pg, 80 pg, 40 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, 2,5 pg). Die Kopienzahl der npt-Gene in den jeweiligen Zellpools wurde mit Hilfe der Standardreihe, die aus den ermittelten Signalintensitäten der titrierten Plasmid-DNA erstellt wurde, berechnet.
Abbildung 11 zeigt die Isolierung von hochexprimierenden mAk Zellpools durch eine GFP-basierte Selektion mittels FACS am Beispiel von zwei Zellpools (Zellpool 5 und 8). Diese Zellpools, aus der Co-Transfektion mit den Vektoren pBID-HC und pBING- LC erhalten, wurden einem sequentiellen GFP-basiertem FACS-Sorting unterzogen. Die Konzentration des lgG2 Antikörpers im Zellkulturüberstand der Pools wurde nach jedem Sortierungsschritt durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/Zelle*Tag) berechnet. Insgesamt wurden 6 Sortierungen durchgeführt, wobei jeweils die 5% Zellen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz heraussortiert wurden. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens sechs Kultivierungspassagen in 75 cm2 Flaschen dar.
Abbildung 12 zeigt die durch Kombination einer GFP-basierten Selektion mit einem MTX-Amplifikationsschritt erzielten Steigerungen in der mAk-Produktivität am Beispiel der Zellpools 5 und 8 (vgl. Abb. 11). Zwei Wochen nach der Co-Transfektion von CHO-DG44 mit den Vektoren pBID-HC und pBING-LC wurden aus den Pools 5 und 8 die 5% Zellen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz heraussortiert. Danach wurde eine dhfr-vermittelte Genamplifikation durch Zusatz von 100 nM Methotrexat (MTX) zum Kultivierungsmedium durchgeführt. Die Konzentration des mAks im Zellkulturüberstand der Pools wurde durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/Zelle*Tag) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens sechs Kultivierungspassagen in 75 cm2 Flaschen dar.
Abbildung 13 zeigt die Korrelation zwischen der Antikörper-Produktivität und der GFP-Fluoreszenz am Beispiel der Zellpools 5 und 8 (vgl. Abb. 11). Diese Zellpools wurden aus der Transfektion von CHO-DG44 mit der Vektorkombination pBID-HC und pBING-LC erhalten. Sie wurden einem sequentiellen GFP-basiertem FACS- Sorting unterzogen, wobei jeweils die 5% Zellen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz heraussortiert wurden. Nach jedem Sortierungsschritt wurde die Konzentration des lgG2 Antikörpers im Zellkulturüberstand des Pools durch ELISA ermittelt und die spezifische Produktivität pro Zelle und Tag (pg/c*d) berechnet. Jeder Datenpunkt stellt dabei den Durchschnitt aus mindestens sechs Kultivierungspassagen in 75 cm2 Flaschen dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Die nachfolgenden Angaben zu den Aminosäurepositionen beziehen sich jeweils auf die Position der Aminosäure, wie sie vom Wildtyp-Neomycin-Phosphotrasferase-Gen mit der SEQ ID NO:1 kodiert wird. Mit einem „modifizierten Neomycin- Phosphotransferase-Gen" ist eine Nukleinsäure gemeint, die für ein Polypeptid mit Neomycin-Phosphotransferase-Aktivität kodiert, wobei das Polypeptid wenigstens an einer der in der Beschreibung näher angegebenen Aminosäurepositionen, die zu dem Willdtyp-Protein mit der SEQ ID NO:2 homolog sind, eine andere Aminosäure als das Wildtyp-Protein aufweist. In diesem Zusammenhang meint der Ausdruck „homolog", dass der die Mutation tragende Sequenzbereich mit Hilfe sog. Standard „alignment" Algorithmen, wie beispielsweise „BLAST" (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search." Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST Server" Meth. Enzymol. 266:131-141 ; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7:649-656; Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schärfer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) mit einer Referenzsequenz, vorliegend mit der Sequenz der Wildtyp-Neomycin- Phosphotransferase nach SEQ ID NO:2 in Übereinstimmung gebracht werden kann. Sequenzen sind dann in Übereinstimmung gebracht, wenn sie sich in ihrer Sequenzabfolge entsprechen und mit Hilfe der Standard „alignment" Algorithmen identifizieren lassen.
Die vorliegende Erfindung stellt neue modifizierte Neomycin-Phosphotransferase- Gene sowie Verfahren zur Herstellung und Selektion von Säugerzelllinien zur Verfügung, die eine hohe Expression heterologer Genprodukte, vorzugsweise biopharmazeutisch relevanter Polypeptide oder Proteine, ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Verfahren beruhen in erster Linie auf der Selektion von Zellen, die neben dem Gen von Interesse ein erfindungsgemäßes Neomycin- Phosphotransferase-Gen exprimieren, das den transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen einen Selektionsvorteil vermittelt. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Verwendung der hier beschriebenen erfindungsgemäßen modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gene (mNPT-Gene) gegenüber dem Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase-Gen (wtNPT-Gen) einen erheblichen selektiven Vorteil aufweist. Dies betrifft insbesondere die Verwendung von Mutanten, die eine geringere Enzymaktivität im Vergleich zur wtNPT aufweisen.
Erfindungsgemäße modifizierte Neomvcin-Phosphotransferase-Gene
Als besonders geeignet hat sich die Verwendung von modifizierten NPT-Genen herausgestellt, die für eine NPT kodieren, die lediglich 1 bis 80%, vorzugsweise 1 bis 60 % der Enzymaktivität der wtNPT aufweist. Weiter bevorzugt sind hierbei NPT- Mutanten, die lediglich 1% bis 30% der Enzymaktivität der wtNPT aufweisen, besonders bevorzugt sind solche, die lediglich 1 ,5% bis 26% der Enzymaktivität der wtNPT aufweisen. Die Enzymaktivität einer NPT lässt sich beispielhaft in einem wie in Beispiel 4 beschriebenen und als Methode 5 angegebenen „Dot Assay" bestimmen.
Als „Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase" bezeichnet man ein Neomycin- Phosphotransferase-Gen, das für das Aminoglycosid-3'-Phosphotransferase II Enzym (EC 2.7.1.95) kodiert, dessen Gen natürlicherweise in Escherichia coli Transposon 5-assoziiert ist, und z.B. die in SEQ ID NO:2 angegebene Aminosäuresequenz enthält oder durch die in SEQ ID NO:1 angegebene Nukleotidsequenz kodiert wird. Dieses Enzym vermittelt Resistenz gegenüber verschiedenen aminoglykosidischen Antibiotika wie Neomycin, Kanamycin und G418, indem es die Antibiotika durch den Transfer des terminalen Phosphats von ATP auf die 3Ηydroxylgruppe des Aminohexose-Rings I inaktiviert. Als wtNPT sind ferner alle NPT zu verstehen, die eine vergleichbare Enzymaktivät aufweisen, wie die durch SEQ ID NO:1 kodierte NPT. Dies schließt insbesondere solche NPT ein, bei denen das enzymatisch aktive Zentrum, welches den Transfer eines terminalen Phosphat von ATP auf ein Substrat katalysiert, in identischer oder annähernd identischer Konformation vorliegt (Shaw et al., 1993; Hon et al., 1997; Burk et al., 2001) und somit eine vergleichbare Enzymaktivität aufweist wie ein Enzym, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 enthält. Eine wtNPT hat hierbei eine vergleichbare Enzymaktivität, wenn diese etwa 81 bis 150%, vorzugsweise 90 bis 120% der Enzymaktivität zeigt, die eine durch SEQ ID NO:2 definierte NPT aufweist, wobei die Aktivität in dem unter Beispiel 4 und als Methode 5 beschriebenen „Dot- Assay bestimmt werden kann.
Grundsätzlich bevorzugt sind Mutanten, bei denen die Verringerung der Enzymaktivität im Vergleich zur wtNPT auf einer Modifikation der Aminosäuresequenz basiert, z.B. auf Substitution, Insertion oder Deletion zumindest einer oder mehrerer Aminosäuren. Deletions-, Insertions- und Substitutionsmutanten lassen sich mittels „ortsspezifischer Mutagenese" und / oder „PCR-basierten Mutagenese-Techniken" erzeugen. Entsprechende Methoden sind beispielhaft von Lottspeich und Zorbas (1998) (Kapitel 36.1 mit weiteren Verweisen) beschrieben. Überraschenderweise zeigte sich, dass bei Verwendung von Neomycin- Phosphotransferase-Mutanten als Selektionsmarker, bei denen zumindest die Aminosäure Tryptophan an Aminosäureposition 91, die Aminosäure Glutaminsäure an Aminosäureposition 182, die Aminosäure Valin an Aminosäureposition 198, die Aminosäure Asparaginsäure an Aminosäureposition 227, die Aminosäure Asparaginsäure an Aminosäureposition 261 oder die Aminosäure Phenylalanin an Aminosäureposition 240 im Vergleich zur wtNPT verändert wurde, eine besonders effektive Anreicherung von transfizierten Säugerzellen mit hohem Expressionsraten des co-integrierten Gens von Interesse erzielt werden kann. Bevorzugt sind demnach Mutanten, die die Aminosäuren an Position 91 , 182, 198, 227, 261 und/oder 240 betreffen. Besonders vorteilhaft sind hierbei Substitutionsmutanten, d.h. Mutanten bei denen die entsprechend im Wildtyp an dieser Stelle vorkommende Aminosäure gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht wurde. Noch weiter bevorzugt sind entsprechende Substitutionsmutanten, bei denen eine Veränderung der entsprechenden Aminosäure zu einer Reduktion der Enzymaktivität im Vergleich zur wt-NPT auf 1 bis 80%, vorzugsweise auf 1 bis 60%, weiter bevorzugt auf 1,5 bis 30%, noch weiter bevorzugt auf 1,5% bis 26% führt. Insbesondere bevorzugt sind modifizierte NPT-Gene, bei denen die Aminosäure 91, 227, 261 und/oder 240 entsprechend modifiziert wurde, so dass die Enzymaktivität im Vergleich zur wt-NPT lediglich 1 bis 80%, vorzugsweise lediglich 1 bis 60%, weiter bevorzugt lediglich 1 ,5 bis 30%, noch weiter bevorzugt lediglich 1,5% bis 26% beträgt. Am meisten bevorzugt ist eine Substitutionsmutante, bei der die Aminosäure an Aminsäureposition 227 in der Form modifiziert wurde, dass die Enzymaktivität der modifizierten NPT weniger als 26%, vorzugsweise zwischen 1 und 20%, noch weiter bevorzugt zwischen 1 und 16% im Vergleich zur wt-NPT beträgt.
Nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Mutanten vorteilhaft, die im Vergleich zur wtNPT an Aminosäureposition 91, 182 oder 227 jeweils für Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, oder Tyrosin kodieren. Darüber hinaus kann die Glutaminsäure an Aminosäureposition 182 auch durch Asparaginsäure, Asparagin, Glutamin oder eine beliebige andere vorzugsweise negativ geladene Aminosäure ersetzt werden. Ferner sind modifizierte NPT-Gene bevorzugt, die an Aminosäureposition 198 im Vergleich zum wtNPT für Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan kodieren. Darüber hinaus sind modifizierte NPT-Gene bevorzugt, die an Aminosäureposition 240 im Vergleich zum wtNPT für Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Tyrosin oder Tryptophan kodieren. Ferner sind modifizierte NPT-Gene bevorzugt, die an Aminosäureposition 261 im Vergleich zum wtNPT für Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Asparagin, Glutamin oder Asparaginsäure kodieren. Insbesondere zeigte sich, dass mit den Mutanten Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn und Phe240lle als Selektionsmarker eine Anreicherung von transfizierten Säugerzellen mit hohen Expressionsraten des co-integrierten Gens von Interesse erzielt wurde, so dass diese Mutanten besonders bevorzugt sind. Noch weiter bevorzugt sind die Mutanten Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn, Phe240lle und Trp91Ala, mit deren Verwendung die besten Anreicherungsraten erreicht werden konnten. Insbesondere bevorzugt ist die Mutante Asp227Val.
Im Gegensatz hierzu erwiesen sich die Asp190Gly- und die Asp208Gly-Mutanten als ungeeignete Marker für die Selektion von transfizierten CHO-DG44-Zellen unter serumfreien Kulturbedingungen. Bedingt durch die vermutlich sehr reduzierte Enzymfunktion dieser Mutanten (Asp190Gly, Asp208Gly) wurden nach der Selektionsphase nur wenige Zellen erhalten, die zudem in Wachstum und Vitalität stark beeinträchtigt waren.
Bei den Aminosäuren an Position 182 und 227 bezogen auf den Wildtyp handelt es sich um nicht-konseπ/ierte Aminosäuren, die außerhalb der drei konservierten Motive im C-terminalen Bereich der Aminogiykosid-3'-Phosphotransferasen lokalisiert sind. Die Aminosäure an Position 91 gehört ebenfalls zu den nicht-konservierten Aminosäuren und liegt außerhalb eines der konservierten Motive im N-terminalen Bereich der Aminoglykosid-3'-Phosphotransferasen. Bei den Aminosäuren an Position 198 und 240 handelt es sich hingegen um konservierte Aminosäuren im C- terminalen Bereich der NPT, die jedoch außerhalb der konservierten Motive liegen. Im Gegensatz hierzu ist die Aminosäure an Position 261 eine konservierte Aminosäure im dritten konservierten Motiv des C-terminalen Bereichs (Shaw et al., 1993; Hon et al., 1997; Burk et al., 2001 ). Im Vergleich zur Verwendung der wtNPT als Selektionsmarker wiesen die Zellen im Fall der Glu182Gly-, Glu182Asp- und Val198Gly-Mutante eine um Faktor 1,4 - 2,4, im Fall der Asp227Gly-Mutante eine um Faktor 1 ,6 - 4,1 , im Fall der Asp227Ala- bzw. Trp91Ala-Mutante eine um Faktor 2,2 bzw. 4, im Fall der Phe240lle- bzw. Asp261Asn-Mutante eine um Faktor 5,7 bzw. 7,3 und im Fall der Asp261Gly- bzw. Asp227Val-Mutante eine sogar um Faktor 9,3 bzw. 14,6 erhöhte Produktivität auf. Zur Expression des mehrkettigen Proteins(eines Antikörpers) wurde dabei eine Co- Transfektion durchgeführt. Die beiden Proteinketten wurden dabei jeweils von einem eigenen Vektor aus exprimiert, wobei der eine Vektor zusätzlich noch für das NPT- Gen und der andere Vektor für das amplifizierbare selektionierbare Dihydrofolat- Reduktase-Gen kodierte.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Anreicherung von rekombinanten Säugerzellen, die ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-
Gen exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass (i) ein Pool an Säugerzellen mit einem Gen für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase transfiziert wird, die im Vergleich zur Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase lediglich 1 bis 80%, vorzugsweise lediglich 1 bis 60%, weiter bevorzugt lediglich 1,5 bis 30%, noch weiter bevorzugt 1 ,5 bis 26% und/oder eine der hier beschriebenen Modifikationen aufweist; (ii) die Säugerzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine
Expression des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens erlauben; und (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren.
Besonders bevorzugt ist ein entsprechendes Verfahren, wenn ein in dieser Anmeldung näher beschriebenes modifiziertes NPT-Gen verwendet wird, insbesondere wenn das verwendete modifizierte NPT-Gen für eine modifizierte NPT kodiert, die im Vergleich zum Wildtyp-Gen an Aminosäureposition 91 für Alanin, an Aminosäureposition 182 für Glycin oder Asparaginsäure, an Aminosäureposition 198 für Glycin, an Aminosäureposition 227 für Alanin, Glycin bzw. Valin, an Aminosäureposition 261 für Glycin oder Asparagin oder an Aminosäureposition 240 für Isoleucin kodiert. Noch weiter bevorzugt sind NPT-Gene, die im Vergleich zum Wildtyp-Gen an Aminosäureposition 227 für Valin und /oder an Aminosäureposition 261 für Glycin und/oder Asparagin kodieren. Insbesondere bevorzugt sind solche NPT-Gene, die an Aminosäureposition 240 im Vergleich zum Wildtyp-Gen für ein Isoleucin oder an Aminosäureposition 227 für ein Valin kodieren, wobei ein NPT- Gen, das an Aminosäureposition 227 im Vergleich zum Wildtyp-Gen für Valin kodiert wiederum besonders bevorzugt ist. Natürlich umfasst die vorliegende Erfindung auch modifizierte NPT-Gene sowie die erfindungsgemäße Verwendung von modifizierten NPT-Genen, die eine Kombination aus den entsprechenden Aminosäureaustauschen aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eukaryontische Expressionsvektoren, die (i) ein heterologes Gen von Interesse in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Promotor und (ii) ein hier beschriebenes erfindungsgemäßes modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen enthalten, welches für eine Neomycin-Phosphotransferase kodiert, die im Vergleich zur Wildtyp-Neomycin- Phosphotransferase eine geringe Enzymaktivität aufweist. Unter einer „geringen" oder „geringeren" Enzymaktivität im Sinne der Erfindung ist eine Enzymaktivität zu verstehen, die maximal 80%, vorzugsweise 1 bis 80%, weiter bevorzugt lediglich 1 bis 60% der Enzymaktivität der wtNPT entspricht. Nach einer weiteren Ausführungsform der voliegenden Erfindung meint „geringere Enzymaktivität" eine Enzymaktivität von 1 bis 30%, vorzugsweise 1 ,5 bis 26% im Vergleich zur Wildtyp- Neomycin-Phosphotransferase.
Ein bevorzugter Expressionsvektor enthält ein modifiziertes NPT-Gen, das für eine modifizierte NPT kodiert, die lediglich 1 bis 80%, vorzugsweise lediglich 1 bis 60% der Enzymaktivität der wtNPT aufweist. Weiter bevorzugt sind Expressionsvektoren mit modifizierten NPT-Genen, die für Mutanten kodieren, die lediglich 1 bis 30% der Enzymaktivität der wtNPT aufweisen. Im Besonderen bevorzugt sind solche Expressionsvektoren, die ein modifiziertes NPT-Gen enthalten, die für Mutanten kodieren, die lediglich 1 ,5 bis 26% der Enzymaktivität der wtNPT aufweisen, wobei die Aktivität in dem unter Beispiel 4 und als Methode 5 beschriebenen „Dot-Assay" bestimmt wird. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthalten die Expressionsvektoren Gene von modifizierten NPT, die im Vergleich zur wtNPT an Aminosäureposition Trp91 , Glu182, Val198, Asp227, Phe240 oder an Position Asp261 modifiziert wurden. Bevorzugt sind in diesem Zusammenhang NPT-Mutanten, die an Position Trp91 , Glu182, Val198, Asρ227, Phe240 oder Asp261 modifiziert sind und lediglich über 1 bis 80%, vorzugsweise lediglich über 1 bis 60%, weiter bevorzugt lediglich über 1 ,5 bis 30%, und besonders bevorzugt über lediglich 1 ,5 bis 26% der Enzymaktivität der wtNPT verfügen. Vorzugsweise können hierbei die Aminosäuren Tryp91 , Glu182, oder Asp227 jeweils durch Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin an der entsprechenden Position ersetzt werden. Die Glutaminsäure an 182 kann ferner auch durch Asparaginsäure, Asparagin, Glutamin oder eine andere vorzugsweise negativ geladene Aminosäure ersetzt werden. Ferner sind modifizierte NPT-Gene bevorzugt, die an Aminosäureposition 198 im Vergleich zum wtNPT für Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan kodieren. Darüberhinaus sind modifizierte NPT-Gene bevorzugt, die an Aminosäureposition 240 im Vergleich zum wtNPT für Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Tyrosin oder Tryptophan kodieren. Ferner sind modifizierte NPT-Gene bevorzugt, die an Aminosäureposition 261 im Vergleich zum wtNPT für Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Asparagin, Glutamin oder Asparaginsäure kodieren. Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Mutante, bei der die Asparaginsäure an Position 227 durch Glycin, Alanin, Valin, Leucin oder Isoleucin ersetzt wird, die Asparaginsäure an Position 261 durch ein Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin oder Glutamin, insbesondere durch Glycin oder Asparagin ersetzt wird.
