TWI330714B - Method for measuring binding site on plasma protein and mutation of plasma protein at the binding of drugs to the plasma protein - Google Patents

Description

1330714 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】

本發明係關於爲簡便地測定對於血漿蛋白質具有結合 親和性之藥物與血漿蛋白質結合部位之結合取代效果之測 定方法及應用於其臨床診斷。更詳細而言，本發明係測定 對於血漿蛋白質具有結合親和性之藥物與血漿蛋白質結合 部位之結合取代效果時，將對於已知結合部位之血漿蛋白 質具有結合親和性之可單一或複數個標識之藥物，添加於 血漿蛋白質，將依據添加可標識藥物之取代效果，測定造 成應測定藥物之游離率之變化，由少量試樣，可同時測定 該藥物之血漿蛋白質結合部位與結合取代效果之方法及應 用於其臨床診斷。 【先前技術】

一般上以治療、診斷爲目的所投予的藥物係經由一次 全身血液循環而經過吸收、分佈、代謝及排泄等過程。於 吸收及分佈的過程中，藥物雖隨著血液的流動而移動，血 管內、組織間隙及細胞內之各空間的移動，係依據未與蛋 白質等結合之狀態之游離型藥物的擴散及輸送而發生，到 達標的作用部位。移動達到恆定狀態時，游離型藥物之濃 度於各空間均同，整體的濃度模式係依據與蛋白質等之結 合大小而決定。 如此地於生物體中，藥物係因應其特性，與一部份的 血漿蛋白質等之生物體高分子以可逆性結合存在。因爲~ -4- (2) (2)1330714 般可通過微血管壁或細胞膜等者爲非結合型藥物’可作爲 有效成份作用者係不與血漿蛋白質等結合之游離型藥物’ 移動至其作用部位係依據與血漿蛋白質等之結合而受到很 大的影響。因爲血漿蛋白質與藥物的結合’影響藥物應作 用病巢部位之分佈或排泄，於開發藥物時，調查該藥物與 血漿蛋白質有無結合，若結合時，預先測定其結合率係必 要的。 於國際公開0 0/7 8352號公報中記載，投予與血漿蛋 白質具有結合親和性之第一藥物，投予對於與該第一藥物 相同的血漿蛋白質具有結合親和性之第二藥物，可控制第 —藥物結合於血漿蛋白質之投予藥物方法及製劑。亦即， 該公報中記載，依據投予第一藥物之同時或其前後，投予 相關之第二藥物時，控制第一藥物結合於血漿蛋白質，可 提高或減低血液中第一製劑之游離濃度。 例如99m -搭標識毓基甘胺醯替甘胺醯替甘胺酸（ mercapto-acetylglycylglycylglycine) ( 99mTc — MAG3)係 於腎臟中依細尿管的分泌，而有效率地排泄於尿中，以診 斷腎及尿路疾病爲目的，廣泛地使用之體內用放射性醫藥 品。關於診斷劑之濃度，已知99mTc- MAG3約90%結合 於血漿蛋白質。於 WOOO/7 8 3 5 2號公報中記載，投予 99mTc - MAG3爲第一藥物時，投予第二藥物之buc〇l〇me 、cefazolin 及 valproic acid 等時，抑制 99mTc — MAG3 與 血漿蛋白質之結合，可提高99mTc-MAG3之游離濃度（ 取代效果），結果係更有效率地排泄99mTc— MAG3於尿 1330714

