WO2004032897A2 - Pharmazeutische zubereitungen, verwendung dieser zubereitung und verfahren zur erhöhung der bioverfügbarkeit von peroral zu applizierenden arzneistoffen - Google Patents

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Philip Lienau
Thomas Backensfeld
Andreas Reichel
Tanja Jung
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Schering Aktiengesellschaft
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers

Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical preparation which contains at least one emulsifier, at least one auxiliary emulsifier and / or solvent and at least one lipid, and to the use of the preparation according to the invention as an oral medicament and a method for increasing the bioavailability of medicaments to be administered orally.
  • medicinal substance is used synonymously with active substance and / or pharmacon and includes substances which have a main pharmacological effect and those which have no main pharmacological effect.
  • medicament is used synonymously with medicament and means that a pharmaceutical preparation which contains at least one medicinal substance is used for therapeutic, prophylactic and / or diagnostic purposes.
  • dosage form means the form to be applied, i.e. the dosage form of the drug, which also includes those dosage forms that have to be converted into the actual dosage form before use.
  • pharmaceutical preparation is used synonymously with the basic mixture, preconcentrate, formulation or active substance carrier system and contains pharmaceutical auxiliary substances which can control or support the medicinal substance effect, and possibly further basic substances, which are required for the production of pharmaceutical forms, ie dosage forms of preparations of pharmaceutical substances.
  • emulsifiers, auxiliary emulsifiers, solvents and lipids are pharmaceutical auxiliaries, emulsifiers and auxiliary emulsifiers belonging to the group of surfactants, ie they have a hydrophilic and a lipophilic fraction in the molecule.
  • emulsifiers as a whole are hydrophilic, ie they have an HLB (hydrophilic - lipophilic balance) value of>10;optimally> 12 on.
  • Auxiliary emulsifiers which are used in the sense of the invention are lipophilic in their entirety, ie they have an HLB value of ⁇ 10; optimally ⁇ 8.
  • solvents have the task of improving the solubility and self-emulsifiability of the existing phases of a formulation according to the invention.
  • organic solvents advantageously alcohols, polyethylene oxide glycols (PEG) and PEG modified, for example etherified PEG (Transcutol ® P) into consideration.
  • Smix surfactant mixture
  • substrate means at least one intestinal enzyme and / or an intestinal efflux system that substances, in particular drugs in the intestine, interact with the respective enzyme or efflux systems in such a way that they are metabolized and / or actively from the intestinal epithelium into the intestinal lumen be removed.
  • intestinal enzyme and / or intestinal efflux system stand for enzymes / efflux systems which occur, inter alia, in intestinal tissue and the absorption of pharmaceuticals there Prevent active substances at least partially and thus reduce bioavailability after oral administration.
  • inhibiting means that, in the presence of the preparation according to the invention or of the auxiliaries which are used for the preparation according to the invention, substrates of intestinal enzymes or intestinal efflux systems are metabolized to a lesser extent by these and / or actively by efflux systems Cells are removed.
  • bioavailability of drugs is defined as the total amount of drug that is systemically available in relation to the time.
  • the potential usefulness of drugs depends, among other things, on the bioavailability, so that there is a particular interest in pharmaceutical development in optimizing the bioavailability of drugs.
  • the bioavailability referred to in the sense of this invention is the speed and / or the extent to which the therapeutically, prophylactically or diagnostically effective part of a medicinal product is released and absorbed from a pharmaceutical form or becomes available at the site of action.
  • the bioavailability is measured via the concentration of the respective drug or its metabolite in body fluids, e.g. Blood, depending on the time.
  • the bioavailability of drugs that are absorbed in particular via the gastrointestinal tract depends on the solubility and thus the resorbability of the drugs.
  • the solubility of, in particular, highly lipophilic and / or poorly water-soluble drugs which consequently have a slow and incomplete drug release and / or absorption, e.g. increased by lipid-based formulations that promote the formation of dissolved phases and thus an increase in the bioavailability of these drugs.
  • US 5,391,377 A discloses a biphasic pharmaceutical composition consisting essentially of a long-lasting release component C 2 -C 2 fatty acids and a pharmaceutically active substance, preferably lipophilic drugs, as well as a non-long-lasting release component, a C 2 -C 2 fatty acid.
  • WO 94/09788 A1 discloses a pharmaceutical preparation which improves the solubility of HIV protease inhibitors by organic solvents, in particular alcohols, and, if appropriate, additionally by an acid.
  • US Pat. No. 5,342,625 A discloses a microemulsion preconcentrate and microemulsion containing cyclosporin, which is an oil-in-water emulsion (O / W emulsion) and is said to lead to higher bioavailability with a smaller inter- and intra-individual spread of the absorption levels.
  • EP 670715 B1 has disclosed an anhydrous pharmaceutical preparation consisting of a surfactant, a co-surfactant and a lipophilic phase as a solution to the problem.
  • these preparations In a pseudo-ternary phase diagram (emulsifier, lipid, water), these preparations have transparent, monophasic areas when water is added proportionately.
  • the disadvantage here is that the transparent, monophasic, water-dilutable area is limited to a water content of at most 70%, so that, in addition, with the so-called exit percentage, cloudiness of the system, in particular precipitation or crystallization of water-insoluble medicinal substance, and thus deteriorated absorption conditions of the medicinal substance prevail ,
  • the bioavailability of drugs to be administered orally is determined in particular in the gastrointestinal tract by enzymes of the first phase, for example from the superfamily of cytochrome P450 monooxygenases, in particular CYP-3A, or the 17 ⁇ -hydroxy-steroid hydrogenases (17ß-HSD, cf. in: SANO , T. et al., Clin. Sci. 2001, 101 (5): 485-491), in particular the 17 ⁇ -HSD 2 isoform, and the second phase, for example sulfatases.
  • the bioavailability of drugs to be administered orally is reduced by efflux systems located in the intestinal epithelium, in particular P-glycoprotein transporters (P-gp transporters).
  • No. 6,028,054 A increases the bioavailability of drugs by adding so-called “bioenhancers” which reduce gastrointestinal metabolism and / or re-ejection by efflux systems.
  • bioenhancers are added to pharmaceutical preparations as further constituents and consist, for example, of from two coplanar, aromatic rings with positive charge.
  • US Pat. No. 6,121,234 A discloses the addition of essential oils to a pharmaceutical preparation which contains hydrophobic pharmaceutical substances, an inhibition of the enzymes of the cytochrome P450-3A group and of the efflux systems being based on the essential oils.
  • WO 99/11290 A1 and WO 01/003695 A1 each disclose an addition of bile acid propyl ester and vitamin C fatty acid ester, in particular vitamin C palmitate, to a pharmaceutical preparation which increases the bioavailability by inhibiting enzymes of the cytochrome P450 3A- , reach group. Furthermore, in the finished drug product Kaletra ® with the active ingredient lipinavir, which is subject to a high enteral first-pass metabolism and is transported abroad by P-gp transporters, ritonavir is added as an adjuvant (Rote Liste, 2002) Concentration of 1/6 of its therapeutic dose reduces enteral and probably also hepatic metabolism and outward transport by the Lopinavir P-gp transporters.
  • One solution to reduce the high oxidative metabolism rate of secondary beta groups by the 17 ⁇ -HSD 2 is to sterically stabilize the sterane structure e.g. due to chemical substituents in the 17 ⁇ position, cf. et al To achieve ethinyl estradiol.
  • the invention is therefore based on the object of developing a pharmaceutical preparation for oral administration which on the one hand the solubility of lipophilic drugs in particular when spontaneously diluted with a hydrophilic medium, such as e.g. the intestinal fluid or purified water, and furthermore a reduction in the bioavailability of lipophilic and / or hydrophilic drugs by intestinal metabolism, in particular by 17 ⁇ -HSD2 and / or CYP-3A4, and / or by an active outward transport from the Counteracts intestinal cells through intestinal efflux systems, especially P-gp transporters (MDR1) or MRP2 proteins.
  • a hydrophilic medium such as e.g. the intestinal fluid or purified water
  • This object is achieved according to the invention by a preparation which contains at least one emulsifier, at least one auxiliary emulsifier and / or solvent and at least one lipid, characterized in that the mass ratio of emulsifier to auxiliary emulsifier and / or solvent (Smix) is 1: 1 to 9: 1 and the total lipid content is> 0% (m / m), this preparation at least partially inhibiting at least one intestinal enzyme and / or at least one intestinal efflux system.
  • EMSES enzyme-modulating-self-emulsifying system
  • the object is achieved by using a pharmaceutical preparation according to the invention for the production of a perloral pharmaceutical means, wherein this preparation at least partially inhibits at least one interstinal enzyme and / or at least one interstinal efflux system.
  • the object is achieved according to the invention by a method for increasing the bioavailability of drugs to be administered orally, a pharmaceutical preparation according to the invention containing a drug and being administered orally.
  • An advantage of the pharmaceutical preparation according to the invention is that it improves the solubility of lipophilic and / or water-insoluble drugs compared to the prior art and at the same time at least partially reduces the metabolism of drugs by intestinal enzymes and / or the active outward transport by intestinal efflux systems.
  • an active ingredient-free pharmaceutical preparation can serve as a carrier system for various medicinal substances which have the aforementioned profiles, i.e. are lipophilic and / or are metabolized by intestinal enzymes and / or are actively transported from the intestinal epithelium back into the intestinal lumen by intestinal efflux systems, and time-consuming and costly drug formulation developments can thus be omitted.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention due to a very low proportion of a hydrophilic phase, is furthermore suitable for producing oral dosage forms, in particular capsules, advantageously gelatin capsules or tablets.
  • the present invention also follows the basic rules of pharmaceutical formulation development, namely to limit excipients to a minimum, both qualitatively and quantitatively.
  • a preferred embodiment of the invention is that the smix is 3: 1 to 9: 1, advantageously 9: 1 and the total lipid content is 10 to 50% (m / m).
  • the emulsifier is PEG-40 hydrogenated castor oil (Cremophor ® RH40), PEG-35-castor oil (Cremophor ® EL) or PEG-400-Monorizinoleat (Estax ® 54), the auxiliary emulsifier or Solvent Glyceryl monocaprylate> 80% (m / m) (lmwitor ® 308) or diethylene glycol monoethyl ether (Transcutol ® P) and which contains lipid triglycerides, fatty oils or waxes.
  • the emulsifier is PEG-40 hydrogenated castor oil (Cremophor ® RH40), PEG-35-castor oil (Cremophor ® EL) or PEG-400-Monorizinoleat (Estax ® 54), the auxiliary emulsifier or Solvent Glyceryl monocaprylate> 80% (m / m) (lmwitor ® 308) or diethylene
  • Particularly preferred triglycerides containing medium-chain triglycerides such as Miglyol ® 812 (C_-C12 triglycerides)
  • preferred fatty oils include castor oil, olive oil, corn oil, soybean oil, sunflower seed oil, peanut oil, walnut oil or safflower oil, most preferably castor oil and preferred waxes include ethyl oleate or isopropyl myristate.
  • the preparation according to the invention additionally contains at least one pharmaceutical substance.
  • Medicinal products which come from the group of therapeutic agents, prophylactic agents or diagnostic agents and are preferably formulated with the preparation according to the invention are either lipophilic and / or water-insoluble or alternatively hydrophilic.
  • Lipophilic drugs are preferably formulated with the preparation according to the invention, particularly preferably drugs that are substrates of at least one intestinal metabolizing enzyme and / or an intestinal efflux system.
  • those drugs are advantageously formulated which are substrates of the 17 ⁇ -hydroxy-steroid dehydrogenases or the cytochrome P450 monooxygenases, with particular advantage from the group of the cytochrome P 450 3A monooxygenases (CYP3A4) or substrates of a P-gp - Transporter systems are.
  • substrate means at least one intestinal enzyme and / or an intestinal efflux system, that these substances, for example drugs or pharmaceutical auxiliaries, interact with and are metabolized by intestinal enzymes and / or by interaction with intestinal efflux systems are actively transported through them from the intestinal epithelium back into the intestinal lumen.
  • a very particularly preferred embodiment of the preparation according to the invention is represented by steroids as medicinal substances, advantageously those which have a secondary hydroxyl group in position 17 of the sterane skeleton and of which particularly preferably estrogens, antiestrogens or androgens.
  • Drugs that are substrates of 17ß-HSD are listed below, but are not limited to the list, they also contain salts and / or derivatives of these drugs:
  • Drugs and drug groups that are lipophilic and / or substrates of cytochrome P450 monooxygenases are listed below, but are not limited to this list, they also include salts and / or derivatives of these drugs:
  • Drugs and drug groups that are substrates of P-gp transporters are listed below, but are not limited to the list, they also contain salts and / or derivatives of these drugs:
  • a preferred embodiment of the use of the preparation according to the invention is that the use of enzymes from the group of cytochrome monooxygenases, preferably from the group of cytochrome P450-3A monooxygenases, or 17 ⁇ -hydroxy-steroid dehydrogenases and / or as an intestinal efflux system, P-gp transporters are at least partially inhibited.
  • the ability of the pharmaceutical preparation according to the invention to increase the solubility of lipophilic phases such as triglycerides, fatty oils or waxes, ie to make them water-dilutable, is shown by means of pseudotemary phase diagrams (cf. Example 3; FIGS. 1a, 1b).
  • active ingredient-free preparations containing emulsifier, auxiliary emulsifier and / or solvent and lipid, gradually diluted with a hydrophilic medium, eg water.
  • a hydrophilic medium eg water.
  • the assessment criteria are clear / cloudy and single / multi-phase. Clear to opalescent, single-phase systems were made visible in the pseudo-phase diagrams (see Fig. 1a and 1b) depending on their occurrence at 25 ° C or 37 ° C.
  • Excipients which are preferably used for the pharmaceutical preparation according to the invention, also have an ability to at least partially inhibit intestinal enzymes or interstinal efflux systems.
  • the suitability of pharmaceutical auxiliaries for the preparation according to the invention generally increases with increasing inhibition. Such potentials can be determined using test systems known to those skilled in the art.
  • the test formulation is the pharmaceutical preparation in Example 2a), prepared according to the invention containing 2.5% AE2, Cre mophor ® EL and Transcutol ® P, S mix. 9: 1, 20% (m / m) Miglyol ® 812 po administered.
  • FIG. 4 shows that the formulation of AE2 according to the invention has a 26% increased bioavailability compared to this po Reached 20% HP-ß-CD solution. From this it can be seen that formulations according to the invention are suitable for increasing the bioavailability of steroids in particular.
  • auxiliary substances to inhibit human cytochrome P450 isoenzymes is determined by means of a CYP test (cf. Example 7).
  • the inhibition of the enzymes is characterized by the concentration (IC 50 , ⁇ g / ml) of the auxiliary substances, at which 50% of the respective isoenzymes are inhibited.
  • concentration (IC 50 , ⁇ g / ml) of the auxiliary substances at which 50% of the respective isoenzymes are inhibited.
  • IC 50 concentration
  • CYP3A4 are selectively inhibited by the auxiliaries according to the invention.
  • the excipients according to the invention have at least one IC 50 ⁇ 1000 on at least one CYP isoenzyme, advantageously an IC 50 100 100, ie they have medium activity, and particularly advantageously an IC 50 10 10, ie they have strong activity.
  • the ability of auxiliaries to inhibit P-gp transporters is determined using a P-gp transporter test (see Example 8).
  • the Activity inhibiting the transporter characterized by the ratio (R), which indicates the ratio of fluorescence intensity of the test solution to the fluorescence intensity of the blank and is directly proportional to inhibition of the P-gp transporter.
  • Fluorescence intensity test solution corresponds to the fluorescence intensity, measured at 485/535 nm (excitation or emission), of the cells containing the test solution and CaIceinAM working solution.
  • Fluorescence intensity Blank corresponds to the fluorescence intensity, measured at 485/535 nm (excitation or emission), of the cells that do not contain a test solution but contain CaIceinAM working solution and thus serve as an O value.
  • Auxiliaries which have a ratio> 1, 18, advantageously> 1, 6 and with particular advantage> 2.1 are preferably suitable for inhibiting the active outward transport of medicinal products by intestinal efflux systems, in particular by P-gp transporters, and becoming one To increase the drug bioavailability, in which case the drug substrates of the P-gp
  • excipients are thus preferably suitable to serve as excipients for the pharmaceutical preparations according to the invention.
