CN101237904B - 使用脉冲的电磁场治疗来调节骨软骨发育的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于调节骨、软骨、或其它结缔组织的生长、发育和修复的组合物和方法。还提供了装置和刺激波形，以不同地调节成骨细胞、软骨细胞、和其它结缔组织细胞的行为，从而促进体外或体内应用的增殖、分化、基质形成或矿化。可以使用具有电荷平衡的信号的连续模式和脉冲段模式的细胞刺激。骨、软骨、和其它结缔组织生长通过经由电刺激释放一氧化氮而被部分地刺激，并且可以通过同时供给NO供体和NO合酶抑制剂来调节。骨、软骨和其它结缔组织生长通过响应促进细胞分化的电刺激释放BMP-2和BMP-7而被部分地刺激。所述方法和装置对促进骨折修复、软骨和结缔组织修复、以及对用于移植的工程组织都是有用的。

Description

使用脉冲的电磁场治疗来调节骨软骨发育的方法

相关申请的交叉应用

本申请要求2005年6月3日提交的美国临时专利申请60/687,430、2005年6月23日提交的美国临时专利申请60/693,490、2006年3月15日提交的美国临时专利申请60/782,462和2006年4月7日提交的美国临时专利申请60/790,128的优先权。

背景技术

与骨和软骨相关联的疾病和损伤对人群有很大的影响。单在美国每年发生约5百万次的骨折。这些中的约10％延迟愈合，并且在这些中，150,000到200,000个不连合的骨折发生伴随有丧失生产力和独立能力。在软骨的情况下，严重的慢性形式的膝关节软骨损害会导致关节软骨的更大的恶化，并且可能最终导致整膝关节的更换。每年，进行约200,000个整膝关节更换手术，人工关节一般仅仅维持10-15年，导致类似的丧失生产力和独立能力。

而且，就作为对于约4400万美国人的主要公共健康威胁的骨质疏松症的发生率方面看来，骨折的发生率也预期保持较高。今天，在美国，估计1000万个人已经有这种疾病，并且估计几乎超过3400万人具有低骨量，这使他们具有增加的骨质疏松症的风险。在超过50岁的人群中，两个女性中就有一人、四个男性中就有一人在他们的余生中发生与骨质疏松症相关联的骨折。骨质疏松症导致每年超过150万的骨折，包括：300,000髋部骨折；700,000脊椎骨折；250,000腕骨折；以及300,000其它位置的骨折。用于骨质疏松的髋部骨折的估计全国直接费用(医院和疗养院)在2002年为180亿美元(全国骨质疏松症基金会年报，2002)。

当前可以获得几种治疗方法来治疗顽固性骨折，诸如：内部和外部固定；骨移植或者移植代用品，包括去除矿物质的骨基质、血小板提取物和骨基质蛋白质；以及生物物理刺激，诸如通过外部固定器或者超声波和电磁场而施加的机械应力。

类似地，软骨损伤的典型治疗根据损伤和症状的严重性有休养和其它的保守治疗、用于整理和平滑被损坏的软骨区域表面的小型关节内窥镜检查手术和其它的外科疗法，诸如微裂缝、钻孔和研磨。所有这些都可以减轻症状，但是其益处通常仅仅是暂时的，特别是当人的损伤前的活动水平保持不变时。

骨和诸如软骨等其它组织以生理上有益的方式来响应电信号。被应用到不连合部分和延迟连合部分的生物电刺激装置在十九世纪60年代首次形成，现在被应用到骨和软骨(Ciombor and Aaron，FootAnkle Clin.2005，(4)：579-93)。当前，它们已经形成了市场并且在临床实践中的角色已被全面接受。归因于生物电刺激的不太公知的结果是正的骨密度变化(Tabrah，1990)和骨质疏松症的预防(Chang，2003)。近来的报告提供了附加的证据：用脉冲电磁场(PEMF)的刺激大大地加速在牵拉骨生成期间形成骨(Fredericks，2003)。

当前，用于骨修复的电疗的临床使用包括直接地植入到修复位置的电极或者非侵入性电容或者电感耦合。经由放置在骨修复位置的目标组织中的一个电极(阴极)和放置在软组织中的阳极来施加直流(DC)。5-100μA的DC电流足以刺激骨生成。所述电容耦合技术使用位于骨折位置的相对侧上的外部皮肤电极。20-200Hz的正弦波通常用于在修复位置中获得1-100mV/cm的电场。

电感耦合(PEMF)技术通过经由一个或者两个电线圈施加时变的磁场而获得时变的电场。感应电场作为触发机构，其调节由许多生长因素介导的骨修复的分子调节的正常过程。Bassett等人首先报告PEMF信号可以使犬齿中的骨修复加速150％。骨修复的实验模型显示使用直流增强了细胞增殖、钙化和提高了机械强度。这样的方法也存在有造成软骨损伤的可能。

受伤的组织相对于正常组织具有电势。在受伤位置测量的电信号(被称为“损伤电势”或者“损伤电流”)仅仅是DCC(直流)，其随着时间缓慢地改变。骨折修复和神经再生电势变化一般在负电极附近比通常要快，但是在正电极附近(在一些情况下，可能发生组织萎缩或者坏死)比通常要慢。为此，大多数近来的研究着重于更高的频率、更复杂的信号(经常不具有净直流分量)。

不幸的是，现在可以获得的大多数电子治疗装置依赖于直接植入电极或者整个电子仪器组件，或者依赖于穿过皮肤的电感耦合，其使用产生时变磁场的线圈，由此在身体组织内感应弱的涡电流，这不能有效地将所述信号提供到组织，因此除了体积大的线圈之外，还需要较大的信号发生器和电池组。在一方面需要手术和生物相容的材料以及在另一方面要求过大的电路复杂性和输入功率，这已经使大多数这样的装置的价格较高，并且也将这样的装置的使用局限于受过高度训练的人员。因此，仍然需要通用的、成本低廉的装置，其可以用于提供生物电刺激以不同地调节骨软骨组织的生长，以促进适当的生长和愈合。

发明内容

按照本发明的主要方面，并且广义而言，本发明提供了一种用于通过对正在生长的或者受损伤的骨或者软骨组织施加电信号来调节例如骨组织或者软骨的生长或者修复的方法。

本发明通过实现生物电信号的提供而克服了现有技术装置和方法的缺点，所述生物电信号被优化为对应于自然身体信号的所选特征，导致加速的且更持久的愈合。在此所述的信号与自然信号的所选特征一致，因此按照本发明的进行电刺激的组织经受最小的生理应力。另外，本发明是非侵入性的且成本低廉的，这使得可以期望对人的多个应用和单独使用。而且，本方法提供了电刺激，其中，电信号接近地模仿自然人体信号的所选特性。被刺激的组织因此受到最小的应力，大大促进了生长和修复。

与传统的TENS类型的装置(其旨在阻断神经系统中的疼痛冲动)相反，用于本发明方法的装置以低于正常人的疼痛感觉的阈值电平的刺激电平来操作，因此，大多数用户在用于修复或者促进骨的生长的治疗期间没有任何感觉。

在此所述的技术使用一类波形，其中一些是新的，其它的有已知当通过感应线圈被应用时对组织具有正生理效应的，但是直到如今还没有显示通过电极具有正生理效应。

虽然对于骨质疏松症治疗当前没有批准任何商业的生物电装置，但是本发明提供了一种有前途的候选者。如在此所示，可以有益地在宏观的水平(即普通的骨折)以及微观的水平(即成骨细胞发育)上应用独特的脉冲电磁场(PEMF)波形模式。本发明的某些实施方案将期望的PEMF波形的用途和应用最大化：例如，脊椎骨、髋部和/或手腕是骨质疏松骨折的最普通的位置，对于这样类型的骨折，发明人提供了简单的、自粘的皮肤接触电极片来作为电治疗递送载体。这样的电极片的使用导致改善了在这样的关键解剖位置的骨量。在微观水平上，本发明人已经识别了优化成骨细胞发育的特定PEMF波形和频率。如在示例中更详细地所述(参见实施例1)，发明人证明了PEMF信号增强了成骨细胞矿化和基质产生，并且所述信号也赋予了结构特征。本发明人也表明其它的PEMF信号增强了细胞增殖和伴随地增加了骨形态形成蛋白质(BMP)。虽然可以在本发明中使用脉冲段和连续的电信号，但是连续而不是脉冲段的信号的施加对增殖和矿化提供了更显著的影响。

本发明的电信号可以用于促进诸如骨和软骨等结构组织的修复和生长。但是，这样的系统和方法不必被限制为用于完整的有机体，因为电子治疗波形也可以影响分离的细胞或者组织培养(已经观察到适当的电刺激调节细胞新陈代谢、分泌和复制的速度)。电信号一般可应用到其它的结缔组织，诸如皮肤、韧带、腱等。在此所述的电信号可以用于刺激其它的组织，以提高组织的修复并且促进组织的生长以用于移植目的。例如，可以在适当的生长介质中使用本发明的装置和波形来治疗分离的皮肤细胞，以提高在制备组织培养的、自生的皮肤移植材料中的细胞增殖和分化。以类似的方式，这些生物电信号可以被直接地施加到受伤的或者有病的皮肤组织以增强愈合。

向骨折处外源性地提供生物电信号和祖细胞(诸如骨髓基质细胞(BMSC))可以导致顽固性骨折的愈合和修复增强。这两个因素(生物电和细胞募集)事实上是自然愈合过程的部分。对于这些应用，使用电治疗系统在受伤后立即施加使用在此所述的波形的电刺激。该电治疗系统可以是轻质的、小型的、便携的。可以在受伤后几天内应用电刺激和通常的基于细胞的治疗。可以在受伤后更长的时间点增加自体固有的细胞。本发明也提供了用于诱发再生自然组织而不是疤痕组织的骨修复或发育的方法。

因此，本发明的一个目的是提供用于通过对骨组织施加新的电信号而调节骨组织的增殖和分化以促进骨修复和发育的方法。

本发明的另一个目的是提供新的培养系统，其包括将PEMF用于骨组织过程。

本发明的另一个目的是提供结合电刺激的祖细胞的新培养系统.

