WO2004027086A1 - Procede de detection de microorganismes resistants a la meticilline - Google Patents

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WO2004027086A1
WO2004027086A1 PCT/FR2003/002788 FR0302788W WO2004027086A1 WO 2004027086 A1 WO2004027086 A1 WO 2004027086A1 FR 0302788 W FR0302788 W FR 0302788W WO 2004027086 A1 WO2004027086 A1 WO 2004027086A1
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methicillin
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Alain Rambach
Alain Le Coustumier
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Alain Rambach
Alain Le Coustumier
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus

Definitions

  • the invention relates to a new gelled medium for detecting microorganisms resistant to methicillin, in which an antibiotic chosen from the group of cephalosporins, in particular second or third generation, is present, and a chromogenic agent carrying a chromophore released after hydrolysis with a enzyme active in said microorganisms.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • Agar growth media have been proposed supplemented with tobramycin or ofloxacin, either in bases which are not very discriminating (derived from
  • the agar diffusion method is also used, for example Mueller Hinton agar, which consists of depositing paper discs impregnated with antibiotics on an agar seeded with the bacterium to be studied. A gradient of antibiotic concentration around each disc is established in the agar. After incubation, there is an inhibition halo around each disc which makes it possible to measure a diameter, which reflects the value of the MIC (minimum inhibition concentration, minimum concentration for which no growth of microorganisms is detected).
  • Mueller Hinton agar which consists of depositing paper discs impregnated with antibiotics on an agar seeded with the bacterium to be studied. A gradient of antibiotic concentration around each disc is established in the agar. After incubation, there is an inhibition halo around each disc which makes it possible to measure a diameter, which reflects the value of the MIC (minimum inhibition concentration, minimum concentration for which no growth of microorganisms is detected).
  • the present invention relates to an agar culture medium making it possible to detect microorganisms resistant to methicillin, and in particular staphylococci, in particular golden staphylococci, with good sensitivity and good specificity.
  • the discriminating capacities of the chromogenic media are used, in combination with the properties of antibiotics of the family of cephalosporins of 2 nd or 3 rd generation, which make it possible to detect microorganisms resistant to methicillin.
  • the invention therefore relates to a medium for the detection of microorganisms resistant to methicillin, comprising, in addition to nutrients allowing the growth of said microorganisms, at least one antibiotic chosen from the group of second or third generation cephalosporins, and a chromogenic agent. releasing a chromophore after hydrolysis with an active enzyme in said microorganisms.
  • the culture media according to the invention allow direct detection of microorganisms resistant to methicillin, due to their growth on the medium according to the invention and the presence of the chromogenic agent (s), to define the nature of the microorganism. There is therefore no need for an additional step of confirming the nature of the microorganisms growing on the medium according to the invention.
  • the media according to the invention allow the detection of bacteria resistant to methicillin, from a striated inoculum on a dish, while the majority of the methods of the prior art use a deposit of approximately 10 4 to 10 5 bacteria on agar.
  • the media according to the invention can be used directly from a sample from a patient, or after an enrichment phase.
  • cephalosporin is intended to denote the antibiotics of the cephalosporin family having a formula derived from the following formula (I):
  • R2 is a group H, acetoxy-methyl, methyl-thiotetrazole, dimethyl-amino-ethyl-thiotetrazole, triazine, acetamino-pyridine (pyridinium), or pyridinium substituted by a carbamoyl, cyclo-pento-pyridinium, thiomethyl-acetoxy group -thiazole, RI is an amino-2-thiazole heterocycle, an ⁇ -piperazine-dione, an ⁇ -sulfo-phenyl, and R4 is an H group or an ⁇ -methoxy radical.
  • R3 is an H group or an ⁇ -methoxy-imino group.
  • the group R4 is hydrogen.
  • Cephamycins are compounds in which the R4 group is an ⁇ -methoxy radical, protecting the ⁇ -lactam nucleus from hydrolysis by ⁇ -lactamases and correspond to the following formula:
  • Oxacephems are compounds in which the sulfur atom of the cephem nucleus is replaced by an oxygen atom, and are considered to be derived from formula (I) presented above.
  • the group R4 is an ⁇ -methoxy.