  • the pharmaceutical preparations according to the invention can, due to their high water-dilutability and thus their good solubility of in particular lipophilic drugs, as well as their ability to inhibit intestinal enzymes and / or the active outward transport by intestinal efflux systems, be used as a technology platform for a wide variety of drugs, in particular those mentioned above , Table 4 shows the formulations according to the invention which are preferably used for this. Table 5 shows possible drug loading of selected pharmaceutical formulations according to the invention.
  • Fig. 2d Test on self-emulsification of a mixture containing 2% E2, Cremophor ® EL and Transcutol ® P, Smix 9: 1, 10 to 60% (m / m), MiglyoI ® 812. symbol of visual evaluation: o; Particle size symbol determined using PCS (double values): -
  • Y-axis percentage of AE2 (symbol: dark bar) and ketone metabolite of AE2 (symbol: longitudinal strip)
  • X-axis percentage of the formulation according to the invention.
  • a pharmaceutical preparation according to the invention corresponds holding Cremophor ® EL, Transcutol ® P and Miglyol ® manufactured 812th
  • This pharmaceutical preparation basic mixture, is then checked visually for clarity and homogeneity (see above).
  • Imwitor ® 30 ⁇ must be converted into a flowable form by heating to 40 ° C on a heatable magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K) before use.
  • 0 g Miglyol ® 1 is added 812 to the mixture and stirred for 5 minutes at 500 rpm in the above-mentioned magnetic. This basic mix is made visually for clarity and
  • Cremophor ® RH40 produced 812, Transcutol ® P and Miglyol ®.
  • Cremophor ® RH40 must be converted into a flowable form by heating to 40 ° C on a heatable magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K).
  • all auxiliary substances must be shaken well before they are used.
  • Cremophor ® RH40 Before use, Cremophor ® RH40 must be converted into a flowable form by heating to 40 ° C on a heatable magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K). In addition, all auxiliary substances must be shaken well before they are used. 3.6 g Cremophor ® RH40 and 400 mg Transcutol ® P on a "Genius" - weighed analytical balance (Sartorius, Göttingen) in a beaker and mixed for 5 minutes at 500 rpm on a magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K). The homogeneity and clarity is checked visually (see Example 1 a). Then 1.0 g of refined castor oil is added to the mixture and stirred for 5 minutes at 500 rpm on the above-mentioned magnetic stirrer. This basic mix is made visually for clarity and
  • Cremophor ® RH40 5 g of a pharmaceutical preparation according to the invention containing Cremophor ® RH40, Transcutol ® P and ethyl oleate produced.
  • Cremophor ® RH40 must be converted into a flowable form by heating to 40 ° C on a heatable magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K). In addition, all auxiliary substances must be shaken well before they are used.
  • 3.6 g of Cremophor ® RH40 and 400 mg of Transcutol ® P are weighed out on a "Genius" analytical balance (Sartorius, Göttingen) in a beaker and for 5 minutes at 500 rpm on a
  • Magnetic stirrer Heidolph MR 3001 K mixed. The homogeneity and clarity is checked visually (see Example 1a). Then 1.0 g of ethyl oleate is added to the mixture and for 5 minutes at 500 rpm on the above-mentioned magnetic stirrer stirred. This basic mixture is checked visually for clarity and homogeneity (see Example 1 a).
  • k) 5 g of a pharmaceutical preparation according to the invention corresponds holding Cremophor ® RH40, lmwitor ® 308 and Miglyol ® 812 manufactured.
  • Imwitor ® 30 ⁇ must be converted into a flowable form by heating to 40 ° C on a heatable magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K) before use. For this, all auxiliary substances must be shaken well before they are used.
  • Imwitor ® 308 must be converted into a flowable form before use by heating to 40 ° C on a heatable magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K). For this purpose, all auxiliaries are shaken well before use.
  • 3.6 g Cremophor ® EL and 400 mg lmwitor ® 308 are weighed into a beaker on a "Genius" analytical balance (Sartorius, Göttingen) and mixed for 5 minutes at 500 rpm on a magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K).
  • This preparation is visually checked for clarity and homogeneity, that is to say that the beaker is held in front of a light source, alternatively in front of a black background, and the contents of the beaker have no visually perceptible cloudiness or floating particles and different phases. Then 1.0 g of ethyl oleate are added to the mixture and stirred for 5 minutes at 500 rpm on the above-mentioned magnetic stirrer.
  • This pharmaceutical preparation, basic mixture is then checked visually for clarity and homogeneity (see above). Examples 1a) -n) can therefore be characterized with a smix of 9: 1 and a lipid content (m / m) in the basic mixture of 20%.
  • auxiliary composition result on the one hand by replacing the lipid phase by the amphiphilic phase (Smix) so that the composition contains, for example, 10% MCT (Miglyol ® 812) in the basic mixture, or by replacing the proportion of emulsifier mixture (Smix ) by the MCT used.
  • the basic mixture would then typically contain 30%, 40% or 50% of the total lipid content.
  • smix by changing the smix to 3: 1 or 1: 1, further combinations can be created in the same way, which are suitable as preparations according to the invention.
  • Example 2 Production of pharmaceutical preparations containing active ingredients
  • estradiol (E2) 10.0 mg of 1,3,5 (10) -estratrien-3,17 ⁇ -diol x AH 2 0, hereinafter called estradiol (E2), are added to 5 g of the pharmaceutical preparation from Example 11) and so long on a magnetic stirrer (Heidolph MR 3001 K) until the active ingredient has clearly dissolved in the formulation (check for clarity, see Example 1a).
  • a magnetic stirrer Heidolph MR 3001 K
  • heat is added to the above-mentioned magnetic stirrer while stirring to approx. 40 ° C. After 24 hours, the clarity of the system is checked again (see Example 1 a).
  • Example 1b are each 1, 0 g of the base mixtures according to the invention analogously to Example 1b) containing Cremophor ® EL, lmwitor ® 308 (Smix. 9: 1) and Miglyol ® 812 [varying the total lipid content of 0-100% (m / m)], and . analogously to Example 1a) containing Cremophor ® EL, Transcutol ® P (Smix 3: 1) and Miglyol ® 812 [varying the total lipid content of 0-100% (m / m)], in each case a magnetic stirrer in each case a 16 ml test tube with a ground glass given.
  • FIGS. 1a and 1b show that in particular basic mixtures according to the invention with a smix of 9: 1 up to a total lipid content of 50% (m / m) and basic mixtures according to the invention with a smix of 3: 1 up to a total lipid content of 30% (m / m) in the water-free basic mixture up to at least 90% (v / v + w) total water content having a clear and homogeneous emulsion are therefore suitable for the pharmaceutical preparations according to the invention.
  • the release vessel is cleaned with demineralized water before the experiment and rinsed with purelab ® water at the end of the cleaning procedure.
  • the dilutions are visually graded after 10 minutes and, on the other hand, the particle size is determined using PCS (cf. FIG. 2a).
  • the particle size measurement by PCS takes place at a measuring temperature of or 37 ° C. 1, 46 served as the angle of refraction of the dispersed phases.
  • the viscosity value of these highly diluted systems was left in the basic setting of the device (viscosity value for water depending on the temperature).
  • compositions with 10-40% (m / m) lipid in the pre-concentrate are preferred because they have clear to bluish-shimmering dispersions (visual assessments of 1 and 2) with particle sizes of ⁇ 200 nm.
  • compositions with 10-50% (m / m) lipid in the preconcentrate are particularly preferred, since they give clear dispersions (visual assessments of 1) and particle sizes of ⁇ 100 nm and therefore of them it can be assumed that the active ingredient is available in a dissolved form.
  • Example 2b 500 mg each of the active substance-containing basic mixture prepared as in Example 2b), comprising 2.0% (m / m) E2, Cremophor®EL and Transcutol®P, Smix 9: 1, and a respective total lipid content of 10, 20 .
  • compositions with 10-40% (m / m) lipid in the pre-concentrate are preferred, since they give clear to bluish-shimmering dispersions (visual assessments of 1 and 2) and particle sizes of ⁇ 200 nm; Particularly preferred are compositions with 10-30% (m / m) lipid in the preconcentrate, which give clear dispersions (visual assessments of 1) and particle sizes of ⁇ 100 nm, since it can be assumed that the active ingredient in a dissolved form for
  • compositions with 40 and 50% (m / m) lipid in the pre-concentrate are preferred, since they give clear to bluish-shimmering dispersions (visual assessments: 2) and particle sizes of ⁇ 200 nm. In these cases it can be assumed that the active substance is available in a dissolved form.
  • Na phosphate buffer 100 mM Na 2 HPO 4 x 2H 2 0 and 100 mM NaH 2 PO 4 x H 2 0
  • test substance solution of AE2 AE2 50 ⁇ M in MeOH (in the test batch 0.3 ⁇ M) formulation batches of the above-mentioned formulation according to the invention (% m / v) :
  • Cofactor solution 2 mL glucose-6-phosphate (160mM) / MgCl 2 (80mM) mix are added to 400 ⁇ L of a glucose-6-phosphate dehydrogenase solution, then 15.6 mg NADP and 13.4 mg NAD added.
  • Microsome solution Intestinal microsomes (InVitroTechnologies; protein content: 24 mg / mL; CYP450 content: 0.058nmol / mg protein) Thawed in a water bath at 37 ° C ( ⁇ 60sec) and to a concentration of 5 mg / mL protein with Na Diluted phosphate buffer.
  • the samples are stored by HPLC at ⁇ -20 ° C for approx. 24 h and centrifuged at 3000 rpm before the HPLC analysis, the supernatant being measured.
  • the concentrations of AE2 and 17 ketone product of AE2 measured by HPLC are shown in FIG. 3.
  • HPßCD solution used 20.0 g of hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HPßCD) are dissolved in 90 ml of water for injections. 1.6 ml of a 1 N HCl solution are added to the cyclodextrin solution. Then 2.0 g of AE2 are weighed into the aqueous cyclodextrin solution and dissolved at room temperature. 0.2 g NaCI and 0.242 g trometamol are weighed out and dissolved in the active ingredient-containing cyclodextrin solution. With 1 N HCI is on pH 7.4 adjusted. It is made up to a final volume of 100.0 ml with water for injections and shaken. The solution is filtered through a 0.2 ⁇ m membrane filter and 20 min. autoclaved at 121 ° C.
  • Formulation preparation analogously to Example 2a) was prepared containing 2% (m / m) AE2, Cremophor ® EL and Transcutol ® P, Smix 9: 1, 20% (m / m) Miglyol ® 812 used dose: iv 5 mg / kg AE2 in 20% HPßCD solution po 10 mg / kg AE2 in 20% HPßCD solution or formulation according to the invention
  • the trial lasted for 3 days.
  • Part 1 Serum collection 30 minutes after taking blood
  • Jeil 2 centrifugation of the precipitated serum (see Part 1) at 5000g for 5 min;
  • Incubation buffer Potassium phosphate buffer, pH 7.4 (KP buffer)
  • Stop solution Acetonitrile / Tris Base 0.5 M, ⁇ O / 20 (V / V)
  • Test substances Cremophor ® EL, Cremophor ® RH40, Estax ® 54, Miglyol ® 812, raff. Castor oil, Transcutol ® P, ethyl oleate, Imwitor ® 308, Tween ® ⁇ 0, 20% HPßCD solution (preparation described in Ex. 6), formulation according to the invention from Ex. 1 a), and Ex. 1d)
  • the incubations are set up in 96-well plate format with a total volume of 200 ⁇ l in duplicate.
  • the background batch controls the fluorescence of the batch without enzyme and formulation according to the invention, the intrinsic fluorescence of the substances is determined in the buffer dilution.
  • the preparation The dilution and pipetting scheme correspond to the original instructions of the test kit manufacturer (Gentest Corp., Woburn, MA, USA).
  • the batches are started by adding the enzyme / substrate mixture, shaken for 30 or 45 minutes in an incubator at 37 ° C., then interrupted with 50 ⁇ l stop solution. The plates are shaken briefly and the fluorescence intensity is measured in the plate fluorescence reader at the wavelengths for excitation or emission.
  • the origin of the fluorescent product forms the basis for the calculation.
  • the comparison of the substrate turnover in the presence or absence of the formulation according to the invention indicates an inhibition of the cytochrome P450 isoenzyme.
  • the IC 50 value is calculated from the concentration-dependent inhibition.
  • Enzyme mixture glucose-6-phosphate (G6P) 0.4 mM MgCl 2 0.4 mM
  • G6Pdehydrogenase (G6PD) 0.2 lU / ml
  • Enzyme mixture glucose-6-phosphate (G6P) 0.4 mM MgCl 2 0.4 mM
  • G6Pdehydrogenase (G6PD) 0.2 lU / ml
  • Enzyme mixture glucose-6-phosphate (G6P) 0.4 mM MgCl 2 0.4 mM
  • G6Pdehydrogenase 0.2 lU / ml Recombinant human CYP450-2C19.1, 5 pmol / batch
  • Substrate 3-cyano-7-ethoxycoumarin (CEC) 25 ⁇ M
  • Pos.Control tranylcypromine 0.045 - 100 ⁇ M
  • the following auxiliaries are tested for their ability to inhibit human, intestinal P-gp transporters: Cremophor ® EL, Estax ® 54, Cremophor ® RH40, raff. Castor oil, PEG 400, Imwitor ® 308, Transcutol ® P, Miglyol ® .
  • MATU cell lines (Max Dellbrück Center (MDC) - Berlin book; 40,000 cells / well / 200 ⁇ l) are first placed in a microtiter plate (Greiner black 96-well plates, clear bottom, sterile), given.
  • MDC Max Dellbrück Center
  • the cells are cultured for 3 days with medium containing adriamycin (ADR) and then switched to medium free of ADR.
  • ADR adriamycin
  • the culture medium contains 500 ml RPMl (2.0 g / l NaHCO 3 ; w / o L-glutamine, w / o phenol red, article no .: F1275, Biochrom, Berlin), 5 ml PenStrep ® (10,000 U penicillin , 10000 ⁇ g / ml streptomycin, article no .: A2213, Biochrom, Berlin), 5 ml L-glutamine (200 mM, article no .: K02 ⁇ 3, Biochrom, Berlin), 50 ml FCS (article no .: S 0115, Fa Biochrom, Berlin) and 50 ⁇ l doxorubicin (1 ⁇ g / ⁇ l).
  • RPMl 2.0 g / l NaHCO 3 ; w / o L-glutamine, w / o phenol red, article no .: F1275, Biochrom, Berlin
  • 5 ml PenStrep ® 10,000 U penicillin ,
  • the incubation buffer Hepes carbonate buffer, pH 7.2, contains 12 ⁇ , 1mM NaCl, 5.4 mM KCI, 1, 0 mM MgSO 4 x 7 H 2 O, 1, ⁇ mM CaCI 2 x 2 H 2 O, 1 , 2 mM Na 2 HPO 4 x 7 H 2 0, 0.4 mM NaH 2 PO 4 x H 2 O, 15.0 mM Hepes, 20.0 mM glucose, 4.2 mM NaHCO 3 .
  • the cells differentiated in 96-well microtiter plates are first washed twice with the incubation buffer.
  • the microtiter plate is now divided into zones. 1 ⁇ 0 ⁇ l of the respective test solution per well are added to a zone and the entire microtiter plate is preincubated at 37 ° C. for 30 min.
  • the test solutions have concentrations of 0.3 to 33.3 ⁇ M of the test substances.
  • a 33.3 ⁇ M concentrated Cremophor ® EL test solution is made from a 30 mM stock solution of the excipient in DMSO, which is diluted 1: 901 with incubation buffer to 33.3 ⁇ M and thus gives a concentration of 30 ⁇ M, the sum of Concentration of DMSO in the batch does not exceed 0.2% (v / v). Dilutions are made analogously. Test solutions for the above-mentioned auxiliaries are prepared analogously.
  • the CaIceinAM working solution (20 ⁇ L / well) is then added to all wells, ie to those with and without the test solution. The plates are shaken carefully and incubated at 37 ° C for a further 30 min.
  • the CaIceinAM working solution is diluted to 10 ⁇ M CaIceinAM working solution by diluting a 1 mM CalceinAM stock solution in DMSO with incubation buffer. After incubation, the fluorescence in a fluorescence plate reader is (Fluostar ®, B & L Systems, Maarssen) at 465/535 nm (excitation or emission on) measured.
  • Fluorescence intensity test solution corresponds to the fluorescence intensity, measured at 485/535 nm (excitation or emission), of the cells containing the test solution and CaIceinAM working solution.
