WO2004022726A1 - 機械的振動による生物機能の制御方法とその装置 - Google Patents

機械的振動による生物機能の制御方法とその装置 Download PDF

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Akio Kishida
Tsutomu Furuzono
Kozo Miyazaki
Toru Masuzawa
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the invention of this application relates to a method and an apparatus for controlling biological functions by mechanical vibration. More specifically, the invention of the present application relates to a biological function control method and device for artificially controlling the function of a cell or tissue by applying mechanical vibration. Background art
  • the cells are cultured by generating longitudinal vibrations using a speaker-type vibration device and circulating the culture solution.
  • a speaker-type vibration device There has been a problem that the adverse effect on the cells of the magnetic field due to the coils constituting the speaker-type vibrating device cannot be excluded.
  • the cells cannot be adhered to a scaffold such as a culture dish when the cells are cultured by lateral vibration, and the cells are detached and die.
  • the culture is performed by circulating the culture medium only by longitudinal vibration. That is, there is still a problem that the cells cannot adhere to the scaffold in the culture by the lateral vibration.
  • the stimulation of cells in the above two reports is due to the fact that cells are cultured by circulating the culture medium efficiently, and the cells are directly stimulated and cultured. It is not something.
  • the above-mentioned tendon cells, bone-like tissue cells, vascular endothelial cells, and the like are cells that exist in the tissues that carry the structure of the living body, and these cells have a mechanism (a sensation sensor) that responds to mechanical stimulation. It is known that cells respond to stimuli via cells, but cells that exist in tissues responsible for the structure of living organisms by directly stimulating cell membranes and cytoskeletons without going through this sensory sensor. Not only is there no known method for controlling biological functions such as cell proliferation in many cells.
  • the invention of this application was made in view of the circumstances described above, and solves the problems of the prior art, and solves the problems of the prior art, such as liquid factors and synthetic polymer substances whose origin is a problem. It is possible to greatly reduce the amount of use without using, or to apply various stimuli directly to the cell membrane, cytoskeleton, etc. by taking advantage of the stimulus imparting property as a physical method. The effect of stimulation can be exerted on cells, and it is more practical, simple, and efficient to promote cell proliferation and reactions in cells or tissues to induce differentiation. It is an object of the present invention to provide a new culture method and a device for controlling the function of cells or tissues, which enables cell culture. Disclosure of the invention
  • the invention of this application solves the above-mentioned problems.
  • a biological function by mechanical vibration characterized by stimulating biological tissue or cells, bacteria or viruses by mechanical vibration. Control method is provided.
  • the second is a method for controlling biological functions characterized by providing stimulation by temporary, continuous or intermittent mechanical vibration.
  • the third is an amplitude of 100 m or less.
  • the fourth is a method for controlling a biological function characterized by providing a stimulus by mechanical vibration of a living organism.Fourth, any biological method characterized by providing a stimulus by a mechanical vibration having a frequency of 100 MHz or less.
  • the biological function control method is characterized in that stimulation is provided by mechanical vibration having an amplitude of 20 / m or less and a frequency in the range of 1 Hz to 10 MHz. Provide a method.
  • the invention of this application provides a culturing method characterized by culturing cells or tissues while stimulating the cells or tissues by any one of the above methods.
  • the present invention provides a culture method characterized by increasing the initial adhesion ability of cultured cells, and eighth, a culture method characterized by promoting proliferation of cultured cells.
  • the ninth aspect of the invention of the present application is a cell fusion method characterized in that cell fusion is promoted by the method described above, and the tenth aspect is a method of introducing a foreign substance into cells.
  • the invention of this application is a device for controlling biological functions by stimulating biological tissues or cells, bacteria or viruses by mechanical vibration, and means for generating mechanical vibration.
  • a biological function control device characterized by having a vibration transmission imparting means for imparting the generated mechanical vibration as a stimulus, and (13) a biological tissue or cell, a bacterium or a virus.
  • the present invention provides a control device for a biological function, comprising: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a perspective view schematically illustrating the outline of the device of the present invention.
  • FIG. 2 is a configuration diagram illustrating the overall configuration of the experimental system.
  • FIG. 3 is a microscope observation image illustrating the results of Example 1. (A) No vibration load and (B) Vibration load.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a transition of cell measurement according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the effect on cell proliferation as a result of Example 2.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the effect on cell fusion in Example 3.
  • FIG. 7 is a photograph illustrating the effect of Example 5 on the induction of differentiation of stem cells.
  • the tissues, cells, bacteria, and viruses of living organisms covered by this application may be of any type or origin, such as plant cells, insect cells, mammalian cells, and those tissues.
  • Various types of stem cells including embryonic stem cells (ES cells) and bone marrow stem cells may be used.