Besonders bevorzugt sind Expressionsvektoren, die modifizierte NPT-Gene enthalten, die für eine Glu182Gly-, Glu182Asp-, Trp91Ala-, Val198Gly-, Asp227Ala-, Asp227Val-, Asp227Gly-, Asp261Gly-, Asp261Asn- oder Phe240lle-Mutante kodieren, die im Fall der Glu182Gly-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4, im Fall der Glu182Asp-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 20, im Fall der Trp91Ala-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:6, im Fall der Val198Gly-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:8, im Fall der Asp227Ala-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 10, im Fall der Asp227Val-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 12, im Fall der Asp227Gly-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:22, im Fall der Asp261Gly-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:14, im Fall der Asp261Asn-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:16 und im Fall der Phe240lle-Mutante die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 18 enthält. Am meisten bevorzugt ist ein Expressionsvektor mit der Verwendung einer Asp227Val-, Asp227Gly, Asp261Gly-, Asp261Asn-, Phe240lle oder Trp91Ala-Mutante, insbesondere wenn sie die in SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 oder SEQ ID NO:6 angegebene Aminosäuresequenz aufweist oder darüber hinaus, wenn sie durch die in SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17 oder SEQ ID NO:5 angegebene Nukleinsäuresequenz kodiert wird oder diese enthält.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung erstmals modifizierte Neomycin- Phosphotransferase-Gene sowie deren Genprodukte zur Verfügung, die im Vergleich zur wtNPT an Aminosäureposition Trp91 , Val198 oder Phe240 für eine andere als die wt-Aminosäure kodieren. Dabei stellt die vorliegende Erfindung insbesondere erstmalig Trp91-, Val198- oder Phe240-Mutanten zur Verfügung, die im Vergleich zur wtNPT ein geringere Enzymaktivität aufweisen. Die hier beschriebenen und im Rahmen der Erfindung zur Verfügung modifizierten NPT kodieren vorzugsweise an Aminosäureposition 91 für Alanin, an Position 198 für Glycin und an Position 240 für Isoleucin. Ferner stellt die vorliegende Erfindung erstmals NPT-Mutanten zur Verfügung, die im Vergleich zur wt-NPT an Position 182 für Glycin, an Position 227 für Alanin oder Valin und an Position 261 für Glycin kodieren. Hierbei werden sowohl die Gene als auch die Genprodukte (Enzyme) im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmalig zur Verfügung gestellt. In diesem Zusammenhang stellt die vorliegende Erfindung erstmalig modifizierte NPT mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14, und SEQ ID NO: 18 zur Verfügung. Ferner stellt die vorliegende Erfindung modifizierte NPT-Gene mit den DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO.11 , SEQ ID NO:13, und SEQ ID NO:17 zur Verfügung. Gen von Interesse
Das im erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthaltene Gen von Interesse umfasst eine Nukleotidsequenz beliebiger Länge, die für ein Produkt von Interesse kodiert. Das Genprodukt oder auch „Produkt von Interesse" ist in der Regel ein
Protein, Polypeptid, Peptid bzw. Fragment oder Derivat davon. Es kann aber auch
RNA oder antisense RNA sein. Das Gen von Interesse kann in voller Länge, in verkürzter Form, als Fusionsgen oder markiertes Gen vorliegen. Es kann sich um genomische DNA oder vorzugsweise cDNA bzw. entsprechende Fragmente oder
Fusionen handeln. Das Gen von Interesse kann die native Gensequenz darstellen, mutiert oder auf sonstige Weise modifiziert sein. Derartige Modifikationen schließen
Codon-Optimierungen zur Anpassung an eine bestimmte Wirtszelle und eine
Humanisierung ein. Das Gen von Interesse kann z.B. für ein sekretiertes, zytoplasmatisches, kernlokalisiertes, membrangebundenes oder zelloberflächen- gebundenes Polypeptid kodieren.
Der Ausdruck „Nukleotidsequenz" oder „Nukleinsäuresequenz" bezeichnet ein Oligonukleotid, Nukleotide, Polynukleotide und deren Fragmente sowie DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die als Einzel- oder Doppelstrang vorliegen und den kodierenden oder den nicht-kodierenden Strang eines Gens repräsentieren kann. Zur Modifikation von Nukleinsäuresequenzen können Standardtechniken, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese oder PCR-vermittelte Mutagenese ( z.B. in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1994 beschrieben), eingesetzt werden.
Unter „kodieren" versteht man die Eigenschaft oder Fähigkeit einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure, beispielsweise einem Gen in einem Chromosom oder einer mRNA, als Matrize für die Synthese von anderen Polymeren und Makromolekülen wie z.B. rRNA, tRNA, mRNA, anderen RNA-Molekülen, cDNA oder Polypeptiden in einem biologischen Prozess zu dienen. Demnach kodiert ein Gen für ein Protein, wenn durch Transkription und nachfolgende Translation der mRNA das gewünschte Protein in einer Zelle oder einem anderen biologischen System produziert wird. Sowohl der kodierende Strang, dessen Nukleotidsequenz identisch mit der mRNA-Sequenz ist und normalerweise auch in Sequenzdatenbanken, z.B. EMBL oder GenBank, angegeben wird, als auch der als Matrize für die Transkription dienende nicht-kodierende Strang eines Gens oder cDNA kann dabei als kodierend für ein Produkt oder Protein bezeichnet werden. Eine Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, schließt auch Nukleinsäuren mit ein, die auf Grund des degenerierten genetischen Codes eine andere Nukleotidsequenzabfolge aufweisen, aber in der gleichen Aminosäuresequenz des Proteins resultieren. Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, können auch Introns enthalten.
Mit dem Ausdruck „cDNA" werden Desoxyribonukleinsäuren bezeichnet, die durch reverse Transkription und Synthese des zweiten DNA-Strangs aus einer von einem Gen produzierten mRNA oder anderen RNA hergestellt werden. Liegt die cDNA als doppelstränges DNA-Molekül vor, dann enthält sie sowohl einen kodierenden als auch einen nicht-kodierenden Strang.
Mit dem Ausdruck „Intron" werden nicht-kodierende Nukleotidsequenzen beliebiger Länge bezeichnet. Sie kommen natürlicherweise in vielen eukaryontischen Genen vor und werden von einem zuvor transkribierten mRNA-Vorläufer durch einen als Spleissen bezeichneten Prozess entfernt. Hierfür ist ein exaktes Herausschneiden des Introns am 5'- und 3'-Ende und eine korrekte Verbindung der entstehenden mRNA-Enden erforderlich, damit eine reife prozessierte mRNA mit dem für die erfolgreiche Proteinsynthese richtigen Leseraster hergestellt wird. Viele der an diesem Spleissing-Prozess beteiligten Spleiss-Donor- und Spleiss-Akzeptor-Stellen, das sind die unmittelbar an den Exon-Intron- bzw. Intron-Exon-Grenzen vorliegenden Sequenzen, sind mittlerweile charakterisiert worden. Für einen Überblick siehe Ohshima et al., 1987.
Protein/Produkt von Interesse
Biopharmazeutisch bedeutsame Proteine/Polypeptide umfassen z.B. Antikörper, Enzyme, Cytokine, Lymphokine, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren sowie deren Derivate bzw. Fragmente, sind aber nicht auf diese beschränkt. Im Allgemeinen sind alle Polypeptide bedeutsam, die als Agonisten oder Antagonisten wirken und/oder therapeutische oder diagnostische Anwendung finden können.
Der Ausdruck „Polypeptide" wird für Aminosäuresequenzen oder Proteine verwendet und bezeichnet Polymere von Aminosäuren beliebiger Länge. Dieser Ausdruck schließt auch Proteine ein, die posttranslational durch Reaktionen wie beispielsweise Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung oder Proteinprozessierung modifiziert werden. Die Struktur des Polypeptids kann z.B. durch Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren, Fusion mit anderen Proteinen, unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität modifiziert werden. Der Ausdruck Polypeptide schließt somit beispielsweise auch Fusionsproteine bestehend aus einem Immunglobulinanteil, z.B. dem Fc-Anteil, und einem Wachstumsfaktor, z.B. einem Interleukin, mit ein.
Beispiele für therapeutische Proteine sind Insulin, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, humanes Wachstumshormon (hGH) und andere Wachstumsfaktoren, Gewebe- plasminogenaktivator (tPA), Erythropoetin (EPO), Cytokine, beispielsweise Interleukine (IL) wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Interferon (IFN)-alpha, beta, gamma, omega oder tau, Tumornekrosefaktor (TNF) wie z.B. TNF-alpha, beta oder gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 und VEGF. Weitere Beispiele sind monoklonale, polyklonale, multispezifische und einzelkettige (single chain) Antikörper und Fragmente davon, wie z.B. Fab, Fab', F(ab')2, Fc und Fc'-Fragmente, leichte (L) und schwere (H) Immunglobulinketten und deren konstante, variable oder hypervariable Regionen sowie Fv- und Fd-Fragmente (Chamov et al., 1999). Die Antikörper können humanen oder nicht-humanen Ursprungs sein. Auch humanisierte und chimäre Antikörper kommen in Frage.
Fab-Fragmente (Fragment antigen-binding = Fab) bestehen aus den variablen Regionen beider Ketten, die durch die angrenzenden konstanten Regionen zusammengehalten werden. Sie können z.B. durch Behandlung mit einer Protease, wie beispielsweise Papain, aus konventionellen Antikörpern erzeugt werden oder aber auch durch DNA-Klonierung. Weitere Antikörperfragmente sind F(ab')2- Fragmente, die durch proteolytischen Verdau mit Pepsin hergestellt werden können.
Durch Genklonierung können auch verkürzte Antikörperfragmente hergestellt werden, die nur aus den variablen Region der schweren (VH) und der leichten Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv-Fragmente (Fragment variable = Fragment des variablen Teils) bezeichnet. Da bei diesen Fv-Fragmenten die kovalente Verbindung über die Cysteinreste der konstanten Ketten nicht möglich ist, werden diese Fv- Fragmente oft anderweitig stabilisiert. Dazu werden die variablen Region der schweren und leichten Kette häufig mittels eines kurzen Peptidfragments von ca. 10 - 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 Aminosäuren, miteinander verknüpft. Auf diese Weise entsteht eine einzelne Polypeptidkette, in der VH und VL durch einen Peptidlinker miteinander verbunden sind. Solche Antikörperfragmente werden auch als single-chain Fv-Fragment (scFv) bezeichnet. Beispiele von scFv- Antikörpern sind bekannt und beschrieben, siehe z.B. Huston et al. (1988).
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt um multimere scFv-Derivate herzustellen. Die Intention besteht in der Erzeugung von rekombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verstärkter Bindungsavidität. Zur Erreichung der Multimerisierung der scFv- Fragmente werden diese als Fusionsproteine mit Multimerisierungsdomänen hergestellt. Als Multimerisierungsdomänen können dabei z.B. die CH3-Region eines IgGs oder Helixstrukturen („coiled coil structure") wie die Leucin-Zipper-Domänen fungieren. In anderen Strategien wird die Interaktion zwischen den VH- und VL- Regionen des scFv-Fragments für eine Multimerisierung genutzt (z.B. Dia-, Tri- und Pentabodies).
Als „Diabody" bezeichnet ein Fachmann ein bivalentes homodimeres scFv-Derivat. Die Verkürzung des Peptidlinkers im scFv-Moleküle auf 5 - 10 Aminosäuren resultiert in der Bildung von Homodimeren durch Überlagerung von VHΛ L-Ketten. Die Diabodies können zusätzlich durch eingeführte Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diabodies finden sich in der Literatur, z.B. bei Perisic et al. (1994). Als „Minibody" bezeichnet der Fachmann ein bivalentes, homodimeres scFv-Derivat. Es besteht aus einem Fusionsprotein, das die CH3-Region eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, besonders bevorzugt lgG1, als Dimerisierungsregion enthält. Diese verbindet die scFv-Fragmente über eine Hinge-Region, ebenfalls von IgG, und eine Linker-Region. Beispiele solcher Minibodies sind bei Hu et al. (1996) beschrieben.
Mit „Triabody" bezeichnet der Fachmann ein trivalentes homotrimeres scFv-Derivat (Kortt et al., 1997). Die direkte Fusion von VH-VL ohne Verwendung einer Linkersequenz führt zur Ausbildung von Trimeren.
Bei den vom Fachmann als Mini-Antikörper bezeichneten Fragmenten, die eine bi-, tri- oder tetravalente Struktur haben, handelt es sich ebenfalls um Derivate von scFv- Fragmenten. Die Multimerisierung wird dabei über di-, tri- oder tetramere „coiled coil"- Strukturen erzielt (Pack et al., 1993 und 1995; Lovejoy et al., 1993).
Gen. das für ein fluoreszierendes Protein kodiert
In einer weiteren Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Expressionsvektor ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Gen, vorzugsweise in funktioneller Verknüpfung mit dem Gen von Interesse. Vorzugsweise erfolgt die Transkription beider Gene unter der Kontrolle eines einzigen heterologen Promotors, so dass das Protein/Produkt von Interesse und das fluoreszierende Protein durch eine bicistronische mRNA kodiert werden. Dies ermöglicht eine Identifizierung von Zellen, die das Protein/Produkt von Interesse in hohen Menge produzieren, über die Expressionsrate des fluoreszierenden Proteins.
Bei dem fluoreszierenden Protein kann es sich z.B. um ein grün, blaugrün, blau, gelb oder andersfarben fluoreszierendes Protein handeln. Ein spezielles Beispiel ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequorea victoria oder Renilla reniformis und daraus entwickelte Mutanten; siehe z.B. Bennet et al. (1998); Chalfie et al. (1994); WO 01/04306 und die dort zitierte Literatur. Weitere fluoreszierende Proteine und dafür kodierende Gene sind in WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 und WO 01/27150 beschrieben, die durch Bezugnahme hierin inkorporiert werden. Bei diesen fluoreszierenden Proteinen handelt es sich um Fluorophore von nicht-biolumineszierenden Organismen der Spezies Anthozoa, beispielsweise von Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp. „red", Discosoma sp. "green", Discosoma sp. "Magenta", Anemonia sulcata.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzproteine beinhalten neben den Wildtyp-Proteinen auch natürliche oder gentechnologisch hergestellte Mutanten und -Varianten, deren Fragmente, Derivate oder z.B. mit anderen Proteinen oder Peptiden fusionierte Varianten. Die eingebrachten Mutationen können dabei beispielsweise das Exzitations- oder Emissionsspektrum, die Chromophorenbildung, den Extinktionskoeffizienten oder die Stabilität des Proteins verändern. Durch Codon-Optimierung kann zudem die Expression in Säugerzellen oder anderen Spezies verbessert werden. Erfindungsgemäß kann das fluoreszierende Protein auch in Fusion mit einem Selektionsmarker, bevorzugterweise mit einem amplifzierbaren Selektionsmarker wie beispielsweise der Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), eingesetzt werden.
Die von den fluoreszierenden Proteinen emittierte Fluoreszenz ermöglicht die Detektion der Proteine z.B. durch Durchflusszytometrie mit einem Fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) oder durch Fluoreszenzmikroskopie.
Weitere regulatorische Elemente
Der Expressionsvektor enthält zumindest einen heterologen Promotor, der die Expression des Gens von Interesse und vorzugsweise auch die des fluoreszierenden Proteins ermöglicht.
Als „Promotor" wird eine Polynukleotidsequenz bezeichnet, die die Transkription der mit ihr funktionell verknüpften Gene oder Sequenzen ermöglicht und kontrolliert. Ein Promotor enthält Erkennungssequenzen für die Bindung der RNA-Polymerase und die Initiationsstelle der Transkription (Transkriptionsinitiationsstelle). Zur Expression einer gewünschten Sequenz in einem bestimmten Zelltyp oder einer Wirtszelle muss jeweils ein geeigneter, funktionaler Promotor gewählt werden. Der Fachmann kennt eine Vielzahl von Promotoren aus verschiedenen Quellen, einschließlich konstitutiver, induzierbarer und reprimierbarer Promotoren. Sie sind in Datenbanken, z.B. GenBank, hinterlegt und können als eigenständige oder innerhalb von Polynukleotidsequenzen klonierte Elemente von kommerziellen oder individuellen Quellen bezogen werden. In induzierbaren Promotoren kann die Aktivität des Promotors in Reaktion auf ein Signal reduziert oder verstärkt werden. Ein Beispiel für einen induzierbaren Promotor stellt der Tetracyclin (tet)-Promotor dar. Dieser enthält Tetracyclin-Operatorsequenzen (tetO), die durch ein Tetracyclin-reguliertes Transaktivatorprotein (tTA) induziert werden können. In der Anwesenheit von Tetracyclin wird die Bindung von tTA an tetO inhibiert. Beispiele für weitere induzierbare Promotoren sind der jun-, fos-, Metallothionin- und Hitzeschockpromotor (siehe auch Sambrook et al., 1989; Gossen et al., 1994).
Unter den Promotoren, die für eine hohe Expression in Eukaryonten besonders gut geeignet sind, befinden sich beispielsweise der Ubiquitin/S27a-Promotor des Hamsters (WO 97/15664), der SV40 early Promotor, der Adenovirus major late Promotor, der Maus Metallothionin-I Promotor, die lange terminale Repeatregion des Rous Sarcoma Virus, der early Promotor des humanen Cytomegalie-Virus. Beispiele für andere heterologe Säugerpromotoren sind der/die Aktin-, Immunglobulin- oder Hitzeschockpromotor(en).
Ein entsprechender heterologer Promotor kann zur Steigerung/Regulierung der Transkriptionsaktivität in einer Expressionskassette in funktionellen Zusammenhang mit weiteren regulatorischen Sequenzen gebracht werden.
Beispielsweise kann der Promotor mit Enhancer-Sequenzen funktionell verknüpft werden, um die Transkriptionsaktivität zu steigern. Hierzu können ein oder mehrere Enhancer und/oder mehrere Kopien einer Enhancer-Sequenz verwendet werden, beispielsweise ein CMV- oder SV40-Enhancer. Dem entsprechend enthält ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor in einer weiteren Ausführungsform einen oder mehrere Enhancer / Enhancer-Sequenzen, vorzugsweise einen CMV- oder SV40- Enhancer.