  • a definition of the cephalosporins thus envisaged can be found in Binger (Mechanism of Action of Beta-lactams, (from the bacterial structure to the structure of the molecule), 1986 Roussel (Paris) editor, chapter III pages 47-62, and chapter IV pages 63-68), and in Richmond (Beta-lactam antibiotics (the background to their use as therapeutic agents), Hoechst Aktiengesellschaft, D- 6230 Frankfurt (Main) 80 publisher, 1981, chapter 3 pages 55- 65).
  • second generation cephalosporins have a better effect than first generation cephalosporins against Gram negative bacteria and are more resistant to degradation by ⁇ -lactamases, third generation cephalosporins having a spectrum of even larger effect against Gram negative bacteria.
  • cephalosporins we can cite: loracarbef, cefaclor, cefuroxime, cefprozil, cefoxitin (cefoxitan), cefamandole, cefotian, cefotetan, cefmetazole, cefocinide, ceforanide, cefpodoximefaxime, cefpodoxime, cefpodoxime cefmenoxime, cefodizime, cefoperazone, cefepime, cefpirome, cefsulfonide, cefetamete, ceftibutene, moxalactam, latamoxef and fiomoxef, especially in the form of (sodium) salts.
  • said antibiotic is cefamandole.
  • said antibiotic is chosen from the group of cephamicins (cefoxitin, cefotetan, cefmetazole, cefbupérazone, cefminox) and oxacephems (moxalactam, latamoxef or flomoxef).
  • cephamicins cefoxitin, cefotetan, cefmetazole, cefbuperazone, cefminox
  • oxacephems mixalactam, latamoxef or flomoxef.
  • said antibiotic is cefoxitin.
  • said antibiotic is cefmetazole.
  • said antibiotic is moxalactam.
  • said antibiotic is cefotetan.
  • the antibiotic concentration in the medium according to the invention is preferably between 0.5 and 50 mg / 1, preferably 1.5 and 30 mg / 1, in particular 1.5 and 15 mg / 1.
  • a stability of at least 2 months has been observed for a medium in accordance with the invention prepared with cefoxitin at a concentration of 5 mg / 1, added to the medium when the latter is at a temperature of 48 °. vs.
  • the stability of the medium in accordance with the invention has been increased to at least 5 months when it has been prepared with cefmetazole at a concentration of 2.5 mg / 1, added to the medium when the latter is at a temperature of 48 ° C.
  • stability of the medium is meant the capacity of the medium according to the invention to allow the selective detection of microorganisms resistant to methicillin, in particular golden staphylococci, for a given time, with the same reliability throughout the duration of the period.
  • flomoxef another cephalosporin, flomoxef, has the ability to maintain its antibiotic activity when it is subjected to a temperature above 100 ° C (its resistance having even been verified by the inventors at 121 ° C).
  • a temperature above 100 ° C makes it possible to produce a medium in accordance with the invention in the form of a single powder, which considerably limits the manipulations necessary to be carried out under sterile conditions for the preparation of any culture medium.
  • the flomoxef can therefore be incorporated into the medium in preparation before heating which facilitates the preparation. This advantage is not negligible because it is likely to facilitate the task of any person having to prepare such environments, whatever their experience in the matter.
  • said microorganisms are staphylococci, and a chromogenic agent is preferably used chosen from the group consisting of 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate and 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside, as well as described in application WO 00/53799.
  • Culture media for S. aureus are known and described in particular in the manual "Oxo ⁇ d Unipath Limited", Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 OPW, England. It can be, for example, "Nutrient Agar Oxo ⁇ d CM3", a medium essentially based on yeast, peptone and agar extracts.
  • said culture medium contains both 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate and 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside.
  • the media according to the present invention will preferably contain from 0.01 to 0.50 g / l, in particular from 0.05 to 0.40 g / l of 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate, preferably from 0.01 to 0.20 g / 1 of 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside, preferably from 0.01 to 0.20 g / 1 of 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside, preferably of 0.01 to 0.20 g / 1 of 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide.
  • the culture medium according to the invention further comprises at least one of the following two chromogenic agents: 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside and 5-bromo 4-chloro 3- indoxyl glucuronide.
  • said medium also contains deferoxamine.
  • deferoxamine makes it possible to inhibit Staphylococcus epidermis without inhibiting Staphylococcus aureus, the concentration used will preferably be between 0.01 and 0.10 g / l.
  • the medium according to the invention also contains a glycopeptide antibiotic chosen from the group consisting of vancomycin, teicoplanin and avoparcin and their mixtures, to detect microorganisms resistant to both methicillin and vancomycin.