  • Fluorescence intensity Blank corresponds to the fluorescence intensity, measured at 485/535 nm (excitation or emission), of the cells that do not contain a test solution but contain CaIceinAM working solution and thus serve as a 0 value.

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Abstract

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zubereitungen enthaltend mindestens einen Emulgator, mindestens einen Hilfsemulgator und/oder Solvent sowie mindestens ein Lipid, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenverhältnis von Emulgator zu Hilfsemulgator und/oder Solvent (Smix) 1:1 bis 9:1 und der Gesamtlipidanteil > 0 % (m/m) beträgt, wobei diese Zubereitung mindestens ein intestinales Enzym und/oder mindestens ein intestinales Effluxsystem zumindest teilweise inhibiert. Diese Zuberreitungen können verwendet werden, um die Bioverfügbarkeiten von Arzneistoffen, die lipophil und/oder Substrate von intestinalen metabolisierenden Enzymen und/oder intestinalen Effluxsystemen sind, insbesondere Steroide zu erhöhen.

Description

Pharmazeutische Zubereitungen, Verwendung dieser Zubereitung und Verfahren zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit von peroral zu applizieren- den Arzneistoffen
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, die mindestens einen Emulgator, mindestens einen Hilfsemulgator und/oder Solvent und mindestens ein Lipid enthält, sowie der Verwendung der erfindungsgemäßen Zubereitung als perorales Arzneimittel und ein Verfahren zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit von peroral zu applizierenden Arzneistoffen.
Folgende technischen Begriffe werden im Sinne dieser Erfindung gemäß nachfolgender Definition verwendet.
Im Sinne dieser Erfindung wird der Begriff Arzneistoff synonym zu Wirkstoff und/oder Pharmakon verwendet und beinhaltet Stoffe, die eine pharmakologi- sche Hauptwirkung aufweisen, sowie solche, die keine pharmakologische Hauptwirkung aufweisen.
Im Sinne der Erfindung wird der Begriff Arzneimittel synonym zu Medikament verwendet und bedeutet, dass eine pharmazeutische Zubereitung, die mindestens einen Arzneistoff enthält, der zu therapeutischen, prophylaktischen und/oder diagnostischen Zwecken verwendet wird.
Im Sinne dieser Erfindung bedeutet Arzneiform die zu applizierende Form, d.h. die Darreichungsform des Arzneimittels, wobei hierunter auch solche Darreichungsformen fallen, die vor Anwendung noch in die eigentliche Darreichungsform überführt werden müssen.
Im Sinne dieser Erfindung wird pharmazeutische Zubereitung synonym zu Grundmischung, Präkonzentrat, Formulierung oder Wirkstoffträgersystem verwendet und enthält pharmazeutische Hilfsstoffe, welche die Arzneistoffwirkung steuern bzw. unterstützen können, sowie möglicherweise weitere Grundstoffe, die für eine Herstellung von Arzneiformen, d.h. Darreichungsformen von Zubereitungen von Arzneistoffen, benötigt werden.
Im Sinne dieser Erfindung sind Emulgatoren, Hilfsemulgatoren, Solvent und l_i- pide pharmazeutische Hilfsstoffe, wobei Emulgatoren und Hilfsemulgatoren zur Gruppe der Tenside gehören, d.h. sie besitzen einen hydrophilen und einen li- pophilen Anteil im Molekül. Im Sinne der Erfindung sind Emulgatoren in ihrer Gesamtheit hydrophil, d.h. sie weisen einen HLB (Hydrophile - Lipophile Balance) Wert von > 10; optimaler Weise > 12 auf. Hilfsemulgatoren, die im Sinne der Erfindung zur Anwendung kommen sind in ihrer Gesamtheit lipophil, d.h. sie weisen einen HLB Wert von < 10; optimaler Weise < 8 auf. Im Sinne der Anmeldung haben Solvente die Aufgabe die Löslichkeit und die Selbstemulgier- barkeit der vorhandenen Phasen einer erfindungsgemäßen Formulierung zu verbessern. Es kommen insbesondere organische Lösungsmittel, mit Vorteil Alkohole, Polyethylenoxidglykole (PEG) und modifizierte PEG, z.B. veretherte PEG (Transcutol®P) in Betracht.
Im Sinne der Anmeldung gibt Smix (surfactant mixture) das Massenverhältnis von Emulgator zu Hilfsemulgator wieder.
Im Sinne dieser Erfindung bedeuten in den Angaben (v/v+m), (m/v) oder (m/m) m = Masse und v = Volumen.
Im Sinne dieser Erfindung bedeutet Substrat mindestens eines intestinalen En- zyms und/oder eines intestinales Effluxsystems, dass Stoffe, insbesondere Arzneistoffe im Intestinum mit dem jeweiligen Enzym oder Effluxsystemen so inter- agieren, dass sie metabolisiert und/oder aktiv aus dem Darmepithel in das Darmlumen ausgeschleust werden.
Im Sinne dieser Anmeldung stehen die Begriffe intestinales Enzyms und/oder intestinales Effluxsystems für Enzyme/Effluxsysteme, die unter anderem in in- testinalem Gewebe vorkommen und dort die Absorption von pharmazeutischen Wirkstoffen zumindest teilweise verhindern und damit eine Bioverfügbarkeit nach peroraler Gabe vermindern können.
Im Sinne dieser Erfindung bedeutet inhibieren, dass in Anwesenheit der erfin- dungsgemäßen Zubereitung oder der Hilfsstoffe, die für die erfindungsgemäße Zubereitung verwendet werden, Substrate von intestinalen Enzymen oder in- testinalen Effluxsystemen durch diese in geringerem Maße metabolisiert werden und/oder aktiv durch Effluxsysteme aus Zellen ausgeschleust werden. Im Sinne dieser Erfindung ist Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen als der Ge- samtarzneistoffanteil definiert, der systemisch in Bezug zur Zeit zur Verfügung steht.
Die potentielle Nützlichkeit von Arzneistoffen hängt unter anderem von der Bioverfügbarkeit ab, so dass in der pharmazeutischen Entwicklung ein besonderes Interesse daran besteht, die Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen zu optimieren. Die im Sinne dieser Erfindung bezeichnete Bioverfügbarkeit ist die Geschwindigkeit und/oder das Ausmaß in denen der therapeutisch, prophylaktisch oder diagnostisch wirksame Anteil eines Arzneimittels aus einer Arzneiform freigesetzt und resorbiert wird bzw. am Wirkort verfügbar wird. Die Bioverfügbarkeit wird gemessen über die Konzentration des jeweiligen Arzneistoffes oder seines Metaboliten in Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, in der Abhängigkeit zur Zeit.
Die Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen, die insbesondere über den Gastroin- testinaltrakt resorbiert werden, hängt von der Löslichkeit und damit der Resor- bierbarkeit der Arzneistoffe ab. So wird im Stand der Technik die Löslichkeit von insbesondere stark lipophilen und/oder schlecht wasserlöslichen Arzneistoffen, die demzufolge eine langsame und unvollständige Arzneistofffreisetzung und/oder Resorption aufweisen, z.B. durch lipidbasierte Formulierungen erhöht, die eine Bildung von gelösten Phasen und somit eine Erhöhung der Bioverfüg- barkeit dieser Arzneistoffe fördern.
In US 5,391 ,377 A wird eine biphasische pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die aus einer langanhaltenden Freigabekomponente, im wesentlichen Cι2-C2 -Fettsäuren und einer pharmazeutisch wirksamer Substanz, vorzugsweise lipophile Arzneistoffe, sowie aus einer nicht-langanhaltenden Freigabekomponente, einer Cι2-C2 -Fettsäure, besteht.
In WO 94/09788 A1 wird eine pharmazeutische Zubereitung offenbart, welche die Löslichkeit von HlV-Protease-lnhibitoren durch organische Lösungsmittel, insbesondere Alkohole, und gegebenenfalls zusätzlich durch eine Säure verbessert.
In US 5,342,625 A wird ein Cyclosporin-enthaltendes Mikroemulsionsvorkon- zentrat und Mikroemulsion offenbart, die eine ÖI-in-Wasser-Emulsion (O/W- Emulsion) darstellt und zu einer höheren Bioverfügbarkeit mit geringeren inter- und intraindividuelle Streubreite der Resorptionsspiegel führen soll.
In EP 670715 B1 wurde als Lösung des Problems eine wasserfreie pharmazeutische Zubereitung, bestehend aus einem Tensid, einem Co-Tensid und einer lipohilen Phase offenbart. Diese Zubereitungen weisen in einem pseudoternä- ren Phasendiagramm (Emulgator, Lipid, Wasser) bei anteiliger Zugabe von Wasser transparente, monophasische Bereiche auf. Nachteilig hierbei ist, dass der transparente, monophasische, wasserverdünnbare Bereich auf einen Wasseranteil von höchstens 70% begrenzt ist, so dass darüber hinaus, beim sogenannten Austrittsprozentsatz, Trübungen des Systems, insbesondere Ausfällungen bzw. Auskristallisieren von wasserunlöslichem Arzneistoff und damit verschlechterte Resorptionsbedingungen der Arzneistoffe herrschen.
In Lienau et al., Proc. EUFEPS World Conference on Drug Absorption and Drug Delivery, Copenhagen, 18-20 Juni 2001 , S. 106 und Lienau et al., Proc. 4th World Meeting ADRITELF / APGI / APV, Florence, 8/11 April 2002, p. 1463f werden pharmazeutischen Zubereitungen beschrieben, die einen Emulgator, Hilfsemulgator und ein Lipid aufweisen und gegenüber den Zubereitungen gemäß EP 670715 B1 den Vorteil haben, dass sie bei schrittweiser Wasserverdünnung in einem pseudotemären Phasendiagramm einen transparenten, mo- nophasischen Bereich über 70% (m/m) Wasseranteil aufweisen. Ein Nachteil der vorbeschriebenen Dokumente besteht darin, dass diese Zubereitungen nur eine Erhöhung der Bioverfügbarkeit von stark lipophilen und/oder wasserunlöslichen Arzneistoffen über die Erhöhung der Löslichkeit lehren, jedoch eine zusätzliche metabolische Verringerung der Bioverfügbarkeit von ins- besondere auch hydrophilen Arzneistoffen nicht gelöst wird.
Die Bioverfügbarkeit von peroral zu applizierenden Arzneistoffen wird insbesondere im Gastrointestinaltrakt durch Enzyme der ersten Phase, beispielsweise aus der Oberfamilie der Cytochrom P450 Monooxygenasen, insbesondere CYP- 3A, oder der 17ß-Hydroxy-Steroid-Hydrogenasen (17ß-HSD, vgl. in: SANO, T. et al., Clin. Sei. 2001, 101 (5): 485 -491), insbesondere der 17ß-HSD 2 Isoform, und der zweiten Phase, beispielsweise Sulfatasen, metabolisiert. Hinzu kommt, dass die Bioverfügbarkeit von peroral zu applizierenden Arzneistoffen durch im Darmepithel befindliche Effluxsysteme, insbesondere P-glycoprotein- Transporter (P-gp-Transporter), verringert wird.
In US 6,028,054 A wird durch Zusatz von sogenannten „Bioenhancern" , die eine gastrointestinale Metabolisierung und/oder einen Wiederauswurf durch Effluxsysteme verringern, die Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen erhöht. Diese „Bioenhancer" werden pharmazeutischen Zubereitungen als weitere Bestandteile zugesetzt und bestehen z.B. aus zwei koplanaren, aromatischen Ringen mit positiver Ladung.
In US 6,121 ,234 A wird der Zusatz von ätherischen Ölen zu einer pharmazeuti- sehen Zubereitung, die hydrophobe Arzneistoffe enthält offenbart, wobei eine Inhibierung der Enzyme der Cytochrom-P450-3A-Gruppe und der Effluxsysteme auf den ätherischen Ölen basiert.
WO 99/11290 A1 und WO 01/003695 A1 offenbaren jeweils einen Zusatz von Gallensäurepropylester und Vitamin C- Fettsäureester, insbesondere Vitamin-C- Palmitat, zu einer pharmazeutischen Zubereitung, welche eine Erhöhung der Bioverfügbarkeit über eine Inhibierung von Enzyme der Cytochrom-P450-3A- , Gruppe erreichen. Weiterhin wird in dem Fertigarzneimittelprodukt Kaletra® mit dem Wirkstoff Lo- pinavir, der einem hohen enteralen First-Pass-Metabolismus sowie einem Auswärtstransport durch P-gp-Transporter unterliegt, Ritonavir als Hilfsstoff zuge- setzt (Rote Liste, 2002), der in einer Konzentration von 1/6 seiner therapeutischen Dosis die enterale und wahrscheinlich auch die hepatische Metabolisie- rung und den Auswärtstransport durch die P-gp-Transporter des Lopinavirs verringert.
Nachteile aus diesem Stand der Technik bestehen darin, dass zum einen zu den pharmazeutischen Zubereitungen jeweils mindestens ein weiterer Stoff zugesetzt werden muss, um eine Inhibierung der jeweiligen Systeme erzielen zu können, jedoch nach den Grundregeln der pharmazeutischen Formulierungsentwicklung Hilfsstoffe sowohl qualitativ als auch quantitativ auf ein Mindestmaß zu beschränken sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die vorangenannten Zusätze eine Eigenwirkung aufweisen können, die zu unerwünschten Belastungen des Organismus führen können. Es kommt hinzu, dass weitere wirkentscheidende Metabplisierungen von Arzneistoffen, wie z.B. Metabolisie- rungen über 17ß-HSD, wahrscheinlich nicht gehemmt werden. 17ß-HSD 2 weist eine hohe Expressionsrate in intestinalem und endometrischem Gewebe
(MARTEL, C. et al.: J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1992, 41 : 597 - 603.) auf und metabolisiert Steroide, insbesondere solche, die in Position 17 des Steran- gerüsts eine sekundäre, gegebenenfalls betaständige Hydroxylgruppe aufweisen, in die entsprechenden Ketonmetaboliten, wie z.B. Estradiol in Estron (vgl. Zhu, B.T. et al., Carciogenesis, 1998, 19 (1): 1 - 27).
Ein Lösungsweg die hohe oxidative Verstoffwechselungsrate von sekundären, betaständigen OH -Gruppen durch die 17ß-HSD 2 zu verringern, besteht darin eine sterische Stabilisierung des Sterangerüsts z.B. durch chemischen Substi- tuenten in 17α- Position, vgl. u.a. Ethinylestradiol, zu erreichen.
Eine galenische Verbesserung der Inhibierung der Metabolisierung von Steroi- den mit sekundärer, betaständiger Hydroxylgruppe wird in Price et al, Obstetrics & Gynecology 1997, 89, S. 340 ff offenbart indem durch sublinguale Applizie- rung die intestinale Metabolisierung umgangen wird.
Hieraus ist nun ersichtlich, dass das Problem der Verringerung der Bioverfüg- barkeit von Arzneistoffen, die Substrate von intestinalen Enzymen, insbesondere von 17ß-HSD2 und/oder CYP-3A4, und/oder intestinalen Effluxsystemen, insbesondere P-gp-Transporter, sind in peroralen Arzneiformen noch nicht zufriedenstellend gelöst wurde.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde eine pharmazeutische Zubereitung zur peroralen Applizierung zu entwickeln, welche zum einen die Löslichkeit von insbesondere lipophilen Arzneistoffen bei insbesondere spontaner Verdünnung mit einem hydrophilen Medium, wie z.B. der Intestinalflüssigkeit oder gereinigtem Wasser, verbessert und darüber hinaus zum anderen einer Verrin- gerung der Bioverfügbarkeit von lipophilen und/oder hydrophilen Arzneistoffen durch intestinale Metabolisierung, insbesondere durch 17ß-HSD2 und/oder CYP-3A4, und/oder durch einen aktiven Auswärtstransport aus den Darmzellen durch intestinale Effluxsysteme, insbesondere P-gp-Transporter (MDR1) oder MRP2 Proteinen, entgegenwirkt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Zubereitung, die mindestens einen Emulgator, mindestens einen Hilfsemulgator und/oder Solvent sowie mindestens ein Lipid enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenverhältnis von Emulgator zu Hilfsemulgator und/oder Solvent (Smix) 1:1 bis 9:1 und der Gesamtlipidanteil > 0 % (m/m) beträgt, wobei diese Zubereitung mindestens ein intestinales Enzym und/oder mindestens ein intestinales Effluxsystem zumindest teilweise inhibiert.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen, die intestinale Enzyme und intestinale Effluxsysteme hemmen, werden auch als Enzym-Modulierendes- Selbst-Emulgierendes-System (EMSES) bezeichnet.
Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch eine Verwendung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung zur Herstellung eines perloralen Arznei- mittels, wobei diese Zubereitung mindestens ein interstinales Enzym und/oder mindestens ein interstinales Effluxsystem zumindest teilweise inhibiert.
Des weiteren wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit von peroral zu applizierenden Arzneistoffen, wobei eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung einen Arzneistoff enthält und peroral appliziert wird.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung besteht darin, dass sie die Löslichkeit von lipophilen und/oder wasserunlöslichen Arzneistoffen gegenüber dem Stand der Technik verbessert und zugleich zumindest teilweise die Metabolisierung von Arzneistoffen durch intestinale Enzyme und/oder den aktiven Auswärtstransport durch intestinale Effluxsysteme verringert.
Ein weiterer Vorteil einer erfindungsgemäßen, wirkstofffreien pharmazeutischen Zubereitung besteht darin, dass diese Zubereitung als Trägersystem für verschiedene Arzneistoffe dienen kann, die über die vorgenannten Profile verfügen, d.h. lipophil sind und/oder durch intestinale Enzyme metabolisiert werden und/oder aktiv durch intestinale Effluxsysteme aus dem Darmepithel zurück in das Darmlumen transportiert werden, und somit zeit- und kostenaufwendige Arzneistoffformulierungsentwicklungen entfallen können.
Ein anderer Vorteil besteht darin, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung auf Grund eines sehr geringen Anteils einer hydrophilen Phase weiterhin dazu geeignet ist perorale Arzneiformen, insbesondere Kapseln, mit Vorteil Gelatinekapseln, oder Tabletten, herzustellen. Die vorliegende Erfindung folgt außerdem den Grundregeln der pharmazeutischen Formulierungsentwick- iung, nämlich Hilfsstoffe sowohl qualitativ als auch quantitativ auf ein Mindest- maß zu beschränken.
Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben. Ein bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass der Smix 3:1 bis 9:1 , mit Vorteil 9:1 und der Gesamtlipidanteil 10 bis 50% (m/m) beträgt.
Einen besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass der Emulgator PEG-40-hydriertes Rizinusöl (Cremophor®RH40), PEG-35- Rizinusöl (Cremophor®EL) oder PEG-400-Monorizinoleat (Estax®54), der Hilfsemulgator oder Solvent Glycerylmonocaprylat > 80% (m/m) (lmwitor®308) oder Diethylenglycolmonoethylether (Transcutol®P) und das Lipid Triglyceride, fette Öle oder Wachse enthält.
Besonders bevorzugte Triglyceride enthalten Mittelkettige Triglyceride (MCT), z.B. Miglyol®812 (C_-C12 Triglyceride), bevorzugte fette Öle enthalten Rizinusöl, Olivenöl, Maiskeimöl, Sojaöl, Sonnenblumenkernöl, Erdnussöl, Walnussöl oder Diestelöl, besonders bevorzugt Rizinusöl und bevorzugte Wachse enthalten Ethyloleat oder Isopropylmyristat.
Es ist auch möglich, dass die erfindungsgemäße Zubereitung zusätzlich mindestens einen Arzneistoff enthält.
Arzneistoffe, die aus der Gruppe der Therapeutika, Prophylaktika oder Di- agnostika stammen und bevorzugt mit der erfindungsgemäßen Zubereitung formuliert werden sind entweder lipophil und/oder wasserunlöslich alternativ hydrophil.
Bevorzugt werden lipophile Arzneistoffe mit der erfindungsgemäßen Zubereitung formulier, besonders bevorzugt Arzneistoffe, die Substrate mindestens eines intestinal metabolisierenden Enzyms und/oder eines intestinalen Effluxsystems sind. Mit Vorteil werden hier wiederum solche Arzneistoffe formuliert, die Substrate der 17ß-Hydroxy-Steroid-Dehydrogenasen oder der Cytochrom- P450-Monooxygenasen, mit besonderem Vorteil aus der Gruppe der Cytochrom P 450 3A- Monooxygenasen (CYP3A4) sind oder Substrate eines P-gp- Transporter-Systems sind. Im Sinne dieser Anmeldung bedeutet Substrat mindestens eines intestinalen Enzyms und/oder eines intestinales Effluxsystems, dass diese Stoffe, z.B. Arzneistoffe oder pharmazeutische Hilfsstoffe mit intestinalen Enzymen interagieren und durch diese metabolisiert werden und/oder durch Interaktion mit intestinalen Effluxsystemen durch diese aktiv aus dem Darmepithel zurück in das Darmlumen transportiert werden.
Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsart der erfindungsgemäßen Zubereitung stellen als Arzneistoffe Steroide dar, mit Vorteil solche, die in Position 17 des Sterangerüsts eine sekundäre, betaständige Hydroxylgruppe aufweisen und hiervon besonders bevorzugt Estrogene, Antiestrogene oder Androgene.
Arzneistoffe, die Substrate von 17ß-HSD darstellen werden im Folgenden aufgeführt, sind jedoch nicht auf die Aufzählung beschränkt, sie beinhalten auch Salze und/oder Derivate dieser Arzneistoffe:
11-α-Hydroxynandrolon, 16-α-Fluorestradiol, 16-α-lodestradiol, 16-ß-
Fluorestradiol, 2,4-Dibromestradiol, 2-Chlorestradiol, 2-Ethoxyestradiol, 2- Fluorestradiol, 2-Hydroxyestriol, 2-Methoxyestradiol, 2-Methoxyestriol, 2- Methoxymethylestradiol, 3-Methoxyestriol, 4-Bromestradiol, 4-Chlorestradiol, 4- Fluor-17ß-estradiol, 4-Hydrxyestradiol, 4-Hydroxytestosteron, 4- Methoxyestradiol, 5-ß-Androstan-17ß-ol-3-on, 6-α-Hydroxyestradiol, 3α, 17ß- Androstandiol, 3ß,17ß -Androstandiol, Androstanolon, Androstendiol, Bolandiol, Bolazin, Boldenon, Clostebol, Dacuroniumbromid, 17-Deacetylpancuronium, Dideactetylvecurronium, Vecuronium, 17ß-Dihydroequilin, 5α-Dihydro-19- nortestosteron, 16α-Brom-7α-(N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra-1 ,3,5(10)- trien-3,17ß-diol (EM-105), 16α-Chlor-7α-(N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra- 1 , 3,5(10)-trien-3,17ß-diol (EM-139), 16α-lod-7α-(N-butyl, N-methyl- undecanamid)-estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (EM-156), 16α-Brom-7α-(N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (EM-220), Epiestriol, Epitiostanol, Estetrol, Estradiol, Estradiol-3-glucuronid, Estrad iol-3-methy lether, Estradiol-3-sulfat, Estrad iol-3-bezoat, Estradiol-3-hexahydrobenzoat, Estra- mustin, Estriol, Estriol-3-glucuronid, Estriol-3-sulfat, Estriol-16-glucuronid, Estry- namin, 17ß-Hydroxy-6-methylen-androsta-1 ,4-dien-3-on (FCE-25071), Ful- vestrant, 1-Hydroxy-17ß-estradiol, 2-Hydroxy-17ß-estradiol, 4-Hydroxy-17ß- estradiol, 6-Hydroxy-17ß-estradiol, 7-Hydroxy-17ß-estradiol, 15-Hydroxy-17ß- estradiol, 18-Hydroxy-17ß-estradiol, 7-(N-butyl-undecanamid)-3, 17ß-estra- 1 , 3,5(10)-trien-3,17ß-diol (ICI-160325), 7α-(N-butyl-undecanamid)-3,17ß-estra- 1 ,3,5(10)-trien-3, 17ß-diol (ICI-163964), Estra-1 ,3,5(10)-trien-7ß-(N- butyl)undecanamid-3,17ß-diol (ICI-164275), 7α-(N-butyl, N-methyl- undecanamid)-estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (ICI-164384), Inocoteron, Estra-3- sulfamate-1 , 3,5(10),7-tetraen-3,17ß-diol (J-1059), Cycloprop[14S,15ß]- 3',15- dihydro-estra-1 , 3,5(10)-trien-3,17ß-diol (J-824), Estra-1 ,3,5(10)-trien-3-sulfamat- 17ß-ol (J-995), Mesterolon, Methenolon, 16-Methylenestradiol, Metogest, Nandrolon, Nisterim, Norelostebol, 3-Octyloxy-5α-androst-3-en-17ß-ol (Octosta- nol), Estradiol-17-phenylpropionat-Estradiol-benzoat mixt. (ORG-369-2), 7- Ethyl-nandrolon (ORG-41640), 11ß-Chlormethyl-estra-3, 17ß-diol (ORG-4333), Piperidinium-1-[(2ß,3α,5α,16ß,17ß)-3,17-dihydroxy-2-(1-piperidinyl)androstan- 16-yl]-1-methyl-bromid (ORG-7402), 17-Desacetylrocuronium (ORG-9943), O- xendolon, 11α-Methoxy-7α-methyl-estra-3-17ß-diol (PDC-7), Quinestradol, 17ß- Hydroxy-7α-methyI-androst-5-en-3-one (RMI-12936), 11α-ethenyl-estra-3, 17ß- diol (RU-39951), 11ß-[4(dimethylamino)phenyl]-estra-3, 17ß-diol (RU-43944), 7α-{4-[2-(dimethylamino)ethoxy]phenyl}-estra-3,17ß-diol (RU-45144), 11ß-{4- [(methylsulfonyl)oxy]phenyl}-estra-3,17ß-diol (RU-48382), 11ß-{4-[[5-[(4,4,5,5,5- pentafluorpentyl)sulfonyl]pentyl]oxy]phenyl}-estra-3,17ß-diol (RU-58668), 17ß- Dihydroxy-9α-fluor-11 ß-androsta-1,4-dien-3-on (SQ-27957), Stenbolon, Cyc- loprop[14R,15α]estra-3',15-dihydro-3-methoxy-1 , 3,5(10)-trien-17ß-ol (STS-593), Cycloprop[14S, 15ß]estra-3', 15-dihydro-3-methoxy-1 ,3,5(10)-trien-17ß-ol (STS- 651), Testosteron, Trestolon, Trilostan, 13ß-Ethyl-8α-gon-1 ,3,5(10)-trien- 3,16α,17ß-triol (WY-5090), 13ß-Ethyl-8ß-gon-1 ,3,5(10)-trien-3,16α,17ß-triol, Estra-2-{tricyclo[3.3.1.13,7]decyl}-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (ZYC-5), Ent- estradiol, 8ß-Vinyl-estradiol, 11 ß-Fluor-7α-{5-[N-methyl-N-3-(4,4, 5,5,5- pentafluorpentylthio)-propylamino]-pentyl}-estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (im weiteren AE1), 11 ß-Fluoro-7α-{5-[methyl-(7,7,8,8,9,9, 10, 10,10- nonafluorodecyl)amino]pentyl}estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (im weiteren AE2), 17ß-Hydroxy-14α,15α-methylen-androst-4-en-3-on (WO 99/672275), 17ß- Hydroxy-7α-Methyl-14α,15α-methylen-androst-4-en-3-on (WO 99/672275), 4- Chlor-17ß-Hydroxy-14α,15α-methylen-androst-4-en-3-on (WO 01/42275), 4,17ß-Dihydroxy-14α,15α-methylen-androst-4-en-3-on (WO 01/42275), 17ß- Hydroxy-14α,15α-methylen-androsta-1 ,4-dien-3-on (WO 01/42275), 4-Chlor- 17ß-Hydroxy-14α,15α-methylen-androsta-1,4-dien-3-on (WO 01/42275), 4- Chlor-17ß-Hydroxy-14α,15α-methylen-estr-4-en-3-on (WO 01/42274), 7ß- Hydroxy-7α-Methyl-14α,15α-methylen-estr-4-en-3-on (WO 99/67276), 17ß- Hydroxy-14α,15α-methylen-estr-4-en-3-on (WO 99/67276), 4,17ß-Dihydroxy- 14α,15α-methylen-estr-4-en-3-on (WO 01/42274), 17ß-Hydroxy-14α,15α- methylen-estra-4,9,11-trien-3-on (WO 01/42274), 3-Ethyl-17ß-hydroxy-14α,15α- methylen -gon-4-en-3-on (WO 01/42274), 17a-ß-Hydroxy-17a-homoandrosta- 4,15-dien-3-on, 1"-Mesyl-17α-(trifluormethyl)-1Η-pyrazol[4",5':2,3]androst-4-en- 17ß-ol
Arzneistoffe und Arzneistoffgruppen, die lipophil sind und/oder Substrate von Cytochrom-P450 Monooxygenasen darstellen werden im Folgenden aufgeführt, sind jedoch nicht auf diese Aufzählung beschränkt, sie beinhalten auch Salze und/oder Derivate dieser Arzneistoffe:
Aromatische Kohlenwasserstoffe, Arylamine, heterocyclische Amine, Caffein, Coffein, Theophyllin, Odansertron, Diethylnitrosamin, Cyclophosphamid, R- Methyl-Phenytion, Antidiabetika- insbesondere Glibenclamid, Rosiglitazon und Tolbutamid- Nicht Steroidale Antirheumatika (NSAR)- insbesondere Diclofenac- Na und Ibuprofen- Coumarin, Phenprocoumon, Warfarin, Sartane, Debrisoquin, Spartein, ß-Blocker, Codein, Neuroleptika- insbesondere Haloperidol- Phenothi- azine, Risperidon, Selektive Serotonin Reuptake Inhibitoren (SSRI)- insbeson- dere Fluvoxamin- tricyclische Antidepressiva, Nitrosamine, Chloroxazon, Di- hydropyridine, Triazolam, Midazolam, Astemizol, Azol-Antimykotika, Cisaprid, Imunsuppressiva- insbesondere Cyclosporin, Tacrolimus und Sirolimus- Calcium-Antagonisten, Makrolide, Malariamittel- insbesondere Halofantrin und Mefloquin- Pimozid, Proteasehemmer -insbesondere Saqunavir, Ritonavir und Lopinavir- Sildenafil, Statine - insbesondere Artorvastatin, Fluvastatin, Levosta- tin und Simvastatin- Steroide- Estradiol, 11ß-Fluoro-17α-methyl-7α-{5-[methyl- (8,8,9,9,9-pentafluornonyl)amino]pentyl}estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (WO 03/045972), 11 ß-Fluor-7α-{5-[N-methyl-N-3-(4,4,5,5,5-pentafluorpentylthio)- propylamino]-pentyl}-estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (im weiteren AE1), 11 ß- Fluoro-7α-{5-[methyl-(7,7,8,8,9,9,10,10,10-nonafluorodecyl)amino]pentyl}estra- 1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (im weiteren AE2), Tamoxifen, Terfenadin
Arzneistoffe und Arzneistoffgruppen, die Substrate von P-gp-Transportem darstellen werden im Folgenden aufgeführt, sind jedoch nicht auf die Aufzählung beschränkt, sie beinhalten auch Salze und/oder Derivate dieser Arzneistoffe:
Aldosteron, Amidodaron, Azipodine, Bepredil, Bisanthren, Catharantin, Cefazo- lin, Cefoperazon, Cefotetan, Cefaranthin, Chinchona-Alkaloide, Chlorpromazin, Cisplatin, Clozapin, Cyclosporin, Dexamethason, Dexniguldipin, Dibucain, Digo- xin, Dilthiazem, Dipyridamol, Domperidon, Demetin, cis-Flupenthixol, Fluphena- zin, Flunitrazepam, Gallopamil, Haloperidol, Hydrocortison, Ivermectin, Lopera- mid, Methadon, Methotrexat, Mitoxanthon, Monesin, Morphin, Morphin 6- glucoronid, Nicardipin, Odanserton, Perphenazin, Phenoxazin, Phenytoin, Pra- zosin, Progesteron, Talinolol, Tamoxifen, Terfenadin, Topotectan, Trifluperazin, Triflupromazin, Valinomycin, Verapamil, Vindolin, Yohimbin. Ritonavir, Lopinavir, L-Thyroxin, 11 ß-Fluoro-17α-methyl-7α-{5-[methyl-(8, 8,9,9, 9-pentafluor- nonyl)amino]pentyl}estra-1 , 3,5(10)-trien-3,17ß-diol (WO 03/045972), 11ß-Fluor- 7α-{5-[N-methyl-N-3-(4,4,5,5,5-pentafluorpentylthio)-propylamino]-pentyl}-estra- 1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol (im weiteren AE1) und 11 ß-Fluoro-7α-{5-[methyl- (7,7,8,8,9,9, 10,10,10-nonafluordecyl)amino]pentyl}estra-1 ,3,5(10)-trien-3, 17ß- diol (im weiteren AE2). Eine bevorzugte Ausführung der Verwendung der erfindungsgemäßen Zube- reitung besteht darin, dass durch die Verwendung Enzyme aus der Gruppe der Cytochrom-Monooxygenasen, bevorzugt aus der Gruppe der Cytochrom-P450- 3A-Monooxygenasen, oder 17ß-Hydroxy-Steroid-Dehydrogenasen und/oder als intestinales Effluxsystem P-gp-Transporter zumindest teilweise inhibiert werden. Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung die Lös- lichkeit von lipophilen Phasen wie Triglyceride, fette Öle oder Wachse zu erhöhen, d.h. gut wasserverdünnbar zu machen, wird mittels pseudotemärer Phasendiagramme gezeigt (vgl. Bsp. 3; Fig. 1a, 1b). Hierbei werden erfindungsgemäße, wirkstofffreie Zubereitungen, enthaltend Emulgator, Hilfsemulgator und/oder Solvent und Lipid, schrittweise mit einem hydrophilen Medium, z.B. Wasser verdünnt. Als Beurteilungskriterien gelten klar / trübe und ein-/ mehrphasig. Klare bis opaleszente, einphasige Systeme wurden in den pseu- doternären Phasendiagrammen (vgl. Fig. 1a und 1b) in Abhängigkeit ihres Auf- tretens bei 25°C oder 37°C sichtbar gemacht. Es hat sich nun gezeigt, dass im Gegensatz zu pharmazeutischen Formulierungen aus EP 670715 B1 bei einer schrittweisen Wasserverdünnung keine Trübung der Verdünnung der erfindungsgemäßen Zubereitung bei einem Wasseranteil über 70% (v/v+m), dem sogenannte Austrittprozentsatz, entstehen und dass erfindungsgemäßen Zube- reitungen bis zu einem Wasseranteil von 90% (v/v+m) eine transparente, o/w- Dispersion aufweisen.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Formulierung gut spontan wasserver- dünnbar zu sein und damit auch eine Löslichkeit von lipophilen Arzneistoffen zu erreichen kann in dem Test auf Selbstemulgierbarkeit überprüft werden (vgl. Bsp. 4; Fig. 2a-e). Dieser Test gibt die Vorgänge, nämlich die spontane Wasserverdünnung von peroral applizierten Formulierungen im Magen, naturgetreuer als die Phasendiagramme wieder, da zu einer im Überschuss vorgelegten hydrophilen Phase die erfindungsgemäße Zubereitung zugegeben wird. Hierbei werden erfindungsgemäße Zubereitungen auf ihre Fähigkeit bei spontaner Wasserverdünnung klare und homogene Dispersion zu bilden, d.h. auf die Fähigkeit zur Selbstemulgierung, überprüft. Dieser Test wird zum einen über eine visuell über Benotung 1 - 5, angelehnt an das Bewertungsschema von Khoo et al., Int. J. of Pharmaceutics, 167 (1998) 155-164 (siehe Tab. 1), und zum ande- ren über die Ermittlung des hydrodynamischen Teilchendurchmessers mittels Photonen Korrelationsspektoskopie (PCS), bewertet. Tabelle l :
Benotungssystem von Emulsionen / Dispersionen nach Selbstemulgierung (Khoo et al., 1998).
