WO2004040309A1

WO2004040309A1 - 薬物の血漿蛋白結合における血漿蛋白質上の結合部位の測定法及び血漿蛋白質変異の測定法

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Publication number: WO2004040309A1
Application number: PCT/JP2003/013572
Authority: WO
Inventors: Keiichi Kawai; Norito Takamura
Original assignee: Nihon Medi-Physics Co., Ltd.
Priority date: 2002-10-31
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2004-05-13
Also published as: TWI330714B; US7175991B2; US20060166269A1; EP1557671B1; DE60335133D1; TW200502551A; EP1557671A1; EP1557671A4; CA2500866A1; CA2500866C; ATE489634T1; AU2003275621A1; JPWO2004040309A1; JP4236050B2

Abstract

　本発明は、血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物の血漿蛋白質結合部位と結合置換効果を簡便に測定するための測定法及びその臨床診断への応用に関する。すなわち、本発明は、血漿蛋白質との結合部位を測定すべき第一の薬物を、血漿蛋白質との結合部位が既知である第二の薬物及び血漿蛋白質と反応させ、血漿蛋白質と第二の薬物との結合による第一の薬物の遊離率の変化を測定することによって第一の薬物の血漿蛋白質との結合部位を測定する方法を提供する。

Description

明細書薬物の血漿蛋白結合における血漿蛋白質上の結合部位の測定法及び血漿蛋白質変異の測定法技術分野

本発明は、血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物の血漿蛋白質結合部位と結合置換効果を簡便に測定するための測定法及びその臨床診断への応用に関する。さらに詳しくは、本発明は、血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物の血漿蛋白質結合部位と結合置換効果の測定に際し、結合部位が既知である血漿蛋白質に結合親和性を有する単一又は複数の標識されていてもょレ、薬物を血漿蛋白質に添加し、標識されていてもよい薬物の添加による置換効果を、測定すべき薬物の遊離率に与える変化を測定することにより、当該薬物の血漿蛋白質結合部位と結合置換効果を少量の試料から同時に測定し得る測定法及びその臨床診断への応用に関する。背景技術

一般に治療、診断等を目的として投与される薬物は、一度全身血液循環を経由して吸収、分布、代謝、排泄等の過程を経る。吸収、分布の過程において薬物は血液の流れに乗って移動するが、血管内、組織間隙、細胞内のそれぞれのスぺース間の移行は、蛋白質等と結合していない状態の遊離型薬物の拡散、輸送によつて起こり、標的作用部位に到達することになる。移行が定常状態に達すると遊離型薬物の濃度は各スペース間で均一となり、全体の濃度パターンは、蛋白質等との結合の大小によって決まる。

このように生体の中では薬物はその特性に応じて一部血漿蛋白質等の生体高分子と可逆的に結合して存在している。一般に毛細血管壁或レ、は細胞 S莫等を通過できるものは非結合型の薬物であるので、有効成分として作用し得るのは血漿蛋白質等と結合していない遊離型の薬物であり、その作用部位への移行は血漿蛋白質等との結合によって大きく影響を受ける。血漿蛋白質と薬物との結合が、薬物が作用すべき病巣部位への分布や排泄に影響を与えることから、薬物の開発においては、当該薬物と血漿蛋白質との結合の有無を調べ、結合する場合にはその結合率を測定しておくことが必要である。

国際公開 00/78352号公報には、血漿蛋白質と結合親和性を有する第一の薬物を投与して、当該第一の薬物と共通の血漿蛋白質に結合親和性を有する第二の薬物を投与し、第一の薬物の血漿蛋白質への結合を制御することができる薬物の投与方法及び製剤が記載されている。すなわち、当該公報には、第一の薬物の投与と同時又はその前後に、かかる第二の薬物を投与することによって、第一の薬物の血漿蛋白質への結合を制御し、血液中の第一の製剤の遊離濃度を高めるもしくは低減できることが記载されている。

例えば、 99 m—テクネチウム標識メルカプトァセチルダリシルク、'リシルク、リシン（^99mT c— MAG₃) は、腎臓において尿細管分泌により効率的に尿中排泄されるため、腎及び尿路疾患の診断を目的として広く用いられている体内用放射性医薬品である。診断剤の濃度において、 ^{9 9m}T c—MAG i、血漿蛋白質にその約 90%が結合していることが知られている。 WO 00/78352 号公報には、 ^{9 9m}T c— MAG₃を第一の薬物とした場合、第二の薬物であるブコローム、セファゾリン、バルプロ酸等の投与により、 ^{9 9m}T c— MAG₃ と血漿蛋白質との結合が抑制され、 ^{9 9m}T c一 MAG ₃.の遊離濃度を高めることができ（置換効果）、結果として^{9 9111} T c—MAG₃がより効率的に尿中排泄されるようになることが記載されている。

また、本発明者らの特許出願、特願 2002-267010号明細書には、血漿蛋白質と結合親和性を有する有効成分を含有する製剤の投与と同時或いはその前後に、当該有効成分と共通の血漿蛋白質に高い結合親和性を有するアミノ酸を含む製剤を投与すると、結合部位において競合的置換が生じ、有効成分の遊離濃度が増加し（置換効果）、従って、有効成分含有製剤を単独で投与するよりは高い薬物活性を得ることが期待できることが記載されている。逆に、アミノ酸を含む製剤の作用により、有効成分の血漿蛋白質結合が高まる場合には、有効成分の遊離濃度が低減し（遊離濃度低減効果）、血液中における有効成分の遊離濃度が長時間にわたり低めに維持されることによるタリァランスの低下で、持続的な薬効発現を達成することが期待できることも記載されている。

ところで、上記のような第二の薬物又はアミノ酸を含む製剤による置換効果は、第一の薬物や投与される生体によって異なることが予想される。薬物が結合する代表的な血漿蛋白質にはアルブミンと酸性糖蛋白質が挙げられ、それぞれ複数個の結合部位を有していることが明らかになつている。例えば第一の薬物の結合部位と第二の薬物の結合部位が同じ場合には、第二の薬物の置換効果により第一の薬物の遊離濃度は大きく変化するが、結合部位が異なる場合にはかかる置換効果による第一の薬物の遊離濃度の変化は小さいと考えられる。このため、第二の薬物による置換効果を期待する場合には、予め第一、第二の薬物の血漿蛋白質との結合部位を調べておく必要がある。薬物が血漿蛋白質上の複数の薬物結合サイトのうちのどのサイトと結合するのかが予めわかれば、当該薬物の薬物動態の予測がより容易になるからである。

