ES2931310T3 - Métodos para analizar composiciones de cisteamina - Google Patents

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Abstract

Se describen métodos para analizar la pureza de las composiciones que comprenden cisteamina y detectar impurezas en las composiciones de cisteamina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para analizar composiciones de cisteamina
La presente invención reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/835.987 presentada el 17 de junio de 2013.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere de manera general a métodos para analizar la pureza de composiciones que comprenden cisteamina y detectar impurezas en composiciones de cisteamina.
ANTECEDENTES
La cisteamina (HS-CH2-CH2-NH2) es capaz de atravesar fácilmente las membranas celulares debido a su pequeño tamaño. En la actualidad, la cisteamina está aprobada por la FDA para el tratamiento de la cistinosis, un trastorno de almacenamiento de cistina intralisosomal. En la cistinosis, la cisteamina actúa convirtiendo la cistina en cisteína y disulfuro mixto de cisteína-cisteamina, que luego pueden abandonar el lisosoma a través de los transportadores de cisteína y lisina respectivamente (Gahl et al., N Engl J Med 2002;347(2): 111-21). Se ha demostrado que el tratamiento con cisteamina da como resultado una disminución de los niveles de cistina intracelular en los leucocitos circulantes (Dohil et al., J. Pediatr 148(6):764-9, 2006).
Las impurezas pueden estar presentes en las formulaciones de cisteamina debido a la formación de subproductos durante el proceso de fabricación y/o debido a la modificación (por ejemplo, degradación) durante el almacenamiento del producto farmacéutico. La determinación precisa y completa de la pureza de las formulaciones que contienen cisteamina es importante para asegurar la aprobación de comercialización del producto farmacéutico y para demostrar que el producto farmacéutico tiene niveles de impurezas aceptables para la administración humana en el momento de la liberación y que tiene una estabilidad de almacenamiento aceptable. Se ha demostrado que el análisis de la pureza de las formulaciones que contienen cisteamina usando un método de HPLC con un sistema de detección electroquímico no tiene la sensibilidad requerida para detectar ciertas impurezas que se encuentran en las formulaciones de cisteamina. Brian D Soriano et al, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences & Applications, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 880, 7 de noviembre de 2011 (2011-11-07, páginas 27-33) describe un ensayo de HPLC basado en fluorescencia para la cuantificación de aductos de cisteína y cisteamina en proteínas derivadas de Escherichia coli.
La presente invención proporciona métodos mejorados para analizar la pureza de composiciones que comprenden cisteamina y detectar impurezas en composiciones de cisteamina.
SUMARIO
La invención se refiere a un método para analizar la pureza de composiciones que comprenden cisteamina de acuerdo con la reivindicación 1 o 12 y las reivindicaciones dependientes de las mismas. El método comprende inyectar una solución de muestra que comprende cisteamina en una columna de HPLC de fase inversa; eluir la muestra de la columna usando una fase móvil que comprende un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1-octanosulfónico), un tampón, acetonitrilo y metanol; y medir la muestra eluida usando un detector UV. La muestra eluida se mide a una longitud de onda de aproximadamente 170 nm a aproximadamente 250 nm.
En métodos relacionados, la invención proporciona un método para analizar la pureza de formulaciones de cisteamina de liberación retardada, como perlas de cisteamina con recubrimiento entérico. Tales perlas incluyen perlas cargadas en cápsulas de dosis individuales que se formulan para administración oral a un paciente. El método comprende moler perlas de cisteamina con recubrimiento entérico; disolver las perlas molidas en un solvente que tenga un pH ácido para formar una solución de muestra que comprenda cisteamina; inyectar la solución de muestra en una columna de HPLC de fase inversa; eluir la muestra de la columna usando una fase móvil que comprende un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1-octanosulfónico), un tampón, acetonitrilo y metanol; y medir la muestra eluida usando un detector UV a una longitud de onda de 170 nm a 250 nm.
Además, la invención proporciona un método para analizar la pureza de las composiciones que comprenden cisteamina que comprende (i) disolver una muestra de cisteamina en un solvente que tiene un pH ácido para formar una solución de muestra que comprende cisteamina; (ii) inyectar la solución de muestra en una columna de HPLC de fase inversa C18; (iii) eluir en gradiente la muestra de la columna usando la primera y la segunda fases móviles, en donde la primera fase móvil comprende aproximadamente el 85% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de aproximadamente 2,6, la solución acuosa comprendiendo aproximadamente 23,6 mM de ácido 1-octanosulfónico sodio y aproximadamente 29 mM de fosfato de sodio; aproximadamente el 3% en volumen de acetonitrilo; y aproximadamente el 12% en volumen de metanol, y la segunda fase móvil comprende aproximadamente el 10% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de aproximadamente 2,6, la solución acuosa comprendiendo aproximadamente 0,2 M de ácido 1-octanosulfónico sódico y aproximadamente 0,1 M de fosfato sódico; aproximadamente el 18% en volumen de acetonitrilo; y aproximadamente el 72% en volumen de metanol; y (iv) medir la muestra eluida usando un detector UV a una longitud de onda de 170 nm a 210 nm.
A los expertos en la técnica les resultarán evidentes aspectos adicionales de la invención a partir de la revisión de la siguiente descripción detallada, tomada junto con las reivindicaciones adjuntas. Aunque la invención es susceptible de realizaciones en varias formas, en lo sucesivo se describen realizaciones específicas de la invención con el entendimiento de que la divulgación es ilustrativa y no se pretende limitar la invención a las realizaciones específicas descritas en la presente. Se pretende que el documento completo se entienda como una divulgación unificada, y debe entenderse que se contemplan todas las combinaciones de características descritas en la presente, incluso si la combinación de características no se encuentran juntas en la misma oración, o párrafo o sección de este documento. Por ejemplo, cuando se describen realizaciones que se refieren a un método para analizar la pureza de composiciones que comprenden cisteamina, se contemplan específicamente realizaciones que implican métodos para analizar formulaciones de cisteamina de liberación retardada como de cisteamina con recubrimiento entérico, y similares que tengan las mismas propiedades y características, y lo contrario también es cierto.