  • ES cells embryonic stem cells
  • bone marrow stem cells examples include those derived from humans, mice, sheep, egrets, and monkeys.
  • the cells may be adherent cells or floating cells.
  • the application scene and the practical purpose include, for example, Examples include tissue culture, cell culture, fermentation, germination, breeding, weeding, and preservation of plants, treatment of animals and humans, sterilization, sterilization, and virus inactivation.
  • “mechanical vibration” generally has an amplitude of 100 m or less. You. From the viewpoint of the size at the time of suspension of cells as a guide, 2 O iim or less is preferable.However, considering that fibroblasts extend to about 100 m, the maximum amplitude is 100 m. It is practical to do so.
  • the amplitude and the frequency are preferably selected in relation to the magnitude of the frequency so that the target tissue, cells, and the like are not physically crushed.
  • the limitation is selected from this viewpoint, but it is practical and preferable that the frequency be 100 MHz or less.
  • the amplitude should be 20 / xm or less, and the cycle should be in the range of 1 Hz to 10 MHz.
  • the frequency is preferably from 10 Hz to 1 MHz.
  • the practical effect is small for frequencies below 1 Hz, while cell and tissue damage must be considered for frequencies above 10 MHz.
  • the vibration may be continuous or intermittent as described above, and may include not only standing waves but also non-stationary waves such as pulse waves. There may be.
  • the "mechanical vibration" of the invention of this application is essentially different from the vibration caused by the irradiation of the medium with the vibration (longitudinal wave due to the sparse density) of the ultrasonic wave.
  • the solid substrate in contact with tissue, cells, bacteria or viruses vibrates. In this case, it is possible to distinguish between the roll and the pitch depending on the vibration direction.
  • the cell or tissue may be present in the form of a cell or tissue in the form of a planar or three-dimensional mass mounted on a supporting solid substrate, Alternatively, a liquid may coexist. Mechanical vibration is effective both in vivo and in vitro.
  • the device of the invention of this application includes a “vibration generating means” and a “vibration transmission applying means”, but the configuration of each of these means is not limited to a specific one.
  • a petri dish plate (4) slidable on a base (3) by a piezoelectric element (1) is vibrated.
  • a configuration in which the culture Petri dish placed in the Petri dish setting part (5) is vibrated by this vibration is considered.
  • the device shown in Fig. 1 also has an overcurrent sensor for verification (6).
  • the piezoelectric element (1) is adapted to generate vibration in the direction indicated by the arrow (2).
  • the device of the invention of the present application may be configured according to the type and properties of target tissues and cells, bacteria, viruses, and the like, the biological function to be controlled, and the like. Not only devices, but also vertical vibration devices with a vertical arrangement of vibration elements, devices that vibrate using an external magnetic field, and array-type vibration devices with a vibrator pattern arrangement. Is also good.
  • various types of solid substrates with which tissues, cells, bacteria, and viruses come into contact are considered.
  • the “substrate” at this time does not have to be a flat plate, but may be a curved surface, an irregular shape, or a granular or fibrous shape.
  • a hard solid but also a soft solid such as a viscous body, jelly, gel, sponge, or rubber-like body may be used.
  • a soft solid such as a viscous body, jelly, gel, sponge, or rubber-like body.
  • FIG. 2 schematically illustrates an overall configuration of an experimental system using a vibration device.
  • the vibrating device (11) is placed in the outside air shut-off box (12), and the temperature can be controlled by the temperature control device (13).
  • the state of the culture can be observed with the microscope (14). Photographed by a digital camera (15) or CCD camera (16) and recorded as an analog signal, for example, on a cell change recording and recording device (17) or a recording medium (18), or directly on a confirmation monitor ( 1 9) Enables confirmation monitoring.
  • the device drive voltage signal (22) of the vibration load device (11) is transmitted by the function generator (7) and the driver (8).
  • the signal (22) can be recorded and monitored by, for example, an oscilloscope (9) and a notebook computer (10).
  • Example 1 the cultivation was performed between the normal culture without vibration and the culture with vibration. The effect on cell initial adhesion was compared. The results are shown in FIGS. 3 and 4.
  • FIG. 3 shows a microscopic observation of the measurement of the initial adhesion ability of the cultured cells by the vibration load.
  • As cultured cells mouse-derived fibroblasts (L929 cells) were used. Then, 929 cells were prepared for non-vibration load and for vibration load, and were inoculated in a culture dish of 6 cm in diameter.
  • a vibration load having a frequency of 100 Hz and an amplitude of 9; am was performed for 1 hour at the time of seeding.
  • the vibration-unloaded L929 cells () had a spherical shape and had not yet adhered to the culture dish, whereas the vibration-loaded L929 cells (B) had already been activated, It adhered to the culture dish and showed signs of division initiation, which was about 4 times higher than the conventional initial adhesion ability.