中〇 另外，本發明者等之申請專利書之特原 267010號說明書中，與投予含有與血漿蛋白質 親和性之有效成份之製劑之同時或其前後，投予 與該有效成份相同之血漿蛋白質具有高結合親和 酸之製劑時，結合部位發生競爭性取代，增加有 游離度（取代效果），因此，比單獨投予含有有 製劑，可期待得到高的藥物活性。相反地，亦記 胺基酸製劑之作用，有效成份結合於血漿蛋白質 有效成份之游離濃度降低（減低游離濃度效果） 之有效成份之游離濃度經過長時間維持低量而降 (clearance )，可期待達成持續性地表現藥效。 然而，依據如上述之第二藥物或含胺基酸製 效果係可預測依第一藥物或所投予之生物體而異 結合之代表性血漿蛋白質，可舉例如白蛋白及酸 質，顯示各具有複數個結合部位。例如第一藥物 位與第二藥物之結合部位相同時，依據第二藥物 果，雖然第一藥物之游離濃度大幅改變，但認爲 不同時，依據相關的取代效果，第一藥物之游離 小。因此，期待第二藥物之取代效果時，預先調 第二藥物與血漿蛋白質之結合部位是必要的。若 藥物係與血漿蛋白質上之複數個藥物結合部位中 位結合，就可更容易地預測該藥物之藥物動態。 另一方面，作爲血漿蛋白質之代表性之白蛋 ! 2002 — 具有結合 含有對於 性之胺基 效成份的 效成份之 載依據含 升高時， ，血液中 低淸除率 劑之取代 ^與藥物 性糖蛋白 之結合部 之取代效 結合部位 濃度變化 查第一及 預先明白 之那個部 白及酸性 -6 - (4) 1330714 糖蛋白質本身發生突變等時，對於上述之取代 給予大的影響。因爲蛋白質之結合部位若發生 物之結合亦變化。 然而，至今尙未開發測定藥物與血漿蛋白 位及結合量用之簡便方法。 測定藥物之取代效果，如WOOO/7 8 3 52號 載，以放射性核種標識之第一藥物及取代用之 血漿混合，測定混合液全體之放射能量，另外 後之含有未與蛋白質結合之藥物之濾液之放射 二者即可。然而，於此方法中，第一藥物及第 時，必須測定第二藥物的取代效果，因此，由 採取多量的測定用血液不可，並且有測定上須 耗費時間等之問題。 【發明內容】 發明之揭示 本發明係有鑑於如上所述而實施者，係以 知與血漿蛋白質之結合部位之第二藥物，依據 與血漿蛋白質之結合之第一藥物之游離率變化 藥物與血漿蛋白質之結合部位及結合量之方法 外’本說明書中’將未與蛋白質結合之游離型 吡率，稱爲游離率。 本發明並提供以少量的試樣，依據測定已 獎蛋白質之結合部位及結合量之藥物之游離率 效果亦可能 變化，與藥 質之結合部 公報中所記 第二藥物與 ，測定超濾 能量，比較 二藥物改變 病重患者非 更多操作或 提供使用已 測定應測定 ，測定第一 爲目的。另 藥物之存在 知與正常血 ，而檢測血 (5) (5)1330714 漿蛋白質之突變的方法爲目的。 另外，本發明係提供依據測定已知與血漿蛋白質之結 合部位之藥物之游離率變化，而檢測血漿蛋白質之突變體 之方法。 本發明係提供將應測定與血漿蛋白質之結合部位之第 一藥物，與已知與血漿蛋白質之結合部位之第二藥物及血 漿蛋白質反應，依據添加第二藥物對於第一藥物結合於血 漿蛋白質的影響，亦即測定第一藥物之游離率變化而測定 第一藥物與血漿蛋白質之結合部位的方法。 另外，本發明係提供將應測定與血漿蛋白質之結合部 位之第一藥物，與已知與血漿蛋白質之結合部位之複數個 第二藥物及血漿蛋白質反應，依據測定第二藥物與血漿蛋 白質之結合而測定第一藥物之游離率變化之測定第一藥物 與血漿蛋白質之結合部位之方法及實施此方法用之試劑組 〇 另外，本發明係提供依據已知與正常血漿蛋白質之結 合部位及結合量之藥物與血漿蛋白質反應，測定該藥物之 游離率變化之檢測血液中蛋白質突變之方法及實施此方法 用之試劑組。 另外，本發明係提供依據將已知與血漿蛋白質之結合 部位之藥物與血漿蛋白質反應，而經時地測定該藥物之游 離率變化之檢測血液中蛋白質突變體之方法及實施此方法 用之試劑組。 