WO2004044199A1 - スクリーニング方法 - Google Patents

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WO2004044199A1
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Takanori Matsuo
Hiroko Tsuge
Masatoshi Hazama
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a novel use of Transforming Growth Factor-) 3 Stimulated Clone-22 (hereinafter abbreviated as TSC-22), a polynucleotide encoding the same, or an antibody against the same, particularly, TSC-M-22 or a TSC-22.
  • TSC-22 Transforming Growth Factor- 3 Stimulated Clone-22
  • the present invention relates to methods for preventing and treating renal diseases, etc., using polynucleotides that are used.
  • angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors are used as remedies for renal disease.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • TGF- 3 Transforming growth factor 1/3 (hereinafter abbreviated as TGF-) 3 is a factor that plays a central role in renal fibrosis.
  • Administration of decorin, an endogenous neutralizing factor of TGF_i3, anti-TGF- / 3 antibody or antisense oligonucleotide of TGF-] 3, to rat models of glomerulonephritis markedly inhibits extracellular matrix (ECM) production It has been reported that the development of glomerular sclerosis is suppressed. In addition, it is known that the introduction of the TGF10 gene in vivo causes accumulation of ECM and induces glomerulonephritis.
  • TGF-j3 realizes various physiological activities by regulating the transcription of various target genes through intracellular signal transduction factors collectively called Smad from its receptor. Therefore, there is a possibility that a molecule located further downstream of the TGF-) 3 signal transduction system may constitute a substance that promotes renal function decline.
  • Ding3 22 is a gene that responds to TGF-] 3 stimulation and encodes a protein with a leucine zipper (LZ) domain, which was first isolated from a mouse osteoblast cell line.
  • LZ leucine zipper
  • the TSC-22 protein has an LZ domain that is often found in transcription factors, but lacks known DNA binding regions (basic amino acid regions, helix-loop-helix (HLH) motifs, etc.) Although it is predicted to act as a transcription repressor, it has been reported that it binds to the GC element of the type C sodium diuretic peptide gene and promotes its transcription. Eur. J. Biochem., 242 460- 6 (1996)), but its physiological functions are not yet well understood.
  • An object of the present invention is to provide a novel screening suitable for searching for a substance useful as a prophylactic and / or therapeutic drug that is indispensable for developing a therapeutic drug for preventing or treating renal diseases, which has excellent effects and has no side effects. Is to provide a way. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, expression of renal TSC-22 in various renal disease model animals is remarkable, particularly in glomerular epithelial cells and tubular epithelial cells. For the first time, it was found that suppression of renal TSC-22 expression in renal disease model animals could produce a therapeutic effect on renal disease. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used. Prevention of related diseases One way method;
  • [6] (a) a cell capable of producing a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (b) Selected from the group consisting of an antibody against the protein or its partial peptide or a salt thereof, a polynucleotide to which the protein or its partial peptide or its salt can bind, and a transcription control factor capable of interacting with the protein or its partial peptide or its salt
  • [8] (a) a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the protein or a partial peptide thereof or Interacts with a polynucleotide to which a salt can bind, or the protein or its partial peptide, or a salt thereof.
  • kits for screening a substance for preventing or treating a disease associated with the protein or a salt thereof comprising a polynucleotide that can hybridize with mRNA encoding the protein or a partial peptide thereof under high stringency conditions;
  • a protein or a salt thereof comprising an antibody against a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Diagnostics for diseases associated with
  • a polynucleotide comprising a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide having a base sequence encoding a partial peptide thereof, A diagnostic agent for a disease associated with the protein or a salt thereof;
  • prophylactic or therapeutic drugs for diabetes or kidney disease comprising TSC-22 inhibitors
  • a method for preventing or treating diabetes or kidney disease in a mammal which comprises administering a TSC-22 inhibitor to the mammal;
  • TSC-22 inhibitor use of a TSC-22 inhibitor to produce a prophylactic or therapeutic drug for diabetes or kidney disease
  • FIGS. 1D to 1F show sections from spontaneously hypercholesterolemic SHC rat kidney.
  • Figures 1A and D magnification: X500
  • Figures 1B and E magnification: X400
  • Figures 1C and F are those of the glomerulus. It is a microscope image.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a mammal (eg, , Human, mouse, rat, egret, sheep, pig, pig, zebra, zebra, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.
  • hepatocytes eg, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, Gut iS cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages , T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, bone Cells, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells or cancer cells of these cells, or any tissue in which those cells are present, for example, For example, olfactory bulb, amygdala, basal ganglia, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • An amino acid sequence having about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more homology is exemplified.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 2 However, a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferable.
  • substantially equivalent activities include, for example, transcription control activities of the insulin gene and the like. Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, it is preferable that the transcription control activities are equivalent (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity of the protein and the molecular weight of the protein may be different.
  • the transcription control activity can be measured using a known method, for example, Northern analysis or gel shift assay for a target gene.
  • the activity of the protein of the present invention can also be evaluated by a method using its intracellular localization, for example, by examining the degree of translocation from the cytoplasm to the nucleus.
  • Examples of the protein of the present invention include (i) one or more (preferably about 1 to 30 and preferably 1 to 10) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Degree, more preferably an amino acid sequence in which a number (1-5) amino acids have been deleted; (ii) one or more (preferably 1-30) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence to which about 1, preferably about 1 to 10, more preferably (1 to 5) amino acids have been added; (iii) 1 or 2 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 (Iv) about 1 to 30 amino acids, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably about 1 to 5 amino acids, and (iv) SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence represented by I an amino acid sequence in which about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids have been substituted with another amino acid, or (V) a combination thereof.
  • a so-called mutin such as a protein containing an amino acid sequence is also included.
  • the protein of the present invention is preferably a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, that is, a human TSC-22 protein or a homolog thereof in other mammals.
  • the protein has a N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, has a C-terminal carbonyl group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH) 2 ) or ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl, ⁇ Bok 6 alkyl group, such as n- butyl; for example, cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl; for example, phenyl, (6 _ 12 Ariru groups such as ⁇ - naphthyl le; for example, benzyl, phenylene Lou 2 alkyl group such as phenethyl; C 7 _ 14 such as flying one Nafuchiru C E _ 2 alkyl group such as ⁇ - naphthylmethyl 7 aralkyl group; pivaloyloxymethyl group and the like are used.
  • ⁇ Bok 6 alkyl group such as n- butyl
  • C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl
  • phenyl (6 _ 12 Ariru groups such as ⁇ -
  • the protein of the present invention has a carbonyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., formyl group, etc.
  • Ashiru groups such as ( ⁇ _ 6 Arukanoi Le such Asechiru group) Protected by, cut in vivo and produced N-terminal glutamine residue is pyroglutamine-oxidized, and substituents on the side chains of amino acids in the molecule (for example, 1 OH, 1 SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are suitable.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is a peptide having the partial amino acid sequence of the protein of the present invention described above. Any substance may be used as long as it has substantially the same activity as the protein. For example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, conserved LZ domain and its amino terminal side Those having a partial amino acid sequence including a region (TSC box) are used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 30 or more, preferably 60 or more, more preferably 100 or more amino acids in the constituent amino acid sequence of the protein of the present invention. Peptides and the like are preferred.
  • substantially the same activity is as defined above.
  • the “substantially the same activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the C-terminus force Rupokishiru group (one CO OH), Cal Pokishireto (_ CO_ ⁇ -), amides may be any of (one C_ ⁇ _NH 2) or an ester (one COOR) .
  • examples of R in the ester include the same as described above for the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminal
  • the partial peptide of the present invention includes amidation or esterification of the lipoxyl group.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention has a N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected by a protecting group, and is formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • G 1 n oxidized by pyroglutamine, of amino acids in the molecule Also included are those in which the substituent on the side chain is protected by an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bonded, such as a so-called glycopeptide.
  • Examples of the salt of the protein or its partial peptide of the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Cono, citric acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Cono, citric acid, tartaric acid, citric acid, malic acid,
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the mammalian cells or tissues described above by a protein purification method known per se. Specifically, mammalian tissues or cells are homogenized, and the soluble fraction and Z or nuclear fraction are subjected to chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced by separating and purifying with the above.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • condensation and elimination of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the methods described in the following (i) to (v).
  • the protein thus obtained can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the protein is obtained as a salt.
  • the salt can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • resins for protein synthesis can be used.
  • examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethyl resin.
  • Methylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, etc. Can be mentioned.
  • an amino acid in which the amino group and the side chain functional group are appropriately protected can be converted into the same sequence as the target protein or peptide (hereinafter sometimes collectively referred to as “protein etc.”). Condensation is performed on the resin according to various known condensation methods. At the end of the reaction, proteins and the like are cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or the like or an amide thereof.
  • the protected amino acids may be added directly to the resin along with the racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt) or may be pre-formed as symmetrical anhydrides or HOBt esters or HOOBt esters. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • the racemization inhibitor eg, HOBt, HOOBt
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or esters thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, tertiary pentoxycarbonyl, isopolnyoxycarbonyl, and 4-methoxybenzyl.
  • Xyxalponyl, C11-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 212-trophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification , Benzyloxycarbonyl hydrazide, tert-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl,
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group and the like are used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B z 1, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as tertiary butyl is used.
  • the imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-1,2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used. .
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Reduction by pum is also used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C. ((40 ° C.).
  • a force-thione scavenger such as thiol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • a force-thione scavenger such as thiol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • imidazole protecting group for histidine 2,4-
  • the dinitrophenyl group is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group for tryptophan is treated with dilute water in addition to the above deprotection by acid treatment in the presence of 1,2-ethanedithiol and 1,4-butanedithiol. It is also removed by alkali treatment with sodium oxide solution, dilute ammonia and the like.
  • Activated carbonyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromethylphenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t)].
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromethylphenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • an amide form of a protein or the like for example, first, a carboxy-terminal amino acid is protected by amidating a high-potency ropoxyl group, and a peptide (protein) chain is added to the amino group side at a desired chain length. Then, a protein or the like from which only the protecting group for the ⁇ -amino group at the N-terminus of the peptide chain is removed and a protein or the like from which only the protecting group for the C-terminal lipoxyl group is removed are produced. The protein and the like are condensed in the above-mentioned mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or the like is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide such as a desired protein.
  • an ester of a protein or the like for example, after condensing a carboxy terminal amino acid lupoxyl group with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein or the like is obtained in the same manner as the amide of a protein or the like. You can get the body.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can also be produced by cleaving the protein of the present invention or a salt thereof with an appropriate peptidase.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof is obtained by culturing a transformant containing DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and isolating the protein or the like of the present invention from the obtained culture. It can also be produced by purification.
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof include genomic DNA, genomic DNA library, human or other mammals (for example, males, monkeys, females, horses, higgins, goats, etc.). , Dogs, cats, guinea pigs, rats, mice, rabbits, hamsters, and any other cells (for example, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney i3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, Epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (e.g., macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils Spheres, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocyte
  • the vectors used for the library are bacteriophage, plus Any of mid, cosmid, phagemid and the like may be used. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above. .
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under conditions of high stringency.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under high stringent conditions include, for example, about 50% or more, preferably about 60%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more, more preferably about 70% or more, particularly preferably about 80% or more, and most preferably about 90% or more.
  • hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, described in Molecular Cloning, 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). This can be done according to the method described above. When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can preferably be performed according to high stringency conditions.
  • High stringency end conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to The conditions at 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is preferable.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is preferably a DNA containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention is not limited as long as it contains a base sequence encoding the same or substantially the same amino acid sequence as a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Anything may be used.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by the RT-PCR method using an mRNA fraction prepared from the above-described cells and tissues.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (2) An activity substantially identical to a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid sequence encoded by the DNA (for example, a DNA encoding a peptide having a transcription control activity is used.
  • DNA that can be hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under high stringency conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more, and more preferably about 80% or more of the nucleotide sequence. Most preferably, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having about 90% or more identity is used.
  • the DNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide was amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein or peptide, or incorporated into an appropriate expression vector.
  • the DNA can be cloned by hybridizing it with a DNA fragment encoding a part or the whole region of the protein of the present invention or with a labeled synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition (described above). When a commercially available library is used, hybridization is performed according to the method described in the instruction manual attached to the library. Can be.
  • the DNA base sequence can be determined using known kits, for example, Mutan TM -Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), ODA-LA PCR, Gapped duplex method.
  • the conversion can be carried out according to a method known per se such as the Kunkel method or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose, or after digestion with a restriction enzyme, if desired, or after adding a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • a DNA fragment of interest is cut out from the DNA encoding the protein of the present invention, and the DNA fragment is ligated downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by the following.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUBll0, TP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, PSH19, pSHl 5
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus
  • Any promoter may be used as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • SRo! Promoter when the host is an animal cell, SRo! Promoter, SV40 Promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, H SV-TK promoter and the like are used. Of these, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • CMV promoter When the host is Eshierihia genus, trp promoter, lac promoter one, re cA promoter, AP L promoter Isseki one, lpp promoter, T7 flop port motor - and the like are preferable.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like are preferable.
  • PHO5 promoter When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • SV400 ri SV40 replication origin
  • the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp f) ), the neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o 1 ", G418 resistant) and the like.
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • Amp f ampicillin resistance gene
  • Ne o 1 neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host may be added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc .; when the host is a Bacillus genus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc .;
  • the host is an animal cell, an insulin signal sequence, an ⁇ -interferon signal sequence, an antibody molecule and a signal sequence are used.
  • a transformant can be produced by transforming a host with an expression vector containing the DNA according to a known method.
  • expression vectors include those described above.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli, K12, DH1 [Procedures of the National Academia]. Sac (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 (Nucleic Acids Research, 9th, 309 (1981)), JA221 [Journal II] Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978), HB 101 [Journal 'ob' Molecular 'Pyology 1, 41, 459 (1969)], C 600 [diene] Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, ⁇ 87-11A, DKD—5D, 20B-12, and Schizosaccharomyces pombe NC YC193, NCYC 2036, Pichia pastoris K M71 or the like is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High derived from egg of Trichoplusia ni Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea and the like are used. virus When BmNPV is used, Bombyx mori N cells (BmN cells) and the like are used as insect cells. As the Sf cells, for example, Sf9 cells
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al.
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dh fr—) cell). ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host. Escherichia bacteria are described, for example, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 21. 10 (1972) and Gene (17), 107 (1982).
  • Bacillus can be transformed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Yeasts are described, for example, in Methods in Enzymology, Vol. 194, 182—187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences. Transformation can be performed according to the method described in USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978).
  • Insect cells and insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • the transformant can be cultured according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferably used as the culture medium.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like necessary for the growth of the transformant.
  • a carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • a nitrogen source for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, Inorganic or organic substances such as potato extract; and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid is preferred.
  • a drug such as, for example, 3i3-indolylacrylic acid may be added to the medium in order to make the opening motor work efficiently.
  • Culture of a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • Culture of the transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Bacillus is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • Examples of a culture medium for culturing a transformant in which the host is yeast include Burkholder's minimum medium OBostian, KL, and the like. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and 0.5% casamino acids SD medium [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. 5330 (1984)].
  • the ⁇ of the medium is preferably about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 for about 24 to 72 hours. Ventilation and agitation may be performed as necessary.
  • the culture medium for culturing insect cells or transformants whose insects are insects is, for example, Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). For example, those to which additives such as 10% purified serum and the like are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably between about 6.2 and 6.4. Culture is usually performed at about 27 C for about 3 to 5 days. Ventilation and stirring may be performed as necessary.
  • Examples of a medium for culturing a transformant in which the host is an animal cell include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122: 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association's (The Journal of the American Medical Association) 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] and the like are used.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours. Aeration and stirring may be performed as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced intracellularly (in the nucleus or cytoplasm) or extracellularly of the transformant.
  • the protein or the like of the present invention can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • the cells or cells collected by a known method from the culture are suspended in an appropriate buffer, and the cells are treated with ultrasonic waves, lysozyme and / or After the cells or cells are destroyed by freeze-thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the soluble protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-1000 TM .
  • the precipitate obtained by the above-mentioned centrifugation or filtration is treated with, for example, a hypertonic solution and the like, and the supernatant is collected by centrifugation to collect the nuclear protein.
  • a method of obtaining a crude extract of the above is used.
  • Isolation and purification of the protein or the like of the present invention contained in the thus obtained soluble fraction or nuclear extract can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include methods using solubility such as salting-out and solvent precipitation; dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method using difference in charge such as ion exchange chromatography; method using specific affinity such as affinity chromatography; difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • a method utilizing a difference in isoelectric points such as isoelectric focusing electrophoresis.
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and when the protein or the like is obtained as a salt, it is known per se.
  • the salt can be converted to a free form or another salt by the method of or a method analogous thereto.
  • the protein or the like produced by the transformant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • protein-modifying enzyme include trypsin, chymo Trypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the protein or the like of the present invention thus obtained can be confirmed by, for example, enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the protein or the like of the present invention may be obtained by using RNA corresponding to DNA encoding the above-described protein of the present invention or a partial peptide thereof as a type III, such as a heron reticulocyte lysate, a wheat germ lysate, and an Escherichia coli lysate. It can also be synthesized by in vitro translation using a cell-free protein translation system. Alternatively, a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can also be synthesized in the form of ⁇ using a cell-free transcription / translation system containing RNA polymerase.
  • the disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof includes a disease in which the amount of the protein of the present invention or a salt thereof is increased or decreased as compared with a normal state.
  • the “disease in which the amount of the protein of the present invention or its salt is increased as compared to the normal state” is, for example, a renal disease (eg, diabetic nephropathy; chronic glomerulonephritis; IgA kidney).
  • a renal disease eg, diabetic nephropathy; chronic glomerulonephritis; IgA kidney.
  • the amount of the protein of the present invention or a salt thereof is reduced as compared with the normal state.
  • diseases include gastrointestinal diseases (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer; gastric cancer; salivary gland cancer); skin diseases (eg, burns, postoperative wounds); and brain tumors.
  • the disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof is preferably a renal disease or diabetes, more preferably diabetic nephropathy.
  • the present invention relates to a method for screening a substance for preventing or treating a disease associated with the protein, which comprises using the protein or the like of the present invention.