Note | Erscheinung des Systems
1 Klare Dispersion
2 Klare bis opaleszente Dispersion
3 I j Weißliche Emulsion
4 Gräuliche Emulsion
Keine Selbstemulgierung, Abscheidungen auf der 5
Wasseroberfläche i
Es wurde nun gefunden, dass in erfindungsgemäße Formulierungen, die in der visuellen Beurteilung eine klare und/oder klare bis opaleszente Dispersion erge- ben und/oder eine Teilchengröße < 200 nm, insbesondere < 100 nm enthalten, besonders geeignet sind, da davon ausgegangen werden kann, dass der Arzneistoff molekular gelöster Form zur Verfügung steht. Zwischen wirkstofffreien und wirkstoffhaltigen Formulierungen wurde im Test auf Selbstemulgierung kein signifikanter Unterschied bezüglich der Teilchengröße und der visuellen Beno- tung gefunden.
Hilfsstoffe, die bevorzugt für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung verwendet werden, weisen außerdem auch eine Fähigkeit auf, intestinale Enzyme oder interstinale Effluxsysteme zumindest teilweise zu inhibieren. Die Eignung von pharmazeutischen Hilfsstoffen für die erfindungsgemäße Zubereitung steigt generell mit zunehmender Inhibierung. Solche Potentiale können über dem Fachmann bekannteTestsysteme festgestellt werden.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen, pharmazeutischen Formulierung 17ß- Hydroxy-Steroid-Dehydrogenasen zumindest teilweise zu inhibieren wird zum einen über in vitro 17ß-HSD-Test bewiesen (vgl. Bsp. 5, Fig. 3). Erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen, die Steroide enthalten, welche eine se- kundäre, betaständige Hydroxylgruppe in Position 17 des Sterangerüsts aufweisen, inhibieren die 17ß-HSD 2, so dass weniger 17-Keto- Biotransformationsprodukt entsteht. Das Inhibierungspotential ist direkt proportional zu dem Massenanteil der erfindungsgemäßen Formulierung. Mit steigen- der Konzentration (0,0%, 0,003%, 0,01 %, 0,03%, 0,1% und 0,3%) einer erfindungsgemäßen Mischung aus Cremophor®EL / Miglyol® 812/ Transcutol®P (72T/ 20T / 8T) im Versuchsansatz verringert sich nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten das Ausmaß der Metabolisierung von 11 ß-FIuoro-7α-{5-[methyl- (7,7,8,8,9,9, 10, 10,10-nonafluorodecyl)aminolpentyl}estra-1 , 3,5(10)-trien-3,17ß- diol (AE2) zum 17-Keton wie folgt (n= 2): 20 % und 23 % -> 21 % und 18 % -> 14 % und 15 % -> 9 % und 8 % -> 5 % und 6 % - 3 % und 3 % des Ausgangswertes an AE2 und es kommt zu einem Anstieg der Menge an genuinem AE 2 nach 30 Minuten in der Mikrosomensuspension (n = 2) 64 % und 66 % -> 70 % und 71 % -> 75 % und 76 % -> 89 % und 83 % -> 109 % und 114 % -> 106 % und 109 % des Ausgangswertes an AE2 (vgl. Bsp5; Fig. 3). Hieraus lässt sich erkennen, dass erfindungsgemäße Formulierungen geeignet sind, 17ß-HSD 2 zu inhibieren.
Ein Nachweis für die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Formulierung die Bio- Verfügbarkeit von Arzneistoffen, insbesondere von Steroiden mit einer sekundären, betaständigen Hydroxylgruppe in Position 17 des Sterangerüsts, zu erhöhen kann mittels dem Fachmann bekannten in vivo Tests überprüft werden. In dem vorliegenden in vivo Test (vgl. Bsp. 6) werden die Bioverfügbarkeiten von AE2 bei i.v. und p.o. Applizierung ermittelt. Da der Wirkstoff AE2 sehr stark li- pophil ist (log P = 5,9), werden pharmazeutischen Zubereitungen verwendet, die jeweils die Löslichkeit des Arzneistoffes in der jeweiligen Formulierung garantieren und somit schon hochentwickelte Systeme darstellen. Es wird als Referenz eine 20%ige HPßCD-Lösung verwendet, die 2% AE2 enthält und sowohl i.V., als auch p.o. verabreicht wird. Als Testformulierung wird die in Bsp. 2a) hergestellte erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung, enthaltend 2,5 % AE2, Cre- mophor®EL und Transcutol®P, Smix 9:1 , 20% (m/m) Miglyol®812 p.o. verabreicht. In Fig. 4 lässt sich erkennen, dass die erfindungsgemäße Formulierung von AE2 eine um 26% erhöhte Bioverfügbarkeit gegenüber dieser p.o. verab- reichten 20%igen HP-ß-CD Lösung erreicht. Hieraus lässt sich erkennen, dass erfindungsgemäße Formulierungen geeignet sind, die Bioverfügbarkeiten von insbesondere Steroiden zu erhöhen.
Die Fähigkeit von Hilfsstoffen humane Cytochrom P450 Isoenzyme zu inhibieren wird über einen CYP-Test festgestellt (vgl. Bsp. 7). Die Inhibierung der Enzyme wird hierbei über die Konzentration (IC50, μg/ml) der Hilfsstoffe charakterisiert, bei der 50% der jeweiligen Isoenzyme inhibiert werden. Es hat sich gezeigt, dass die CYP-Isoenzyme, insbesondere CYP3A4, durch die erfindungs- gemäßen Hilfsstoffe selektiv inhibiert werden. Die erfindungsgemäßen Hilfsstoffe weisen an mindestens einem CYP-Isoenzym mindestens eine IC50 < 1000 auf, mit Vorteil eine IC50 ≤ 100, d.h. sie besitzen mittlere Aktivität, und mit besonderem Vorteil eine IC50 ≤ 10, d.h. sie besitzen starke Aktivität. Bei der Testung von erfindungsgemäßen Zubereitungen hergestellt nach Bsp. 1a) und /oder 1d) wurde überraschenderweise gefunden, dass sie an Isoenzymen CYP 3A4, CYP 2C9 und CYP 2C19 eine niedrigere IC50 als die jeweiligen einzelnen Hilfsstoffe aufweisen und eine mittlere bis starke Aktivität besitzen (vgl. Tab 2).
Tabelle 2:
Inhibierungsaktivitäten bzgl. CYP-Isoenzymen von Hilfsstoffen und Formulierungen
Figure imgf000019_0001
Diese Ergebnisse belegen, dass erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen intestinale Enzyme, insbesondere 17ß-HSD2 und Cytochrom- Isoenzyme, mit Vorteil CYP3A4 inhibieren und somit zu einer Erhöhung der Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen führen können.
Die Fähigkeit von Hilfsstoffen P-gp-Transporter zu inhibieren wird über einen P- gp-Transporter-Test (vgl. Bsp. 8) bestimmt. In dem vorliegenden Test wird die Aktivität den Transporter zu inhibieren über die Ratio (R) charakterisiert, welches das Verhältnis von Fluoreszenzintensität der Prüflösung zur Fluoreszenzintensität des Blank angibt und direkt proportional zu Inhibierung der P-gp- Transporter ist. Fluoreszenzintensität Prüflösung entspricht der Fluoreszenzintensität, gemessen bei 485 / 535 nm (Exzitation bzw. Emission), der Zellen, die Prüflösung und CaIceinAM-Arbeitslösung enthalten. Fluoreszenzintensität Blank entspricht der Fluoreszenzintensität, gemessen bei 485 / 535 nm (Exzitation bzw. Emission), der Zellen, die keine Prüflösung, jedoch CaIceinAM- Arbeitslösung enthalten und somit als O-Wert dienen.
Es werden für nachstehende Hilfsstoffe in Tab. 3 folgende maximalen Aktivitäten, R-Werte, bzgl. Der Inhibierung von P-gp-Transportem ermittelt:
Tabelle 3: Inhibierungsaktivitäten bzgl. P-gp-Transporter von Hilfsstoffen
Figure imgf000020_0001
Hilfsstoffe, die eine Ratio > 1 ,18, mit Vorteil > 1 ,6 und mit besonderem Vorteil > 2,1 aufweisen, sind bevorzugt geeignet den aktiven Auswärtstransport von Arzneistoffen durch intestinale Effluxsysteme, insbesondere durch P-gp- Transporter zu inhibieren und zu einer Erhöhung der Arzneistoffbioverfügbarkeit zu führen, wobei in diesem Fall die Arzneistoffe Substrate des P-gp-
Transporters sein müssen [R (AE1) = 2,43; R (AE2)] . Solche Hilfsstoffe sind somit bevorzugt geeignet als Hilfsstoffe für die erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitungen zu dienen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können auf Grund ihrer hohen Wasserverdünnbarkeit und damit ihrer guten Löslichkeit von insbesondere lipophilen Arzneistoffen, sowie ihrer Fähigkeit intestinale Enzyme und/oder den aktiven Auswärtstransport durch intestinale Effluxsysteme zu hemmen als Technologieplattform für verschiedenste, insbesondere die im vor- hineingenannten Arzneistoffe genutzt werden. In Tabelle 4 werden die erfindungsgemäßen Formulierungen angegeben, die hierfür bevorzugt verwendet werden. In Tabelle 5 werden möglichen Wirkstoffbeladungen von ausgewählten erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen angegeben.
Tabelle 4:
Wirkstofffreie erfindungsgemäße Formulierungen
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Die nachfolgenden Beispiele stellen bevorzugte Zusammensetzungen der Erfindung dar, ohne die Erfindung jedoch auf diese Beispiele zu limitieren.
Figurenbeschreibung:
Fig. 1a:
Pseudoternäres Phasendiagramm einer Mischung aus Cremophor®EL und Im- witor®30δ, Smix 9:1 , Miglyol®δ12, titriert mit Wasser bei 25°C und 37°C. Schenkelbezeichnungen verlaufen dem Uhrzeigersinn entgegengesetzt. Transparente, monophasische Bereiche bei 25°C und 37°C sind längsgestreift markiert.
Fig. 1b:
Pseudoternäres Phasendiagramm einer Mischung aus Cremophor®EL und Transcutol®P, Smix 3:1 , Miglyol®312, titriert mit Wasser bei 25°C und 37°C. Schenkelbezeichnungen verlaufen dem Uhrzeigersinn entgegengesetzt. Transparente, monophasische Bereiche bei 25°C und 37°C sind längsgestreift und nur bei 37°C sind ausgefüllt markiert.
Fig. 2a: Test auf Selbstemulgierung einer Mischung enthaltend Cremophor®EL und TranscutoI®P, Smix 9:1 , 10 bis 60% (m/m), Miglyol®812. Symbol der visuellen Bewertung: o und Δ; Symbol der Teilchengröße bestimmt mittels PCS (n = 4, mit Standardabweichung): —
Fig. 2b:
Test auf Selbstemulgierung einer Mischung enthaltend 2% (m/m) AE2, Cre- moρhor®EL und Transcutol®P, Smix 9:1 , 10 bis 60% (m/m), Miglyol®812. Symbol der visuellen Bewertung: D und Δ; Symbol der Teilchengröße bestimmt mittels PCS (Doppelwerte): —
Fig. 2c:
Test auf Selbstemulgierung einer Mischung enthaltend 7,5% AE1 , Cre- mophor®EL und lmwitor®308, Smix 3:1 , 10 bis 60% (m/m), Miglyol®812. Symbol der visuellen Bewertung: o; Symbol der Teilchengröße bestimmt mittels PCS (Doppelwerte): —
Fig. 2d: Test auf Selbstemulgierung einer Mischung enthaltend 2% E2, Cremophor®EL und Transcutol®P, Smix 9:1 , 10 bis 60% (m/m), MiglyoI®812. Symbol der visuellen Bewertung: o; Symbol der Teilchengröße bestimmt mittels PCS (Doppelwerte): —
Fig. 2e:
Test auf Selbstemulgierung einer Mischung enthaltend 2% AE2, Estax®54 und Transcutol®P, Smix 9:1 , 10 bis 60% (m/m) Miglyol®δ12. Symbol der visuellen Bewertung: o; Symbol der Teilchengröße bestimmt mittels PCS (Doppelwerte):
Fifl- 3:
17ß-HSD2-Test an Mikrosomen intestinalen Ursprungs. Metabolische Stabilität von 0,3 μM AE2 in einer intestinale Mikrosomensuspension und Entstehung des 17-Ketonmetaboliten nach 30 Min. in Abhängigkeit der Konzentration (m/v) ei- ner erfindungsgemäßen Formulierung enthaltend Cremophor®EL und Transcu- tol®P, Smix 9:1 , 20% (m/m), Miglyol®δ12.
Y-Achse: Prozentualer Anteil von AE2 (Symbol: dunkler Balken) und Ketonme- tabolit von AE2 (Symbol: längsgestreifter Balken) X-Achse: Prozentualen Anteil der erfindungsgemäßen Formulierung.