依據本發明之方法，可測定某種藥物於血漿蛋白質上 -8 · (6) (6)1330714 之某個結合部位，以多少的結合力，結合多少量，因此， 由多數的候補藥物群中，可選擇具有所需之血漿蛋白質結 合檔案之藥物。另外，依據本發明之方法，可知道健康者 及患者之血漿蛋白質上之藥物結合部位之突變。另外，使 用本發明之方法，爲控制（增加結合或增加游離率）既存 藥物與血漿蛋白質之結合所需之添加劑，亦即可選出取代 藥之第二藥物。 因此，依據本發明之方法，可提供改善所處方之既存 醫藥品之體內藥物動態用之添加劑，本發明對於檢討既存 醫藥品處方之改良或更加提高有效性之醫藥品之製劑改良 ，可給予很大的幫助。 依據本發明，因爲以少量試樣可簡便地進行選擇控制 藥物效果用之取代藥物，另外，血漿蛋白質有突變時，亦 可以少量的試樣，簡便地測定其結合部位之異常，所以對 於藥物治療的貢獻大》 用以實施發明之最佳型態 認爲投予與血漿蛋白質具有結合性之第一藥物之同時 或其前後，投予對於相同的血漿蛋白質具有高結合性之第 二藥物時，於結合部位發生取代，而產生更高的第一藥物 之游離濃度（取代效果），可期待得到吡單獨投予第一藥 物更高的藥物活性。相反地，因第二藥物之作用而提高第 一藥物之血漿蛋白質濃度時（減低游離濃度效果），依據 血液中之第一藥物之游離濃度經過長時間維持低量，可期 -9 · (7) (7)1330714 待達成持續性地表現藥效。 與相關血漿蛋白質具有結合親和性之第一藥物係只要 符合投予目的之藥物’任何治療藥或診斷藥均可。第二藥 物係與治療或診斷目的無關，爲得到上述之取代效果，以 選自對於與第一藥物相同的血漿蛋白質，具有競爭的結合 親和性，阻礙第一藥物結合於血费蛋白質，增大第一藥物 之游離量者’或與第一藥物之血漿蛋白質之結合部位相同 而且結合親和性更高者爲宜。相反地，爲得到減低游離濃 度效果’由依據第二藥物結合於血漿蛋白質而使第一藥物 之血漿蛋白結合上昇之藥物，選擇其效果高者而可達成目 的。 雖未發現解釋有關藥物之取代效果及減低游離濃度效 果之實際狀態之硏究，依據本發明者等之特願2 002 -267010號說明書揭示，依據藥物組成降低（取代效果） 或提升（減低游離濃度效果）藥物結合於血漿蛋白質之例 。依據第一藥物與第二藥物之組成而欲得到如此的效果， 依據本發明之方法，明確地要求預先求出第一及第二藥物 與血漿蛋白質之結合部位。於本發明之測定方法，相對於 一個第一藥物，可使用單一或組合複數個第二藥物。 本發明之測定方法中之血漿蛋白質係不論其來自人類 者及來自動物者。作爲結合藥物之血漿蛋白質，代表性者 可舉例如人類血淸白蛋白（HSA) 、αι —酸性糖蛋白質 (AGP) 、r-球蛋白及脂質白質等，一般多爲結合於 HSA 或 AGP 者。 •10- (8) (8)1330714 作爲HAS結合部位’有部位I 、部位Π及部位ffi ^ 依據藥物HAS上之結合部位已被確定。作爲具有結合特 —性於HAS之部位I之藥物，可舉例如bucolome ( 5~正 丁基_1 一環己基一 2，4，6 —三羰基全氫嘧啶）、 cefazolin(7—〔1—(氫）—四哩基乙酿胺基〕）—3 — 〔2— (5 —甲基一 1，3，4 -噻唑基）硫甲基〕—3_ cephem—4 -殘酸、Phenylbutazone ( 1 > 2 -二苯基一3， .5 —二類基—4 —正丁基吼哩卩定）、valproic acid (2 —丙基 戊酸鈉）、阿司匹靈（Aspirin) (2 -乙酸基苯甲酸）、水 楊酸（鄰經基苯甲酸）、ceftriaxone( (6R，7R) — 7 — 〔2_胺基一 4 一噻唑〕一 2 -甲氧基亞胺基乙醯胺基）-3 —(2，5 —二徑基—2 —甲基—6- 氧—5 —羯基—1，+ 2，4 一三嗪一 3-硫甲基）一8—羯基—5-噻_1 一偶氮二環〔 4、2、0〕辛—2 —燃基—2 —孩酸二鈉、Sulfamethizole( N - (5-甲基一1，3’ 4 一噻二唑—2 -基）磺胺）、