  • a glycopeptide antibiotic chosen from the group consisting of vancomycin, teicoplanin and avoparcin and their mixtures, to detect microorganisms resistant to both methicillin and vancomycin.
  • the inventors have shown that it is not necessary to have a high osmotic charge in the culture medium.
  • the culture medium of the invention is also functional with a sodium concentration of less than 3 %, and equal to about 2-2.5%.
  • the incubation conditions can be adapted as a function of the quantity of sodium chloride in the medium (duration of incubation, more or less high temperature, etc.).
  • the invention also relates to the use of a medium according to the invention for the detection of microorganisms resistant to methicillin.
  • the invention also relates to a method for detecting microorganisms resistant to methicillin in a sample, comprising the steps consisting in: inoculating a medium according to the invention with said sample or an inoculum from said sample, - incubating said medium in conditions allowing the growth of said microorganisms, detecting, on said medium, the presence of said microorganisms resistant to methicillin, by the presence of colored colonies.
  • incubation conditions are known to those skilled in the art, and incubation at temperatures between 25 ° C and 42 ° C, preferably between 30 ° C and 38 ° C, is generally used.
  • the incubation times are conventional (approximately 24 hours).
  • the medium according to the invention makes it possible in particular to easily detect metapillin-resistant staphylococci, by reducing the analysis time.
  • the combination of the antibiotics chosen within the framework of the invention and the agents Chromogens in fact make it possible to reduce the number of false positives and false negatives, and thus to reduce the need to carry out additional analyzes.
  • composition of a medium according to the invention for the detection of S. aureus resistant to methicillin
  • Oxacillin (6 mg / ml) or cefoxitin (5 mg / 1) is added to this medium, after autoclaving, before the medium is solid (when it is at a temperature of approximately 45 ° C).
  • This medium contains 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate and 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside, allowing the specific detection of golden staphylococci (purple coloration of colonies), as well as 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside and 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide, to color the other microorganisms that may be present in the inoculum.
  • AR4295 MetiS strain sensitive to methicillin
  • AR4297 MetiR strain resistant to methicillin (homogeneous)
  • MRhet strain resistant to methicillin (heterogeneous)
  • Z252 strain resistant to methicillin, homogeneous, low level of resistance
  • the petri dishes are inoculated with bacterial cultures by striating the dishes, to observe the growth of isolated bacteria, after incubation at 37 ° C. for 24 hours.
  • the growing bacteria give purple colonies on the culture medium, confirming that the microorganisms are golden staphylococci.
  • the medium according to the invention makes it possible to directly detect golden staphylococci resistant to methicillin, including heterogeneous strains or with a low level of resistance, due to the combination of the growth of bacteria and the coloration of the colonies.

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Abstract

L’invention se rapporte à un nouveau milieu solide de détection de microorganismes résistants à la méticilline, dans lequel sont présents un antibiotique choisi dans le groupe des céphalosporines notamment de seconde ou troisième génération, et un agent chromogène portant un chromophore libéré après hydrolyse avec une enzyme active chez lesdits microorganismes.

Description

PROCEDE DE DETECTION DE MICROORGANISMES RESISTANTS A LA METICILLINE
L'invention se rapporte à un nouveau milieu gélifié de détection de microorganismes résistants à la méticilline, dans lequel sont présents un antibiotique choisi dans le groupe des céphalosporines notamment de seconde ou troisième génération, et un agent chromogène portant un chromophore libéré après hydrolyse avec une enzyme active chez lesdits microorganismes.
La détection systématique des Staphylococcus aureus résistants à la méticilline (aussi écrite méthicilline) (MRSA) est importante.
En effet, bien que les MRSA ne semblent pas plus virulents que les MSSA, (Staphylocoques dorés sensibles à la méticilline), leurs infections sont plus difficiles et onéreuses à traiter. Ceci est dû à ce que la méti-résistance confère la résistance à toutes les béta-lactamines et que cette résistance est très souvent associée à des résistances à de nombreux autres antibiotiques antistaphylococciques majeurs (Lyon et Skurry, Microbiol. Rev. 51 ; 88 - 134)
Pour cette détection on a parfois utilisé des milieux de croissance géloses supplémentés à la méticilline. Cette méthode est maintenant souvent abandonnée car elle détecte mal certaines souches MRSA, en particulier des souches hétérogènes dans lesquelles des populations bactériennes contiennent une proportion très faible de bactéries franchement résistantes à la méticilline (dans lesquelles 1 bactérie sur 10 ou 10 exprime la résistance). Cette méthode donne un nombre important de résultats faux négatifs.