Además de lo anterior, la invención incluye, como un aspecto adicional, todas las realizaciones de la invención de alcance más limitado de cualquier manera que las variaciones específicamente mencionadas con anterioridad. Con respecto a los aspectos de la invención descritos como género, se consideran individualmente todas las especies individuales aspectos separados de la invención. Con respecto a los elementos descritos como una selección dentro de un intervalo, debe entenderse que se contemplan como una realización de la invención todas las subunidades discretas dentro del intervalo. Los intervalos pueden expresarse en la presente como desde "alrededor de" o "aproximadamente" un valor particular y/o hasta "alrededor de" o "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización de acuerdo con la invención incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores particulares se expresan como aproximaciones, pero se usan antecedentes como "aproximadamente", "por lo menos aproximadamente" o "menos de aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra realización.
Con respecto a los aspectos de la invención descritos o reivindicados con "un" o "uno", debe entenderse que estos términos significan "uno o más" a menos que el contexto sin ambigüedad requiere un significado más restringido. Debe entenderse que el término "o" abarca elementos en forma alternativa o conjunta, a menos que el contexto requiera de manera inequívoca lo contrario. Si los aspectos de la invención se describen como "que comprenden" una característica, también se contemplan realizaciones "que consisten en" o "que consisten esencialmente en" la característica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 proporciona un cromatograma de HPLC de cisteamina obtenido de acuerdo con los métodos descritos en la presente.
La FIG. 2 proporciona cromatogramas de HPLC de cisteamina obtenidos usando un detector UV (paneles de la izquierda) y usando un detector electroquímico (paneles de la derecha).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La invención proporciona métodos mejorados para analizar la pureza de composiciones que comprenden cisteamina y detectar impurezas en las composiciones de cisteamina. Tales métodos preferiblemente proporcionan una mayor sensibilidad y una menor selectividad con respecto a los métodos que no son de acuerdo con la invención. Al proporcionar menos selectividad, los métodos inventivos permiten la detección de impurezas adicionales que las detectadas por métodos más selectivos. Por tanto, los métodos inventivos pueden proporcionar una determinación más completa y más precisa del número y cantidades de impurezas y/o sustancias relacionadas presentes en una formulación de cisteamina. Como se usa en la presente, el término "formulación de cisteamina", "composición de cisteamina" o "composición que comprende cisteamina" se refiere a cualquier formulación que comprenda cisteamina, incluyendo las formulaciones que comprenden sales de cisteamina. Como se usa en la presente, el término "sustancias relacionadas" se refiere a compuestos derivados de cisteamina que están presentes en la formulación de cisteamina inicialmente tras la preparación y/o después del almacenamiento. Las sustancias relacionadas con la cisteamina incluyen, pero no se limitan a, dímero de cisteamina (es decir, cistamina) y otros productos obtenidos por modificación de cisteamina y/o reacción de cisteamina con otros componentes presentes en la formulación tales como sales.
La invención se describe con más detalle a continuación. Los encabezados de las secciones son para facilitar la lectura y no se pretende que la limiten per se.
Métodos de HPLC
En un aspecto, la invención proporciona un método para analizar la pureza de las composiciones que comprenden cisteamina y detectar impurezas en las composiciones de cisteamina. El método comprende: inyectar una solución de muestra que comprende cisteamina en una columna de HPLC de fase inversa; eluir la muestra de la columna usando una fase móvil que comprende un ácido alquilsulfónico, un tampón, acetonitrilo y metanol; y medir la muestra eluida usando un detector UV a una longitud de onda de 170 nm a 250 nm. Opcionalmente, el método incluye disolver una muestra de cisteamina en un solvente que tenga un pH ácido para formar la solución de muestra que comprende cisteamina.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para analizar la pureza de perlas de cisteamina con recubrimiento entérico y detectar impurezas en perlas de cisteamina con recubrimiento entérico. El método comprende: moler perlas de cisteamina con recubrimiento entérico; disolver las perlas molidas en un solvente que tenga un pH ácido para formar una solución de muestra que comprende cisteamina; inyectar la solución de muestra en una columna de HPLC de fase inversa; eluir la muestra de la columna usando una fase móvil que comprende ácido 1-octanosulfónico, un tampón, acetonitrilo y metanol; y medir la muestra eluida usando un detector UV.
En varias realizaciones, el solvente en el que se disuelve la muestra de cisteamina comprende un ácido alquilsulfónico, un tampón, acetonitrilo y metanol. Los solventes ejemplares incluyen la fase móvil de HPLC. Cuando la muestra se eluye en gradiente usando la primera y la segunda fases móviles, el solvente es típicamente la fase móvil que tiene el mayor porcentaje en volumen de componentes acuosos y el menor porcentaje en volumen de componentes orgánicos (generalmente referida como la primera fase móvil o fase móvil A).
La solución de muestra se inyecta en una columna de HPLC de fase inversa. Típicamente, la solución de muestra se inyecta en un volumen de 10 pl o 100 pl; sin embargo, pueden usarse otros volúmenes de inyección (por ejemplo, 5 pl, 20 pl, 30 pl, 40 pl, 50 pl, 60 pl, 70 pl, 80 pl o 90 pl de solución de muestra) y pueden usarse múltiples inyecciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco inyecciones de 10 pl de solución de muestra). Se inyecta una cantidad suficiente de muestra en la columna para que puedan detectarse sustancias relacionadas con la cisteamina. Generalmente, la cantidad de cisteamina inyectada en la columna es de por lo menos 30 pg, por lo menos 40 pg, por lo menos 50 pg y/o por lo menos 60 pg.
La columna de HPLC incluye un material de relleno (es decir, una fase estacionaria). En la HPLC de fase inversa, la columna contiene un material de relleno hidrófobo. Las columnas de HPLC de fase inversa ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una columna C18, una columna C8, una columna de sílice, una columna de sílice unida a ciano y una columna de sílice unida a fenilo. La columna de HPLC generalmente tiene un tamaño de partícula del material de relleno de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 10 pm de diámetro, de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 7 pm de diámetro, de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 5 pm de diámetro, de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 4 pm de diámetro, y/o de aproximadamente 3,5 pm de diámetro. Las columnas típicas de HPLC tienen un diámetro interno de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 7 mm, de aproximadamente 0,15 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 0,3 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 0,7 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 1,5 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 4 mm a aproximadamente 5 mm, y/o de aproximadamente 4,6 mm. Generalmente, las columnas de HPLC tienen una longitud de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 500 mm, de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 250 mm, de aproximadamente 20 mm a aproximadamente 250 mm, de aproximadamente 30 mm a aproximadamente 250 mm, de aproximadamente 50 mm a aproximadamente 250 mm, de aproximadamente 75 mm a aproximadamente 200 mm, y/o de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 150 mm.