本发明的另一个目的是提供用于生长自体固有的和异源的组织以在其需要时移植到宿主中的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供用于在生物体外或者在体内电刺激非定向祖细胞以诱发增殖或者分化的方法。

本发明的另一个目的是提供用于调节软骨、骨或其它结缔组织的生长的方法。

本发明的另一个目的是提供用于调节骨形态形成蛋白质的表达和释放的方法。

通过阅读下面对于所公开的实施方案和所附的权利要求的详细说明，本发明的这些和其它目的、特征和优点将变得显然。

附图说明

图1是用于刺激骨折愈合的波形的示意图。

图2a提供了示出用于促进骨的矿化的、基于感应的线圈波形并且适于皮肤施加的脉冲模式的有效电信号波形的图示。

图2b提供了示出用于促进骨的矿化的连续模式的有效电信号波形的图示。

图3a提供了示出用于促进骨细胞的增殖的脉冲模式的有效电信号波形的图示。

图3b提供了示出用于促进骨细胞的增殖的连续模式的有效电信号波形的图示。

图4提供了示出用于提供电流的实验室空间的图示。

图5提供了示出在上清液(左)和膜(右)中的碱性磷酸酶中的改变的条形图。

图6提供了示出在骨钙蛋白和钙沉积物随着信号“B”的改变的条形图；

图7提供了示出在存在和不存在L-NAME的情况下作为PEMF信号波形的对照±标准偏差的百分比的、由DNA测量的细胞数量上的提高的条形图。L-NAME单独被作为实验对照。

图8提供了使用用于在体外应用中的机械和电子刺激的组合的设置的示意图。

本发明的详细描述

下面的说明包括执行本发明的最佳的当前考虑的方式。这个说明用于说明本发明的一般原理，不应当当作限定。在此所述的参考文献的文本通过引用被整体包含在此，其中包括美国临时申请60/687,430、60/693,490、60/782,462和60/790,128。

应当理解，在此所述的本发明的当前的体外应用也可以被外推到体内应用、治疗等中。本领域内的技术人员可以理解，使用减少的制剂和体外模型而开发的技术可以最终用于体内的应用。可以从自体外或者动物模型测试系统得到的剂量响应曲线外推体内的电子刺激的有效值和范围。

本发明使得能够提供生物电信号，所述生物电信号被优化为对应于自然身体信号的所选择的特性，产生加速的和更永久的愈合。在此所述的信号唯一地符合自然信号的所选择的特征，因此，按照本发明进行电刺激的组织经受了最小的生理应力。另外，本发明是非侵入性的和成本低廉的，使得能够期望对于人的多次应用和单独使用。

骨重塑

骨是人体的最硬的组织之一。作为人体骨骼的主要成分，其不仅支持肌肉结构，而且保护在颅腔和胸腔内的重要器官。骨由在细胞间的钙化材料(骨细胞外基质)和不同的细胞类型(成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)构成。细胞外基质由有机和无机成分构成。所述有机成分包括细胞、胶原蛋白、蛋白多糖、透明质烷和其它蛋白质、磷脂和生长因子。骨的硬度来自矿化的无机成分，其主要是以羟磷灰石Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂形式结晶的钙和磷。胶原蛋白和羟磷灰石的组合使得骨具有坚硬和刚性特性。

从间充质来源的祖细胞衍化出成骨细胞，并且所述成骨细胞被分布在正在出现的骨基质旁边的表面上，并且一个接一个地排列。成骨细胞的主要功能是确立和发育骨基质，并且在基质矿化中起作用。当成骨细胞被嵌入骨基质的陷窝中时，成骨细胞被称为骨细胞，所述成骨细胞采用略微不同的形态，保持与其它骨细胞的接触。破骨细胞是更大的多核细胞，其包含降血钙素和整联蛋白的受体和其它特殊的结构特征。破骨细胞的主要功能是再吸收钙化的骨基质的无机和有机成分。

骨重塑是骨组织的重吸收和形成的基本的和高度综合的过程，其导致具有矿化基质的更新的精确地平衡的骨质。上述可更新的过程能够实现，而不损害骨骼的整体解剖架构。内部更新的这个连续过程通过响应于应力连续修复微裂纹和改变而保证骨保持用于真实再生的能力和维持骨完整性。成人骨骼的架构和构成处于永久的动态平衡。重塑也提供了用于响应于内环境稳定的要求而释放钙的手段。影响骨重塑的条件包括机械刺激(诸如固定或者失重状态)、电流或者电磁场(诸如电容耦合的电场或者脉冲的电磁场)、激素改变或者响应于特定的炎症。

骨重塑通过一系列配合的活动周期而发生，所述活动周期包括激活、重吸收、逆转、形成和静止步骤。激活的特征为存在衬细胞的薄层。然后，造血系统的循环的单核细胞开始迁移到激活区域，并且结合在一起以形成破骨细胞。激活后是重吸收，其中，激活的破骨细胞挖开骨性表面。这个步骤通常持续约2-4周。逆转在重吸收之后发生，并且持续9天，在此期间，在重吸收凹陷中存在失活的前成骨细胞。下一个步骤是形成，并且需要约3-4月。在这个阶段期间，激活的成骨细胞重新填充挖空区域。骨重塑的最后阶段是静止，其间，不发生重塑行为，直到开始下一个重塑周期。理想地，骨填充的数量必须等于重吸收的数量，并且不丢失骨质量。

波形

本发明提供了电信号和波形，所述波形使得能够在生理组织上进行特定的行为。这样的波形在体外和体内应用中都是有效的。在此示出骨软骨组织以不同地响应于显著不同的频率和波形。

所特别关心的是包括交变的矩形或者准矩形的脉冲的信号，所述脉冲具有相反的极性和不同的长度，由此形成矩形、不对称的脉冲序列。特定长度的脉冲已经被理论化为激活特定的细胞生化机制，特别是将钙或者其它小的、移动的、带电的物质结合到在细胞膜上的受体，或者它们的(通常较慢的)解除结合。具有相反极性的这样的序列的多个部分可以平衡来获得大致净零的电荷，并且所述序列可以或者是连续的或者被划分为由大致零信号的间隔隔开的多个脉冲段。以脉冲段模式施加的刺激具有与作为连续序列施加的那些类似的作用，但是它们的行为可能由于在零信号期间将带电的物质从受体解除结合的(理论上)能力而在细节上不同，并且所需要的施加时间表也不同。

图1示出了对于刺激骨和软骨组织有效的基本波形20的示意图，其中，线22表示在连续模式中的波形，线24表示在脉冲段模式中的较长时标上的同一波形。电平26和28表示电压或者电流的两个不同的特征值，并且间隔30、32、34和36表示在特定的转换之间的定时。电平26和28通常被选择使得当在波形的全周期上被平均时，没有净直流(D.C.)分量，虽然如果期望的话可以选择电平26和28以产生净的正或者净的负直流分量。在实际应用中，诸如20的波形通常在下述方面被修改：所有的电压或者电流向在电平26和28之间的某个中间电平以指数衰减，并且衰减时间常数优选地大于间隔34。结果被表示为线38。在此所述的波形一般具有两个信号分量：相对于彼此被示出为间隔30的较长分量和被示出为间隔32的较短分量。

在短和长信号分量长度中的变化对被刺激的组织产生特定的效果。在本发明中所关心的脉冲长度可以被定义如下(以长度增加的顺序)：

长度α：在持续时间上在5和75微秒之间，优选的是在持续时间上在10和50微秒之间，更优选的是在持续时间上在20和35微秒之间，最优选的是在持续时间上为约28微秒。

长度β：在持续时间上在20和100微秒之间，优选的是在持续时间上在40和80之间，更优选的是在持续时间上在50和70微秒之间，最优选的是在持续时间上为约60微秒。

长度γ：在持续时间上在100和1000微秒之间，优选的是在持续时间上在150和800微秒之间，更优选的是在持续时间上在180和500微秒之间，最优选的是在持续时间上为约200微秒。

长度δ：在持续时间上超过1毫秒，优选的是在持续时间上在5和100毫秒之间，更优选的是在持续时间上在10和20毫秒之间，最优选的是在持续时间上为约13毫秒。

在第一实施方案中，电信号具有长度α的较短分量和长度β的较长分量：因此，在最优选的每个类型的脉冲长度(分别是28微秒和60微秒)下具有约11.4KHz的频率。由交替的长度α和长度β的脉冲构成的信号在此被称为“类型A”信号，它们的波形被称为“类型A”波形。在图2a中示出了作为连续的脉冲序列而施加的“类型A”信号。诸如此的信号有益于促进组织样本的增殖或者多种生理或者治疗应用的培养。

在脉冲段模式中，在约0.5到500毫秒(优选的是约50毫秒)的脉冲段中接通“类型A”波形，并且所述脉冲段以0.1-10Hz或者优选约1Hz重复。在图2b中示出了这种类型的波形的一个示例。

在第二实施方案中，所述电信号具有长度α的较短分量，和具有长度γ的较长分量：因此在最优选的每个类型的脉冲长度(分别是28微秒和200微秒)下具有约4.4KHz的频率。由交替的长度α和长度γ的脉冲构成的信号在此被称为“类型B”信号，它们的波形被称为“类型B”波形。在先前美国专利申请第10/875,801号(公开第2004/0267333号)中描述了这样的波形。在图3a中示出了作为连续的脉冲序列而施加的“类型B”信号。诸如此的信号有益于疼痛缓解和促进骨愈合，并且也刺激体外的成骨细胞培养物中的松质骨样结构的发育，并且应用到手术骨修复和移植材料的领域。

在脉冲段模式中，在约1到50毫秒(优选的是约5毫秒)的脉冲段中接通“类型B”波形，并且所述脉冲段以5-100Hz或者优选约15Hz重复。在图3b中示出了这种类型的波形的一个示例。这个波形在形状和幅度上类似于由在不连合的骨刺激产品(例如EBI MEDICA，INC.

(Parsippany，纽约州)和ORTHOFIX，INC.