  • the cell number was measured using human umbilical vein endothelial cells used for artificial blood vessels and the like.
  • a 5 ⁇ 10 s cell Z6 cm Petri dish was prepared for each of the starting cells and seeded.
  • vibration was applied and the cells were cultured for 1 hour.
  • the frequency of vibration was 0 to 10000 Hz, and the amplitude was 0 to 15 / xm, and the number of cells adhered to the culture dish under each vibration condition was counted.
  • Fig. 4 when no vibration was applied, about 20% of the cultured cells adhered to the culture dish, and when vibration was applied, about 80%, about four times that of the cultured cells. It was confirmed that they were adhered.
  • Human umbilical vein endothelial cells were prepared and seeded on a culture dish. Eighteen hours after seeding, vibration was applied for one hour, and then the cells were cultured for another 48 hours, and the number of cells was counted.
  • the vibration frequency (Hz) was set to 0, 10, 100, 1000, and 10,000.
  • the number of amplitudes (/ in) was set to 5, and the number of starting cells was set to 0.5 ⁇ 10 5 cells in a Z6 cm dish.
  • the above-mentioned L929 cells were used as cells, and 5 ⁇ 10 5 cells / 6 cm dish was prepared as the starting cell number.
  • the vibration was performed at a frequency of 500 Hz and an amplitude of 5 m, the vibration load time was 1 hour, and the culture time was 48 hours after the vibration load, after which the number of cells was counted.
  • the results are shown in FIG.
  • the “Fusion Index” in the figure indicates the average number of multinucleated cells observed in 20 visual fields at a magnification of X40 of a microscope in a petri dish with a diameter of 6 cm.
  • L929 cells were seeded densely to form multinucleated cells.
  • the average number of multinucleated cells was 2 in the control (C0NT) without vibration, and the average number of multinucleated cells was 2.5 in the case of vibration loading, and the number of multinucleated cells in the central part was 2.
  • C0NT control
  • the number of multinucleated cells in the central part was 2.
  • Human cord blood vein endothelial cells were used as cultured cells.
  • pCMV-GFP (2 g) having a green fluorescence coloring ability was used.
  • 4 ⁇ 10 5 cells were seeded, seeded on a 6 cm Petri dish for one day, and the culture medium was replaced one hour before shaking.
  • plasmid DNA containing the GFP gene was added to the culture solution at a concentration of 2 / g / mL. After incubation for 30 minutes, vibration stimulation was applied in the same manner as in Example 2.
  • Bone marrow cells differentiate into various cells due to drug stimulation, etc., but when cultured under normal conditions, maintain a spherical morphology, and for an extremely long period of about one month, mainly fibroblasts To differentiate into a cell group. .
  • Example 5 cells containing a bone marrow stem cell fraction isolated and obtained were seeded from mouse bone marrow, and the behavior of the cells with and without vibration was compared and observed and examined.
  • biological functions of cells or tissues can be artificially controlled by applying a stimulus by mechanical vibration.
  • the activation and proliferation of cultured cells are promoted, and a new method for introducing a foreign gene is also provided.
  • the invention of this application will provide innovative technologies in many fields such as pathological diagnosis, gene therapy, regenerative medicine, reproductive medicine, safety evaluation, minimally invasive treatment, genetic analysis, and biological simulation. .