Canrenoate ( 17 —羥基—3 -羰基一 17α -孕甾-4，6-二燒—21—殘酸）及 Dansyl — L - asparagine (天冬酿胺 )等。作爲具有結合特一性於HAS之部位Π之藥物，可 舉例如 Ibuprofen (2— (4 —異丁基苯基）丙酸）、

Nabumetone ( 4 - (6 -甲氧基一 2 -萘基）2 — 丁酮：

Nabumetone代謝物之6-甲氧基-2萘基醋酸酯表現於部 位Π之結合特一性）及 probenecid (羧苯磺二丙胺）（4 —(N，N-二丙基胺磺醯）苯甲酸）等。另外，雖未鑑 定HAS上之結合部位，但已知et〇p〇side( (5S，5aR， -11 - (10) (10)1330714 對於血漿蛋白質具有親和性之有效成份之血液中游離濃度 之製劑及其投予方法。此含有單一或複數個胺基酸的製劑 係可選自色胺酸 '天門冬酸、甘胺酸、絲胺酸、白胺酸、 甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、脯胺酸、胱胺酸 及丙胺酸或此等之鹽及此等之衍生物或此等衍生物之鹽等 。亦即，此等之胺基酸中亦包含N-乙醯基色胺酸及羥苯 基甘胺酸等之胺基酸分子中導入取代基之胺基酸衍生物及 此等之鹽。此時，期待控制有效成份結合於複數個血漿蛋 白質或人類血淸白蛋白之複數個結合部位時，期待相乘效 果時等，亦可選擇複數個胺基酸。另外，使用複數個胺基 酸時，亦可選擇含有 Proteamin 12X (註冊商標）及 Kidomin (註冊商標）等之胺基酸之輸液，亦可含有與此 等輸液相同組成或成份量之製劑。爲控制有效成份結合於 血漿蛋白質，依據使用單一或複數個胺基酸，比控制血漿 蛋白質結合用之製劑其本身對於生物體的影響較少，而且 可提供比現實上投予更適合之製劑。 尤其，色胺酸係對於HSA部位Π及AGP爲有效的取 代藥物，色胺酸衍生物之N-乙醯基色胺酸係對於HS A 部位Π爲有效的取代藥物，另一方面，顯示對於AGP之 減低游離濃度效果。天門冬酸係顯示對於AGP之取代效 果’甘胺酸衍生物之羥苯基甘胺酸係顯示對於HSA部位 Π及AGP之減低游離濃度效果。相對於此，如Proteamin 12X之胺基酸混合物之胺基酸輸液係對於HSA部位Π及 AGP之任何結合部位亦顯示取代效果，具有作爲廣泛性使 -13- (12) (12)1330714 (4一苯基螺〔呋喃_2(3H) - Γ — (3’ Η) —異苯并 咲喃〕3’ 3’ -二酮）等之螢光性物質或色素。 另外’於本發明之測定法中，使用複數個第二藥物時 ’可將該第二藥物分別以相同或相異之標識物質標識。以 相異的標識物質標識.時，雖可更容易分離測定，但因爲即 使標識物質相同’仍可同時分離測定，所以不限標識物質 種類。 當然’本發明方法中之第—藥物及第二藥物以標識物 質標識與否均可同時分離測定。例如即使第一藥物、第二 藥物及血漿蛋白質之混合溶液本身，亦可以高效能液相層 析法（HPLC)，進行分離測定。 基於本發明之方法，使已知與正常血漿蛋白質之結合 部位及結合量之藥物與血漿蛋白質反應，依據測定該藥物 之游離率變化而可測定血發蛋白質之突變程度。另外，使 已知與血漿蛋白質之結合部位之藥物與血漿蛋白質反應， 依據測定該藥物之游離率變化而可檢測血漿蛋白質突變體 。使反應之血漿蛋白質係任何存在於血液中、血漿中或血 淸中者均可。 其次，關於測定第一藥物之血漿蛋白質結合部位之方 法，參考實施例1而說明β首先，作爲第一藥物，例如將 Warfarin ( MC — WRF)添加於健康成人所分離之血淸1， 預先求出於其中添加生理食鹽水爲對照組時之游離率（表 1中爲0.96)。另外，此時Warfarin之結合部位於實驗前 爲未知。其次，將Warfarin與血淸1之混合液分爲4份 -15- (13) (13)1330714 ，分別添加作爲第二藥物之結合於 HSA之部位I之 bucolome ( BCL)、結合於 HSA 之部位 Π 之 Ibuprofen ( IPF)、結合於AGP之部位A及部位B之Propranolo]( PPL)以及主要結合於AGP之部位B之Verapamil (VPM )，測定各游離率（表1中，依次爲2.83、0.97、1.00及 1.06)。添加生理食鹽水時之對照組游離率與此等相比較 時，僅添加BCL時之游離率高，添加IPF、PPL及VPM 時之變化很少。在此因爲BCL具有HAS之部位I之結合 部位，所以明白 W a r f a r i η亦爲結合於部位I之藥物。另 外，表1係使用健康成人男性之血淸之結果，但使用人類 血淸（human pool serum)之表3中之對照組之游離率亦 可得到相同的結果。 以第一藥物爲二氮平（Diazepam) (14C-DZP)時，同 樣地如表1所示，因爲僅具有結合部位於HSA之部位Π 之IPF之游離率與對照組相比較爲1 .7倍，所以可測定 Diazepam爲對於HSA之部位Π具有結合性之藥物》 在此說明測定第一藥物之結合部位，其逆向當然亦可 能。亦即，若已知Warfarin之結合部位爲HSA之部位I 時，以14C標識 Warfarin爲第二藥物，以第一藥物爲 BCL、IPF、PPL及VPM時，於此等第一藥物中，可判定 與HSA之部位I結合之第一藥物爲BCL。 本發明之方法係對於標識第一藥物，可測定各結合部 位之游離率’若使用可同時測定之複數個標識第二藥物時 ’以一次的操作可判定第一藥物爲結合於那個部位之藥物 -16- (15) (15)1330714 比較即可。藥物係與實施例2同樣地標識不同的放射性核 種時’血漿蛋白質之複數個結合部位中那個部位發生突變 ’以一次的測定即可得知》以下，以實施例3及4作說明 © 於實施例3中，使用正常男子血淸，測定胺基酸及胺 基酸輸液之血漿蛋白質結合部位及取代效果。表5中，於 正常男子血淸中添加生理食鹽水，添加結合於血淸白蛋白 (HSA)之部位I之過鐯酸（99mTc〇4-)、結合於HSA 之部位Π之Diazepam (l4C—DZP)、結合於αι —酸性糖 蛋白質（AGP)之部位Α及部位β之Propranolol (3Η — PPL)以及結合於HSA之部位ϋ及AGP雙方之1251 - IMP 時之游離率係以對照組游離率表示，分別爲2 1.0 7、1 . 5 0 、9.00 及 23 _40。 相對於此’於實施例4中，於發生突變之人類血淸2 中添加生理食鹽水，測定添加此等標識藥物時之對照組游 離率。於表7中與表5同樣的順序表示游離率。對照組游 離率分別爲21.08、1.80' 21.40及27·23。比較兩者時得 知’僅Propranolol (PPL)之游離率差異2.3倍以上。因 爲PPL·係結合於AGP之部位A及部位B之藥物，認爲血 淸2係於AGP之結合部位A及部位B具有突變之血淸。 另外’將此方法經時實施時，亦可測定同一患者中之 血漿蛋白質之突變。 以上’雖然表示本發明之測定方法，亦可提供實施此 等測定方法用之試劑組。 -18- (16) 1330714

測定第一藥物與血漿蛋白質之結合部份時，係含有已 知與血漿蛋白質之結合部位之複數個第二藥物及正常對照 組血淸之試劑組。該試劑組因應需要，亦可構成爲一個另 有可超濾裝置之試劑組。作爲可超濾裝置之試劑組，可考 慮組合例如於底部具備有可分離血漿之孔徑之膜之容器及 分離用之可加上所需壓力之加壓裝置。於此容器中放入血 漿，加壓時，因爲可分離由容器底部除去血漿蛋白質之液 體成份，所以可測定血漿部份之放射能以及除去血漿蛋白 質之濾液成份之放射能。

測定血漿中蛋白質之突變程度時，係具有已知與正常 血漿蛋白質之結合部位及結合量之藥物及正常對照組血淸 之試劑組。此試劑組亦同樣地因應需要，亦可構成爲一個 另有可超濾裝置之試劑組。使應測定之血漿蛋白質與已知 與正常血漿蛋白質之結合部位及結合量之藥物反應，測定 血漿蛋白質與該藥物之結合程度，比較藥物與正常血漿蛋 白質之結合部位及結合量，而可測定該血漿蛋白質結合部 位突變之有無。 【實施方式】 實施例 以下係依據實施例，更詳細地說明本發明，但本發明 並不局限於此等實施例。 實施例1 :檢討依據同時測定2種核種之藥物之血漿 蛋白質結合部位之簡便測定法 -19- (17) (17)1330714