(McKinney，德克萨斯州))普通使用的典型的感应(线圈)电磁装置提供的有效电流。

在第三实施方案中，电信号具有长度β的较短分量，和具有长度γ的较长分量：因此在最优选的每个类型的脉冲长度(分别是60微秒和200微秒)下具有约3.8KHz的频率。由交替的长度β和长度γ的脉冲构成的信号在此被称为“类型C”信号，它们的波形被称为“类型C”波形。诸如此的信号有益于促进骨再生、成熟和钙化。

在脉冲段模式中，在约1到50毫秒(优选的是约5毫秒)的脉冲段中接通“类型C”波形，并且所述脉冲段以5-100Hz或者优选约15Hz重复，这与“类型B”很相似。这个波形在形状和幅度上类似于由在不连合的骨刺激产品(例如ORTHOFIX，INC.(McKinney，德克萨斯州)、PhysioStim Lite

，被设计来促进脊柱融合的愈合)普通使用的其它典型的感应(线圈)电磁装置提供的有效电流。

在第四实施方案中，电信号具有长度γ的较短分量，和长度δ的较长分量：因此在最优选的每个类型的脉冲长度(分别是200微秒和13微秒)下具有约75Hz的频率。由交替的长度γ和长度δ的脉冲构成的信号在此被称为“类型D”信号，它们的波形被称为“类型D”波形。诸如此的信号特别有益于促进软骨愈合和骨钙化，并且治疗或者逆转骨质疏松症和骨关节炎。虽然在广义上类似于如通过引用而被并入在此的美国专利#5,273,033的图3中所示的由BIONICAREMEDICAL TECHNOLOGIES INC.

BIO-1000^TM通过电极提供的信号，但是“类型D”信号在波形形状上实质不同(其是矩形的而不是指数的)，并且其优选是电荷平衡的。

在脉冲段模式中，在至少100毫秒(优选是约1秒)的脉冲段中接通“类型D”波形，并且以一秒或者更大的间隔重复脉冲段。

信号强度也可以不同：事实上，更强的信号经常不比更弱的信号有益，并且有时还更差。对于典型的信号(诸如图1的信号)，峰值效用通常位于每平方厘米1和10微安(μA/cm²)之间的某个位置，并且交叉点在约这个值的100倍处。在这个点之外，所述信号可以缓慢愈合或者可能本身引起进一步的损伤。

以连续模式而不是脉冲段模式运行的电信号或者波形与本方法特别相关。(例如图2a或者3a)。连续地运行的信号具有与脉冲段信号类似的效果，但是可能需要不同的递送时间表来实现类似的结果。

对于用于本发明的方法的波形，典型的所施加的平均电流密度在每平方厘米0.1和1000微安之间，优选地在每平方厘米0.3和300微安之间，更优选地在每平方厘米1和100微安之间，最优选地在每平方厘米10微安，结果导致在典型的身体组织中，电压梯度的范围分别在每平方厘米0.01和1000之间、0.03和300之间、0.1和100之间、1和10微安之间。所述独立的接近方波的信号与长正分段和短负分段异步，或者反之亦然。所述正负部分平衡以获得零净电荷，或者可选地可以与在脉冲尾部的均衡脉冲电荷不平衡，以提供在作为整体的波形上的零净电荷平衡。由皮肤电极提供的这些波形使用连续的矩形或者近似矩形的波形，而不是正弦的或者强指数衰减的波形。在通过引用而整体被并入在此的、所公开的美国专利申请10/875,801(公开号2004/0267333)中公开了本发明的方法中可用的其它波形。

如上所述的电信号可以在需要治疗时在间歇的治疗间隔或者在一天中连续地施加到细胞、生物组织或者个人。治疗间隔在此被定义为以脉冲段或者连续模式施加波形的时间间隔。治疗间隔可以是在持续时间上为约10分钟到约4小时、在持续时间上为约30分钟到约2.5小时或者在持续时间上为约1小时。治疗间隔可以每天发生约1到100次。可以对于每种情况调整治疗间隔的持续时间和频率，以获得有效数量的电刺激来促进细胞增殖、细胞分化、骨生长、发育或者修复。所述参数被调整以确定最有效的治疗参数。

信号不必然在治疗间隔上要求长的持续时间，虽然如果期望的话可以使用24小时的施加。通常，为了获得生物效果，需要30分钟(一天重复几次)。可以通过标准手段(诸如细胞计数、核酸或者蛋白质合成的增加)来测量体外细胞增殖。也可以测量(mRNA和蛋白质合成)基质蛋白质(胶原蛋白类型I、III和IV)以及生长因子和细胞因子(诸如TGF-B、VEGF、SLPI、FN、MMP)的上调和下调。可以通过损伤的治愈率或者通过测量骨质密度来确定体内效果。用于骨组织的增殖、分化或者矿化的其它诊断方法对于本领域内的技术人员是显然的。

在一个实施方案中，依序使用促进增殖和促进分化的信号。这种波形的组合用于提高细胞数量，因此促进细胞的分化。作为示例，所述依序使用增殖和分化信号可以用于促进成骨细胞的增殖，因此促进将成骨细胞分化为产生矿物质的骨细胞，其促进骨的矿化，或者反之亦然。例如，可以使用一个治疗范例，其中，首先在体外或离体向细胞群施加促进增殖的A型信号达到几个小时、几天或者几周，然后将所述促进增殖的信号替换为促进矿化的B型信号达到几个小时、几天或者几周，直到已经实现了骨矿化。所产生的组织可以然后被移植以有益于病人。也可以将两种信号同时施加以同时促进增殖、分化和矿化。

可以通过皮肤电极或者电化学连接来提供所述电信号。可以以商业方式获得皮肤电极，其大小诸如11/2×12、2×31/2和2×2英寸，其分别可能有益于施加到脊柱、髋部和臂部。这些可再用的电极是有益的，因为它们不包含胶乳，并且还没有显示大的皮肤刺激。所述可再用电极可以多次被使用；这也减少病人的费用。这样的电极可以包括电极#214(1/5”×13”)、#220(2”×2”)和#230(2”×3/5”)(KOALATYPRODUCTS

，Tampa，佛罗里达州)或者电极#T2020(2”×2”)和#T2030(2”×3.5”)(VERMED，INC

，Bellows Falls，佛蒙特州)。

使用皮肤电极来取代电磁线圈具有多个优点。首先，皮肤电极更有效。使用电极，仅仅必须产生将实际被发送到身体内的信号，使用线圈，因为与组织的不良电磁耦合，所置入的信号必须比在所述组织中需要的强许多许多倍。这使得所需要的电极产生电路可能比线圈的产生电路简单得多，同时需要更少的功率来操作。其次，皮肤电极更有利于用户。皮肤电极具有至多需要提供等同的信号电平的线圈的重量和体积的百分之几。类似地，因为较好的耦合效率，可以使得用于驱动电极的信号发生器比用于线圈的信号发生器小得多和轻得多。在短时间后，佩带者几乎注意不到它们在那里。第三，皮肤电极更经济。不像线圈(其每个花费几百到几千美元)那样，电极是“可丢弃”物品，通常成本小于1美元。而且，因为更大的效率和更简单，与用于线圈的相比较，用于驱动它们的信号发生器和电池可以小和制造便宜。第四，皮肤电极允许更简单的电池结构和更长的电池使用期限，这便利了使用所述装置的容易性和病人的顺从性。最后，皮肤电极比电磁线圈更通用。线圈必须被建立来匹配它们将被使用于的身体部分的几何特性，并且每个必须足够大来环绕或者围住要治疗的部分。这表示，要“覆盖”身体，必须有许多许多不同的线圈大小和形状，其中一些特别大。另一方面，利用电极，仅仅通过电极布置来确定电流分布，可以容易在其间的全部体积来预测电流分布，因此，身体可能仅仅被“覆盖”几个电极类型外加良好地选择的方位的列表。

刺激系统

本发明也考虑包括细胞和用于向细胞提供电信号的刺激器的生物系统。这样的细胞可以包括但是不限于前驱细胞，诸如干细胞、非定向祖细胞、定向祖细胞、多能祖细胞、多向性祖细胞或者在分化的其它阶段的细胞。这样的细胞可以是胚胎的、胎儿的或者成人的细胞，并且可以从自体固有的或者同种异体的来源采集或者与其分离。在一个实施方案中，使用增殖细胞，虽然也可以在在此所述的方法中使用非增殖细胞。这样的细胞可以在体外，例如在组织培养物中被组合，或者这样的细胞可以在体内被组合以用于组织工程或者组织修复应用。移植的干细胞可以选择性地被吸引到受伤或者疾病的位置，然后被电刺激以增强愈合。

按照本发明的方法和目的的刺激细胞培养物也需要用于同时向许多培养孔提供均匀的波形而不干扰孵育过程或者引起污染的实用手段。在此提供用于使用用于信号施加的、特殊设计的电容耦合阳极化的电极系统来达到下述目的的装置：用于在孵育期间电刺激培养物，所述培养物优选地包含6个组织培养孔，它们被连接为多孔系统。通过使用带状电缆附件，在孵化器的密封上的泄露被最小化，以保持用于培养物的受控二氧化碳环境。在图4中以部分示意的形式示出了典型的设置。

例如在图4所示的设置中，互连6个组织培养孔110a-110f，并且每个孔在室端部包括由两条15毫米和一条7.5毫米的直的导线分段形成的电极140，所述两条15毫米和一条7.5毫米的直的导线分段通过回头弯而结合，并且通过直角弯而连接到桥112的中央部分142。在图4中示出了7个这样的桥。电极140被定大小以适配Lab-Tek II滑动箱的端壁，所述滑动箱测量尺寸为18×48毫米，其内部具有典型的3毫米填充深度。这样的电极的电容是约0.56微法。桥112a和112g不同在具有端孔螺旋144，每个端孔螺旋包含约15cm的导线。结果产生的在桥导线112a或者112g和对应的银电极104之间的电容是约2.3微法。

由固态的较为惰性的金属形成的桥112a、112b等在端孔106a和106b之间电串联室110a、110b等。虽然在此示出了6个室110a到110f和七个桥112a到112g，但是可以使用任何其它方便的室数量“n”和桥的数量“n+1”。另外，多个这样的串联的分组(每个由“n”个室、“n+1”个桥和两个端孔构成)可以使用信号分布装置(诸如电阻器网络以在分组之间分担信号能量)来用于单个信号源100，这是电子信号传输领域中公知的。

所示设置的总的电阻抗(具有所述的12个室电极端、2个端孔螺旋电极106和6个所述室)主要具有电容0.045微法外加约1万欧姆的电阻分量。在信号源100和端孔106a之间连接的串联电阻器(未示出)可以将所施加的电流调整到期望的电平，并且也“淹没”所述串联的电抗的电容部分，例如，对于1M欧姆的电阻器，频率响应从5Hz到3Mhz在+/-3dB内是均匀的。