L'utilisation de milieux de croissance géloses supplémentés à l'oxacilline est fréquente mais, comme avec la méticilline, certaines souches sont difficiles à détecter.
De plus, pour que ces antibiotiques (méticilline, oxacilline) fonctionnent à peu près efficacement comme suppléments sélectifs, on est contraint de n'employer que certains milieux de croissance. En conséquence les milieux proposés à l'utilisateur sont par exemple des dérivés du Muller Hinton Agar ou du Mannitol
Sait Agar. Malheureusement pour l'utilisateur ces milieux sont souvent peu discriminants pour l'espèce S. aureus ce qui diminue encore la sensibilité et la spécificité. On a proposé des milieux de croissance géloses supplémentés à la tobramycine ou l'ofloxacine, soit dans des bases peu discriminantes (dérivées du
Mannitol sait Agar par exemple), soit dans la base très discriminante du
CHROMagar Staph aureus, mais la corrélation avec la résistance à la méticilline est médiocre d'où un excès de faux positifs et de faux négatifs.
On utilise aussi la méthode de diffusion sur gélose, par exemple la gélose Mueller Hinton, qui consiste à déposer des disques de papier imprégnés d'antibiotiques sur une gélose ensemencée avec la bactérie à étudier. Il s'établit dans la gélose un gradient de concentration d'antibiotique autour de chaque disque. Après incubation, il se produit un halo d'inhibition autour de chaque disque qui permet de mesurer un diamètre, qui reflète la valeur de la CMI (concentration minimale d'inhibition, concentration minimale pour laquelle aucune croissance des microorganismes n'est détectée).
La présente invention se rapporte à un milieu de culture gélose permettant de détecter les microorganismes résistants à la méticilline, et en particulier les staphylocoques, notamment les staphylocoques dorés, avec une bonne sensibilité et une bonne spécificité.
Ainsi, dans le cadre de la présente invention, on utilise les capacités discriminantes des milieux chromogènes, en combinaison avec les propriétés des antibiotiques de la famille des céphalosporines de 2eme ou 3eme génération, qui permettent de détecter les microorganismes résistants à la méticilline.
L'invention se rapporte donc à un milieu pour la détection de microorganismes résistants à la méticilline, comprenant, outre des nutriments permettant la croissance desdits microorganismes, au moins un antibiotique choisi dans le groupe des céphalosporines de seconde ou troisième génération, et un agent chromogène libérant un chromophore après hydrolyse avec une enzyme active chez lesdits microorganismes.
Les milieux de culture selon l'invention permettent une détection directe des microorganismes résistants à la méticilline, en raison de leur croissance sur le milieu selon l'invention et de la présence de(s) l'agent(s) chromogène(s), permettant de définir la nature du microorganisme. On n'a donc pas besoin d'étape supplémentaire de confirmation de la nature des microorganismes poussant sur le milieu selon l'invention. Les milieux selon l'invention permettent la détection de bactéries résistantes à la méticilline, à partir d'un inoculum strié sur boîte, alors que la majorité des méthodes de l'art antérieur utilisent un dépôt d'environ 104 à 105 bactéries sur la gélose. On peut utiliser les milieux selon l'invention directement à partir d'un prélèvement à partir d'un patient, ou après une phase d'enrichissement.
Par céphalosporine de seconde ou troisième génération, on entend désigner les antibiotiques de la famille des céphalosporines présentant une formule dérivée de la formule (I) suivante :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle R2 est un groupement H, acétoxy-méthyle, méthyl-thiotétrazole, diméthyl-amino-éthyl-thiotétrazole, triazine, acétamino-pyridine (pyridinium), ou pyridinium substitué par un groupement carbamoyl, cyclo-pento-pyridinium, thiométhyl-acétoxy-thiazole, RI est un hétérocycle amino-2-thiazole, une α- pipérazine-dione, un α-sulfo-phényle, et R4 est un groupement H ou un radical α- méthoxy.
En particulier, on entend désigner les composés présentant la formule suivante :
Figure imgf000004_0002
dans laquelle R3 est un groupement H ou un groupement α-méthoxy-imino. Dans un cas particulier, le groupement R4 est un hydrogène.