F'fl- 4:
Vergleich der Serumkonzentrationen von AE 2 in weiblicher Ratten, Symbole ausgefüllt, und dessen 17-Keton-metaboliten, Symbole offen, nach i.v. und p.o. Applikation für die Zeit von 0-24 h, wobei bei Ratte ( R ) 1 und 2: 5 mg/kg AE 2 in einer 20%igen HPßCD-Lösung i.V., bei R 3: 10 mg/kg AE 2 in einer 20%igen HPßCD-Lösung p.o. und in R 5 und 6: 10 mg/kg AE 2 in einer erfindungsgemäßen Zubereitung gemäß Bsp. 2a verabreicht wird. Y-Achse: Serumkonzentration in ng/ml, X-Achse: Zeit in h, logarithmischer Maßstab. Beispiel 1: Herstellung erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen
a) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung ent- haltend Cremophor®EL, Transcutol®P und Miglyol®812 hergestellt.
Hierfür werden alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt. Es werden 3,6 g Cremophor®EL und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - A- nalysenwaage (Sartorius, Göttingen) in ein Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) ge- mischt. Diese Zubereitung wird visuell auf Klarheit und Homogenität kontrolliert, d.h. dass das Becherglas vor eine Lichtquelle, alternativ vor einen schwarzen Hintergrund, gehalten wird und der Inhalt des Becherglases keine optisch wahrnehmbare Trübung oder Schwebeteilchen sowie unterschiedliche Phasen aufweist. Daraufhin werden 1,0 g Miglyol®812 zu der Mischung gegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt.
Diese pharmazeutische Zubereitung, Grundmischung, wird anschließend visuell auf Klarheit und Homogenität (s.o.) überprüft.
b) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung ent- haltend Cremophor®EL, lmwitor®30δ und Miglyol®δ12 hergestellt.
Hierfür müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Imwitor®30δ muss vor der Verwendung durch Erhitzen auf 40°C auf einem beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) in eine fließfähige Form überführt werden. Es werden 3,6 g Cremophor® EL und 400 mg geschmol- zenes Imwitor® 30δ auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g Miglyol® 812 der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und
Homogenität (s. Bsp. 1a) überprüft. c) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Cremophor®RH40, Transcutol®P und Miglyol®812 hergestellt. Cremophor® RH40 muss vor der Verwendung durch Erhitzen auf 40°C auf einem beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) in eine fließfähige Form überführt werden. Zudem müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Es werden 3,6 g Cremophor®RH40 und 400 mg TranscutoI®P auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g Miglyol®312 der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1 a) überprüft.
d) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Estax®54, Transcutol®P und Miglyol®δ12 hergestellt. Hierfür müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Es werden 3,6 g Estax®54 und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - A- nalysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. . Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1 a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g Miglyol®812 der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1a) überprüft.
e) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Estax®54, lmwitor®308 und Miglyol®812 hergestellt. Hierfür müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Imwitor®308 muss vor der Verwendung durch Erhitzen auf 40°C auf einem beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) in eine fließfähige Form überführt werden. Es werden 3,6 g Estax®54 und 400 mg lmwitor®30δ auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Hei- dolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1a) kontrolliert.
Daraufhin wird 1 ,0 g Miglyol®812 der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1a) überprüft.
f) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Estax®54, Transcutol®P und raffiniertem Rizinusöl hergestellt. Hierfür müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Es werden 3,6 g Estax®54 und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - A- nalysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g raffiniertes Rizinusöl der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1a) überprüft.
g) Es werden 5g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Estax®54, Transcutol®P und Ethyloeat hergestellt. Hierfür müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden.
Es werden 3,6 g Estax®54 und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - A- nalysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1 a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g Ethyloleat der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1a) überprüft.
h) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung ent- haltend Estax®54, Transcutol®P und Polyethylenglykol 400 hergestellt.
Hierfür müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Es werden 3,6 g Estax®54 und 400 mg Polyethylenglykol 400 auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewo- gen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g Miglyol®812 der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1 a) überprüft.
i) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Cremophor®RH40, Transcutol®P und raffiniertem Rizinusöl herge- stellt.
Cremophor®RH40 muss vor der Verwendung durch Erhitzen auf 40°C auf einem beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) in eine fließfähige Form überführt werden. Zudem müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Es werden 3,6 g Cremophor®RH40 und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1 a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g raffiniertes Rizinusöl der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und
Homogenität (s. Bsp. 1 a) überprüft.
j) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Cremophor®RH40, Transcutol®P und Ethyloleat hergestellt. Cremophor®RH40 muss vor der Verwendung durch Erhitzen auf 40°C auf einem beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) in eine fließfähige Form überführt werden. Zudem müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Es werden 3,6 g Cremophor®RH40 und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem
Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g Ethyloleat der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1 a) überprüft.
k) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung ent- haltend Cremophor®RH40, lmwitor®308 und Miglyol®812 hergestellt.
Imwitor®30δ muss vor der Verwendung durch Erhitzen auf 40°C auf einem beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) in eine fließfähige Form überführt werden. Hierfür müssen alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt werden. Es werden 3,6 g Estax®54 und 400 mg lmwitor®308 auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in einem Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Die Homogenität und Klarheit wird visuell (s. Bsp. 1 a) kontrolliert. Daraufhin wird 1 ,0 g Miglyol®812 der Mischung hinzugegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese Grundmischung wird visuell auf Klarheit und Homogenität (s. Bsp. 1a) überprüft.
I) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Cremophor®EL, Transcutol®P und raffiniertem Rizinusöl hergestellt. Hierfür werden alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt. Es werden 3,6 g Cremophor®EL und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - A- nalysenwaage (Sartorius, Göttingen) in ein Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Diese Zubereitung wird visuell auf Klarheit und Homogenität kontrol- liert, d.h. dass das Becherglas vor eine Lichtquelle, alternativ vor einen schwarzen Hintergrund, gehalten wird und der Inhalt des Becherglases keine optisch wahrnehmbare Trübung oder Schwebeteilchen sowie unterschiedliche Phasen aufweist. Daraufhin werden 1 ,0 g raffiniertes Rizinusöl zu der Mischung gegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese pharmazeutische Zubereitung, Grundmischung, wird an¬ schließend visuell auf Klarheit und Homogenität (s.o.) überprüft. m) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Cremophor®EL, Transcutol®P und Ethyloleat hergestellt. Hierfür werden alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt. Es werden 3,6 g Cremophor®EL und 400 mg Transcutol®P auf einer "Genius" - A- nalysenwaage (Sartorius, Göttingen) in ein Becherglas eingewogen und für 5
Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Diese Zubereitung wird visuell auf Klarheit und Homogenität kontrolliert, d.h. dass das Becherglas vor eine Lichtquelle, alternativ vor einen schwarzen Hintergrund, gehalten wird und der Inhalt des Becherglases keine optisch wahrnehmbare Trübung oder Schwebeteilchen sowie unterschiedliche Phasen aufweist. Daraufhin werden 1 ,0 g Ethyloleat zu der Mischung gegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese pharmazeutische Zubereitung, Grundmischung, wird anschließend visuell auf Klarheit und Homogenität (s.o.) überprüft.
n) Es werden 5 g einer erfindungsgemäßen pharmazeutische Zubereitung enthaltend Cremophor®EL, lmwitor®303 und Ethyloleat hergestellt. Imwitor®308 muss vor der Verwendung durch Erhitzen auf 40°C auf einem beheizbaren Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) in eine fließfähige Form überführt werden Hierfür werden alle Hilfsstoffe vor ihrer Verwendung gut geschüttelt. Es werden 3,6 g Cremophor®EL und 400 mg lmwitor®308 auf einer "Genius" - Analysenwaage (Sartorius, Göttingen) in ein Becherglas eingewogen und für 5 Minuten bei 500 UpM auf einem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gemischt. Diese Zubereitung wird visuell auf Klarheit und Homogenität kontrolliert, d.h. dass das Becherglas vor eine Lichtquelle, alternativ vor einen schwarzen Hintergrund, gehalten wird und der Inhalt des Becherglases keine optisch wahrnehmbare Trübung oder Schwebeteilchen sowie unterschiedliche Phasen aufweist. Daraufhin werden 1 ,0 g Ethyloleat zu der Mischung gegeben und für 5 Minuten bei 500 UpM auf o.g. Magnetrührer eingerührt. Diese pharmazeutische Zubereitung, Grundmischung, wird anschließend visuell auf Klarheit und Homogenität (s.o.) überprüft. Die Beispiel 1a)-n) lassen sich demnach mit einem Smix von 9:1 , und einem Lipidgehalt (m/m) in der Grundmischung von 20% charakterisieren. Weitere Kombinationen aus diesen Hilfsstoffzusammensetzung ergeben sich zum einen durch ein Ersetzen der Lipidphase durch die amphiphile Phase (Smix), so dass die Zusammensetzung z.B. 10% MCT (Miglyol®812) in der Grundmischung enthält, oder durch ein Ersetzen des Anteils an Emulgatorenmischung (Smix) durch das verwendete MCT. Die Grundmischung enthielte dann typischer Weise 30%, 40% oder 50% Gesamtlipidanteil. Weiterhin lassen sich durch eine Veränderung des Smix zu 3:1 oder 1 :1 weitere Kombinationen in gleicher Weise erstellen, die sich als erfindungsgemäße Zubereitungen geeignet sind.
Beispiel 2: Herstellung wirkstoffhaltiger pharmazeutischer Zubereitungen
a) Es werden 12,5 mg 1 1 ß-Fluoro-7α-{5-[methyl-(7,7,8,8,9,9,10,10,10- nonafluorodecyl)amino]pentyl}estra-1 ,3,5(10)-triene-3,17ß-diol (AE 2) zu 5 g der pharmazeutische Zubereitung aus Beispiel 1 a) beigemengt und so lange auf dem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gerührt, bis der Wirkstoff sich in der Formulierung klar gelöst hat (Überprüfung der Klarheit s. Bsp. 1a). Zur Beschleunigung der Arzneistofflöslichkeit in der Grundlösung erfolgt eine Wärmezufuhr unter Rühren auf ca. 40°C auf dem o.g. Magnetrührer. Nach 24 h wird erneut die Klarheit des Systems überprüft (s. Bsp. 1a).
b) Es werden 10,0 mg 1 ,3,5 (10)-Estratrien-3,17ß-diol x A H20, im folgenden Estradiol (E2) genannt, zu 5 g der pharmazeutische Zubereitung aus Beispiel 11) beigemengt und so lange auf dem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gerührt, bis der Wirkstoff sich in der Formulierung klar gelöst hat (Über- prüfung der Klarheit s. Bsp. 1a). Zur Beschleunigung der Arzneistofflöslichkeit in der Grundlösung erfolgt eine Wärmezufuhr unter Rühren auf ca. 40°C auf dem o.g. Magnetrührer. Nach 24 h wird erneut die Klarheit des Systems überprüft (s. Bsp. 1 a). c) Es werden 10,0 mg AE 2 zu 5 g der pharmazeutische Zubereitung aus Beispiel 1d) beigemengt und so lange auf dem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gerührt, bis der Wirkstoff sich in der Formulierung klar gelöst hat (Überprüfung der Klarheit s. Bsp. 1a). Zur Beschleunigung der Arzneistoff- löslichkeit in der Grundlösung erfolgt eine Wärmezufuhr unter Rühren auf ca. 40°C auf dem o.g. Magnetrührer. Nach 24 h wird erneut die Klarheit des Systems überprüft (s. Bsp. 1a).
d) Es werden 37,5 mg 11 ß-Fluor-7a-[5-methyl-{4,4,5,5,5-pentafluorpentyl-
9sulfanyl]-propyl}amino)-pentyl]-estra-1 ,3,5(10)-trien-,3,17ß-diol (AE1) zu 5 g der pharmazeutische Zubereitung aus Beispiel 1b) beigemengt, wobei der Smix 3:1 beträgt, und so lange auf dem Magnetrührer (Heidolph MR 3001 K) gerührt, bis der Wirkstoff sich in der Formulierung klar gelöst hat (Überprü- fung der Klarheit s. Bsp. 1a). Zur Beschleunigung der Arzneistofflöslichkeit in der Grundlösung erfolgt eine Wärmezufuhr unter Rühren auf ca. 40°C auf dem o.g. Magnetrührer. Nach 24 h wird erneut die Klarheit des Systems ü- berprüft (s. Bsp. 1a).
Beispiel 3:
Test auf schrittweise Wasserverdünnung; pseudoternäre Phasendiagramme
Es werden jeweils 1 ,0 g der erfindungsgemäßen Grundmischungen analog Bsp. 1b), enthaltend Cremophor®EL, lmwitor®308 (Smix 9:1) und Miglyol®812 [variierender Gesamtlipidanteil von 0-100% (m/m)], und analog Bsp. 1a), enthaltend Cremophor®EL, Transcutol®P (Smix 3:1) und Miglyol®812 [variierender Gesamtlipidanteil von 0-100% (m/m)], jeweils ein Magnetrührstäbchen in jeweils ein 16 ml Reagenzglas mit Schliff gegeben. Jede dieser Zubereitungen wird mit Hilfe eines Mischers, MS 1 Minishaker (Fa. IKA, Stauten), auf höchster Stufe für 2-3 Minuten homogen vermischt. Nach der ersten visuellen Beurteilung bei 25°C (s. Bsp. 1a) wird zu jeder Grundmischung anteilig jeweils 10% (v/v+w) Wasser mittels einer Eppendorfpipette zum vorliegenden Ansatz hinzugegeben. Die Systeme werden nach jedem Titrationsschritt ca. 10 s auf dem Kontaktschüttler durchmischt. Es folgt ein temperiertes Equilibrieren bei 37°C (Thermostat F20 MH von Julabo, Seelbach für ein 151 Wasserbad) bei einer Rührgeschwindigkeit von ca. 270 UpM (Variomag® Telemodul 40S mit 60 Magnetrührpositionen). Eine visuelle Beurteilung bei 37°C ( s. Bsp. 1a) findet nach 0,25 - 0,5 h statt. Wasser wird bis zu einem Gesamtwassergehalt von 90% (v/v+w) gemäß der vorstehenden Methode zugegeben.
Treten im Verlauf dieser Verdünnungen halbfeste und gelartige Ansätze auf, werden diese erhitzt (Wasserbad mit 60°C) und daraufhin homogenisiert.
Die so erhaltenen Phasendiagramme sind in Fig. 1a und 1b dargestellt und zeigen, dass insbesondere erfindungsgemäße Grundmischungen mit einem Smix von 9:1 bis zu einem Gesamtlipidanteil von 50% (m/m) und erfindungsgemäße Grundmischungen mit einem Smix von 3:1 bis zu einem Gesamtlipidanteil von 30% (m/m) in der wasserfreien Grundmischung bis mindestens 90% (v/v+w) Gesamtwassergehalt eine klare und homogene Emulsion aufweisen somit für die erfindungsgemäße pharmazeutischen Zubereitungen geeignet sind.
Beispiel 4: Test auf Selbstemulgierbarkeit von wirkstofffreien pharmazeutischen Zubereitungen
a) Es werden jeweils 500 mg der nach Beispiel 1b) hergestellten Grundmischung enthaltend Cremophor®EL und lmwitor®308, Smix 9:1 , und einen je- weiligen Gesamtlipidanteil von 10, 20, 30, 40, 50, und 60% (m/m) Migly- ol®δ12 auf einer Analysenwaage ("Genius", Fa. Sartorius, Göttingen) in jeweils eine 1 ml Einmalspritze eingewogen. Die gefüllte Spritze wird tropfenweise zu 250 ml purelab® Wasser gegeben, das auf 37°C erwärmt und in einer Freisetzungsapparatur DT7R (ERWEKA, Heusenstamm) mit Blattrühr- einsatz mit 60 Umdrehungen pro Minute gerührt wird. Das Freisetzungsgefäß wird vor dem Versuch mit demineralisiertem Wasser gereinigt und am Ende der Reinigungsprozedur mit purelab® Wasser gespült. Die Verdünnungen werden nach 10 Minuten zum einen visuell benotet und zum anderen wird die Teilchengröße mittels PCS ermittelt (vgl. Fig. 2a).