使用結合於人類血淸白蛋白（hsa )之部位I之 Warfarin (實驗中使用14C標識物：14C— WRF)、結合於 HSA之部位Π之Diazepam (實驗中使用l4C標識物：I4C 一 D Z P )、結合於α ,—酸性糖蛋白質（A G P )之酸性藥物 結合部位（部位A )及鹼性藥物結合部位（部位B )之 Propranolol (實驗中使用3h標識物：3H — PPL )以及主 要結合於AGP之部位B之Verapamil (實驗中使用3H標 識物：3H - VPM )，依據添加對於特定之血漿蛋白質具有 結合親和性之藥物，而檢討上述各標識藥物之取代效果。 對於特定之血漿蛋白質具有結合親和性之藥物，使用結合 於HSA之部位I之bucolome (BCL)、結合於HSA之部 位Π之Ibuprofen ( IPF)、結合於AGP之部位A及部位 B之Propranolol ( PPL )以及主要結合於AGP之部位B 之 Verapamil (VPM)(各試驗濃度：400# M)進行檢討 〇

健康成人男性之血液所分離之血清（人類血淸1: HAS=5.07g/dL，AGP=72.0mg/dL)及市售之人類血淸（ human pool serum ) ( cosmobio 製 Lot. No. 1 3 768 : HSA = 4.40g/dL，AGP=79.1 mg/dL)之 HSA 濃度，以 1/15M 磷酸緩衝溶液（ρΗ=7·4)稀釋成50〇βΜ。於此500// L 之血淸溶液中，添加20//L之對於特定之血漿蛋白質具有 結合親和性之藥物。此時，將各藥物以生理食鹽水溶解， 添加於血淸溶液成試驗濃度。作爲對照組溶液，係使用於 上述血淸溶液中，添加20// L之生理食鹽水以取代藥物溶 -20- (19) (19)1330714 顯示明顯的取代效果。同樣地’添加結合於H S A之部位 Π之IPF，僅結合於HSA之部位Π之14C-DZP明顯地被 取代。另一方面，添加對於AGP具有結合親和性之PPL 及VPM中，各3H標識物：3H—PPL及3H— VPM雖均顯 示高取代效果，但依據於AGP上之結合部位之親和性之 不同（3H — PPL爲AGP之部位A及部位B; 3H_VPM爲 AGP之部位B )，分別於對應之結合部位之取代效果，相 對地變高。因此，此同時測定2種核種法中，由對應所添 加藥物之血漿蛋白質結合部位之標識物之取代效果，確認 可簡便地決定該藥物之血漿蛋白質結合部位。另外，依據 使用本方法，分離測定有關2個結合部位之取代效果相異 之2種核種之放射線，因爲可由同一試驗血淸同時測定， 所以可以比傳統之血淸量少而測定。 表2中雖顯示與表1同樣地依據血淸之追加試驗結果 ’得到幾乎完整的再現性，顯示本測定法之高精度及信賴 性。 另外，即使使用人類血淸（human pool serum)時（ 表3) ’雖然取代效果的程度不同，但因爲有關血漿蛋白 質結合部位之對應係得到與人類血淸1相同的結果，所以 即使血漿蛋白質組成相異之血淸，確定本方法可廣泛性地 應用。 -22- (20) 1330714 表1 各標識藥物取代對於血漿蛋白結合之結合部位一 性的藥物之效果： 人類血淸1