  • the screening method includes, for example,
  • the "gene whose expression is controlled by the protein of the present invention” includes, for example, an insulin gene.
  • the gene may be a chimeric DNA containing a cis element of a promoter (eg, an insulin gene promoter or the like) whose transcriptional activity is controlled by the protein or the like.
  • various reporters are provided downstream of the promoter.
  • DNAs encoding proteins may be ligated.
  • Examples of “cells containing a gene whose expression is controlled by the protein of the present invention” include, for example, ⁇ cells.
  • Examples of the "promoter whose transcription activity is controlled by the protein of the present invention” include, for example, an insulin gene promoter.
  • transcription regulator capable of interacting with the protein of the present invention examples include, for example, a transcription regulator capable of binding to a cis element of an insulin gene promoter. It can be provided as a liquid.
  • a transcription control factor capable of interacting with the protein or the like of the present invention can be purified from a nuclear extract using the protein or the like of the present invention as a probe, or obtained by using a polynucleotide encoding the protein or the like of the present invention.
  • -cDNA can be cloned by the hybrid method.
  • the supply of the protein or the like of the present invention to the screening system can also be carried out by using a cell that further has the ability to produce the protein or the like.
  • Cells having the ability to produce the protein of the present invention used in the screening method using the protein of the present invention are not particularly limited, but the cells of the present invention may be responsive to various stimuli such as oxidative stress and treatment with a growth factor. Those that induce the production of proteins and the like are preferred.
  • the cell capable of producing the protein or the like of the present invention may be a transformant containing DNA encoding the above-described protein or the like of the present invention.
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention include mammals (preferably, humans, rats, mice, etc.) kidneys or kidneys, more preferably cells isolated from kidneys, and the like. No. These cells may be immortalized.
  • Culturing of cells having the ability to produce the protein or the like of the present invention is performed in the same manner as in the above-described transformant.
  • Test substances include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the protein or the like of the present invention can be quantified by a known method, for example, using an antibody against the protein or the like of the present invention, according to a method such as Western analysis, ELISA method or a method analogous thereto.
  • the term "antibody to the protein or the like of the present invention” refers to any antibody that can recognize the protein or the like of the present invention, such as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. It may be.
  • the antibody may be the antibody molecule itself, or may be F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule. Further, the antibody may be labeled.
  • a labeling agent used for labeling an antibody for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • a radioisotope e.g., [3 5 S) [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable, and for example, ⁇ -galactosidase, 3-darcosidase, allyl phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin- (strebut) avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the protein or the like of the present invention can be quantified using a transcription control factor capable of interacting with the protein or the like of the present invention according to West-Western analysis or a method analogous thereto.
  • the transcription control factor is preferably labeled, and as the labeling agent, the same substances as described above can be used.
  • the protein or the like of the present invention can be quantified using a polynucleotide to which it can bind, according to the gel shift assay or a method analogous thereto.
  • Polynucleotides to which the protein of the present invention can bind include those containing a sequence in the promoter region of a gene to which the protein of the present invention binds and regulates transcription. For example, previously reported, but not limited to, the GC element of the C-type natriuretic peptide gene.
  • the protein or the like to be quantified may be one contained in a cell or secreted outside a cell, and may be a total of both.
  • the cells When quantifying the protein of the present invention contained in the cells, the cells are appropriately fixed. It is preferably performed after the treatment with a liquid or a membrane permeation enhancer. In addition, after suspending the cells in an appropriate buffer and disrupting the cells by ultrasonication or freeze-thawing, the amount of proteins and the like in the disrupted liquid can be determined. If necessary, the protein and the like in the crushed liquid may be separated and purified, and then the protein and the like may be quantified. When quantifying the protein or the like of the present invention transferred into the nucleus, the protein in the nuclear extract obtained by disrupting the cells as described above, collecting the precipitate, and treating the precipitate with a hypertonic solution or the like is further used. And so on.
  • the intracellular localization of the protein or the like of the present invention is evaluated, for example, by monitoring the degree of translocation of the protein or the like from the cytoplasm to the nucleus in cells having the ability to produce the protein or the like. can do.
  • the transfer of the protein or the like from the cytoplasm to the nucleus can be monitored.
  • a transformant capable of expressing the protein or the like of the present invention as a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP translocation of the protein or the like from the cytoplasm to the nucleus can be directly monitored ( See, for example, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278: 659-664 (2000)).
  • the present invention also relates to a screening kit that can be used in the screening method based on the production amount of the protein or the like of the present invention described in 1) above.
  • the kit comprises: (a) a cell capable of producing the above-described protein of the present invention; and (b) a reagent capable of detecting the protein of the present invention. It is characterized in that it comprises at least one, preferably both, of an antibody, a polynucleotide to which the protein or the like can bind, or a transcription control factor capable of interacting with the protein or the like as its constitution.
  • the kit may further include, as required, other reagents and instruments necessary or preferable for performing the screening method 1) above.
  • the activity of the protein or the like of the present invention used as an index in the screening method of the above 2) using the protein or the like of the present invention includes, for example, a transcription control activity.
  • a transcription control activity For example, "activity of controlling the binding of a transcription control factor capable of interacting with the protein or the like of the present invention to a target polynucleotide", “binding activity of a protein or the like of the present invention to a target polynucleotide”, “Activity of controlling the expression of a gene under the control of transcription control by the protein of the present invention” and “nuclear translocation activity of the protein of the present invention” and the like can be mentioned.
  • transcription control factor capable of interacting with the protein of the present invention examples include, for example, a transcription factor involved in the transcription control of an insulin gene, wherein the transcription control activity is regulated by the protein of the present invention. And the like.
  • a transcription control factor can be provided as a nuclear extract of a cell that expresses it (for example, ⁇ cells in the case of the insulin gene transcription factor).
  • target polynucleotide of a transcription control factor capable of interacting with the protein or the like of the present invention include, for example, a polynucleotide containing a nucleotide sequence of a human or other mammal-derived insulin gene promoter or a part thereof. No.
  • target polynucleotide such as the protein of the present invention
  • examples of the “target polynucleotide such as the protein of the present invention” include those exemplified as the above "polynucleotide to which the protein of the present invention can bind”.
  • the binding activity or the activity controlling binding can be measured by a known method such as a gel shift assay (electrophoretic mobility shift assay) or a method analogous thereto.
  • a gene under the control of transcription control by the protein or the like of the present invention a gene under the control of a promoter containing, as a cis element, a target polynucleotide of a transcription control factor capable of interacting with the protein or the like of the present invention, or Examples include a gene under the control of a promoter containing a target polynucleotide such as the protein of the present invention as a cis element.
  • the former includes, for example, the insulin gene.
  • the latter previously reported, includes the C-type natriuretic peptide gene.
  • the expression control activity of such a gene can be determined by preparing appropriate primers based on the nucleotide sequence of mRNA produced from the gene and performing RT-PCR to transcribe the gene. It can be measured by measuring the amount of the product.
  • the above-mentioned expression control activity can be measured by Northern blotting using a probe prepared by labeling a polynucleotide containing all or a part of the base sequence of mRNA produced from the gene according to a known method or a method analogous thereto. It can be measured by the blotting method.
  • the above-mentioned expression control activity can be determined by a known method or a method analogous thereto according to a known method or a method analogous thereto, including a target polynucleotide such as a transcription control factor capable of interacting with the protein of the present invention or a target polynucleotide such as the protein of the present invention.
  • An expression vector in which an appropriate reporter gene is ligated downstream is prepared, and the vector is introduced into an appropriate cell, preferably a cell producing a protein or the like of the present invention and Z or a transcription control factor capable of interacting therewith. Alternatively, it can be measured by confirming the expression of the protein encoded by the repo overnight gene.
  • kits that can be used in the screening method of 2a) include (a) a cell containing a gene whose expression is controlled by the protein of the present invention, (b) a protein of the present invention, and (c) A reagent capable of detecting the expression of a gene, for example, a reagent containing at least one, and preferably all of the polynucleotides capable of hybridizing with the gene under high stringent conditions is included.
  • the protein or the like of the present invention in (b) may be produced by the cell in (a).
  • Kits that can be used in the screening method of 2b) include (a) the protein of the present invention, and (b) the polynucleotide or the protein of the present invention to which the protein of the present invention can bind. Those that include at least one, and preferably both, of the transcription regulators that can act as constituents thereof.
  • Kits that can be used in the screening method of 2c) include (a) cells having the ability to produce the protein of the present invention and, if necessary, (b) antibodies against the protein and the like. Are included.
  • the cell of (a) when the protein of the present invention is produced in a form that can be visualized in living cells, such as a fusion protein with a fluorescent protein such as GFP, the antibody of (b) can be omitted. it can.
  • kits can further include, as required, other reagents and instruments necessary or preferable for carrying out the above-mentioned screening method 2).
  • the subject of the present invention instead of comparing the production amount or activity of the protein of the present invention in the presence and absence of the test substance, it is suspected that the subject of the present invention has a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the amount or activity of the protein of the present invention in cells or other specimens derived from an animal with those derived from a normal control animal it is determined whether or not the test animal has a disease associated with the protein of the present invention.
  • a substance for preventing or treating a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof that is, a substance that regulates (promotes or inhibits) the production of the protein or the like of the present invention, or A substance that regulates (promotes or inhibits) the activity of the protein or the like of the present invention can be screened.
  • a test substance that reduces the production of the protein or the like of the present invention by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, as a substance that inhibits the production of the protein or the like of the present invention You can choose.
  • a test substance that increases the activity of the protein or the like of the present invention by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more promotes the activity of the protein or the like of the present invention.
  • the preventive and therapeutic substances for diseases associated with the protein of the present invention obtained by using the screening method of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, Any of animal tissue extract, plasma, etc. may be used. These may form a salt, and specific examples of the salt include those similar to the above-mentioned salt of the protein of the present invention.
  • the “prophylactic / therapeutic substance for a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof” (compound) obtained by the screening method using the protein or the like of the present invention may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier if necessary. After being made into a pharmaceutical composition, it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the pharmacologically acceptable carrier various organic or inorganic carrier substances commonly used as a drug substance are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations, and solvents in liquid preparations It is formulated as a solubilizer, suspending agent, tonicity agent, buffer, soothing agent and the like. If necessary, pharmaceutical additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners can also be used. '
  • excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, starch, pregelatinized starch, dextrin, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose sodium, and Arabicago. , Pullulan, light citric anhydride, synthetic aluminum silicate, magnesium metasilicate aluminate, and the like.
  • Preferred examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like.
  • binder examples include starch arsenide, sucrose, gelatin, gum arabic, methylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose sodium, crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, trehalose, dextrin, pullulan, Hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polybierpilidone, and the like.
  • Preferred examples of the disintegrant include lactose, sucrose, starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethylcellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, light caffeic anhydride, and low-substituted hydroxypropyl pill. Cellulose and the like can be mentioned.
  • Preferred examples of the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, sesame oil, corn oil, and so on. Leaven oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizer examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannyl, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, Examples include sodium salicylate and sodium acetate.
  • the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride and glycerin monostearate; Hydrophilic polymers such as alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose; polysorbates, and polyoxyethylene hardened castor oil.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride and glycerin monostearate
  • Hydrophilic polymers such as alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose
  • Preferred examples of the tonicity agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose and the like.
  • buffer solutions such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • Preferred examples of the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • Suitable examples of preservatives include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • Preferred examples of the antioxidant include sulfite, ascorbate and the like.
  • the coloring agent include water-soluble edible tar dyes (eg, edible dyes such as edible red Nos. 2 and 3, edible yellows 4 and 5, edible blue Nos. 1 and 2, water-insoluble lake dyes) (Eg, the aluminum salt of the water-soluble edible tar dye, etc.), and natural pigments (eg, ⁇ -potency rotin, chlorophyll, bengalara, etc.)
  • Preferable examples of the sweetener include sodium saccharin and dipotassium glycyrrhizinate. Pum, aspartame, stevia and the like.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include oral preparations such as disintegrants, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, and suspensions; and injections (eg, Subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.), external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, ointments, etc.), suppositories (eg, rectal suppositories, Parenteral preparations such as vaginal suppositories, pellets, drops, sustained-release preparations (eg, sustained-release microcapsules, etc.) can be safely administered orally or parenterally.
  • oral preparations such as disintegrants, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, and suspensions
  • injections eg, Subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injection
  • the pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the technical field of formulation, for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia. The specific manufacturing method of the drug product is described below in detail.
  • the content of the compound obtained by the screening method of the present invention in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, the dose of the compound and the like, but is, for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • oral preparations include, as active ingredients, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol, etc.), disintegrants (eg, carboxymethylcellulose calcium, etc.), binders (eg, pregelatinized starch, Add gum arabic, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polybierpyrrolidone, etc.) or lubricating agents (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 600, etc.) and compress and mold.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch, D-mannitol, etc.
  • disintegrants eg, carboxymethylcellulose calcium, etc.
  • binders eg, pregelatinized starch, Add gum arabic, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polybierpyrrolidone, etc.
  • lubricating agents eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 600, etc.
  • the coating base examples include a sugar coating base, a water-soluble film coating base, an enteric film coating base, a sustained release film coating base, and the like.
  • sucrose is used, and one or more kinds selected from talc, precipitated calcium carbonate, gelatin, acacia, pullulan, carnapalow and the like may be used in combination.
  • hydroxypropyl cell mouth Cellulose-based polymers such as cellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and methylhydroxyethylcellulose; polyvinylacetate-l-decylaminoacetate, aminoalkyl methacrylate copolymer E [Eudragit E (trade name) Synthetic polymers such as polyvinylpyrrolidone; and polysaccharides such as pullulan.
  • enteric film coating base examples include cellulosic polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose and cellulose acetate fluorate; L [Eudragit L (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.], Copolymer methacrylate LD [Eudragit L — 30 D55 (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.], methacrylic acid copolymer S [Eudragit S (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and natural products such as shellac.
  • cellulosic polymers such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, carboxymethylethylcellulose and cellulose acetate fluorate
  • L Eudragit L (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.]
  • Copolymer methacrylate LD “Eudragit L — 30 D55 (trade name), Rohm Pharma Co.
  • sustained-release film coating base examples include cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.); ethyl acrylate / methacrylic acid Acrylic acid polymers such as methyl copolymer suspension [Eudragit NE (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and the like.
  • cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.); ethyl acrylate / methacrylic acid Acrylic acid polymers such as methyl copolymer suspension [Eudragit NE (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and the like.
  • the above-mentioned coating bases may be used by mixing two or more kinds thereof at an appropriate ratio. Further, at the time of coating, a light shielding agent such as titanium oxide, iron sesquioxide and the like may be used.
  • Injectable preparations contain active ingredients as dispersants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), preservatives (eg, methylparaben, propylparaben, benzyl) Alcohol, chlorobutanol, phenol, etc.), tonicity agent (eg, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, dextrose, etc.) and aqueous solvents (eg, distilled water, physiological saline, Ringer's solution) or It is manufactured by dissolving, suspending, or emulsifying in oily solvents (eg, vegetable oils such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, and propylene glycol).
  • dispersants eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyethylene glycol, carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.
  • additives such as a solubilizing agent (eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, etc.), a soothing agent (eg, benzyl alcohol, etc.) are used. Is also good.
  • a solubilizing agent eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.
  • a stabilizer eg, human serum albumin, etc.
  • a soothing agent eg, benzyl alcohol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in mammals (for example, humans, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, monkeys). , Chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • the dosage of the preventive or therapeutic agent for diseases associated with the protein or its salt of the present invention varies depending on the target disease, the administration target, the administration route, and the like.
  • an adult patient 60 kg in weight
  • administering about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 mg of the compound obtained by the screening method of the present invention as an active ingredient per day. 0 to 20 mg.
  • the present invention is further characterized in that a polynucleotide containing a base sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof (hereinafter, sometimes abbreviated as “polynucleotide of the present invention”) is used. And a method for screening a substance for preventing or treating a disease associated with the protein or a salt thereof of the present invention.
  • examples of the disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof include those described above in the screening method using the protein or the like of the present invention.
  • the disease is kidney disease or diabetes.
  • it is diabetic nephropathy.
  • the polynucleotide of the present invention may be any of a DNA, RNA and a DNAZA chimera as long as it contains a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof, Preferably it is DNA. These may be either double-stranded or single-stranded. For double-stranded, double-stranded DNA, double-stranded R NA or DNA: RNA hybrid may be used. For single strand, sense strand
  • DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof include those described above in the method for producing the protein or the like of the present invention by a genetic engineering technique.
  • the screening method using the polynucleotide of the present invention includes, for example, culturing cells having the ability to produce the protein or the like of the present invention and cells having the ability to produce the protein or the like of the present invention in the presence of the test substance.
  • the amount of mRNA encoding the protein of the present invention or its partial peptide is measured and compared using the polynucleotide of the present invention.
  • the cell having the ability to produce the protein of the present invention the method for culturing the cell, and the test substance, those similar to the above-described screening methods using the protein, etc. of the present invention can be mentioned.
  • the amount of mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be quantified according to a known method, for example, the method described in Molecular Cloning, 2nd edition (described above) or a method analogous thereto. it can.
  • a total RNA or polyA (+) RNA is extracted from a culture of cells having the ability to produce the protein or the like of the present invention by a conventional method, and the polynucleotide of the present invention, for example, SEQ ID NO: 1 Northern hybridization is carried out using a polynucleotide containing all or a part of the base sequence represented as a probe, or a pair of oligos containing a part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Quantification can be performed by RT-PCR using nucleotides as primers.
  • a test substance that increases the amount of mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof by about 20% or more, preferably 30% or more, and more preferably about 50% or more, is added to the protein of the present invention.
  • the present invention also relates to a screening kit that can be used in the above-described screening method using the polynucleotide of the present invention.
  • the kit comprises: (a) a cell capable of producing the above-described protein of the present invention; and) a reagent capable of detecting the expression of a gene encoding the protein of the present invention, for example, a protein of the present invention. And at least one, and preferably both, of the polynucleotides capable of hybridizing under high stringency conditions with the mRNA encoding the same.
  • the kit may further include, as desired, other reagents and instruments necessary or preferable for performing the above-described screening method using the polynucleotide of the present invention.