如果期望的话，可以这样用在放大的室110b中所示的探针来测量在室中的信号能量分布。探针120被沉浸在介质122中，并且被移动到一连串位置，优选标注矩形的网格，所述探针120由任何合理的惰性金属构成，但是优选由作为电极104a和104b的99.9％的纯银构成，其除了在它们的尖端之外被绝缘，并且这些尖端以已知和固定的距离相间。在每个位置的差动电压被差动放大器124(诸如模拟装置AD522)读取，并且被发送到用于显示或者记录的示波器或者其它装置(一般地被指示为126)。结果被方便地表示为数字阵列，用于表示在每个点的信号强度与整体平均值的比率，如在图4的底部的放大的室110b再次所示。或者，可以使用其它的手段，诸如彩色编码或者三维图形。

如在图4中的网格所示，在电极被布置在矩形室的窄端的情况下的信号分布通常相当均匀，除了在紧邻电极本身的小区域之外。当切断的或者破裂的氧化物复原时，均匀性也随着时间或者在介质中或者在普通盐水中改善。例如在图4左下的平均值以上的读数可能产生自在切断的导线端的不完全复原的氧化物。

为了处理方便、最小化介质蒸发和容易保持无菌性，在分组中的所有的室、桥和端孔可以方便地被组配在硬玻璃板或者其它可以灭菌的载体上，并且这些板的一个或多个一旦被组配则可以被围在诸如硬塑料箱之类的外部容器中。

本发明也提供了新的刺激装置，用于提供电信号以便促进骨生长或者修复。具体地，提供了新的无源电极系统，用于提供电信号。这些电极系统耦合用于体外或者体内应用的时变电信号；并且替代传统的电解液桥技术(用于通过有利于电容耦合的感应来提供PEMF类型的信号)。所述电极系统可以由诸如但是不限于下述的材料构成：阳极化的金属，诸如铌、钽、钛、锆、钼、钨和钒。铝和不锈钢共享这样特性，但是程度很低，因为它们被包含氯离子的溶液缓慢地侵蚀。在可用的频率(通常在约5Hz和3MHz之间，并且在电路改进的情况下，从小于约1Hz到超过约30MHz)，可忽略DC电流通过。

铌是自我钝化(由此当被暴露到氧气和湿气时形成薄但是很耐久的表面氧化物层)的几种金属之一。这个过程可以被阳极化控制。一般地，自我钝化建立可靠的连接，而其它方法比较困难，但是，本设计独特地使用电容耦合来在电极中感应电流，由此避免与其它金属形成电连接的困难。这种电极系统提供了可忽略的电解，并且没有生理上严重的细胞毒性，也有益于体内应用。

用于本发明的电极系统的导线是“自我保护的”，当被暴露到湿气或者氧气时形成非活性氧化物的薄的但是很耐久和紧密粘着的表面层。如此形成的氧化物具有高的介电常数，并且氧化物的厚度大致均匀，并且可以被密切地控制。保护性氧化物薄层允许所述金属作为耦合电容器，用于向具有均匀分布和可忽略的电解的培养介质引入交流(零净电荷，或者ZNC)电信号。

一般被指示为100的刺激器或者其它信号源通过导线、接线或者通过任何其它方便的装置102而被连接到一对较为惰性的金属电极104a和104b，它们被浸没在端孔106a和106b中的导电液体中。这些装置提供了信号对于其要应用到的培养室110a、110b等的组件的进入点。电极104a和104b优选使用纯银(99.9％纯)，端孔106a和106b中的液体优选使用盐(氯化钠溶液)，因为在使用中，氯化银薄层形成在界面上，并且通过可逆的电化学反应便利了电流的通过。但是，也可以使用其它的金属和液体。

桥112a、112b等可以由任何较为惰性的金属形成，只要所述金属不是细胞毒性的。通常被用作惰性电极以用于生物液体的金属是银、金、铂和其它铂族金属。不幸的是，它们成本高，可以允许甚至催化在它们的表面的一些电化学反应(特别是如果存在小的杂质的话)，并且这样的反应的生成物可能是细胞毒性的。

由于这个原因，在本发明中优选使用所谓的“自我保护”金属的组，所述金属与水或者水溶液接触，形成薄的、连续的、高度不可溶解的和生理上惰性的表面氧化物层，其将所述金属表面密封以免其它的液体接触。这个氧化物形成电信号传递系统和培养介质之间的唯一接触。这样的金属包括铌、钽、钛、锆、钼、钨和钒。铝和不锈钢共享这个属性，但是是以较小的程度，因为它们被包含氯离子(几乎所有的生物液体都如此)的溶液缓慢地侵蚀。

通过阳极化，可以增强在这样的金属上的氧化物形成，并且以密切可控的方式来提高所述氧化物的厚度。均匀的氧化物厚度提供了金属表面每单位面积均匀的电容，于是得出在表面上的较为均匀的信号强度，而几乎与其在液体中的形状无关。通过切割和形成而引起的在氧化物中的小裂缝通过与所述液体的进一步的反应而迅速地愈合。

本申请尤其优选使用铌，因为由于通过经由阳极化产生的表面氧化物(Nb₂O₅)中的光干涉形成的鲜艳和稳定的颜色，它在珠宝中常见，因此可以以合理的价格以方便的形式和多种常备的颜色来获得它。里奥格兰德(Rio Grande)珠宝公司例如存储了20和22规格的圆形铌导线，其被预先阳极氧化为“紫色”、“桃红色”、“蓝黑色”、“深青色”、“绿色”和“金色”，每种颜色表示不同的氧化物厚度。所述导线容易被加工和形成为任何期望的电极形状。在给出Nb₂O₅的折射率(N_D＝2.30)及其介电常数(ε_R＝41ε₀)的情况下，可以从光反射谱容易地测量所述氧化物厚度，并且可以计算结果产生的每单位面积的电容或者导线长度。“紫色”导线具有最薄的氧化物，从420纳米的峰值反射率测量为48纳米，因此对于22规格的“紫色”导线(直径为0.644厘米，里奥格兰德目录编号638-240)，电容被计算为每厘米导线长度0.154微法。直接测量初始由于氧化物裂缝而给出非常高的读数，但是在盐水中24小时后，所测量的电容稳定在每厘米0.158微法，接近预测值。

桥112a、112b等因此非常像传统的盐桥那样电作用，除了不可能有液体或者离子流通过它们，因此避免了在室之间或者在室和端孔之间的可能的交叉污染。另外，避免了传统盐桥遇到的蒸发和可能的泄露的问题以及操作琼脂或者其它胶凝剂的不方便。因为它们是电容性的，因此所述桥阻挡直流，因此达到所述室的信号在相位之间电荷平衡，去除了任何直流分量。

优选的是，与生长介质接触的所有的桥端具有相同的大致尺寸，并且包含大致相同的导线长度，因此全部具有大致相等的电容，并且靠着培养室(其本身优选是矩形的)的窄端布置，如图4中的放大的室110b中所示。与在端孔中的液体接触的桥端(例如在图4中的桥112a和112g的左端)如果期望的话可以被提供不同的形状，以增加接触，降低电容，并且/或者更好地适配端孔(如果这些与培养室不同)的大小和形状。例如，当使用圆形端孔时，在它们中浸入的桥端可以方便地被形成为螺旋144，如图4中所示。

因此总之，本发明所考虑的生物系统包括下面的元件：电子模拟器、阳极化的金属电极和细胞。用于这样的系统中的适当的PEMF信号包括如例如在图2或者3中所述的波形。这样的信号的实际应用包括提高骨组织的增殖、分化或者矿化，提高BMP表达，或者提高一氧化氮产生。

组织工程

本发明的方法也可以用于组织工程应用。可以结合生物相容的支架使用本发明的方法和培养系统来培养细胞，以在体外或离体产生功能组织，或者所述细胞被移植以在体内形成功能组织。被移植的细胞或者宿主细胞也可以被选择性地移植或者吸引到受伤或者疾病位置，然后被使用在此所述的电信号刺激以增强愈合或者修复。组织支架可以由生物相容的自然聚合物、合成聚合物或者其组合被形成为具有大致开放的架构的非织的开放的细胞化的基质，所述基质提供了培养系统内的或者体内的细胞浸润的足够空间，同时在将支架集成到宿主体内的目标位置中期间，保持足够的机械强度来承受由在所述支架内的细胞生长施加的收缩的、压缩的或者拉伸的力。组织支架可以是硬结构，用于产生具有限定形状的固态的三维机构，或者，支架可以是半固态的基质，用于产生柔性组织。

本发明的方法和培养系统包括使用由聚合物单独、共聚物或者其混合物制成的支架。所述聚合物可以是可生物降解的或者生物稳定的或者其组合。在此使用的“可生物降解的”材料是包含可以在生理条件，包括酶促的或者化学键的水解分裂下被裂解的键。

适当的自然聚合物包括但是不限于多糖，诸如海藻酸盐、纤维素、右旋糖苷、支链淀粉(pullane)、聚透明质酸、几丁质、聚(3-羟基烷酸酯)、聚3-羟基辛酸酯和聚(3-羟基脂肪酸)。在本发明中也考虑所述自然聚合物的化学衍生物，包括化学基团的取代和/或添加(诸如烷基、烯基、羟基化、氧化)以及本领域内的技术人员熟悉的其它修改。也可以从诸如胶原蛋白、玉米蛋白、酪蛋白、明胶、谷蛋白和血清白蛋白的蛋白质中选择所述自然聚合物。适当的合成聚合物包括但是不限于聚磷腈、聚乙烯醇、聚酰胺、聚酯酰胺、聚氨基酸、聚酐、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基甘醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二甲酸盐、聚原酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤代乙烯、聚酯、聚交酯、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚已内酯、聚羟基丁酸酯、聚氨酯、苯乙烯异丁酯苯乙烯嵌段聚合物(SIBS)和共聚物及其组合。

可生物降解的合成聚合物是优选的，并且包括但是不限于聚α-羟基酸，诸如聚L-乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(即聚D，L-乳酸共-乙醇酸(PLGA))以及透明质酸。FDA批准聚α-羟基酸用于人类临床应用。应当注意，某些聚合物(包括多糖和透明质酸)是水溶性的。当使用水溶性聚合物时，重要的是通过化学修饰(例如通过使用交联剂)使得这些聚合物呈部分地水不溶性的。