藥物 主要的結合部位 標識藥物 合部位 ,4c-wrf ,4C-DZP 3H-PPL 3H-VPM HSA部位I HSA部位II AGP部位 A及B AGP部位B 對照組游離率(％) 0.96 2.10 10.88 35.95 BCL HSA部位1 游離率(％) 2.83 2.21 11.63 39.23 變化率(倍） 2.96 1.06 1.07 1.09 IPF HSA部位II 游離率(％) 0.97 3.57 10.47 36.56 變化率(倍） 1.02 1.70 0.96 1.02 PPL AGP部位A 游離率(％) 1.00 2.24 36.27 61.93 及部位B 變化率(倍） 1.04 1.07 3.33 1.72 VPM AGP咅[5位B 游離率(％) 1.06 2.31 33.50 65.37 變化率(倍） 1.11 1.10 3.08 1.82 -23- (21) (21)1330714 表2 各標識藥物取代對於血漿蛋白結合之結合部位一 性的藥物之效果： 人類血淸1之追加試驗 標識藥物 藥物 合部位 主要的結合部位^\ l4C-WRF ,4C-DZP 3H-PPL 3H-VPM HSA部位I HSA部位II AGP部位 A及B AGP部位B 對照組 游離率(％) 0.97 2.07 1.098 36.22 BCL HSA部位1 游離率(％) 2.75 2.24 11.55 39.41 變化率(倍） 2.83 1.09 1.05 1.09 IPF HSA部位II 游離率(％) 0.98 3.61 10.11 36.78 變化率(倍） 1.01 1.75 0.92 1.02 PPL AGP咅啦A 及部位B 游離率(％) 0.97 2.18 36.24 61.63 變化率(倍） 1.00 1.06 3.30 1.70 VPM AGP部位B 游離率(％) 1.05 2.25 33.32 81.63 變化率(倍） 1.09 1.09 3.03 2.25 -24 - (22) (22)1330714 表3 各標識藥物取代對於血漿蛋白結合之結合部位一 性的藥物之效果： 人類血淸(human pool serum ) ^標識藥物 藥物^合部位 主要的結合部位^\ ,4c-wrf ,4C-DZP 3H-PPL 3H-VPM HSA部位I HSA部位II AGP部位 A及B AGP部位B 對照組 游離率(％) 0.89 2.62 11.82 36.22 BCL HSA部位1 游離率(％) 2.58 2.98 12.41 36.67 變化率(倍） 2.89 1.14 1.05 1.01 IPF HSA部位II 游離率(％) 0.90 3.78 8.83 33.44 變化率(倍） 1.01 1.44 0.75 0.92 PPL AGP部位A 及部位B 游離率(％) 0.91 2.76 34.28 52.14 變化率(倍） 1.11 1.06 2.90 1.44 VPM AGP咅啦B 游離率(％) 0.99 2.78 29.90 60.12 變化率(倍） 1.11 1.06 2.53 1.66 -25- (23) (23)1330714 實施例2 :檢討依據同時測定4種核種之藥物之血漿 蛋白質結合部位之簡便測定法 使用結合於人類血淸白蛋白（HSA)之部位I之過鐯 酸（99mTc04_ )、結合於HSA之部位Π之Diazepam (實 驗中使用 MC標識物：14C 一 DZP )、結合於£^—酸性糖 蛋白質（AGP)之部位A及部位B之Propranolol (實驗 中使用3H標識物：3H—PPL)以及結合於HSA之部位Π 及AGP雙方之1251 — IMP，依據添加對於特定之血漿蛋白 質具有結合親和性之藥物，而檢討上述各標識藥物之取代 效果。對於特定之血漿蛋白質具有結合親和性之藥物，與 實施例1同樣地使用結合於HSA之部位I之bucolome ( BCL)、結合於HSA之部位Π之Ibuprofen(IPF)、結合 於AGP之部位A及部位B之Propran〇i〇i ( ppl )以及主 要結合於AGP之部位B之Verapamil ( VPM)(各試驗濃 度：400//M)進行檢討。 本實驗中，由健康成人男性之血液所分離之血淸（人 類血淸 1: HSA=5.07g/dL，AGP=72.0mg/dL)之 HSA 濃 度，以1/15M磷酸緩衝溶液（ρη=7·4)稀釋成500//M。 於此500 之血淸溶液中，同時添加4種核種之 "mTc04" (9.25xl0'2kBq/5^/L) > )4C-WRF( 3.7x10' 1 kB q/5 // L ) 'SH-VPMCQJSxlodkBq/SyL)及 125I_ IMP ( 1.85x10 iBq/SyL)之混合溶液，超濾前後之試樣 液量爲5 // L。另外’與實施例1同樣地作爲對照組溶液 係使用添加生理食鹽水者以取代藥物溶液者。另外，因爲 -26- (24) 1330714 於試驗溶液中含有上述之4種核種，除了使用液體閃爍計 數器（liquid scintillation counter ) ( Aloka 製 LSC -

5 10 0)，並使用 auto well gamma counter ( Aloka 製 ARC 一 3 8 0 )，利用r射線的能量設定而分離測定99mTc〇4-及 1251，並且對於由此等之計數率所求得之MC及3H，修正 因r射線之影響，而求出添加BCL、IPF、PPL及VPM後 之游離率及變化率。結果如表4所示。

如表4所示，於人類血淸1中，依據添加結合於η S A 之部位I之BCL ’僅已知結合於HSA之部位I之99mTc04 _顯示有意義的取代效果。同樣地，添加結合於HSA之部 位E之IPF，認爲對於結合於HSA之部位Π之"C—DZP 及1251 - IMP有取代效果。另一方面，添加對於AGP具有 結合親和性之P P L及V P Μ中，表示相同結合部位之3 Η — PPL及1251- IMP均顯示高取代效果。因此，即使此同時 測定4種核種法，由所添加對應藥物之血漿蛋白質結合部 位之標識物之取代效果，確認可更簡便地決定該藥物之血 漿蛋白質結合部位。本方法中，因爲可由同一個試驗血淸 ，依據分離測定及修正相異之4種核種之放射線，因爲可 同時測定有關4個結合部位之取代效果，僅以500 μ L之 稀釋血液就可測定主要的藥物結合部位。另外，基於同樣 的原理，同時使用可分離測定及修正之其他標識物，可由 同一個試驗血淸，得到更多有關血漿結合蛋白質結合之情 報。 -27- (25) 1330714 表4 各標識藥物取代對於血漿蛋白結合之結合部位一 性的藥物之效果： 人類血淸1