一方、血漿蛋白質として代表的なアルブミンゃ酸性糖蛋白質自体に変異等がある場合にも、上記の置換効果に大きな影響を与える可能性がある。蛋白質の結合部位に変化が生じれば薬物との結合が変化するためである。

ところが、これまで薬物と血漿蛋白質との結合部位及び結合量を測定するための簡便な方法は開発されていなかった。

薬物の置換効果を測定するには、例えば WO O 0 / 7 8 3 5 2号公報に記載されているように、放射性核種で標識した第一の薬物、及び置換用の第二の薬物を血漿と混合し、混合液全体の放射能量を測定し、また、限外濾過した後の蛋白質と結合していない薬物を含む濾液の放射能量を測定し、両者を比較すればょレ、。しかしながら、この方法では、第一の薬物、第二の薬物が変る度に第二の薬物の置換効果を測定する必要があり、このため、重篤な患者から測定用の血液を多量に採取しなければならず、加えて測定に手間や時間が掛かる等の問題があつた。発明の開示

本発明は上記に鑑みなされたものであって、血漿蛋白質との結合部位が既知である第二の薬物を用いて、血漿蛋白質との結合を測定すべき第一の薬物の遊離率の変化を測定することによって、第一の薬物の血漿蛋白質との結合部位及び結合量を測定する方法を提供することを目的とする。尚、本明細書では蛋白質と結合していなレ、遊離型薬物の存在比を遊離率と言う。

本発明はまた、少量の試料で、正常血漿蛋白質との結合部位及び結合量が既知である薬物の遊離率を測定することにより、血漿蛋白質の変異を検出する方法を提供することを目的とする。

さらに本発明は、血漿蛋白質との結合部位が既知である薬物の遊離率の変化を測定することにより、血漿蛋白質の変異体を検出する方法を提供することを目的とする。

本発明は、血漿蛋白質との結合部位を測定すべき第一の薬物を、血漿蛋白質との結合部位が既知である第二の薬物及び血漿蛋白質と反応させ、第一の薬物の血漿蛋白質への結合に対する第二の薬物添カ卩による影響、すなわち第一の薬物の遊離率の変化を測定することによって、第一の薬物の血漿蛋白質との結合部位を測定する方法を提供する。

また、本発明は、血漿蛋白質との結合部位を測定すべき第一の薬物を、血漿蛋白質との結合部位が既知である複数の第二の薬物及び血漿蛋白質と反応させ、第二の薬物と血漿蛋白質との結合による第一の薬物の遊離率の変化を測定することで、第一の薬物の血漿蛋白質との結合部位を測定する方法及びこの方法を実施するためのキットを提供する。

また、本発明は、正常血漿蛋白質との結合部位及び結合量が既知である薬物と血漿蛋白質とを反応させ、当該薬物の遊離率の変化を測定することにより、血液中の蛋白質の変異を検出する方法及びこの方法を実施するためのキットを提供する。

さらに、本発明は、血漿蛋白質との結合部位が既知である薬物と血漿蛋白質とを反応させ、当該薬物の遊離率の変化を経時的に測定することにより、血液中の蛋白質変異体を検出する方法及びこの方法を実施するためのキットを提供する。本発明の方法により、ある薬物が、血漿蛋白質上のどの結合部位にどれくらいの結合力でどれくらいの量結合するかを測定することができ、従って、多数の候補薬物群の中から所望の血漿蛋白質結合プロファイルを有する薬物を選択することが可能となる。また、本発明の方法により、健常人及び患者の血漿蛋白質上の薬物結合部位の変異を知ることができる。さらに、本発明の方法を用いれば、既存の薬物の血漿蛋白質との結合を制御する（結合を増す又は遊離率を増す）ために必要な添加剤、つまり、置換薬である第二の薬物を選び出すことができる。従って、本発明の方法により、処方される既存医薬品の体内薬物動態を改善するための添加剤を提供することが可能となり、本発明は、既存医薬品の処方の改良或いはより有効性を高める医薬品の製剤改良の検討に大きく寄与することができる。

本発明によれば、薬物の効果をコントロールするための置換薬物の選択を少量の試料で簡便に行うことができ、また、血漿蛋白質に変異がある場合にもその結合部位の異常を少量の試料で簡便に測定できることから薬物治療への貢献は大きレ、。

発明を実施するための形態

血漿蛋白質と結合性を有する第一の薬物の投与と同時或いはその前後に、共通の血漿蛋白質に高い結合性を有する第二の薬物を投与すると、結合部位において置換が生じ、第一の薬物のより高い遊離濃度を生じる（置換効果）と考えられ、第一の薬物を単独で投与するよりは高い薬物活性を得ることが期待できる。逆に第二の薬物の作用により第一の薬物の血漿蛋白質濃度が高まる場合（遊離濃度低減効果）には、血中の第一の薬物の遊離濃度が長時間にわたり低めに維持されることにより持続的な薬効発現を達成することも期待できる。

かかる血漿蛋白質と結合親和性を有する第一の薬物は、投与の目的に添った薬物であれば治療薬又は診断薬のいずれでも良い。第二の薬物は、治療又は診断目的とは関係なく先述の置換効果を得るためには第一の薬物と同じ血漿蛋白質への競合的結合親和性を有し、第一の薬物の血漿蛋白質への結合を阻害し第一の薬物の遊離量を増大させるもの、又は第一の薬物と血漿蛋白質への結合部位が共通し、かつより結合親和性の高いものから選ぶのが好ましい。逆に遊離濃度低減効果を得るためには、第二の薬物が血漿蛋白質に結合することにより第一の薬物の血漿蛋白結合が上昇するような薬物から、その効果の高いものを選ぶことにより目的を達成できる。

薬物のかかる置換効果及び遊離濃度低減効果の本態を解明した研究は見当たらないが、本発明者らによる特願 2 0 0 2 - 2 6 7 0 1 0号明細書には、薬物の組み合わせにより血漿蛋白質への薬物の結合が低下した（置換効果）又は上昇した

(遊離濃度低減効果）例が開示されている。第一の薬物と第二の薬物の組み合わせによってこのような効果を得ようとするには、本発明の方法によって、第一及び第二の薬物の血漿蛋白質との結合部位を予め求めておくことが望ましいことは明らかである。本発明の測定方法では、一の第一の薬物に対して、単一又は複数の第二の薬物を組み合わせて用いることができる。