Las columnas de HPLC comerciales incluyen columnas analíticas XBRIDGE (Waters, Milford, Massachusetts), por ejemplo, columnas analíticas XBRIDGE que tienen un diámetro interno y una longitud, respectivamente, de 1,0 x 50 mm, 1,0 x 100 mm, 1. 0 x 150 mm, 2,1 x 10 mm, 2,1 x 10 mm, 2,1 x 20 mm, 2,1 x 30 mm, 2,1 x 50 mm, 2,1 x 75 mm, 2,1 x 100 mm, 2,1 x 150 mm, 3,0 x 20 mm, 3,0 x 30 mm, 3,0 x 50 mm, 3,0 x 75 mm, 3,0 x 100 mm, 3,0 x 150 mm, 4,6 x 20 mm, 4,6 x 30 mm, 4,6 x 50 mm, 4,6 x 75 mm, 4,6 x 100 mm, 4,6 x 100 mm, 4,6 x 150 mm y 4,6 x 250 mm. Las columnas analíticas XBRIDGE contienen material de relleno que tiene tamaños de partículas, por ejemplo, de aproximadamente 2,5 pm de diámetro, aproximadamente 3,5 pm de diámetro y aproximadamente 5 pm de diámetro.
La muestra se eluye de la columna usando una fase móvil que comprende un ácido alquilsulfónico, un tampón, acetonitrilo y metanol. Típicamente, la elución es una elución en gradiente. Durante una elución en gradiente, se usan la primera y la segunda fases móviles que tienen diferentes composiciones. La primera y las segunda fases móviles se mezclan en proporciones cambiantes a lo largo de la elución de tal manera que la composición de la fase móvil cambia durante el curso de la elución. Una elución en gradiente incluye opcionalmente uno o más cambios escalonados en la proporción de las fases móviles.
Típicamente se incluye en la fase móvil una solución acuosa que comprende un ácido alquilsulfónico y un tampón en una cantidad de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 95% en volumen de la fase móvil, por ejemplo, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 90% en volumen, de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 85% en volumen, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 80% en volumen, de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 75% en volumen, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 70% en volumen, de aproximadamente el 35% a aproximadamente el 65% en volumen, de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60% en volumen, y/o de aproximadamente el 45% a aproximadamente el 55% en volumen. También pueden usarse otras cantidades de la solución acuosa. Por ejemplo, cuando la muestra se eluye en gradiente, una fase móvil puede incluir la solución acuosa a aproximadamente a la concentración más baja y la segunda fase móvil puede incluir la solución acuosa a aproximadamente la concentración más alta. Por tanto, otras cantidades ejemplares de solución acuosa incluyen de aproximadamente el 75% a aproximadamente el 95% en volumen, de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90% en volumen, aproximadamente el 85% en volumen, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 30% en volumen, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 25% en volumen, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20% en volumen, y/o de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10% en volumen. La solución acuosa típicamente tiene un pH ácido, por ejemplo un pH de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 2 a aproximadamente 6, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, y/o de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 2,8.
Los ácidos alquilsulfónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido etanosulfónico, ácido propanosulfónico, ácido butanosulfónico, ácido pentanosulfónico, ácido hexanosulfónico, ácido heptanosulfónico, ácido octanosulfónico, ácido nonanosulfónico y ácido decanosulfónico. El ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico o ácido 1-octanosulfónico) puede incluirse en la solución acuosa de la fase móvil en cualquiera de sus formas de sal, como en forma de sal sódica, por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico sódico o ácido 1-octanosulfónico sódico. El ácido alquilsulfónico (o una sal del mismo) típicamente se incluye en la solución acuosa a una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 120 mM, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM, y/o de aproximadamente 60 mM a aproximadamente 90 mM. También pueden usarse otras concentraciones del ácido alquilsulfónico (o sales del mismo). Por ejemplo, cuando la muestra se eluye en gradiente, una fase móvil puede incluir el ácido alquilsulfónico (o sales del mismo) a una concentración más baja y la segunda fase móvil puede incluir el ácido alquilsulfónico (o sales del mismo) a una concentración más alta. Por tanto, otras concentraciones ejemplares del ácido alquilsulfónico (o sales del mismo) en la solución acuosa incluyen de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 40 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM. de aproximadamente 120 mM a aproximadamente 280 mM y/o de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 250 mM.
Típicamente se incluye un tampón en la solución acuosa a una concentración de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 200 mM, de 20 mM a aproximadamente 150 mM y/o de 30 mM a aproximadamente 100 mM. También pueden usarse otras concentraciones de tampón. Por ejemplo, cuando la muestra se eluye en gradiente, una fase móvil puede incluir el tampón a una concentración más baja y la segunda fase móvil puede incluir el tampón a una concentración más alta. Por tanto, otras concentraciones ejemplares de tampón en la solución acuosa incluyen de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 75 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 75 mM a aproximadamente 125 mM, de aproximadamente 85 mM a aproximadamente 115 mM, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM y/o de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM. Los tampones ejemplares incluyen cualquier tampón que tenga una pKa a un pH ácido, por ejemplo, un pH de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 6, de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, de aproximadamente 2 a aproximadamente 4, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 y/o de aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5. Los tampones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fosfato, ácido cítrico/citrato, ácido acético/acetato, glicina, ácido fórmico/formiato y ácido succínico/succinato. En varias realizaciones, el tampón incluye fosfato de sodio.
El acetonitrilo típicamente se incluye en la fase móvil en una cantidad de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 95% en volumen de la fase móvil, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 30% en volumen, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 25% en volumen, de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 20% en volumen, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 15% en volumen, de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 12% en volumen, y/o de aproximadamente el 10% en volumen. También pueden usarse otras cantidades de acetonitrilo. Por ejemplo, cuando la muestra se eluye en gradiente, una fase móvil puede incluir acetonitrilo a una concentración más baja y la segunda fase móvil puede incluir acetonitrilo a una concentración más alta. Por tanto, otras cantidades ejemplares de acetonitrilo incluyen de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 8% en volumen, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 6% en volumen, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5% en volumen, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 4% en volumen, aproximadamente el 3% en volumen, de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 30% en volumen, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 25% en volumen, de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 20% en volumen y/o aproximadamente el 18% en volumen.