Les céphamycines sont des composés dans lesquels le groupement R4 est un radical α-méthoxy, protégeant le noyau β-lactame de l'hydrolyse par les β- lactamases et répondent à la formule suivante :
Figure imgf000005_0001
Les oxacephems sont des composés dans lesquels l'atome soufre du noyau céphem est remplacé par un atome d'oxygène, et sont considérés comme dérivés de la formule (I) présentée plus haut.
Figure imgf000005_0002
En général, pour ces composés, le groupement R4 est un α-méthoxy. Une définition des céphalosporines ainsi envisagées peut être trouvée dans Binger (Mécanisme d'Action des Bêta-lactamines, ( de la structure bactérienne à la structure de la molécule ), 1986 Roussel (Paris) éditeur, chapitre III pages 47-62, et chapitre IV pages 63-68), et dans l'ouvrage de Richmond (Beta-lactam antibiotics (the background to their use as therapeutic agents ), Hoechst Aktiengesellschaft, D- 6230 Frankfurt (Main) 80 éditeur, 1981, chapitre 3 pages 55-65).
A titre accessoire, on peut noter que les céphalosporines de seconde génération présentent un meilleur effet que les céphalosporines de première génération contre les bactéries Gram négatives et résistent mieux à la dégradation par les β-lactamases, les céphalosporines de troisième génération présentant un spectre d'effet encore plus large vis-à-vis des bactéries Gram négatives.
Parmi les céphalosporines de seconde et troisième génération, on peut citer : loracarbef, cefaclor, cefuroxime, cefprozil, cefoxitin (cefoxitan), cefamandole, cefotian, cefotetan, cefmetazole, cefocinide, ceforanide, cefpodoxime, cefixime, cefotaxime, ceftizoxime, ceftriaxone, ceftazidime, cefmenoxime, cefodizime, cefoperazone, cefepime, cefpirome, cefsulfonide, cefetamete, ceftibutene, moxalactam, latamoxef et fiomoxef, notamment sous forme de sels (sodiques). L'homme du métier peut obtenir des listes de tels composés, notamment sur Internet au site www.biam2.org ou www.fpnotebook.com. Dans un mode de réalisation préféré, ledit antibiotique est le cefamandole.
Dans un autre mode de réalisation, ledit antibiotique est choisi dans le groupe des céphamicines (cefoxitine, cefotetan, cefmetazole, cefbupérazone, cefminox) et des oxacephems (moxalactam, latamoxef ou flomoxef). Dans un mode de réalisation préféré, ledit antibiotique est la cefoxitine.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit antibiotique est le cefmetazole.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit antibiotique est le moxalactam.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit antibiotique est le cefotetan.
La concentration en antibiotique dans le milieu selon l'invention est de préférence comprise entre 0,5 et 50 mg/1, de préférence 1,5 et 30 mg/1, en particulier 1,5 et 15 mg/1. Quelques essais de routine permettent à l'homme du métier de l'ajuster en fonction de la CMI (concentration minimale d'inhibition, concentration minimale pour laquelle aucune croissance des microorganismes n'est détectée) des microorganismes considérés pour l'antibiotique considéré. II est à noter que parmi les antibiotiques susceptibles d'entrer dans la composition d'un milieu de l'invention, certains sont capables de conférer certaines propriétés audit milieu. Par exemple, la cefoxitine ou le cefmetazole confèrent une stabilité particulière, d'au moins 2 mois audit milieu.
Par exemple, on a observé une stabilité d'au moins 2 mois pour un milieu conforme à l'invention préparé avec de la cefoxitine à une concentration de 5 mg/1, ajoutée au milieu quand celui-ci est à une température de 48°C. La stabilité du milieu conforme à l'invention a été portée à au moins 5 mois quand celui-ci a été préparé avec du cefmetazole à une concentration de 2,5 mg/1, ajouté au milieu lorsque celui-ci est à une température de 48°C. Par « stabilité du milieu », on entend désigner la capacité du milieu conforme à l'invention à permettre la détection sélective de microorganismes résistants à la méticilline, en particulier des staphylocoques dorés, pendant un temps donné, avec la même fiabilité pendant toute la durée de la période.