本発明の測定法における血漿蛋白質は、ヒト由来のものであると動物由来のものであるとを問わない。薬物が結合する血漿蛋白質としては、代表的なものとして、ヒト血清アルブミン（HSA) 、ひ一酸性糖蛋白質（AGP) 、ガンマグロブリン、リポ蛋白質等が挙げられ、一般に HS Aまた AGPに結合するものが多い。

HS Aは結合部位としてサイト I、サイト I I及ぴサイト I I Iを有している。薬物によっては HSA上の結合するサイトは既に確認されている。 HSAのサイト Iに結合特異性を有する薬物として、ブコローム（5— n—ブチルー 1ーシク口へキシルー 2, 4， 6—トリオキソパーヒドロピリミジン）、セファゾリン (7- [1一 (H) ーテトラゾリルァセトアミド] —3— [2— （5—メチルー 1， 3, 4—チアゾリル）チオメチル] — 3—セフエムー 4—カルボキシラート）、フエニルブタゾン（1， 2—ジフエニル一 3， 5—ジォキソー 4一 n—ブチルビラゾリジン）、バルプロ酸（2—プロピルペンタン酸ナトリウム）、ァスピリン（2—ァセトキシ安息香酸）、サリチル酸（O—ヒドロキシ安息香酸）、セフトリアキソン ( (6 R, 7 R) -7- [2—ァミノ一 4—チアゾィル] —2 ーメトキシイミノアセトアミド）一 3— (2, 5—ジヒドロー 2—メチルー 6— ォキシドー 5—ォキソ一 1 , 2, 4一トリァジン一 3—ィルチオメチル) 一 8— ォキソ一 5—チア一 1ーァゾビシクロ [4. 2. 0] ォクト _ 2—ェン一 2—力ノレボン酸ジナトリウム) 、スルファメチゾール（N— (5—メチルー 1， 3， 4 ーチアジアゾール— 2—ィル) スルファニルアミド）、カンレノン酸（1 7—ヒドロキシ一 3—ォキソ一 1 7 α—プレダナ一 4， 6—ジェン一 21—力ノレボキシラート）、ダンシル一 Lーァスパラギン等が挙げられる。 H S Αサイト I Iに結合特異性を有するものとしてイブプロフヱン（2— （4一イソブチルフエニル）プロピオン酸) 、ナブメトン（4— (6—メトキシ一 2—ナフチル） 2ーブタノン；ナブメトンの代謝物である 6—メトキシー 2—ナフチル酢酸がサイト I I結合特異性を示す）、プロぺネシド（4一 (N, N—ジプロピルスルファモイル）安息香酸）等が挙げられる。また、 HS A上の結合部位は同定されていないが、エトポシド（（5 S， 5 a R, 8 a R, 9 S) - 9 - [ (4, 6— O— （R) — ェチリデンー i3— D—グルコピラノシル）ォキシ ] —5， 8， 8 a, 9—テトラヒドロー 5— (4—ヒドロキシ一 3， 5—ジメトキシフエニル）一イソべンゾフ口 [5， 6 - f ] [1， 3] ベンゾジォキソールー 6 (5 a H) —オン) も HS Aに結合特異性を有することが知られている。

AG Pに結合特異性を有する薬物としては、ジソピラミド（《— (2—ジイソプロピルアミノエチル) 一 α—フエ二ルー 2—ピリジンァセトアミド) 、ベラパミル（ひ一 [3— [ [2- (3, 4—ジメトキシフヱニル）ェチル] ーメチルァミノ] プロピル] — 3， 4一ジメトキシー α— （ 1ーメチルェチル）ベンゼンァセトニトリル）、プロプラノロール (1ーィソプロピルアミノ一 3— (1一ナフチルォキシ）一 2—プロパノール）、エリスロマイシン等が挙げられる。

AG Ρは結合部位として酸性薬物結合部位サイト A及び塩基性薬物結合部位サィト Bを有している。 AGPのそれぞれのサイトに結合する薬物についても既に確認されているものがある。サイト A及びサイト Bの両方に結合する薬物としてプロプラノロール、サイト Bのみに結合性を有する薬物としてはべラパミルがある。

これらの薬物は、それ自体が薬理作用を有するので、生体に及ぼす影響を考慮しながら使用されなければならない。

一方、特願 2002— 267010号明細書には、血漿蛋白質と結合親和性を有する有効成分の投与に際して、当該有効成分と共通の血漿蛋白質に結合親和性を有する単一又は複数のアミノ酸を含む製剤を、有効成分の投与と同時又はその前後に投与し、有効成分の血漿蛋白質への結合を制御することを特徴とする、血漿蛋白質に結合親和性を有する有効成分の血液中遊離濃度を制御する製剤及びその投与方法が述べられている。この単一又は複数のアミノ酸を含む製剤は、例えば、トリプトファン、ァスパラギン酸、グリシン、セリン、ロイシン、メチォ二ン、フエ二ルァラニン、トレオニン、バリン、プロリン、システィン及びァラニン又はそれらの塩並びにそれらの誘導体又はそれら誘導体の塩等から選択される。すなわち、これらのアミノ酸には、 N—ァセチルトリプトファン、ヒドロキシフェニルグリシン等のアミノ酸分子中に置換基を導入したアミノ酸誘導体及びそれらの塩も含まれる。このとき、例えば、複数の血漿蛋白質又はヒト血清アルブミンの複数の結合部位に対する有効成分の結合制御を期待する場合、相乗効果を期待する場合などでは、複数のアミノ酸が選択されることもある。また、複数のァミノ酸を用いる場合に、プロテアミン 1 2X (登録商標）及ぴキドミン（登録商標）等のアミノ酸を含む輸液を選択してもよいし、それら輸液と同等の組成または成分量を含む製剤としてもよい。有効成分の血漿蛋白質への結合を制御するため、単一又は複数のアミノ酸を用いることにより、血漿蛋白質結合を制御するための製剤そのものの生体への影響をより少なくし、かつ、現実の投与により一層適した製剤を提供することができる。

特に、トリプトファンは H S Aサイト I I及び AG Pに有効な置換薬であり、トリプトファンの誘導体である N—ァセチルトリプトファンは HS Aのサイト I Iに有効な置換薬である一方、 AG Pには遊離濃度低減効果を示す。ァスパラギン酸は AG Pに置換効果を示し、グリシンの誘導体であるヒドロキシフエニルダリシンは HS Aサイト I I及ぴ AG Pに対して遊離濃度低減効果を示す。これに対して、プロテアミン 12 Xのようにアミノ酸の混合物であるアミノ酸輸液は H SAのサイト I I及ぴ AG Pのいずれの結合部位にも置換効果を示し、汎用置換薬として利用できる可能性がある。