  • Substances for preventing or treating diseases associated with the protein of the present invention or salts thereof obtained by the screening method using the polynucleotide of the present invention include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, Any of a plant extract, an animal tissue extract, and plasma may be used. These may form a salt, and specific examples of the salt include those similar to the salts of the protein of the present invention described above.
  • the prophylactic / therapeutic substance (compound) for a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof obtained by the screening method may be mixed with a pharmacologically acceptable carrier, if necessary, to form a pharmaceutical composition.
  • a pharmacologically acceptable carrier if necessary, to form a pharmaceutical composition.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be used as a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with it.
  • the pharmacologically acceptable carrier may be the same as the case of a substance for preventing or treating a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof obtained by the screening method using the protein or the like of the present invention. Is mentioned.
  • the pharmaceutical composition can be produced in the same manner as in the case of a substance for preventing or treating a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof obtained by the screening method using the protein or the like of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity, (E.g., human, mouse, rat, egret, sheep, hidge, bush, horse, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) orally or parenterally. .
  • the dose of the drug for preventing or treating the disease associated with the protein or its salt of the present invention varies depending on the target disease, the administration target, the administration route, and the like.
  • an adult patient suffering from renal disease body weight 6 O kg
  • the prophylactic / therapeutic substances for diseases associated with the protein or its salt of the present invention can also be screened by detecting the promoter activity of the gene encoding the protein.
  • the activity of the promoter can be detected also in cells having a vector formed by linking the transcription regulatory region of the gene encoding the protein of the present invention to the repo overnight gene and non-human mammals.
  • the repo overnight gene includes, for example, i3-galactosidase gene (1 acZ), soluble alkaline phosphatase gene, luciferase gene and the like.
  • a tissue that originally expresses the protein of the present invention will ⁇ -galactosidase is expressed instead of the protein of the present invention.
  • 5 _ bromo-4-black _ 3-indolyl _ / 3-galacto The expression state of the protein of the present invention can be easily confirmed by staining using a reagent serving as a substrate for jS-galactosidase such as pyranoside (X-gal).
  • cells or tissue sections are fixed with datalaldehyde or the like, washed with phosphate-buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or around 37. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the tissue sample is washed with an ImM EDTAZPBS solution to stop the galactosidase reaction, and by observing the coloration, the protein of the present invention in the cell or tissue is observed. The expression status can be confirmed. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • a compound that promotes or inhibits the activity of the promoter of the gene encoding the protein of the present invention can regulate the production and activity of the protein or a salt thereof, thus preventing the disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof.
  • ⁇ Useful as a therapeutic Since the expression of the protein of the present invention or mRNA encoding the same increases in, for example, diabetic / renal disease (eg, diabetic nephropathy), early diagnosis of the disease, determination of symptom severity, progression of the disease, Useful for prediction. Therefore, the antibody against the protein or the like of the present invention and the above-mentioned polynucleotide of the present invention are useful as diagnostic agents for diseases associated with the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the antibody binds to and inactivates (neutralizes) the protein of the present invention or a salt thereof
  • the antisense polynucleotide of the DNA encoding the protein of the present invention comprises the protein of the present invention. It inhibits translation into the protein by hybridizing with mRNA encoding the protein, and therefore, as a compound obtained by the screening method of the present invention, as a prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with the protein of the present invention or a salt thereof. Useful.
  • the present invention also relates to a preventive / therapeutic agent for a disease associated with the protein or a salt thereof, comprising an antibody against the protein or the like of the present invention.
  • diseases associated with the protein of the present invention or a salt thereof include those described above in the screening method using the protein or the like of the present invention. Those exemplified as increasing amounts of disease are also mentioned. However, it is preferably renal disease or diabetes, and more preferably diabetic nephropathy.
  • an antibody against the protein or the like of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as “the antibody of the present invention”) can be produced using the protein or the like as an antigen according to a known method for producing an antibody or antiserum. it can.
  • a monoclonal or polyclonal antibody against the protein or the like of the present invention can be produced, for example, as follows. [Preparation of monoclonal antibody]
  • the protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, together with itself or a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • mammals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mammal immunized with an antigen, such as a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization, and the antibody-producing cells contained therein are collected.
  • an antigen such as a mouse
  • myeloma cells of the same or different species a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting the antiserum with a discriminating protein described later and measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kellar and Milstein [Nature, 256, 495 (1975) 3].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include mammalian myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • mammalian myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1
  • P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG 1000 to PEG 6000
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas are prepared, for example, by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then labeling with a radioactive substance or an enzyme.
  • a solid phase eg, a microplate
  • an immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cells used for cell fusion are mice
  • Screening can be performed by adding a hybridoma culture supernatant to the solid phase to which the antibody or protein ⁇ is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, and detecting the monoclonal antibody bound to the solid phase. it can.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • the selection of monoclonal antibodies can usually be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as hybridomas can grow.
  • a serum-free culture medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 t, preferably about 37 ° C.
  • the cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the monoclonal antibody thus obtained can be obtained by a method known per se, for example, Separation and purification of epiglobulin [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen A specific purification method in which only the antibody is collected using a binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody].
  • epiglobulin eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen A specific purification method in which only the antibody is collected using a binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dis
  • the polyclonal antibody against the protein or the like of the present invention can be produced according to a method known per se.
  • an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed and immunized to a mammal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the type of carrier-protein and the mixing ratio of carrier-hapten are determined by antibody against hapten immunized by cross-linking with carrier. As long as it can be efficiently carried out, any kind may be cross-linked at any ratio.For example, a serum albumin, a thyroglobulin, a hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0.1 to hapten per 1 hapten. A method of force-pulling at a rate of 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents for example, glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, and the like are used.
  • the condensation product is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody itself or together with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the dose is usually given about every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • polyclonal antibody titer in antiserum is the same as the measurement of antibody titer in antiserum described above. It can be measured similarly. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the preventive / therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof comprising the antibody of the present invention may be the antibody of the present invention itself, but the antibody can be pharmacologically acceptable. It is preferably a pharmaceutical composition obtained by mixing with a carrier.
  • the pharmacologically acceptable carrier include those similar to the aforementioned “preventive / therapeutic substance for diseases associated with the protein of the present invention or a salt thereof”.
  • the pharmaceutical composition can be produced in the same manner as in the above-mentioned "preventive / therapeutic substance for diseases associated with the protein of the present invention or a salt thereof".
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in mammals (e.g., , Chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • the dosage of the prophylactic / therapeutic agent varies depending on the target disease, the target of administration, the administration route, and the like.For example, in an adult patient (body weight 60 kg) suffering from renal disease, the active ingredient per day is
  • the antibody of the present invention is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the present invention also relates to a preventive / therapeutic agent for a disease associated with the protein or a salt thereof, comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof includes, among those described above in the screening method using the protein or the like of the present invention, the amount of the protein of the present invention or the salt thereof when compared with the normal state.
  • diseases in which renal disease is increasing, preferably renal disease or diabetes, and more preferably diabetic nephropathy.
  • a base complementary to a base sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof includes a nucleotide sequence completely complementary to a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof, Alternatively, any protein may be used as long as it has a substantially complementary base sequence and has an effect of suppressing the translation of the protein of the present invention from RNA encoding the protein.
  • nucleotide sequence a nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a nucleotide sequence capable of hybridizing under the physiological conditions of a cell expressing the protein, more specifically Is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably about 90% or more with the complementary strand of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • a base sequence having about 95% or more homology is exemplified.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence information of the cloned or determined polynucleotide of the present invention. Such a polynucleotide can inhibit the replication or expression of the gene encoding the protein of the present invention. That is, the antisense polynucleotide of the present invention can hybridize with RNA transcribed from the gene encoding the protein of the present invention, and inhibits the synthesis (processing) or function (translation into protein) of mRNA. Can be.
  • the length of the target region of the antisense polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as the translation of the protein of the present invention is inhibited by the hybridization of the antisense polynucleotide, and
  • the entire sequence or partial sequence of the RNA encoding the protein of the present invention may be as short as about 15 bases and as long as the entire sequence of mRNA or the initial transcript. Considering the ease of synthesis and antigenicity, oligonucleotides consisting of about 15 to about 30 bases are preferred, but not limited thereto.
  • the 5'-end hairpin loop, 5'-end 6-base pair 'repeat, 5'-end untranslated region, 5'-end untranslated region, polypeptide translation initiation codon, and protein of the gene encoding the protein of the present invention To coding region, ORF translation start codon, 3 'end untranslated region, 3' end palindrome region, and 3 'end
  • the apin loop can be selected as a target region, but any region within the gene can be selected as a target. For example, it is also preferable to use the intron portion of the gene as the target region.
  • the antisense polynucleotide of the present invention not only inhibits translation into a protein by hybridizing with mRNA or an early transcript encoding the protein of the present invention, but also has a double-stranded DNA of the present invention. It may bind to a gene encoding a protein to form a triplex, thereby inhibiting RNA transcription.
  • Antisense polynucleotides are 2-hydroxy D-report-containing deoxynucleotides, D-report-containing deoxynucleotides, N-daricosides of purine or pyrimidine bases, and other types of nucleosides. Or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds ( ⁇ , such polymers may be used in DNA or RNA) (Including nucleotides having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides). Nucleotides), as well as those with known modifications, eg, labeled, capped, methylated, and one or more natural nucleotides replaced with analogs, as known in the art.
  • an intramolecular nucleotide such as an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, For example, those having phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, Has side-chain groups such as syn, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc.
  • an intramolecular nucleotide such as an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, For example, those having phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, Has side-chain groups such as syn, antibody, signal peptide,
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications can include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also have sugar moieties modified, e.g., one or more hydroxyl groups are replaced with halogens, aliphatic groups, or functional groups such as ethers, amines, etc. It may be converted.
  • An antisense polynucleotide is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and if toxic Minimize the toxicity of antisense nucleic acids.
  • Antisense polynucleotides can contain altered or modified sugars, bases, or linkages, can be provided in specialized forms such as ribosomes, microspheres, or can be applied or added by gene therapy. Can be given in a different form.
  • the charge form of the phosphate skeleton Polycations such as polylysine, which acts to neutralize liposomes, and crude water-based substances such as lipids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.), which enhance the interaction with cell membranes and increase the uptake of nucleic acids.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'end or 5' end of nucleic acids for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene dalicol.
  • a lipozyme capable of specifically cleaving mRNA or the gene initial transcript encoding the protein of the present invention inside the coding region is also an antisense polymorph of the present invention. May be included in the nucleotide.
  • the term "lipozyme” refers to an RNA having an enzymatic activity for cleaving a nucleic acid, but it has recently been found that an oligo DNA having the nucleotide sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleaving activity. Therefore, in the present specification, it is used as a concept including DNA as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleavage activity.
  • the most versatile liposomes include self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroid and willoid, and hammerhead and hairpin types are known.
  • the hammerhead type exerts enzymatic activity at about 40 bases, and the hammer-several bases at both ends (approximately 10 bases in total) adjacent to the head structure take the desired cleavage site of mRNA.
  • By using a complementary sequence it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of lipozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA since it uses only RNA as substrate.
  • the mRNA corresponding to the "polynucleotide of the present invention" is double-stranded by itself.
  • the target sequence can be made into a single strand by using a hybrid lipozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid capable of specifically binding to an RNA helicase. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5577 (2001)].
  • the lipozyme is used in the form of an expression vector containing the DNA encoding it, the tRNA-modified sequence may be further ligated to facilitate translocation of the transcript to the cytoplasm. It can also be used as a hybrid ribozyme [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • RNA interference RNA interference
  • the antisense oligonucleotide and lipozyme of the present invention determine the target region of mRNA or early transcript based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence information encoding the protein of the present invention, and use a commercially available DNAZRNA automatic synthesizer (Applied ⁇ Biosystems, Beckman, etc.) to synthesize a sequence complementary thereto.
  • a DNAZRNA automatic synthesizer Applied ⁇ Biosystems, Beckman, etc.
  • the sense strand and antisense strand are synthesized by a DNAZRNA automatic synthesizer, and denatured in a suitable annealing buffer, for example, at about 90 to about 95 ° C for about 1 minute. After that, it can be prepared by annealing at about 30 to about 70 ° C.
  • a longer double-stranded polynucleotide can be prepared by synthesizing complementary oligonucleotide chains so as to overlap each other, annealing them, and ligating them with ligase.
  • the prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof comprising the antisense polynucleotide of the present invention may be the antisense polynucleotide itself of the present invention. It is preferably a pharmaceutical composition obtained by mixing the sense polynucleotide with a pharmacologically acceptable carrier.
  • the antisense polynucleotide is formulated in the same manner as in the case of a substance for preventing or treating a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof, which is obtained by a screening method using the protein or the like of the present invention. , Humans, mice, rats, rabbits, rabbits, sheep, pigs, rabbits, pomas, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the antisense polynucleotide can also be administered after being inserted into an appropriate vector such as, for example, a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus-associated virus vector.
  • the antisense polynucleotide may be administered by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter, or after aerosolization, may be locally administered as an inhalant into the trachea.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the target of administration, the route of administration, and the like. For example, in an adult patient (body weight 6 O kg) suffering from renal disease, about 0 1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of a polynucleotide encoding the protein of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
  • the present invention also relates to a diagnostic agent for a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof, comprising the above-mentioned “polynucleotide of the present invention”.
  • a diagnostic agent for a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof comprising the above-mentioned “polynucleotide of the present invention”.
  • mammals for example, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgs, bush, elephants, dogs, cats, dogs, monkeys
  • DNA encoding the protein of the present invention in chimpanzees and the like.
  • abnormalities (genetic abnormalities) in mRNA for example, as diagnostic agents for genetic damage such as damage, mutation, or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • useful are useful.
  • the above-described genetic diagnosis using the polynucleotide of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Procaging). (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) It can be implemented by such means.
  • the present invention such as diabetic and renal diseases may be used. It can be diagnosed that the possibility of suffering from a disease associated with a protein or a salt thereof is high.
  • the present invention also relates to a diagnostic agent for a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof, comprising the above-mentioned “antibody of the present invention”.
  • the antibody of the present invention is competitively reacted with a test solution and the labeled protein of the present invention, and the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody is measured. Quantifying the protein of the present invention or a salt thereof in a test solution by the following method:
  • the other antibody is the other of the protein or the like of the present invention, for example, the C-terminal.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein or the like, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the quantification of the protein of the present invention or a salt thereof using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen in the test solution is measured. Any measurement method may be used as long as it is detected by physical or physical means, and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • Examples of the discriminating agent used in the measurement method using a discriminating substance include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance.
  • Radioisotopes if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the above-mentioned enzyme those which are stable and have a large specific activity are preferable.
  • 3] -galactosidase, iS-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, and lignoic acid dehydrogenase are used.
  • As the fluorescent substance for example, fluorescein, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, J-reciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin- (strept) avidin system may be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the detection antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, such as the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation) Measure the amount of labeling for either B or F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. React with an excess amount of the labeled antibody, and then add the immobilized antigen to the unreacted labeled antibody. After binding the body to the solid phase, the solid and liquid phases are separated. Next, the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing scattering by a laser is preferably used.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and written documents.
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a biopsy sample eg, Kidney cells, ⁇ cells, etc.
  • the expression of the protein of the present invention or a salt thereof is determined to be excessive or decreased by quantifying the concentration of the protein in the sample, for example, diabetic ⁇ kidney It can be diagnosed that the possibility of suffering from a disease associated with the protein of the present invention or a salt thereof such as a disease is high.
  • the present invention further relates to a preventive / therapeutic agent for diabetes or kidney disease, preferably diabetic nephropathy, comprising a TSC-22 inhibitor.
  • D3 (3-22 inhibitor refers to a substance capable of quantitatively and / or Z- or qualitatively inhibiting TSC-22 in vivo. Specifically, the expression of D3-3-22 gene (Substances that suppress all levels of transcription, post-transcriptional regulation, translation, and post-translational modification), or that can destabilize or suppress the activity of TSC-22 protein. , Peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These may form salts. Specific examples of the salt include those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention.
  • the TSC-22 inhibitor is preferably a substance capable of suppressing the production or expression of TSC-22 or the activity of TSC-22 in kidney or kidney.
  • TSC-22 inhibitor Prevention of diabetes or kidney disease (eg, diabetic nephropathy) containing a TSC-22 inhibitor is a therapeutic agent for diseases in which the protein of the present invention or a salt thereof is related, depending on the properties of TSC-22.
  • the preparation can be made in the same manner as in the case of the prophylactic / therapeutic substance or the antisense polynucleotide of the present invention.
  • the prophylactic / therapeutic agent is safe and has low toxicity, it can be used, for example, in mammals (for example, humans, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, horses, horses, birds, cats, dogs, monkeys, Oral or parenteral administration to chimpanzees).
  • mammals for example, humans, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, horses, horses, birds, cats, dogs, monkeys, Oral or parenteral administration to chimpanzees).
  • the dosage of the TSC-22 inhibitor varies depending on the target disease, administration subject, administration route and the like.For example, in an adult patient (body weight 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 100 mg per day is used. 50 mg, more preferably about 1. 0 to 2 Omg.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, and examples thereof are described below.
  • optical isomer of an amino acid the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • RNA Liponucleic acid
  • a 1 a Alanine
  • Th r Threonine Cy s: Cystine
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • 1 shows the nucleotide sequence of the protein coding region of human TSC-22 cDNA.
  • Example 1 Increase in TSC-22 mRNA Expression in Kidney of Wistar fatty Rat Male Wistar fatty rats (13 22 and 40 weeks old; Takeda Labix) with spontaneous onset of diabetic nephropathy (DN) exhibiting insulin-independent diabetes (NIDDM) and their normal control males of the same age Using Wistar lean rats (Takeda Lapics), 24-hour urine collection and tail vein blood collection were performed, and urinary albumin excretion, plasma glucose concentration, and plasma insulin concentration were measured.
  • DN diabetic nephropathy
  • NIDDM insulin-independent diabetes
  • Urinary albumin excretion was measured using A / GB Test Co., Ltd. (Wako Pure Chemical Industries), and plasma glucose concentration was measured using SYNCHRON CX5 DEL (Beckman Coulter). Insulin concentration was measured by the RIA method (Shionogi Pharmaceutical). Kidneys were collected from each of the five rats and stored at -80 ° C. After crushing the sample, total RNA was extracted. A ply and a fluorescent probe were prepared based on the mRNA sequence of a previously reported report (Endocrinology, 134 (3): 1205-1212 (1994)), and various mRNAs were obtained by real-time quantitative RT-PCR using ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). The expression level was measured. The results are shown in Tables 1 and 2.