Mit dem Ausdruck „Enhancer" wird eine Polynukleotidsequenz bezeichnet, die in cis- Lokalisierung auf die Aktivität eines Promotors einwirkt und so die Transkription eines mit diesem Promotor funktionell verknüpften Gens stimuliert. Im Gegensatz zu Promotoren ist die Wirkung der Enhancer positions- und orientierungsunabhängig und können somit vor oder hinter eine Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns oder selbst innerhalb der Kodierregion positioniert werden. Der Enhancer kann dabei sowohl in unmittelbarer Nähe der Transkriptionseinheit als auch in beträchtlichem Abstand zum Promotor lokalisiert sein. Auch eine physikalische und funktioneile Überlappung mit dem Promotor ist möglich. Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Enhancern aus verschiedenen Quellen bekannt (und in Datenbanken wie GenBank hinterlegt, z.B. SV40 Enhancer, CMV Enhancer, Polyoma Enhancer, Adenovirus Enhancer) und als eigenständige oder innerhalb von Polynukleotidsequenzen klonierte Elemente verfügbar (z.B. bei ATCC hinterlegt oder aus kommerziellen und individuellen Quellen). Eine Vielzahl von Promotorsequenzen beinhalten auch Enhancer-Sequenzen, wie z.B. der häufig verwendete CMV Promotor. Der humane CMV-Enhancer gehört dabei zu den stärksten bisher identifizierten Enhancern. Ein Beispiel für einen induzierbaren Enhancer ist der Metallothionein-Enhancer, der durch Glucocorticoide oder Schwermetalle stimuliert werden kann.
Eine weitere mögliche Modifikation ist z.B. die Einführung multipler Sp1- Bindungsstellen. Die Promotorsequenzen können ferner mit regulatorischen Sequenzen kombiniert werden, die eine Steuerung/Regulierung der Transkriptionsaktivität gestatten. So kann der Promotor reprimierbar/induzierbar gemacht werden. Dies kann beispielsweise durch die Verknüpfung mit Sequenzen geschehen, die Bindungsstellen für positiv oder negativ regulierende Transkriptionsfaktoren darstellen. Der oben genannte Transkriptionsfaktor SP-1 beispielsweise hat einen positiven Einfluss auf die Transkriptionsaktivität. Ein weiteres Beispiel ist die Bindungsstelle für das Aktivatorprotein AP-1, das sowohl in positiver als auch in negativer Weise auf die Transkription einwirken kann. Die Ak- tivität des AP-1 kann durch verschiedenste Faktoren, wie z.B. Wachstumsfaktoren, Cytokine und Serum, gesteuert werden (Faisst et al., 1992, und Referenzen darin). Die Transkriptionseffizienz kann auch dadurch gesteigert werden, dass die Promotorsequenz durch Mutation (Substitution, Insertion oder Deletion) von einer, zwei, drei oder mehr Basen verändert wird und dann in einem Reportergen-Assay bestimmt wird, ob sich dadurch die Promotoraktivität erhöht.
Grundsätzlich umfassen die zusätzlichen regulatorischen Elemente heterologe Promotoren, Enhancer, Terminations- und Polyadenylierungssignale und weitere Expressionskontrollelemente. Für die verschiedenen Zelltypen sind sowohl induzierbare als auch konstitutive regulatorische Sequenzen bekannt.
„Transkriptionsregulatorische Elemente" umfassen gewöhnlich einen Promotor stromaufwärts von der zu exprimierenden Gensequenz, Transkriptionsinitiations- und -terminationsstellen sowie ein Polyadenylierungssignal.
Der Ausdruck „Transkriptionsinitiationsstelle" bezieht sich auf eine Nukleinsäure in dem Konstrukt, die der ersten Nukleinsäure entspricht, welche in das primäre Transkript, d.h. den mRNA-Precursor, inkorporiert wird. Die Transkriptions- initiationssteile kann mit den Promotorsequenzen überlappen.
Der Ausdruck „Transkriptionsterminationsstelle" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die normalerweise am 3'-Ende des Gens von Interesse oder des zu transkribierenden Genabschnitts vorhanden ist und die den Abbruch der Transkription durch RNA-Polymerase bewirkt.
Das „Polyadenylierungssignal" ist eine Signalsequenz, welche die Spaltung an einer spezifischen Stelle am 3'-Ende der eukaryontischen mRNA und den posttranskrip- tionellen Einbau einer Sequenz von etwa 100-200 Adeninnukleotiden (polyA- Schwanz) am gespaltenen 3'-Ende verursacht. Das Polyadenylierungssignal umfasst die Sequenz AATAAA etwa 10-30 Nukleotide stromaufwärts von der Spaltstelle sowie eine stromabwärts gelegene Sequenz. Es sind verschiedene Poly- adenylierungselemente bekannt, z.B. tk polyA, SV40 late und early polyA oder BGH polyA (z.B. beschrieben in US 5,122,458).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verfügt jede Transkriptionseinheit über einen Promotor oder ein Promotor/Enhancer-Element, ein Gen von Interesse und/oder ein Markergen, sowie über ein Transkriptionsterminationselement. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform enthält die Transkriptionseinheit weitere translationsregulatorische Einheiten.
„Translationsregulatorische Elemente" umfassen eine Translationsinitiationsstelle (AUG), ein Stoppcodon und ein polyA-Signal für jedes zu exprimierende Polypeptid. Für eine optimale Expression kann es günstig sein, 5'- und/oder 3'-nichttranslatierte Bereiche der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz zu entfernen, hinzuzufügen oder zu ändern, um potentielle zusätzliche ungeeignete Translationsinitiationscodons oder andere Sequenzen, welche die Expression auf dem Niveau der Transkription oder Expression beeinträchtigen können, zu eliminieren. Um die Expression zu fördern, kann man alternativ ribosomale Konsensus-Bindungsstellen unmittelbar stromaufwärts vom Startcodon inserieren. Um ein sekretiertes Polypeptid zu produzieren, enthält das Gen von Interesse gewöhnlich eine Signalsequenz, welche für ein Signalvoriäuferpeptid kodiert, die das synthetisierte Polypeptid zu und durch die ER-Membran transportiert. Die Signalsequenz befindet sich oft, jedoch nicht immer, am Aminoterminus des sekretierten Proteins und wird durch Signal- Peptidasen abgespalten, nachdem das Protein durch die ER-Membran geschleust wurde. Die Gensequenz wird gewöhnlich, jedoch nicht notwendigerweise, eine eigene Signalsequenz enthalten. Wenn die native Signalsequenz nicht vorhanden ist, kann in bekannter Weise eine heterologe Signalsequenz eingeführt werden. Dem Fachmann sind zahlreiche solcher Signalsequenzen bekannt und in Sequenzdatenbanken wie GenBank und EMBL hinterlegt.
Ein erfindungsgemäß besonderes bedeutsames regulatorisches Element ist die interne Ribosomenbindungsstelle (IRES). Das „IRES-Element" umfasst eine Sequenz, welche die Translationsinitiation unabhängig von einer 5'-terminalen Methylguanosiniumkappe (CAP-Struktur) sowie dem stromaufwärts gelegenen Gen funktionell bewerkstelligt und in einer tierischen Zelle die Translation zweier Cistrone (offener Leseraster) von einem einzigen Transkript ermöglicht. Das IRES-Element stellt eine unabhängige Ribosomenbindungsstelle für die Translation des unmittelbar stromabwärts gelegenen offenen Leserasters zur Verfügung. Im Gegensatz zu bakterieller mRNA, die multicistronisch sein kann, d.h. für mehrere verschiedene Polypeptide oder Produkte kodieren kann, die nacheinander von der mRNA translatiert werden, sind die meisten mRNAs von Tierzellen monocistronisch und kodieren nur für ein einziges Protein oder Produkt. Bei einem multicistronischen Transkript in einer eukaryontischen Zelle würde die Translation von der stromaufwärts am nächsten gelegenen Translationsinitiationsstelle initiiert und vom ersten Stoppcodon beendet werden, worauf das Transkript aus dem Ribosom freigesetzt würde. Bei der Translation entstünde somit nur das erste von der mRNA kodierte Polypeptid oder Produkt. Dagegen ermöglicht ein multicistronisches Transkript mit einem IRES-Element, das mit dem zweiten oder weiteren offenen Leserastern in dem Transkript funktionell verknüpft ist, die anschließende Translation des stromabwärts gelegenen offenen Leserasters, so dass in der eukaryontischen Zelle zwei oder mehr, von demselben Transkript kodierte Polypeptide oder Produkte produziert werden.
Das IRES-Element kann von verschiedener Länge und von verschiedenem Ursprung sein und z.B. vom Encephalomyocarditisvirus (EMCV) oder anderen Picomaviren stammen. In der Literatur sind verschiedene IRES-Sequenzen und deren Anwendung bei der Konstruktion von Vektoren beschrieben worden; siehe z.B. Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991 ; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996, Mosser et al., 1997.
Die stromabwärts gelegene Gensequenz ist mit dem 3'-Ende des IRES-Elements funktionell verknüpft, d.h. der Abstand wird so gewählt, dass die Expression des Gens nicht oder nur marginal beeinflusst wird bzw. eine für den Zweck ausreichende Expression aufweist. Der optimale und zulässige Abstand zwischen dem IRES- Element und dem Startcodon des stromabwärts gelegenen Gens für eine noch ausreichende Expression lässt sich in einfachen Versuchen durch Variation des Abstands und Bestimmung der Expressionsrate als Funktion des Abstandes mit Hilfe von Reportergen-Assays ermitteln.
Durch die geschilderten Maßnahmen kann eine optimierte Expressionskassette erhalten werden, die von hohem Nutzen für die Expression heterologer Genprodukte ist. Eine durch eine oder mehrere solcher Maßnahmen erhaltene Expressionskassette ist daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Hamster-Ubiguitin/S27a-Promotor
In einer weiteren Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Expressionsvektor den Ubiquitin/S27a-Promotor des Hamsters, vorzugsweise in funktioneller Verknüpfung mit dem Gen von Interesse und noch mehr bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit dem Gen von Interesse und dem Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert.
Der Ubiquitin/S27a-Promotor des Hamsters ist ein starker homologer Promotor, der in der WO 97/15664 beschrieben ist. Ein solcher Promotor weist vorzugsweise mindestens eines der folgenden Merkmale auf: GC-reicher Sequenzbereich, Sp1- Bindungsstelle, Polypyrimidinelement, Abwesenheit einer TATA-Box. Besonders bevorzugt ist ein Promotor, der eine Sp1 -Bindungsstelle bei Abwesenheit einer TATA-Box aufweist. Ferner ist ein solcher Promotor bevorzugt, der konstitutiv aktiviert ist und insbesondere unter serumhaltigen, serumarmen und serumfreien Zellkulturbedingungen gleichermaßen aktiv ist. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich um einen induzierbaren Promotor, insbesondere um einen Promotor, der durch Serumentzug aktiviert wird.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform ist ein Promotor mit einer Nukleotidsequenz, die in Fig. 5 der WO 97/15664 enthalten ist. Besonders bevorzugt sind dabei Promotorsequenzen, in denen die Sequenz von Position -161 bis - 45 von Fig. 5 enthalten ist. Die in den Beispielen der vorliegenden Patentbeschreibung verwendeten Promotoren beinhalten jeweils ein DNA-Molekül mit der Sequenz von Position 1923 bis 2406 der SEQ ID NO:55 des beiliegenden Sequenzprotokolls. Diese Sequenz entspricht dem Fragment - 372 bis + 111 aus Fig. 5 der WO 97/15664 und repräsentiert den bevorzugten Promotor, d.h. ein bevorzugter Promotor sollte diesen Sequenzbereich umfassen. Ein anderes geeignetes Promotorfragment enthält die Sequenz von Position 2134 bis 2406 (entspricht - 161 bis + 111 in Fig. 5 der WO 97/15664). Ein Promotor, der lediglich die Sequenz von Position 2251 bis 2406 beinhaltet, ist nicht mehr funktionsfähig (entspricht Position - 45 bis + 111 in Fig. 5 der WO 97/15664). Eine Verlängerung der Promotorsequenz in 5'-Richtung ausgehend von Position 2134 ist möglich.
Es können auch funktioneile Subfragmente der vollständigen Hamster- Ubiquitin/S27a-Promotorsequenz sowie funktionelle Mutanten/Varianten der vollständigen Sequenz oder Subfragmente hiervon eingesetzt werden, die z.B. durch Substitutionen, Insertionen oder Deletionen modifiziert worden sind. Entsprechende Subfragmente, Mutanten oder Varianten werden nachfolgend auch als „modifizierter Promotor" bezeichnet.
Ein modifizierter Promotor, gegebenenfalls kombiniert mit weiteren regulatorischen Elementen, weist vorzugsweise eine Transkriptionsaktivität auf, die der des Promotorfragments von Position 1923 bis 2406 der in SEQ ID NO:55 angegebenen Nukleotidsequenz (- 372 bis + 111 aus Fig. 5 der WO 97/15664) entspricht. Ein modifizierter Promotor erweist sich als tauglich im Sinne der Erfindung, wenn er über eine Transkripitionsaktivität verfügt, die mindestens 50%, besser mindestens 80%, noch besser mindestens 90%, und noch mehr bevorzugt mindestens 100% der Aktivität des 1923 bis 2406 Fragments (- 372 bis + 111 Fragments) in einem vergleichenden Reportergen-Assay aufweist. Insbesondere bevorzugt sind modifizierte Promotoren, die eine minimale Sequenzhomologie zur Wildtyp-Sequenz SEQ ID NO:55 des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors von mindestens 80%, besser mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95% und besonders bevorzugt mindestens 97% aufweisen und über eine entsprechende Promotoraktivität in einem vergleichenden Reportergen-Assay verfügen. In einem entsprechenden vergleichenden Reportergen-Assay werden die zu testenden Promotorfragmente einschließlich der Referenzsequenz jeweils vor ein promotorloses Reportergen Moniert, das z.B. für Luciferase, sezernierte Alkalische Phosphatase oder grünes fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert. Diese Konstrukte (Promotorsequenz + Reportergen) werden anschließend in die Testzellen, z.B. CHO- DG44, mittels Transfektion eingeführt und die Induktion der Reportergenexpression durch das jeweilige Promotorfragment über die Bestimmung des Proteingehalts des Reportergens ermittelt. Ein entsprechender Test findet sich beispielhaft auch in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, updated.
Die Promotorsequenz des Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotors sowie die modifizierter Promotoren, die z.B. auch die 5 '-untranslatierte Region bzw. ausgewählte Fragmente hiervon umfassen können, und die kodierende Region sowie die 3'- untranslatierte Region des Ubiquitin/S27a-Gens bzw. ausgewählte Fragmente hiervon, können von einem Fachmann in Kenntnis der in der WO 97/15664 beschriebenen Sequenz mit verschiedenen Standardmethoden erhalten werden, wie z.B. in Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994 beschrieben. Ausgehend von der in WO 97/15664 beschriebenen Sequenz kann beispielsweise ein geeigneter Abschnitt ausgewählt und eine Oligonukleotid-Sonde chemisch synthetisiert werden, die die Sequenz dieses Abschnitts enthält. Mit einer solchen Sonde kann z.B. durch Hybridisierung aus einer genomischen Bibliothek des Hamsters das Ubiquitin/S27a- Gen bzw. dessen 5 '-untranslatierte Region oder sonstige Fragmente kloniert werden. Mittels des oben beschrieben Reportergen-Assays ist der Fachmann in der Lage, ohne erheblichen Aufwand promotoraktive Fragmente zu identifizieren und im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Die 5'-untranslatierte Region bzw. spezielle Fragmente davon können auch leicht durch PCR-Amplifikation mit entsprechenden Primern aus genomischer DNA oder einer genomischen Bibliothek erhalten werden. Fragmente der 5'-untranslatierten Region können auch durch limitierten Exonuklease Ill-Verdau aus größeren DNA-Fragmenten erhalten werden. Solche DNA-Moleküle können auch chemisch synthetisiert oder aus chemisch synthetisierten Fragmenten durch Ligation erzeugt werden. Deletions-, Insertions- und Substitutionsmutanten lassen sich mittels „ortsspezifischer Mutagenese" und / oder „PCR-basierten Mutagenese-Techniken" erzeugen. Entsprechende Methoden sind beispielhaft in Lottspeich und Zorbas (1998) (Kapitel 36.1), mit weiteren Verweisen, aufgeführt.
Es ist auch möglich über Kreuzhybridisierung mit Sonden aus dem 5'- untranslatierten Bereich des Hamster-Ubiquitin/S27a-Gens oder aus dem S27a- Anteil des Hamster-Ubiquitin/S27a-Gens bzw. der 3'-untranslatierten Region geeignete Promotorsequenzen aus korrespondierenden homologen Genen anderer, bevorzugt Säugerspezies, zu identifizieren und zu isolieren. Entsprechende Techniken sind beispielhaft in Lottspeich und Zorbas (1998) (Kapitel 23) beschrieben. „Homolog" im Sinne der Erfindung sind Gene, sofern ihre Nukleotidsequenz mindestens 70%, besser mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95% und besonders bevorzugt mindestens 97% Übereinstimmung mit der Nukleotidsequenz des Gens zeigt, zu dem es homolog ist.
Durch die geschilderten Maßnahmen kann eine optimierte Expressionskassette erhalten werden, die von hohem Nutzen für die Expression heterologer Genprodukte ist. Eine durch eine oder mehrere solcher Maßnahmen erhaltene Expressions- kassette ist daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Herstellung erfindungsgemäßer Expressionsvektoren
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionsvektors kann grundsätzlich nach herkömmlichen, dem Fachmann geläufigen Methoden, wie z.B. bei Sambrock et al. (1989) beschrieben, erfolgen. Dort findet sich auch eine Beschreibung der funktioneilen Komponenten eines Vektors, z.B. geeigneter Promotoren (zusätzlich zum Hamster-Ubiquitin/S27a-Promotor), Enhancer, Terminations- und Polyadenylierungssignale, Antibiotikaresistenzgene, Selektionsmarker, Replikationsstartpunkte und Spieisssignale. Zur Herstellung können herkömmliche Klonierungsvektoren verwendet werden, z.B. Plasmide, Bakteriophagen, Phagemide, Cosmide oder virale Vektoren wie Baculovirus, Retroviren, Adenoviren, Adeno- assoziierte Viren und Herpes Simplex-Virus, aber auch künstliche Chromosomen/Mini-Chromosomen. Die eukaryontischen Expressionsvektoren enthalten typischerweise auch prokaryontische Sequenzen wie z.B. Replikationsursprung und Antibiotikaresistenzgene, die die Vermehrung und Selektion des Vektors in Bakterien ermöglichen. Eine Vielzahl von eukaryontischen Expressionsvektoren, die multiple Klonierungsstellen zur Einführung einer Polynukleotidsequenz enthalten, sind bekannt und einige sind kommerziell bei verschiedenen Firmen wie Stratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, Wl, USA oder BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA erhältlich.