本発明の測定法における第一の薬物又は第二の薬物は、標識物質により標識されていることを必ずしも必要とするものではないが、これらの薬物を放射性核種、蛍光性物質、色素等の種々の標識物質で標識すれば置換効果の測定が容易になる。標識として使用される放射性核種としては、 3—水素（³H) 、 1 1一炭素

(^{X 1}C) 、 14—炭素（¹⁴C) 、 15—酸素（^{1 5}0) 、 1 8—フッ素

(^{1 8}F) 、 32—リン（³²P) 、 59—鉄（⁵⁹F e) 、 67 _ί同

(⁶⁷Cu) 、 67—ガリウム（^{6 7}Ga) 、 81m—クリプトン（^81mKr) 、 8 1—ルビジウム（^{8 1}Rb) 、 89—ストロンチム（^{8 9} S r) 、 90—イツトリウム (⁹⁰Ύ) 、 99m—テクネチウム (^99mT c) 、 1 1 1一インジウム 1¹ I η) , 1 23—ョード（^{1 23} 1) 、 1 25—ョード（^{1 25} I ) 、 1 31—ョード（^{1 3 1} I) 、 1 33—キセノン（^l Xe) 、 1 17mスズ

(^{1 1 7m}Sn) 、 1 53—サマリウム

、 186—レニウム

(^{1 86}R e) 、 1 88—レニウム（^{1 8}°Re) 、 201—タリウム

(²⁰¹ T 1 ) 、 21 2—ビスマス（²¹ Β ί) 、 21 3—ビスマス

(^{21 3}B i) 及び 21 1一アスタチン（^{21 1}At) 等が例示され、診断用としては 18—フッ素（^{1 8}F) 、 99m—テクネチウム（^99mTc) 、 67—ガリゥム（^{D 7}Ga) 、 1 1 1一インジウム ¹ 丄 I n) 、 1 23—ョード

1²³ I ) 、 1 31—ョード ³¹ I )等が用いられることが多い。その他、トレーサー実験で汎用される核種である、 1 3—窒素（^{1 3}N) 、 22—ナトリゥム（²²Na) 、 35—硫黄（^{3 b}S) 、 40—カリウム（⁴⁰K) 、 45—力ルシゥム（⁴⁵C a) 等で標識することもできる。また、 2—水素（²H) 等の放射性核種以外の同位体を利用すれば、質量分析計による測定も可能である。放射性核種以外を利用した標識としては、フルォレセイン（3' , 6' ージヒドロキシスピロ [イソべンゾフラニル ( 3 H) ， 9，一 [9H] キサンセン] 3—ォン）、フルォレセィンィソチオシァネート、フノレオレサミン (4一フエニルスピ口 [フラン一 2 (3H) ， 1，一（3， H) 一イソべンゾフラン] 3， 3，ージオン）等の蛍光性物質や色素も使用可能である。

また、本発明の測定法において、複数の第二の薬物を用いる際には、当該第二の薬物を各々同一又は異なる標識物質で標識することができる。異なる標識物質で標識すれば分離測定がより容易となるが、標識物質が同一であっても同時分離測定が可能であるため標識物質の種類は問わない。

むろん、本発明の方法における第一の薬物又は第二の薬物は、標識物質で標識していなくても同時分離測定が可能である。例えば、第一の薬物、第二の薬物及ぴ血漿蛋白質の混合溶液のままでも、高速液体クロマトグラフィー（HPLC) による分画測定を行うことができる。

本発明の方法に基づき、正常血漿蛋白質との結合部位及び結合量が既知である薬物と血漿蛋白質とを反応させ、当該薬物の遊離率の変化を測定することにより、血漿蛋白質の変異の程度を測定することができる。また、血漿蛋白質との結合部位が既知である薬物と血漿蛋白質とを反応させ、当該薬物の遊離率の変化を測定することにより、血漿蛋白質変異体を検出することができる。反応させる血漿蛋白質は、血液中、血漿中又は血清中のいずれに存在するものでもよい。

では、第一の薬物の血漿蛋白質結合部位を測定する方法について、実施例 1を参照しながら説明する。まず、第一の薬物として、例えばヮルフアリン（^{1 4}c -WRF) を健常成人から分離した血清 1に添加し、これにコントロールとして生理食塩水を添加した時点での遊離率（表 1では 0. 96) を求めておく。なお、この場合、ヮルフアリンの結合部位は実験前には不明とする。次に、ヮルファリンと血清 1の混合液を 4つに分け、それぞれに第二の薬物として、 HSAサイト Iに結合するブコローム（BCL) 、 HSAのサイト I Iに結合するイブプロフェン（ I PF) 、 AG Pのサイト A及びサイト Bに結合するプロプラノロール (PPL) 、 AG Pの主にサイト Bに結合するべラパミル（VPM) を添加し、各々の遊離率を測定する（表 1では、順に、 2. 83、 0. 97、 1. 00、 1. 06である）。生理食塩水を添加したときのコント口ール遊離率とこれらを比較すると、 BCLを添加した場合のみ遊離率が高く、 I PF、 PPL、 VPMを添加した場合の変化は僅かである。ここで、 BCLは HS Aのサイト Iに結合部位を有することから、ヮルファリンもサイト Iに結合する薬物であることが分かる。なお、表 1は健常成人男性の血清を用いた結果であるが、ヒトプール血清を用いた表 3でもコントロールの遊離率は同様の結果が得られている。

第一の薬物をジァゼパム（¹⁴C— DZP) とした場合も、同様に表 1に示すように、 HSAのサイト I Iに結合部位を有する I PFの遊離率のみがコント口ールに比べて 1. 7倍になっていることから、ジァゼパムが HS Aのサイト I I に結合性を有する薬物であることが測定される。

ここでは、第一の薬物の結合する部位を測定する場合を説明したが、その逆も当然に可能である。すなわち、ヮノレファリンの結合部位が HS Aサイト Iであることが既知とすると、 ¹⁴ C標識ヮルフアリンを第二の薬物とし、第一の薬物を BCL、 I PF、 P P L又は VPMとした場合には、これら第一の薬物の中で H SAサイト Iと結合する第一の薬物が BCLであることが判断できる。

本発明の方法は、標識された第一の薬物に対して、結合部位ごとに遊離率を測定することができるが、同時測定可能な複数の標識された第二の薬物を使用すれば、一回の操作で第一の薬物がどのサイトに結合する薬物であるかを判定することができる。これを、実施例 2を参照しながら説明する。

