JP2016030217A - 電磁刺激領域による骨と細胞の遺伝的調節とその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】哺乳動物の組織、骨、または任意の組み合わせの遺伝的調節を改変するための装置および方法を提供する。【解決手段】該方法は、それによって調整されたあらかじめ決められた外形で構成される調整された時間とともに変化する刺激領域をもたらし、該外形が複数の調整されたあらかじめ決められた性能指数で構成されるとともに、該性能指数によって制御可能であり、該性能指数が調整されたＢ場の規模、調整された増加するスルーレート、調整された立ち上がり時間、調整された低下するスルーレート、調整された立ち下がり時間、調整された周波数、調整された波長、および調整されたデューティサイクルで構成される、工程と、あらかじめ決められた調整された暴露の間、調整された時間とともに変化する刺激領域に、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせを暴露する工程とから構成される。【選択図】図６

Description

（発明の起源）
本明細書に記載された発明は米国政府の職員によってなされたものであり、発明に係るまたは発明の使用料を支払うことなく、政府の目的のために米国政府によってあるいは米国政府のために製造および使用されることもある。

１．革新の分野
本革新は、生物物理学、バイオエレクトロメカニクス、組織再生、組織培養、および神経生理学の分野に一般に関する。より具体的には、本革新は電磁場、好ましくは、哺乳動物などの生体細胞や生体組織の成長と特異的な遺伝的発現を改変する、強化する、または制御するための時間と共に変化する磁場の使用に関する。より具体的には、本革新は、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせの遺伝的調節を改変するための比較的低周波数電磁場を含む、非侵襲的な方法と装置の使用に関する。

２．背景及び関連技術
軟骨は多くの関節の内部に存在する密性結合組織の一種であり、アクチンとコラーゲンの繊維、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、およびエラスチン繊維で構成された大量の細胞外マトリクスまたは軟骨基質を生成する軟骨細胞と呼ばれる、特殊な細胞からできている。軟骨細胞は軟骨で見られる唯一の細胞である。

他の結合組織とは異なり、軟骨は血管を含んでいないか、あるいは無血管と呼ばれる。したがって、他の結合組織と比較して、軟骨の成長と修復はより緩慢である。

軟骨に影響を与えかねない疾患がいくつかある。軟骨異栄養症は、軟骨の成長とその後の骨形成を妨げることを特徴とする疾患の一群である。変形性関節症（ＯＡ）は軟骨に影響を与える一般的な疾患である。

軟骨の修復能力には限界がある。というのも軟骨細胞は小腔中で結合しており、損傷部位に移動することができないからである。したがって、軟骨は破損すると治すのが難しい。さらに、硝子軟骨には血液が供給されないため、新しい軟骨基質の堆積は遅い。

アセトアミノフェン／パラセタモールは第一次治療として一般に使用され、鎮痛が十分でない場合には、抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）が治療に加えるものとしてのみ推奨される。決定的な解決策を探し出し、関節炎の症状を和らげ、損傷を受けた軟骨の代わりとなる耐久性のあるものを生成する手順を開発する必要がある。

骨は脊椎動物の内骨格の一部を形成する堅い器官である。骨を構成する組織の１つのタイプは石灰化した骨組織（ｏｓｓｅｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ、ｂｏｎｅ ｔｉｓｓｕｅとも呼ばれる）であり、堅さとハチの巣のような三次元の内部構造を与える。

骨を構成している複数の種類の細胞がある。例えば、骨芽細胞は骨原性細胞に由来する単核の骨形成細胞である。これは類骨の継ぎ目（ｏｓｔｅｏｉｄ ｓｅａｍｓ）の表面にあり、石灰化して骨になる類骨として知られているタンパク質混合物を作る。類骨は主としてＩ型コラーゲンからできている。

骨粗鬆症として一般に知られている疾患では、骨は脱塩され、異常なまでに希薄になる。骨密度の低下は、椎骨の崩壊、殿部、前腕、手首、足首の骨折、および、身体の自由を奪う痛みにつながることもある。

最新の治療は、非侵襲的な手段である記載された本革新とは対立する侵襲的な手段（例えば外科手術または薬の投与）を含む。こうした疾患向けの代替的な非外科的治療は、電気治療と磁場治療で構成された電気的な骨成長刺激を含んでいる。しかしながら、こうした治療は、皮膚接触あるいは組織へのプローブ／電極の挿入のいずれかに依存しているため、比較的侵襲性である。