Auf eine dem Fachmann geläufige Weise werden der heterologe Promotor, das Gen von Interesse, sowie das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen sowie gegebenenfalls das für ein fluoreszierendes Protein kodierende Gen, zusätzliche regulatorische Elemente wie die interne Ribosomenbindungsstelle (IRES), Enhancer oder ein Polyadenylierungssignal in den Expressionsvektor eingeführt. Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor enthält minimal einen heterologen Promotor, das Gen von Interesse und ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen. Vorzugsweise enthält der Expressionsvektor noch ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Gen. Erfindungsgemäß ist insbesondere die Verwendung eines Ubiquitin/S27a-Promotors als heterologen Promotor. Besonders bevorzugt ist ein Expressionsvektor, bei dem der heterologe Promotor, vorzugsweise ein Ubiquitin/S27a-Promotor, das Gen von Interesse und das Gen, welches für ein fluoreszierendes Protein kodiert, funktionell miteinander verknüpft sind oder in funktioneller Verknüpfung stehen und das Neomycin-Phosphotransferase-Gen in der selben oder aber in einer separaten Transkriptionseinheit lokalisiert ist.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Ausdruck „funktioneile Verknüpfung" bzw. „funktionell verknüpft" auf zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen oder -teilsequenzen, die so positioniert sind, dass sie ihre beabsichtigte Funktion ausüben können. Beispielsweise ist ein Promotor/Enhancer funktionell mit einer kodierenden Gensequenz verknüpft, wenn er in cis-Stellung die Transkription der verknüpften Gensequenz kontrollieren oder modulieren kann. Im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, befinden sich funktionell verknüpfte DNA-Sequenzen in enger Nachbarschaft und, sofern zwei kodierende Gensequenzen verknüpft werden oder im Falle einer Sekretionssignalsequenz, im gleichen Leseraster. Obwohl sich ein funktionell verknüpfter Promotor im Allgemeinen stromaufwärts von der kodierenden Gensequenz befindet, muss er nicht notwendigerweise eng benachbart sein. Enhancer müssen ebenfalls nicht in enger Nachbarschaft vorliegen, solange sie die Transkription der Gensequenz begünstigen. Zu diesem Zweck können sie sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts von der Gensequenz vorliegen, gegebenenfalls in einigem Abstand. Eine Polyadenylierungsstelle ist funktionell mit einer Gensequenz verknüpft, wenn sie am 3'-Ende der Gensequenz derart positioniert ist, dass die Transkription über die kodierende Sequenz bis hin zum Polyadenylierungssignal fortschreitet. Die Verknüpfung kann nach üblichen rekombinanten Methoden erfolgen, z.B. mittels der PCR-Technik, durch Ligation an geeigneten Restriktionsschnittstellen oder durch Spleissen. Wenn keine geeigneten Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, können in an sich bekannter Weise synthetische Oligonukleotid-Linker oder Adaptoren verwendet werden. Erfindungsgemäß erfolgt die funktioneile Verknüpfung vorzugsweise nicht über Intronsequenzen.
In einer der beschriebenen Ausführungsformen sind der heterologe Promotor, vorzugsweise ein Ubiquitin/S27a-Promotor, das Gen von Interesse und das für ein fluoreszierendes Protein kodierende Gen funktionell miteinander verknüpft. Dies meint z.B., dass sowohl das Gen von Interesse als auch das für ein fluoreszierendes
Protein kodierende Gen ausgehend von dem selben heterologen Promotor exprimiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die funktionelle Verknüpfung über ein IRES-Element, so dass von beiden Genen eine bicistronische mRNA synthetisiert wird. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann zusätzlich
Enhancer-Elemente enthalten, die funktionell auf einen oder mehrere Promotoren wirken. Besonders bevorzugt ist ein Expressionsvektor, bei dem der heterologe
Promotor, vorzugsweise der Ubiquitin/S27a-Promotor bzw. eine modifizierte Form hiervon, mit einem Enhancer-Element, z.B. einen SV40-Enhancer oder einem CMV-
Enhancer-Element, verknüpft ist. Grundsätzlich kann die Expression der Gene innerhalb eines Expressionsvektors von einer oder mehreren Transkriptionseinheiten aus erfolgen. Als „Transkriptionseinheit" wird dabei eine Region definiert, die ein oder mehr zu transkribierende Gene enthält. Dabei sind die Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit funktionell derart miteinander verknüpft, dass alle Gene innerhalb einer solchen Einheit unter der transkriptionellen Kontrolle desselben Promotors oder Promotors/Enhancers stehen. Als Resultat dieser transkriptioneilen Verknüpfung von Genen kann mehr als ein Protein oder Produkt von einer Transkriptionseinheit aus transkribiert und somit exprimiert werden. Jede Transkriptionseinheit enthält dabei die regulatorischen Elemente, die für die Transkription und die Translation der in ihr enthaltenen Gensequenzen erforderlich sind. Jede Transkriptionseinheit kann dabei die gleichen oder verschiedene regulatorische Elemente enthalten. Für die funktioneile Verknüpfung der Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit können IRES-Elemente oder Introns verwendet werden.
Der Expressionsvektor kann eine einzige Transkriptionseinheit zur Expression des Gens von Interesse, des modifizierten NPT-Gens und gegebenenfalls des Gens, das für das Fluoreszenzprotein kodiert, enthalten. Alternativ können diese Gene auch in zwei oder mehr Transkriptionseinheiten angeordnet sein. Dabei sind verschiedene Kombinationen der Gene innerhalb einer Transkriptionseinheit möglich. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann mehr als ein Expressionsvektor, bestehend aus ein, zwei oder mehr Transkriptionseinheiten, in eine Wirtszelle durch Co-Transfektion oder in aufeinanderfolgenden Transfektion in beliebiger Reihenfolge eingeführt werden. Jede Kombination von regulatorischen Elementen und Genen auf jedem Vektor kann gewählt werden, so lange eine ausreichende Expression der Transkriptionseinheiten gewährleistet ist. Falls erforderlich können weitere regulatorische Elemente und Gene, wie z.B. zusätzliche Gene von Interesse oder Selektionsmarker, auf den Expressionsvektoren positioniert werden.
Demnach kann ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor, enthaltend ein Gen von Interesse und ein Gen, das für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase kodiert, beide Gene in einer oder in zwei separaten Transkriptionseinheiten enthalten. Jede Transkriptionseinheit kann ein oder mehrere Genprodukte transkribieren und exprimieren. Wenn beide Gene in einer Transkriptionseinheit enthalten sind, stehen sie unter der Kontrolle desselben Promotors oder Promotors/Enhancers, wobei vorzugsweise ein IRES-Element verwendet wird, um die funktioneile Verknüpfung aller Komponenten zu gewährleisten. Wenn das Gen, das für modifizierte Neomycin-Phosphotransferase kodiert, und das Gen von Interesse in zwei separaten Transkriptionseinheiten enthalten sind, können sie unter der Kontrolle desselben oder verschiedener Promotoren/Enhancer stehen. Vorzugsweise verwendet man jedoch für das modifizierte NPT-Gen einen schwächeren heterologen Promotor, z.B. den SV40 early Promotor, und setzt vorzugsweise auch keinen Enhancer ein. Expressionsvektoren mit zwei separaten Transkriptionseinheiten sind im Rahmen der Erfindung bevorzugt. Hierbei enthält die eine (bicistronische) Transkriptionseinheit das Gen von Interesse und gegebenenfalls ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Gen, während die andere Transkriptionseinheit das modifizierte NPT-Gen enthält. Vorzugsweise ist jede Transkriptionseinheit am 3'-Ende durch eine Sequenz begrenzt, die für ein polyA- Signal, vorzugsweise BGH-polyA oder SV40 polyA kodiert.
Erfindungsgemäß sind auch solche Expressionsvektoren, die anstelle des Gens von Interesse lediglich eine multiple Klonierungsstelle aufweisen, die die Klonierung des Gens von Interesse über Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen ermöglicht. Im Stand der Technik sind zahlreiche Erkennungssequenzen für die verschiedensten Restriktionsendonukleasen, sowie die hierzu gehörigen Restriktionsendonukleasen bekannt. Bevorzugt werden Sequenzen verwendet, die aus zumindest 6 Nukleotiden als Erkennungssequenz bestehen. Eine Auflistung geeigneter Erkennungssequenzen finden sich beispielsweise in Sambrook et al., (1989).
Wirtszellen
Zur Transfektion mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor werden eukaryontische Wirtzellen verwendet, vorzugsweise Säugerzellen und insbesondere Nagerzellen wie z.B. Mäuse-, Ratten- und Hamster-Zelllinien. Die erfolgreiche Transfektion der entsprechenden Zellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor resultiert in transformierten, genetisch modifizierten, rekombinanten oder transgenen Zellen, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
Im Rahmen der Erfindung bevorzugte Wirtszellen sind Hamsterzellen wie z.B. BHK21, BHK TK", CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 und CHO-DG44 Zellen oder Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien. Besonders bevorzugt sind CHO- DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 und BHK21 Zellen, insbesondere CHO-DG44 und CHO-DUKX Zellen. Ebenfalls geeignet sind Myelomzellen der Maus, vorzugsweise NS0 und Sp2/0 Zellen sowie Derivate/Abkömmlinge dieser Zelllinien.
Beispiele für Hamster- und Mäusezellen, die erfindungsgemäß angewandt werden können, sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Aber auch Derivate und Abkömmlinge dieser Zellen, andere Säugerzellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Zelllinien von Mensch, Maus, Ratte, Affen, Nagetieren, oder eukaryontische Zellen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Hefe-, Insekten- und Pflanzenzellen, können ebenfalls als Wirtszellen zur Produktion von biopharmazeutischen Proteinen verwendet werden.
Tabelle 1 : Hamster- and Mäuse-Produktionszelllinien
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Die Transfektion der eukaryontischen Wirtszellen mit einem Polynukleotid oder einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektor erfolgt nach üblichen Methoden (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Geeignete Transfektionsmethoden sind z.B. die Liposomen-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Copräzipitation, Elektroporation, Polykationen (z.B. DEAE-Dextran)-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Mikroinjektion und virale Infektionen. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise eine stabile Transfektion durchgeführt, wobei die Konstrukte entweder in das Genom der Wirtszelle oder ein artifizielles Chromosom/Minichromosom integriert werden oder in stabiler Weise episomal in der Wirtszelle enthalten sind. Die Transfektionsmethode, die die optimale Transfektionsfrequenz und Expression des heterologen Gens in der jeweiligen Wirtszelle ermöglicht, ist dabei bevorzugt. Per Definition wird jede Sequenz oder jedes Gen, das in eine Wirtszelle eingebracht wird, in Bezug auf die Wirtszelle als „heterologe Sequenz" oder „heterologes Gen" bezeichnet. Selbst dann, wenn die einzubringende Sequenz oder das einzubringende Gen identisch zu einer endogenen Sequenz oder einem endogenen Gen der Wirtszelle ist. Beispielsweise ist ein Hamster Aktingen, das in eine Hamster- Wirtszelle eingebracht wird, per Definition ein heterologes Gen.
Erfindungsgemäß sind insbesondere rekombinante Säugerzellen, vorzugsweise Nagerzellen, besonders bevorzugt Hamsterzellen, wie z.B. CHO- oder BHK-Zellen, die mit einem der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transfiziert wurden.
Bei der rekombinanten Herstellung heteromerer Proteine, wie z.B. monoklonaler Antikörper (mAk), kann die Transfektion geeigneter Wirtszellen prinzipiell auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen. Derartige mAk sind aus mehreren Untereinheiten, den schweren und leichten Ketten, aufgebaut. Für diese Untereinheiten kodierende Gene können in unabhängigen oder in multicistronischen Transkriptionseinheiten auf einem einzigen Plasmid untergebracht werden, mit dem dann die Wirtszelle transfiziert wird. Dies soll die stöchiometrische Repräsentanz der Gene nach Integration in das Genom der Wirtszelle sichern. Allerdings muss hierbei im Falle unabhängiger Transkriptionseinheiten sichergestellt werden, dass die mRNAs, die für die verschiedenen Proteine kodieren, die gleiche Stabilität, Transkriptions- und Translationseffizienz aufweisen. Im zweiten Fall erfolgt die Expression der Gene innerhalb einer multicistronischen Transkriptionseinheit durch einen einzigen Promotor und es entsteht nur ein Transkript. Durch Verwendung von IRES- Elementen wird eine recht effiziente interne Translationsinitiation der Gene in dem zweiten und den nachfolgenden Cistrons ermöglicht. Dennoch sind die Expressionsraten für diese Cistrons geringer als die des ersten Cistrons, dessen Translationsinitiation über einen sogenannten „cap"-abhängigen Prä- Initiationskomplex wesentlich effizienter ist als die IRES-abhängige Translationsinitiation. Um eine tatsächlich äquimolare Expression der Cistrons zu erreichen, können beispielsweise noch zusätzliche intercistronische Elemente eingeführt werden, die im Zusammenwirken mit den IRES-Elementen für einheitliche Expressionsraten sorgen (WO 94/05785).
Eine andere und erfindungsgemäß bevorzugte Möglichkeit der simultanen Herstellung mehrerer heterologer Proteine ist die Co-Transfektion, bei der die Gene getrennt in verschiedene Expressionsvektoren integriert werden. Dies hat den Vorteil, dass bestimmte Verhältnisse der Gene und Genprodukte zueinander eingestellt werden können, wodurch Unterschiede in der mRNA-Stabilität sowie in der Transkriptions- und Translationseffizienz ausgeglichen werden können. Außerdem sind die Expressionsvektoren wegen ihrer geringeren Größe stabiler und sowohl bei der Klonierung als auch bei der Transfektion einfacher handhabbar.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden daher die Wirtszellen zusätzlich mit einem oder mehreren Vektoren mit Genen, die für ein oder mehrere andere Proteine von Interesse kodieren, transfiziert, bevorzugt co-transfiziert. Der oder die zur Co-Transfektion verwendeten weiteren Vektoren kodieren z.B. für das oder die anderen Proteine von Interesse unter der Kontrolle der gleichen Promotor/Enhancer-Kombination sowie für zumindest einen weiteren Selektionsmarker, z.B. die Dihydrofolat-Reduktase.
Erfindungsgemäß werden die Wirtszellen vorzugsweise unter serumfreien Bedingungen etabliert, adaptiert und kultiviert, gegebenenfalls in Medien, die frei von tierischen Proteinen /Peptiden sind. Beispiele für im Handel erhältliche Medien sind Harn 's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S-SFMII (Invitrogen), serumfreies CHO-Medium (Sigma) und proteinfreies CHO-Medium (Sigma). Jedes dieser Medien kann gegebenenfalls mit verschiedenen Verbindungen ergänzt werden, z.B. Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z.B. Insulin, Transferrin, epidermalem Wachstumsfaktor, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor), Salzen (z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium, Phosphat), Puffern (z.B. HEPES), Nukleosiden (z.B. Adenosin, Thymidin), Glutamin, Glukose oder anderen äquivalenten Nährstoffen, Antibiotika und/oder Spurenelementen. Obwohl erfindungsgemäß serumfreie Medien bevorzugt sind, können zur Züchtung der Wirtszellen und zur späterem Proteinproduktion auch Medien verwendet werden, die mit einer geeigneten Menge an Serum versetzt wurden. Zur Selektion von genetisch modifizierten Zellen, die ein oder mehrere Selektionsmarkergene exprimieren, wird dem Medium ein oder mehrere geeignete Selektionsmittel zugefügt.
Als „Selektionsmittel" wird eine Substanz bezeichnet, die das Wachstum oder das Überleben von Wirtszellen mit einer Defizienz für das jeweilige Selektionsmarkergen beeinträchtigt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise Geneticin (G418) als Mediumzusatz zur Selektion heterologer Wirtszellen, die ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen tragen, verwendet. Vorzugsweise werden G418- Konzentrationen zwischen 100 und 800 μg/ml Medium verwendet, besonders bevorzugt sind 300 bis 400 μg/ml Medium. Sollten die Wirtzellen mit mehreren Expressionsvektoren transfiziert werden, z.B. wenn separat mehrere Gene von Interesse in die Wirtszelle eingebracht werden sollen, so verfügen diese meist über verschiedene Selektionsmarkergene.
Ein „Selektionsmarkergen" ist ein Gen, das die spezifische Selektion von Zellen, die dieses Gen erhalten, durch Zugabe eines entsprechenden Selektionsmittels in das Kultivierungsmedium ermöglicht. Zur Verdeutlichung, ein Antibiotika-Resistenzgen kann als positiver Selektionsmarker verwendet werden. Nur Zellen, die mit diesem Gen transformiert wurden, können in der Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums wachsen und somit selektioniert werden. Nichttransfomierte Zellen hingegen können unter diesen Selektionsbedingungen nicht wachsen oder überleben. Es gibt positive, negative und bifunktionale Selektionsmarker. Positive Selektionsmarker ermöglichen die Selektion und damit Anreicherung von transformierten Zellen durch Vermittlung einer Resistenz gegenüber dem Selektionsmittel oder durch Kompensierung eines metabolischen oder katabolischen Defekts der Wirtszelle. Im Gegensatz dazu können durch negative Selektionsmarker Zellen, die das Gen für den Selektionsmarker erhalten haben, selektiv eliminiert werden. Ein Beispiel hierfür ist das Thymidinkinasegen des Herpes Simplex Virus, dessen Expression in Zellen bei gleichzeitiger Gabe von Acyclovir oder Gancyclovir zu deren Elimination führt. Die in dieser Erfindung verwendeten Selektionsmarker, einschließlich der amplifzierbaren Selektionsmarker, schließt gentechnologisch veränderte Mutanten und Varianten, Fragmente, funktionelle Äquivalente, Derivate, Homologe und Fusionen mit anderen Proteinen oder Peptiden ein, solange der Selektionsmarker seine selektiven Eigenschaften beibehält. Solche Derivate weisen eine beträchtliche Homologie in der Aminosäuresequenz in den Bereichen oder Domänen auf, denen die selektive Eigenschaft zugeschrieben wird. In der Literatur sind eine Vielzahl von Selektionsmarkergenen, einschließlich bifunktionaler (positiv/negativ) Marker, beschrieben (siehe z.B. WO 92/08796 und WO 94/28143). Beispiele für Selektionsmarker, die für gewöhnlich in eukaryontischen Zellen verwendet werden, beinhalten die Gene für Aminoglykosid-Phosphotransferase (APH), Hygromycin-Phosphotransferase (HYG), Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), Thymidinkinase (TK), Glutamin-Synthetase, Asparagin-Synthetase und Gene, die Resistenz gegenüber Neomycin (G418), Puromycin, Histidinol D, Bleomycin, Phleomycin und Zeocin vermitteln.
Eine Selektion von transformierten Zellen ist auch durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) möglich. Hierzu werden beispielsweise bakterielle ß- Galaktosidase, Zelloberflächenmarker oder fluoreszierende Proteine (z.B. grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und dessen Varianten von Aequorea victoria und Renilla reniformis oder anderer Spezies; rote fluoreszierende Proteine und in anderen Farben fluoreszierende Proteine und deren Varianten von nicht- biolumineszierenden Organismen wie z.B. Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.) zur Selektion von transformierten Zellen eingesetzt.
Genexpression und Selektion hoch produzierender Wirtszellen
Der Ausdruck „Genexpression" bezieht sich auf die Transkription und/oder Translation einer heterologen Gensequenz in einer Wirtszelle. Die Expressionsrate kann hierbei allgemein bestimmt werden, entweder auf Basis der Menge der entsprechenden mRNA, die in der Wirtszelle vorhanden ist, oder auf Basis der produzierten Menge an Genprodukt, das von dem Gen von Interesse kodiert wird. Die Menge der durch Transkription einer ausgewählten Nukleotidsequenz erzeugten mRNA kann beispielsweise durch Northern Blot Hybridisierung, Ribonuklease-RNA- Protektion, in situ Hybridisierung von zellulärer RNA oder durch PCR-Methoden bestimmt werden (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Proteine, die von einer ausgewählten Nukleotidsequenz kodiert werden, können ebenfalls durch verschiedene Methoden, wie z.B. durch ELISA, Western Blot, Radioimmunassay, Immunpräzipitation, Nachweis der biologischen Aktivität des Proteins oder durch Immunfärbung des Proteins mit nachfolgender FACS-Analyse, bestimmt werden (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994).