Die Teilchengrößenmessung per PCS erfolgt bei einer Messtemperatur von oder 37°C. Als Brechungswinkel der dispergierten Phasen diente 1 ,46. Der Viskositätswert dieser stark verdünnten Systeme wurde in der Grundeinstellung des Gerätes belassen (Viskositätswert für Wasser in Abhängigkeit der Temperatur).
Wie in Fig. 2a) erkennbar ist, sind Zusammensetzungen mit 10 - 40 % (m/m) Lipid im Präkonzentrat bevorzugt, da sie klare bis bläulich schimmernde Dispersionen (visuelle Beurteilungen von 1 und 2) mit Teilchengrößen von < 200 nm aufweisen. Besonders bevorzugt sind Zusammensetzung mit 10 - 30 % (m/m) Lipid im Präkonzentrat, die klare Dispersionen (visuelle Beurteilungen von 1) und Teilchengrößen von < 100 nm aufweisen, da man hierbei davon ausgehen kann, dass der Wirkstoff in einer gelösten Form zur Verfügung steht. Es wurde die Teilchengröße mit einer Probenanzahl n= 4 ermittelt, so dass
die Standardabweichung nach folgender Formel S = in die
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Figuren eingetragen wird. Die offenen Dreieckigen offenen Symbole geben die visuellen Beurteilungen der unterschiedlichen Proben an.
Es werden 500 mg der analog Beispiel 2d) hergestellten wirkstoffhaltigen Grundmischung enthaltend 2% (m/m) AE2, Cremophor®EL und lmwitor®303,
Smix 9:1 , und einen jeweiligen Gesamtlipidanteil von 10, 20, 30, 40, 50, und 60% (m/m) Miglyol®812 nach Beispiel 4a) auf die spontane Wasserverdünn- barkeit getestet.
Wie in Fig. 2b) erkennbar ist besteht zu der Figur 2a kein signifikanter Unterschied in der visuellen Beurteilung, wie auch in der Teilchengröße. c) Es werden jeweils 500 mg der analog Beispiel 2d) hergestellten wirkstoffhal- tigen Grundmischung enthaltend 7,0 % (m/m) AE1 , Cremophor®EL und Im- witor®30δ, Smix von 3:1 , und einen jeweiligen Gesamtlipidanteil von 10, 20, 30, 40, 50, und 60% (m/m) Miglyol®812 nach Beispiel 4a) auf die spontane Wasserverdünnbarkeit getestet.
Wie in Fig. 2c) erkennbar ist, sind besonders Zusammensetzung mit 10 - 50 % (m/m) Lipid im Präkonzentrat besonders bevorzugt, da sie klare Dispersionen (visuelle Beurteilungen von 1) und Teilchengrößen von < 100 nm erge- ben und damit davon ausgegangen werden kann, dass der Wirkstoff in einer gelösten Form zur Verfügung steht.
d) Es werden jeweils 500 mg der analog Beispiel 2b) hergestellten wirkstoffhal- tigen Grundmischung enthaltend 2,0 % (m/m) E2, Cremophor®EL und Transcutol®P, Smix 9:1 , und einen jeweiligen Gesamtlipidanteil von 10, 20,
30, 40, 50, und 60% (m/m) Rizinusöl (RIZ) nach Beispiel 4a) auf die spontane Wasserverdünnbarkeit getestet.
Wie in Fig. 2d) erkennbar ist, sind Zusammensetzungen mit 10 - 40 % (m/m) Lipid im Präkonzentrat bevorzugt, da sie klare bis bläulich schimmernde Dispersionen (visuelle Beurteilungen von 1 und 2) und Teilchengrößen von < 200 nm ergeben; besonders bevorzugt sind Zusammensetzung mit 10 - 30 % (m/m) Lipid im Präkonzentrat, die klare Dispersionen (visuelle Beurteilungen von 1) und Teilchengrößen von < 100 nm ergeben, da hierbei davon ausgegangen werden kann, dass der Wirkstoff in einer gelösten Form zur
Verfügung steht.
e) Es werden jeweils 500 mg der analog Beispiel 2c) hergestellten wirkstoffhal- tigen Grundmischung enthaltend 2,0 % (m/m) AE2, Estax®54 und Transcu- tol®P, Smix 9:1 , und einen jeweiligen Gesamtlipidanteil von 10, 20, 30, 40,
50, und 60% (m/m) Miglyol® nach Beispiel 4a) auf die spontane Wasserverdünnbarkeit getestet. Wie in Fig. 2e) erkennbar ist, sind Zusammensetzungen mit 40 und 50 % (m/m) Lipid im Präkonzentrat bevorzugt, da sie klare bis bläulich schimmernde Dispersionen (visuelle Beurteilungen: 2) und Teilchengrößen von < 200 nm ergeben. In diesen Fällen kann davon ausgegangen werden, dass der Wirkstoff in einer gelösten Form zur Verfügung steht.
Beispiel 5:
Metabolische Stabilität, in vitro 17ß-HSD2-Test
Es wird eine erfindungsgemäße Formulierung analog Bsp. 1a) hergestellt, enthaltend Cremophor®EL und Transcutol®P, Smix 9:1 , 20% (m/m) Miglyol®δ12, auf ihre Eigenschaft 17ß-HSD2 in intestinalen Mikrosomen zu inhibieren getestet. 17ß-HSD2 vermittelt die intestinale enzymatische Dehydrogenisierung einer OH-Gruppe in Position 17 des Sterangerüsts zu einer Keton-Gruppe. Eine Inhibierung der 17ß-HSD2 wird über eine Testsubstanz, AE2, die Substrat dieses Enzyms ist und zu einem 17-Keto-Produkt biotransformiert wird, gemessen. Es • wird das Verhältnis der AE2-Konzentration und des 17-Keton- Biotransformationsprodukts zu bestimmten Zeitpunkten (0, 10, 20, 30, 45 und 60 Minuten) jeweils zur Anfangs-AE2-Konzentration in % (m/m) ermittelt.
Für diesen Versuch werden folgende Materialien verwendet:
Na-Phosphatpuffer: 100 mM Na2HPO4 x 2H20 und100 mM NaH2PO4 x H20 Testsubstanzlösung von AE2: AE2 50μM in MeOH (im Versuchsansatz 0,3μM) Formulierungsansätze der o.g. erfindungsgemäßen Formulierung (%m/v):
0%, 0,00441 %, 0,0147%, 0,0441 %, 0,147% und 0,441% Formulierung in Na- Phosphatpuffer (im Versuchsansatz 0%, 0,003%, 0,01%, 0,03%, 0,01% und 0,3% Formulierung).
Kofaktor-Lösung: 2 mL Glucose-6-Phoshat (160mM) / MgCI2(80mM)-Mix werden zu 400 μL einer Glucose-6-Phoshat-Dehydrogenase-Lösung gegeben, anschließend werden 15,6 mg NADP und 13,4 mg NAD zugegeben. Mikrosomen-Lösung: Intestinale Mikrosomen (InVitroTechnologies; Proteingehalt: 24 mg/mL; CYP450-Gehalt: 0,058nmol/mg Protein) Im Wasserbad bei 37°C aufgetaut (~60sec) und auf eine Konzentration von 5 mg/mL Protein mit Na-Phosphatpuffer verdünnt.
Es werden jeweils 170 μL/well der Formulierungspuffer und 5 μLΛ/vell Testsubstanzlösung von AE2 in die entsprechenden Wells vorgelegt, wobei für jeden Messzeitpunkt (0, 10, 20, 30, 45 und 60 Minuten) Doppelwerte angesetzt werden. Zu den 0 Minuten-Werten wird jeweils 250μL eiskaltes MeOH gegeben. Unverzüglich danach werden zu allen Wells 25μL Mikrosomen-Lösung und 50μL Ko- faktor-Lösung gegeben. Die Proben der O-Minuten-Werte werden ohne Inkubation bei — 20°C für ca. 24h gelagert. Die anderen Proben werden jeweils für 10, 20, 30, 45 und 60 Minuten bei 37°C inkubiert und durch die Zugabe von jeweils 250 μL eiskaltem MeOH nach diesen Zeitpunkten wird die Dehydrogenisie- rungsreaktion gestoppt. Die Proben werden bis zur Vermessung per HPLC bei ~ -20°C ca. 24h gelagert und vor der HPLC-Analyse bei 3000 Upm zentrifugiert, wobei der Überstand vermessen wird. Die per HPLC gemessenen Konzentrationen an AE2 und 17 Keton-Produkt von AE2 werden in Fig. 3 wiedergegeben.
Beispiel 6:
In vivo i.v./p.o. Test auf Inhibierung intestinaler 17ß-HSD2 durch erfin- dungsgemäße Formulierungen in Ratten
Verwendete Tiere: Ratte, weiblich, 200-250 g, SchöWistar
Verwendete HPßCD-Lösung: Es werden 20,0 g Hydroxypropyl-ß- Cyclodextrin (HPßCD) in 90 ml Wasser für Injektionszwecke gelöst. 1.6 ml einer 1 N HCI Lösung werden zu der Cyclodextrin - Lösung gegeben. Anschließend werden 2,0 g AE2 zu der wässerigen Cyclodextrin Lösung gewogen und bei Raumtemperatur gelöst. 0.2 g NaCI und 0.242 g Trometamol werden abgewogen und in der wirkstoffhaltigen Cyclodextrin Lösung gelöst. Mit 1 N HCI wird auf pH 7.4 eingestellt. Es wird mit Wasser für Injektionszwecke auf ein Endvolumen von 100.0 ml aufgefüllt und umgeschüttelt. Die Lösung wird über 0.2 μm Membranfilter filtriert und 20 min. bei 121 °C autoklaviert.
Verwendete erfindungsgemäße Formulierung: Zubereitung analog Bsp 2a) hergestellt, enthaltend 2 % (m/m) AE2, Cremophor®EL und Transcutol®P, Smix 9:1 , 20% (m/m) Miglyol®812 Verwendete Dosis: i.v. 5 mg/kg AE2 in 20%ige HPßCD-Lösung p.o. 10 mg/kg AE2 in 20%ige HPßCD-Lösung bzw. erfindungsgemäße Formulierung
Der Versuch erstreckt sich über einen Zeitraum von 3 Tagen.
Tag 1 : Es werden an Ratten (R:1 , 2, 3, 5, 6) eine Katheterisierung der
Vena Jugularis unter Narkorennarkose vorgenommen. Tag 2: Es werden R 1 und 2: jeweils 5 mg/kg AE2-HPßCD-Lösung i.v. über die Schwanzvene, R3: 10 mg/kg AE2-HPßCD-Lösung und R 5 und 6: jeweils
10 mg/kg AE2haltige erfindungsgemäße Formulierung (o.g.) p.o. über die p.o.-Applikationnadel appliziert. Blutabnahmen werden zu den vorgegeben Zeitpunkten (i.V.: 5, 15, 30, 45 Minuten, 1 , 2, 4, 6,
8 und 24 h; p.o.: 15, 30, 45 Minuten, 1 , 2, 4, 6, 8 und 24 h) über den Jugularis-Katheter abgenommen und nach Probenaufarbeitung Teil 1 aufbereitet. Tag 3: Abnahme der 24 h-Werte aus der Hohlvene, Probenaufarbeitung Teil 1 und 2
Probenaufarbeitung:
Teil 1 : Serumgewinnung 30 Minuten nach erfolgter Blutabnahme durch
Zentrifugation bei 3000g für 5 min. Anschließend werden 100μL des Serums 1 :5 mit Acetonitril zur Fällung versetzt. Probenlagerung bis zur Analytik per LC/MS/MS bei ~ -20°C (mind. 24h).
Jeil 2: Zentrifugation des gefällten Serums (s. Teil 1) bei 5000g für 5 min;
Abpiettieren der Aliquots für die Analytik per LC/MS/MS Die pharmakokinetischen Parameter werden mittels des Programms WinNon- lin® errechnet. Die jeweiligen Konzentrationen von AE2 und des Metaboliten werden in Fig. 4 wiedergegeben.
Beispiel 7:
Cytochrom P450 Inhibitionstest, in vitro CYP-Test
Materialien für diese in vitro Tests:
96-Loch-Platten, für Fluoreszenzmessungen geeignet Schüttler/Inkubator für 37 °C, Platten-Fluoreszenz-Reader (Fluostar)
Inkubationspuffer: Kalium-Phosphatpuffer, pH 7.4 (KP-Puffer) Stopplösung: Acetonitril/ Tris Base 0.5 M, δO/20 (V/V)
Lösungen der Prüfsubstanzen und Positiv-Kontrolle in Acetonitril, Verdünnungen mit Inkubationspuffer.
Prüfsubstanzen: Cremophor®EL, Cremophor®RH40, Estax®54, Miglyol®812, raff. Rizinusöl, Transcutol®P, Ethyloleat, lmwitor®308, Tween®δ0, 20%igen HPßCD-Lösung (Herstellung in Bsp. 6 beschrieben), erfindungsgemäße Formulierung aus Bsp. 1 a), und Bsp. 1d)
Es werden Stammlösungen der jeweiligen Prüfsubstanzen bzw. -formulierungen in Acetonitril hergestellt und mit Inkubationspuffer verdünnt (im Ansatz 3 mg/ml in 2% Acetonitril); weitere Konzentrationen werden durch serielle Verdünnung hergestellt. Konzentration des Acetonitril beträgt höchstens 2% in allen Ansätzen.
Die Inkubationen werden im 96-Lochplattenformat mit 200μl Gesamtvolumen in Doppelwerten angesetzt. Der Backgroundansatz kontrolliert die Fluoreszenz des Ansatzes ohne Enzym und erfindungsgemäße Formulierung, die Eigenfluoreszenz der Substanzen wird in der Pufferverdünnung bestimmt. Die Zuberei- tung der Verdünnungen und das Pipetierschema entspricht der Originalvorschrift des Herstellers des Prüfkits (Gentest Corp., Woburn, MA, USA).
Die Ansätze werden durch Zugabe des Enzym/Substratgemisches gestartet, 30 bzw. 45 Minuten im Inkubator bei 37 °C geschüttelt, dann mit 50 μl Stopplösung unterbrochen. Die Platten werden kurz geschüttelt und die Fluoreszenz- Intensität im Platten-Fluoreszenz-Reader bei den Wellenlängen für Exzitation bzw. Emission gemessen.
Die Entstehung des fluoreszierenden Produkts bildet die Basis für die Berechnung. Der Vergleich des Substratumsatzes in An- bzw. Abwesenheit der erfindungsgemäßen Formulierung zeigt eine Hemmung des Cytochrom P450- Isoenzyms an. Aus der konzentrationsabhängigen Hemmung wird der IC50-Wert berechnet.
a) Inhibition von rekombinantem, humanem Cytochrom P450 3A4 Isoenzym
Inkubationspuffer: KP-Puffer 200 mM
Enzymgemisch: Glukose-6-Phosphat (G6P) 0,4 mM MgCI2 0,4 mM
NADP+ 8,1 μM
G6Pdehydrogenase (G6PD) 0,2 lU/ml
Rekombinantes humanes CYP450-3A4, 1 pMol /Ansatz Substrat: 7-Benzyloxy-trifluoromethylcoumarin (7-BFC) 50 μM Pos. Kontrolle: Ketokonazol 0,25 - 560 nM
Inkubationsdauer: 30 Minuten
Exzitations-/Emissionswellenlänge: 410/530 nm
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. b) Inhibition von rekombinantem. humanem Cytochrom P450 2C9 Isoenzym
Inkubationspuffer: KP-Puffer 50 mM
Enzymgemisch: Glukose-6-Phosphat (G6P) 0,4 mM MgCI2 0,4 mM
NADP+ 8,1 μM
G6Pdehydrogenase (G6PD) 0,2 lU/ml
Rekombinantes humanes CYP450-2C9, 1 ,0 pMol /Ansatz Substrat: 7-Methoxy-4-trifluoromethylcoumarin (7-MFC) 37,5 μM Pos. Kontrolle: Sulfaphenazol 0,005 - 10 μM
Inkubationsdauer: 45 Minuten
Exzitations-/Emmissionswellenlänge: 410/530 nm
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
c) Inhibition von rekombinantem, humanem Cytochrom P450 2C19 Isoenzym
Inkubationspuffer: KP-Puffer 50 mM
Enzymgemisch: Glukose-6-Phosphat (G6P) 0,4 mM MgCI2 0,4 mM
NADP+ 8,1 μM
G6Pdehydrogenase (G6PD) 0,2 lU/ml Rekombinantes humanes CYP450-2C19,1 ,5 pMol /Ansatz
Substrat: 3-Cyano-7-ethoxycoumarin (CEC) 25 μM Pos. Kontrolle: Tranylcypromin 0,045 - 100 μM
Inkubationsdauer: 30 Minuten
Exzitations-/Emmissionswellenlänge: 410/460 nm
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Beispiel 8:
Test auf Inhibierung der P-gp-Transporter; P-gp-Transporter-Test
Es werden folgende Hilfsstoffe auf Ihre Fähigkeit humane, intestinale P-gp- Transporter zu inhibieren getestet: Cremophor®EL, Estax®54, Cre- mophor®RH40, raff. Rizinusöl, PEG 400, lmwitor®308, Transcutol®P, Miglyol®.