可生物降解的聚合物基质的优点之一是可以将血管生成的和其它的生物活性的化合物直接地并入所述基质中，以便它们在所述基质在体内降解时缓慢地被释放。当细胞聚合物结构被血管化并且所述结构降解时，细胞将按照它们的固有特性分化。包括营养素、生长因子、分化或去分化(即，促使分化的细胞失去分化性能并且获得例如增殖等性能以及更多的一般功能)的诱导剂、分泌产物、免疫调节剂、炎症抑制剂、退化因子、生物活性化合物(可增强或允许淋巴网络或神经纤维的向内生长)、透明质酸、以及本领域技术人员已知的药物(由诸如Collaborative Research，Sigma Chemical Co.等供应商提供，并且在告知有效剂量的情况下可以商购)、血管生长因子(例如血管内皮生长因子(VEGF))、EGF和HB-EGF等因子可以被并入基质中或与基质组合而被提供。类似地，含有例如附着肽RGD(Arg-Gly-AsP)的肽的聚合物可以被合成，以用于形成基质。

试剂盒

在本发明中还提供了试剂盒，其将电刺激器与生物相容的支架结合，以支撑细胞生长并且将整合到被联合的组织中。内装有电极的容器可以被设置有试剂盒，电极可以由自钝化材料或其它传统的电极材料制成。这些试剂盒可以可选地包括例如生长介质等试剂以及生长因子，以促进细胞与支架的结合。包括在试剂盒中的支架可以被设计成具有被固定于其表面的促进生长的分子和粘合分子。这种试剂盒可选地与关于适当使用和最佳化的使用说明被包装在一起。

直到细胞可以与试剂盒的其它元素结合而生成适当的组织之前，细胞可以被设置在试剂盒中，以保护材料保存的形式。在一个具体实施方式中，所提供的细胞是被低温储藏在液氮中或者是在诸如海藻酶糖的存在下干燥的细胞。细胞可以是未分化的祖细胞，包括干细胞、多能干细胞、多向性干细胞或定向祖细胞。可选地，最终被分化的细胞也可以被用于这些试剂盒。这些试剂盒可以被设计为制备用于例如，但不限于，骨、软骨、肌肉、肾、肝、神经系统、肺、心、血管系统等中任一器官系统的替换组织。

细胞也可以从需要治疗的病人获取，以便从病人自己的组织基因工程替换组织。使用病人自己的组织提供了一种生成移植组织的方法，其减少了与组织排斥相关的并发症。

已经发现除了单纯的电刺激之外，体外的电和机械刺激的组合可能对某些方面有利。机械刺激可以包括拉伸负荷、压缩负荷或剪切负荷。典型的装置如图8a到图8e的剖面图所示。

在各种负荷的情况中，测试装置都围绕本领域所熟悉的任何一种类型的培养孔或室200而安装，该培养孔或室内装有介质202，细胞层204通常附着于底片或膜206，该底片或膜可以是或不是培养孔的刚性机械底部208的一部分。电极210可以是如所描述的任意一种可用的金属，但优选可自保护的金属，更优选阳极化处理的铌，该电极210以在整个介质202中形成相对均匀的电流分布的方式被设置在室200中。

对于拉伸负荷而言，膜206在如图8a中所示的培养孔或室200中形成另外的或者“伪”底部。膜206可以由任意的适当柔性且弹性的材料制成，细胞自行粘附于其上，该材料可以是例如经过等离子蚀刻的硅橡胶。管212用外接的泵或其它稳定的或波动的压力或真空源216连接膜206与刚性室底部208之间的空间214。压力或真空源216的间歇运转促使膜206上下弯曲，在膜中从而在附着于该膜的细胞层204中形成间歇张力。可选地，源216可以长期地几乎不或完全不在膜206上施加压力，这使得细胞204可以长满未展开状态的膜，然后施加一个不同的压力，从而例如在培养生长中的一个点上拉伸膜206，细胞在该点上刚好实现融合并且建立起缝隙连接的接触。

对于压缩负荷而言，不同的是，培养孔或室200用盖220密封并且直接连接于如图8b所示的压力源216。源216在介质202中形成稳定的或波动的液静压，从而将该液静压直接地施加给细胞层204。

作为用于压缩负荷的一个可选装置，管212和压力源216被取消并且室盖220采用可移动的活塞的形状，稳定的或变动的压力可以通过该室盖直接施加给介质202，从而施加给细胞204，如图8c所示。

对于剪切负荷而言，不同的是，培养孔200通过两根管212a和212b连接于压力源216，介质202通过该两根管循环流动，如图8d所示。该流动可以是在一个单独方向上恒定的，间歇的，或是振荡的。各管优选装配有隔板220，以获得如通过箭头222总体表示的更均匀的流。隔板220可以与所示电极210分开地制成，或者可选地，电极可以被穿孔或另外制成不连续的，以便自身形成隔板。介质202的移动和其与细胞层204的摩擦产生所需的剪切负荷。

作为用于提供剪切负荷的备选装置，用移动的叶轮230代替管212a和212b以及压力源216，该叶轮保持介质202相对于细胞层204移动(如箭头232总体表示)。叶轮230可以采用几种形式中的任何一种，但是可以有利地采用如图8e所示的圆柱形，其中室200的刚性底部208采用大致相同的形状，并且与叶轮表面保持相对一致的间隔。因此仅仅通过保持叶轮230在恒定速度下旋转，使介质202以一稳定速度连续地扫过细胞204。或者，改变叶轮230的速度可以改变流动速度，从而改变剪切负荷的水平。电极210未示出，因为它们可以位于该配置中的多个位置上。但是，优选地，刚性室底208和叶轮230自身由适当的电极金属制成，更优选由自保护金属制成，最优选由阳极化的铌制成，并且它们自身被用作电极。

骨生长的分化调节

如上所述的本发明的波形在用于促进体内骨组织生长和修复的方法中也是有用的。如上所述，具有A类波形的刺激可提高细胞增殖。A类波形也导致用于促进分化的骨形态形成蛋白质的增加。在一个实施方案中，使用A类或在更低程度上使用B类电信号可实现BMP-2和BMP-7产量的增加。对适当的体内组织愈合或形成组织移植物而言，该效果是高度有价值的，它提供了增强生成足够组织的方法。对提供足够的可渗透入用于组织工程目的的聚合物支架的细胞量而言，该信号也是有价值的。在另一实施方案中，如体外试验所示，体内刺激提供了成骨细胞的增殖和分化，以增加用于矿化的成骨细胞数量。细胞数量上的这种增加提供了用于在通过电刺激发育或再生骨时填入间隙或孔的方法。由A类波形诱导的通过增殖生成的细胞可以被立即使用或利用传统的细胞储存方法进行保存直至将来需要时。

用B类波形的刺激在较小程度上促进增殖，并且具有不同于A类波形的作用。由B类波形促进的作用包括，但不限于，矿化作用、细胞外蛋白质生成、以及基质机化。B类波形的作用也是有价值的，可提供增强新骨组织的矿化步骤和骨化作用的方法。在一个实施方案中，用B类波形刺激发育或再生骨组织，以增强矿化作用速率。已经有人提出，B类波形可以通过钙/钙调蛋白途径并且通过G蛋白质偶连受体或机械感受器对骨细胞的刺激而进行作用(Bowler，FrontBiosci，1998，3：d769-780；Baribault et al，MoI Cell Biol，2006，26(2)：709-717)。这样，还提供了调节钙/钙调蛋白介导的反应活性以及利用电刺激的G蛋白质偶连受体或机械感受器的方法。这些细胞通道和受体的调节对促进体外或体内骨组织的生长和修复都是有价值的。

用C类波形的刺激可促进骨再生、成熟以及钙化。这些波形也是有价值的，并且提供了增强新骨组织的矿化步骤和骨化作用的方法。

用D类波形的刺激可促进软骨发育和愈合以及骨钙化，对治疗或逆转骨质疏松症和骨关节炎是有用的。这些波形的应用包括：体内应用，例如修复损坏的软骨，增加患有骨质疏松症的病人的骨密度；以及例如与软骨的组织工程相关的体外应用。

还提供了组合或顺次使用本申请中所述的波形的方法，以开发可对骨软骨组织的发育或再生产生具体生物效果的治疗方案。

在一个实施方案中，患有骨障碍的病人的骨折可以用信号治疗，以治愈骨折然后加固骨。作为该实施方案的非限制性实施例，患骨折的骨质疏松病人可以通过首先用A类信号的刺激进行治疗，以促进生长因子的增殖和释放，然后用B类波形，以促进在修复位置上的骨密度增加，从而增加骨质量密度和防止再骨折。

在另一实施方案中，可以将本申请中所述的波形的两类或多类组合用于促进骨软骨组织的相继增殖、分化以及矿化。作为该实施方案的一个非限制性实施例，在与聚合物基质的结合中或结合之前，成骨细胞的培养物可以在A类信号的影响下生长。当接种聚合物基质以后，将B类信号施加给细胞-基质结构，以促进作为骨移植而有用的结构的矿化。

在第三实施方案中，可以同时施加两个或多个信号，以促进体内或体外骨软骨组织的伴随增殖、分化和矿化。不同的信号也可以被依次施加给骨软骨组织，以便获得比单独传输其任一种信号更好的效果。该依次施加的步骤可以根据需要而重复，以生成另外的组织(例如骨)，该方法通过以足够次数循环进行该两步法来获得所需的生物效应。作为一个特定的非限制性实施例，可以首先施加A类信号，以首先通过增殖作用生成更多的骨细胞，然后施加B类信号，以诱导大量的骨细胞而产生更多的骨组织(基质、矿物和组织)，然后如果需要则进行重复。利用相继刺激重复的方案而生成的骨量将大于通过单独或组合的信号而生成的骨量。

祖细胞刺激

本申请所述的方法和波形可以被应用于未分化的前体细胞，以促进增殖和/或分化成定向的谱系。这种祖细胞可以包括，但不限于，干细胞、非定向的祖细胞、定向祖细胞、多能祖细胞、多向性祖细胞或其它分化阶段的细胞。具体还包括有成骨细胞和成软骨细胞。在一个实施方案中，用A类信号体外刺激多能成体干细胞(间充质干细胞或骨髓干细胞)，以促进多能成体干细胞增殖和分化成具体的通道，例如骨、结缔组织、脂肪等。如前面所述的祖细胞刺激包括组合或者依次施加这两种信号。