Mit „hohem Expressionslevel (-rate)", „hoher Expression", „verstärkter Expression" oder „hoher Produktivität" wird die anhaltende und ausreichend hohe Expression oder Synthese einer in eine Wirtszelle eingebrachten heterologen Sequenz, beispielsweise eines für ein therapeutisches Protein kodierenden Gens, bezeichnet. Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt vor, wenn eine erfindungsgemäße Zelle nach einem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ohne Genamplifikation kultiviert wird, und wenn diese Zelle zumindest mehr als ungefähr 0,5 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (0,5 pg/Zelle/Tag). Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt auch dann vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle ohne vorherige Genamplifikation zumindest mehr als ungefähr 1 ,0 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (1 ,0 pg/Zelle/Tag). Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt insbesondere auch vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle ohne vorherige Genamplifikation zumindest mehr als ungefähr 1 ,5 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (1,5 pg/Zelle/Tag). Eine verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine hohe Produktivität liegt insbesondere dann vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle ohne vorherige Genamplifikation zumindest mehr als ungefähr 2,0 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (2,0 pg/Zelle/Tag). Eine besonders verstärkte oder hohe Expression bzw. ein(e) besonders hohe(r) Expressionslevel (-rate) oder eine besonders hohe Produktivität liegt dann vor, wenn die erfindungsgemäße Zelle ohne vorherige Genamplifikation zumindest mehr als ungefähr 3,0 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (3,0 pg/Zelle/Tag). Durch einen einfachen Genamplifikationsschritt, z.B. mit Hilfe des DHFR/MTX-Amplifikationssystems, wie nachfolgend beschrieben, lassen sich die Produktivitäten um zumindest einen Faktor 2 bis 10 steigern, so dass man in Bezug auf eine Zelle, die einem Genamplifikationsschritt unterzogen wurde, von einer „hohen Expression", „verstärkten Expression" oder „hohen Produktivität" spricht, wenn diese Zelle zumindest mehr als ungefähr 5 pg des gewünschten Genprodukts pro Tag produziert (5 pg/Zelle/Tag), vorzugsweise zumindest mehr als ungefähr 10 pg/Zelle/Tag, besonders bevorzugt zumindest mehr als ungefähr 15 pg/Zelle/Tag, noch weiter bevorzugt zumindest mehr als ungefähr 20 pg/Zelle/Tag, bzw. zumindest mehr als ungefähr 30 pg/Zelle/Tag.
Eine hohe oder verstärkte Expression, eine hohe Produktivität oder ein(e) hohe(r) Expressionslevel (-rate) kann sowohl durch Verwendung einer der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren als auch durch Anwendung eines der erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden.
Beispielsweise können durch die Co-Expression des Gens von Interesse und eines modifizierten NPT-Gens Zellen selektioniert und identifiziert werden, die das heterologe Gen in hohem Maße exprimieren. Die modifizierte NPT ermöglicht im Vergleich zur wtNPT eine effizientere Selektion von stabil transfizierten Wirtszellen mit hoher Expression des heterologen Gens von Interesse. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Expression von mindestens einem Gen von Interesse in rekombinanten Säugerzellen, dadurch gekennzeichnet, dass (i) ein Pool von Säugerzellen mit mindestens einem Gen von Interesse und einem Gen für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase transfiziert wird, die im Vergleich zur Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase lediglich 1 bis 80% der Aktivität aufweist, vorzugsweise lediglich 1 bis 60%, weiter bevorzugt lediglich 1,5 bis 30%, im Besonderen 1 ,5% bis 26%; (ii) die Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens (Gene) von Interesse und des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens erlauben; (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, vorzugsweise G418, das selektiv auf das Wachstum der Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin- Phosphotransferase-Gen exprimieren; und (iv) das (die) Protein(e) von Interesse aus den Säugerzellen oder dem Kulturüberstand gewonnen wird (werden). Vorzugsweise werden hierbei rekombinante Säugerzellen verwendet, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfiziert worden sind.
Ferner ist auch ein Verfahren zur Selektion von rekombinanten Säugerzellen Gegenstand der Erfindung, die mindestens ein Gen von Interesse exprimieren, wobei
(i) ein Pool von Säugerzellen mit mindestens einem Gen von Interesse und einem
Gen für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase transfiziert wird, die im
Vergleich zur Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase lediglich 1 bis 80% der Aktivität aufweist, vorzugsweise lediglich 1 bis 60%, weiter bevorzugt lediglich 1 ,5 bis 30%, im Besonderen 1,5% bis 26%; (ii) die Säugerzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens(Gene) von Interesse und des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens eriauben; und (iii) die
Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, vorzugsweise G418, das selektiv auf das Wachstum der Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-
Phosphotransferase-Gen exprimieren. Besonders bevorzugt sind Verfahren zur Expression von zumindest einem Gen von Interesse und zur Selektion von rekombinanten Zellen, die ein entsprechendes Gen von Interesse exprimieren, wenn ein in dieser Anmeldung näher beschriebenes modifiziertes NPT-Gen verwendet wird, insbesondere wenn ein modifiziertes NPT- Gen verwendet wird, das im Vergleich zum Wildtyp-Gen an Aminosäureposition 182 für Glycin oder Asparaginsäure, an Aminosäureposition 91 für Alanin, an Aminosäureposition 198 für Glycin, an Aminosäureposition 227 für Alanin, Glycin oder Valin, an Aminsäureposition 261 für Glycin oder Asparagin oder an Aminosäureposition 240 für Isoleucin kodiert. Im Besonderen bevorzugt ist die Verwendung der Asp227Val-, Asp227Gly-, Asp261Gly-, Asp261Asn-, Phe240lle- oder Trp91Ala-Mutante. Generell eignen sich für ein entsprechendes Verfahren alle in dieser Patentschrift erwähnten, modifizierten erfindungsgemäßen Neomycin- Phosphotransferase-Gene. Zu den bevorzugten Neomycin-Phosphotransferase- Genen siehe unter dem Abschnitt - modifizierte Neomycin-Phosphotransferase- Gene.
Die Selektion der Zellen, die ein Gen von Interesse und ein modifiziertes NPT-Gen exprimieren, erfolgt z.B. durch Zugabe von G418 als Selektionsmittel. Möglich ist allerdings auch die Verwendung von anderen aminoglykosidischen Antibiotika wie z.B. Neomycin oder Kanamycin. Bevorzugt ist hierbei die Kultivierung und Selektion der erfindungsgemäßen Zellen in 200 bis 800 μg G418 pro mL Kulturmedium. Als besonders bevorzugt hat sich die Zugabe von 300 bis 700 μg G418 pro mL Kulturmedium herausgestellt. Die Zugabe von ungefähr 400 μg G418 pro mL Kulturmedium stellt die am meisten bevorzugte Ausführungsform dar. Mit einem entsprechenden Verfahren konnten rekombinante Zellen mit besonders hoher Expressionsrate selektioniert werden. Im Vergleich zur Verwendung der wtNPT als Selektionsmarker wiesen die Zellen nach Selektion mit 400 μg G418 pro mL Kulturmedium im Fall der Glu182Gly-, Glu182Asp- und Val198Gly-Mutante eine um Faktor 1 ,4-2,4, im Fall der Asp227Gly-Mutante eine um Faktor 1 ,6-4,1, im Fall der Asp227Ala- bzw. Trp91Ala-Mutante eine um Faktor 2,2 bzw. 4, im Fall der Phe240lle- bzw. Asp261Asn-Mutante eine um Faktor 5,7 bzw. 7,3 und im Fall der Asp261Gly- bzw. Asp227Val-Mutante eine sogar um Faktor 9,3 bzw. 14,6 erhöhte Produktivität auf. Die spezifischen Produktivitäten für die jeweiligen modifizierten NPT-Gene sind in Abb.6 dargestellt.
Die entsprechenden Verfahren können mit einer durch FACS gestützten Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die als weiteren Selektionsmarker beispielsweise ein (oder mehrere) Fluoreszenzprotein(e) (z.B. GFP) oder einen Zelloberflächenmarker enthalten, kombiniert werden. Andere Methoden zur Erzielung einer verstärkten Expression, wobei auch eine Kombination verschiedener Methoden möglich ist, beruhen beispielsweise auf der Verwendung von (artifiziellen) Transkriptionsfaktoren, Behandlung der Zellen mit natürlichen oder synthetischen Agenzien zur Hochregulation endogener oder heterologer Genexpression, Verbesserung der Stabilität (Halbwertszeit) der mRNA oder des Proteins, Verbesserung der mRNA- Translationsinitiation, Erhöhung der Gendosis durch Verwendung von episomalen Plasmiden (basierend auf der Verwendung von viralen Sequenzen als Replikationsursprung, z.B. von SV40, Polyoma, Adenovirus, EBV oder BPV), Einsatz von amplifikationsfördernden Sequenzen (Hemann et al., 1994) oder auf DNA- Konkatemeren basierenden in vitro Amplifikationssystemen (Monaco et al., 1996).
Eine gekoppelte Transkription des Gens von Interesse und des Gens, das für das fluoreszierende Protein kodiert, hat sich als besonders effektiv im Zusammenhang mit der Verwendung eines modifizierten NPT-Gens als Selektionsmarker herausgestellt. Von der resultierenden bicistronischen mRNA werden sowohl das Protein/Produkt von Interesse als auch das fluoreszierende Protein exprimiert. Aufgrund dieser Kopplung der Expression des Proteins von Interesse und des fluoreszierenden Proteins ist es erfindungsgemäß leicht möglich, hochproduzierende rekombinante Wirtszellen über das exprimierte fluoreszierende Protein zu identifizieren und zu isolieren, z.B. durch Sortieren mit Hilfe eines Fluoreszenzaktivierten Zellsortiergeräts (FACS).
Die Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die eine hohe Vitalität und eine erhöhte Expressionsrate des gewünschten Genprodukts zeigen, ist ein mehrstufiger Prozess. Die mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfizierten oder gegebenenfalls einem weiteren Vektor z.B. co-transfizierten Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die eine Selektion der Zellen erlauben, die die modifizierte NPT exprimieren, z.B. durch Kultivierung in Gegenwart eines Selektionsmittel wie etwa G418 in Konzentrationen von 100, 200, 400, 600, 800μg oder mehr G418/mL Kulturmedium. Anschließend werden die entsprechenden Zellen zumindest auf die Expression des mit dem Gen von Interesse gekoppelten Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, untersucht, um die Zellen/Zellpopulation zu identifizieren und herauszusortieren, die die höchsten Expressionsraten an fluoreszierendem Protein zeigen. Vorzugsweise werden nur die Zellen aussortiert und weiter kultiviert, die zu den 10 - 20% Zellen mit der höchsten Expressionsrate an fluoreszierendem Protein gehören. In der Praxis bedeutet dies, dass die hellsten 10% der fluoreszierenden Zellen heraussortiert und weiter kultiviert werden. Entsprechend können auch die hellsten 5%, vorzugsweise die hellsten 3%, oder auch nur die hellsten 1% der fluoreszierenden Zellen eines Zellgemisches heraussortiert und vermehrt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden lediglich die hellsten 0,5% bzw. die hellsten 0,1% der fluoreszierenden Zellen heraussortiert und vermehrt.
Der Selektionsschritt kann an Zellpools oder mit bereits vorsortierten Zellpools/ Zellklonen durchgeführt werden. Es können ein oder mehrere, vorzugsweise zwei oder mehr und insbesondere drei oder mehr Sortierungsschritte durchgeführt werden, wobei zwischen den einzelnen Sortierungsschritten die Zellen über einen bestimmten Zeitraum, z.B. etwa zwei Wochen bei Pools, kultiviert und vermehrt werden. In den Abbildungen 11 und 12 sind spezifische Produktivitäten nach FACS- basiertem Sortieren mit und ohne Genamplifiationsschritt beispielhaft für die Mutante Asp227Gly dargestellt.
Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Gewinnung und Selektion von rekombinanten Säugerzellen, die mindestens ein heterologes Gen von Interesse exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass (i) rekombinante Säugerzellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transfiziert werden; (ii) die transfizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens (e) von Interesse, des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens ermöglicht; (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren; und (iv) die Säugerzellen mittels flowzytometrischer Analyse aussortiert werden, die eine besonders hohe Expression des fluoreszierenden Gens zeigen. Optional können die Schritte ii) - iv) mit den nach Schritt iv) gewonnenen Zellen einfach oder mehrfach wiederholt werden.
Bevorzugt ist ein entsprechendes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die aussortierten Säugerzellen eine durchschnittliche spezifische Produktivität ohne zusätzlichen Genamplifikationsschritt von größer 0,5pg des (der) gewünschten
Genprodukts (Genprodukte) pro Tag und Zelle (0,5 pg/Zelle/Tag), vorzugsweise von größer 1 pg/Zelle/Tag, besonders bevorzugt von größer 2 pg/Zelle/Tag, weiter bevorzugt von größer 3 pg/Zelle/Tag, noch weiter bevorzugt von größer 4,pg/Zelle/Tag, beispielsweise von größer 5, 6, 7, 8, 9, 10 usw., von größer 15, 20,
25 pg/Zelle/Tag usw. besitzen. Wie oben erwähnt, lässt sich die Produktivität dieser
Zellen durch einen einfachen Genamplifikationsschritt, beispielsweise unter
Verwendung des DHFR/MTX-Systems um zumindest einen Faktor 2 bis 10 steigern.
Beispielhaft ist dies in Abbildung 12 für die Selektion mit Hilfe der NTP-Mutante Asp227Gly dargestellt. Die spezifischen Produktivitäten lagen zwischen 20 und 25 pg/Zelle/Tag.
Weiterhin erfindungsgemäß ist ein Verfahren, bei dem entsprechend aussortierte Zellen vermehrt werden und zur Herstellung des kodierenden Genprodukt von Interesse verwendet werden. Hierzu werden die selektionierten hoch-produzierenden Zellen vorzugsweise in einem serumfreien Kulturmedium und vorzugsweise in Suspensionskultur unter Bedingungen gezüchtet, die eine Expression des Gens von Interesse erlauben. Das Protein/Produkt von Interesse wird dabei vorzugsweise als sekretiertes Genprodukt aus dem Zellkulturmedium gewonnen. Bei Expression des Proteins ohne Sekretionssignal kann das Genprodukt aber auch aus Zelllysaten isoliert werden. Um ein reines, homogenes Produkt zu erhalten, das im Wesentlichen frei ist von anderen rekombinanten Proteinen und Wirtszellproteinen, werden übliche Reinigungsschritte durchgeführt. Hierzu entfernt man häufig zunächst Zellen und Zelltrümmer aus dem Kulturmedium oder Lysat. Das gewünschte Genprodukt kann dann von kontaminierenden löslichen Proteinen, Polypeptiden und Nukleinsäuren befreit werden, z.B. durch Fraktionierung an Immunaffinitäts- und lonenaustauschsäulen, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC oder Chromatographie an Sephadex, Silica oder Kationenaustauscherharzen wie DEAE. Methoden, die zur Aufreinigung eines von rekombinanten Wirtszellen exprimierten heterologen Proteins führen, sind dem Fachmann bekannt und sind in der Literatur beschrieben, z.B. bei Harris et al. (1995) und Scopes (1988).
Amplifizierbares Selektionsmarkergen
Ferner können die erfindungsgemäßen Zellen optional auch einem oder mehreren Genamplifikationsschritten unterzogen werden, in dem sie in Gegenwart eines Selektionsmittels kultiviert werden, das zu einer Amplifikation eines amplifzierbaren Selektionsmarkergens führt. Dieser Schritt kann sowohl mit Zellen erfolgen, die ein fluoreszentes Protein exprimieren und vorzugsweise mittels FACS einfach oder mehrfach sortiert wurden (vorzugsweise in einer der hier beschriebenen Art und Weise) als auch mit nicht sortierten Zellen.
Voraussetzung ist, dass die Wirtszellen zusätzlich mit einem Gen transfiziert werden, das für einen amplifizierbaren Selektionsmarker kodiert. Denkbar ist, dass das Gen, welches für einen amplifizierbaren Selektionsmarker kodiert, auf einem der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren vorhanden ist oder aber mit Hilfe eines weiteren Vektors in die Wirtszelle eingebracht wird.
Das amplifizierbare Selektionsmarkergen kodiert gewöhnlich für ein Enzym, das für das Wachstum von eukaryontischen Zellen unter bestimmten Kultivierungsbedingungen erforderlich ist. Beispielsweise kann das amplifizierbare Selektionsmarkergen für Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) kodieren. In diesem Fall wird das Gen amplifiziert, wenn man eine damit transfizierte Wirtszelle in Gegenwart des Selektionsmittels Methotrexat (MTX) kultiviert. In der folgenden Tabelle 2 sind Beispiele für weitere erfindungsgemäß verwendbare amplifizierbare Selektionsmarkergene und die dazugehörigen Selektionsmittel angegeben, die in einem Überblick bei Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537- 566 (1990) beschrieben sind.
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Als amplifizierbares Selektionsmarkergen wird erfindungsgemäß ein Gen bevorzugt, das für ein Polypeptid mit der Funktion von DHFR kodiert, z.B. für DHFR oder ein Fusionsprotein aus dem fluoreszierenden Protein und DHFR. DHFR ist für die Biosynthese von Purinen erforderlich. Zellen, denen das DHFR-Gen fehlt, können in Purin-defizientem Medium nicht wachsen. Das DHFR-Gen ist deshalb ein nützlicher Selektionsmarker zur Selektion und Amplifikation von Genen in Zellen, die in Purin- freiem Medium kultiviert werden. Das Selektionsmittel, das in Verbindung mit dem DHFR-Gen verwendet wird, ist Methotrexat (MTX).
Die vorliegende Erfindung schließt deshalb eine Methode zur Herstellung und Selektion von rekombinanten Säugerzellen ein, die folgende Schritte enthält: (i) Transfektion der Wirtszellen mit Genen, die zumindest für ein Protein/Produkt von Interesse, eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase und DHFR kodieren; (ii) Kultivierung der Zellen unter Bedingungen, die eine Expression der verschiedenen Gene ermöglichen; und (iii) die Amplifikation dieser co-integrierten Gene durch Kultivierung der Zellen in Gegenwart eines Selektionsmittels, das die Amplifikation zumindest des amplifizierbaren Selektionsmarkergens erlaubt, wie z.B. Methotrexat. Bevorzugt werden die transfizierten Zellen hierbei in Hypoxanthin/Thymidin-freiem Medium in der Abwesenheit von Serum und unter Zugabe steigender Konzentrationen an MTX kultiviert. Vorzugsweise beträgt die Konzentration an MTX bei dem ersten Amplifikationsschritt zumindest 5 nM. Die Konzentration an MTX kann aber auch zumindest 20 nM oder 100 nM betragen und stufenweise auf bis zu 1 μM gesteigert werden. Im Einzelfall können auch Konzentration von über 1 μM verwendet werden, z.B. 2 μM.