  • Urinary albumin excretion, plasma glucose and insulin levels
  • Candesartan cilexetil (angiotensin II typel receptor antagonist) suspended in 0.5% methylcellulose lOOcP in male Zucker fatty rats (ZF rats, 18 weeks old, Charles River Japan, Inc.) who exhibit hyperinsulinemia and spontaneously develop renal impairment ) was orally administered once daily for 9 weeks.
  • Male Zucker lean rats (ZL rats, Charles River Japan) of the same age, which were a control group and a normal control group, were orally administered once daily with 0.5% methylcellulose lOOcP (Vehicle).
  • Urinary albumin excretion, blood glucose and insulin levels
  • TSC-22 DIRNA expression increased, and TGF-i31 mRNA expression also increased. Furthermore, when the increase in urinary albumin excretion was suppressed by candesartan cilexetil administration, any of the above mRNA expression increases was also suppressed.
  • Example 3 TSC-22 mRNA expression in kidney of spontaneously hypercholesterolemic rats Current increase
  • Kidneys were collected from SD rats and SHC rats that had been fixed by reflux with 10% neutral buffered formalin, fixed with 10% neutral buffered formalin, and embedded in paraffin to prepare blocks. This was sliced to a thickness of 4 l ⁇ and used as a section for in situ hybridization (ISH) staining.
  • Digoxigenin (DIG) -labeled RNA probes were prepared using T3 and SP6 RNA polymerase based on the following sequences. DIG RNA Labeling Mix (Roche) was used for DIG labeling.
  • GAPDH glycosyl-phosphate- Dehydrogenase gene was used as a positive control to confirm ISH conditions in rat kidney, and then TSC-22 antisense probe and its sense probe [SEQ ID NO: 3; rat TSC-22 mRNA (GenBank Accession number: L25785) 3 ,-Part of the untranslated region (base numbers: 61 1 to 952)], NBT / BCIP (nitro blue tet razolium / 5 bromo-4-chlo oro-3-) as anti-DIG antibody and chromogenic substrate ISH was performed using indo lyl phosphate). After staining, nuclear staining was performed using a Gelnetchroth.
  • the screening method of the present invention it is possible to screen a preventive / therapeutic agent for renal disease, diabetes and the like which has excellent effects and has no side effects.

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Abstract

本発明は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、あるいは配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩が関連する疾患、例えば、腎疾患または糖尿病の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。

Description

スクリーニング方法
技術分野
本発明は、 Transforming Growth Factor- )3 Stimulated Clone-22 (以下、 T S C— 22と略称する） 、 それをコードするポリヌクレオチドあるいはそれに対 する抗体等の新規用途、 特に T S C明 _ 22またはそれをコードするポリヌクレオ チドを用いた腎疾患等の予防 ·治療薬のスクリーニング方法などに関する。
書 背景技術
現在、 腎疾患の治療薬としては、 アンジォテンシン変換酵素 （ACE) 阻害剤 などが用いられているが、 これらの薬剤は腎血行動態に影響を及ぼすために、 高 度の腎機能低下患者には適用できないという欠点を有する。 従って、 かかる副作 用のない新規な腎疾患予防 ·治療薬の開発が切望されている。
あらゆる腎疾患は末期腎不全に至る過程で腎線維化を伴う。 腎線維化において 中心的役割を果たす因子としてトランスフォーミング成長因子一 /3 (以下、 TG F— ) 3と略称する） が挙げられる。 糸球体腎炎ラットモデルに、 TGF_i3の内 因性中和因子であるデコリン、 抗 TGF— /3抗体または TGF— ]3のアンチセン スオリゴヌクレオチドを投与すると、 細胞外マトリックス （ECM) 産生が顕著 に阻害され、 糸球体硬化の進展が抑制されることが報告されている。 また、 TG F一 0遺伝子のインビポ導入により E CMの蓄積が起こり、 糸球体腎炎が誘発さ れることが知られている。
T G F— j3は、 そのレセプ夕一から S m a dと総称される細胞内シグナル伝達 因子を介して種々の標的遺伝子の転写を調節することにより、 多様な生理活性を 実現している。 従って、 TGF— )3シグナル伝達系のさらに下流に位置する分子 が腎機能低下進展作用の実体をなしている可能性がある。 丁3( — 22は、 TGF— ]3刺激に応答する遺伝子の 1つとして、 マウス骨芽 細胞株から最初に単離されたロイシンジッパー （LZ) ドメインを有する蛋白質 をコ一ドする遺伝子であり ひ. Biol. Chem. , 267{\^)： 10219-24 (1992)) 、 そ のヒトホモログは 144アミノ酸からなる蛋白質をコードする （ヒトーマウス (ラット） 間のホモロジ一は、 アミノ酸レベルで約 9 9 %の同一性である ； Biochem. Biophys. Res. Commun. , 222 { )： 821-6 (1996)) 。 TSC—22蛋白 質は、 転写制御因子にしばしば見られる LZドメインを持つが、 既知の DNA結 合領域 （塩基性アミノ酸領域、 ヘリックス一ループ一へリックス （HLH) モチ ーフなど） を欠くため、 転写抑制因子として働くことが予測されているが、 C型 ナトリゥム利尿性べプチド遺伝子の G Cエレ ントに結合してその転写を促進す るとの報告もあり Eur. J. Biochem. , 242 460-6 (1996)) 、 その生理的機 能については未だよく理解されていない。
本発明の目的は、 優れた効果を奏しかつ副作用のない、 腎疾患等の予防 '治療 薬を開発する上で不可欠の、 当該予防 ·治療薬として有用な物質を探索するのに 好適な新規スクリーニング方法を提供することである。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 各種の腎 疾患モデル動物における腎 T SC-22の発現が、 特に糸球体上皮細胞や尿細管 上皮細胞において顕著に増加していることを初めて見出し、 さらに、 腎疾患モデ ル動物における腎 TSC— 22の発現を抑制することによって、 腎疾患の治療効 果が得られることを初めて見出した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
[1] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いること を特徴とする、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質のスクリ 一二ング方法；
[2] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩が関 連する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法；
[3] 疾患が糖尿病または腎疾患である上記 [1] 記載のスクリーニング方 法；
[4] 疾患が糖尿病性腎症である上記 [1] 記載のスクリーニング方法； [5] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能 力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、 両条件下における 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の生産量を比較することを特徴 とする、 上記 [1] 記載のスクリーニング方法；
[6] (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生 する能力を有する細胞、 並びに（b) 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたは その塩に対する抗体、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が結合し 得るポリヌクレオチドおよび該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と 相互作用し得る転写制御因子からなる群より選択される物質を含んでなる、 該蛋 白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング用キット； [7] 被験物質の存在下および非存在下における、 配列番号： 2で表されるァ ミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは その部分ペプチドまたはその塩の活性を比較することを特徴とする、 上記 [1] 記載のスクリーニング方法；
[8] (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 並び に ） 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が結合し得るポリヌク レオチドあるいは該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と相互作用し 得る転写制御因子を含んでなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 - 治療物質のスクリーニング用キット；
[ 9 ] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩により発現が 制御される遺伝子を含有する細胞および該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩を、 被験物質の存在下および非存在下に培養し、 両条件下における該遺 伝子の発現を比較することを特徴とする、 上記 [ 7 ] 記載のスクリーニング方 法；
[ 1 0 ] (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩によ り発現が制御される遺伝子を含有する細胞、 （b) 該蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩、 並びに（c) 該遺伝子と八イストリンジェン卜な条件下で ハイブリダィズし得るポリヌクレオチドを含んでなる、 該蛋白質またはその塩が 関連する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング用キット；
[ 1 1 ] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を産生する 能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、 両条件下におけ る該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を比較することを特徴 とする、 上記 [ 7 ] 記載のスクリーニング方法；
[ 1 2 ] (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を産 生する能力を有する細胞、 並びに（b) 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩により発現が制御される遺伝子とハイストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズし得るポリヌクレオチドを含んでなる、 該蛋白質またはその塩が関連 する疾患の予防.治療物質のスクリーニング用キット；
[ 1 3 ] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含 有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩が関 連する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法；
[14] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部 分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを用いることを特 徵とする、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質のスクリー二 ング方法；
[15] ポリヌクレオチドが配列番号： 1で表される塩基配列の全部または一 部を含有する上記 [14] 記載のスクリーニング方法；
[16] 疾患が糖尿病または腎疾患である上記 [14] 記載のスクリーニング 方法；
[17] 疾患が糖尿病性腎症である上記 [ 14] 記載のスクリーニング方法； [18] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する 能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、 両条件下におけ る該蛋白質またはその部分ペプチドをコードする mRNAの量を I；ヒ較することを 特徴とする、 上記 [14] 記載のスクリーニング方法；
[19] (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を産 生する能力を有する細胞、 並びに ） 該蛋白質またはその部分ペプチドをコー ドする mRNAとハイストリンジエンドな条件下でハイブリダィズし得るポリヌ クレオチドを含んでなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物 質のスクリーニング用キッ卜；
[20] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗 体を含有してなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬；
[213 疾患が糖尿病または腎疾患である上記 [20] 記載の予防 ·治療薬；
[22] 疾患が糖尿病性腎症である上記 [20] 記載の予防 ·治療薬； [23] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列と相 補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有してなる、 該蛋白質またはその 塩が関連する疾患の予防 ·治療薬；
[24] 疾患が糖尿病または腎疾患である上記 [23] 記載の予防 ·治療薬； [25] 疾患が糖尿病性腎症である上記 [23] 記載の予防 ·治療薬；
[26] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体を含有してなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の診断薬；
[27] 疾患が糖尿病または腎疾患である上記 [26] 記載の診断薬；
[28] 疾患が糖尿病性腎症である上記 [26] 記載の診断薬；
[29] 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドをコードする塩基配列を含 有するポリヌクレオチドを含有してなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患 の診断薬；
[30] 疾患が糖尿病または腎疾患である上記 [29] 記載の診断薬；
[31] 疾患が糖尿病性腎症である上記 [29] 記載の診断薬；
[32] TSC-22抑制薬を含有してなる糖尿病または腎疾患の予防 ·治療 薬；
[33] 腎疾患が糖尿病性腎症である上記 [32] 記載の予防 ·治療薬；
[34] 哺乳動物に TSC— 22抑制薬を投与することを特徴とする、 該哺乳 動物における糖尿病または腎疾患の予防または治療方法；
[35] 腎疾患が糖尿病性腎症である上記 [34] 記載の方法；
[36] 糖尿病または腎疾患の予防 ·治療薬を製造するための、 TSC-22 抑制薬の使用；
[37] 腎疾患が糖尿病性腎症である上記 [36] 記載の使用などに関する。 図面の簡単な説明
図 1 A〜Fは、 自然発症高コレステロール血症 SHCラットおよび正常 SDラット の腎臓における TSC-22の発現の様子を示す。 図 1 A〜Cは正常 SDラット腎由来切 片を示し、 図 1 D〜Fは自然発症高コレステロール血症 SHCラット腎由来切片を 示す。 図 1 Aおよび D (倍率： X 5 0 ) 並びに図 1 Bおよび E (倍率： X 4 0 0 ) は尿細管の顕微鏡像、 図 1 Cおよび F (倍率： X 4 0 0 ) は糸球体の顕微鏡 像である。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質 （以下、 「本発明の蛋白質」 と略記する ことがある） は、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） の細胞 （例え ば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 iS細胞、 骨髄細胞、 メサンギ ゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑 筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファ ージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もし くはガン細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋な どに由来する蛋白質であってよく、 また、 化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成 された蛋白質であってもよい。 あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列 を有するポリヌクレオチドを導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質 であってもよい。 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列としては、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 特に好ましくは約 9 5 %以上、 最も好ましくは 約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す る蛋白質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 インスリン遺伝子等の転写制御活性な どが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 転写制御活性が同等 (例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 蛋白質の分子量など の量的要素は異なっていてもよい。
転写制御活性の測定は、 公知の方法、 例えば、 標的遺伝子についてのノーザン 解析やゲルシフトアツセィ等を用いて行うことができる。 あるいは、 本発明の蛋 白質の活性は、 その細胞内局在性を用いた方法、 例えば、 細胞質から核への移行 度を調べることによつても評価することができる。
また、 本発明の蛋白質としては、 例えば、 （i)配列番号： 2で表されるァミノ 酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、 （i i)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i)配列番号： 2で表されるァミノ 酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配 列、 （iv)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 またほ (V)それ らを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆるムティンも含ま れる。
, 上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その揷入、 欠失または置換の位置は、 蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。 本発明の蛋白質は、 好ましくは、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有す る蛋白質、 すなわちヒト TSC— 22蛋白質または他の哺乳動物におけるそのホ モログである。
本明細書における蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （アミ ノ末端） 、 右端が C末端 (カルボキシル末端) である。 配列番号： 2で表される アミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、 本発明の蛋白質は、 C末端が力 ルポキシル基 (-COOH) 、 カルポキシレート（― COO— ) 、 アミド (-C ONH2) またはエステル （一 COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの〇卜6アルキル基；例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基；例えば、 フエニル、 α—ナフチ ルなどの ( 6_12ァリール基；例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー 2アルキル基； α—ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー Cェ _ 2アルキル基 などの C7_147ラルキル基； ピバロィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明の蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を 有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも 本発明の蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末 端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明の蛋白質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの（^_6アルカノィ ルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成 する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基 （例えば一 OH、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インド —ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基 などの C i— 6アルカノィル基などの Cェ _ 6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。 本発明の蛋白質の部分ペプチド （以下、 単に 「本発明の部分ペプチド」 と略称 する場合もある） としては、 上記した本発明の蛋白質の部分アミノ酸配列を有す るペプチドであり、 且つ本発明の蛋白質と実質的に同質の活性を有する限り、 何 れのものであってもよいが、 例えば、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列のう ち、 L Zドメインおよびそのアミノ末端側に隣接する保存領域 （T S Cボック ス） を含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。
本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、 本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列 のうち少なくとも 3 0個以上、 好ましくは 6 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個 以上のァミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましい。
ここで 「実質的に同質の活性」 とは上記と同意義を示す。 また、 「実質的に同 質の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （一 C O OH) 、 カル ポキシレート （_ C O〇—） 、 アミド （一 C〇NH 2 ) またはエステル （一 C O O R) の何れであってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 本発明の蛋 白質について前記したと同様のものが挙げられる。 本発明の部分ペプチドが C末 端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 力ルポ キシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに 含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなど が用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明の蛋白質と同様に、 N末 端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内 で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の 側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合した いわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または塩基との生理 学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま しい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素 酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマ ル酸、 マレイン酸、 コノ、ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の蛋白質またはその塩は、 前述した哺乳動物の細胞または組織から自体 公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。 具体的には、 哺乳動物 の組織または細胞をホモジナイズし、 可溶性画分およぴ Zまたは核画分を逆相ク 口マトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグ ラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することによって、 本発明の蛋 白質またはその塩を製造することができる。
本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 「本発明の蛋 白質等」 と包括的に略記する場合がある） は、 公知のペプチド合成法に従って製 造することもできる。
ペプチド合成法は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれであってもよい。 本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合 し、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白 質を製造することができる。
ここで、 縮合や保護基の脱離は、 自体公知の方法、 例えば、 以下の（i)〜(v)に 記載された方法に従って行われる。
(i) M. Bodanszky および M. A. Onde t t i ペプチド · シンセシス （Pept i de Synthes i s) , Intersc i ence Pub l i shers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ 'ペプチド（The Pept i de)， Academi c Press, New York (1965年） (i i i)泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv)矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
(V)矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
このようにして得られた蛋白質は、 公知の精製法により精製単離することがで きる。 ここで、 精製法としては、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトダラ フィ一、 液体クロマトグラフィー、 再結晶、 これらの組み合わせなどが挙げられ る。