Típicamente, el metanol se incluye en la fase móvil en una cantidad de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 85% en volumen de la fase móvil, por ejemplo, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 80% en volumen, de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 75% en volumen, de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70% en volumen, de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 65% en volumen, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 60% en volumen, y/o de aproximadamente el 35% a aproximadamente el 55% en volumen. También pueden usarse otras cantidades de metanol. Por ejemplo, cuando la muestra se eluye en gradiente, una fase móvil puede incluir metanol en una concentración más baja y la segunda fase móvil puede incluir metanol en una concentración más alta. Por tanto, otras cantidades ejemplares de metanol incluyen de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20% en volumen, de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 15% en volumen, aproximadamente el 12% en volumen, de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 85% en volumen, de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 80% en volumen, y/o aproximadamente el 72% en volumen.
Una fase móvil ejemplar comprende de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 95% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de aproximadamente 2,0 a 3,0, la solución acuosa comprendiendo un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1- ácido octanosulfónico) y un tampón de fosfato, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 30% en volumen de acetonitrilo, y de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 85% en volumen de metanol. En varias realizaciones, la solución acuosa incluye de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 300 mM de un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1-octanosulfónico) y de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 200 mM de tampón de fosfato.
La muestra puede eluirse en gradiente usando una primera y una segunda fases móviles que se mezclan en diferentes proporciones a lo largo de la elución. Una primera fase móvil ejemplar comprende de aproximadamente de 75% a aproximadamente el 95% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de aproximadamente 2,0 a 3,0, la solución acuosa comprendiendo un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1-octanosulfónico) y un tampón de fosfato, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 8% en volumen de acetonitrilo, y de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20% en volumen de metanol. En varias realizaciones, la solución acuosa de la primera fase móvil incluye de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM de un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1-octanosulfónico) y de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 100 mM de tampón de fosfato. Una segunda fase móvil ejemplar comprende de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 30% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de aproximadamente 2,0 a 3,0, la solución acuosa comprendiendo un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1-octanosulfónico) y un tampón de fosfato, de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 30% en volumen de acetonitrilo, y de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 85% en volumen de metanol. En varias realizaciones, la solución acuosa de la segunda fase móvil incluye de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM de un ácido alquilsulfónico (por ejemplo, ácido 1-hexanosulfónico y/o ácido 1-octanosulfónico) y de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM de tampón de fosfato.
En una elución en gradiente, el gradiente típicamente comienza con un alto porcentaje de la primera fase móvil, por ejemplo, aproximadamente el 100% de la primera fase móvil y el 0% de la segunda fase móvil, aproximadamente el 90% de la primera fase móvil y aproximadamente el 10% de la segunda fase móvil, y/o aproximadamente el 80% de la primera fase móvil y aproximadamente el 20% de la segunda fase móvil. Durante un período de tiempo, por ejemplo, durante por lo menos 5 minutos, durante por lo menos 10 minutos, durante por lo menos 15 minutos, durante por lo menos 20 minutos, durante por lo menos 25 minutos y/o durante por lo menos 30 minutos, la proporción de la primera fase móvil a la segunda fase móvil se reduce continuamente. Al final del período de tiempo, el porcentaje de la primera fase móvil es menor que al comienzo del gradiente, por ejemplo, aproximadamente el 30% de la primera fase móvil y aproximadamente el 70% de la segunda fase móvil. aproximadamente el 40% de la primera fase móvil y aproximadamente el 60% de la segunda fase móvil, aproximadamente el 50% de la primera fase móvil y aproximadamente el 50% de la segunda fase móvil, aproximadamente el 60% de la primera fase móvil y aproximadamente el 40% de la segunda fase móvil, y/o aproximadamente el 70% de la primera fase móvil y aproximadamente el 30% de la segunda fase móvil. En una elución ejemplar a un caudal de 1 ml/min, el perfil de elución proporciona el 100% de la primera fase móvil durante 2 minutos, luego disminuye linealmente la cantidad de la primera fase móvil al 60% y aumenta linealmente la cantidad de la segunda fase móvil al 40% durante un período de 18 minutos, luego proporciona el 60% de la primera fase móvil y el 40% de la segunda fase móvil durante 5 minutos, y luego proporciona el 100% de la primera fase móvil durante 15 minutos.
La muestra se eluye de la columna usando un caudal adecuado, por ejemplo, de aproximadamente 0,001 ml/min a aproximadamente 2 ml/min, de aproximadamente 0,01 ml/min a aproximadamente 2 ml/min, de aproximadamente 0,1 ml/min a aproximadamente 2 ml/min, de aproximadamente 0,5 ml/min a aproximadamente 2 ml/min y/o de aproximadamente 1 ml/min. Además, la muestra se eluye a una temperatura de columna adecuada, por ejemplo, de aproximadamente 20° C a aproximadamente 80° C, de aproximadamente 25° C a aproximadamente 60° C, de aproximadamente 30° C a aproximadamente 50° C y/o de aproximadamente 40° C.
La muestra eluida se mide usando un detector UV y la señal se registra usando un dispositivo de registro adecuado. Típicamente, la muestra eluida se mide a una longitud de onda de aproximadamente 170 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 170 nm a aproximadamente 240 nm, de aproximadamente 170 nm a aproximadamente 230 nm, de aproximadamente 170 nm a aproximadamente 220 nm, de aproximadamente 170 nm a aproximadamente 210 nm, 180 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 180 nm a aproximadamente 240 nm, de aproximadamente 180 nm a aproximadamente 230 nm, de aproximadamente 180 nm a aproximadamente 220 nm, de aproximadamente 180 nm a aproximadamente 210 nm, de aproximadamente 190 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 190 nm a aproximadamente 240 nm, de aproximadamente 190 nm a aproximadamente 230 nm, de aproximadamente 190 nm a aproximadamente 220 nm, de aproximadamente 190 nm a aproximadamente 210 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 240 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 230 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 220 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 210 nm, de aproximadamente 250 nm o menos, de aproximadamente 240 nm o menos, de aproximadamente 230 nm o menos, de aproximadamente 220 nm o menos, y/o de aproximadamente 210 nm o menos.