Sind die entsprechenden Zellen zusätzlich mit einem Gen für ein fluoreszentes Protein transformiert, lassen sich diese Zellen mit Hilfe eines Fluoreszenz-akti vierten Zeilsortiergeräts (FACS) identifizieren und aussortieren, und anschließend in einem Genamplifikationsschritt in Gegenwart von mindestens 20, vorzugsweise in Gegenwart von 50 oder 100 nM MTX kultivieren und amplifizieren. Hierdurch kann eine erhebliche Steigerung der Produktivitäten auf über 20pg Genprodukt pro Zelle und Tag, vorzugsweise auf über 21, 22 ,23, 24, 25, usw., 30, 35, 40, usw, erzielt werden. Die Wirtszellen kann man einem oder mehreren Genamplifikationsschritten unterziehen, um die Kopienzahl zumindest des Gens von Interesse und des amplifizierbaren Selektionsmarkergens zu erhöhen. Erfindungsgemäß ist die erzielbare hohe Produktivität an eine effektive Vorselektion über eine Neomycin- Phosphotransferase-vermittelte Resistenz gegenüber aminoglykosidischen Antibiotika wie Neomycin, Kanamycin und G418 gebunden. Es ist daher möglich, die Anzahl der erforderlichen Genamplifikationsschritte zu reduzieren und z.B. nur eine einzige Genamplifikation durchzuführen.
In einer weiteren Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung somit auch Verfahren zur Gewinnung und Selektion von rekombinanten Säugerzellen, die mindestens ein heterologes Gen von Interesse exprimieren und dadurch gekennzeichnet sind, dass (i) rekombinante Säugerzellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor sowie dem Gen für ein amplifizierbares Selektionsmarkergen transfiziert werden; (ii) die Säugerzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens (e) von Interesse, des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens und des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, ermöglicht; (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, der selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren; (iv) die Säugerzellen mittels flowzytometrischer Analyse aussortiert werden, die eine hohe Expression des fluoreszierenden Proteins zeigen; (v) die aussortierten Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, unter denen das amplifizierbare Selektionsmarkergen exprimiert wird; und (vi) dem Kulturmedium ein Selektionsmittel zugegeben wird, das die Amplifikation des amplifizierbaren Selektionsmarkergens zur Folge hat.
Besonders bevorzugt ist ein entsprechendes Verfahren, sofern die in dieser Erfindung beschriebenen modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gene verwendet werden. Weiterhin bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem lediglich ein Amplifikationsschritt durchgeführt wird. Weiterhin bevorzugt ist ein entsprechendes Verfahren, dass zu rekombinanten Säugerzellen führt, die eine durchschnittliche spezifische Produktivität von größer 20pg, vorzugsweise von über 21, 22 ,23, 24, 25, usw., 30, 35, 40, usw, des (der) gewünschten Genprodukts (Genprodukte) pro Zelle und Tag zeigen.
Säugerzellen, vorzugsweise Mausmyeloma- und Hamsterzellen, sind bevorzugte Wirtszellen für den Einsatz von DHFR als amplifizierbaren Selektionsmarker. Besonders bevorzugt sind die Zelllinien CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) und CHO- DG44 (Urlaub et al., 1983), da sie bedingt durch Mutation keine eigene DHFR- Aktivität aufweisen. Um die DHFR-bedingte Amplifikation auch in anderen Zelltypen anwenden zu können, die über eine eigene endogene DHFR-Aktivität verfügen, kann bei der Transfektion ein mutiertes DHFR-Gen verwendet werden, das für ein Protein mit einer reduzierten Sensitivität gegenüber Methotrexat kodiert (Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982).
Der DHFR-Marker ist bei der Verwendung von DHFR-negativen Grundzellen wie CHO-DG44 oder CHO-DUKX besonders gut zur Selektion und nachfolgenden Amplifikation geeignet, da diese Zellen kein endogenes DHFR exprimieren und somit nicht in Purin-freiem Medium wachsen. Deshalb kann hier das DHFR-Gen als dominanter Selektionsmarker eingesetzt werden und die transformierten Zellen werden in Hypoxanthin/Thymidin-freiem Medium selektioniert.
Im folgenden wird die Erfindung anhand nicht-beschränkender Ausführungsbeispiele näher erläutert. BEISPIELE
Abkürzungen
Ala (=A): Alanin
AP: alkalische Phosphatase
Asn (=N): Asparagin
Asp (=D): Asparaginsäure bp: Basenpaar
BSA: Rinderserumalbumin
CHO: Chinese Hamster Ovary dhfr: Dihydrofolat-Reduktase
DMSO: Dimethylsulfoxid
ELISA: enzyme-linked immunosorbant assay
FACS: fluorescence-activated cell sorter
FITC: Fluorescein-Isothiocyanat
GFP: grünes fluoreszierendes Protein
Glu (=E): Glutaminsäure
Gly (=G): Glycin
HBSS: Hanks Balanced Salt Solution
HT: Hypoxanthin/Thymidin lle (=1): Isoleucin
IRES: intemal ribosomal entry site kb: Kilobase mAk: monoklonaler Antikörper
MCP-1 : monocyte chemoattractant protein- 1
MTX: Methotrexat
MW: Mittelwert
NPT: Neomycin-Phosphotransferase
PCR: polymerase chain reaction
PBS: Phosphate buffered saline
Phe (=F): Phenylalanin
Trp (=W): Tryptophan
Val (=V): Valin
WT: Wildtyp
Methoden
1. Zellkultur und Transfektion
Die Zellen CHO-DG44/dhff/_ (Urlaub et al., 1983) wurden permanent als Suspensionszellen in serum-freiem und mit Hypoxanthin und Thymidin supplementiertem CHO-S-SFMII Medium (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) in Zellkulturflaschen bei 37°C in feuchter Atmosphäre und 5% C02 kultiviert. Die Zellzahlen sowie die Viabilität wurden mit einem CASY1 Cell Counter (Schaerfe System, DE) oder durch Trypanblau-Färbung bestimmt und die Zellen dann in einer Koηzentration von 1 - 3 x105/mL eingesät und alle 2 - 3 Tage passagiert. Zur Transfektion von CHO-DG44 wurde Lipofectamine Plus Reagenz (Invitrogen GmbH) eingesetzt. Pro Transfektionsansatz wurden dabei insgesamt 1 μg Plasmid- DNA, 4 μL Lipofectamine und 6 μL Plus-Reagenz nach den Angaben des Herstellers gemischt und in einem Volumen von 200 μL zu 6 x105 exponentiell wachsenden CHO-DG44 Zellen in 0,8 mL HT-supplementiertem CHO-S-SFMII Medium gegeben. Nach dreistündiger Inkubation bei 37°C in einem Zellinkubator erfolgte eine Zugabe von 2 mL HT-supplementiertem CHO-S-SFMII Medium. Zur NPT-basierten Selektion wurden die Zellen 2 Tage nach Transfektion in HT-supplementiertes CHO-S-SFMII mit G418 (Invitrogen) transferiert, wobei das Medium alle 3 bis 4 Tage gewechselt wurde. In der Regel wurden zur Selektion 400 μg/mL G418 zugesetzt, wobei in einigen experimentellen Serien die Konzentration auch auf 200 μg/mL erniedrigt bzw. auf 500, 600 oder 800 μg/mL erhöht wurde. Bei einer DHFR- und NPT-basierten Selektion im Falle einer Co-Transfektion, in der der eine Expressionsvektor einen DHFR- und der andere Expressionsvektor einen Neomycin-Phosphotransferase- Selektionsmarker enthielt, wurden die Zellen 2 Tage nach Transfektion in CHO-S- SFMll Medium ohne Hypoxanthin- und Thymidinzusatz transferiert und dem Medium außerdem noch G418 (Invitrogen) in einer Konzentration von 400μg/mL zugesetzt. Eine DHFR-basierte Genamplifikation der integrierten heterologen Gene kann durch Zugabe des Selektionsagens MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) in einer Konzentration von 5 - 2000 nM zu einem HT-freien CHO-S-SFMII Medium erreicht werden.
2. Expressionsvektoren
Zur Expressionsanalyse wurden eukaryontische Expressionsvektoren eingesetzt, die auf dem pAD-CMV Vektor (Werner et al., 1998) basieren und die konstitutive Expression eines heterologen Gens über die Kombination CMV Enhancer/Hamster Ubiquitin/S27a Promotor (WO 97/15664) vermitteln. Während der Basisvektor pBID das dhfr-Minigen enthält, das als amplifzierbarer Selektionsmarker dient (siehe z.B. EP-0-393-438), ist im Vektor pBIN das dhfr-Minigen durch ein Neomycin- Phosphotransferase-Resistenzgen ersetzt worden (Abb. 1). Hierzu wurde der Selek- tionsmarker Neomycin-Phosphotransferase, inklusive SV40 early Promotor und TK- Polyadenylierungssignal, aus dem kommerziellen Plasmid pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, USA) als 1640 bp Bsu36l-Fragment isoliert. Nach einer Auffüllreaktion der Fragmentenden durch Klenow-DNA-Polymerase wurde das Fragment mit dem 3750 bp Bsu36l/Stul-Fragment des Vektors pBID, das ebenfalls mit Klenow-DNA- Polymerase behandelt wurde, ligiert.
Im bicistronischen Basisvektor pBIDG (Abb. 1) wurde die IRES-GFP-Genregion aus dem Vektor plRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, USA) isoliert und in einer Weise unter die Kontrolle des CMV Enhancer/Promotors im Vektor pBID gebracht, dass die multiple Klonierungsstelle zwischen Promotorregion und IRES-Element erhalten blieb. Dabei wurde wie folgt vorgegangen. In einer PCR-Mutagenese, wobei das Plasmid plRES2-EGFP als Template diente, wurde zum einen die Hindill- Schnittstelle AAGCTT innerhalb der IRES-Sequenz durch den Einsatz mutagener Primer in die Sequenzabfolge ATGCTT umgewandelt und somit entfernt. Zum anderen wurde mittels eines Primers mit Komplementarität zum 5'Ende der IRES- Sequenz eine Xbal-Schnittstelle bzw. mit Komplementarität zum 3'Ende der GFP- Sequenz eine Spel-Schnittstelle eingeführt. Das resultierende PCR-Fragment, das die komplette IRES- und GFP-Sequenz umfasste, wurde mit Xbal und Spei verdaut und in die singuläre Xbal-Schnittstelle am 3 'Ende der multiplen Klonierungsstelle des Vektors pBID kloniert. Auf gleiche Weise wurde die IRES-GFP-Genregion aus dem Vektor plRES2-EGFP unter die Kontrolle des CMV Enhancer/Hamster Ubiquitin/S27a Promotors im Vektor pBIN gebracht. Daraus resultierte der bicistronische Basisvektor pBING (Abb. 1).
Die humane MCP-1 cDNA (Yoshimura et al., 1989) wurde als 0,3 kb Hindlll/EcoRI- Fragment in die entsprechenden Schnittstellen des Vektors pBIN kloniert, wobei der Vektor pBIN-MCP1 resultierte (Abb. 2A).
Zur Expression eines monoklonalen humanisierten lgG2 Antikörpers wurde die schwere Kette als 1,5 kb BamHI/Hindlll-Fragment in den mit BamHI und Hindlll- verdauten Vektor pBID bzw. pBIDG kloniert, wobei der Vektor pBID-HC bzw. pBIDG-
HC resultierte (Abb. 2B). Die leichte Kette hingegen wurde als 0,7 kb BamHI/Hindlll- Fragment in die entsprechenden Schnittstellen des Vektors pBIN bzw. pBING kloniert, wodurch der Vektor pBIN-LC bzw. pBING-LC (Abb. 2B ) entstand.
3. FACS Die flowcytometrischen Analysen und Sorting wurden mit einem Coulter Epics Altra- Gerät durchgeführt. Das FACS ist mit einem Helium-Argon-Laser mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm ausgestattet. Die Fluoreszenzintensität wird bei einer dem Fluoreszenzprotein adäquaten Wellenlänge aufgenommen und mittels der angeschlossenen Software Coulter Expo32 prozessiert. Das Sorting wird standardmäßig mit einer Rate von 8000 - 10000 Events/Sekunde durchgeführt. Die suspendierten Zellen lassen sich abzentrifugieren (5 min bei 180xg) und in HBSS auf eine Zellkonzentration von 1 - 1,5 x107/mL eingestellen. Anschließend kann ein Sorting der Zellen entsprechend ihres Fluoreszenzprotein-Signals erfolgen. Die Zellen werden in Röhrchen mit vorgelegtem Kultivierungsmedium aufgenommen, abzentrifugiert und abhängig von der aussortierten Zellzahl in entsprechende Kultivierungsgefäße eingesät oder direkt in Mikrotiterplatten abgelegt.
4. ELISA
Die MCP-1 -Titer in Überständen von stabil transfizierten CHO-DG44 Zellen wurden mittels ELISA mit dem Kit OptEIA Human MCP-1 Set nach dem Protokoll des Herstellers quantifiziert (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, DE). Die Quantifizierung des lgG2 mAks in den Überständen von stabil transfizierten CHO-DG44 Zellen erfolgte mittels ELISA nach Standardprotokollen (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, updated), wobei zum einen ein Ziege anti Human IgG Fc-Fragment (Dianova, Hamburg, DE) und zum anderen ein AP-konjugierter Ziege anti Human Kappa light chain Antikörper (Sigma) eingesetzt wurde. Als Standard diente gereinigter lgG2 Antikörper.
Produktivitäten (pg/Zelle/Tag) wurden dabei mit der Formel pg/((Ct-Co) t / In (Ct-Co)) berechnet, wobei Co und Ct die Zellzahl bei Aussaat bzw. Ernte und t die Kultivierungsdauer angibt.
5. Dot Assay zur Bestimmung der NPT-Enzymaktivität Zur Herstellung eines Zellextrakts nach einem Protokoll von Duch et al., 1990 wurden jeweils 6x106 Zellen zweimal mit PBS gewaschen und nachfolgend in 600 μL Extraktionspuffer (0,135 M Tris-HCI pH 6,8, 20% Glycerin, 4 mM Dithiothreitol) resuspendiert. Nach viermaligem Einfrieren und Auftauen in einem Trockeneis- bzw. Wasserbad wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und der Überstand für den nachfolgenden Enzym-Assay eingesetzt. Die Proteinkonzentration in den Zellextrakten wurde mittels eines Bradford-Assays unter Verwendung des BIO-RAD Protein Assays (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, DE) bestimmt, wobei BSA als Standardprotein diente (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, updated). Zur Bestimmung der NPT-Enzymaktivität wurde ein Dot Assay, basierend auf dem Protokoll von Platt et al. 1987, durchgeführt. Dazu wurden je 5 μg, 2,5 μg und 1 ,25 μg Protein mit Extraktionspuffer auf ein Endvolumen von 20 μL gebracht, wobei mit Zellextrakt aus nicht-transfizierten CHO-DG44 Zellen auf einen Gesamtproteingehalt von jeweils 5 μg aufgefüllt wurde. Nach Zugabe von jeweils 200 μL Assaypuffer (67 mM Tris-HCI pH 7,1 , 42 mM MgCI2, 400 mM NH4CI) plus/minus 40 μg/mL G418 und plus/minus 5 μCi [γ-33P]-ATP/mL (NEN) wurden die Extrakte bei 27°C für 135 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Extrakte in einem 96 Well Vakuum Manifold (Schleicher & Schüll, Dassel, DE) durch einen Sandwich aus je einer Lage Whatman 3MM-Papier, P81 Phosphocellulose-Membran (Whatman Laboratory Division, Maidstone, Großbritannien) und Nitrocellulose- Membran (Schleicher & Schüll) filtriert. Durch Proteinkinasen phosphorylierte Proteine sowie nicht-phosphorylierte Proteine binden dabei an die Nitrocellulose, während phosphoryliertes G418 die Nitrocellulose passiert und an die Phosphocellulose bindet. Nach dreimaligem Nachwaschen mit deionisiertem H20 wurden die Membranen aus der Apparatur entnommen, nochmals mit H20 gewaschen und dann luftgetrocknet. Die Quantifizierung der radioaktiven Signale erfolgte mittels eines Phospho Imagers (Molecular Dynamics, Krefeld, DE).
6. Northern Blot Analyse Die Isolierung von Gesamt-RNA aus den Zellen erfolgte mit dem TRIZOL-Reagenz nach den Angaben des Herstellers (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) und die gelektrophoretische Auftrennung von je 30 μg RNA sowie der Transfer auf eine Hybond N+ Nylonmembran (Amersham Biosciences, Freiburg, DE) nach dem Standardprotokoll für Glyoxal/DMSO-denaturierte RNA (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, updated). Als Sonde für die nachfolgende nicht-radioaktive Hybridisierung mit dem Geneimages CDP-Star Detection Kit (Amersham Biosciences) wurde ein mit dem Geneimages random prime labelling Kit (Amersham Biosciences, Freiburg, DE) FITC-dUTP-markiertes PCR-Produkt, das die Kodierregion des NPT-Gens umfasste, nach den Angaben des Herstellers verwendet.