藥物 主要的結合部位 標識藥物 合部位 99mTc04- 14C-DZP 3H-PPL ,25i-imp HSA部位I HSA部位II AGP部位 A及B HSA部位II 及AGP 對照組游離率(％) 21.07 1.50 9.00 23.40 BCL HSA部位1 游離率(％) 25.14 1.50 9.00 23.75 變化率(倍） 1.19 1.01 1.00 1.02 IPF HSA部位II 游離率(％) 23.19 2.30 9.90 26.33 變化率(倍） 1.10 1.55 1.09 1.13 PPL AGP部位A 游離率(％) 22.70 1.60 29.30 30.60 及部位B 變化率(倍） 1.08 1.05 3.24 1.31 VPM AGP部位B 游離率(％) .20.58 1.20 27.80 31.34 變化率(倍） 0.98 0.80 3.08 1.34 -28- (26) (26)1330714 實施例3:檢討依據同時測定多種核種之藥物之取代 血漿蛋白質結合部位的效果 使用依據如實施例1所示之同時測定2種核種及實施 例2所示之同時測定4種核種之簡便測定法’關於 W 0 0 / 7 8 3 5 2號公報所舉例之認爲對於與第一藥物相同之血 漿蛋白質具有結合親和性之第二藥物之候補藥物之紅黴素 (ETM)以及特願2002— 267010號所舉例之胺基酸及胺 基酸輸液（以下稱爲取代藥物），檢討此等與血漿蛋白質 結合部位及取代效果。添加胺基酸之色胺酸（Trp ) 、N — 乙醯基色胺酸（NAT)、丙胺酸（AU)、天門冬酸（Asp )及羥苯基甘胺酸（HPG )(各試驗濃度：400 // Μ )，胺 基酸輸液之Proteamin 12Χ(ΡΤΑ)(試驗濃度：1/100) 於血淸溶液。 血淸係將健康成人男性之血液所分離之血淸（人類血 淸 1 : HSA = 5.07g/dL ’ AGP = 72.0mg/dL)及市售之人類 血淸(human pool serum ) (cosmobio 製 Lot. No. 13768 :HSA=4.40g/dL，AGP=79_1 mg/dL·)之 HSA 濃度，以 1/15M磷酸緩衝溶液（ΡΗ=7·4)稀釋成50〇；c/M使用。作 爲對照組溶液係使用添加生理食鹽水以取代藥物之溶液者 。使用人類血淸1時之結果如表5所示，人類血淸（ human pool serum )之結果如表6所示β 抗生物質之ETM作爲可安全地投予之取代藥物爲有 效的候補藥物，依據本測定法的結果（表6)確認對於於 A G P表不結合親和性之藥物爲有效的取代藥物。 * 29 - (27) 1330714

關於胺基酸及胺基酸輸液，雖然認爲Trp對於於HS A 之部位I具有親和性之藥物無有意義的取代效果’但顯示 對於於HSA之部位Π或AGP具有親和性之藥物爲有效的 取代藥物（表5 )。另外，確認即使對於於H S A之部位Π 及AGP二者具有親和性之藥物，亦可作爲有效取代藥物 蓮作（表5 )。另一方面，Trp之衍生物之NAT雖然對於 於HSA之部位具有親和性之藥物爲有效的取代藥物，但 對於於AGP具有親和性之藥物則表示減低些許游離濃度 之效果。Asp雖然對於於HSA之部位I及部位Π具有親 和性之藥物，未表示有意義的取代效果，但對於於AGP 具有親和性之藥物則爲有效的取代藥物，總而言之，顯示 對於於HSA之部位Π及AGP二者具有親和性之藥物，亦 可作爲有效取代藥物運作。另外，甘胺酸之衍生物之Η p g 對於於HSA之.部位Π或AGP具有親和性之藥物，表示減 低游離濃度之效果。雖然如上述顯示，各胺基酸作爲分別 具有結合位置特一性之取代藥物而作用，但如pTA之例 (表5 )所示’胺基酸混合物之胺基酸輸液係於任何Hs A 之部位I 、部位Π及AGP均表示取代效果，顯示可作爲 廣泛性使用取代藥物利用之可能性。 -30 - (28) 1330714 表5 人類血淸1中各取代藥物取代血漿蛋白質結合部 位之效果： 4種核種