髄核は、圧縮荷重下でそれずれの椎間板の内部であらゆる方向に水圧を分散させるように機能する椎間板の中央のゼリーのような物質である。髄核は、椎間板軟骨細胞（関節の軟骨細胞に対立するものとして）、コラーゲン細線維、および水を引きつけるヒアルロン長鎖を有するプロテオグリカンアグリカンを含む。個々のヒアルロン鎖には硫酸コンドロイチン硫酸と硫酸ケラタンの側鎖が付けられている。

（電場と磁場）
電場は電荷を帯びた粒子を囲む空間を記述する特性である。電場は電位または電圧の差によって作られる：つまり、電圧が高ければ高いほど、結果として生じる電場は強い。対照的に、電磁的に生成される磁場は電流が流れる際に作られる：つまり、電流が大きければ大きいほど、磁場は強い。電流が流れていないときでさえ磁場は存在する。対照的に、流れがないときには、電磁的に生成される磁場は存在しない。電流が流れている場合、電磁的に生成される磁場の強さは電力消費量に応じて変動するが、電場の強さは一定になる。結果として生じた力は電場と磁場の両方に関する。電場に関連する力は固定された電荷または静電荷に依存する。反対に、磁場（つまりローレンツ力）に関連付けられる荷電粒子に働きかけられた力は、移動する電荷に依存する。さらに、電場と磁場は完全には相互に排他的ではない。例えば、荷電粒子は電場を生成するだけではない。電荷は移動すると磁場を生成し、磁場が変化すると前記磁場の変化は電場を生成する。したがって、ＣＡ２＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、およびＭｇ２＋などの弱い金属（イオン）はすべて変調または共鳴の効果に従い、磁束によって亜細胞的に（ｓｕｂ−ｓｅｌｌｕｌａｒｌｙ）移動するように作られ得る。別の言い方をすれば、変動する磁場は電場を生じさせる。実際には、稲妻は付随する磁場を作る大気の放電の一例である。

（電気刺激治療）
電気刺激治療は以下を含む：容量結合（ＣＣ）；および、直流（ＤＣ）または直接結合。電気刺激治療の形態のそもそもの根拠は、骨への物理的な圧力によりわずかな電流が生じ（つまり、圧電性の結果）たという観察であり、これが機械的歪みとともに、骨形成を促す電気信号への物理的な圧力（圧縮と引張）の導入の基礎となる機構であると考えられていた。容量結合は、関心領域に電気刺激を適用するために関心領域の対向する端部で患者の皮膚に置かれた２つの容量性プレートまたは電極によって一般に生成される電場に依存する。直流に基づく治療は、関心組織を囲む皮膚表面と直接接触し対向する電極の配置を必要とし、一般に電極の埋め込みを含む。関心領域は一定の直流によって刺激される。

（磁場治療）
磁場治療は以下を含む：パルス電磁場（ＰＥＭＦ）治療を含む時間とともに変化する磁場（ＴＶＭＦ）治療。細胞の成長を刺激する時間とともに変化する磁場の一般的な使用は、関連技術で開示されている。骨や軟骨のようなヒト組織中の圧電特性が骨と軟骨の形成を規制するための基礎を形成すると理論づけられている。とりわけ、磁場が磁性粒子に力を加え、電荷を帯びた粒子を移動させるため、磁場力はヒト組織の中の物理的ストレスをシミュレートし、それによって、組織の高導電性の細胞外液中で小さな誘導電流（ファラデー流れ）を生じさせる。一般に、時間とともに変化する磁場治療は、磁場を電気的に生成するためのコイルの使用を含んでいる。ＰＥＭＦは時間とともに変化する磁場治療のサブセットとみなされており、その波形のパルスまたはバーストに一般に関連付けられる。ＰＥＭＦ治療で使用される結果として生じる波形は、実質的に単相、実質的に二相、実質的に正方形、シヌソイド、または実質的に三角形であり得る。さらに、ＰＥＭＦ治療は、６−５００Ｈｚなどの電磁スペクトルの下方端部上の周波数で一般に構成される。さらに、ＰＥＭＦ治療で使用される波形は一般におよそテスラ／秒の非常に高いおよび低いスルーレートを有しており、それによって、前記パルスまたはバーストを促す。