7. Dot Blot Analyse Die Isolierung von genomischer DNA aus den Zellen erfolgte unter Verwendung eines DNA-Isolierungskits nach den Angaben des Herstellers (DNA Isolation Kit for Cells and Tissue; Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE). Verschiedene DNA- Mengen (10 μg, 5 μg, 2,5 μg, 1,25 μg, 0,63 μg und 0,32 μg) wurden nach Standardprotokoll (Ausubel et al., 1994) in einem alkalischen Puffer unter Verwendung eines 96 Well Vakuum Maniolds (Schleicher & Schüll, Dassel, DE) auf eine Hybond N+ Nylonmembran (Amersham Biosciences, Freiburg, DE) filtriert. Nicht-transfizierte CHO-DG44 Zellen dienten als Negativkontrolle. Als Standard wurde das Plasmid pBIN-LC eingesetzt (320 pg, 160 pg, 80 pg, 40 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg, 2,5 pg). Als Sonde für die nachfolgende nicht-radioaktive Hybridisierung mit dem Geneimages CDP-Star Detection Kit (Amersham Biosciences) wurde ein mit dem Geneimages random prime labelling Kit (Amersham Biosciences, Freiburg, DE) FITC-dUTP-markiertes PCR-Produkt, das die Kodierregion des NPT-Gens umfasste, nach den Angaben des Herstellers verwendet. Die Chemilumineszenzsignale wurden mittels eines ImageMaster VDS-CL (Amersham Biosciences) quantifiziert. Anschließend wurde die Kopienzahl der npt-Gene in den jeweiligen Zellen mit Hilfe der Standardreihe, die aus den ermittelten Signalintensitäten der titrierten Plasmid- DNA erstellt wurde, ermittelt. Die Anzahl der Plasmidmoleküle wurde dabei mit der Avogadroschen Konstante berechnet und der DNA-Gehalt einer CHO-Zelle als ca. 5 pg angenommen. Beispiel 1 : Mutagenese der Neomycin-Phosphotransferase
Die zur Herstellung der NPT-Mutanten Glu182Gly (SEQ ID NO:3), Trp91Ala (SEQ ID NO:5), Val198Gly (SEQ ID NO:7), Asp227Ala (SEQ ID NO:9), Asp227Val (SEQ ID NO:11), Asp261Gly (SEQ ID NO:13), Asp261Asn (SEQ ID NO:15), Phe240lle (SEQ ID NO:17), Glu182Asp (SEQ ID NO:19), Asp227Gly (SEQ ID NO:21), Asp190Gly (SEQ ID NO:23) und Asp208Gly (SEQ ID NO:25) erforderlichen Basensubstitutionen im Wildtyp NPT-Gen erfolgten mittels PCR unter Verwendung von mutagenen Primern (Abb. 3). Der Vektor pBIN (Abb. 1) bzw. pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, USA) diente dabei als Template für die PCR-Mutagenese. Zunächst wurden in separaten PCR-Ansätzen die 5' bzw. 3'Anteile der jeweiligen Mutanten hergestellt. Für die Herstellung der Mutanten Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Asp190Gly, Val198Gly, Asp208Gly und Asp227Gly wurden für die Amplifikation dazu Primerkombinationen eingesetzt, die aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und dem jeweiligen mutagenen reverse (rev) Primer bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und dem jeweiligen mutagenen forward (for) Primer bestanden:
- Im Fall von NPT-Mutante Glu182Gly (SEQ ID NO:3) aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und E182Grev (SEQ ID NO:32) bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und E182Gfor (SEQ ID NO:31); - Im Fall von NPT-Mutante Glu182Asp (SEQ ID NO:19) aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und E182Drev (SEQ ID NO:48) bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und E182Dfor (SEQ ID NO:47);
- im Fall von NPT-Mutante Trp91Ala (SEQ ID NO:5) aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und W91Arev (SEQ ID NO:34) bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und W91Afor (SEQ ID NO:33);
- im Fall von NPT-Mutante VaM 98Gly (SEQ ID NO:7) aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und V198Grev (SEQ ID NO:36) bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und V198Gfor (SEQ ID NO:35)
- Im Fall von NPT-Mutante Asp190Gly (SEQ ID NO:23) aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und D190Grev (SEQ ID NO:δ0) bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und
D190Gfor (SEQ ID NO:49); - Im Fall von NPT-Mutante Asp208Gly (SEQ ID NO:2δ) aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und D208Grev (SEQ ID NO:δ2) bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und D208Gfor (SEQ ID NO:δ1 );
- Im Fall von NPT-Mutante Asp227Gly (SEQ ID NO:21) aus Neoforδ (SEQ ID NO:27) und D227Grev (SEQ ID NO:δ4) bzw. aus Neorevδ (SEQ ID NO:28) und
D227Gfor (SEQ ID NO:δ2). Für die Herstellung der Mutanten Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn und Phe240lle wurden für die Amplifikation Primerkombinationen eingesetzt, die aus Neofor2 (SEQ ID NO:29) und dem jeweiligen mutagenen reverse (rev) Primer bzw. aus IC49 (SEQ ID NO:30) und dem jeweiligen mutagenen forward (for) Primer bestanden:
- Im Fall von NPT-Mutante Asp227Ala (SEQ ID NO:9) aus Neofor2 (SEQ ID NO:29) und D227Arev (SEQ ID NO:38) bzw. aus IC49 (SEQ ID NO:30) und D227Afor (SEQ ID NO:37); - im Fall von NPT-Mutante Asp227Val (SEQ ID NO:11) aus Neofor2 (SEQ ID NO:29) und D227Vrev (SEQ ID NO:40) bzw. aus IC49 (SEQ ID NO:30) und D227Vfor (SEQ ID NO:39);
- im Fall von NPT-Mutante Asp261 Gly (SEQ ID NO:13) aus Neofor2 (SEQ ID NO:29) und D261 Grev (SEQ ID NO:42) bzw. aus IC49 (SEQ ID NO:30) und D261 Gfor (SEQ ID NO:41 );
- im Fall von NPT-Mutante Asp261Asn (SEQ ID NO:1δ) aus Neofor2 (SEQ ID NO:29) und D261Nrev (SEQ ID NO:44) bzw. aus IC49 (SEQ ID NO:30) und D261Nfor (SEQ ID O:43);
- im Fall von NPT-Mutante Phe240lle (SEQ ID NO: 17) aus Neofor2 (SEQ ID NO:29) und F240lrev (SEQ ID NO:46) bzw. aus IC49 (SEQ ID NO:30) und
F240lfor (SEQ ID NO:4δ).
Nachfolgend wurden der Kodierstrang des δ'Anteils und der Komplementärstrang des 3'Anteils der jeweiligen Mutanten durch Hybridisierung im Überlappungsbereich, der von den mutagenen Primersequenzen gebildet wird, zusammengeführt, die Einzelstrangbereiche aufgefüllt und das gesamte Produkt nochmals in einer PCR mit den Primern Neoforδ (SEQ ID NO:27) und Neorevδ (SEQ ID NO:28) bzw. Neofor2 (SEQ ID NO:29) und IC49 (SEQ ID NO:30) amplifiziert. Diese PCR-Produkte wurden mit Stul/Rsrll (Neoforδ/Neorevδ PCR-Produkte der Mutanten Glu182Gly, Trp91Ala und Val198Gly), Stul/BstBI (Neoforδ/Neorevδ PCR-Produkte der Mutanten Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly und Asp227Gly) bzw. Dralll/Rsrll (Neofor2/IC49 PCR-Produkte der Mutanten Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn und Phe240lle) verdaut. Anschließend wurde im Vektor pBIN-LC (Abb. 2B) bzw. pBK- CMV (Stratagene, La Jolla, USA) ein Teil der Wildtyp NPT-Sequenz durch Stul/Rsrll Verdau, Dralll/Rsrll Verdau bzw. Stul/BstBI Verdau entfernt und durch die korrespondierenden Fragmente der PCR-Produkte ersetzt. Durch Sequenzanalyse sowohl des Komplementär- als auch des Kodierstrangs wurden die gewünschten Basensubstitutionen in den jeweiligen Mutanten verifiziert und sichergestellt, dass die restliche DNA-Sequenz der Wildtyp NPT-Sequenz entsprach. Auf diese Weise wurden die Expressionsvektoren pBIN1-LC, pBIN2-LC, pBIN3-LC, pBIN4-LC, pBINδ- LC, pBIN6-LC, pBIN7-LC und pBIN8-LC generiert, die die NPT-Mutanten Glu182Gly, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn bzw. Phe240lle enthalten (Abb. 2B).
Die restlichen NPT-Mutanten wurden als 1640 bp Bsu36l-Fragment aus dem modifizierten pBK-CMV isoliert, die Fragmentenden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und mit dem 37δ0 bp Bsu36l/Stul-Fragment des Vektors pBID, das ebenfalls mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt wurde, ligiert. Auf diese Weise wurden die Expressionsvektoren pKS-Nδ, pKS-N6, pKS-N7 und pKS-N8 generiert, die die NPT-Mutanten Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly bzw. Asp227Gly enthalten. In diese Expressionsvektoren wurde dann jeweils die humane MCP-1 cDNA als 0,3 kb Hindlll/EcoRI Fragment (Abb. 2A) bzw. die leichte Kette des humanisierten lgG2 Antikörpers als 0,7 kb Hindlll/BamHI-Fragment kloniert (Abb. 2B).
Bei den eingeführten Mutationen in der Neomycin-Phosphotransferase handelt es sich zum einen um Substitutionen von mehr (Val198Gly, Phe240lle) oder weniger (Trp91Ala, Glu182Gly, Glu182Asp, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly) konservierten Aminosäuren, die konservierte Domänen, wie z.B. die Motive 1 , 2 und 3 (Shaw et al., 1993), flankieren (Abb. 4). Zum anderen liegen die Mutationen innerhalb des konservierten Motivs 1 (Asp190Gly), 2 (Asp208Gly) oder 3 (Asp261Gly, Asp261Asn) und betreffen eine konservierte Aminosäure. Beispiel 2: Einfluss der NPT-Mutationen auf die Selektion von stabil transfizierten MCP-1 exprimierenden Zellen
MCP-1 wurde als Beispiel für die Expression eines einzelkettigen Proteins in CHO- Zellen gewählt. Dazu wurden CHO-DG44 mit pKS-Nδ-MCP1 , pKS-N6-MCP1, pKS- N7-MCP1, pKS-N8-MCP1 bzw. pBIN-MCP1 transfiziert (Abb. 2A). Es wurden dabei jeweils Doppelansätze durchgeführt. Zwei Tage nach Transfektion wurden die Zellen in einer 96 Well-Platte ausgesät (2000 Zellen/Well) und mit 400 μg/mL G418 in HT- supplementiertem CHO-S-SFMII Medium selektioniert. Im Fall der mit pBIN-MCP1 transfizierten Zellen wurde parallel auch noch eine Selektion mit 800 μg/mL G418 durchgeführt. Die erhaltenen Zellpopulationen wurden sukzessive über 24 Well- in 6 Well-Platten überführt. Schon während der Selektionsphase konnten Unterschiede in den verschiedenen Transfektionsansätzen festgestellt werden. Im Gegensatz zu den Zellpopulationen, in denen mit einem NPT Wildtyp-Gen (SEQ ID NO:1) selektioniert wurde, überlebten in den Zellpopulationen, die mit einer mutierten NPT transfiziert worden waren, weniger Zellen die anfängliche Selektion mit G418. Diese Zellpopulationen konnten deshalb auch erst ca. 4 Tage später in die 24 Well-Platten transferiert werden. Und in den mit pKS-N6-MCP1 und pKS-N7-MCP1 transfizierten Ansätzen konnten bei einer Konzentration von 400 μg/mL G418 überhaupt keine stabil transfizierten Zellen selektioniert werden. Vermutlich ist in den NPT-Mutanten mit den Mutationen Asp190Gly bzw. Asp208Gly die Enzymfunktion so stark beeinträchtigt, dass nicht mehr genug G418-Moleküle inaktiviert werden können, um ein Wachstum der stabil transfizierten Zellen zu ermöglichen. Bei einer Reduktion der G418-Konzentration auf 200 μg/mL überlebten zwar einige wenige Zellen die erste Selektionsphase, aber sie zeigten alle starke Beeinträchtigungen in Wachstum und Vitalität und eine Expansion war, bis auf wenige Ausnahmen bei der Mutante Asp208Gly, nicht möglich. Von den mit den Mutanten Glu182Asp und Asp227Gly bzw. mit dem NPT-Wildtyp transfizierten Zellen wurden jeweils 18 Pools (je 9 Pools aus Ansatz 1 und 2) über vier Passagen hinweg in 6 Well-Platten kultiviert und die Konzentration des produzierten MCP-1 im Zellkulturüberstand durch ELISA ermittelt. Zellpools, bei denen als Selektionsmarker die NPT-Mutanten eingesetzt wurden, zeigten durchschnittlich um δ0% - δ7% (Glu182Asp-Mutante) bzw. δ7% - 6δ% (Asp227Gly- Mutante) höhere Produktivitäten als Zellpools, in denen die Selektion mit dem NPT- Wildtyp bei 400 oder sogar 800 μg/mL G418 durchgeführt worden war (Abb. δ). Somit konnte durch die Verwendung von NPT-Mutanten als Selektionsmarker der Anteil von Hochproduzenten in den transfizierten Zellpopulationen tatsächlich erhöht werden.
Beispiel 3: Einfluss der NPT-Mutationen auf die Selektion von stabil transfizierten mAk exprimierenden Zellen
In einer Co-Transfektion wurden CHO-DG44 Zellen zunächst mit den Plasmidkombination pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-Wildtyp), pBIDG-HC/pKS-Nδ-LC (Glu182Asp NPT-Mutante) bzw. pBIDG-HC/pKS-N8-LC (Asp227Gly NPT-Mutante) transfiziert (Abb. 2B). In den eingesetzten Vektorkonfigurationen werden die beiden Proteinketten eines humanisierten lgG2 Antikörpers jeweils von einem eigenen Vektor, der zusätzlich noch für einen DHFR- bzw. Neomycin-Selektionsmarker in einer separaten Transkriptionseinheit kodiert, exprimiert. Die Expression der Produktgene wird dabei von einer CMV-Enhancer/Hamster Ubiquitin/S27a Promotor- Kombination vermittelt. Vergleichbare Daten können aber auch beispielsweise mit einem CMV Enhancer/Promotor, einem SV40-Enhancer/Hamster Ubiquitin/S27a Promotor oder anderen Promotorkombinationen erzielt werden. Insgesamt wurden vier Transfektionsserien mit jeweils 6 Pools pro Plasmidkombination durchgeführt. Im Gegensatz zu den Zellpopulationen, in denen mit einem NPT-Wildtypgen selektioniert wurde, überlebten in den Zellpopulationen, die mit einem mutierten NPT transfiziert worden waren, weniger Zellen die anfängliche Selektion mit G418. Nach einer zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools in HT-freiem CHO-S-SFMII Medium mit Zusatz von 400 μg/mL G418 wurde über mehrere Passagen (6 - 8) hinweg eine Bestimmung des Antikörper-Titers in den Zellkulturüberständen mittels ELISA vorgenommen. Im Vergleich zur Verwendung eines NPT-Wildtypgens als Selektionsmarker wiesen die Zellen, die mit der Glu182Asp-Mutante selektioniert worden waren, durchschnittlich eine Erhöhung der Produktivität und des Titers um 86% bzw. 77% und die mit der Asp227Gly-Mutante selektionierten Zellen sogar eine Erhöhung der Produktivität und des Titers um 126% bzw. 107% auf. Durch die Verwendung einer NPT-Mutante mit verminderter Enzymaktivität konnten somit selektiv Zellen mit bis zu doppelt so hoher Grundproduktivität angereichert werden. In einer weiteren Transfektionsserie wurde der Einfluss von verschiedenen G418- Konzentrationen auf die Selektion getestet. Zur Selektion der transfizierten Zellpools, jeweils 3 Pools, wurden hierbei 400, δOO bzw. 600 μg/mL G418 eingesetzt. Bei den höheren Konzentration überlebten in den Zellpopulationen, in denen mit einem NPT Wildtypgen selektioniert wurde, deutlich weniger Zellen die anfängliche Selektion, wobei der Effekt bei der Asp227Gly-Mutante am größten war. Die erhaltenen stabil transfizierten Zellpopulationen zeigten jedoch keine Beeinträchtigung bezüglich Wachstum und Vitalität. Zwischen den erzielten Produktivitäten und Titern konnte jedoch innerhalb einer zur Transfektion eingesetzten Plasmidkombination kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Aber auch hier wiesen die mit den NPT-Mutanten selektionierten Zellen wiederum im Durchschnitt die höchsten Produktivitäten auf, angeführt von der Asp227Gly-Mutante mit einer im Vergleich zum NPT-Wildtyp vierfach höheren Produktivität, gefolgt von der Glu182Asp-Mutante mit einer um Faktor 2,4 höheren Produktivität (Abb. 6A).
Nachfolgend wurden in einer Co-Transfektion CHO-DG44 Zellen mit den Plasmidkombinationen pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-Wildtyp), pBIDG-HC/pBIN1-LC (Glu182Gly NPT-Mutante), pBIDG-HC/pBIN2-LC (Trp91Ala NPT-Mutante), pBIDG- HC/pBIN3-LC (Val198Gly NPT-Mutante), pBIDG-HC/pBIN4-LC (Asp227Ala), pBlDG- HC/pBINδ-LC (Asp227Val NPT-Mutante), pBIDG-HC/pBIN6-LC (Asp261Gly NPT- Mutante), pBIDG-HC/pBIN7-LC (Asp261Asn NPT-Mutante) bzw. pBIDG-HC/pBIN8- LC (Phe240lle NPT-Mutante), transfiziert (Abb. 2B). Auch in diesen eingesetzten Vektorkonfigurationen werden die beiden Proteinketten eines monoklonalen humanisierten lgG2 Antikörpers jeweils von einem eigenen Vektor, der zusätzlich noch für einen DHFR- bzw. Neomycin-Selektionsmarker in einer separaten Transkriptionseinheit kodiert, exprimiert. Pro Plasmidkombination wurden jeweils δ Pools transfiziert. Im Gegensatz zu den Zellpopulationen, in denen mit einem NPT-Wildtypgen selektioniert wurde, überlebten in den Zellpopulationen, die mit einem mutierten NPT transfiziert worden waren, weniger Zellen die anfängliche Selektion mit G418. Nach einer zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools in HT-freiem CHO-S-SFMII Medium mit Zusatz von 400 μg/mL G418 wurde über sechs Passagen hinweg eine Bestimmung des Antikörper-Titers in den Zellkulturüberständen mittels ELISA vorgenommen. In Abb. 6B sind die Mittelwerte der ermittelten Titer und Produktivitäten aus den jeweiligen Pools im Test zusammengefasst. Im Vergleich zur Verwendung eines NPT-Wildtypgens als Selektionsmarker wiesen alle Zellpools, die mit einer NPT-Mutante selektioniert worden waren, durchschnittlich eine Erhöhung der Produktivität und des Titers um den Faktor 1, 4 - 14,6 bzw. 1 ,4 - 10,8 auf (Abb. 6B). Die beste selektive Anreicherung von Zellen mit höherer Grundproduktivität konnte dabei mit den NPT-Mutanten Asp227Val bzw. Asp261Gly erzielt werden, mit Steigerungen der durchschnittlichen Produktivität um den Faktor 14,6 bzw. 9,3.
Im Vektor pBIDG-HC ist ein weiterer Selektionsmarker, das GFP, enthalten. Das GFP ist dabei transkriptionell mit der schweren Kette über ein IRES-Elements verknüpft. Die dadurch bedingte Korrelation zwischen der Expression des Zielproteins und des Selektionsmarkers GFP ermöglicht deshalb auch eine schnelle Bewertung der Höhe und der Verteilung der Expressionslevel in den transfizierten Zellpopulationen auf der Basis der in FACS-Analysen bestimmten GFP-Fluoreszenz. Nach einer zwei- bis dreiwöchigen Selektion der transfizierten Zellpools in HT-freiem CHO-S-SFMII Medium mit Zusatz von G418 wurde in einer FACS-Analyse die GFP- Fluoreszenz gemessen (Abb. 7). Die erhaltenen GFP-Fluoreszenzsignale korrelierten in der Tat mit den ermittelten Titerdaten für den monoklonalen lgG2 Antikörper. Mit den NPT-Mutanten Asp227Val, Asp261Gly, Asp161Asn und Phe240lle selektionierte Pools wiesen auch den größeren Anteil an Zellen mit hoher GFP-Fluoreszenz auf, gefolgt von den mit den NPT-Mutanten Trp91Ala, Asp227Gly, Gly182Asp, Asp227Ala, Glu182Gly und Val198Gly selektionierten Zellen.
Durch die Zugabe des Selektionsagens Methotrexat (MTX) zum Kulturmedium konnte die Produktivität der Zellen durch die Induktion einer dhfr-vermittelten Genamplifikation noch weiter erhöht werden. So konnte zum Beispiel nach einem einfachen Genamplifikationsschritt mit 100 nM MTX die spezifische Produktivität in den Zellpools, die aus einer Co-Transfektion mit den Plasmidkombinationen pBIDG- HC/pBINδ-LC (NPT-Mutante Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (NPT-Mutante Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC (NPT-Mutante Asp261Asn) und pBIDG- HC/pBIN8-LC (NPT-Mutante Phe240lle) resultierten, um den Faktor 2 bis 4 gesteigert und je nach Pool Produktivitäten zwischen 4 und 14 pg/Zelle/Tag erzielt werden. In Abbildung 8 sind exemplarisch an einem Zellpool, der aus der Co- Transfektion pBIDG-HC/pBINδ-LC (NPT-Mutante Asp227Val) erhalten wurde, die durch MTX-Zugabe (100 nM MTX gefolgt von δOO nM MTX) erzielten Steigerungen in der Produktivität auf 27 pg/Zelle/Tag dargestellt.