実施例 2では、 4核種同時測定による薬物の血漿蛋白質結合部位の簡便測定法の検討を行っている。血漿蛋白質との結合部位の不明な第一の薬物として、プコローム（BCL) 、イブプロフェン（I PF) 、プロプラノロール（PPL) 、ベラパミル（VPM) 、第二の薬物としてヒト血清アルブミン（HSA) のサイト Iに結合する過テクネチウム酸（^99mT c〇₄一）、 1"13 のサィト 1 Iに結合するジァゼパム（¹⁴C— DZP) 、ひ一酸性糖蛋白質（AGP) のサイト A及ぴサイト Bに結合するプロプラノロール（³H—PPL) 並びに HSAのサイト I Iと AG Pの両方に結合する ^{1 25} I— I MPを用いている。まず、正常ヒト血清に上記の第二の薬物のすべてを同時に添加し、生理食塩水を加えた時点での、各放射能を測定しコントロールの遊離率とした。ついで、第一の薬物例えばイブプロフェンを添加し、遊離率を測定したところ、表 4に示すように、コントロールの遊離率と比べて著しく変化したのは、 HSAのサイト I Iに結合する丄 ⁴C— DZ Pの遊離率であった。これより、イブプロフェンの結合部位は、 D Z Pと同じ H S Aサイト I Iであることが測定できた。実施例 1と異なる点は、 4つの異なる標識物質で標識した第二の薬物を用いているため、 1回の操作で測定ができることにある。

ここまでは、血液試料が正常な場合を例に挙げて説明したが、患者の血液の中には、健常人とは異なる血漿蛋白質との結合を示す場合がある。このため、薬物の投与前に患者の血漿蛋白質の結合部位に変異があるかどうかを把握しておくことが望ましい。このような場合にも、本発明の方法は適用が可能である。すなわち、薬物と正常血漿蛋白質との遊離率を予め測定しておき、当該薬物と患者血液中に存在する血漿蛋白質とを反応させ、当該薬物の遊離率を測定して比較すればよい。薬物には実施例 2と同様に異なる放射性核種を標識しておけば、血漿蛋白質の複数の結合部位のどの部位に変異が生じているかを一回の測定で知ることができる。以下、実施例 3、 4を例にあげて説明する。

実施例 3では正常男子血清を用いてァミノ酸及びァミノ酸輸液の血漿蛋白質結合部位及び置換効果を測定した。表 5には、正常男子血清に生理食塩水を添加し、ヒト血清アルブミン（HSA) のサイト Iに結合する過テクネチウム酸

(99m_{T c} o₄ -) 、 HSAのサイト I Iに結合するジァゼパム（¹⁴C一 DZ P) 、ひ ]_一酸性糖蛋白質（AGP) のサイト A及ぴサイト Bに結合するプロプラノロール（³H—P PL) 並びに HSAのサイト I Iと AG Pの両方に結合する^{12 5} I— I MPを添加したときの遊離率がコントロール遊離率として示されており、それぞれ 21. 07、 1. 50、 9. 00、 23. 40であった。

これに対して、実施例 4では、変異があるとされるヒト血清 2に生理食塩水を添加し、これらの標識薬物を添カ卩したときのコントロール遊離率が測定されている。表 7には、表 5と同順で遊離率が示され、コントロール遊離率は、それぞれ 21. 08、 1. 80、 21. 40、 27. 23であった。両者を比較すると、プロプラノロール（PPL) の遊離率のみが 2. 3倍以上異なっていることが分かる。 P P Lは AG Pのサイト A及びサイト Bの結合する薬物であるから、血清 2は AGPの結合サイト A及びサイト Bに変異を有する血清であると考えられる。また、この方法を経時的に実施すれば、同一患者における血漿蛋白質の変異を測定することも可能である。

以上、本発明の測定方法を示したがこれらの測定方法を実施するためのキットも提供可能である。

第一の薬物の血漿蛋白質との結合部位を測定する場合には、血漿蛋白質との結合部位が既知である複数の第二の薬物及ぴ正常コント口ール血清を含有するキットとする。このキットは、必要に応じて、さらに限外濾過可能な装置を有している 1のキットとして構成することができる。限外濾過可能な装置としては、例えば、血漿分離可能な孔径を有する膜を底部に備えた容器と、分離のために必要な圧力を加えることができる加圧装置の組み合わせが考えられる。この容器に血漿を入れ、圧力を加えると、容器の底部より血漿蛋白質を除いた液体成分が分離できるので、血漿部分の放射能と、血漿蛋白質を除いた濾液部分の放射能を分離して測定することができる。

血漿中の蛋白質の変異の程度を測定する場合には、正常血漿蛋白質との結合部位及ぴ結合量が既知の薬物及び正常コントロール血清を有するキットとする。このキットも同様に必要に応じて、さらに限外濾過可能な装置を有している 1のキットとして構成することができる。測定すべき血漿蛋白質を正常血漿蛋白質との結合部位及び結合量が既知の薬物と反応させ、血漿蛋白質と当該薬物との結合の程度を測定し、薬物の正常血漿蛋白質との結合部位及び結合量を比較すれば、当該血漿蛋白質結合部位の変異の有無を測定することができる。

実施例

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1 2核種同時測定による薬物の血漿蛋白質結合部位の簡便測定法の検討ヒト血清アルブミン（HSA) のサイト Iに結合するヮルファリン（実験には ^{1 4} C標識体： ¹⁴ C一 WRFを使用）、 H S Aのサイト I Iに結合するジァゼバム（実験には¹⁴ C標識体： ^{1 4} C一 D Z Pを使用）、ひ丄一酸性糖蛋白質（A GP) の酸性薬物結合部位（サイト A) 及び塩基性薬物結合部位（サイト B) に結合するプロプラノロール（実験には³ H標識体： ³H— P P Lを使用）並びに AG Pの主にサイト Bに結合するべラパミル（実験には °H標識体： ³H— VP Mを使用）を用い、特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物の添加による上記各標識薬物の置換効果を検討した。特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物には、 HS Aのサイト 1に結合するブコローム（B CL) 、 113 のサィト 1 Iに結合するイブプロフェン（ I P F) 、 AG Pのサイト A及びサイト Bの両方に結合するプロプラノロール（P P L) 並びに AG Pの主にサイト Bに結合するベラパミル（VPM) (各試験濃度： 4 0 0 μΜ) を検討に用いた。