上記方法で得られる蛋白質が遊離体である場合には、 該遊離体を公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に蛋白 質が塩として得られた場合には、 該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法に よって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明の蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の合成には、 通常市販 の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 ァミノ メチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒ ドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' ージメトキシフエ二 ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4ー （2 ' ， 4 ' —ジメトキシフエ二 ルー Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このよう な樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的と する蛋白質もしくはペプチド （以下、 「蛋白質等」 と総称する場合もある） の配 列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に 樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中 で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的の蛋白質等またはそのアミド 体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性化 試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C：、 N, N， ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチルー N ' — （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これ らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 H O O B t)ととも に保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または H O B t エステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、 蛋白質縮合反応に 使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジ メチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N _メチルピロリドンな どの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 ト リフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホ キシド類、 ピリジンなどのアミン類， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのェ —テル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約— 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリーペンチ ルォキシカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2一二トロフエニルスルフエニル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステ ル、 4 _ニトロベンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4—クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 ターシャリ一ブトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2 - B z 1、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 ターシャリーブチルなどが用いられる。 ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4—メトキシ 一 2， 3 , 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 B u m、 B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 ° ( 〜 4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2一エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基とし て用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2 —エタンジチオール、 1 , 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2， 4 , 5—トリクロ口フエノール、 2 , 4—ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 H O N B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフタルイミド、 H O B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
蛋白質等のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端 アミノ酸のひ一力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプチ ド （蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端の α—アミ ノ基の保護基のみを除いた蛋白質等と C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除 去した蛋白質等とを製造し、 この両蛋白質等を上記したような混合溶媒中で縮合 させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護 蛋白質等を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗蛋白 質等を得ることができる。 この粗蛋白質等は既知の各種精製手段を駆使して精製 し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質等のアミド体を得ることができ る。 蛋白質等のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の 一力 ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白質 等のアミド体と同様にして、 所望の蛋白質等のエステル体を得ることができる。 本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 本発明の蛋白質またはその塩を適当な ぺプチダーゼで切断することによつても製造することができる。
さらに、 本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 本発明の 蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D NAを含有する形質転換体を培養 し、 得られる培養物から本発明の蛋白質等を分離精製することによって製造する こともできる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D NAとしては、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 ヒトまたは他の哺乳動物 （例えば、 ゥシ、 サル、 ゥマ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ハムスターなど） のあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア 細胞、 塍臓 i3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細 胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 (例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好 中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽 細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆 細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存 在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側 頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生 殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小 腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精 巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 脳や脳の各部位） 由来の c D NA、 前記した細胞 '組織由来の c D NAライブラリ一、 合成 D N Aなどが 挙げられる。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラス ミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細 胞 ·組織より total R N Aまたは m R N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcr iptase Polymerase Chain React ion (以下、 「R T - P C R法」 と略称する） によって増幅することもできる。
本発明の蛋白質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 1で表され る塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 1で表される塩基配列とハイス トリンジエンドな条件下で八イブリダィズする塩基配列を含有し、 前記した配列 番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 転写制御活性など） を有する蛋白質をコードする D N Aなどが挙げられる。
配列番号： 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 1で表される塩基配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 特に好ま しくは約 8 0 %以上、 最も好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有する塩基配列を 含有する D N Aなどが用いられる。
ハイプリダイゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー ·クロ一ニング （Molecular Cloning) 第 2版 （J. Sambrook et al . , Cold Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 ハイブリダィゼ —シヨンは、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 ハイ ブリダィゼ一シヨンは、 好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行な うことができる。
ハイストリンジエンドな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 の 場合が好ましい。
本発明の蛋白質をコードする D NAは、 好ましくは配列番号： 1で表される塩 基配列を含有する D NAなどである。 本発明の部分ペプチドをコ一ドする DNAは、 配列番号： 2で表されるァミノ 酸配列の一部と同一もじくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列 を含むものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 上記した細胞'組織由来の cDNA、 上記した細胞.組織 由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使 用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミド などいずれであってもよい。 また、 上記した細胞，組織より mRNA画分を調製 したものを用いて直接 RT-P CR法によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコ一ドする DNAとしては、 例えば、 ( 1 ) 配列番号： 1で表される塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有する DNA、 または （2) 配列番号： 1で表される塩基配列を有する DN Aとハイス トリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 該 DNAにコー ドされるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性 （例：転写制御活性な ど） を有するペプチドをコードする D N Aなどが用いられる。
配列番号： 1で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下で八イブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 該塩基配列と約 60%以上、 好ましく は約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 最も好ましくは約 90%以上の 同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DN Aは、 該蛋白質また はペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成 DNAプライマーを用い て PCR法によって増幅するか、 または適当な発現ベクターに組み込んだ DNA を、 本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もしくは合成 DN Aを標識したものとハイブリダィゼーションすることによってクローニング することができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 モレキュラー ·クロ一 ニング （Molecular Cloning) 第 2版 （前述） に記載の方法などに従って行なう ことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 ハイブリダィゼーシ ョンは、 該ライブラリ一に添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうこ とができる。
DNAの塩基配列は、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝 酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変 換することができる。
クローン化された DNAは、 目的によりそのまま、 または所望により制限酵素 で消化するか、 リンカ一を付加した後に、 使用することができる。 該 DNAはそ の 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳 終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの 翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加 することができる。
本発明の蛋白質をコードする DNA発現ベクターは、 例えば、 本発明の蛋白質 をコードする DN Aから目的とする DN A断片を切り出し、 該 DN A断片を適当 な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することがで さる。
発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 325, pUC 12, pUC 13) ；枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB l l 0, TP 5, p C 194) ；酵母由来プラスミド （例、 pSH19， pSHl 5) ； λファージなどのバクテリオファージ； レトロウイルス, ワクシニアウイ ルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルス； p A 1— 1 1、 pXTl、 pRc /CMV、 pRc/RSV、 p c DNA I N e oなどが用いられる。
プロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー 夕一であればいかなるものでもよい。
例えば、 宿主が動物細胞である場合、 SRo!プロモー夕一、 SV40プロモー 夕一、 LTRプロモーター、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 H SV-TKプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 CMVプロモーター、 S R αプロモーターなどが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合、 t r pプロモーター、 l a cプロモータ 一、 r e cAプロモーター、 APLプロモ一夕一、 l p pプロモーター、 T7プ 口モータ—などが好ましい。 宿主がバチルス属菌である場合、 SP01プロモーター、 SP02プロモータ 一、 p e nPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAP プロモータ一、 ADHプロモータ一などが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモー夕一 などが好ましい。
発現ベクターとしては、 上記の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシン グシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V400 r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることが できる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピ シリン耐性遺伝子 （以下、 Amp fと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性 遺伝子 （以下、 Ne o1"と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、 dh f r遺伝子 を選択マ一カーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つて選択することもできる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の蛋白質の N端末 側に付加してもよい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合、 PhoA ·シグナル配 列、 OmpA ·シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、 α—アミラ —ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが；宿主が酵母である場 合、 MF ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列などが；宿主が動物細胞で ある場合、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
上記のようにして得られる 「本発明の蛋白質をコードする DNA」 を含有する 形質転換体は、 公知の方法に従い、 該 DNAを含有する発現ベクターで、 宿主を 形質転換することによって製造することができる。
ここで、 発現ベクターとしては、 前記したものが挙げられる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、 例えば、 ェシエリヒア， コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシージングズ■ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ力デミ — ·ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック ·ァシッズ · リサーチ （Nucleic Acids Research) , 9卷， 309 (1981)〕 ， J A221 〔ジャーナル■ォブ ·モレキュラー ·ノ イォロジ一 （Journal of Molecular Biology) , 120巻， 517 (1978)〕 , HB 101 〔ジャーナル 'ォブ' モレキュラー 'パイォロジ一， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネ ティックス （Genetics) ， 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス · サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー (Journal of Biochemistry) ， 95 巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R— , ΝΑ87 - 1 1 A, DKD— 5D， 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) N C YC 1 91 3, NCYC 2036, ピキア パストリス （Pichia pastoris) K M71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合、 夜盗蛾の幼虫由来 株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞、 Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウィルス が BmNPVの場合、 昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞
(ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン .ヴィポ （In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー
(Nature) , 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f.r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒト FL 細胞などが用いられる。
形質転換は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従つて実施することができる。 ェシェリヒア属菌は、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ 力デミ一 ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 21 10 (1972)やジーン （Gene) ， 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、 例えば、 モレキュラー，アンド 'ジェネラル ·ジエネティッ クス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 1 11 (1979)などに 記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、 例えば、 メソッズ · イン · ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology) , 194卷， 182— 187 (1991) 、 プロシージングズ ·ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 75巻， 1929 (1978)などに記載 の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、 例えば、 バイオ Zテクノロジー (Bio/Technology) ，6， 47 - 55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール. 263 - 2 6 7 ( 1 9 9 5 ) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジ一 （Vi rology) ， 5 2巻， 4 5 6 ( 1 9 7 3 )に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することが できる。
例えば、 宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養 する場合、 培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。 また、 培地は、 形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物などを含有することが好まし い。 ここで、 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖などが；窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーン スチープ · リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液 などの無機または有機物質が；無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン 酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。 また、 培地 には、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは、 好ましくは約 5〜 8である。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例 えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Mi l ler) , ジャーナ ル · ォブ · ェクスペリメンッ · イン · モレキュラー · ジエネティックス ( Journal of Exper iments in Molecul ar Genet ics) ， 4 3 1 - 4 3 3 , Cold Spr ing Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2〕 が好ましい。 必要により、 プ 口モータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 i3—インドリルアクリル酸の ような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、 通常約 1 5〜4 3 °Cで、 約 3〜2 4時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、 通常約 3 0〜4 0 °Cで、 約 6 〜2 4時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 バーク ホールダー （Burkholder) 最小培地 OBos t ian, K. L. ら、 プロシ一ジングズ- ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ■ォブ .ザ .ユーェ スエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 プロシージングズ- ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕 などが挙げられる。 培地の ρΗは、 好ましくは約 5〜 8である。 培養は、 通常約 20°C〜35 で、 約 24〜72時間行なわれる。 必要に応じて、 通気や撹拌を 行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例 え ば Grace's Insect Medium ( Grace, T. C. C. , ネ ィ チ ャ 一 (Nature) , 195, 788(1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加え たものなどが用いられる。 培地の pHは、 好ましくは約 6. 2〜6. 4である。 培養は、 通常約 27 Cで、 約 3〜5日間行なわれる。 必要に応じて通気や撹拌を 行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 約 5~20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻: 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ .ザ ·アメリカン . メアイカ レ ' アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング . ォブ · ザ · ソサイエティ · フォー · ザ · バイオロジカル · メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 (1 950)〕 などが用いられる。 培地の; pHは、 好ましくは約 6〜8である。 培養 は、 通常約 30 〜40°Cで、 約 15〜60時間行なわれる。 必要に応じて通気 や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内 （核内もしくは細胞質内） または細胞 外に本発明の蛋白質を製造することができる。 前記形質転換体を培養して得られる培養物から本発明の蛋白質等を自体公知の 方法に従つて分離精製することができる。
例えば、 本発明の蛋白質等を培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、 培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し た後、 遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い られる。 該緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X - 1 0 0 TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。 一方、 核画分から本発明の 蛋白質等を抽出する場合は、 上記の遠心分離またはろ過により得られる沈殿を例 えば高張液等で処理し、 遠心分離して上清を回収することにより、 核蛋白質の粗 抽出液を得る方法などが用いられる。
このようにして得られた可溶性画分あるいは核抽出液中に含まれる本発明の蛋 白質等の単離精製は、 自体公知の方法に従って行うことができる。 このような方 法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、 限外ろ過 法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主と して分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差 を利用する方法；ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用 する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法； 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。 これら の方法は、 適宜組み合わせることもできる。
かくして得られる蛋白質等が遊離体である場合には、 自体公知の方法あるいは それに準じる方法によって、 該遊離体を塩に変換することができ、 蛋白質等が塩 として得られた場合には、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 該 塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 形質転換体が産生する蛋白質等を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 該蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモ トリプシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ ーゼなどが用いられる。
かくして得られる本発明の蛋白質等の存在は、 特異抗体を用いたェンザィムィ ムノアツセィゃウエスタンブロッテイングなどにより確認することができる。 さらに、 本発明の蛋白質等は、 上記の本発明の蛋白質またはその部分ペプチド をコードする D NAに対応する R N Aを铸型として、 ゥサギ網状赤血球ライセ一 ト、 コムギ胚芽ライセ一ト、 大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系 を用いてインビトロ翻訳することによつても合成することができる。 あるいは、 さらに R N Aポリメラーゼを含む無細胞転写ノ翻訳系を用いて、 本発明の蛋白質 またはその部分ペプチドをコードする D NAを铸型としても合成することができ る。