Beispiel 4: Bestimmung und Vergleich der NPT-Enzymaktivität
Um die Enzymaktivität der NPT-Mutanten mit der des NPT-Wildtyps zu vergleichen wurde ein Dot Assay zur Bestimmung der NPT-Aktivität in- Zellextrakten, basierend auf dem Protokoll von Platt et al. 1987 und beispielhaft in Abb. 9A für die NPT- Mutanten Glu182Asp und Asp227Gly gezeigt, durchgeführt. Dazu wurden Zellextrakte von jeweils zwei verschiedenen mAk exprimierenden Zellpools hergestellt, die entweder mit dem NPT-Wildtypgen (SEQ ID NO:1) oder mit den NPT- Mutanten Glu182Gly (SEQ ID NO:3), Glu182Asp (SEQ ID NO:19), Trp91Ala (SEQ ID NO:δ), Asp190Gly (SEQ ID NO:23), Val198Gly (SEQ ID NO:7), Asp208Gly (SEQ ID NO:2δ), Asp227Ala (SEQ ID NO:9), Asp227Val (SEQ ID NO:11), Asp227Gly (SEQ ID NO:21), Asp261Gly (SEQ ID NO:13), Asp261Asn (SEQ ID NO:1δ), bzw. Phe240lle (SEQ ID NO: 17) transfiziert und selektioniert worden waren. Als Negativkontrolle dienten Zellextrakte aus nicht-transfizierten CHO-DG44 Zellen. Die Enzymaktivitäten der NPT-Mutanten waren im Vergleich zum NPT-Wildtyp signifikant reduziert. Durchschnittlich wiesen die NPT-Mutanten lediglich noch zwischen 1,5% und 62% der Wildtyp-Enzymaktivität auf, wobei die NPT-Mutanten Asp261Gly und Asp261Asn mit 3,1% bzw. 1,5% die geringste Restaktivität und die NPT-Mutanten Val198Gly sowie Trp91Ala mit 61 ,9% bzw. 53,2% die höchste Restaktivität aufwiesen (Abb. 9B). Die auf der Phosphocellulose erhaltenen Signale waren dabei spezifisch für die durch die NPT-Enzymaktivität hervorgerufene Phosphorylierung von G418. Ohne Zusatz des NPT-Substrats G418 zum Assaypuffer konnte keine Aktivität auf der Phosphocellulose nachgewiesen werden. Die auf der Nitrocellulose-Membran erhaltenen Signale, die aus den durch Proteinkinasen phosphorylierten Proteinen innerhalb des Zellextrakts resultierten, wurden als interne Kontrolle für gleiche Probenauftragsmengen herangezogen. Die reduzierte Enzymaktivität der NPT-Mutanten im Vergleich zum NPT-Wildtyp war dabei nicht auf eine verringerte Genexpression zurückzuführen. Im Gegenteil, Northern Blot Analysen an Gesamt-RNA ergaben, dass Zellpools, die mit dem NPT- Wildtyp transfiziert worden waren und eine hohe NPT-Enzymaktivität aufwiesen, weniger RNA exprimierten als mit NPT-Mutanten transfizierte Zellpools (Abb. 10). Die einzige Ausnahme bildeten Zellen, die mit der NPT-Mutante Glu182Gly transfiziert worden waren und vergleichbare Mengen an NPT-mRNA exprimierten. In Dot Blot Analysen, die an genomischer DNA aus diesen transfizierten Zellpopulationen durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass die höhere Expression der NPT- Mutanten durch Gendosiseffekte und/oder durch Integration der exogenen DNA in transkriptionsaktivere genomische Regionen erzielt wurden (Abb. 10). Zum Beispiel, in den mit der NPT-Mutante Trp91Ala selektionierten Zellen dominiert in Pool 1 der Gendosiseffekt, in Pool 2 hingegen der Integrationseffekt. Auf diese Weise können transfizierte Zellen, bei denen zur Selektion Marker mit reduzierter Enzymaktivität verwendet wurden, eine ausreichende hohe Menge an Markerprotein synthetisieren, um bei identischem Selektionsdruck die verminderte Resistenz gegenüber dem selektiven Agens auszugleichen.
Beispiel 5: Isolierung von Zellen mit hoher Expression eines mAks durch GFP- basiertes FACS-Sorting
In einer Co-Transfektion wurden CHO-DG44 Zellen mit der Plasmidkombination pBID-HC und pBING-LC, kodierend für einen monoklonalen humanisierten lgG2 Antikörper, transfiziert (Abb.2B). In den eingesetzten Vektorkonfigurationen werden die beiden Proteinketten des Antikörpers jeweils von einem eigenen Vektor, der zusätzlich noch für einen DHFR- bzw. modifizierten Neomycin-Phosphotransferase- Selektionsmarker (Asp227Gly-Mutante; SEQ ID NO:21) in einer separaten Transkriptionseinheit kodiert, exprimiert. Zusätzlich ist im Vektor pBING-LC ein weiterer Selektionsmarker, das GFP, enthalten. Durch die transkriptionelle Verknüpfung der Expression des GFPs und der leichten Kette mittels eines IRES- Elements konnten bei der Co-Transfektion von CHO-DG44 mit den Vektoren pBID- HC/pBING-LC in kurzer Zeit Zellen mit einer hohen Expression des monoklonalen Antikörpers allein dadurch isoliert werden, dass mittels sequentiellem FACS-Sorting die Zellen mit einem hohen GFP-Gehalt selektioniert wurden. Insgesamt wurden 8 separate Zellpools transfiziert, aus denen nach einer ersten zwei- bis dreiwöchigen Selektion in HT-freiem CHO-S-SFMII Medium mit Zusatz von 400 μg/mL G418 stabil transfizierte Zellpopulationen erhalten wurden. Mittels ELISA wurden die Titer und Produktivitäten aller 8 Pools über mehrere Passagen (7 - 8) hinweg bestimmt. Im Durchschnitt lagen die Titer bei ca. 1,4 mg/L und die Produktivitäten bei ca. 1 ,3 pg/Zelle/Tag. Für das sich anschließende sequentielle FACS-basierte Sortierung wurden die Pools δ und 8 ausgewählt, wobei der Pool δ die höchste Produktivität und der Pool 8 eine dem Durchschnitt aller Pools entsprechende Produktivität aufwies. Bei jedem Schritt wurden jeweils die δ% Zellen mit der höchsten GFP-Fluoreszenz durch FACS heraussortiert wurden und im Pool weiter kultiviert. Diese Sortierung wurde insgesamt bis zu sechsmal durchgeführt, wobei zwischen jeder Sortierung eine Kultivierungsperiode von ca. zwei Wochen lag. Erstaunlicherweise konnte dabei eine gute Korrelation zwischen mAk-Produktivität und GFP-Fluoreszenz gezeigt werden (Abb. 13), obwohl beide Proteinketten jeweils von einem eigenen Vektor aus exprimiert wurden und bei der GFP-basierten FACS-Sortierung zudem auch nur auf die Expression der leichten Kette, bedingt durch deren transkriptionelle Kopplung mit GFP, selektioniert werden konnte. Die Produktivitäten konnten dabei allein durch die FACS-basierte Sortierung auf bis zu 9,δ pg/Zelle/Tag gesteigert werden (Abb. 11). Vergleichbare Daten konnten auch bei einer funktionellen Verknüpfung des Hamster- Promotors mit dem SV40-Enhancer anstelle des CMV-Enhancers erzielt werden. Durch einen einzigen nachfolgenden MTX-Amplifikationsschritt, ausgehend von Pools δ und 8 aus dem ersten Sortierungsschritt, durch Zugabe von 100 nM MTX zum Selektionsmedium konnte die Produktivität der Pools noch auf durchschnittlich über 20 pg/Zelle/Tag erhöht werden (Abb. 12). Die hohen Expressionslevel des fluoreszenten Proteins hatten dabei keinerlei negativen Einfluss auf Zellwachstum und -Vitalität. Bei der Genamplifikation werden die Wachstumseigenschaften der Zellen auch maßgeblich durch die Zugabe von MTX, vor allem bei Zusatz in höheren Konzentrationen, negativ beeinflusst. Die vorsortierten Zellpools wiesen jedoch ein erheblich robusteres Verhalten gegenüber der recht hohen initialen Dosis von 100 nM MTX auf. Sie überstanden die Selektionsphase viel besser, d.h. es wurden schon 7δ
nach 2 Wochen wieder Zellpopulationen mit hoher Vitalität und guter Wachstumsrate erhalten.
Zudem konnte die Entwicklungszeit zur Selektion von hochproduzierenden Zellen im
Vergleich zu einer konventionellen stufenweisen Genamplifikationsstrategie, die in der Regel vier Amplifikationsstufen mit steigenden Zugaben von MTX umfasst, auf ca. 6 Wochen reduziert werden. Dies wurde durch die kombinierte Anwendung einer Anreicherung von transfizierten Zellen mit erhöhter Expression der Gene von Interesse, erzielt durch die Verwendung eines modifizierten NPT-Selektionsmarkers mit reduzierter Enzymaktivität, gefolgt von einer GFP-basierten FACS-Sortierung mit einem nachfolgenden Genamplifikationsschritt erreicht.
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Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen an Aminosäureposition 91 ,
198 und/oder 240 bezogen auf das Wildtyp-Gen für eine andere Aminosäure als das Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase-Gen kodiert.
2. Modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierte Neomycin-Phosphotransferase, die durch das Neomycin-Phosphotransferase-Gen kodiert wird, eine geringere Enzymaktivität als die Wildtyp-Neomycin-Phosphotransferase aufweist.
3. Modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-
Gen im Vergleich zum Wildtyp-Gen an Aminosäureposition 91 bezogen auf das Wildtyp-Gen für Alanin, an Aminosäureposition 198 für Glycin, und/oder an Aminsäureposition 240 für Isoleucin kodiert.
4. Modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Neomycin- Phosphotransferase-Gen für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO:6, SEQ SEQ ID NO:8 oder SEQ ID NO:18 kodiert.
δ. Modifiziertes Neomycin-Rhosphotransferase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthaltend oder bestehend aus eine(r) Sequenz nach SEQ ID NO:δ, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:17.
6. Modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen im Vergleich zum Wildtyp-
Gen an Aminosäureposition 182 bezogen auf das Wildtyp-Gen für Glycin, an Aminossäureposition 227 für Alanin oder Valin und/oder an Aminosäureposition 261 für Glycin kodiert.
7. Modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:10, . SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 14 kodiert.
8. Modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen nach einem der Ansprüche 6 oder 7 enthaltend oder bestehend aus eine(r) Sequenz nach SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 oder SEQ ID NO:13.
9. Modifizierte Neomycin-Phosphotransferase kodiert durch ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Eukaryontischer Expressionsvektor enthaltend ein modifiziertes Neomycin- Phosphotransferase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
11. Eukaryontischer Expressionsvektor enthaltend ein heterologes Gen von Interesse in funktioneller Verknüpfung mit einem heterologen Promotor u n d ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen, welches für eine Neomycin- Phosphotransferase kodiert, die im Vergleich zur Wildtyp-Neomycin-
Phosphotransferase eine geringere Enzymaktivität aufweist.
12. Expressionsvektor nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, a) dass es sich bei dem modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gen um ein Gen nach einem der Ansprüche 1 bis δ handelt, o d e r b) das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen an Aminosäureposition 182 und/oder 227 für eine andere Aminosäure als das Wildtyp-Gen an der ensprechenden Stelle kodiert, o d e r c) das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen an Aminosäureposition 261 für ein Glycin kodiert.
13. Expressionsvektor nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen an Aminosäureposition 182 bezogen auf das Wildtyp-Gen für Glycin oder Asparaginsäure kodiert und/oder an Aminosäureposition 227 bezogen auf das Wildtyp-Gen für ein Alanin, Glycin oder Valin kodiert.
14. Expressionsvektor nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:18, SEQ ID:20 oder SEQ ID NO:22 kodiert.
1δ. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 11 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass er einen oder mehrere Enhancer in funktioneller Verknüpfung mit dem oder den Promotoren enthält.
16. Expressionsvektor nach Anspuch 1δ dadurch gekennzeichnet, dass der Enhancer ein CMV- oder SV40-Enhancer ist.
17. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 11 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass er einen Hamster Ubiquitin/S27a-Promotor enthält.
18. Expressionsvektor nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Gen von Interesse unter der Kontrolle des Ubiquitin/S27a-Promotors steht.
19. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 11 bis 18 dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich ein Gen für ein fluoreszierendes Protein enthält, welches optional funktionell mit dem Gen von Interesse und dem heterologen Promotor verknüpft ist/wird.
20. Expressionsvektor nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich eine interne Ribosomenbindungsstelle (IRES) enthält, welche eine bicistronische Expression des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des Gens, das für ein Protein/Produkt von Interesse kodiert, unter der Kontrolle eines heterologen Promotors ermöglicht.
21. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 19 oder 20 dadurch gekennzeichnet, dass sich das Gen, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen in einer oder in zwei separaten Transkriptionseinheiten befinden.
22. Säugerzelle enthaltend ein modifiziertes Neomycin-Phosphotransferase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
23. Säugerzelle die mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 10 bis 18 transfiziert wurde.
24. Säugerzelle die mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 19 bis 21 transfiziert wurde.
2δ. Säugerzelle nach einem der Ansprüche 22 bis 24 dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich mit einem Gen für einen amplizifierbaren Selektionsmarker transfiziert ist.
26. Säugerzelle nach Anspruch 2δ dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem amplifizierbaren Selektionsmarkergen um die Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) handelt.
27. Säugerzelle nach einem der Ansprüche 22 bis 26 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Säugerzelle um eine Nagerzelle handelt.
28. Säugerzelle nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nagerzelle um eine CHO- oder BHK-Zelle handelt.
29. Verfahren zur Anreicherung von Säugerzellen dadurch gekennzeichnet, dass (i) ein Pool von Säugerzellen mit einem Gen für eine modifizierte Neomycin- Phosphotransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder mit einer E182D-, D227G- oder D261 N-Neomycin-Phosphotransferase-Mutante transfiziert wird; (ii) die Säugerzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens erlauben; und (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren.
30. Verfahren zur Gewinnung und Selektion von Säugerzellen, die mindestens ein heterologes Gen von Interesse exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass (i) ein Pool von Säugerzellen mit mindestens einem Gen von Interesse und einem Gen für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder, mit einer E182D-, D227G- oder D261N-Neomycin-
Phosphotransferase-Mutante transfiziert wird;
(ii) die Säugerzellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens(Gene) von Interesse und des modifizierten Neomycin- Phosphotransferase-Gens erlauben; und (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren.
31. Verfahren nach Anspruch 30 dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen zusätzlich mit einem Gen für einen amplifizierbaren Selektionsmarker transfiziert werden und die selektionierten Säugerzellen vorzugsweise zumindest einem Genamplifikationsschritt unterzogen werden, wobei es sich bei dem amplifizierbaren Selektionsmarkergen vorzugsweise um DHFR handelt und die Genamplifikation vorzugsweise durch die Zugabe von Methotrexat erfolgt.
32. Verfahren zur Gewinnung und Selektion von Säugerzellen, die mindestens ein heterologes Gen von Interesse exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass (i) rekombinante Säugerzellen mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 19 bis 21 transformiert werden;
(ii) unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens (e) von Interesse, des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens ermöglicht;
(iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren; und (iv) die Säugerzellen mittels flowzytometrischer Analyse sortiert werden.
33. Verfahren nach Anspruch 32 dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen zusätzlich mit einem Gen für einen amplifizierbaren Selektionsmarker transfiziert werden und die mittels flowzytometrischer Analyse sortierten Zellen zumindest einem Genamplifikationsschritt unterzogen werden, wobei es sich bei dem amplifizierbaren Selektionsmarkergen vorzugsweise um DHFR handelt und die Genamplifikation vorzugsweise durch die Zugabe von Methotrexat erfolgt.
34. Verfahren zur Herstellung von mindestens einem Protein von Interesse in rekombinanten Säugerzellen dadurch gekennzeichnet, dass
(i) ein Pool von Säugerzellen mit mindestens einem Gen von Interesse und einem Gen für eine modifizierte Neomycin-Phosphotransferase nach einem der
Ansprüche 1 bis 8, oder mit einer E182D-, D227G- oder D261 N-Neomycin-
Phosphotransferase-Mutante transfiziert wird; (ii) die Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der)
Gens (Gene) von Interesse und des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-
Gens erlauben;
(iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren; und
(iv) das (die) Protein(e) von Interesse aus den Säugerzellen oder dem
Kulturüberstand gewonnen wird (werden). 3δ. Verfahren zur Herstellung von mindestens einem Protein von Interesse in rekombinanten Säugerzellen dadurch gekennzeichnet, dass (i) rekombinante Säugerzellen mit einem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 19 bis 21 transfiziert werden;
(ii) unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des (der) Gens (e) von Interesse, des Gens, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und des modifizierten Neomycin-Phosphotransferase-Gens ermöglicht; (iii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-Phosphotransferase-Gen exprimieren; und
(iv) die Säugerzellen mittels flowzytometrischer Analyse sortiert werden (v) das (die) Protein(e) von Interesse aus den Säugerzellen oder dem Kulturüberstand gewonnen wird (werden).
36. Verfahren zur Herstellung von mindestens einem Protein von Interesse dadurch gekennzeichnet, dass
(i) Säugerzellen nach einem der Ansprüche 2δ oder 26 unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des Gens von Interesse, des modifizierten
Neomycin-Phosphotransferase-Gens und des amplifizierbaren Selektionsmarkergens erlauben;
(ii) die Säugerzellen in Anwesenheit zumindest eines Selektionsmittels kultiviert und selektioniert werden, das selektiv auf das Wachstum von Säugerzellen wirkt, und solche Zellen im Wachstum bevorzugt, die das modifizierte Neomycin-
Phosphotransferase-Gen exprimieren;
(iii) die selektionierten Säugerzellen zumindest einem Genamplifikationsschritt in unterzogen werden; und
(iv) das (die) Protein(e) von Interesse anschließend aus den Säugerzellen oder dem Kulturüberstand gewonnen wird (werden). 8δ
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36 dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen mit mindestens zwei Genen von Interesse transfiziert sind, die für ein heteromeres Protein/Produkt kodieren, und
(i) unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression der Untereinheiten des heteromeren Proteins/Produkts ermöglichen; und
(ii) das heteromere Protein/Produkt aus der Kultur oder dem Kulturmedium isoliert wird.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 37 dadurch gekennzeichnet, dass die aussortierten Säugerzellen eine durchschnittliche spezifische Produktivität von größer δpg des (der) gewünschten Genprodukts (Genprodukte) pro Tag und Zelle zeigen.
39. Verfahren nach Anspruch 36 oder 37 dadurch gekennzeichnet, dass die aussortierten Wirtzellen eine durchschnittliche spezifische Produktivität von größer 20pg des (der) gewünschten Genprodukts (Genprodukte) pro Tag und Zelle zeigen.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 39 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Säugerzelle um eine Nagerzelle handelt.
41. Verfahren nach Anspruch 40 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nagerzelle um eine CHO- oder BHK-Zelle handelt.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 41 dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen in Suspensionskultur kultiviert werden.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 42 dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen serumfrei kultiviert werden.
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