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Abstract

生物の組織または細胞、細菌もしくはウイルスに対して機械的振動により刺激を与えることを特徴とする。

Description

機械的振動による生物機能の制御方法とその装置 技術分野
この出願の発明は、機械的振動による生物機能の制御方法とその装置に関する ものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 機械的振動を加えることによ つて、人為的に細胞または組織の機能制御を可能とする生物機能の制御方法とそ のための装置に関するものである。 背景技術
従来より生物材料としての培養細胞の細胞機能を制御する方法について、数多 く研究や検討がなされてきているが、 その大部分のものは、 蛋白質等の液性因子 の添加をともなうものである。 また遺伝子の導入や高分子物質添加についても報 告されている。しかしながら、これら外来の外来物質の添加をともなう方法では、 添加される液性因子の由来が問題になる場合が多い。たとえば、 動物由来のもの でも、 ゥサギ由来なのか、 ヒッジ由来なのか、 あるいはヒト由来なのか等が問題 となる。 また、 価格に関しても問題になる場合が多々ある。 さらに、 遺伝子の導 入についても、電気穿孔方法やウィルスをベクターとして遺伝子を導入する方法、 合成物質等を利用した導入促進剤を使用する方法、 あるいはマイクロシリンジを 用いて直接導入する方法等が検討されているが、 いずれも十分な効果が得られて いないのが実情である。 さらにまた、 ウィルスを用いる方法は、 研究レベルでは 非常に有効であるが、 治療方法として人体に適用するとなると、 どうしても病因 性や安全性等に関して問題がある。
また、 物理的手法に関しては、 静水圧、 細胞伸展、 超音波等の手法を用いて、 細胞機能の制御を行うことが検討されている。 これらの物理的手法による刺激は、 イン夕一ロイキン、サイトカインゃ TNF- α等、種々の生体因子の活性化をはじめ、 抑制や分泌等の制御機構を働かせることによって、細胞または組織の増殖や分化 等の成長に寄与する効果をもたらすことが知られている。 たとえば、 培養腱に対 する機械的振動を与え、 腱細胞の増殖を促進させる報告がある （関谷勇人著、 名 古屋市立大学医学会雑誌、 5 1巻、 2号、 第 8 7〜9 7頁)。また、 骨様組織の 形成に対して力学的刺激を与えることにより、培養細胞数の変化を検討している 報告もなされている（宮本祐一ら著、医用電子と生体工学、 V o l . 3 4、 N o . 4、 第 3 3 1 ~ 3 3 4頁）。
し力しながら、 上記の培養腱に対する機械的振動の場合は、 スピーカー型の振 動装置を用いて、 縦振動を発生させ、 培養液を循環させることにより、 細胞を培 養しているため、スピーカー型の振動装置を構成しているコイルによる磁場の細 胞に対する悪影響が排除できないという問題があった。 また、 横振動による培養 は、 細胞が培養シャーレ等の足場に接着することができず、 剥がれてしまい死滅 するという問題もあった。
また、 骨様組織の形成における力学的刺激の影響においては、 上記の培養腱に 対する機械的振動に関する報告と同様に、縦振動のみによる培養液を循環させた 培養である。 すなわち、 依然として、 横振動による培養では、 細胞が足場に接着 することができないこと等の問題があった。
さらにまた、 上記の 2つの報告における、 細胞への刺激は、 あくまでも、 培養 液を効率よく循環させて、 細胞培養していることに起因しており、 細胞に直接刺 激を与えて培養しているものではない。 なお、 上記の腱細胞や骨様組織の細胞や 血管内皮細胞等は、 生体の構造を担う組織に存在する細胞であり、 これらの細胞 は、 力学的刺激に応答する機構 （カ覚センサー） を介して、 刺激に応答する細胞 であることは知られていたが、 このカ覚センサーを介さずに、 細胞膜や細胞骨格 等に直接的に刺激を与え、 生体の構造を担う組織に存在する細胞に限らず、 多く の細胞においても細胞増殖等の生物機能を制御するための方法は知られていな つ,こ o
すなわち、 従来の物理的な刺激付与の方法については、 刺激と細胞への作用の 相関性が必ずしも明白でなく、 刺激付与の方法の選択や、 条件の制御等をどのよ うに行うべきかについての指針も定められていないのが現状である。 このため、 実用的な手法としての簡便で、 効率的な態様として確立されていない。
そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであつ て、 従来技術の問題点を解決し、 従来のような由来が問題となる液性因子や合成 高分子物質等を使用せず、 もしくは大幅にその使用量を減らすことができ、 しか も物理的手法としての刺激付与性の特徵を生かして、細胞膜や細胞骨格等に直接 的に刺激を与えることにより、種々の細胞においても刺激による効果を奏するこ とができ、 より実際的に簡便、 かつ効率的に、 細胞の増殖や細胞または組織内の 反応を促進して分化を誘導し、 さらには新しい遺伝子導入の方法をも可能とする という、 細胞または組織の機能制御のできる、 新しい培養方法とそのための装置 を提供することを課題としている。 発明の開示