特許文献１では、哺乳動物における組織修復を増強するための装置が開示されている。開示された装置は以下を含む：哺乳動物の身体部分の一部を囲むスリーブであって、電流が流されると磁場を生成することができる導電性のコイルを含むスリーブ、哺乳動物の身体部分上のスリーブを支持するための手段；および、導電性のコイルの内部で約０．０５Ｇ〜０．５Ｇの時間とともに変化する磁力を生み出すのに十分な方形波の時間とともに変化する電流を導電性のコイルに供給するための手段であって、それによって、スリーブが哺乳動物の身体部分上に置かれ、約０．０５Ｇ〜０．５Ｇの時間とともに変化する磁力が長時間、哺乳動物の身体部分で発生する際に、哺乳動物の身体部分内での組織再生が、時間とともに変化する磁力を適用しない際に生じるであろう通常の組織再生速度を上回る速度にまで上昇する、手段。時間とともに変化する磁力のアプリケーションなしで生じる。導電性のコイルは、好ましくは、１インチ当たりおよそ１０本の巻線を含む、ワイヤーなどの強磁性材料である。スリーブは哺乳動物の身体部分、例えば、腕または脚に置くことができ、身体部分は組織修復、骨折修復の治癒速度の増加または潰瘍化した皮膚の治癒速度の増加などの組織の修復を増強するために長時間０．０５Ｇ〜０．５Ｇの時間とともに変化する磁力に晒される。治療を受ける哺乳動物には時間とともに変化する磁力を加えている間に濃度を増加させたカルシウムイオン（Ｃａ＋あるいはＣａ＋＋）を与えることが望ましい。

（同化および異化遺伝子の発現）
ここ数十年間で、サイトカインまたはパラクリン、およびゲノムのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの製品である自己分泌因子を含む、少なくともいくつかの効果を含む多くのホルモンが発見されている。さらに、特異的な遺伝子といくつかの分子は、一日の動物の活動の正常な時間と一致するように変動するグルコース代謝などのプロセスとともに、互いに連携して、または組織のリモデリングの最終目標を容易にする遺伝子カスケード（シャペロン）において作用する（非特許文献１）。

同様に、ビタミンなどの既知の生体分子は、正常な軟骨と骨の維持のプロセスを永続させるのに役立つ。ビタミンＤ（特にＤ３）とビタミンＫは、正常な哺乳動物（特にヒト）の生理機能に関してある程度知られている（非特許文献２）（非特許文献３）。発明者らは、重要な遺伝子発現の刺激を促進することにより（とりわけ、応答カスケードの一部として予想されなかったオステオカルシンのアップレギュレーション）、任意の輪郭がはっきりと示された形態またはマトリックス中の患部（ＲＯＩ）の処置の間にこれらの２つの濃度を増加させたビタミンを追加することで、新しい骨の形成が強化および加速され、石灰化は骨を生成するものの軟骨を生成しないことから、被験体の組織中の軟骨からの骨の発現は区別される。

同化は、より小さな単位から分子を構築する、代謝経路あるいはゲノムとタンパク質の反応のセットである （非特許文献４）。こうした反応は、細胞の場合では、細胞中のエネルギーの「塊（ｐａｃｋｅｔ）」の分解時に他のゲノムの反応に由来するエネルギーシステムを必要とする。細胞、器官、または有機体のどのレベルであっても、代謝プロセスを分類する１つの方法は、同化作用として、または同化の反対である異化としてのものである。

異化作用は、分子をより小さな単位に分解して、エネルギーを放出する一連の経路である （非特許文献４）。異化作用では、核酸、タンパク質、多糖類、および脂質などの大きな分子は、それぞれアミノ酸、ヌクレオチド、単糖類、および脂肪酸などのより小さな単位に分解される。本明細書に記載の目的のために、「異化作用」は修復機能、とりわけ、有機的な観点から組織の分解、再編成、または変性に関連付けられる。

現在、こうした生物物理学的および電気的な刺激を使用することが十分には活用されていない。しかしながら、分子・細胞のレベルでの基礎をなす機構が理解されるようになるにつれ、こうした医療技術を駆使する医療機器の使用が広範に実施されるようになる。現在、関連技術は、生体細胞および関連する組織の刺激された成長に関して、電磁場波形に関連付けられる周波数とＢ場（Ｂ−Ｆｉｅｌｄ）の規模に主として依存している。実際、関連技術の公報は、Ｂ場の規模が生体細胞や組織成長に影響を与えるための主たる制御変数であることを示している。ある時点で、Ｂ場の規模の効果は、細胞レベルで与えられる物理的な力と比較すると、むしろ熱効果となる。例えば、３０ｋＨｚ以上のいかなる磁場も無線周波数範囲に分類され、細胞下レベルでの熱的加熱効果をもたらすことが知られている。関連技術には、特異的な遺伝子をアップレギュレートするおよびダウンレギュレートするために必要となる特異的な刺激領域外形の発見が欠けている（前記外形は周波数とＢ場の規模だけでなく、波形の形状、立ち上がり時間、増加するスルーレート、立ち下がり時間、低下するスルーレート、デューティサイクル、休止時間（ｄｗｅｌｌ ｔｉｍｅ）、暴露時間、および他の可能な要因から構成される）。特異的な遺伝子の刺激に関連する特定の外形の発見の治療的関連性が本明細書で説明される。したがって、あらかじめ決められた外形の特定の刺激領域によって特異的な遺伝子の刺激を促す装置と使用方法を提供することが望ましい。