Il est également à noter qu'une autre céphalosporine, le flomoxef, présente quant à lui la capacité à conserver son activité antibiotique lorsqu'il est soumis à une température supérieure à 100°C (sa résistance ayant même été vérifiée par les inventeurs à 121°C). Une telle propriété permet de réaliser un milieu conforme à l'invention sous forme d'une unique poudre, ce qui limite considérablement les manipulations nécessaires à effectuer dans des conditions stériles pour la préparation de tout milieu de culture. Le flomoxef peut donc être incorporé au milieu en préparation avant chauffage ce qui en facilite la préparation. Cet avantage n'est pas négligeable car est de nature à faciliter la tâche de toute personne ayant à préparer de tels milieux, quelle que soit son expérience en la matière.
Dans un mode de réalisation préféré, lesdits microorganismes sont des staphylocoques, et on utilise préférentiellement un agent chromogène choisi dans le groupe constitué du 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate et du 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside,ainsi que décrit dans la demande WO 00/53799.
Les milieux de culture de S. aureus sont connus et décrits notamment dans le manuel "Oxoïd Unipath Limited", Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 OPW, Angleterre. Il peut s'agir, par exemple de "Nutrient Agar Oxoïd CM3", milieu essentiellement à base d'extraits de levure, de peptone et d'agar.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit milieu de culture contient à la fois du 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate et du 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside.
Les milieux selon la présente invention contiendront, de préférence, de 0,01 à 0,50 g/1, notamment de 0,05 à 0,40 g/1 de 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate, de préférence de 0,01 à 0,20 g/1 de 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside, de préférence de 0,01 à 0,20 g/1 de 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside, de préférence de 0,01 à 0,20 g/1 de 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide.
Dans un mode de réalisation particulier, le milieu de culture selon l'invention comporte, en outre, au moins l'un des deux agents chromogènes suivants : 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside et 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit milieu contient en outre de la déféroxamine. La déféroxamine permet en effet d'inhiber Staphylococcus epidermis sans inhiber Staphylococcus aureus, la concentration mise en oeuvre sera de préférence comprise entre 0,01 et 0,10 g/1.
Dans un mode de réalisation, le milieu selon l'invention contient également un antibiotique glycopeptide choisi dans le groupe constitué de la vancomycine, la teicoplanine et l'avoparcine et leurs mélanges, afin de détecter les microorganismes résistants à la fois à la méticilline et à la vancomycine. On peut utiliser environ de
5 mg/1 à 50 mg/1 de ces antibiotiques, plus particulièrement de 5 mg/1 à 30 mg/1, de
10 mg/1 à 30 mg/1, environ 25 mg/1. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont montré qu'il n'est pas nécessaire d'avoir une forte charge osmotique dans le milieu de culture. Ainsi, contrairement aux milieux de détection de staphylocoques dorés résistants à la méticilline, utilisant l'oxacilline comme antibiotique, dans lesquels on ajoute du chlorure de sodium, le milieu de culture de l'invention est également fonctionnel avec une concentration de sodium inférieure à 3 %, et égale à environ 2-2,5 %. Les conditions d'incubation peuvent être adaptées en fonction de la quantité de chlorure de sodium dans le milieu (durée d'incubation, température plus ou moins élevée...).
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'un milieu selon l'invention pour la détection de microorganismes résistants à la méticilline. L'invention se rapporte également à un procédé de détection de microorganismes résistants à la méticilline dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : inoculer un milieu selon l'invention avec ledit échantillon ou un inoculum issu dudit échantillon, - incuber ledit milieu dans des conditions permettant la croissance desdits microorganismes, détecter, sur ledit milieu, la présence desdits microorganismes résistants à la méticilline, par la présence de colonies colorées.
Les conditions d'incubation sont connues de l'homme du métier, et on utilise généralement une incubation à des températures comprises entre 25°C et 42°C, de préférence entre 30°C et 38°C.
Les durées d'incubation sont classiques (environ 24 heures).
Selon le microorganisme considéré, on peut utiliser une durée d'incubation plus courte ou plus longue, travailler dans des conditions aérobies ou anaérobies... Le milieu selon l'invention permet notamment de détecter aisément les staphylocoques résistants à la méticilline, en réduisant le temps d'analyse. La combinaison des antibiotiques choisis dans le cadre de l'invention et des agents chromogènes permet en effet de réduire le nombre de faux positifs et de faux négatifs, et de diminuer ainsi le besoin de réaliser des analyses complémentaires.