Dafür werden zunächst in eine Mikrotiterplatten (Greiner schwarz 96er Platten, clear bottom, steril) eine Suspension von humanen Brustkrebszellinien, MATU- Zelllinien (Max-Dellbrück-Centrum (MDC)-Berlin-Buch; 40 000 Zellen / well / 200 μl), gegeben. Um eine stabile und hohe Expression von P-gp zu gewährleisten, werden die Zellen werden über 3 Tage mit Adriamycin (ADR)-haltigen Medium kultiviert und dann auf ADR-freies Medium umgestellt.
Das Kulturmedium enthält 500 ml RPMl (2,0 g/l NaHCO3; w/o L-Glutamine, w/o Phenol red, Artikelnr.: F1275, Fa. Biochrom, Berlin), 5 ml PenStrep® (10 000 U Penicillin, 10000μg/ml Streptomycin, Artikelnr.: A2213, Fa. Biochrom, Berlin), 5 ml L-Glutamin (200 mM, Artikelnr.: K02δ3, Fa. Biochrom, Berlin), 50 ml FCS (Artikelnr.: S 0115, Fa. Biochrom, Berlin) und 50 μl Doxorubicin (1 μg/μl).
An Tag 4 werden die Zellen für den Versuch mit Inkubationspuffer gewaschen und anschließend für ca. 10 min in Inkubationspuffer equilibriert. Der Inkubationspuffer, Hepes-Carbonat Puffer, pH 7,2, enthält 12δ,1mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1 ,0 mM MgSO4 x 7 H2O, 1 ,δ mM CaCI2 x 2 H2O, 1 ,2 mM Na2HPO4 x 7 H20, 0,4 mM NaH2PO4 x H2O, 15,0 mM Hepes, 20,0 mM Glucose, 4,2 mM NaHCO3.
Die in 96er-Mikrotiterplatten ausdifferenzierten Zellen werden zunächst 2x mit dem Inkubationspuffer gewaschen. Es wird nun die Mikrotiterplatte in Zonen aufgeteilt. In eine Zone werden 1δ0 μl der jeweiligen Prüflösung pro well zugegeben und die gesamte Mikrotiterplatte wird 30 min bei 37°C vorinkubiert. Die Prüflösungen weisen Konzentrationen von 0,3 bis 33,3 μM der Testsubstanzen auf. Eine 33,3 μM konzentrierte Cremophor®EL-Prüfiösung wird aus einer 30 mM Stammlösung des Hilfsstoffes in DMSO, die 1 :901 mit Inkubationspuffer auf 33,3 μM verdünnt wird und so im Ansatz eine Konzentration von 30 μM ergibt, wobei die Summe der Konzentration an DMSO im Ansatz nicht 0,2% (v/v) über- schreitet. Verdünnungen werden analog hergestellt. Prüflösungen für die o.g. Hilfsstoffe werden analog hergestellt.
Anschließend erfolgt die Zugabe der CaIceinAM-Arbeitslösung (20 μL/well) in alle wells, d.h. in die mit und ohne Prüflösung. Die Platten werden kurz vorsich- tig geschüttelt und weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Die CaIceinAM- Arbeitslösung wird durch Verdünnen einer 1 mM CalceinAM-Stammlösung in DMSO mit Inkubationspuffer zu 10 μM CaIceinAM-Arbeitslösung verdünnt. Nach erfolgter Inkubation wird die Fluoreszenz in einem Platten-Fluoreszenz-Reader (Fluostar®, B&L Systems, Maarssen) bei 465 / 535 nm (Exzitation bzw. Emissi- on) gemessen.
Es wird folgendes Verhältnis Ratio ( R ) von Fluoreszenzintensität Prüflösung zur Fluoreszenzintensität Blank ermittelt.
Fluoreszenzintensität Prüflösung entspricht der Fluoreszenzintensität, gemessen bei 485 / 535 nm (Exzitation bzw. Emission), der Zellen, die Prüflösung und CaIceinAM-Arbeitslösung enthalten.
Fluoreszenzintensität Blank entspricht der Fluoreszenzintensität, gemessen bei 485 / 535 nm (Exzitation bzw. Emission), der Zellen, die keine Prüflösung, je- doch CaIceinAM-Arbeitslösung enthalten und somit als 0-Wert dienen.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 wiedergegeben.

Claims

Patentansprüche:
1. Pharmazeutische Zubereitung, die mindestens einen Emulgator, min- destens einen Hilfsemulgator und/oder Solvent sowie mindestens ein Lipid enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenverhältnis von E- mulgator zu Hilfsemulgator und/oder Solvent (Smix) 1 :1 bis 9:1 und der Gesamtlipidanteil > 0 % (m/m) beträgt, wobei diese Zubereitung mindestens ein intestinales Enzym und/oder mindestens ein intestinales Efflux- System zumindest teilweise inhibiert.
2. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Smix 3:1 bis 9:1 beträgt.
3. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Smix 9:1 beträgt. 4. Pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1-
3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gesamtlipidanteil 10-50% (m/v) beträgt.
5. Pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1-
4, wobei intestinale Enzyme aus der Gruppe der 17ß-Hydroxy-Steroid- Dehydrogenase oder der Cytochrommonooxygenasen und intestinale
Effluxsysteme aus der Gruppe der P-gtykoproteine stammen.
6. Pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1-
5, dadurch gekennzeichnet, dass der Emulgator PEG-40-hydriertes Rizinusöl (Cremophor®RH40), PEG-35-RizinusöI (Cremophor®EL) oder PEG- 400-Monorizinoleat (Estax®54) enthält.
7. Pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1-
6, dadurch gekennzeichnet, dass der Hilfsemulgator und/oder das Solvent Glycerylmonocaprylat > 80% (m/m) (lmwitor®308) oder Diethylengly- colmonoethylether (Transcutol®P) enthält. 8. Pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1-
7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid Triglyceride, fetten Öle oder Wachse enthält.
9. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Triglycerid Mittelkettige Triglyceride (Miglyol®) enthält.
10. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das fette Öl Rizinusöl, Olivenöl, Maiskeimöl, Sojaöl, Sonnen- blumenkernöl, Erdnussöl, Walnussöl oder Diestelöl enthält.
11. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch δ, dadurch gekennzeichnet, dass das Wachs Ethyloleat oder Isopropylmyristat enthält.
12. Pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1- 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung zusätzlich mindestens einen Arzneistoff enthält.
13. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Arzneistoff lipophil und/oder wasserunlöslich oder hydrophil ist.
14. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch ge- kennzeichnet, dass mindestens ein Arzneistoff ein Substrat mindestens eines intestinalen Enzyms und/oder eines intestinales Effluxsystems ist.
15. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein intestinales Enzym aus der Gruppe der 17ß- Hydroxy-Steroid-Dehydrogenasen und/oder Cytochrom-Monooxygenasen stammt.
16. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein intestinales Enzym 17ß-HSD 2 ist und/oder aus der Gruppe der Cytochrom P 450 3A- Monooxygenasen stammt.
17. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeich- net, dass mindestens ein intestinales Effluxsytem aus der Gruppe der P- gp-Transporter-Systeme stammt.
18. Pharmazeutische Zubereitung nach einer der Ansprüche 12-17, dadurch gekennezichnet, dass mindestens ein Arzneistoff ein Steroid ist.
19. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeich- net, dass das Steroid in Position 17 des Sterangerüsts eine sekundäre, betaständige Hydroxylgruppe enthält.
0. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroid ein Estrogen, ein Antiestrogen oder ein Androgen ist. 1 . Pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1 δ-20, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroid 1 1-α-
Hydroxynandrolon, 16-α-Fluorestradiol, 16-α-lodestradiol, 16-ß- Fluorestradiol, 2,4-Dibromestradiol, 2-Chlorestradiol, 2-Ethoxyestradiol, 2-Fluorestradiol, 2-HydroxyestrioI, 2-Methoxyestradiol, 2-Methoxyestriol, 2-Methoxymethylestradiol, 3-Methoxyestriol, 4-Bromestradiol, 4- Chlorestradiol, 4-Fluor-17ß-estradiol, 4-Hydrxyestradioi, 4-
Hydroxytestosteron, 4-Methoxyestradiol, 5-ß-Androstan-17ß-ol-3-on, 6- α-Hydroxyestradiol, 3α, 17ß-Androstandiol, 3ß,17ß -Androstandiol, Androstanolon, Androstendiol, Bolandiol, Bolazin, Boldenon, Clostebol, Dacuroniumbromid, 17-Deacetylpancuronium, Dideactetylvecurronium, Vecuronium, 17ß-Dihydroequilin, 5α-Dihydro-19-nortestosteron, 16α-
Brom-7α-(N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra-1 , 3,5(10)-trien-3,17ß- diol, 16α-Chlor-7α-(N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra-1 ,3,5(10)-trien- 3,17ß-diol, 16α-lod-7α-(N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra-1 ,3,5(10)- trien-3,17ß-diol, 16α-Brom-7α-(N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra- 1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol, Epiestriol, Epitiostanol, Estetrol, Estradiol,
Estradiol-3-glucuronid, Estradiol-3-methylether, Estradiol-3-sulfat, Estra- diol-3-bezoat, Estradiol-3-hexahydrobenzoat, Estramustin, Estriol, Estriol- 3-glucuronid, Estriol-3-sulfat, Estriol-16-glucuronid, Estrynamin, 17ß- Hydroxy-6-methylen-androsta-1 ,4-dien-3-on, Fulvestrant, 1-Hydroxy-17ß- estradiol, 2-Hydroxy-17ß-estradiol, 4-Hydroxy-17ß-estradiol, 6-Hydroxy-
17ß-estradiol, 7-Hydroxy-17ß-estradiol, 15-Hydroxy-17ß-estradiol, 13- Hydroxy-17ß-estradiol, 7-(N-butyl-undecanamid)-3,17ß-estra-1 ,3,5(10)- trien-3,17ß-diol, 7α-(N-butyl-undecanamid)-3, 17ß-estra-1 , 3,5(10)-trien- 3, 17ß-diol, Estra-1 , 3,5(10)-trien-7ß-(N-butyl)undecanamid-3,17ß-diol, 7α- (N-butyl, N-methyl-undecanamid)-estra-1 , 3,5(10)-trien-3, 17ß-diol, Inoco- teron, Estra-3-sulfamate-1 ,3,5(10),7-tetraen-3,17ß-diol, Cyc- loprop[14S,15ß]- 3', 15-dihydro-estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol, Estra- 1 , 3,5(10)-trien-3-sulfamat-17ß-ol, Mesterolon, Methenolon, 16- Methylenestradiol, Metogest, Nandrolon, Nisterim, Norelostebol, 3- Octyloxy-5α-androst-3-en-17ß-ol, Estradiol- 17-phenylpropionat-Estradiol- benzoat mixt., 7-Ethyl-nandrolon, 1 1 ß-Chlormethyl-estra-3, 17ß-diol, Pi- peridinium-1-[(2ß,3α,5α,16ß,17ß)-3,17-dihydroxy-2-(1- piperidinyl)androstan-16-yl]-1-methyl-bromid, 17-Desacetylrocuronium,
Oxendolon, 1 1 α-Methoxy-7α-methyl-estra-3-17ß-diol, Quinestradol, 17ß- Hydroxy-7α-methyl-androst-5-en-3-one, 1 1 α-ethenyl-estra-3, 17ß-diol, 1 1 ß-[4(dimethylamino)phenyl]-estra-3, 17ß-diol, 7α-{4-[2- (dimethylamino)ethoxy]phenyl}-estra-3,17ß-diol, 1 1 ß-{4- [(methylsulfonyl)oxy]phenyl}-estra-3,17ß-diol, 1 1 ß-{4-[[5-[(4,4,5,5,5- pentafluorpentyl)sulfonyl]pentyl]oxy]phenyl}-estra-3,17ß-diol, 17ß- Dihydroxy-9α-fluor-1 1 ß-androsta-1 ,4-dien-3-on, Stenbolon, Cyc- loprop[14R, 15α]estra-3',15-dihydro-3-methoxy-1 ,3,5(10)-trien-17ß-oi, Cycloprop[14S,15ß]estra-3',15-dihydro-3-methoxy-1 ,3,5(10)-trien-17ß-ol, Testosteron, Trestolon, Trilostan, 13ß-Ethyl-δα-gon-1 , 3,5(10)-trien-
3,16α,17ß-triol, 13ß-Ethyl-δß-gon-1 ,3,5(10)-trien-3,16α,17ß-triol, Estra-2- {tricycio[3.3.1.13,7]decyl}-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol, Ent-estradiol, 3ß- Vinyl-estradiol, 1 1 ß-Fluor-7α-{5-[N-methyl-N-3-(4,4, 5,5,5- pentafluorpentylthio)-propylamino]-pentyl}-estra-1 , 3,5(10)-trien-3, 17ß-diol , 1 1 ß-Fluoro-7α-{5-[methyl-(7,7,δ,δ,9,9,10,10, 10- nonaf luorodecyl)amino]pentyl}estra-1 ,3,5(10)-trien-3, 17ß-diol, 1 1 ß- Fluoro-17α-methyl-7α-{5-[methyl-(δ,δ,9,9,9- pentafluornonyl)amino]pentyl}estra-1 ,3,5(10)-trien-3,17ß-diol, 17ß- Hydroxy-14α, 15α-methylen-androst-4-en-3-on , 17ß-Hydroxy-7α-Methyl- 14α, 15α-methylen-androst-4-en-3-on, 4-Chlor-17ß-Hydroxy-14α, 15α- methylen-androst-4-en-3-on, 4, 17ß-Dihydroxy-14α, 15α-methylen- androst-4-en-3-on, 17ß-Hydroxy-14α,15α-methylen-androsta-1 ,4-dien-3- on, 4-Chlor-17ß-Hydroxy-14α,15α-methyIen-androsta-1 ,4-dien-3-on, 4- Chlor-17ß-Hydroxy-14α,15α-methylen-estr-4-en-3-on, 7ß-Hydroxy-7α- Methyl-14α, 15α-methylen-estr-4-en-3-on, 17ß-Hydroxy-14α,15α- methy!en-estr-4-en-3-on, 4, 17ß-Dihydroxy-14α,15α-methylen-estr-4-en-3- on, 17ß-Hydroxy-14α,15α-methylen-estra-4,9,1 1-trien-3-on, 3-Ethyl-17ß- hydroxy-14α,15α-methylen -gon-4-en-3-on, 17a-ß-Hydroxy-17a- homoandrosta-4,15-dien-3-on, 1"-Mesyl-17α-(trifluormethyl)-1'H- pyrazol[4",5':2,3]androst-4-en-17ß-ol.
22. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1-21 zur Herstellung eines peroralen Arzneimittels zur Inhibierung mindestens eines intestinales Enzyms und/oder mindestens eines intestinales Effluxsystems.
23. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein intestinales Enzym aus der Gruppe der 17ß-Hydroxy-Steroid-Dehydrogenasen und/oder Cytoch- rom-P450-Monooxygenasen stammt.
24. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein intestinales Enzym 17ß- HSD 2 ist und/oder aus der Gruppe der Cytochrom-P450-3A- Monooxygenasen stammt. 25. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein intestinales Effluxsystem ein P-gp-Transporter ist.
26. Verwendung einer pharmazeutischen Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 22-25, dadurch gekennzeichnet, dass das Arznei- mittel aus der Gruppe der Therapeutika, Prophylaktika oder Diagnostika kommt.
27. Verfahren zur Erhöhung der Bioverfügbarkeit von peroral zu applizierenden Arzneistoffen, dadurch gekennzeichnet, dass eine pharmazeutische Zubereitung nach mindestens einem der Ansprüche 1-21 einen Arznei- stoff enthält und peroral appliziert wird.
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