この出願の発明は、 前記の課題を解決するものとして、 第 1には、 生物の組織 または細胞、細菌もしくはウィルスに対して機械的振動により刺激を与えること を特徴とする機械的振動による生物機能の制御方法を提供する。
この方法について、 第 2には、 一時的あるいは連続的または間欠的な機械的振 動により刺激を与えることを特徴とする生物機能の制御方法を、 第 3には、 振幅 が 1 0 0 m以下の機械的振動により刺激を与えることを特徴とする生物機能の 制御方法を、 第 4には、 周波数 1 0 0 MH z以下の機械的振動により刺激を与え ることを特徵とするいずれかの生物機能の制御方法を、 第 5には、 振幅が 2 0 / m以下で、 周波数が 1 H zから 1 0 MH zの範囲の機械的振動により刺激を与え ることを特徴とする生物機能の制御方法を提供する。
また、 この出願の発明は、 第 6に、 上記いずれかの方法によって、 細胞または 組織に刺激を与えながら培養することを特徴とする培養方法を提供する。
第 7には、 培養細胞の初期接着能を増大させることを特徴とする培養方法を、 第 8には、 培養細胞の増殖を促すことを特徴とする培養方法を提供する。
そして、 この出願の発明は、 第 9には、 前記の方法によって、 細胞融合を促す ことを特徴とする細胞融合方法を、 第 1 0には、 細胞に外来物質を導入する方法 を、 第 1 1には、 外来物質が、 遺伝子、 タンパク質または薬物を導入することを 特徴とする方法を提供する。
さらに、 第 1 2に、 この出願の発明は、 生物の組織または細胞、 細菌もしくは ウィルスに対して機械的振動により刺激を与えて生物機能を制御する装置であ つて、 機械的振動を発生させる手段を備え、 発生させた機械的振動を刺激として 与えるための振動伝達付与手段を有することを特徴とする生物機能の制御装置 を提供し、 第 1 3には、 生物の組織または細胞、 細菌もしくはウィルスが接触す る固体基板を備えていることを特徴とする生体機能の制御装置を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 この出願の発明の装置の概要を模式的に例示した斜視図である。 図 2は、 実験システムの全体構成を例示した構成図である。
図 3は、 実施例 1の結果を例示した顕微鏡観察の像である。 （A) 振動無負荷、 (B) 振動負荷した場合を示している。
図 4は、 実施例 1における細胞計測の推移を例示した図である。
図 5は、 実施例 2の結果として細胞増殖への作用を例示した図である。
図 6は、 実施例 3における細胞融合への作用を例示した図である。
図 7は、 実施例 5における幹細胞の分化誘導への作用を例示した写真である。
(A) 振動無負荷、 （B) 振動負荷した場合を示している。
なお、 図中の符号は、 次のものを示す。
1 圧電素子 （振動子）
2 振動方向
3 土台部
シャーレ置板
5 シャーレ設置部
6 検定用過電流センサー
7 ファンクションジェネレータ
8 ドライバ 差替え用紙 (mm 9 オシロスコープ
1 0 ノートパソコン
1 1 振動負荷装置
1 2 外気遮断ボックス
1 3 温度調節装置
1 4 顕微鏡
1 5 デジタルカメラ
1 6 CCDカメラ
1 7 細胞変化記録録画用装置
1 8 記録媒体
1 9 確認用モニター
2 0 入力電圧信号
2 1 波形データ
2 2 装置駆動電圧信号
2 3 アナログ信号 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は、 上記のとおりの特徴をもつものであるが、 以下にその実施 の形態について詳しく説明する。
まず、 この出願が対象とする生物の組織や細胞、 細菌類、 そしてウィルスは、 いかなる種類や由来のものでもよく、 たとえば、 細胞であれば、 植物細胞や昆虫 細胞、 哺乳類細胞、 それらの組織としての構成の各種のもの、 さらには、 胚性幹 細胞 （E S細胞） や骨髄幹細胞をはじめとする各種の幹細胞であってよい。 また 哺乳類細胞においては、 ヒト由来、 マウス由来、 ヒッジ由来、 ゥサギ由来あるい はサル由来等が例示できる。 そして、 細胞は接着性細胞あるいは浮遊性細胞でも よい。
このような各種の対象に対しての適用が考慮されているこの出願の発明の生 物機能の制御方法においては、 適用の場面や実際上の目的としては、 たとえば、 組織培養、 細胞培養、 発酵、 植物の発芽、 育成、 除草、 そして保存等や、 動物や ヒ卜の治療、 除菌、 滅菌やウィルスの不活化等が例示される。