本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患としては、 正常時と比較した場合 に、 本発明の蛋白質またはその塩の量が増加あるいは減少している疾患が挙げら れる。
ここで、 「正常時と比較した場合に、 本発明の蛋白質またはその塩の量が増加 している疾患」 としては、 例えば腎疾患 （例えば、 糖尿病性腎症；慢性糸球体腎 炎； IgA腎症；腎移植後の慢性拒絶；腎癌；腹膜透析時の腹膜硬化症；急性腎炎 症候群；ネフローゼ症候群；巣状糸球体硬化症；膜性腎症；尿崩症；慢性腎盂腎 炎；進行性腎障害） ；内分泌 ·代謝性疾患 （例えば、 糖尿病） ；循環器疾患 （例 えば、 動脈硬化症；心筋梗塞；心不全；心筋症； PTCAおよびステント留置後の血 管再狭窄；心 ·血管移植後の慢性拒絶；血栓症） ；脳血管障害 （例えば、 脳梗 塞） ；肺疾患 （例えば、 肺線維症、 慢性閉塞性肺症候群、 肺癌） ；肝疾患 （例え ば、 肝硬変、 肝炎、 肝癌） ；消化管疾患 （例えば、 大腸炎、 大腸癌） ；性腺疾患 (例えば、 前立腺癌） ；膠原病 （例えば、 強皮症、 全身性エリテマトーデス） ； リウマチ性疾患 （例えば、 慢性関節リウマチ） ；骨疾患 （例えば、 骨粗鬆症） な どが挙げられる。
「正常時と比較した場合に、 本発明の蛋白質またはその塩の量が減少している 疾患」 としては、 例えば消化管疾患 （例えば、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍；胃癌；唾 液腺癌） ；皮膚疾患 （例えば、 火傷、 術後の創傷） ；脳腫瘍などが挙げられる。 本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患は、 好ましくは腎疾患または糖尿 病であり、 さらに好ましくは糖尿病性腎症である。
本発明は、 本発明の蛋白質等を用いることを特徴とする、 該蛋白質が関連する 疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法に関する。 当該スクリーニング方法 は、 例えば、
1) 本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非 存在下に培養し、 両条件下における本発明の蛋白質等の生産量を比較すること； 2) 被験物質の存在下および非存在下における本発明の蛋白質等の活性を比較す ること；などによって行われる。
後者の方法は、 さらに、
2a) 本発明の蛋白質等の活性を、 該蛋白質等により発現が制御される遺伝子を含 有する細胞における該遺伝子の発現を測定することにより評価する方法；
2b) 本発明の蛋白質等の活性を、 該蛋白質等により転写活性が制御されるプロモ
—ターのシスエレメントへの該蛋白質等もしくはそれと相互作用し得る転写制御 因子の結合度を測定することにより評価する方法；
2c) 本発明の蛋白質等の活性を、 該蛋白質等の細胞内局在性を測定することによ り評価する方法；などに分けられる。
「本発明の蛋白質等により発現が制御される遺伝子」 としては、 例えばインス リン遺伝子等が挙げられる。 あるいは、 該遺伝子は該蛋白質等により転写活性が 制御されるプロモータ一 （例、 インスリン遺伝子プロモーター等） のシスエレメ ントを含むキメラ D N Aであってもよく、 この場合は当該プロモータ一の下流に 各種のレポーター蛋白質をコードする D N Aを連結してもよい。 「本発明の蛋白 質等により発現が制御される遺伝子を含有する細胞」 としては、 例えば、 塍細胞 などが挙げられる。 また、 「本発明の蛋白質等により転写活性が制御されるプロ モータ一」 としては、 例えば、 インスリン遺伝子プロモーターなどが挙げられる。 「本発明の蛋白質等と相互作用し得る転写制御因子」 としては、 例えば、 インス リン遺伝子プロモーターのシスエレメントに結合し得る転写制御因子などが挙げ られ、 該転写制御因子は、 例えば、 塍細胞核抽出液として提供され得る。 あるい は、 本発明の蛋白質等と相互作用し得る転写制御因子は、 核抽出液から本発明の 蛋白質等をプローブとして、 精製、 もしくは本発明の蛋白質等をコードするポリ ヌクレオチドを用いて酵母 two- hybr id法により c D N Aをクローニングすること ができる。
上記 2a) の場合、 スクリーニング系への本発明の蛋白質等の供給は、 該蛋白質 等を産生する能力をさらに有する細胞を用いることによつても行うことができる。 本発明の蛋白質等を用いるスクリーニング方法に使用される 「本発明の蛋白質 等を産生する能力を有する細胞」 は特に限定されないが、 酸化ストレスや増殖因 子処理などの各種刺激に応じて本発明の蛋白質等の産生が誘導されるものが好ま しい。 あるいは、 本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞は、 前記した本 発明の蛋白質等をコードする D N Aを含有する形質転換体であってもよい。
本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞の好適な例としては、 哺乳動物 (好ましくは、 ヒト、 ラット、 マウスなど） の腎臓もしくは塍臓、 より好ましく は腎臓から単離された細胞などが挙げられる。 これらの細胞は不死化されたもの であってもよい。
本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞の培養は、 前記した形質転換体 と同様にして行われる。
被験物質としては、 例えばペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられる。 本発明の蛋白質等は、 公知の方法、 例えば、 本発明の蛋白質等に対する抗体を 用いて、 ウェスタン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従 つて定量することができる。
ここで使用される 「本発明の蛋白質等に対する抗体」 は、 本発明の蛋白質等を 認識し得る抗体であれば、 モノクローナル抗体またはポリク口一ナル抗体の何れ であってもよい。 また、 該抗体は、 抗体分子そのものであってもよいし、 抗体分 子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分であってもよい。 また、 抗体 は標識されていてもよい。
抗体の標識に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素、 酵素、 蛍 光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔3 5 S ) 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 β—ガラクトシダーゼ、 3—ダルコシダ一ゼ、 アル力リフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸 脱水素酵素などが用いられる。 蛍 物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例え ば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられ る。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一 （ストレブト） ァ ビジン系を用いることもできる。
あるいは、 本発明の蛋白質等は、 上記本発明の蛋白質等と相互作用し得る転写 制御因子を用いて、 ウェスト一ウェスタン解析またはそれに準じる方法に従って 定量することができる。 該転写制御因子は標識されていることが好ましく、 標識 剤としては上記と同様の物質を用いることができる。
あるいはまた、 本発明の蛋白質等は、 それが結合し得るポリヌクレオチドを用 いてゲルシフ卜アツセィ法またはそれに準じる方法に従って定量することができ る。 「本発明の蛋白質等が結合し得るポリヌクレオチド」 としては、 本発明の蛋 白質が結合して転写を制御する遺伝子のプロモーター領域中の配列を含むものが 挙げられる。 例えば、 以前に報告されたものとしては、 C型ナトリウム利尿性べ プチド遺伝子の G Cエレメントがあるが、 これに限定されない。
本発明の蛋白質等を定量する際、 定量される蛋白質等は、 細胞内に含まれるも のまたは細胞外に分泌されたもののいずれであってもよく、 さらに両者の合計で あってもよい。
また、 細胞内に含まれる本発明の蛋白質等を定量する場合、 細胞を適当な固定 液あるいは膜透過促進剤処理した後に行うことが好ましい。 また、 細胞を適当な 緩衝液に懸濁し、 超音波または凍結融解などによって細胞を破壊した後、 破碎液 中の蛋白質等を定量することもできる。 必要により、 破碎液中の蛋白質等を分離 精製した後に、 蛋白質等の定量を行ってもよい。 核内に移行した本発明の蛋白質 等を定量する場合、 上記と同様に細胞を破壊した後、 沈殿を回収し、 これをさら に高張液等で処理することにより得られる核抽出液中の蛋白質等を測定すればよ い。
上記 2c) の場合、 本発明の蛋白質等の細胞内局在性は、 例えば、 該蛋白質等を 産生する能力を有する細胞における該蛋白質等の細胞質から核への移行の度合い をモニタリングすることにより評価することができる。 例えば、 蛍光標識した本 発明の蛋白質等に対する抗体で該細胞を免疫染色することにより、 該蛋白質等の 細胞質から核への移行をモニタリングすることができる。 あるいは、 本発明の蛋 白質等を G F Pなどの蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現し得る形質転換体を 用いることにより、 直接的に該蛋白質等の細胞質から核への移行をモニタリング することもできる （例えば、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 278 : 659-664 (2000)を参照) 。
本発明はまた、 上記 1)の本発明の蛋白質等の生産量を指鏢とするスクリーニン グ法に用いることができるスクリーニング用キットに関する。 該キットは、 （a) 上記の本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞、 および (b)本発明の蛋白 質等を検出することができる試薬、 例えば、 上記した本発明の蛋白質等に対する 抗体、 該蛋白質等が結合し得るポリヌクレオチドもしくは該蛋白質等と相互作用 し得る転写制御因子の少なくとも一方、 好ましくは両方をその構成として含むこ とを特徴とする。 該キットは、 所望により上記 1)のスクリーニング方法を実施す るのに必要もしくは好ましい他の試薬類、 器具類をさらに構成として含むことが できる。
本発明の蛋白質等を用いる上記 2)のスクリーニング方法において指標として用 いられる本発明の蛋白質等の活性としては、 例えば転写制御活性などが挙げられ る。 具体的には、 例えば 「本発明の蛋白質等と相互作用し得る転写制御因子の標 的ポリヌクレオチドへの結合を制御する活性」 、 「本発明の蛋白質等の標的ポリ ヌクレオチドへの結合活性」 、 「本発明の蛋白質等による転写制御の支配下にあ る遺伝子の発現制御活性」 、 「本発明の蛋白質等の核移行活性」 などが挙げられ る。
「本発明の蛋白質等と相互作用し得る転写制御因子」 としては、 例えば、 イン スリン遺伝子の転写制御に関与する転写因子であって、 本発明の蛋白質によって 該転写制御活性が調節されている蛋白質などが挙げられる。 このような転写制御 因子はそれを発現する細胞 （例えば、 上記インスリン遺伝子の転写因子の場合は 塍細胞など） の核抽出液として提供され得る。
「本発明の蛋白質等と相互作用し得る転写制御因子の標的ポリヌクレオチド」 としては、 例えば、 ヒトまたは他の哺乳動物由来のインスリン遺伝子プロモータ 一の塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド等が挙げられる。
「本発明の蛋白質等の鏢的ポリヌクレオチド」 としては、 上記の 「本発明の蛋 白質等が結合し得るポリヌクレオチド」 として例示されたものが挙げられる。 上記結合活性もしくは結合を制御する活性は、 ゲルシフ卜アツセィ法 (electrophoret i c mobi l i ty shi f t assay) 等の公知の方法またはそれに準じる 方法を用いて測定することができる。
「本発明の蛋白質等による転写制御の支配下にある遺伝子」 としては、 本発明 の蛋白質等と相互作用し得る転写制御因子の標的ポリヌクレオチドをシスエレメ ントとして含むプロモーターの制御下にある遺伝子、 または本発明の蛋白質等の 標的ポリヌクレオチドをシスエレメントとして含むプロモーターの制御下にある 遺伝子が挙げられる。 前者として、 例えば、 インスリン遺伝子などが挙げられる。 後者として、 以前に報告されたものとしては、 C型ナトリウム利尿性ペプチド遺 伝子が挙げられる。
このような遺伝子の発現制御活性は、 該遺伝子から産生される m R N Aの塩基 配列をもとに適当なプライマーを作成し、 R T— P C Rを行つて該遺伝子の転写 産物量を測定することにより測定できる。 また、 上記発現制御活性は、 公知の方 法またはそれに準じる方法に従って、 該遺伝子から産生される mR N Aの塩基配 列の全部または一部を含むポリヌクレオチドを標識して作成したプローブを用い たノザンブロッテイング法により測定できる。 また、 上記発現制御活性は、 公知 の方法またはそれに準じる方法に従って、 本発明の蛋白質等と相互作用し得る転 写制御因子の鏢的ポリヌクレオチド、 または本発明の蛋白質等の標的ポリヌクレ ォチドを含むプロモーターの下流に適当なレポーター遺伝子を連結した発現べク ターを作成し、 該ベクターを適当な細胞、 好ましくは本発明の蛋白質等および Z またはそれと相互作用し得る転写制御因子を産生する細胞に導入して、 レポ一夕 一遺伝子がコードする蛋白質の発現を確認することによつても測定できる。
本発明はまた、 上記 2)の本発明の蛋白質等の活性を指標とするスクリーニング 法に用いることができるスクリーニング用キットに関する。 例えば、 上記 2a)の スクリーニング法に用いることができるキットとしては、 （a)本発明の蛋白質等 により発現が制御される遺伝子を含有する細胞、 （b)本発明の蛋白質等および (c) 該遺伝子の発現を検出することができる試薬、 例えば、 該遺伝子とハイストリン ジェントな条件下でハイプリダイズし得るポリヌクレオチドの少なくとも 1つ、 好ましくはすべてをその構成として含むものが挙げられる。 尚、 （b)の本発明の 蛋白質等は、 （a)の細胞により産生されるものであってもよい。
上記 2b)のスクリーニング法に用いることができるキットとしては、 （a)本発明 の蛋白質等、 および (b)上記した本発明の蛋白質等が結合し得るポリヌクレオチ ドまたは本発明の蛋白質等と相互作用し得る転写制御因子の少なくとも一方、 好 ましくは両方をその構成として含むものが挙げられる。
また、 上記 2c) のスクリーニング法に用いることができるキットとしては、 (a)本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞、 および必要に応じて（b)該蛋 白質等に対する抗体をその構成として含むものが挙げられる。 （a)の細胞におい て、 本発明の蛋白質等が G F Pなどの蛍光蛋白質との融合蛋白質のように生細胞 で可視化可能な形態で産生される場合は、 （b)の抗体を省略することができる。 これらのキットは、 所望により上記 2)のスク ύ一二ング方法を実施するのに必 要もしくは好ましい他の試薬類、 器具類をさらに構成として含むことができる。 上記のスクリーニング方法において、 被験物質の存在下と非存在下における本 発明の蛋白質の産生量または活性を比較する代わりに、 本発明の蛋白質またはそ の塩が関連する疾患に罹患している疑いのある動物由来の細胞その他の検体と正 常対照動物由来のそれとにおける本発明の蛋白質の量または活性を比較すること によって、 被検動物が本発明の蛋白質が関連する疾患に罹患しているか否か、 ま たは将来該疾患に罹患する可能性が高いか否かを診断することができる。
本発明の蛋白質等を用いるスクリーニング方法によって、 本発明の蛋白質また はその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質、 すなわち、 本発明の蛋白質等の産生 を調節 （促進または阻害） する物質、 あるいは本発明の蛋白質等の活性を調節 (促進または阻害） する物質をスクリーニングすることができる。
例えば、 本発明の蛋白質等の産生量を約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増大させる被験物質を、 本発明の蛋白質等の産生を 促進する物質として；本発明の蛋白質等の産生量を約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる被験物質を本発明の蛋白質等 の産生を阻害する物質として、 それぞれ選択することができる。
また、 例えば、 本発明の蛋白質等の活性を約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以 上、 より好ましくは約 5 0 %以上増大させる被験物質を、 本発明の蛋白質等の活 性を促進する物質として；本発明の蛋白質等の活性を約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる被験物質を本発明の蛋白質 等の活性を阻害する物質として、 それぞれ選択することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる本発明の蛋白質が関連する疾患 の予防 ·治療物質は、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発 酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などのいずれであつ てもよい。 これらは塩を形成していてもよく、 該塩の具体例としては、 前記した 本発明の蛋白質の塩と同様のものが挙げられる。 本発明の蛋白質等を用いるスクリーニング方法により得られる 「本発明の蛋白 質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質」 （化合物） は、 必要により薬 理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、 本発明の蛋白 質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬として用いることができる。
ここで、 薬理学的に許容される担体としては、 製剤素材として慣用の各種有機 あるいは無機担体物質が用いられ、 固形製剤における賦形剤、 滑沢剤、 結合剤、 崩壊剤；液状製剤における溶剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張化剤、 緩衝剤、 無 痛化剤などとして配合される。 また必要に応じて、 防腐剤、 抗酸化剤、 着色剤、 甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。 '
賦形剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 D—マンニトール、 D—ソルビトー ル、 デンプン、 α化デンプン、 デキストリン、 結晶セルロース、 低置換度ヒドロ キシプロピルセルロース、 カルポキシメチルセルロースナトリゥム、 アラビアゴ ム、 プルラン、 軽質無水ケィ酸、 合成ゲイ酸アルミニウム、 メタケイ酸アルミン 酸マグネシゥムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、 ステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸カルシ ゥム、 タルク、 コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、 ひ化デンプン、 ショ糖、 ゼラチン、 アラビアゴム、 メチルセルロース、 カルポキシメチルセルロース、 カルポキシメチルセルロース ナトリウム、 結晶セルロース、 白糖、 D—マンニト一ル、 トレハロース、 デキス トリン、 プルラン、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチル セルロース、 ポリビエルピ口リドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 デンプン、 カルボキシメチルセル口 ース、 カルポキシメチルセルロースカルシウム、 クロスカルメロースナトリウム、 カルポキシメチルスターチナトリウム、 軽質無水ケィ酸、 低置換度ヒドロキシプ 口ピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、 注射用水、 生理的食塩水、 リンゲル液、 アルコール、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ゴマ油、 トウモロコシ油、 ォ リーブ油、 綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコ —ル、 D—マンニ! ル、 トレハロース、 安息香酸ベンジル、 エタノール、 トリ スァミノメタン、 コレステロール、 トリエタノ一ルァミン、 炭酸ナトリウム、 ク ェン酸ナトリウム、 サリチル酸ナトリウム、 酢酸ナトリウムなどが挙げられる。 懸濁化剤の好適な例としては、 ステアリルトリエタノールァミン、 ラウリル硫 酸ナトリウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化ベンザルコニゥム、 塩化べンゼトニゥム、 モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポ リビニルアルコール、 ポリビニルピロリドン、 カルポキシメチルセルロースナト リウム、 メチルセルロース、 ヒドロキシメチルセルロース、 ヒドロキシェチルセ ルロース、 ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート 類、 ポリオキシェチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、 塩化ナトリウム、 グリセリン、 D—マンニトー ル、 D—ソルビトール、 ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、 リン酸塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェン酸塩などの緩 衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、 ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、 パラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブ夕ノー ル、 ベンジルアルコール、 フエネチルアルコール、 デヒドロ酢酸、 ソルビン酸な どが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、 亜硫酸塩、 ァスコルビン酸塩などが挙げられる。 着色剤の好適な例としては、 水溶性食用タール色素 （例、 食用赤色 2号および 3号、 食用黄色 4号および 5号、 食用青色 1号および 2号などの食用色素、 水不 溶性レーキ色素 （例、 前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など） 、 天然 色素 （例、 β—力ロチン、 クロロフィル、 ベンガラなど） などが挙げられる。 甘味剤の好適な例としては、 サッカリンナトリウム、 グリチルリチン酸二カリ ゥム、 アスパルテーム、 ステビアなどが挙げられる。 前記医薬組成物の剤形としては、 例えば綻剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル、 マイクロカプセルを含む） 、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などの経 口剤；および注射剤 （例、 皮下注射剤、 静脈内注射剤、 筋肉内注射剤、 腹腔内注 射剤など） 、 外用剤 （例、 経鼻投与製剤、 経皮製剤、 軟膏剤など） 、 坐剤 （例、 直腸坐剤、 膣坐剤など） 、 ペレット、 点滴剤、 徐放性製剤 （例、 徐放性マイクロ カプセルなど） 等の非経口剤が挙げられ、 これらはそれぞれ経口的あるいは非経 口的に安全に投与できる。
医薬組成物は、 製剤技術分野において慣用の方法、 例えば日本薬局方に記載の 方法等により製造することができる。 以下に、 製剤の具体的な製造法について詳 述する。 医薬組成物中の本発明のスクリーニング方法により得られる化合物の含 量は、 剤形、 該化合物の投与量などにより異なるが、 例えば約 0 . 1ないし 1 0 0重量％である。
例えば、 経口剤は、 有効成分に、 賦形剤 （例、 乳糖， 白糖， デンプン， D—マ ンニトールなど) 、 崩壊剤 (例、 カルポキシメチルセルロースカルシウムなど) 、 結合剤 （例、 α化デンプン， アラビアゴム， カルポキシメチルセルロース， ヒド ロキシプロピルセルロース， ポリビエルピロリドンなど） または滑沢剤 （例、 タ ルク， ステアリン酸マグネシウム， ポリエチレングリコール 6 0 0 0など） など を添加して圧縮成形し、 次いで必要により、 味のマスキング、 腸溶性あるいは持 続性を目的として、 コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングす ることにより製造される。
該コーティング基剤としては、 例えば糖衣基剤、 水溶性フィルムコーティング 基剤、 腸溶性フィルムコーティング基剤、 徐放性フィルムコーティング基剤など が挙げられる。
糖衣基剤としては、 白糖が用いられ、 さらに、 タルク、 沈降炭酸カルシウム、 ゼラチン、 アラビアゴム、 プルラン、 カルナパロウなどから選ばれる 1種または 2種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、 例えばヒドロキシプロピルセル口 ース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 ヒドロキシェチルセルロース、 メ チルヒドロキシェチルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリビニルァセタ 一ルジェチルァミノアセテート、 アミノアルキルメタァクリレートコポリマー E 〔オイドラギット E (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 ポリビニルピロリドンな どの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、 例えばヒドロキシプロピルメチル セルロース フタレート、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース ァセテ一卜サ クシネート、 カルポキシメチルェチルセルロース、 酢酸フ夕ル酸セルロースなど のセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマ一 L 〔オイドラギット L (商品 名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタアクリル酸コポリマ一 L D 〔オイドラギット L — 3 0 D 5 5 (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタアクリル酸コポリマー S 〔オイドラギット S (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 などのアクリル酸系高分 子；セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、 例えばェチルセルロースなどのセ ルロース系高分子；アミノアルキルメタァクリレートコポリマー R S 〔オイドラ ギット R S (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 アクリル酸ェチル ·メタアクリル 酸メチル共重合体懸濁液 〔オイドラギット N E (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、 その 2種以上を適宜の割合で混合して用いても よい。 また、 コーティングの際に、 例えば酸化チタン、 三二酸化鉄等のような遮 光剤を用いてもよい。
注射剤は、 有効成分を分散剤 （例、 ポリソルベート 8 0 , ポリオキシエチレン 硬化ヒマシ油 6 0， ポリエチレングリコール， カルポキシメチルセルロース， ァ ルギン酸ナトリウムなど） 、 保存剤 （例、 メチルパラベン， プロピルパラベン， ベンジルアルコール， クロロブタノ一ル， フエノールなど） 、 等張化剤 （例、 塩 化ナトリウム， グリセリン， D—マンニトール， D—ソルビトール， ブドウ糖な ど） などと共に水性溶剤 （例、 蒸留水， 生理的食塩水， リンゲル液等） あるいは 油性溶剤 （例、 ォリーブ油， ゴマ油， 綿実油， トウモロコシ油などの植物油、 プ ロピレングリコ一ル等） などに溶解、 懸濁あるいは乳化することにより製造され る。 この際、 所望により溶解補助剤 （例、 サリチル酸ナトリウム， 酢酸ナトリウ ム等） 、 安定剤 （例、 ヒト血清アルブミン等） 、 無痛化剤 （例、 ベンジルアルコ ール等） 等の添加物を用いてもよい。 注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填さ れる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与 することができる。
本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬の投与量は、 対象 疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより異なるが、 例えば、 腎疾患に罹患してい る成人患者 （体重 6 0 k g ) においては、 一日あたり、 有効成分である本発明の スクリーニング方法により得られる化合物として、 約 0 . 1ないし 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0ないし 5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0ないし 2 0 m gで ある。
本発明はさらに、 本発明の蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドする塩基配 列を含有するポリヌクレオチド （以下、 「本発明のポリヌクレオチド」 と略記す ることがある） を用いることを特徴とする、 本発明の蛋白質またはその塩が関連 する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法に関する。
ここで、 本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患としては、 本発明の蛋白 質等を用いるスクリーニング法において上記したものが同様に挙げられるが、 好 ましくは腎疾患または糖尿病であり、 さらに好ましくは糖尿病性腎症である。 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質またはその部分べプチドをコ一 ドする塩基配列を含有するものであれば、 D NA、 R NAまたはD NAZR NA キメラのいずれであってもよいが、 好ましくは D NAである。 これらは二本鎖ま たは一本鎖のいずれであってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 D NA、 二本鎖 R N Aまたは D N A : R N Aのハイブリッドでもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖
(すなわち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （すなわち、 非コード鎖） であってもよい。 なお、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aとしては、 本発明の蛋白質等の遺伝子工学的手法による製造方法において前 記したものが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドを用いるスクリーニング方法は、 例えば、 本発明の 蛋白質等を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、 本発明の蛋白質等を産 生する能力を有する細胞を被験物質の存在下に培養した場合とで、 本発明の蛋白 質またはその部分ペプチドをコードする mR N Aの量を本発明のポリヌクレオチ ドを用いて測定 ·比較することなどによって行われる。
ここで、 本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞、 該細胞の培養方法、 および被験物質としては、 前記した本発明の蛋白質等を用いるスクリーニング方 法と同様のものが挙げられる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする mR NAの量は、 公知の 方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 第 2版 （前 述） に記載の方法またはそれに準じる方法に従って定量することができる。 例え ば、 本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞の培養物から常法に従って全 R NAまたはポリ A ( + ) R NAを抽出し、 本発明のポリヌクレオチド、 例えば、 配列番号： 1で表される塩基配列の全部または一部を含有するポリヌクレオチド をプローブとしてノーザンハイブリダィゼ一シヨンを行うか、 あるいは配列番 号： 1で表される塩基配列の一部を含有する一対のオリゴヌクレオチドをプライ マーとして R T— P C R法を行うことによって定量することができる。