健常成人男性の血液から分離した血清（ヒト血清 1 : HSA= 5. 0 7 g/d L, AG P= 7 2. Omg/d L) 及ぴ市販のヒトプール血清（コスモバイオ製 L o t . N o . 1 3 7 6 8 : HS A=4. 40 g/d L, AGP= 7 9. l mg /d L) の Ή S A濃度を 5 0 0 μ Mになるように lZl 5Mリン酸緩衝液（ p H = 7. 4) で希釈した。この血清溶液 5 0 0 μ Lに特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物を 2 0 μ L添加した。この時、各薬物は生理食塩水で溶解し、試験濃度となるように血清溶液に添加した。コント口ール溶液としては、上記血清溶液に薬物の溶液の代わりに生理食塩水を 2 0 μ L添加したものを用いた。その後、 ¹⁴ C-WRF (3. 7 X l O^{_ 1} k B q/5 t L) 及び³ H— VPM (9. 25 X 1 0^{- 1} kB q/5 L) の混合溶液、又は^{1 4}C— DZP (3. 7 X 1 0^_1 k B q/5 ^ L) 及び³ H— P P L (9. 25 X 10 ^{_ i} kB q/5 μ L) の混合溶液を 2核種同時に添加し試験溶液とした。

コント口ール溶液及び各試験溶液より各 20 μ Lを採取し、限外濾過前のサンプルとした。次にコント口ール溶液及び各試験溶液より各 450 ^ Lを限外濾過器（トーソー製 U 1 t r a c e n t 10) に採取し，遠心分離機（TOMY製R LX— 1 35) で 3000 r pm、 10分間遠心分離することにより限外濾過を行った。遠心操作後それぞれ 20 μ Lの濾液を採取し、限外濾過後のサンプルとした。限外濾過前後のそれぞれのサンプルに液体シンチレーター（アマシャム製 AC S I I ) を加えて、液体シンチレーシヨンカウンタ（ァロカ製 LSC—51 00) で¹⁴ C及び³ Hの放射能（c pm) を分離測定し、下記式により各試験溶液の遊離率（％) 並びに特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物添加による遊離率の変化率を求めた。

遊離率（％) = {限外濾過後の放射能（c pm) Z限外濾過前の放射能（c p m) } X 1 00

変化率（倍） =試験溶液の遊離率（％) Zコントロール溶液の遊離率（％) ヒト血清 1を用いた場合の結果を表 1及ぴ表 2に、ヒトプール血清の結果を表 3に示す。なおコントロール及ぴ各試験濃度の遊離率は n = 3の平均値である。表 1に示したヒト血清 1において、 HSAのサイト Iに結合する BCLを添カロすることにより、 I- I S Aのサイト Iに結合することが知られている ^{1 4} C— WR Fのみが顕著な置換効果を示した。同様に、 HS Aのサイト I Iに結合する I P

Fの添加では、 HSAのサイト I Iに結合する^{1 4} C一 DZ Pのみが顕著に置換された。一方、 AG Pに結合親和性を有する P P L及ぴ VPMの添加において、それぞれの³ H標識体： ³H— P P L及び³ H— VPMは共に高い置換効果を示したが、 AG P上の結合部位への親和性の相違によって、それぞれが対応する結合部位（³H— P P Lでは AGPのサイト A及びサイト B ； ³H_VPMでは A GPサイト B) への置換効果が相対的に高くなつた。よって、本 2核種同時測定法では、添加した薬物の血漿蛋白質結合部位に対応する標識体の置換効果から、当該薬物の血漿蛋白質結合部位を簡便に決定し得ることが確認された。さらに、本法を用いることにより、 2つの結合部位に関する置換効果を異なる 2核種の放射線を分離測定することで、同一試験血清から同時に測定可能であることから、従来より少量の血清による測定が可能となった。

表 2では、表 1と同じ血清による追試験の結果を示したが、ほぼ完璧な再現性が得られ、本測定法の高い精度と信頼性が明らかとなった。

さらに、ヒトプール血清を用いた場合（表 3 ) においても、置換効果の程度は異なるものの、血漿蛋白質結合部位に関する対応はヒト血清 1と同様の結果が得られたことから、血漿蛋白質の組成が異なる血清においても、汎用的に本法が応用できることが確かめられた。

表 1 各標識薬物の血漿蛋白結合に対する結合部位特異的薬物の置換効果：ヒト血清 1

表 2 各標識薬物の血漿蛋白結合に対する結合部位特異的薬物の置換効果

実施例 2 4核種同時測定による薬物の血漿蛋白質結合部位の簡便測定法の検討ヒト血清アルブミン（HSA) のサイト Iに結合する過テクネチウム酸

9 9m

( T c O ―) 、 113 のサィト 1 Iに結合するジァゼパム（実験には 1⁴C標識体： ¹⁴ C— DZ Pを使用）、《1—酸性糖蛋白質（AG.P) のサイト A及びサイト Bに結合するプロブラノロール（実験には ³ H標識体： ³ H— P P Lを使用）並びに HS Aのサイト I Iと AG Pの両方に結合する ¹ " I一 I M Pを用い、特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物の添加による上記各標識薬物の置換効果を検討した。特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物には、実施例 1と同様に HS Aのサイト Iに結合するブコローム（B C L) HSAのサイト I Iに結合するイブプロフェン（I P F) AG Pのサイト A及びサイト Bの両方に結合するプロプラノロール（P P L) 並びに AG Pの主にサイト Bに結合するべラパミル（VPM) (各試験濃度： 40 0 //M) を検討に用いた。本実験では、健常成人男性の血液から分離した血清（ヒト血清 1 HS A= 5. 0 7 g/d L, AGP= 7 2. Omg/d L) の H S A濃度を 5 0 0 μ Mになるように 1Z1 5Mリン酸緩衝液 (pH= 7. 4) で希釈した。この血清溶液 50

0 μ Lに ^mT c 0₄_ (9. 2 5 X 1 0一² k B qZ5 μ L) C一 D Z P (3. 7 X 1 0^{_ 1} k B q/5 μ L) ³H - P P L (9. 2 5 X l O^{_ 1} k B q/5 μ L) 及び 1 ^{2 5} I - I MP (1. 8 5 X 1 0— ¹ k B q/5 μ L) の混合溶液を 4核種同時に添加し、限外濾過前後のサンプリング液量は 5 μ Lとした。なお、実施例 1と同様にコントロール溶液としては、薬物の溶液の代わりに生理食塩水を添加したものを用いた。また、試験溶液には上記 4核種が含まれるので液体シンチレーシヨンカウンタ (ァロカ製 L S C - 5 1 0 0 ) に加え、オートゥエルガンマカウンタ（ァロカ製 ARC— 3 8 0) も使用し、 ^{9 9m}T cと^{12 5} 1 を Ύ線のエネルギー設定を利用して分離測定すると共に、それらの計数率から求めた ³ H及び ¹⁴ Cに対する γ線による影響を補正したうえで、 B C L I P F P P L及ぴ V ΡΜ添加後の遊離率と変化率を求めた。結果を表 4に示す。