そして、 より具体的な制御されるべき機能については、 主として細胞の内部で 起こる事象に関連するものとして、たとえば、接着、増殖、分化、生合成、遊走、 形態変化、 代謝、 アポトーシス、 形質転換、 ネクロ一シス、 不活化、 酵母の出芽 等が例示される。 一方、 細胞が外部環境と関連する事象に関しては、 細胞融合、 遺伝子やタンパク質、 あるいは薬物の導入、 さらには破壊等が例示される。 以上のような生物機能の制御方法として機械的振動によって刺激を与えると のことはこれまで全く報告されていないものであって、その適用範囲の広さや目 的の多様性、 そして顕著な作用効果の点において画期的なものである。
細胞や組織に対して振動を加えて生物機能の制御を行なうこの出願の発明に おいては、 「機械的振動」 は、 一般的にはその振幅が 1 0 0 m以下とすることが 考慮される。 目安としての細胞の浮遊時のサイズの観点からは 2 O iim以下が好 適であるが、 繊維芽細胞では 1 0 0 m程度まで伸展することを考慮すると、 振 幅は最大でも 1 0 0 mまでとするのが実際的である。 そして、 この振幅につい ては、 周波数の大きさにも関係して、 対象となる組織、 細胞等が物理的に破碎さ れることがないように振幅と周波数が選択されるのが好ましい。
周波数については、 その限定については、 この観点から選択されるが、 1 0 0 MH z以下とすることが実際的であって好ましい。
さらには、 細胞に対しては、 振幅が 2 0 /xm以下、 周期が 1 H zから 1 0 MH zの範囲のものとすること、 さらには、 培養する細胞や組織の種類、 その由来に よっても異なるが、 一般的には周波数は 1 0 H zから 1 MH zが好適である。 細胞に対しては、周波数が 1 H z未満の場合には実際的な効果は小さく、他方、 1 0 MH zを超える場合には細胞や組織の損傷も考慮されねばならない。
そして、 振動の負荷対象としての細胞や組織の細胞骨格、 細胞膜、 膜蛋白質等 の生体機能や役割を考慮して、 それぞれについて、 適用する波形が異なるものと することが好ましいことも考慮される。 また、 振動は前記のとおり連続的または 間欠的であってもよく、 定常波だけでなく、 パルス波をはじめとして非定常波で あってもよい。
この出願の発明の 「機械的振動」 は、 媒質が振動する （疎密度による縦波） 超 音波照射による振動とはその作用において本質的に相違している。 組織、 細胞、 細菌あるいはウィルスが接している固体基板が振動する。 この際には、 振動方向 による横揺れと縦揺れとが区別可能となる。
もちろん、 振動を与える場合の細胞または組織の存在形態としては、 支持固体 基板上に搭載して平面状に、 あるいは三次元的に塊状となって存在してもよいし、 微粒子状で存在してもよいし、さらには、液体が共存してもよい。機械的振動は、 生体内および生体外のいずれにおいても効果を発揮する。
この出願の発明の装置では、 「振動発生手段」 と 「振動伝達付与手段」 とを備 えているが、 これらの各手段の構成が特定のものに限定されることはない。 たと えば、 その代表的な例としては、 図 1に例示したような、 圧電素子 （1 ) によつ て、 土台部 （3 ) にスライド可能とされたシャーレ置板 （4 ) を振動させ、 この 振動によってシャーレ設置部 （5 ) に置いた培養シャーレを振動するようにした 構成のものが考慮される。 この図 1の装置では、 検定用過電流センサ一 （6 ) も 備えている。 圧電素子 （1 ) は矢印の振動方向 （2 ) の振動を発生するようにし ている。
対象とする組織や細胞、 そして細菌、 ウィルス等の種類や性質、 制御目的とす る生物機能等に応じてこの出願の発明の装置は構成されて良く、 たとえば図 1に 例示した横方向振動の装置だけでなく、縦方向への振動素子の配置による縦方向 振動装置をはじめ、 外部磁場を利用して振動させるようにしたものや、 振動子の パターン配列によるアレイ型の振動装置等であってもよい。 また、 振動伝達付与 手段としては、 組織や細胞、 そして細菌、 ウィルスが接触する固体基板の各種の ものが考慮される。 この際の 「基板」 は平板状でなくてもよく、 曲面状、 異形状 のもの、 さらには粒状、 繊維状等のものでもよい。 また、 硬質固体だけでなく、 粘性体、 ジェリー、 ゲル、 スポンジ、 ゴム状体等の軟質の固体であってもよい。 以上のようなこの出願の発明によって、従来のような由来が問題となる液性因 子や合成高分子物質等を使用せず、 もしくは大幅にその使用量を減らすことがで き、 しかも物理的手法としての刺激付与性の特徴を生かして、 細胞膜や細胞骨格 等に直接的に刺激を与えることにより、種々の細胞においても刺激による効果を 奏することができ、 より実際的に簡便、 かつ効率的に、 細胞の増殖や細胞または 組織内の反応を促進して分化を誘導し、 さらには新しい遺伝子等の外来物質の導 入をも容易とする等の、 細胞または組織等の生物機能を制御することのできる、 新しい刺激付与方法とそのための装置が実現される。