或者，本申请中所述的波形和方法也可以被应用于体内多能成体干细胞(间充质干细胞或骨髓干细胞)，以便用A类信号刺激细胞，以促进将多能成体干细胞增殖和分化成具体通道，例如骨、结缔组织、脂肪等。也可包括这两种信号的组合或者依次施加。

祖细胞的电刺激也可以伴随有已知用于促进祖细胞增殖或分化的增殖和分化因子。增殖因子包括具有对细胞的致有丝分裂作用的任何化合物。这种增殖因子可以包括，但不限于，bFGF、EGF、粒细胞集落刺激因子、IGF-I，等。分化因子包括具有对细胞的分化作用的任何化合物。这种分化因子可以包括，但不限于，视黄酸、BMP-2、BMP-7等。

本申请所述的电波形提供了对体外或体内骨软骨组织的生长和发育的分化和组合调节。在矿化作用之前，用A类信号增加细胞的增殖，增大了骨细胞的数量，因此实现了由用B类信号刺激完成的随后的矿化作用的增加。本发明的波形也通过释放一氧化氮和骨形态形成蛋白质促进了祖细胞增殖和分化。

电容耦合

用自钝化金属的体外和体内刺激的制备通常很难，因为其很难获得金属间电连接。本发明提供了可获得使用自钝化金属电极的益处的方法，而不存在与获得可靠电连接相关的问题。这些电极的电容耦合提供了感应直流电流经过自钝化金属电极的方法，其不需要任何电连接。在该方法中，将由例如铌、钽、钛、锆、钼、钨和钒等自钝化金属、铝以及不锈钢制成的电极灭菌，并设置在将被刺激的细胞群的附近。电路导线被设置在例如盐水溶液等导电介质中的金属电极附近，电信号通过电路导线传输从而刺激细胞群，其中，被电容耦合的电流从导线经过盐水溶液和氧化物层进入自钝化金属电极。在一个实施方案中，电容耦合刺激被用于体外应用，例如，但不限于，细胞培养物。可以使用该方法刺激一个培养皿，或者可以将几个培养皿或孔连接在一起，以进行相同的电刺激。

在另一实施方案中，电容耦合刺激被用于体内应用，其中无菌阳极化金属电极被植入需要治疗的病人体内，而电路导线与皮肤接触地被设置在病人体外，以便在对促进组织的修复或生长有效量的时间内在被植入的金属电极中感应电流。例如，电极的外端可以在紧挨皮肤的下方形成一个扁平线圈，信号可以使用设置于线圈正上方的皮肤上的传统皮肤接触电极而耦合于该线圈中。如本领域技术人员熟知，电容耦合电极的不需要强耦合于组织的部分可以用适用于被植入的电路的任何绝缘材料覆盖，从而使信号损失和对不进行治疗的组织的不期望刺激最小。在例如骨修复的具体实施例中，由自钝化金属制成的无菌阳极化金属电极被植入需要治疗的病人体内，并且被刺激。当骨修复进行足够时间之后，可以从病人体内取出电极。

增加BMP表达

本发明进一步包括使用A类和B类波形来促进从被刺激的细胞表达和释放骨形态形成蛋白质(BMP)的方法和装置。本申请所述的电信号可以被用于促使在足以对暴露于该信号的组织产生益处的电平下释放BMP。益处可以产生于不是直接地暴露于信号的组织中。

BMP是骨诱导反应中所涉及的多肽。除了BMP-1之外，它们隶属于转化生长因子β家族。至今已经发现并研究了至少20种BMP，但是仅BMP 2、4、7已经可以对使干细胞分化为成骨细胞的成熟细胞的整个步骤进行体外刺激。目前的研究试图开发用于整形外科组织再生的输送BMP的方法。(Seeherman，Cytokine Growth Factor Rev.2005Jun；16(3)：329-45)。本申请所提供的方法是通过电刺激来诱导用于整形外科组织再生的体外或体内BMP释放，而不是通过在技术上严格要求且成本高的输送方法中的输送外源性BMP。

在一个实施方案中，使用A类以及在较低程度上使用B类波形，以诱导外源性BMP的表达和释放。内源性BMP的释放促进目标组织的生长和分化。刺激电极的设置对体外制备的局部区域或在需要增加BMP表达的病人体内提供了一种靶定BMP表达的方式。在一个实施方案中，BMP-2或BMP-7或其组合被外源性地释放，以实现目标组织的分化和生长。在一个特定的实施方案中，释放BMP-2和BMP-7之一或其两者可以促进骨或软骨组织中的分化、矿化、蛋白质生成以及基质机化。

通过一氧化氮刺激骨、软骨或其它结缔组织细胞

本申请中所述的方法和电信号也可以被用于促进骨、软骨或其它结缔组织的修复和生长。在一个实施方案中，B类波形通过释放一氧化氮(NO)增加了细胞的生长。波形可以促使在足以对暴露于该信号的组织产生益处的电平下释放一氧化氮。益处可以产生于不直接暴露于该信号的组织中。通过与电刺激结合共同施用NO供体可以进一步增加骨、软骨、或其它结缔组织细胞生长。NO供体包括，但不限于，硝普钠(SNP)、SIN-1、SNAP、DEA/NO以及SPER/NO。通过与电刺激结合共同施用NO合酶抑制剂可以降低骨、软骨或其它结缔组织细胞生长。这种NO合酶抑制剂包括，但不限于，N(G)-硝基-1-精氨酸甲酯(L-NAME)、NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)、以及7-硝基吲唑(7-NI)。可以根据具体要求使用这些方法来调节骨、软骨或其它结缔组织细胞生长。

本发明的装置和方法的应用

通过使用本申请所述的本发明的装置和方法，该装置和方法对促进骨软骨组织的生长、分化、发育和矿化是有效的。

可以相信，通过加强将例如在对不同生理条件的细胞反应中所涉及的细胞因子类等化学因子的释放，该装置可以直接在治疗位置上操作。这加剧了血液流动并且抑制了在治疗位置上的进一步发炎，从而增强了身体的内在治疗处理。

本发明尤其可用于加速愈合简单的或复杂的(多处的或粉碎性的)骨折，包括，但不限于，在手术过程中被锯开的或被断开的骨。本发明可以被用于促进脊椎融合手术之后的椎骨融合。

本发明可以被用于治疗不愈合的骨折；治疗、预防或逆转骨质疏松症；治疗、预防或逆转骨质减少；治疗、预防或逆转骨坏死；延迟或消除编织骨(骨痂、骨刺)的形成；延迟或逆转长期卧床休息中的骨钙质流失；延迟或逆转微重力下的骨钙质流失。此外，本发明可以被用于加剧局部血液循环，增加外伤伤口区域的血液流动，增加慢性皮肤溃疡区域的血液流动并且调节血液凝固。

还可以利用本发明的一个方面是加速愈合被损坏的或被撕伤的软骨。而且，本发明可以被用于加速皮肤外伤或溃疡的愈合(表皮形成)。

本发明可以被进一步用于加速所培养的细胞或组织的生长，调节细胞增殖，调节细胞分化，调节细胞循环进度，调节转化生长因子的表达，调节骨形态发生蛋白的表达，调节软骨生长因子的表达，调节胰岛素样生长因子的表达，调节成纤维细胞生长因子的表达，调节肿瘤坏死因子的表达，调节白细胞间介素的表达以及调节细胞因子类的表达。

本发明的方法和装置通过下面的非限制性实施例进一步说明。本领域技术人员在阅读本申请的描述之后，在不脱离本发明的精神和/或所附的权利要求范围的条件下，可以借助其它各种实施方案、变形例、以及它们的等同替换。

具体实施方案

实施例1

PEMF信号结构对原始成骨细胞培养物中的矿化和形态的影响

本研究的目标是通过评价原始骨细胞培养物中的生物化学和形态变化来比较用电容耦合输送的两种PEMF波形结构。

方法

成骨细胞培养物：原始的人体成骨细胞(CAMBREX

，Walkersville，MD)被扩增到75％融合(confluence)，并且以50000个细胞/ml的密度直接接种在前面所述的LAB-TEK^TM(NALGENUNC INTERNATIONAL^TM，Rochester，NY)室中。培养物最初是在没有分化因子的条件下用基础成骨细胞介质支持的。当培养物在室内达到70％融合时，介质被补充有氢化可的松-21-半琥珀酸盐(200mM的最终浓度)、β-甘油磷酸盐(10mM的最终浓度)和抗坏血酸。在37℃、5％CO₂、95％空气下的潮湿空气中培养成骨细胞持续21天。在试验期间每隔两天更换一次介质并对每个室补充4ml。

电刺激：刺激培养物，每天刺激两次且每次持续30分钟或两小时。将两种电信号方案可选择地施加到细胞上，其中一种是表示为“信号A”的连续波形(60/28正/负信号持续时间，以微秒计)，而另一种是表示为“信号B”的连续波形(200/28正/负信号持续时间，以微秒计)。在样本中测得的密度为2.4mV/cm(峰到峰)。未被刺激的成骨细胞(NC)以相似的方式以相同的密度(作为对照例)进行接种。使用具体方法中的步骤测量以下内容：碱性磷酸酶、钙、骨钙蛋白和组织结构。将下面图中的各个符号记为“A”信号和“B”信号，将30分钟持续时间记为“1”，将2小时持续时间记为“2”，将NC(或融合)作为没有电流(即，A1就是A信号-30分钟；B2就是B信号-2小时)。

本申请所用的电装置实现了将连续波形的电刺激同时应用到多个外植体。对每个试验而言，六对外植体被设置在4ml培养介质中的单个的孔中。在相同条件下培养对照样本，其仅有的不同在于缺乏所输送的信号。本试验的结构包括通过铌导线的线圈段串联连接的六个测试培养孔(17×42mm)。

将人体成骨细胞设置在LAB-TEK^TM II滑孔(NALGE NUNCINTERNATIONAL^TM，Rochester，NY)中，该各滑孔具有表面面积为约10cm²。通过使其经由铌导线串联连接而将信号同时施加给几个室，其中铌导线用作耦合电容。该刺激是200/28微秒双极矩形脉冲以15/秒重复的9毫秒脉冲段、传输9mV/cm(类似于标准临床骨治疗信号)的指定信号B；或是60/28微秒基本单极脉冲的48毫秒脉冲段、传输4mV/cm的指定信号A。培养物每天接受两次30分钟或2小时的刺激。在7、14和21天的时间点上从介质中取出样本并分析碱性磷酸酶、骨钙蛋白、基质钙和组织学。伴随形态的矿化已通过Von Kossa染色法得到确认。所有的生物化学分析都是通过传统的分析方法进行的。