Procesamiento de cisteamina
La formulación de cisteamina para el análisis de acuerdo con los métodos inventivos incluye todas las formas de cisteamina, incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" es una sal que puede formularse en un compuesto para uso farmacéutico, incluyendo pero no limitadas a, sales metálicas (por ejemplo, sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amoníaco o aminas orgánicas. Los ejemplos de derivados de cisteamina incluyen clorhidrato, bromhidrato, acetato, maleato, pamoato, fosfato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato, bitartrato y derivados de fosfocisteamina. Una forma ejemplar de cisteamina es el bitartrato de cisteamina.
La formulación de cisteamina puede ser una formulación de liberación inmediata. Las formulaciones de liberación inmediata generalmente pueden prepararse para análisis disolviéndolas en un solvente adecuado para formar una solución de muestra. Si es necesario, la formulación de cisteamina de liberación inmediata puede molerse o desagregarse de otro modo antes de disolverla. Si la formulación de cisteamina está presente en una cápsula u otra unidad de dosis individual, la cápsula u otra unidad puede abrirse y el contenido vaciarse en un recipiente adecuado antes de disolverla.
La formulación de cisteamina también puede ser una formulación de liberación retardada como una formulación de cisteamina con recubrimiento entérico. Para preparar formulaciones de cisteamina de liberación retardada tales como perlas de cisteamina con recubrimiento entérico, las perlas generalmente se muelen para formar un polvo o se muelen con una cantidad de un solvente adecuado para formar una pasta. Luego, el polvo o la pasta resultante se disuelve para formar una solución de muestra para el análisis.
Los recubrimientos entéricos prolongan la liberación hasta que el producto de cisteamina alcanza el tracto intestinal, normalmente el intestino delgado. Debido a los recubrimientos entéricos, se mejora la administración al intestino delgado, mejorando de este modo la captación del ingrediente activo a la vez que se reducen los efectos secundarios gástricos. Los productos de cisteamina con recubrimiento entérico ejemplares se describen en la Publicación Internacional N° WO 2007/089670 publicada el 9 de agosto de 2007.
Generalmente, el recubrimiento entérico comprende un material polimérico que evita la liberación del producto de cisteamina en el entorno de pH bajo del estómago pero que se ioniza a un pH ligeramente más alto, típicamente un pH de 4 o 5, y por tanto se disuelve lo suficiente en el intestino delgado para liberar gradualmente el agente activo en el mismo. Por consiguiente, entre los materiales de recubrimiento entérico más eficaces se encuentran los poliácidos que tienen un pKa en el intervalo de aproximadamente 3 a 5. Los materiales de recubrimiento entérico adecuados incluyen, pero no se limitan a, gelatina polimerizada, goma laca, copolímero de ácido metacrílico tipo CNF, ftalato de butirato de celulosa, ftalato de hidrógeno de celulosa, ftalato de propionato de celulosa, ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), ftalato de acetato de celulosa (CAP), trimelitato de acetato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de dioxipropilmetilcelulosa, carboximetiletilcelulosa (CMEC), succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCAS) y polímeros y copolímeros de ácido acrílico, típicamente formados a partir de acrilato de metilo, acrilato de etilo, metacrilato de metilo y/o metacrilato de etilo con copolímeros de ésteres de ácido acrílico y metacrílico (Eudragit NE, Eudragit RL, Eudragit RS).
EJEMPLOS EJEMPLO 1
Las muestras de bitartrato de cisteamina se evaluaron mediante HPLC de elución en gradiente usando una columna XBRIDGE C18 (dimensiones: 150 mm x 4,6 mm; tamaño de partículas de relleno: 3,5 gm) (Waters, Milford, Massachusetts). La temperatura del automuestreador fue de 4° C. Se inyectaron aproximadamente 10 gl o aproximadamente 100 pl de muestra en la columna. La temperatura de la columna fue de 40° C y la muestra se eluyó a un caudal de 1,0 ml/min de acuerdo con el siguiente perfil:
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La fase móvil A contenía ácido 1-octanosulfónico sódico 23,6 mM y fosfato sódico 29,0 mM (pH 2,6)/acetonitrilo/metanol 85/3/12 (v/v/v). La fase móvil B contenía ácido 1-octanosulfónico sódico 0,20 M y fosfato sódico 0,10 M (pH 2,6)/acetonitrilo/metanol 18/10/72 (v/v/v). La pureza del ácido 1-octanosulfónico fue >98%. La detección se llevó a cabo usando un detector UV a 210 nm.
Preparación de la solución de referencia. Las soluciones de referencia de estándar de referencia analítico de bitartrato de cisteamina se prepararon de la siguiente manera. Se prepararon soluciones de estándar de trabajo y estándar de control de trabajo que tenían una concentración nominal de 0,54 mg/ml de estándar de referencia analítico de bitartrato de cisteamina en la fase móvil A usando material de vidrio de baja actina. Se preparó una solución de sensibilidad de trabajo con una concentración nominal de 0,30 mg/ml de estándar de referencia analítico de bitartrato de cisteamina en la fase móvil A usando material de vidrio de baja actina, que corresponde al límite de cuantificación (LOQ) de la cisteamina. El contenido de agua del estándar de referencia analítico de bitartrato de cisteamina se determinó no más de 7 días antes de su uso mediante titulación de Karl Fischer o análisis termogravimétrico (TGA). El estándar de referencia se almacenó refrigerado y cubierto con nitrógeno.
Preparación de la muestra del ensayo de preparación de perlas. Se prepararon microesferas de cisteamina con recubrimiento entérico (RP103) para análisis de acuerdo con el procedimiento siguiente. Se molieron aproximadamente 3,7 g de perlas RP103 hasta obtener un polvo fino usando un molino de bolas durante aproximadamente 1 minuto a 27 Hz. La molienda se transfirió a una botella ámbar para su almacenamiento. Las soluciones de muestra del ensayo de preparación de perlas madre se prepararon por duplicado añadiendo 370,4 mg ± 5 mg de la molienda a un matraz volumétrico actínico bajo de 250 ml y diluyendo con la fase móvil A. La mezcla se agitó con una barra agitadora durante por lo menos 15 minutos. Se filtraron aproximadamente 15 ml de la solución resultante a través de un filtro de nailon de 0,45 pm, descartándose los primeros 5 ml. La concentración de cisteamina de la solución de muestra de ensayo de preparación de perlas madre resultante fue de aproximadamente 0,300 mg/ml. Las soluciones de muestra de preparación de perlas de trabajo se prepararon colocando 4,0 ml de solución de muestra de ensayo de preparación de perlas madre en un matraz volumétrico actínico bajo de 25 ml y diluyendo a volumen con la fase móvil A. La concentración de cisteamina de la solución de muestra de preparación de perlas de trabajo resultando fue de aproximadamente 0,048 mg/ml.