そこで以下に実施例を説明し、 さらに詳しくこの出願の発明について説明する。 もちろん、 以下の例によって発明が限定されることはない。 実施例
「生物機能の制御装置」 として、 図 1の構成を有し、変位範囲 0から 15 ΠΙ、 使用周波数 1 Η ζから 10 k Η ζ、 歪みゲージ位置センサー内臓、 歪みゲージ分 解能 lnmの装置を用いた。 また、 振動対象は、 直径 50匪のシャーレとした。 図 2は、振動装置を用いた実験システムの全体構成を概略的に例示したもので ある。
振動装置（11)は外気遮断ボックス（12)内に配置され、温度調節装置（1 3) により温度コントロール可能とされ、 培養の状態は顕微鏡 （14)で観察で き、 この際の観察源はデジタルカメラ （15) または CCDカメラ （16) により 撮影されて、 たとえばアナログ信号として、 細胞変化記録録画用装置 （17) や 記録媒体 （18) に記録されるとともに、 あるいは直接的に確認用モニター （1 9) にて確認モニタ一できるようにしている。
振動負荷装置 （11) の装置駆動電圧信号 （22) は、 ファンクションジエネ レー夕 （7)およびドライバ （8) により伝送される。 この信号 （22) につい ては、たとえばオシロスコープ（9)およびノートパソコン（10)により記録 · モニタ一できるようにしている。 ぐ実施例 1 >初期接着への作用
実施例 1では、 振動を加えない通常の培養と振動を加えた培養における、 培養 細胞の初期接着への作用を比較検討した。 その結果を図 3および図 4に示した。 図 3では、振動負荷による培養細胞の初期接着能力の計測を顕微鏡による観察 図を示した。培養細胞としては、 マウス由来の繊維芽細胞 （L 929細胞） を用 いた。このし 929細胞を振動無負荷用と振動負荷用を用意し、 直径 6cmの培養 シャーレにそれぞれ播種した。 振動負荷による場合には、 この播種時に周波数 1 00Hz、 振幅 9;amの振動負荷を 1時間行つた。 1時間後、 振動無負荷の L 9 29細胞 ( は、球状を呈し、未だ培養シャーレ面に接着していなかった。一方、 振動負荷の L 929細胞 （B) は、 細胞が活性化され、 既に培養シャーレ面に接 着し、 分裂開始の兆候が見られ、 これは従来の初期接着能よりも約 4倍に相当し た。
次に、 細胞数の計測を、 人工血管等に使用されるヒト臍帯静脈内皮細胞を用い て行った。 開始細胞数としてそれぞれ 5 X 10 s細胞 Z6cmシャーレを用意し、 播種した。 細胞播種 1時間後、 振動を負荷し、 1時間培養した。 振動の周波数は 0から 10000Hz、 また振幅は 0から 15/xmとし、 それぞれの振動条件にお ける培養シャーレ面に接着している細胞数を計測した。 その結果、 図 4に示した ように、 振動を負荷していない場合は、 約 20%の培養細胞が培養シャーレ面に 接着し、 振動を負荷した場合においては、 その約 4倍の約 80%が接着している ことが確認された。 ぐ実施例 2 >培養細胞の増殖への作用
振動による培養細胞の増殖に対しての作用を検討した。その結果を図 5に示し た。
ヒト臍帯静脈内皮細胞を用意し、 培養シャーレに播種した。 播種 18時間後に 振動を 1時間負荷させ、 その後さらに 48時間培養し、 細胞数の計測を行った。 振動の周波数 （Hz) は、 0、 10、 100、 1000、 10000とした。 ま た振幅数（/ in) は、 5とし、 開始細胞数は、 0. 5X 105細胞 Z6cmシャーレ とした。
その結果は、 図 5に示したように、 振動を負荷していない場合よりも、 振動を 負荷した場合のほうが顕著な増殖率が得られた。
<実施例 3 >細胞融合への作用
振動による細胞融合への作用を評価した。
細胞としては前述の L 929細胞を用い、 開始細胞数として 5 X 105細胞/ 6cmシャーレを用意した。 振動は、 周波数 500Hz、 振幅 5 mで、 振動負荷 時間を 1時間、 そして培養時間は、 振動負荷後 48時間とし、 この後に細胞数を 計測した。 その結果を図 6に示した。 図中の 「Fusion Index」 とは、 直径 6cm シャーレにおいて、顕微鏡の倍率 X 40における視野 20ケ所中の多核細胞を検 視し、 その平均数を表したものである。
まず、 L 929細胞を密に播種し、多核細胞を形成させた。コントロール（C0NT) である振動無負荷においては、 多核細胞の平均数は 2であったが、 振動負荷の場 合では多核細胞の平均数は 2. 5であり、 またその中央部における多核細胞数は 4であった。 これは、 中央部においては、 約 2倍の融合率となった。 また、 これ ら振動無負荷の細胞と振動負荷の細胞との間における相違は、顕微鏡下でも明瞭 に識別できた。