结果

使用可商购的ELISA试剂盒(R&D SYSTEMS^TM，MinneapolisMN；INVITROGEN，INC.^TM，Carlsbad，CA)来评价PGE2生成量。其结果以pg/mg组织/24小时(即，μM/g/24hrs)为单位进行表示。

碱性磷酸酶(AP)：在研究设计中所表示的时间点上，溶解细胞(Mammalian-PE，Genotech，St.Louis，MO)并收集上清液。通过在镁存在的碱性条件下将对硝基苯磷酸盐(PNPP)裂解为硝基苯(PNP)，测量碱性磷酸酶。最终产品PNP的比色度是在405纳米处具有吸收峰。使用0.5M碳酸盐缓冲液可以获得pH10.3的碱性条件。直接分析培养介质以获得ALP活性。用氚核X-100的溶液萃取细胞层ALP，并测量等分试样的ALP活性。在溶解缓冲萃取之后测量上清液和膜中的碱性磷酸酶(图5)。如在其它研究(Lohman，2003)中所预期那样，在膜中的碱性磷酸酶表达在接近7日时最高。但是，在“B”刺激下培养的细胞中，培养介质持续显示可测量的AP增加。

骨钙蛋白：骨钙蛋白(5800道尔顿(dalton))是成骨细胞的具体产物。少量的骨钙蛋白被直接地释放到循环中；它主要被沉积在骨基质中。研究表明，骨钙蛋白作为完整的(1-49)蛋白质和作为N-末端片段进行循环。主要的N-末端片段是肽(1-43)。Mid-TactOsteocacin Elisa试剂盒因其高特异性而被选择。该分析是高度敏感的(0.5ng/ml)并且仅需要25微升的样本。对照组与我们的试验组同时进行，这对由BTI制造商(BTI，Stoughton，MA)提供的期望值提供了强相关。在冷却处理培养物后测定的并且由基质成分确定的骨钙蛋白沉积在进行“B”刺激后更加显著，并且在21日时达到最高(图6)。

DNA含量：用0.1N氢氧化钠萃取细胞层，并且取等分试样(aliquot)用CyQuant分析试剂盒(INVITROGEN，INC.^TM，Carlsbad，CA.)分析DNA含量。对于用氚核X-100萃取来测量ALP含量的细胞样本，用1N氢氧化钠调节萃取物至0.1N氢氧化钠。标准曲线包含匹配的缓冲液。对于还要求蛋白质含量的样本，采用染色结合法(Bradford)取等分试样测量蛋白质含量。

钙：通过Schwarzenbach理论方法用形成紫色络合物的邻甲酚酞氨缩络合剂测量钙。通过添加2ml的0.5M醋酸并过夜，钙被溶解并且通过在552nm的比色分析而对照定量测得其含量(CORELABORATORY SUPPLIES^TM，Canton，MI)。

在培养物中的钙分布也是通过组织学来评价的。将细胞固定在2％戊二醛中，用卡可酸盐缓冲液清洗，用PBS清洗，然后再进行水合以如所说明的染色。各时间段是相继进行的；代表性的形态持续显示了21天，比较了“A”信号与“B”信号，并且将这两种信号与对照组进行了比较(图6)。对于信号B，最显著的测定值是具有明显的优选排列的(我们将其解释为“假松质性”骨)的钙分布。对于信号A，呈现出比信号B更高质量的细胞增殖和更少的基质生成(但是，信号A明显比对照物具有更多基质)。

骨测量法分析是由Croucher方法发展和变化而来的。在该二维室系统中，研究了相对于取样的栅格样本的整体面积的平均小梁骨面积(trabecular area)。在各个强度下从两室采用最少20个视野进行骨形成、类骨质宽度以及细胞数目的研究。为了直接比较以及去除误差，使用随机的具体栅格。另外，刺激室和对照室的成骨细胞培养物都是通过Von Kossa法(Mallory，1961)直接染色而检查组织学和定量测定钙在培养物中的分布。

结论

在接近10～14天时升至峰值然后逐渐减退的碱性磷酸酶在由信号B刺激的上清液中增加。在冷却处理培养物之后测定的并且通过基质成分确定的骨钙蛋白沉积在仅施加信号B时更显著，并且在21天时增大至最高点。所测定的以mg/dl为单位的基质钙和作为组织培养皿的面积的函数的基质钙在仅施加信号B的情况下为最多。由组织学和Von Kossa染色法获得的矿物分布验证了来自化验分析的生物化学数据。B刺激获得了更大量的矿物，而且形成可在三维小梁骨排列中提供所期望的类似张力动力的网状二维图形。用信号A比对照物更高质量地呈现出细胞增殖，但是用信号B的显著增加的矿化和图形在21天时更为明显。

这两种信号结构产生了非常不同的效果，这一事实可以通过分析信噪比(SNR)来容易地说明，该分析表明在采用Ca/CaM目标时，信号B的可检测性比信号A高10倍。该研究首次表明PEMF具有潜在的能实现与组织形态学一致的结构变化。几何图形在培养21天后变得明显，其反映出与松质骨一致的小梁骨网状物，并且与在对照物中和在所有评价时间点上暴露于信号A的培养物中的细胞的随机定向形成鲜明对比。这样的结果表明优选的信号结构能够实现以前限于组织水平观察的结构层次。

实施例2

用于体外PEMF刺激的铌“盐”桥的使用

引言

开发使用阳极化铌导线的无源电极系统，以便将时变的电信号耦合到培养室中。该设计的目的在于通过代替传统的用于传输PEMF类信号(例如，由EBI重复脉冲段骨生长刺激器在用于细胞、组织研究的体外组织中电容地而不是电感地产生的信号)的电解质桥技术来降低复杂性和提高再现性。经阳极化处理的铌导线容易获得，并且仅要求简单的手动工具即可形成电极桥。在可利用的频率下(通常在5Hz到3Hz之间)，可以忽略DC电流的通过。

背景

电容耦合的电场通常都已被引入到具有传统的电解质盐桥的培养介质中，这种盐桥具有受限的频率响应并且很难在后续的暴露时间中不受污染地进行使用。铌(钶)是可以自钝化的若干金属中的一种，当被暴露于氧气或湿气中时形成薄而很耐久的表面氧化物层。其它金属有钽、钛、以及在一个更低程度上有不锈钢。该步骤可以通过阳极化处理加速或控制。自钝化的问题是使得与其它金属的可靠连接变得困难。本设计避免了这个难题。

材料和方法

氧化铌(Nb₂O₅)是坚硬的、透明的、电绝缘的，并且对水、普通试剂和宽pH范围下的生物液体都是惰性的。阳极化铌形成显示一系列鲜艳光干涉色彩的具有均匀厚度的Nb₂O₅，并且产生稳定且可再现的电容，由于没有添加染料，该光干涉色彩可用于珠宝。珠宝商的铌以标准色彩进行出售，每种色彩代表一种不同的氧化物厚度。由于Nb₂O₅的介电接触异常高(ε_R＝41ε₀)并且该层很薄(48～70nm)，所以它们的电容都格外大。“紫色的”铌具有最薄的氧化物和最高级别的电容(对于22号导线(Rio Grande#638-240)为0.158μF/cm)，接近对48nM氧化物(420nM峰值反射)的计算值。在水或生理盐水中，在弯曲过程中形成的剪断线端和小瑕疵很快由氧化物愈合，不需要再阳极化处理

铌桥

在本申请中，氧化铌与介质形成唯一的电接触，并且PEMF类信号电容性地经过它。在小于几毫安的信号电平下，引起人为现象的电解或pH变化可以忽略。多个室可以串联连接，每个室均接收相同的信号。各铌桥均被弯曲，以在各末端上形成片状电极，铌桥通常的电容为0.56μF。在矩形室的端部设置电极桥形成几乎均匀的电流分布和在整个介质中的电压梯度。在培养变换器、电极以及PEMF类信号的典型装置中测量的梯度如在图4中预先示出，并且在其相应的文字中已经描述，该梯度表明主要在电极附近或介质在深度方向上的显著变化处的平均变动为±3％。一个室或几个串联连接的室通过特定铌端的桥而被赋予能量，各桥的外端通过盐水而电容耦合到形成连接终端的银片电极。这消除了将铌连接于自身或任何其它金属的必要。电流通过一串联极限电阻(series limiting resistance)R_lim控制。所获得的带通(额定值为±3dB)随R_lim而稍微变化，但是，在5Hz～3MHz之间运行的测试装置中，最高频率通过了试验。因此PEMF类信号可以通过电容耦合在体内不失真地传输。

试验：

使用前面所述的B类波形在成骨细胞和软骨细胞培养物上测试铌电极桥的实用性。在不存在细胞的情况下，将该信号施加在OGM^TM成骨细胞介质(CAMBREX

，Walkersville，MD)上，24小时后测得的pH为8.29，而没有被赋能的对照物为8.27，这证实了可以忽略的电解。使用A类和B类波形两者的OGM^TM在21天中成骨细胞强力增殖和分化和多孔性骨类结构的发育表明不存在生理有效的细胞毒性。持续21天进行30分钟和两小时暴露于培养物中的波形，然后，用能量色散X射线(EDX)分析细胞和基质。没有检测到铌。在其它研究中，将B类信号应用到含1％胎牛血清的培养介质中的人体软骨细胞(HCC)持续96小时。B类信号导致细胞数量增加154％，细胞数量是通过测量细胞层中的DNA含量而获得的，该增加再次表明没有有效细胞毒性。直接比较电容耦合的信号与除了是电磁耦合之外其余相同的信号，它们均每天被传输30分钟，持续四天，通过DNA测得成骨细胞增加，它们的增加都显著不同于对照物(铌157％，EM耦合164％)，但相互之间没有明显不同。

结论

已经研发出一种用于将电容耦合的PEMF类信号施加给培养物中的细胞/组织的新铌电极桥。铌桥的带通为5Hz到3MHz，因此例如用于骨和伤口修复的临床应用的PEMF类信号可不失真地通过。与标准电解质桥结构不同，铌桥在培养皿中提供了均匀的电流密度。长期的PEMF暴露的应用表明没有电解或生理有效的细胞毒性。

实施例3

使用电容耦合的PEMF信号刺激软骨细胞

引言

目前正在测试类似于用于骨修复的临床应用的PEMF信号对减轻关节炎病人的关节疼痛的能力。所关心的是该疼痛减轻信号是否还可以改善受损软骨的潜在问题。

背景

与药物治疗和生物制剂相比，基于PEMF的治疗方法提供了容易使用的非侵入性治疗，该治疗不包含具有潜在副作用的外来试剂，并且具有零清除时间。PEMF治疗方法的问题包括：识别响应细胞、说明细胞上的物理转导位置、以及确定导致细胞响应的反应的生物机理。本研究的目的在于确定目前正在被测试疼痛减轻的具体PEMF信号(MEDRELIEF，Healthonics，Inc，GA)是否可以体外刺激软骨细胞或者反应的生物机理是否可以被解释。

方法

将正常人体软骨细胞(HCC；CAMBREX

，Walkersville，MD)以单层附着在矩形的细胞室中。PEMF应用通过铌电极桥系统而电容耦合，该系统允许时变电流均匀流过室。本申请所描述的脉冲段B类信号由不对称矩形脉冲的10毫秒脉冲段构成，宽度为200/28，以15Hz重复。每次治疗施加PEMF信号30分钟。用细胞层的DNA含量评价细胞生长。通过使用由INVITROGEN INC.