米国特許７，１７９，２１７号

Ｒａｍｓｅｙ ｅｔ ａｌ，２００７ Ａｔｋｉｎｓ、２００９ Ｋｏｓｈｉｈａｒａ、１９９７ ｄｅ Ｂｏｌｓｔｅｒ， １９９７

本発明は、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせの遺伝的調節を改変するシステムと方法に関する。「関連する組織」を含むものに関して多くの実施形態がある。例えば、関連する組織は、軟骨組織、骨組織、結合組織、海綿骨組織、腱と筋肉、あるいは任意の組み合わせなどを含むこともある。具体的には、改変する行為は、特定の順序でまたは連続して、哺乳動物の生理機能における前述の細胞型の優先的な刺激によって哺乳動物系の易感染性の軟骨、骨、および関連する組織の保持、修復、および減少を促すことからなることもある。刺激領域発生器（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｉｅｌｄ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）を用いて、あらかじめ決められた調整された暴露時間または複数の調整された暴露時間系列の間、あらかじめ決められた性能特性または性能指数（Ｆｉｇｕｒｅｓ ｏｆ Ｍｅｒｉｔ）（ＦＯＭ）の調整された時間とともに変化する刺激領域外形を対象組織に送達してもよく、ここで前記ＦＯＭはＢ場の規模、周波数、波長、増加するスルーレート、低下するスルーレート、立ち上がり時間、立ち下がり時間、およびデューティサイクルを含むこともある。装置は、以下を含むいくつかの構成要素を備えることもある：１）動力源、２）制御構成要素、および３）送信構成要素。動力源は、装置の制御構成要素によって制御および管理されるあらかじめ決められた外形の電磁的に発生した時間とともに変化する刺激領域を生成するのに必要な電気を供給し、前記時間とともに変化する刺激領域は送信構成要素によって標的組織または関心領域（ＲＯＩ）へと誘導される。送信構成要素は、標準的な送信アンテナ、電磁コイル、多重コイルからなる複合アレイ（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ａｒｒａｙ）、適切な磁場密度でＲＯＩに正確な磁場を送達するアンテナ、または任意の組み合わせの実施形態をとることもある。一実施形態では、装置は、軟骨、骨、または両方の再生、回復、修復、維持、または任意の組み合わせの原因である既知の哺乳動物の遺伝子の活性化を引き起こす生化学的な細胞および細胞以下の分子の反応を優先的に刺激する（アップレギュレートする、ダウンレギュレートする、あるいは両方の組み合わせ）ために、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形を含む時間とともに変化する刺激領域を送達する。

本発明は、時間とともに変化する磁場、とりわけ、軟骨、骨、および軟組織の治療のために処置部位で少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形からなる調整されたあらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域を生成することができる調整された電気信号を利用する装置で生成された時間とともに変化する磁場の適用に基づいた生物医学的な治療用途のための装置を提供することを目的としている。

本発明はさらに、変形性関節症、骨折、骨粗鬆症などの処置のために、軟骨、骨、関連する組織、または任意の組み合わせに浸透させるために設計された少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形の調整されたあらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域を作るワイヤーコイルを使用して、多機能のモジュール装置を提供することも目的とする。

本発明はさらに、前述の哺乳動物の細胞の遺伝的調節を改変するべく、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形の調整された時間とともに変化する刺激領域を生成して放出するために、周波数、振幅、立ち上がり時間、増加するスルーレート、立ち下がり時間、低下するスルーレート、デューティサイクル、休止サイクル、またはその組み合わせに基づいて、少なくとも１つの調整された電気信号を刺激領域発生器装置に提供することも目的とする。

本発明はさらに、身体の負荷軽減効果（ｂｏｄｙ ｕｎｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ）に向けた対抗策として筋萎縮を縮小させるためにあらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域を利用する時間とともに変化する磁場の神経筋の刺激を提供することも目的としている。こうした効果には寝たきりになって病院で、あるいは人間の宇宙飛行といった別の種類の環境的な難題において直面するかもしれない。