表 4に示した通り、ヒト血清 1において、 HSAのサイト Iに結合する B C L を添加することにより、 HSAのサイト Iに結合することが知られている ^99m T c〇₄一のみが有意な置換効果を示した。同様に、 HSAのサイト I Iに結合する I P Fの添加では、 HSAのサイト I Iに結合する ¹⁴ C D Z P及ぴ^{1 25}

1一 I MPに置換効果が認められた。一方、 AG Pに結合親和性を有する P P L 及ぴ VPMの添加において、同じ結合部位を示す³ H— P P L及ぴ¹ " I一 I MPは共に高い置換効果を示した。よって、本 4核種同時測定法でも、添加した薬物の血漿蛋白質結合部位に対応する標識体の置換効果から、当該薬物の血漿蛋白質結合部位をより簡便に決定し得ることが確認された。本法では、同一試験血清から、異なる 4核種の放射線の分離測定と補正により、 4つの結合部位に関する置換効果を同時に測定可能であることから、僅か 5 0 0 μ Lの希釈血清により主要な薬物結合部位の測定が可能となった。さらに、同様の原理に基づき、分離測定と補正の可能な他の標識体を同時に用いることで、同一試験血清からより多くの血漿蛋白結合に関する情報を得ることが可能となった。

表 4 各標識薬物の血漿蛋白結合に対する結合部位特異的薬物の置換効果：ヒト血清 1

実施例 3 多核種同時測定による薬物の血漿蛋白質結合部位と置換効果の検討実施例 1に示した 2核種同時測定及び実施例 2に示した 4核種同時測定による簡易測定法を用いて、 WO O 0Z7 8 3 5 2号公報で挙げられている第一の薬物と共通の血漿蛋白質に結合親和性を有する第二の薬物の候補薬物に考えられるェリスロマイシン（ETM) 、特願 2 0 0 2 - 2 6 7 0 1 0号で挙げられているァミノ酸及びアミノ酸輸液（以下、置換薬物）に関して、それらの血漿蛋白質結合部位と置換効果を検討した。アミノ酸としては、トリブトファン（T r p) 、 N ーァセチルトリプトフアン (NAT) 、ァラニン (A 1 a ) 、ァスパラギン酸 (A s p) 及ぴヒドロキシフユニルダリシン（HPG) (各試験濃度： 40 0 μ Μ) を、アミノ酸輸液にはプロテアミン 1 2 X (ΡΤΑ) (試験濃度： 1Ζ1 0 0) を血清溶液に添カ卩した。

血清には、健常成人男性の血液から分離した血清（ヒト血清 1 ： HSA=5. 07 g/d L, AGP= 72. Omg/d L) 及び市販のヒトプール血清（コスモパイォ製 L o t - No. 13768 ： HS A=4. 40 g/d L, AGP= 7 9. 1 mgZd L) の HS A濃度を 500 μΜになるように 1ノ1 5Mリン酸緩衝液 (ρΗ= 7. 4) で希釈して用いた。コント口ール溶液としては、置換薬物の溶液の代わりに生理食塩水を添加したものを用いた。ヒト血清 1を用いた場合の結果を表 5に、ヒトプール血清の結果を表 6に示す。

抗生物質である Ε ΤΜは、安全に投与できる置換薬物として有力な候補薬物であるが、本測定法の結果（表 6) より AG Ρに結合親和性を示す薬物に対して有効な置換薬物であることが確認された。

ァミノ酸及ぴァミノ酸輸液に関しては、 T r pは H S Aのサイト Iに親和性を有する薬物には有意な置換効果は認められないものの、 HSAのサイト I I又は

AGPに親和性を有する薬物に対しては有効な置換薬物であることが明らかになつた（表 5) 。また、 HSAのサイト I I及び AG P両者に親和性を有する薬物に対しても有効な置換薬物として働くことが確認された（表 5) 。一方、 T r p の誘導体である NATは HSAのサイト I Iに親和性を有する薬物に対して有効な置換薬物であるが、 AG Pに親和性を有する薬物に対しては若干遊離濃度を低減させる効果を示した。 A s pは HSAのサイト I、サイト I Iに親和性を有する薬物に対しては有意な置換効果を示さないが、 AG Pに親和性を有する薬物に対しては有効な置換薬物であり、トータルで HSAのサイト I I及び AGP両者に親和性を有する薬物に対しても有効な置換薬物として働くことが明らかになつた。さらに、グリシンの誘導体である HPGは HS Aのサイト I I又は AGPに親和性を有 "る薬物に対して遊離濃度低減効果を示した。以上のように個々のァミノ酸はそれぞれ結合位置特異性を持つ置換薬物として作用することが明らかとなったが、 PTAの例（表 5) で示されたようにアミノ酸の混合物であるアミノ酸輸液は HS Aのサイト I、サイト I I、 AG Pいずれにも置換効果を示し、汎用置換薬物として利用できる可能性が示された。表 5 ヒト血清 1における各置換薬物の血漿蛋白質結合部位と置換効果

4核種同時測定

表 6 ヒトプール血清における各置換薬物の血漿蛋白質結合部位と置換効果

2核種同時測定

実施例 4 多核種同時測定による血漿蛋白質変異体診断への応用と変異体血清における薬物の血漿蛋白結合のモニタリング

実施例 2に示した 4核種同時測定による簡易測定法を用いて、特定の血漿蛋白質が変異体である血清の鑑別診断へ応用した。また、当該血清における薬物の蛋白結合置換効果のモニタリングへの可能性を検討した。血清には、 AGPが変異体である成人男性の血液から分離した血清（ヒト血清 2 ： HSA=4. 88 g/d L, AGP= 38. Omg/d L) の HSA濃度を 500 になるように 1/1 5Mリン酸緩衝液 (pH= 7. 4) で希釈して用いた。

特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物には、実施例 2同様に HS Aのサイト Iに結合するブコローム（BCL) 、 HS Aのサイト I Iに結合するイブプ口フェン（I PF) 、 AG Pのサイト A及びサイト Bの両方に結合するプロプラノロール（PP L) 並びに AG Pの主にサイト Bに結合するべラパミル（VP M) (各試験濃度： 400 / M) を用い、 AG Ρの変異に関する鑑別診断への応用性を検討した。コントロール溶液としては、薬物の溶液の代わりに生理食塩水を添加したものを用いた。結果を表 7に示す。