Preparación de muestras de ensayo. Se prepararon cápsulas que contenían microesferas de cisteamina (RP103) con recubrimiento entérico para análisis de acuerdo con el procedimiento siguiente. Para reducir la exposición a la luz y al oxígeno, la preparación de la muestra (desde el pesaje inicial de las cápsulas llenas hasta la carga de los viales de muestra en la HPLC) se completó en un día. Se pesaron diez cápsulas. Se vació el contenido de la cápsula y se pesaron las cubiertas vacías para determinar el peso medio de llenado de la cápsula. El contenido de la cápsula se molió hasta obtener un polvo fino usando un molino de bolas durante aproximadamente 1 minuto a 27 Hz. La molienda se transfirió a una botella ámbar para su almacenamiento. Las soluciones de muestra madre se prepararon por duplicado añadiendo la cantidad apropiada de la molienda para 1 cápsula (según lo determinado por el peso medio de llenado de la cápsula) a un matraz volumétrico actínico bajo de 25 ml y diluyendo con la Fase móvil A. La mezcla se agitó con una barra de agitación durante por lo menos 15 minutos. La solución resultante se centrifugó a aproximadamente 3400 rpm durante 5 minutos. Se filtraron aproximadamente 15 ml de la solución centrifugada a través de un filtro de nailon de 0,45 pm (Acrodisc, 25 mm de diámetro), descartándose los primeros 5 ml, para obtener soluciones de muestra madre. Las soluciones de muestra de trabajo se prepararon colocando 6,0 ml de solución de muestra madre (para cápsulas de 25 mg) o 2,0 ml de solución de muestra madre (para cápsulas de 75 mg) en un matraz volumétrico actínico bajo de 10 ml y diluyendo a volumen con Fase móvil A.
Preparación de muestras con uniformidad de contenido. Se prepararon cápsulas que contenían microesferas de cisteamina (RP103) con recubrimiento entérico para análisis de acuerdo con el procedimiento siguiente. Para reducir la exposición a la luz y al oxígeno, la preparación de la muestra (desde el pesaje inicial de las cápsulas llenas hasta la carga de los viales de muestra en la HPLC) se completó en un día. Se pesaron diez cápsulas. El contenido de cada cápsula se vació en morteros separados y las cubiertas vacías se pesaron para determinar el peso de llenado de la cápsula individual. Se añadieron al mortero aproximadamente 1-2 ml de Fase móvil A. Las perlas se molieron inmediatamente hasta obtener una pasta. Si era necesario, se añadía Fase móvil A adicional a la pasta, hasta un total de 5 ml. La pasta se transfirió a un matraz volumétrico de baja actina de 250 ml. El mortero y la maja se enjuagaron a fondo con la Fase móvil A y la solución de enjuague se recogió en el mismo matraz. El matraz se llenó aproximadamente tres cuartas partes con la Fase móvil A y se agitó durante por lo menos 15 minutos. El matraz se llenó al volumen con la Fase móvil A. Se filtraron aproximadamente 20 ml de la solución resultante a través de un filtro de nailon de 0,45 pm (Acrodisc, 25 mm de diámetro), descartándose los primeros 5 ml, para obtener soluciones de muestra de CU madre. Las soluciones de muestra de CU de trabajo se prepararon colocando 12,0 ml de solución de muestra de CU madre (para cápsulas de 25 mg) o 4,0 ml de solución de muestra de CU madre (para cápsulas de 75 mg) en un matraz volumétrico de baja actina de 25 ml y diluyendo a volumen con Fase móvil A. La concentración de cisteamina de las soluciones de muestra de CU de trabajo resultantes fue de aproximadamente 0,048 mg/ml.
Análisis de datos. La concentración de la solución estándar de trabajo de cisteamina se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: Concentración de cisteamina (Cstd) = mg de estándar de referencia analítico de bitartrato de cisteamina x Pf/25,0 ml
Pf representa un factor de pureza para el material estándar. Pf se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: Pf = B x (100-agua) x C/100
donde B = la base libre de cisteamina anhidra en el estándar de referencia analítico de bitartrato de cisteamina (expresado como un valor decimal en la etiqueta de la botella estándar),
agua = el contenido de agua se determinó mediante Karl Fischer o TGA no más de 7 días antes del uso (expresado como un porcentaje), y
C = la corrección de cistamina (expresada como un valor decimal en la etiqueta del frasco estándar).
La cantidad de cisteamina por cápsula se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: mg de cisteamina por cápsula = (ASam/AStd) x CStd x DF x (AveWt/SamWt)
donde ASam = el área del pico de cisteamina en el cromatograma de la muestra con una inyección de 10 pl, AStd = el área media del pico de cisteamina en todos los cromatogramas de soluciones estándar de trabajo con una inyección de 10 pl,
CStd = la concentración (mg/ml) de cisteamina en la solución estándar de trabajo,
DF = el factor de dilución (125 para cápsulas de 75 mg; 41,6667 para cápsulas de 25 mg),
AveWt = el peso medio de llenado de la cápsula (mg), y
SamWt = el peso de la muestra (mg).
Para uniformidad de contenido, la cantidad de cisteamina por cápsula se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: mg de cisteamina por cápsula = (ASam/AStd) x CStd x DF
donde ASam = el área del pico de cisteamina en el cromatograma de la muestra con una inyección de 10 pl, AStd = el área media del pico de cisteamina en todos los cromatogramas de soluciones estándar de trabajo con una inyección de 10 pl,
CStd = la concentración (mg/ml) de cisteamina en la solución estándar de trabajo, y DF = el factor de dilución (1562,5 para cápsulas de 75 mg; 520,8 para cápsulas de 25 mg).