一実施形態では、装置は、約１２５μｓ乃至約１ｍｓまでの立ち上がり時間で；約２．０ｋＧ／ｓ乃至約５０．０ｋＧ／ｓの増加するスルーレートで；約１２５μｓ乃至１ｍｓまでの立ち下がり時間で；約２．０ｋＧ／ｓ乃至約５００．０ｋＧ／ｓの低下するスルーレートで；または任意の組み合わせで、約９Ｈｚ乃至約２００Ｈｚまでの実質的な方形波を放射して目標領域または組織に送達することもある。さらに、装置は約６５％乃至約８０％のデューティサイクル（および、それぞれ約３５％乃至約２０％のその後の休止時間）で作動することもある。またさらに、装置は、連続的なやり方で、または決められた時間スケジュールに基づいて、約１時間乃至約１２００時間のあらかじめ決められた調整された暴露時間にわたって作動することもある。こうしたＦＯＭからの偏差は、哺乳動物の細胞、イオン輸送、したがって遺伝子とタンパク質の発現に関して、他と異なる反応を引き出すこともある。

一実施形態では、本革新は、損傷を受けた軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、またはその任意の組み合わせを含む関心領域に非常に近いあらかじめ決められた空間関係に装置を位置決めする工程であって、前記装置が時間とともに変化する刺激領域を生成することができる、工程、Ｂ場の規模が約０．６Ｇ乃至約５０Ｇであり、周波数が約９Ｈｚ乃至約２００Ｈｚであり、立ち上がり時間が約０．７５ｍｓ乃至約１ｍｓであり、増加するスルーレートが約２．０ｋＧ／ｓ乃至約２０．０ｋＧ／ｓであり、立ち下がり時間が約１２５μｓ乃至約３００μｓであり、低下するスルーレートが約５．０ｋＧ／ｓ乃至約５０．０ｋＧ／ｓであり、および、デューティサイクルが約６５％乃至約８０％であるなかで実質的に正方形の波形の形態をしたあらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域を生成する工程であって、前記刺激領域が軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、または任意の組み合わせの成長を促す、工程、を含む方法である。

一実施形態では、本革新は、動力源、制御構成要素、および送信構成要素を含む装置を提供する工程；前記装置に非常に近い空間関係において、損傷を受けた軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、または任意の組み合わせを含む関心領域を位置決めする工程；周波数が約９Ｈｚ乃至約２００Ｈｚであり、立ち上がり時間が約０．７５ｍｓ乃至約１ｍｓであり、増加するスルーレートが約２．０ｋＧ／ｓ乃至約２０．０ｋＧ／ｓであり、立ち下がり時間が約１２５μｓ乃至約３００μｓであり、および低下するスルーレートが約５．０ｋＧ／ｓ乃至約５０．０ｋＧ／ｓであるなかで実質的に正方形の波形からなる時間とともに変化する刺激領域を生成するように前記装置を操作する工程であって、前記正方形の波形のデューティサイクルは約６５％から約８０％であり、前記装置の動作が時間とともに変化する刺激領域を生成し、刺激領域は軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、または任意の組み合わせの成長を促す、工程、を含む方法である。図６を参照すると、別の実施形態では、動力源、制御構成要素、送信構成要素、または任意の組み合わせは、スリーブ（２０）に組み込まれる（例えば、特許文献１に記載される。ここでは、動力源、制御構成要素、および送信構成要素は互いに動作可能に接続されている）。スリーブは、身体部分または哺乳動物の生理機能の付属器官などＲＯＩ（２１）を包むことができ、前記ＲＯＩに磁場（３４）を送達することができる。

一実施形態では、あらかじめ決められた外形のパルス刺激領域は、様々な治療用途を実現するために他と異なるマトリックス信号伝達を決定するためのあらかじめ決められた外形の時間とともに変化する刺激領域と組み合わせて（連続的にまたは平行して）使用されてもよい。別の実施形態では、制御構成要素制御は、１つ以上の領域のあらかじめ決められた特性を制御する。別の実施形態では、制御構成要素は導体、増幅器、または両方で構成される。

一実施形態では、刺激領域は、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせのためのＣＡ２＋イオン輸送の変調を実行することができるあらかじめ決められた外形の磁場で構成される。別の実施形態では、刺激領域は、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせの遺伝的調節を改変することができるあらかじめ決められた外形の磁場で構成される。さらに別の実施形態では、刺激領域は、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、および髄核の成長、保持、再生、および修復に関連付けられるとともに、これらに必要でかつこれらの原因である特定の生体分子を生成または抑制することができる。

一実施形態では、あらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域は、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせの成長速度を通常の生理的な成長速度よりも著しく増加させるために、こうした細胞や組織の遺伝的調節を改変することができる。別の実施形態では、あらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域は、限定されないが：ＢＭＰ、アクチン、トロンボスポンジン、ラミニン（ｌａｍａｎｉｎｓ）、プロテオグリカン、コラーゲン、腫瘍壊死因子、形質転換増殖因子、および細胞骨格のファミリーを含む活性化遺伝子ファミリーに関連付けられる細胞の成長、保持、回復、および修復を増強するために制御され得る。