一方、実施例 3で選択した置換薬物として、アミノ酸としては、トリプトファン（T r p) 、ァラニン（A l a) 及びァスパラギン酸（A s p) (各試験濃度： 400μΜ) を、アミノ酸輸液にはプロテアミン 12Χ (ΡΤΑ) (試験濃度： 1Ζ100) を血清溶液に添カ卩し、それらの血漿蛋白質結合部位と置換効果をモニタリングした。その結果を表 8に示す。

ヒト血清 2は薬物の血漿蛋白結合性から A G Pが変異体であると考えられている血清である。表 7においても、 AGPに結合親和性を有する P P L及び VPM の添加において、同じ結合部位を有する " H— P P Lの置換効果は実施例 2で示した他の血清に比して低く、 ¹ I— I MPに対する置換効果も僅かであった。一方、《[3 のサィト 1に結合する8じしの添加にょり、 HS Aのサイト ] [に結合する 99m_{T c}o₄—が有意な置換効果を示した。また、 HSAのサイト I Iに結合する I P Fの添カ卩では、 113 のサィト 1 Iに結合する¹⁴ C一 DZPに対して置換効果が認められたが、 ⁵ I— I MPには、逆に結合促進としての作用、すなわち遊離濃度低減効果を示した。また、これらの HS Aに結合親和性を有する BCL及び I PFの添加において、 AG Pに結合を示す³ H_P PL及び ^{1 25} I— I MPとの結合が増加した。このように、本多核種同時測定法を臨床に応用することにより、特定の血漿蛋白質に結合親和性を有する薬物添加による置換効果の差から、当該血清に含まれる血漿蛋白質の変異の有無を簡便に診断し得ることが示された。本法では、僅か 500 μ Lの希釈血清により主要な薬物結合部位の測定が可能であること力ゝら、患者血清を用いる診断法として有用であることが明らかとなった。

さらに、このような血漿蛋白質が変異している場合、通常の投薬によっても、重篤な副作用を示す可能性が高い。加えて、 WO 00/78 3 52号公報で挙げられている第一の薬物と共通の血漿蛋白質に結合親和性を有する第二の薬物や、特願 2002-26 70 1◦号明細書で挙げられているアミノ酸及びアミノ酸輸液等の置換薬物の併用に際しては、個々の血清における置換効果をモニタリングすることが重要となる。表 8は、表 7に示したヒト血清 2を用いたモニタリングの結果である。実施例 3の結果と比較しても、全く異なった置換効果を示している力本法が僅か 50 0 μ Lの希釈血清により全ての主要な薬物結合について同時に測定し得ることから、個々の患者血清によるモニタリングへの応用を可能にするものである。

表 7 4核種同時測定による各標識薬物の血漿蛋白結合に対する置換効果：ヒト血清 2

表 8 4核種同時 2 j定による各置換薬物の血漿蛋白質結合部位と置換効果ヒト血清 2

Claims

請求の範囲

I . 血漿蛋白質との結合部位を測定すべき第一の薬物を、血漿蛋白質との結合部位が既知である第二の薬物及び血漿蛋白質と反応させ、血漿蛋白質と第二の薬物との結合による第一の薬物の遊離率の変化を測定することによって第一の薬物の血漿蛋白質との結合部位を測定する方法。

2 . 血漿蛋白質がヒト又は動物由来のものである請求項 1に記載の測定法。

3 . 第一の薬物が放射性核種、蛍光性物質又は色素によって標識されている請求項 1に記載の測定法。

4 . 血漿蛋白質が血清アルブミン又は酸性糖蛋白質であり、第一の薬物が放射性核種によって標識されている請求項 1から 3のいずれか 1項に記載の測定法。

5 . 血漿蛋白質との結合部位を測定すべき第一の薬物を、血漿蛋白質との結合部位が既知である複数の第二の薬物及び血漿蛋白質と反応させ、血漿蛋白質と第二の薬物との結合による第一の薬物の遊離率の変化を測定することによって第一の薬物の血漿蛋白質との結合部位を測定する方法。

6 . 血漿蛋白質がヒト又は動物由来のものである請求項 5に記載の測定法。

7 . 第一の薬物が放射性核種、蛍光性物質又は色素によって標識されている請求項 5に記載の測定法。

8 . 血漿蛋白質が血清アルブミン又は酸性糖蛋白質であり、複数の第二の薬物が、これら血漿蛋白質の異なる結合サイトと結合している請求項 5から 7のいずれか 1項に記載の測定法。

9 . 複数の第二の薬物が、各々同一又は異なる物質で標識されている請求項 7に記載の測定法。

1 0 . 複数の第二の薬物が、各々異なる放射性核種で標識されており、当該異なる放射性核種が、同時に分離測定可能である請求項 9に記載の測定法。

I I . 正常血漿蛋白質との結合部位及び結合量が既知である薬物と血漿蛋白質を反応させ、当該薬物の遊離率を測定することにより、血漿蛋白質の変異を検出する方法。

1 2 . 血漿蛋白質がヒト又は動物由来のものである請求項 1 1に記載の検出法。

1 3 . 当該薬物が放射性核種、蛍光性物質又は色素によって標識されている請求項 1 1に記載の検出法。

1 4 . 当該薬物が複数種であり、各々同一又は異なる物質で標識されている請求項 1 3に記載の検出法。

1 5 . 血漿蛋白質が血清アルブミン又は酸性糖蛋白質であり、当該複数種の薬物が、これら血漿蛋白質の異なる結合サイトと結合している請求項 1 4に記載の検出法。

1 6 . 当該複数種の薬物が各々同一又は異なる放射性核種で標識されており、当該異なる放射性核種が同時に分離測定可能である請求項 1 5に記載の検出法。

1 7 . 血漿蛋白質との結合部位が既知である薬物と血漿蛋白質とを反応させ、当該薬物の遊離率の変化を測定することにより、血漿蛋白質変異体を検出する請求項 1 5又は 1 6に記載の検出法。

1 8 . 血漿蛋白質との結合部位が既知である複数の第二の薬物及び正常コントロール血清を含有する請求項 5から 1 0のいずれか 1項に記載の方法を実施するためのキット。

1 9 . 正常血漿蛋白質との結合部位及び結合量が既知である薬物、並びに正常コントロール血清を含有する請求項 1 1から 1 7のいずれか 1項に記載の方法を実施するためのキット。

2 0 . 当該キットがさらに限外濾過装置を有している請求項 1 8又は 1 9に記載のキット。