例えば、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする mR N Aの量を 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増大させる 被験物質を、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進する物質として； 本発明の蛋白質をコードする mR N Aの量を約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以 上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる被験物質を、 本発明の蛋白質をコー ドする遺伝子の発現を阻害する物質として選択することができる。
本発明はまた、 上記の本発明のポリヌクレオチドを用いるスクリーニング方法 に用いることができるスクリーニング用キットに関する。 該キットは、 （a)上記 した本発明の蛋白質等を産生する能力を有する細胞、 および )本発明の蛋白質 等をコードする遺伝子の発現を検出することができる試薬、 例えば、 本発明の蛋 白質等をコードする mR N Aとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズ し得るポリヌクレオチドの少なくとも一方、 好ましくは両方をその構成として含 むことができる。 該キットは、 所望により上記の本発明のポリヌクレオチドを用 いるスクリーニング方法を実施するのに必要もしくは好ましい他の試薬類、 器具 類をさらに構成として含むことができる。
本発明のポリヌクレオチ を用いるスクリーニング方法により得られる本発明 の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質は、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などのいずれであってもよい。 これらは塩を形成していてもよ く、 該塩の具体例としては、 前記した本発明の蛋白質の塩と同様のものが挙げら れる。
該スクリーニング方法により得られる本発明の蛋白質またはその塩が関連する 疾患の予防 ·治療物質 (化合物) は、 必要により薬理学的に許容し得る担体とと もに混合して医薬組成物とした後に、 本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾 患の予防 ·治療薬として用いることができる。
ここで、 薬理学的に許容される担体としては、 本発明の蛋白質等を用いるスク リーエング方法により得られる本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予 防 ·治療物質の場合と同様のものが挙げられる。
該医薬組成物は、 本発明の蛋白質等を用いるスクリーニング方法により得られ る本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質の場合と同様に して製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与 することができる。
本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬の投与量は、 対象 疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより異なるが、 例えば、 腎疾患に罹患してい る成人患者 （体重 6 O k g ) においては、 一日あたり、 有効成分である本発明の スクリーニング方法により得られる化合物として、 約 0 . 1ないし 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0ないし 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0ないし 2 0 m gで ある。
本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質は、 該蛋白質を コードする遺伝子のプロモ一タ一活性を検出することによってスクリーニングす ることもできる。
本発明の蛋白質をコードする D N Aがレポーター遺伝子で置換された細胞ある いは非ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の蛋白質をコードする遺伝 子のプロモーターの支配下に存在するので、 被験物質による処理あるいは被験物 質の投与後に、 該レポ一ター遺伝子がコードする蛋白質の発現を確認することに より、 該プロモーターの活性を検出することができる。
また、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域とレポ一夕一遺伝子 が連結されてできたベクターを有する細胞および非ヒト哺乳動物においても該プ 口モーターの活性を検出できる。
ここで、 レポ一夕一遺伝子としては、 例えば i3—ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z ) , 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子など が挙げられる。
例えば、 本発明の蛋白質をコードする D NA領域の一部を大腸菌由来の /3—ガ ラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明の蛋白質 の発現する組織で、 本発明の蛋白質の代わりに β—ガラクトシダ一ゼが発現する。 したがって、 例えば、 5 _ブロモ— 4—クロ口 _ 3—インドリル _ /3—ガラクト ピラノシド （X— g a l ) のような jS —ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用 いる染色により、 簡便に本発明の蛋白質の発現状態を確認することができる。 具 体的には、 細胞あるいは組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩 衝生理食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織镖本を I mM E D T A Z P B S溶液で洗浄することによって、 —ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観察することにより、 細胞あるいは組織における本発明の蛋白質の発現状 態を確認することができる。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NA を検出してもよい。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子のプロモータ一活性を促進または阻害する 化合物は、 該蛋白質またはその塩の産生および活性を調節することができるので、 本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬として有用である。 本発明の蛋白質またはそれをコードする m R N Aは、 例えば糖尿病ゃ腎疾患 (例、 糖尿病性腎症） などで発現が増加するため、 当該疾患における早期診断、 症状の重症度の判定、 疾患進行の予測のためのマ一力一として有用である。 よつ て、 本発明の蛋白質等に対する抗体および上記の本発明のポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の診断薬として有用である。 さらに、 該抗体は本発明の蛋白質またはその塩と結合してこれを不活性化 （中和） し、 ま た、 本発明の蛋白質をコードする D NAのアンチセンスポリヌクレオチドは、 本 発明の蛋白質をコードする mR N Aとハイブリダィズして該蛋白質への翻訳を阻 害するので、 本発明のスクリーニング方法により得られる化合物と同様に、 本発 明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬として有用である。
したがって、 本発明はまた、 本発明の蛋白質等に対する抗体を含有してなる該 蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬に関する。 ここで、 本発明の 蛋白質またはその塩が関連する疾患としては、 本発明の蛋白質等を用いるスクリ —ニング法において上記したもののうち、 正常時と比較した場合に本発明の蛋白 質またはその塩の量が増加している疾患として例示されたものが同様に挙げられ るが、 好ましくは腎疾患または糖尿病であり、 さらに好ましくは糖尿病性腎症で める。
本発明の蛋白質等に対する抗体 （以下、 「本発明の抗体」 と略記する場合があ る） は、 該蛋白質等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に 従って製造することができる。 本発明の蛋白質等に対するモノクローナル抗体ま たはポリクローナル抗体は、 例えば以下のようにして製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の蛋白質等を、 哺乳動物に対して、 投与により抗体産生が可能な部位に、 それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与する。 投与に際して抗体産生能を高 めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与 してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用 いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラッ卜が好まし く用いられる。
例えば、 抗原で免疫された哺乳動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個 体を選択し、 最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含 まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。 抗血清中の抗 体価の測定は、 例えば、 後記の鏢識化蛋白質と抗血清とを反応させたのち、 抗体 に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。 融合操作は、 既知の方法、 例えば、 ケ一ラ一とミルスタインの方法 〔ネイチヤー (Nature) , 256、 495 (1975) 3 に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール ( P E G ) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好 ましくは P E Gが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0、 A P— 1な どの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG600 0 ) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 3 7 °Cで 1〜 10分間ィンキュベ一トすることにより効率よく細胞融合を実施でき る。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、 例えば、 蛋白質抗原を直接あるい は担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養 上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細 胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いら れる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出す る方法；抗免疫グ 0プリン抗体またはプロテイン Αを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した蛋白質を加え、 固相 に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；などによりスクリーニングする ことができる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 モノクローナル抗体の選別は、 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、 ハイプリドーマが生育できるも のならばどのような培地を用いても良い。 このような培地としては、 例えば、 1 〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 164.0培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイ ブリド一マ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ) などを用いる ことができる。 培養温度は、 通常 20〜40t、 好ましくは約 37 °Cである。 培 養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上 記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、 自体公知の方法、 例えば、 免 疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電 気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過 法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤 により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って 分離精製することができる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明の蛋白質等に対するポリクローナル抗体は、 自体公知の方法に従って製 造することができる。 例えば、 免疫抗原 （蛋白質抗原） 自体、 あるいはそれとキ ャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様 に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の抗体含有物を採取して、 抗 体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリア一蛋白質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力プリングさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤、 例えばグルタ ルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチォ ピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 哺乳動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで きる。
本発明の抗体を含有してなる、 本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の 予防'治療薬は、 本発明の抗体そのものであってもよいが、 該抗体を薬理学的に 許容し得る担体とともに混合して得られる医薬組成物であることが好ましい。 こ こで、 薬理学的に許容される担体としては、 前記した 「本発明の蛋白質またはそ の塩が関連する疾患の予防 ·治療物質」 の場合と同様のものが挙げられる。 該医薬組成物は、 前記した 「本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予 防 ·治療物質」 の場合と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与 することができる。
該予防 ·治療薬の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより異な るが、 例えば、 腎疾患に罹患している成人患者 （体重 6 0 k g ) においては、 一 日あたり、 有効成分である本発明の抗体として、 約 0 . 1ないし 1 0 0 m g、 好 ましくは約 1 . 0ないし 5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0ないし 2 0 m gであ る。
本発明はまた、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列 と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有してなる、 該蛋白質または その塩が関連する疾患の予防 ·治療薬に関する。 ここで、 本発明の蛋白質または その塩が関連する疾患としては、 本発明の蛋白質等を用いるスクリーニング法に おいて上記したもののうち、 正常時と比較した場合に本発明の蛋白質またはその 塩の量が増加している疾患として例示されたものが同様に挙げられるが、 好まし くは腎疾患または糖尿病であり、 さらに好ましくは糖尿病性腎症である。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列と相補的な塩基 配列を有するポリヌクレオチド （以下、 「本発明のアンチセンスポリヌクレオチ ド」 と略記する場合がある） としては、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチド をコードする塩基配列と完全に相補的な塩基配列、 または実質的に相補的な塩基 配列を有し、 本発明の蛋白質をコードする R N Aからの該蛋白質の翻訳を抑制す る作用を有するものであればよい。 「実質的に相補的な塩基配列」 としては、 本 発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列と、 該蛋白質を発現 する細胞の生理学的条件下でハイブリダィズし得る塩基配列、 より具体的には、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の相補鎖との間で 約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好 ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 クローン化した、 あるいは決定さ れた本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そ うしたポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子の複製または発 現を阻害することができる。 即ち、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子から転写される R N Aとハイブリダィズする ことができ、 mR NAの合成 (プロセッシング) または機能 （蛋白質への翻訳） を阻害することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの標的領域は、 ァンチセンスポリヌク レオチドがハイプリダイズすることにより、 結果として本発明の蛋白質の翻訳が 阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、 本発明の蛋白質をコードす る R NAの全配列であっても部分配列であってもよく、 短いもので約 1 5塩基程 度、 長いもので mR NAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。 合成の容易 さや抗原性の問題を考慮すれば、 約 1 5〜約 3 0塩基からなるオリゴヌクレオチ ドが好ましいがそれに限定されない。 具体的には、 例えば、 本発明の蛋白質をコ —ドする遺伝子の 5， 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6 —ベースペア ' リピ一ト、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻 訳開始コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端へ ァピンループが標的領域として選択しうるが、 該遺伝子内部の如何なる領域も镖 的として選択しうる。 例えば、 該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすること もまた好ましい。
さらに、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質をコード する mR NAもしくは初期転写産物とハイプリダイズして蛋白質への翻訳を阻害 するだけでなく、 二本鎖 D NAである本発明の蛋白質をコードする遺伝子と結合 して三重鎖 （トリプレックス） を形成し、 R NAの転写を阻害し得るものであつ てもよい。
7ンチセンスポリヌクレオチドは、 2ーデォキシー D—リポースを含有してい るデォキシヌクレオチド、 D—リポースを含有しているデォキシヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他のタイプのヌクレオ チド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の 蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有する その他のポリマー （伹し、 該ポリマーは D NAや R NA中に見出されるような塩 基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） な どが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本 鎖 R NA、 さらに D NA： R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾 ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の 付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いた もの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した もの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチ ルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートな ど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォ エート、 ホスホロジチォェ一卜など） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L一 リジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有している もの、 イン夕一カレント化合物 (例えば、 ァクリジン、 プソラレンなど) を持つ もの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の 金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持 つもの （例えば、 ひァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオ シド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を 含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含ん でいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシ ル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであつ てよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が 修飾されていてよく、 例えば、 1偭以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基など で置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていて よい。
アンチセンスポリヌクレオチドは、 R NA、 D NA、 あるいは修飾された核酸 (R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体 ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシ ドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞 透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにす る、 そしてもし毒性があるならァンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。 こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al.， Pharm Tech Japan, Vol . 8, pp. 247, 1992 ; Vol . 8， pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al . ed. , Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開示がある。
アンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供 与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられること ができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷 を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用 を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい 脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホル メート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に 特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどの ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ 用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレンダリコールなどのグ リコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。
本発明の蛋白質をコードする mR N Aもしくは遺伝子初期転写産物を、 コード 領域の内部 （初期転写産物の場合はィントロン部分を含む） で特異的に切断し得 るリポザィムもまた、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含され得る。 「リポザィム」 とは核酸を切断する酵素活性を有する R NAをいうが、 最近では 当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴ D NAも同様に核酸切断活性を有す ることが明らかになっているので、 本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有 する限り D NAをも包含する概念として用いるものとする。 リポザィムとして最 も汎用性の高いものとしては、 ウイロイドゃウィルソィド等の感染性 R N Aに見 られるセルフスプライシング R N Aがあり、 ハンマーへッド型ゃヘアピン型等が 知られている。 ハンマーヘッド型は約 4 0塩基程度で酵素活性を発揮し、 ハンマ —ヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ （合わせて約 1 0塩基程 度） を mR N Aの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、 標的 mR N Aのみを特異的に切断することが可能である。 このタイプのリポザィムは、 R N Aのみを基質とするので、 ゲノム D N Aを攻撃することがないというさらなる利 点を有する。 「本発明のポリヌクレオチド」 に対応する mR N Aが自身で二本鎖 構造をとる場合には、 RN Aヘリカーゼと特異的に結合し得るウィルス核酸由来 の RN Aモチーフを連結したハイプリッドリポザィムを用いることにより、 鏢的 配列を一本鎖にすることができる CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)] 。 さらに、 リポザィムを、 それをコードする DN Aを含む発 現べクタ一の形態で使用する場合には、 転写産物の細胞質への移行を促進するた めに、 t RNAを改変した配列をさらに連結したハイプリッドリボザィムとする こともできる [Nucleic Acids Res., 29(13)： 2780-2788 (2001)] 。
本発明の蛋白質をコードする mRNAもしくは遺伝子初期転写産物のコード領 域内の部分配列 （初期転写産物の場合はイントロン部分を含む） に相補的な二本 鎖オリゴ RNAもまた、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含され得る。 短い二本鎖 RN Aを細胞内に導入するとその RN Aに相補的な mRNAが分解さ 、 れる、 いわゆる RNA干渉 （RNA i) と呼ばれる現象は、 以前から線虫、 昆虫、 植物等で知られていたが、 最近、 この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認 されたことから [Nature, £Π(6836)： 494-498 (2001)] 、 リポザィムの代替技 術として注目されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポザィムは、 本発明の蛋白質 をコードする cDN A配列もしくはゲノミック D N A配列情報に基づいて m R N Aもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、 市販の DNAZRNA自動合成機 (アプライド ·バイオシステムズ社、 ベックマン社等） を用いて、 これに相補的 な配列を合成することにより調製することができる。 RNA i活性を有する二本 鎖ォリゴ R N Aは、 センス鎖及びァンチセンス鎖を DNAZRNA自動合成機で それぞれ合成し、 適当なアニーリング緩衝液中で、 例えば、 約 90〜約 95°Cで 約 1分程度変性させた後、 約 30〜約 70 °Cで約 1〜約 8時間ァニーリングさせ ることにより調製することができる。 また、 相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交 互にオーバーラップするように合成して、 これらをアニーリングさせた後リガ一 ゼでライゲーシヨンすることにより、 より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製す ることもできる。 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる、 本発明の蛋白質また はその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬は、 本発明のアンチセンスポリヌクレオ チドそのものであってもよいが、 該アンチセンスポリヌクレオチドを薬理学的に 許容し得る担体とともに混合して得られる医薬組成物であることが好ましい。 該 アンチセンスポリヌクレオチドは、 本発明の蛋白質等を用いるスクリーニング方 法により得られる本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質 の場合と同様にして、 製剤化し、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーな ど） に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。 また、 アンチセ ンスポリヌクレオチドは、 例えばレトロウイルスベクター、 アデノウイルスべク ター、 アデノウイルスァソシェ一テツドウィルスベクタ一などの適当なベクタ一 に揷入した後に投与することもできる。
ァンチセンスポリヌクレオチドは、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよう なカテーテルによって投与してもよく、 エアロゾル化後、 吸入剤として気管内に 局所投与することもできる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより異なるが、 例えば、 腎疾患に罹患している成人患者 （体重 6 O k g ) においては、 一日あたり、 約 0 . 1ないし 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0 ないし 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0ないし 2 0 m gである。