標識藥物 々合部位 "mTc04· ,4C-DZP 3H-PPL 125i-imp HSA部位I HSA部位II AGP部位 A及B HSA部位II 及AGP 對照組游離率(％) 21.07 1.50 9.00 23.40 Trp 游離率(％) 22.28 3.50 18.40 32.59 變化率(倍） 1.06 2.36 2.03 1.39 Ala 游離率(〇/〇) 22.03 1.40 13.50 27.57 變化率(倍） 1.05 0.98 1.49 1.18 Asp 游離率(％) 21.69 1.40 18.00 29.47 變化率(倍） 1.03 0.92 1.99 1.26 PTA 游離率(％) 23.20 2.30 14.20 32.08 變化率(倍） 1.10 1.54 1.57 1.37 -31 - (29) (29)1330714 表6 人類血淸（human pool serum)中各取代藥物取 代血漿蛋白質結合部位之效果： 4種核種 標識藥物 合部位 藥物主要的結合部位 l4C-WRS 14c-dzp 3H-PPL 3H-VPM HSA部位I HSA部位II AGP部位 A及B AGP部位B 對照組游離率(％) 0.90 2.54 12.34 33.98 ETM 游離率(％) 0.88 2.67 23.79 54.78 變化率(倍） 0.99 1.04 1.93 1.61 Trp 游離率(％) 0.98 5.71 12.47 31.78 變化率(倍） 1.08 2.25 1.01 0.94 NAT 游離率(％) 0.97 3.08 11.54 34.19 變化率(倍） 1.07 1.21 0.94 1.01 HPG 游離率(％) 0.90 2.39 10.68 34.74 變化率(倍） 1.00 0.94 0.87 1.02 -32- (30) (30)1330714 實施例4 :依據同時測定多種核種，應用於診斷血漿 蛋白質突變體以及監控突變體血淸中藥物之血漿蛋白質結 合 使用如實施例2所示之依據同時測定4種核種之簡便 測定法，應用於鑑別診斷特定之血漿蛋白質爲突變體之血 淸。另外，檢討監控該血淸中藥物之蛋白質結合取代效果 之可能性。 血淸係將A G P爲突變體之成人男性之血液所分離之 血淸（人類血淸 2 : HSA = 4.88g/dL，AGP = 38.0mg/dL ) 之HSA濃度，以1/15M磷酸緩衝溶液（ρΗ=7·4)稀釋成 5 00 μ Μ使用。 對於特定之血漿蛋白質具有結合親和性之藥物係使用 與實施例2同樣地使用結合於HSA之部位I之bucolome (BCL )、結合於 HSA 之部位 Π 之 Ibuprofen ( IPF )、結 合於AGP之部位A及部位B之Propranolol ( PPL )以及 主要結合於AGP之部位B之Verapami] ( VPM )(各試驗 濃度：400；/ M)，檢討鑑別診斷有關AGP突變之應用性 «作爲對照組溶液係使用添加生理食鹽水以取代藥物溶液 者。結果如表7所示。 另一方面，作爲實施例3所選擇之取代藥物，添加胺 基酸之色胺酸（Trp )、丙胺酸（Ala )、及天門冬酸（ Asp )(各試驗濃度：400以Μ )，胺基酸輸液之 P rote amin 12Χ ( ΡΤΑ )(試驗濃度：1/100)於血淸溶液 ，監控此等取代血漿蛋白質結合部位之效果。其結果如表 -33- (31) (31)1330714 8所示。 人類血淸2係由藥物之血漿蛋白結合性而認爲AGP 爲突變體。表7中，添加對於AGP具有結合親和性之 PPL及VPM時，具有相同結合部位之3H-PPL之取代效 果吡實施例2所示之其他血淸爲低，對於1251 一 IMP之取 代效果亦很少。另一方面，依據添加結合於H S A之部位 I之BCL，結合於HSA之部位I之99mTc04_顯示有意義 的取代效果。另外，添加結合於H S A之部位Π之IP F，認 爲對於結合於HSA之部位Π之14C - DZP有取代效果， 但對於^5I- IMP則相反地促進結合之作用，亦即表示減 低游離濃度之效果。另外，添加此等對於HSA具有結合 親和性之BCL及IPF中，對於AGP表示結合之3H-PPL 及1251 — IMP之結合增加。如此地，依據臨床上應用此同 時測定多核種法顯示，由依據添加對於特定之血漿蛋白質 具有結合親和性之藥物之取代效果差異，可簡便地診斷該 血淸所含之血漿蛋白質有無突變。因爲本法中僅以5 00 // L之稀釋血液而可測定主要藥物之結合部位，顯示作爲 使用患者血淸之診斷係有效的。 另外’如此之血漿蛋白質變異時，即使通常的投藥， 表現嚴重副作用的可能性高。另外，併用WOO 0/7 8352公 報中所舉例之對於與第一藥物相同之血漿蛋白質具有結合 性之第二藥物或特願2002 — 267010號說明書中所舉例之 胺基酸及胺基酸輸液等之取代藥物時，監控各血淸中之取 代效果係重要的。表8係監控使用表7所示之人類血淸2 -34 - (32) 133〇714 之結果。即使與實施例3之結果相比較’表示完全相異的 取代效果，但因爲本法僅以500；aL之稀釋血液而可同時 測定有關全部的主要藥物結合，所以可依據各患者血淸而 應用於監控者。

-35- (33) (33)1330714 表7 以同時測定4種核種之各標識藥物對於血漿蛋白 結合之取代效果： 人類血淸2 標識藥物 合部位 取代藥物主要的結合 "mTc〇4_ ,4C-DZP 3H-PPL l25I-IMP HSA部位I HAS 咅位 II AGP部位 A及B HSA部位II 及AGP 對照組 游離率(％) 21.08 1.80 21.40 27.23 BCL HSA部位1 游離率(％) 27.42 1.90 18.40 25.72 變化率(倍） 1.30 1.07 0.86 0.94 IPF HSA部位II 游離率(％) 25.28 3.10 11.20 24.10 變化率(倍） 1.20 1.77 0.52 0.89 PPL AGP咅啦A 游離率(％) 17.23 2.30 38.70 27.85 及部位B 變化率(倍） 0.82 1.32 1.81 1.02 VPM AGP部位B 游離率(％) 20.42 1.90 34.80 30.52 變化率(倍） 0.97 1.08 1.63 1.12 -36-

Claims (1)

1330714 公告本 拾、申請專利範圍 --- 第92 1 30264號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國99年6月23日修正

1 . 一種測定方法，其係以一次的操作且在生物體外 (in vitro )測量與第一藥物的血漿蛋白質之結合部位的 方法，其特徵爲，將應測定與血漿蛋白質之結合部位之第 一藥物，與與血漿蛋白質之結合部位爲已知之具有相異的 結合部位之複數個第二藥物及血漿蛋白質反應，然後，關 於各第二藥物的游離率，藉由測量與第一藥物的非存在下 的游離率比較的變化，而測定與第一藥物的血漿蛋白質之 結合部位。 2.如申請專利範圍第1項之測定方法，其中複數個 第二藥物分別以相同或相異的物質標識。

3 ·如申請專利範圍第2項之測定方法，其中血漿蛋 白質爲來自人類或動物者。 4·如申請專利範圍第2項之測定方法，其中第一藥 物係以放射性核種、螢光性物質或色素所標識者》 5.如申請專利範圍第2項至第4項中任一項之測定 方法’其中血漿蛋白質爲血清白蛋白或酸性糖蛋白質，而 複數個第二藥物係與此等血漿蛋白質之相異結合部位結合 6·如申請專利範圍第2項之測定方法，其中複數個 弟二藥物係分別以相異之放射性核種所標識，該相異之放 1330714 射性核種係可以同時分離測定