(Carlsbad，CA)提供的分析试剂盒的Griess反应评价培养介质的一氧化氮(NO)含量。其结果以NO的微摩尔数除以通过细胞层的DNA含量确定的细胞数量来表达。

结果

PEMF信号在持续96小时的期间内每12小时以峰到峰为400微安施加一次给生长在含1％胎牛血清的培养介质中的HCC细胞，该信号导致细胞生长增加153±22％，p＜0.001。所关心的是，在第一次PEMF治疗之后的24小时收集的条件培养基显示NO增加196±14％，p＜0.001，其在96小时时下降到非有效水平。在类似条件下，当将SNP(NO供体——硝普钠)添加到最终浓度为3微克/ml时，也出现在24小时时的NO的增加(174±26％，p＜0.001)和在96小时时的细胞数目的增加(168±22％，p＜0.001)(与未经治疗的对照物相比)。在随后的试验中，血清浓度降低到0.1％，每24小时一次地在40微安下施加PEMF，并且在72小时后进行测量。PEMF治疗将条件培养基中的NO含量增大至154±30％，＜0.01。如图7所示，PEMF治疗增加了细胞数量并且该细胞响应被L-NAME(一氧化氮合酶抑制剂)减弱。

结论

这些结果表明目前正在测试降低由关节炎引起的关节疼痛的PEMF信号也可以对软骨提供益处。数据表明人体软骨细胞可以用增加的细胞生长来响应这种信号。而且，用于PEMF刺激的软骨细胞生长的作用的可能的生物机理是通过释放NO完成的。软骨细胞对NO供体的类似响应支持该理论。尽管不是结论性的，但是数据证实PEMF治疗后增加的细胞生长被NO介导，或者说在PEMF引起细胞生长增加的机理中NO是一个必需的步骤。

实施例4

在原始成骨细胞培养物中的BMP生成的PEMF刺激：取决于信号结构和暴露时间

引言

作为在脊椎融合手术和用于治疗长骨中的顽固性不愈合的辅助手段，PEMF作为非手术性疗法已被证实有效。试点研究已经证明成骨细胞对信号结构和时间会不同地响应。一个重要的不同包括用沉积基质代替细胞增殖的倾向。基于BMP在脊椎融合和非愈合中的被证实的功效以及基于表明BMP-2和BMP-4被PEMF刺激的尝试(Bodamyali，1998)，我们的研究集中在更好地理解以前的细胞响应是否可能与BMP调节相关。

目标

本研究比较了用电容耦合传输的两种PEMF波形结构，将原始骨细胞培养物中的生物化学和形态变化与BMP调节相联系。

方法

将正常人体成骨细胞设定在10cm²的各培养室中。通过利用作为耦合电容的铌导线将几个室串联连接，可以同时将多个信号施加到若干室中。刺激由一连续系列的60/28微秒矩形双极性脉冲(被记为“信号A”)或200/28微秒矩形双极性脉冲(被记为“信号B”)构成，该刺激将1.2mV/cm(在A信号的情况下)或2.4mV/cm(在B信号的情况下)的峰-峰电场均匀地施加给培养物。将培养物暴露30分钟(1)或两小时(2)，每天两次，得到用于比较的组A1、A2、B1和B2。通过ELISA分析法对先前被用于膜蛋白质测定的等分试样分析BMP蛋白质，将先前被用于测定钙和理解形态的基质用于分离RNA，该RNA随后通过使用已知可获得的用于(18s RNA)BMP-2和BMP-7的序列引物的两步逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)来进行分析。刺激增殖的信号和刺激基质沉积的信号都被分析以便于BMP调节和蛋白质表达功能。使用来自7天、14天、21天的时间点上的样本，以确保对分析的相同比较。

结果

该试验的主要的结果有六个方面：1)BMP蛋白质和用于BMP的mRNA响应两种刺激(尤其是“A”信号)而增加；2)每天传送两次的30分钟刺激与两小时治疗相比在21天时提供BMP-2表达增加接近40倍，其大部分的增加是在14天到21之间的期间获得的；3)“A”信号的30分钟刺激提供了BMP-7表达的15倍增加，同样也是在14天到21天之间的分析最为显著；4)在“B”信号的情况中发现BMP-2或BMP-7仅适度增加；5)该研究首次证实BMP-7表达通过PEMF刺激而促进；6)尽管增殖评价是定性的，但BMP沉积的致有丝分裂性质与以前的公开文献一致。评价PEMF短期时间内对变形的细胞系的作用的文献表明BMP-3和BMP-6都没有被刺激(Yajima，1996)。我们没有对我们的模型评价这些生长因子。

结论

由于大部分研究已经表明BMP-2具有形态形成和致有丝分裂的性能，所以细胞响应“A”信号而增殖也就并不奇怪。两种信号结构产生了很不相同的效果，这可以通过SNR分析潜在地进行解释，该SNR分析表明在设定Ca/CaM转导通道的情况下，信号“B”的用量可以大于信号“A”的10倍。尽管由“B”信号提供了过大的基质沉积，但也许更未预料到的是标准化的BMP-2和BMP-7水平。骨形成敏锐地依靠生长因子和表面微细结构的平衡。事实上，平滑表面的存在超越了细胞对BMP-2的响应，并且加重了畸形的矿化作用。如果在响应“B”信号中观察到高度的基质机化和沉积，BMP自身内部和本身的(inand of)转导似乎不足以发生骨形成，并且可以提供单独通过不同的目标机理而发生。

实施例5

个案研究：用PEMF刺激治疗骨质疏松症

一个骨质疏松症病人(女性、年龄50岁、起始的T＝-3.092)使用采用信号B(200/30)的电刺激，一周使用4～5天，每天使用3～5小时。该病人在一年的时间内持续相同的药物治疗、营养补充和活动。在6个月和12个月时进行骨密度扫描，发现骨质量密度增加16％和29％。

Claims (15)

1.一种用于调节骨、软骨或其它结缔组织的发育或修复的系统，包括：

电信号刺激器，该电刺激器被构造成产生具有多个脉冲段的重复模式的D类信号的第一电信号，每个脉冲段包括多个长度δ的较长时段的第一电平的多个独立正脉冲，所述独立正脉冲被长度γ的较短时段的第二电平的多个负脉冲分隔，每个脉冲段持续脉冲段持续时间，并且至少被在第二电平的均衡脉冲彼此分隔，其中所述较长时段、较短时段和脉冲段持续时间选自以下：

较长时段等于13毫秒，较短时段等于200微秒，脉冲段持续时间等于1秒；和

许多电极可电连接到电信号刺激器，以将至少第一电信号偶联到组织。

2.如权利要求1的系统，其中所述电信号刺激器被构造成产生第一电信号，第一电信号包括第三电平的脉冲段之间的另外的持续时间，所述第三电平在第一电平和第二电平之间。

3.如权利要求1系统，其中所述脉冲段以至少1Hz的频率重复。

4.如权利要求1的系统，其中所述电信号刺激器进一步被构造成产生A类信号、B类型号或C类信号的第二电信号，所述第二电信号具有许多脉冲段的重复模式，每个脉冲段包括较长时段的第一电平的多个独立正脉冲，所述独立正脉冲被较短时段的第二电平的多个负脉冲分隔，每个脉冲段持续脉冲段持续时间，并且至少被在第二电平的均衡脉冲彼此分隔，其中所述较长时段、较短时段和脉冲段持续时间选自以下：

A)长度β的较长时段为20微秒-100微秒，长度α的较短时段为5微秒-75微秒，脉冲段持续时间为0.5微秒-500微秒；

B)长度γ的较长时段为100微秒-1000微秒，长度α的较短时段为5微秒-75微秒，脉冲段持续时间为1.0毫秒-50毫秒；和

C)长度γ的较长时段为100微秒-1000微秒，长度β的较短时段为20微秒-100微秒，脉冲段持续时间为1.0毫秒-50毫秒δ。

5.如权利要求4的系统，其中所述电信号刺激器被构造成产生彼此连续的第一和第二电信号。

6.如权利要求4的系统，其中所述电信号刺激器产生彼此同时出现的第一和第二电信号。

7.如权利要求1的系统，其中所述系统还被构造成提供机械装载组合第一信号的发生。

8.如权利要求1的系统，其中所述电极被构造成向组织提供电容偶联。

9.如权利要求1的系统，还包括：

用于保留多个细胞的装置，其中所述细胞选自干细胞、未定向祖细胞、定向祖细胞、多能祖细胞或多向性祖细胞或其它分化阶段的细胞。

10.如权利要求9的系统，其中所述多个电极包括阳极化金属的桥电极。

11.如权利要求10的系统，其中，所述阳极化金属是铌、钽、钛、锆、钼、钨、钒、铝或不锈钢。

12.如权利要求9的系统，进一步包括用于机械装载所述细胞的装置。

13.一种用于制备适合于移植的组织的试剂盒，包括：

细胞；

如权利要求1-4任一项所述的系统；和

可生物降解的或生物稳定的支架。

14.如权利要求13的试剂盒，其中所述支架由选自天然或合成聚合物的材料制成。

15.如权利要求13或14的试剂盒，其中，所述支架与生长促进分子或粘合促进分子相结合。

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