<実施例 4 >細胞への遺伝子導入
振動による外来遺伝子の導入について検討した。
培養細胞には、 ヒト臍帯血静脈内皮細胞を用いた。外来遺伝子として、 緑蛍光 発色能を有する pCMV- GFP (2 g ) を使用した。 まず、 4X105個の細胞を 蒔き、 6cmシャーレに蒔き 1日置き、振動をかける 1時間前に培養液を交換した。 1時間後、培養液に GFPの遺伝子を含むプラスミド DNAを 2 / g/mLとなるように 加え、 30分のインキュベーション後、 実施例 2と同様に、 振動刺激を与えた。 48時間後、 位相差顕微鏡で血球計算板を用いて全細胞を数え、 同じ試料を蛍光 顕微鏡で緑色に光る細胞の数を数えた。 振動は、 周波数 （Hz) は、 100、 1 000、 10000、 振幅数 5 mで 1時間負荷した。 また、 振動を与えない比 較対照 （Negative Ctrl.) も用意した。 その結果、 比較対照群においては、 蛍光 度が 0に対して、振動周波数 1 0 0 H zおよび 1 0 0 0 O H zにおいては蛍光度 1から 2の中程度、 1 0 0 O H zにおいては蛍光度 3の強い度合いを示した。 こ れによって、 振動を負荷させることによって、 特に周波数が 1 0 0 O H zの場合 に強く、 外来遺伝子が効果的に導入されることが確認された。
<実施例 5 >培養細胞の分化誘導
骨髄細胞は、 薬物刺激等によって、 種々の細胞に分化するが、 通常の条件にお いて培養した場合は、 球状の形態を維持し、 また約 1ヶ月の極長期では、 繊維芽 細胞を主体とした細胞群に分化する。 .
そこで、 実施例 5では、 マウスの骨髄より、 分離取得した骨髄幹細胞分画を含 有する細胞を播種し、 振動付加の有無における細胞の挙動を比較して、 観察およ び検討した。
結果は、 図 7に例示したとおりであった。振動を付加していない通常の培養に おいては、 球状の形態を維持していることが観察された。 一方、 1 0 k H zの横 振動を 1時間付加して、 細胞を培養した場合では、 球状の形態が変化をして、 上 皮様に一部、 繊維芽細胞様の細胞へと分化している様子が確認された。 この結果 から、 機械的振動を加えた培養は、 幹細胞の分化誘導刺激として利用することが できると期待することができる。 産業上の利用可能性
この出願の発明によって、細胞または組織の生体試料に機械的振動による刺激 を加えることによって、 人為的に生物機能の制御が可能となる。
培養細胞の活性化および増殖が促進され、新しい外来遺伝子の導入方法も提供 される。
この出願の発明により、 病理診断、 遺伝子治療、 再生医学、 生殖医療、 安全評 価、 低侵襲治療、 遺伝子解析、 生体シミュレ一夕一等多くの分野において革新的 な技術が提供されることになる。

Claims

請求の範囲
I . 生物の組織または細胞、 細菌もしくはウィルスに対して機械的振動により 刺激を与えることを特徴とする機械的振動による生物機能の制御方法。
2 . —時的あるいは連続的または間欠的な機械的振動により刺激を与えること を特徴とする請求項 1の生物機能の制御方法。
3 . 振幅が 1 0 0 m以下の機械的振動により刺激を与えることを特徴とする 請求項 1または 2の生物機能の制御方法。
4. 周波数 1 0 0 MH z以下の機械的振動により刺激を与えることを特徴とす る請求項 1ないし 3のいずれかの生物機能の制御方法。
5 . 振幅が 2 0 m以下で、 周波数が 1 H zから 1 0 MH zの範囲の機械的振 動により刺激を与えることを特徴とする請求項 4の生物機能の制御方法。
6 . 請求項 1ないし 5のいずれかの方法であって、 細胞または組織に刺激を与 えながら培養することを特徴とする培養方法。
7 . 培養細胞の初期接着能を増大させることを特徴とする請求項 6の培養方法。
8 . 培養細胞の増殖を促すことを特徴とする請求項 6の培養方法。
9 . 請求項 1ないし 5のいずれかの培養方法であって、 細胞融合を促すことを 特徴とする細胞融合方法。
1 0 . 請求項 1ないし 5のいずれかの培養方法であって、 細胞に外来物質を導 入することを特徴とする物質導入方法。
I I . 外来物質が、 遺伝子、 タンパク質または薬物であることを特徴とする請 求項 1 0の物質導入方法。
1 2 . 生物の組織または細胞、 細菌もしくはウィルスに対して機械的振動によ り刺激を与えて生物機能を制御する装置であって、機械的振動を発生させる手段 を備え、発生させた機械的振動を刺激として与えるための振動伝達付与手段を有 することを特徴とする生物機能の制御装置。
1 3 . 生物の組織または細胞、 細菌もしくはウィルスが接触する固体基板を備 えていることを特徴とする請求項 1 2の生体機能の制御装置。
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