さらに、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発 明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドの存在やその発現状況を調べるための 診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
本発明はまた、 上記の 「本発明のポリヌクレオチド」 を含有してなる、 本発明 の蛋白質またはその塩が関連する疾患の診断薬に関する。 例えば、 本発明のポリ ヌクレオチドをプローブとして使用することにより、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の蛋白質をコードする D NAま たは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mR N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知の ノーザンハイブリダィゼーシヨンや P C R— S S C P法 （ゲノミックス (Genomics) , 第 5巻， 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシージングズ · ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー■ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスェ ― (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実 施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーションにより発現過多または減少が検出さ れた場合や PC R—S S CP法により DN Aの突然変異が検出された場合は、 例 えば、 糖尿病ゃ腎疾患などの本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患に罹患 している可能性が高いと診断することができる。
本発明はまた、 上記の 「本発明の抗体」 を含有してなる、 本発明の蛋白質また はその塩が関連する疾患の診断薬に関する。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明の蛋白質等とを競合的 に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明の蛋白質等の割合を測定する ことにより被検液中の本発明の蛋白質またはその塩を定量することを特徴とする、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の診断方法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することにより被検液中の本発明の蛋白質またはその塩を定量することを 特徴とする、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の診断方法を提供する。
上記 （ii) の定量においては、 一方の抗体が本発明の蛋白質等の N端部を認識 する抗体である場合、 他方の抗体が本発明の蛋白質等の他の部分、 例えば C端部 を認識する抗体であることが望ましい。
また、 本発明の蛋白質等に対するモノクロ ナル抗体を用いて該蛋白質の定量 を行うことができるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これら の目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質またはその塩の定量は、 特に制限される べきものではなく、 被測定液中の抗原量に対応した抗体、 抗原もしくは抗体—抗 原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含 む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定 法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およ びサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンド イッチ法を用いるのが特に好ましい。
镖識物質を用いる測定法に用いられる鏢識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵 素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ]3 _ガラクトシダ ーゼ、 iS —ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リ ンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス力 ミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 Jレシフェリン、 ルシゲニンなどが用い られる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン— （ストレブ ト) アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 蛋白質等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポ リスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が あげられる。 サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明の蛋白質またはその塩の量を定量することができる。 1次反応 と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらし て行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることが できる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは 鏢識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向 上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
上記サンドィツチ法による本発明の蛋白質またはその塩の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明の蛋白 質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応お よび 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明の蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し (B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量す る。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレング リコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体と して固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体 として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質の測定系を構築すれ ばよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照す ることができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GYJ Vol . 70 (Immunochemical Techniques (Part A) ) 、 同 書 Vol . 73 (Immunochemi cal Techniques (Part B) )、 同書 Vol . 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol . 84 (Immunochemi cal Techniques (Par t D ： Selec ted Immunoassays) )、 同書 Vo l . 92 (Immunochemical Techniques (Par t E ： Monoc lonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I ： Hybr i doma Technology and Monoc l onal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の蛋白質また はその塩を感度良く定量することができる。
本発明の抗体を用いる上記の定量法において、 被検動物の生検サンプル （例、 腎細胞、 塍細胞など） を被検体とし、 該検体中の本発明の蛋白質またはその塩の 濃度を定量することによって、 該蛋白質の発現過多または減少が検出された場合 は、 例えば、 糖尿病ゃ腎疾患などの本発明の蛋白質またはその塩が関連する疾患 に罹患している可能性が高いと診断することができる。
本発明は、 さらに、 TSC— 22抑制薬を含有してなる糖尿病または腎疾患、 好ましくは糖尿病性腎症の予防 ·治療薬に関する。
丁3(3—22抑制薬とは、 生体内において、 TS C— 22を量的および Zまた は質的に抑制し得る物質をいう。 具体的には、 丁3じ—22遺伝子の発現 （転写、 転写後調節、 翻訳、 翻訳後修飾などの各レベルをすベて包含する） を抑制するか、 あるいは TSC— 22蛋白質を不安定化もしくは活性を抑制しうる物質であれば 特に限定されず、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生 産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などのいずれであっても よい。 これらは塩を形成していてもよく、 該塩の具体例としては、 前記した本発 明の蛋白質の塩と同様のものが挙げられる。
TSC-22抑制薬は、 好ましくは、 腎臓または塍臓において、 TSC-22 の産生もしくは発現または TS C— 22の活性を抑制しうる物質である。
TSC— 22抑制薬を含有してなる糖尿病または腎疾患 （例、 糖尿病性腎症） の予防 '治療薬は、 TSC— 22の性状に応じて、 本発明の蛋白質またはその塩 が関連する疾患の予防 ·治療物質や本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの場 合と同様にして製剤化することができる。
該予防 ·治療薬は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒ ト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与することがで さる。
TSC— 22抑制薬の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより 異なるが、 例えば、 成人患者 （体重 60 kg) においては、 一日あたり約 0.1 ないし 100mg、 好ましくは約 1. 0ないし 50mg、 より好ましくは約 1. 0ないし 2 Omgである。
本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UPAC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分 野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関 し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
c DNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シ卜シン
RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグァノシン三リン酸
d CTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
V a 1 ：バリン
L e u ：ロイシン
I 1 e ：ィソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸
L y s ： リ、 ン
A r g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
P h e ：フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
p G 1 u ： ピログルタミン酸
S e c ：セレノシスティン (selenocysteine
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒ卜 TS C - 22 cDN Aの蛋白質コード領域の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト TS C— 22蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 4においてセンスプローブとして用いられた DN Aの塩基配列を示す。 以下において、 実施例により本発明をより具体的にするが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。 実施例 1 Wistar fattyラットの腎臓における TSC-22 mRNA発現の増加 ィンスリン非依存性糖尿病（NIDDM)を呈し糖尿病性腎症 (DN)を自然発症する雄 性 Wistar fattyラット （13 22及び 40週齢；武田ラビックス） と、 その正常対照 ラットである同週齢の雄性 Wistar leanラット （武田ラピックス） を用いて、 24 時間蓄尿及び尾静脈採血を行い、 尿中アルブミン排泄量、 血漿中グルコース濃度 及び血漿中インスリン濃度を測定した。 尿中アルブミン排泄量は A/G Bテストヮ コ一（和光純薬） を用いて測定し、 血漿中グルコース濃度はシンクロン CX5デル 夕（Beckman Coulter)にて測定した。 インスリン濃度は RIA法 （塩野義製薬） によ り測定した。 各 5匹のラットより腎臓を採取し- 80°Cで保存した。 試料を破砕後、 total RNAを抽出した。 既報 (Endocrinology, 134(3)： 1205-1212 (1994)) の mRNA配列をもとにプライ 及び蛍光プローブを作製し、 ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems)を用いてリアルタイム定量 RT-PCR法により各種 mRNA発現量 を測定した。 結果を表 1及び表 2に示す。
表 1
尿中アルブミン排泄量、 血漿中グルコース濃度及び血漿中ィンスリン濃度
Wistar lean ラッ卜 Wistar fatty ラット 週齢 13 22 40 13 22 40 尿中アルブミン 5.1 4.0 10.4
排泄量 （mg/day)
血漿中グルコース 138.9 137.1 134.3
濃度 （nig/dl)
血漿中インスリン 123.0 125.6 158.7
濃度 （ Units/ml)
(n=5, Mean) 表 2
Wistar fattyラットの腎臓における TSC- 22及び TGF- ]31の mRNA発現量
(各週齢の Wistar lean ラットの腎臓における発現量を 1とした時の相対値) 週齢 13 22 40
TSC-22 1.0 1.0 1.6
TGF- β 1 1.1 1.0 1.7
(n=5, Mean) Wistar fattyラットは 13週齢より NIDDMを呈し、 22週齢より DNを発症して尿中 アルブミン排泄量が増加した。 40週齢の Wistar fattyラットにおいて TSC - 22 mRNA発現量の増加が認められ、 また、 transforming growth factor- ]31 (TGF-)S 1) mRNA発現量の増加も認められており、 TSC-22 mRNAと TGF-|S 1 mRNA発現量の間 には有意な正相関 (r=0.80598, p=0.0049) が認められた。 実施例 2 Zucker fattyラットの腎臓における TSC-22 mRNA発現の変化
高インスリン血症を呈し、 腎障害を自然発症する雄性 Zucker fattyラット （ZF ラット、 18週齢、 日本チャールズリバ一） に 0.5%メチルセルロース lOOcPに懸濁 したカンデサルタンシレキセチル (angiotensin II typel受容体拮抗薬） を 9週 間、 一日一回連日経口投与した。 対照群及び正常対照群である同週齢の雄性 Zucker leanラット （ZLラット、 日本チャールズリバ一） には 0.5%メチルセル口 ース lOOcP (Vehicle) を一日一回連日経口投与した。 投与 8週後に 24時間蓄尿を 行い、 A/G Bテストヮコー （和光純薬） を用いて尿中アルブミン排泄量を測定し た。 投与 9週後に腎臓を採取し- 80°Cで保存した。 試料を破砕後、 total RNAを抽 出した。 既報 （前述） の mRNA配列をもとにプライマ一及び蛍光プローブを作製し、 ABI PRISM7700 (Applied Biosystems) を用いてリアルタイム定量 RT- PCR法によ り各種 mRNA発現量を測定した。 結果を表 3及び表 4に示す。 表 3
尿中アルブミン排泄量、 血中グルコース濃度及び血中ィンスリン濃度
ZLラッ卜 ZFラット ZFラッ卜
Vehicle Vehicle 力ンデサルタン シレキセチル 尿中アルブミン排泄】 48.5 401.5 61.7
(mg/day)
(n=8 - 9， Mean) 表 4
Zucker fattyラットの腎臓における TSC- 22及び TGF- |S 1の mRNA発現量
(Zucker leanラットの腎臓における発現量を 1とした時の相対値）
ZFラッ卜 ZFラッ卜
Vehicle カンデサルタンシレキセチル
TSC-22 2.4 1.6
TGF- β 1 2.1 1.2
(n=8-9， Mean) 尿中アルブミン排泄量が増加している Zucker fattyラットの腎臓においては TSC-22 DIRNA発現量が増加し、 TGF- i31の mRNA発現の増加も認められた。 さらに、 カンデサルタンシレキセチル投与により尿中アルブミン排泄量の増加が抑制され た場合には、 上記のいずれの mRNA発現量増加も抑制された。 実施例 3 自然発症高コレステロール血症ラットの腎臓における TSC- 22 mRNA発 現の増加
腎障害を自然発症する雄性の自然発症高コレステロール血症ラット （SHCラッ 卜、 6, 12, 20及び 26 - 30週齢、 武田ラビックス） 及び正常対照群である同週齢の 雄性 Sprague-Dawleyラット （SDラット、 日本クレア） を用いて、 24時間蓄尿及び 尾静脈採血を行い、 尿中アルブミン排泄量、 血漿中総コレステロール濃度及び血 中尿素窒素濃度を測定した。 尿中アルブミン排泄量は A/G Bテストヮコー （和光 純薬） を用いて測定し、 血漿中総コレステロール濃度及び血中尿素窒素濃度はシ ンクロン CX5デルタ (Beckman Coul ter) を用いて測定した。 腎臓を採取し- 80°C で保存した。 試料を破碎後、 total RMを抽出した。 既報の mRNA配列をもとにプ ライマー及び蛍光プローブを作製し、 ABI PRISM7700 (Appl ied Biosys tems) を 用いてリアルタイム定量 RT- PCR法により各 mRNA発現量を測定した。 結果を表 5 R び表 6に示す。 表 5
尿中アルブミン排泄量、 血漿中グルコース濃度及び血漿中インスリン濃度
SD ラッ卜 SHC ラッ卜 週齢 6 12 20 26- -30 6 12 20 26-30 尿中アルブミン 6. 1 9. 2 13. 1 16. 4
Figure imgf000064_0001
598. 3 656. 6 排泄量 （mg/day) - 血中尿素窒素 18. 9 21. 5 22. 8 21. 5 15. 7 20. 2 40. 1 85. 1 濃度 (mg/dl)
(n=4-5, Mean) 表 6
SHCラットの腎臓における TSC- 22及び TGF- 31の mRNA発現量
(各週齢の SD ラットの腎臓における発現量を 1とした時の相対値) 週齢 6 12 20 26- -30
TSC-22 1.9 3.5 6.0 12. 4
TGF- β 1 1.1 1.4 4.5 9. 0
(n=4-5, Mean; 12週齢の SHCラットにおいて既に尿中アルブミン排泄量が増加しており、 以後、 経時的に増加した。 また、 20週齢以降の SHCラットにおいて血中尿素窒素濃度も 経時的に増加した。 TSC- 22 mRNAの発現は 6週齢の SHCラットにおいては 1.9倍に増 加しており、 以後、 経時的な発現量増加が認められた。 SHCラットにおいて TSC- 22 mRNA発現量は尿中アルブミン排泄量 （r=0.67648， ρ=0·0015) 及び血中尿素窒 素濃度 （r=0.96394， ρ=0.0001) と有意な正相関を示した。 また、 TGF- i31 mRNA 発現量の増加は 12週齢以降の SHCラットにおいて認められた。 SHCラットにおける TSC-22 mRNAと TGF- β 1 mRNA発現量の間には有意な正相関 （ r=0.88356, p=0.0001) が認められた。 実施例 4 自然発症高コレステロール血症 SHCラットおよび正常 SDラットの腎臓 における TSC- 22の発現 一 in situ hybr idizat ionによる解析一
10%中性緩衝ホルマリンにより還流固定した SDラットおよび SHCラットから腎 臓を採取し、 10%中性緩衝ホルマリンによる固定後、 パラフィン包埋してブロッ クを作製した。 これを 4 ιηの厚さで薄切し、 in situ hybridization (ISH)染色 用の切片として使用した。 以下の配列をもとに T3および SP6 RNA polymerase を 用いてジゴキシゲニン （DIG) 標識 RNAプローブを作製した。 DIG標識には DIG RNA Labeling Mix (ロシュ社） を用いた。 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate- dehydrogenase) 遺伝子をポジティブコントロールとしてラット腎臓における ISH の条件を確認した後、 TSC-22ァンチセンスプローブおよびそのセンスプローブ [配列番号： 3 ； ラット TSC - 22 mRNA (GenBank Access i on番号： L25785) の 3， - 非翻訳領域の一部 （塩基番号： 61 1- 952) ] 、 抗 DIG抗体および発色基質として NBT/BCIP (ni t ro b lue t e t razo l ium/5 bromo - 4 - chl oro - 3 - indo lyl phosphate) を用いて ISHを行った。 染色後， ゲルネヒトロートにより核染色を行った。
その結果、 図 1に示すように SHCラット腎臓の近位尿細管、 薄壁尿細管、 糸球 体包の上皮細胞と足細胞、 遠位尿細管および集合管の上皮細胞にシグナルが認め られ、 正常のものより明らかに強かった。 また、 SHCラ ト腎でシグナルが強か つた尿細管は管腔が著しく拡張していた。 また、 SHCラット腎には、 炎症部位が 存在したが TSC- 22の発現シグナルは認められなかった。 なお、 センスプローブに よるシグナルは SDおよび SHCラット腎ともに認められなかつた。
以上の結果は、 TSC-22が糸球体や尿細管の上皮細胞系で高発現することと腎障 害の発症が密接に関係していることを示唆している。 産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング法によれば、 優れた効果を有し、 かつ、 副作用のない 腎疾患や糖尿病などの予防 ·治療薬をスクリーニングすることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特 徴とする、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質のスクリー二 ング方法。
2 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩が関連す る疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法。
3 . 疾患が糖尿病または腎疾患である請求項 1記載のスクリーニング方法。
4. 疾患が糖尿病性腎症である請求項 1記載のスクリ一二ング方法。
5 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を 有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、 両条件下における該蛋 白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の生産量を比較することを特徴とす る、 請求項 1記載のスクリーニング方法。
6 . (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する 能力を有する細胞、 並びに（b) 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩に対する抗体、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が結合し得る ポリヌクレオチドおよび該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と相互 作用し得る転写制御因子からなる群より選択される物質を含んでなる、 該蛋白質 またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング用キット。
7 . 被験物質の存在下および非存在下における、 配列番号： 2で表されるァミノ 酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩の活性を比較することを特徴とする、 請求項 1記載の スクリーニング方法。
8 . (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩、 並びに (b) 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が結合し得るポリヌクレ ォチドあるいは該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と相互作用し得 る転写制御因子を含んでなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治 療物質のスクリーニング用キット。
9 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩により発現が制御 される遺伝子を含有する細胞および該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩を、 被験物質の存在下および非存在下に培養し、 両条件下における該遺伝子 の発現を比較することを特徴とする、 請求項 7記載のスクリーニング方法。
1 0 . (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩により発 現が制御される遺伝子を含有する細胞、 （b) 該蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩、 並びに（c) 該遺伝子とハイストリンジェン卜な条件下でハイ ブリダィズし得るポリヌクレオチドを含んでなる、 該蛋白質またはその塩が関連 する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング用キット。
1 1 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力 を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、 両条件下における該 蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を比較することを特徴とす る、 請求項 7記載のスクリーニング方法。
1 2 . (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生す る能力を有する細胞、 並びに（b) 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩により発現が制御される遺伝子とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズし得るポリヌクレオチドを含んでなる、 該蛋白質またはその塩が関連する 疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング用キット。
1 3 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有す るポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩が関連す る疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング方法。
1 4 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴と する、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質のスクリーニング 方法。
1 5 . ポリヌクレオチドが配列番号： 1で表される塩基配列の全部または一部を 含有する請求項 1 4記載のスクリーニング方法。
1 6 . 疾患が糖尿病または腎疾患である請求項 1 4記載のスクリーニング方法。
1 7 . 疾患が糖尿病性腎症である請求項 1 4記載のスクリーニング方法。
1 8 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力 を有する細胞を被験物質の存在下およぴ非存在下に培養し、 両条件下における該 蛋白質またはその部分ペプチドをコードする mR N Aの量を比較することを特徴 とする、 請求項 1 4記載のスクリーニング方法。
1 9 . (a) 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生す る能力を有する細胞、 並びに（b) 該蛋白質またはその部分ペプチドをコードす る mR NAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得るポリヌクレ ォチドを含んでなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療物質の スクリーニング用キット。
2 0 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を 含有してなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の予防 ·治療薬。
2 1 . 疾患が糖尿病または腎疾患である請求項 2 0記載の予防 ·治療薬。
2 2 . 疾患が糖尿病性腎症である請求項 2 0記載の予防 ·治療薬。
2 3 . 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドをコードする塩基配列と相補的 な塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有してなる、 該蛋白質またはその塩が 関連する疾患の予防 ·治療薬。
24. 疾患が糖尿病または腎疾患である請求項 23記載の予防 ·治療薬。
25. 疾患が糖尿病性腎症である請求項 23記載の予防 ·治療薬。
26. 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を 含有してなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の診断薬。
27. 疾患が糖尿病または腎疾患である請求項 26記載の診断薬。
28. 疾患が糖尿病性腎症である請求項 26記載の診断薬。
29. 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有す るポリヌクレオチドを含有してなる、 該蛋白質またはその塩が関連する疾患の診 断薬。
30. 疾患が糖尿病または腎疾患である請求項 29記載の診断薬。
3 1. 疾患が糖尿病性腎症である請求項 29記載の診断薬。
32. TSC- 22抑制薬を含有してなる糖尿病または腎疾患の予防 ·治療薬。
33. 腎疾患が糖尿病性腎症である請求項 32記載の予防 ·治療薬。
34. 哺乳動物に TSC— 22抑制薬を投与することを特徴とする、 該哺乳動物 における糖尿病または腎疾患の予防または治療方法。
35. 腎疾患が糖尿病性腎症である請求項 34記載の方法。
36. 糖尿病または腎疾患の予防 ·治療薬を製造するための、 丁3( —22抑制 薬の使用。
37. 腎疾患が糖尿病性腎症である請求項 36記載の使用。
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