Para el Ensayo de preparación de perlas, la cantidad de cisteamina por cápsula se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: mg de cisteamina por cápsula = (ASam/Astd) x CStd x DF x (AveWt/SamWt)
donde ASam = el área del pico de cisteamina en el cromatograma de la muestra con una inyección de 10 pl; AStd = el área media del pico de cisteamina en todos los cromatogramas de las soluciones estándar de trabajo con una inyección de 10 pl;
CStd = la concentración (mg/ml) de cisteamina en la solución estándar de trabajo,
DF = el factor de dilución (usar el factor de dilución de 75 mg, 1562,5),
AveWt = el peso medio de llenado de la cápsula (mg) (usar el peso de llenado objetivo, 370,4 mg) y SamWt = el peso de la muestra (mg) (usar el peso real usado en la preparación de la muestra).
El porcentaje de la indicación de la etiqueta (%LC) se calculó para las soluciones de muestra del ensayo, uniformidad del contenido y ensayo de preparación de perlas de acuerdo con la siguiente ecuación: %LC = (mg de cisteamina)/LC x 100%
donde mg de cisteamina = la cantidad calculada por la ecuación aplicable anterior, y LC = la cantidad indicada en la etiqueta (75 mg o 25 mg) (usar 75 mg para el ensayo de preparación de perlas).
La cantidad de sustancias relacionadas con el bitartrato de cisteamina (incluyendo las impurezas de cisteamina) como la cistamina se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:
mg de sustancia relacionada = (ARs/Astd) x (Cstd/RRF) x DF x (AveWt/SamWt)
donde Ar s = el área del pico de cualquier sustancia relacionada en el cromatograma de la solución de muestra de trabajo con una inyección de 100 pl (se descartaron los picos antes de RRT 0,48; también se descartaron los picos observados en el cromatograma de la segunda inyección de la Fase móvil A/Muestran en blanco (inyección de 100 pl)),
Astd = el área media del pico de cisteamina en todos los cromatogramas de las soluciones estándar de trabajo con una inyección de 10 pl,
Cstd = concentración (mg/ml) de cisteamina en la solución estándar de trabajo,
RRF = factor de respuesta relativo (0,98 para cistamina; 1,00 para otras sustancias relacionadas),
DF = factor de dilución (12,5 para cápsulas de 75 mg; 4,16667 para cápsulas de 25 mg),
AveWt = el peso medio de llenado de la cápsula (mg), y
SamWt = el peso de la muestra molida de la preparación de la solución de muestra de trabajo (mg).
El porcentaje en peso de cistamina y otras sustancias relacionadas individuales se determinó de acuerdo con la siguiente ecuación:
% de sustancia relacionada individual = mg de sustancia relacionada / mg de cisteamina x 100%
donde mg de sustancia relacionada = la cantidad de sustancia relacionada calculada anteriormente y mg de cisteamina = la cantidad de cisteamina para la muestra de ensayo.
El porcentaje de sustancias relacionadas totales se determinó sumando todas las sustancias relacionadas mayores o iguales al 0,05%. Se descartaron los picos después de 28 minutos. A diferencia de un método de detección electroquímica anterior que descartaba los picos de elución temprana como no relevantes para el cálculo de la pureza, el método anterior determina que los picos tempranos son impurezas e integra los picos de elución temprana como se ha descrito anteriormente.
Se probaron cinco lotes de cisteamina con recubrimiento entérico (RP103) (liberación retardada, concentración de 75 mg) y dos lotes de cisteamina sin recubrimiento entérico (Cystagon®) (liberación inmediata) de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente para determinar el porcentaje en peso de sustancias relacionadas. Los cinco lotes de RP103 se probaron en el momento de la liberación del lote ("Momento 0") y a los 12 o 18 meses después de la liberación del lote. El porcentaje de cada sustancia relacionada se calculó como porcentaje en peso de cisteamina. Se asignó un RRF de 1,00 a cada sustancia relacionada (excepto la cistamina) porque no se aisló una cantidad suficiente de las sustancias relacionadas para determinar el RRF. Para la cistamina, se determinó que el RRF era de 0,98. Los resultados de las pruebas se proporcionan en la Tabla 1 y en la FIG. 1 se proporciona un cromatograma representativo.
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Estos resultados demuestran un total menor de sustancias relacionadas para la cisteamina con recubrimiento entérico en el momento de la liberación del lote y 12 meses después de la liberación del lote con respecto a la cisteamina sin recubrimiento entérico. Por ejemplo, el presente método muestra que los lotes de una formulación de cisteamina de liberación inmediata contienen más del 5% de impurezas de cistamina, mientras que un método de detección electroquímica demostró con anterioridad que el producto de liberación inmediata contenía menos del 5% de impurezas de cistamina. Por el contrario, el método muestra que la composición de liberación retardada RP103 comprende menos del 5% de impurezas de cistamina. Además, usando el método de detección UV, se detectaron picos de impurezas adicionales, por ejemplo, Pico 1, Pico 5 y Pico 6 (ver la Tabla 1 y la Figura 1), que no fueron detectados por un método de detección electroquímico. Estos resultados también demuestran que los presentes métodos proporcionan una determinación precisa y altamente sensible de sustancias relacionadas presentes en las formulaciones de cisteamina.
EJEMPLO 2
La detección UV de impurezas de bitartrato de cisteamina se comparó con detección electroquímica, que se ha usado con anterioridad para detectar impurezas en una formulación de cisteamina de liberación inmediata. Se evaluaron dos muestras de bitartrato de cisteamina (sin recubrimiento entérico) por HPLC. La primera muestra (Muestra A) contenía bitartrato de cisteamina (CBT) a una concentración de 1 mg/ml, enriquecido con tiomorfolina (TMP), óxido de tiomorfolina-1 (OTMP), Pico 1 (ver la Tabla 1 y la Figura 1) (RRT0.85), y Pico 4 (ver la Tabla 1 y la Figura 1) (R4). La segunda muestra (Muestra B) contenía bitartrato de cisteamina (CBT) a una concentración de 1 mg/ml, enriquecido con lantionamina (TBEA), Pico 5 (ver la Tabla 1 y la Figura 1) (R5), Pico 6 (ver la Tabla 1 y la Figura 1) (R6), y Pico D (ver la Tabla 1) (RRT0.89). Ambas muestras se almacenaron a 5° C durante unos días antes del análisis por HPLC.