EXEMPLES Exemple 1
Composition d'un milieu selon l'invention pour la détection de S. aureus résistants à la méticilline :
Peptone et extrait de levure 40 g/1
NaCl 25 g/1 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate 0,10 g/1
5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside 0, 05 g/1
5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside 0, 05 g/1
5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide 0, 05 g/1
Déféroxamine 0,050 g/1 Agar 15 g/1
On ajoute, dans ce milieu, de l'oxacilline (6 mg/ml) ou de la cefoxitine (5 mg/1), après autoclavage, avant que le milieu ne soit solide (lorsqu'il est à une température d'environ 45 °C).
Ce milieu contient du 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate et du 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside, permettant la détection spécifique des staphylocoques dorés (coloration mauve des colonies), ainsi que du 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl galactoside et du 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide, pour colorer les autres microorganismes pouvant être présents dans l'inoculum.
Exemple 2
Etude de la croissance de souches de S. aureus résistantes à la méticilline sur le milieu CHROMagar Staph aureus (disponible par la société CHROMagar, 4, Place du 18 Juin 1940, 75006 Paris France) :
AR4295 MetiS : souche sensible à la méticilline AR4297 MetiR : souche résistante à la méticilline (homogène)
MRhet : souche résistante à la méticilline (hétérogène)
Z252 : souche résistante à la méticilline, homogène, faible niveau de résistance
Figure imgf000010_0001
+ = croissance de colonies ; - = pas de croissance ; * = microcolonies
On inocule les boîtes de Pétri avec des cultures bactériennes en striant les boîtes, pour observer la croissance de bactéries isolées, après incubation à 37°C pendant 24 heures.
Les bactéries qui croissent donnent des colonies mauves sur le milieu de culture, confirmant que les microorganismes sont des staphylocoques dorés.
Ainsi, le milieu selon l'invention permet de détecter directement les staphylocoques dorés résistants à la méticilline, y compris les souches hétérogènes ou à faible niveau de résistance, du fait de la combinaison de la croissance des bactéries et de la coloration des colonies.

Claims

REVENDICATIONS
1. Milieu pour la détection de microorganismes résistants à la méticilline, comprenant, outre des nutriments permettant la croissance desdits microorganismes, un antibiotique choisi dans le groupe des céphalosporines de seconde ou de troisième génération, et un agent chromogène libérant un chromophore après hydrolyse avec une enzyme active chez lesdits microorganismes.
2. Milieu selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits microorganismes sont des staphylocoques, en particulier des staphylocoques dorés.
3. Milieu selon la revendication 2, dans lequel ledit agent chromogène est choisi dans le groupe constitué du 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate et du 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside.
4. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit antibiotique est le cefamandole.
5. Milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit antibiotique est choisi dans le groupe des céphamicines et des oxacephems.
6. Milieu selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit antibiotique est choisi dans le groupe constitué de la cefoxitine, le cefmetazole, le moxalactam, le cefotetan et le flomoxef.
7. Milieu selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce qu'il contient du 5-bromo 6-chloro 3-indoxyl phosphate et du 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucoside.
8. Milieu selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, au moins l'un des deux agents chromogènes suivants : 5-bromo 4- chloro 3-indoxyl galactoside et 5-bromo 4-chloro 3-indoxyl glucuronide.
9. Milieu selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce qu'il contient, en outre, un antibiotique choisi dans le groupe constitué de la vancomycine, la teicoplanine, l'avoparcine, et leurs mélanges.
10. Milieu selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que la concentration en chlorure de sodium est inférieure à 3 %.
11. Milieu selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la concentration en antibiotique est comprise entre 0,5 et 50 mg/1.
12. Milieu selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la concentration d'un agent chromogène est comprise entre 0,01 et 0,5 g/1.
13. Utilisation d'un milieu selon l'une des revendications 1 à 12 pour la détection de microorganismes résistants à la méticilline.
14. Procédé de détection de microorganismes résistants à la méticilline dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : inoculer un milieu selon l'une des revendications 1 à 12 avec ledit échantillon ou un inoculum issu dudit échantillon, incuber ledit milieu dans des conditions permettant la croissance desdits microorganismes, détecter, sur ledit milieu, la présence desdits microorganismes résistants à la méticilline, par la présence de colonies colorées.
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