本明細書で用いられるように、「刺激領域」は電磁的に生成された磁場を指し、磁場はＢ場で構成され、このとき、１つの電荷ｑを有し、速度（ｖ）で前記Ｂ場を移動する粒子は物理的な力を受ける。さらに、本明細書で使用されるように、「関心領域」とは刺激領域にさらされるように標的とされた領域として定義される。関心領域は例えば；生体物質を含む回転壁式容器（ａ ｒｏｔａｔｉｎｇ ｗａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ ）あるいは患者の身体上のあらかじめ決められた領域であり得る。またさらに、本明細書で使用されるように、「外形」とは波形を指す。加えて、「性能指数」とは測定可能な性能特性または性能値を指す。またさらに、「同化」とは有機的な観点からの組織の構築または組織の再生を指す。「異化」とは修復機能、とりわけ、有機的な観点からの組織の分解、再編成、または変性を指す。本明細書で使用されるようなＨＣＨはヒトの軟骨細胞を指す。本明細書で使用されるようなＨＯＢはヒトの骨芽細胞を指す。本明細書で使用されるように、ＮＤＲは差異の調節が１つもないこと、または０の差異の調節を指す。本明細書で使用されるように、ＮＲＥは調節された効果がないことを指す。請求項において本出願で使用されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語と共に使用されるとき、単語「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味する。

上に列挙された本発明の特徴、利点、および目的が、以降明らかになる他のものと同様に達成され、詳細に理解され得ることから、先に簡潔に要約された本発明のさらに特定される記載が、添付の図面で例証される特定の実施形態を参照することによって含まれることもある。これらの図は明細書の一部を形成する。添付の図面は本発明の好ましい実施形態を例証し、したがって、そうした範囲に限定されるものとみなされてならない。

実質的に二相の正方形の波形の典型的な刺激領域外形を描く。 実質的に単相のデルタ波形の典型的な刺激領域外形を描く。 典型的な刺激領域発生器装置を例証する。 典型的な回転壁式容器を例証する。 典型的な刺激領域発生器装置に統合された典型的な回転壁式容器を例証する。 スリーブの形態の典型的な刺激領域発生器装置を例証しており、前記刺激領域発生器装置は哺乳動物の生理機能の関心領域にあらかじめ決められた外形の磁場を送達する。 哺乳動物の組織、骨、または任意の組み合わせの遺伝的調節を改変する方法のフローチャートを描いており、該方法は、少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域に、前記哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせを晒す工程を含む。 少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域に、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせを晒す工程に関連付けられる下位工程のフローチャートを描く。 少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域に関して、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形を調整する工程に関連した下位工程のフローチャートを描く。 少なくとも１つの遺伝子発現解析の結果から遺伝子の同化および異化の効果を分析する工程に関連した下位工程のフローチャートを描く。 分析工程から少なくとも１つの結論を生成する工程に関連した下位工程のフローチャートを描く。

本革新は、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせの遺伝的調節を改変するために少なくとも１つのあらかじめ決められた外形の刺激領域を利用する。一実施形態では、少なくとも１つのあらかじめ決められた外形は、経験的な技術に従って調整される。装置と方法の様々な実施形態は、変形性関節症と骨粗鬆症の疾患に適用可能であるがこれらに限定されず、同様に、生理機能の骨格組織および柔軟な組織または結合組織の損傷した構造を処置および解決するために使用されるように適用可能であるが、これに限定されない。本明細書で記載された革新は、上に概説された所望の結果に影響を与えるために完全に非侵襲性の方法とプロトコルを使用する。本革新は、変形性関節症、骨粗鬆症、骨減少症、および他の軟骨／骨の疾患、欠損、および損傷を含むヒトの病変組織に、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形の調整されたまたは調整可能な刺激領域を暴露することを介して、ヒトの病変組織を処置する方法に関する。

一実施形態では、方法は、少なくとも１つのあらかじめ決められた時間にわたって、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形の調整されたあらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域を調整するまたは選択することに関連した工程を含み、異なる外形は異なる時間に採用されてもよい。ワイヤーを通って流れる電流が磁場を生成することは周知である。結果として生じる磁場は電荷（つまり電流）の移動によって生成される。しかしながら、電気信号の特性またはＦＯＭを調整する、あるいは細胞と亜細胞の観察に基づいた組織の再成長を最適化するべく調整されたあらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域を生成するための具体的な方法は、関連技術では周知ではない。本明細書に記載された革新は、上記の問題の少なくともいくつかを解決しようとするものである。