Las muestras A y B se evaluaron mediante HPLC de elución isocrática usando una columna ATLANTIS T3 C18 (dimensiones: 150 mm x 4,6 mm; tamaño de partículas de relleno: 3 pm) (Waters, Milford, Massachusetts). La temperatura del automuestreador fue de 5° C. Se inyectaron aproximadamente 10 pl de muestra en la columna. La temperatura de la columna fue de 40° C y la muestra se eluyó a un caudal de 1,0 ml/min durante 15 minutos. La fase móvil contenía monohidrato de hexanosulfonato de sodio 8,8 mM, H3PO4 al 0,1% en agua/acetonitrilo 88/12 (v/v). La aguja se lavó con agua.
La detección UV se llevó a cabo usando un detector UV a 200 nm. La detección electroquímica se llevó a cabo usando un detector electroquímico con una celda de condición (250 mV, 5 pA) y una celda analítica (650 mV, 100 pA).
Inicialmente se pensaba que la detección electroquímica era un método de detección más sensible en comparación con la detección UV. Sin embargo, como se muestra en la FIG. 2, se detectaron picos adicionales y se demostró una mayor resolución de pico mediante el método de detección UV descrito en la presente (ver los paneles de la izquierda) en comparación con el método de detección electroquímica (ver los paneles de la derecha). En la FIG. 2, los paneles superiores corresponden a la Muestra A y los paneles inferiores corresponden a la Muestra B.
Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que muchas de las impurezas identificadas en la presente y detectadas usando el detector UV a baja longitud de onda no experimentan una reacción redox, que es necesaria para detectar una impureza usando un detector electroquímico. Por lo tanto, como se ilustra a continuación, el método de detección UV identifica más picos de impurezas que un método de detección electroquímico.
Por ejemplo, el método de detección UV identificó picos de impurezas adicionales no identificados por detección electroquímica, como tiomorfolina (TMP), tiomorfolina-1-óxido (OTMP), Pico D, Pico 4, lantionamina (TBEA), Pico 5, y Pico 6.
Por tanto, el método de detección UV descrito en la presente demostró una mayor sensibilidad y una menor selectividad en comparación con la detección electroquímica.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para analizar la pureza de composiciones que comprenden cisteamina que comprende:
(i) inyectar una solución de muestra que comprende cisteamina en una columna de HPLC de fase inversa; (ii) eluir la muestra de la columna usando una fase móvil que comprende un ácido alquilsulfónico un tampón, acetonitrilo y metanol; y
(iii) medir la muestra eluida usando un detector UV a una longitud de onda de 170 nm a 250 nm.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además disolver una muestra de cisteamina en un solvente que tiene un pH ácido para formar la solución de muestra que comprende cisteamina.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la composición comprende perlas de cisteamina con recubrimiento entérico y en donde el método incluye realizar los siguientes pasos antes del paso (i):
(a) moler las perlas de cisteamina con recubrimiento entérico;
(b) disolver las perlas molidas en un solvente que tiene un pH ácido para formar una solución de muestra que comprende cisteamina.
4. El método de la reivindicación 2 o 3, en donde el solvente comprende un ácido alquilsulfónico, un tampón, acetonitrilo, y metanol.
5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la fase móvil comprende:
del 5% al 95% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de 2.0 a 3.0, la solución acuosa comprendiendo un ácido alquilsulfónico y un tampón de fosfato,
del 1% al 30% en volumen de acetonitrilo, y
del 5% al 85% en volumen de metanol.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la solución acuosa comprende:
de 15 mM a 300 mM de un ácido alquilsulfónico, y
de 15 mM a 200 mM de tampón de fosfato.
7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra se eluye usando una elución en gradiente.
8. El método de la reivindicación 7, que comprende eluir en gradiente la muestra usando la primera y la segunda fases móviles, en donde la primera fase móvil comprende:
del 75% al 95% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de 2.0 a 3.0, la solución acuosa comprendiendo un ácido alquilsulfónico y un
tampón de fosfato,
del 1% al 8% en volumen de acetonitrilo, y
del 5% al 20% en volumen de metanol; y
la segunda fase móvil comprende:
del 5% al 30% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de
2.0 a 3.0, la solución acuosa comprendiendo un ácido alquilsulfónico y un
tampón de fosfato,
del 8% al 30% en volumen de acetonitrilo, y
del 50% al 85% en volumen de metanol.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la solución acuosa de la primera fase móvil comprende:
de 15 mM a 300 mM de un ácido alquilsulfónico, y
de 15 mM a 100 mM de tampón de fosfato;
en donde la solución acuosa de la segunda fase móvil comprende:
de 100 mM a 300 mM de un ácido alquilsulfónico, y
de 100 mM a 200 mM de tampón de fosfato.
10. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la solución de muestra comprende bitartrato de cisteamina.
11. El método de la reivindicación 3, en donde las perlas se muelen para formar un polvo o una pasta.
12. Un método para analizar la pureza de composiciones que comprenden cisteamina que comprende:
(i) disolver una muestra de cisteamina en un solvente que tiene un pH ácido para formar una solución de muestra que comprende cisteamina;
(ii) inyectar la solución de muestra en una columna de HPLC de fase inversa C18;
(iii) eluir en gradiente la muestra de la columna usando la primera y la segunda fases móviles,
en donde la primera fase móvil comprende:
aproximadamente el 85% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de aproximadamente 2,6, la solución acuosa comprendiendo aproximadamente 23,6 mM de ácido 1-octanosulfónico sodio y aproximadamente 29 mM de fosfato de sodio; aproximadamente el 3% en volumen de acetonitrilo;
y aproximadamente el 12% en volumen de metanol, y la segunda fase móvil comprende: aproximadamente el 10% en volumen de una solución acuosa que tiene un pH de aproximadamente 2,6, la solución acuosa comprendiendo aproximadamente 0,2 M de ácido 1-octanosulfónico sódico y aproximadamente 0,1 M de fosfato sódico; aproximadamente el 18% en volumen de acetonitrilo; y aproximadamente el 72% en volumen de metanol; y
(iv) medir la muestra eluida usando un detector UV a una longitud de onda de 170 nm a 210 nm.
13. El método de la reivindicación 12, que comprende eluir en gradiente a un caudal de aproximadamente 1,0 ml/min de acuerdo con el perfil siguiente:
Figure imgf000015_0001
14. El método de la reivindicación 12 o 13, en donde la columna de HPLC tiene un tamaño de partícula de material de relleno de aproximadamente 3,5 pm de diámetro, una longitud de aproximadamente 150 mm, y un diámetro interno de aproximadamente 4,6 mm.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende inyectar por lo menos 30 pg de cisteamina en la columna.
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