一実施形態では、革新は、例えば、損傷した軟骨がある関節のようなＲＯＩが包むことができる装置で構成される。装置は、あらかじめ決められた周波数、波長、規模、立ち上がり時間、増加するスルーレート、立ち下がり時間、低下するスルーレート、デューティサイクル、または組織の改変をもたらす任意の組み合わせで少なくとも１つの刺激領域を生成することもある。例えば、本実施形態は、軟骨細胞、骨細胞、または両方を再生成かつ再成長させるために、影響を受けた領域にＴＶＭＦを非侵襲的に適用することによって侵襲的な外科技術に関連する諸問題に取り組む。

一実施形態の一例として、発明者らは、あらかじめ決められた周波数の電気的に生成された刺激領域の再生可能な送信の成功が５つの要因で構成されることを確認した：（１）あらかじめ決められたＦＯＭを含む刺激領域の外形または波形；（２）周囲の環境を克服する十分な場束；（３）送信構成要素（アンテナ）の設計；（４）スルーレートと立ち上がりおよび立ち下がり時間の変化；ならびに、（５）刺激領域へのＲＯＩの暴露時間。本明細書に記載された革新は、生物学的作用に刺激領域の暴露を関連付ける基本的な基礎をなす機構を解明することを目的とした細胞レベルでの実験室での研究に起因する。具体的には、発明者らの研究の成果は、あらかじめ決められた外形の刺激領域によってもたらされる分子の変化または細胞の変化に基づいて機構を特定し、それによって、物理的な力がいかにして哺乳動物の生理機能内部の生物作用に転換または変換されるかに関する手掛かりを与えるものである。

一実施形態では、例えば図７をとりわけ参照すると、本革新は、哺乳動物の組織、骨、または任意の組み合わせの遺伝的調節を改変する方法を含み、該方法は：あらかじめ決められた調整された暴露時間、または複数の調整された暴露時間系列にわたって、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形で構成される少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域に、前記哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせを暴露する工程（１１）であって、前記少なくとも１つのあらかじめ決められた外形が、複数の調整されたあらかじめ決められた性能指数で構成されるとともに、前記複数の調整されたあらかじめ決められた性能指数の少なくとも１つによって制御可能であり、前記複数のあらかじめ決められた調整された性能指数が、調整されたＢ場の規模、調整された増加するスルーレート、調整された立ち上がり時間、調整された低下するスルーレート、調整された立ち下がり時間、調整された周波数、調整された波長、および調整されたデューティサイクルで構成される、工程；前記調整されたＢ場の規模、前記調整された暴露時間、または前記複数の調整された暴露時間系列、および以下の前記調整されたあらかじめ決められた性能指数：前記調整された増加するスルーレート、前記調整された立ち上がり時間、前記調整された低下するスルーレート、前記調整された立ち下がり時間、前記調整された周波数、前記調整された波長、または前記調整されたデューティサイクル、の少なくとも１つを操作することによって、前記少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形を生成するために前記少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域を制御する工程（１２）、を含む。方法はさらに、少なくとも１つの時間とともに変化する刺激領域に関連した前記少なくとも１つのあらかじめ決められた外形を調整する工程（５０）であって、それによって少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形で構成される少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域をもたらす、工程で構成されることもあり、前記少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形は、複数の調整されたあらかじめ決められた性能指数で構成されるとともに、前記複数の調整されたあらかじめ決められた性能指数の少なくとも１つによって制御可能であり、前記複数のあらかじめ決められた調整された性能指数は、調整されたＢ場の規模、調整された増加するスルーレート、調整された立ち上がり時間、調整された低下するスルーレート、調整された立ち下がり時間、調整された周波数、調整された波長、および調整されたデューティサイクルで構成される。

一実施形態において、例えば図８を参照すると、少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域に、前記哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせを暴露する工程（１１）は、前記哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核、関連する組織、または任意の組み合わせに良く似た空間的関係に刺激領域発生器装置を提供する工程（１８）；および、前記刺激領域発生器装置を使用して、前記調整された時間とともに変化する刺激領域を生成する工程（１９）で構成されることもある。一実施形態において、例えば図９を参照すると、調整の工程は、少なくとも１つの回転壁式容器中に少なくとも１セットの細胞のサンプルを提供する工程（５１）；少なくとも１つの実験のあらかじめ決められた外形を含む少なくとも１つの実験的な時間とともに変化する刺激領域に、前記少なくとも１セットの細胞のサンプルを暴露する工程（５２）；前記少なくとも１セットの細胞のサンプルに対して少なくとも１回の遺伝子発現解析を行う工程（５３）；前記少なくとも１回の遺伝子発現解析の結果から遺伝子の同化および異化の効果を分析する工程（５４）；分析する前記工程から少なくとも１つの結論を得る工程（５５）；前記少なくとも１つの結論に基づいて、前記少なくとも１つの実験的なあらかじめ決められた外形を調節する工程（５６）；および、あらかじめ決められた調整された暴露時間、または複数の調整された暴露時間系列にわたって、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形で構成された少なくとも１つの調整された時間とともに変化する刺激領域を選択する工程（５７）、で構成されることもある。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子発現を行う工程（５３）は、前記少なくとも１セットの細胞のサンプルを暴露する前記工程（５２）の後に生じることもある。一実施形態では、少なくとも１つの実験的なあらかじめ決められた外形を調節する工程（５６）は、少なくとも１つの結論があらかじめ決められた基準を満たしていない場合に生じることもある。細胞のサンプルの少なくとも１つのセットは、関連する組織に加えて、ヒトの軟骨細胞とヒトの骨芽細胞からなる群から選ばれることもある。

一実施形態において、例えば図１０を参照すると、遺伝子の同化および異化の効果を分析する工程（５４）は、遺伝子または遺伝子ファミリーのあらかじめ決められたセットを選択する工程（５８）；前記少なくとも１つの遺伝子発現の結果から遺伝子の前記セット中の各遺伝子の倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を計算する工程（５９）；前記倍率変化が前記各遺伝子に関してアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションと一致しているかどうかを判断する工程（６０）；および、前記各遺伝子に関する前記アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに基づいて、前記倍率変化のそれぞれを同化または異化の効果として分類する工程（６１）、で構成されてもよい。

一実施形態において、例えば図１１を参照すると、少なくとも１つの結論を生成する前記工程（５５）は、前記各遺伝子に関する前記アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに対する前記同化または異化の効果のそれぞれに関して相対的価値を確立する工程（６２）；前記相対的価値のそれぞれを組み合わせて比較する工程（６３）；絶対的な正味の同化の効果、絶対的な正味の異化の効果、正味の同化の効果、正味の異化の効果、または非限定的な効果のいずれかで構成される結論を選択する工程（６４）、で構成されることもある。

一実施形態では、約１０Ｈｚ乃至約２００Ｈｚまでの周波数を備えた実質的に方形波の信号は、哺乳動物の軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、髄核（および関連する組織）の亜細胞の分子の構成要素に影響を与え、そうすることでこれらを改変し、それによってこうした細胞のゲノムおよびプロテオミクスの出力または発現に影響を与えることを目的として、送信構成要素によってＲＯＩに誘導され得る。発現デルタは、対照（未処置細胞）と比較して、細胞の亜細胞レベルおよび核のレベルでの信号伝達の差の直接的な原因である。発明者らは、あらかじめ決められた外形の刺激領域を生成するために用いられる特定の範囲の電気信号の特性を含む、電気信号のＦＯＭの操作によってあらかじめ決められた外形を備えた刺激領域の様々な実施形態が、軟骨と骨の細胞の改変をもたらすことを実験室での検査を通じて確認した。例えば、特別なＢ場の規模、周波数、立ち上がり時間、立ち下がり時間、スルーレート、あらかじめ決められた暴露時間または複数の暴露時間系列（つまり暴露時間スケジュール）の波長で構成されたあらかじめ決められた外形の時間とともに変化する刺激領域を用いて、先に列挙された所望のイベントをもたらす被験体の細胞内の特定の亜細胞の細胞小器官を優先的に刺激してもよい。結果として生じる外形は実質的に正方形の波形であってもよい。

実験室での検査は、あらかじめ決められた外形の時間とともに変化する刺激領域とあらかじめ決められた外形のＰＥＭＦに別々のＲＯＩを暴露することで構成され、ＲＯＩは回転壁式容器（ＲＷＶ）で構成された。ＲＷＶは送信構成要素に挿入された（図５を参照）。ＲＷＶは、あらかじめ決められた容積のマイクロキャリアと、ヒトの軟骨細胞またはヒトの骨芽細胞：および細胞成長媒体で構成されたあらかじめ決められた細胞容量を含んでいた。２Ｄと３Ｄの培養技術の両方が使用された。その後、細胞成長を観察し、分析が行われた。

（刺激領域発生器装置）
とりわけ図３を参照すると、上に言及された刺激領域発生器装置（３０）に関して、装置（３０）はあらかじめ決められた外形（１０）の刺激領域を電気的に生成するために提供される。装置（３０）は、１）動力源（３１）、２）制御構成要素（３２）、および３）送信構成要素（３３）を含むいくつかの構成要素を含むこともある。装置（３０）は、軟骨と骨の回復、修復、維持、または任意の組み合わせの原因である既知の哺乳動物の遺伝子の活性化を引き起こすべく、生化学的な細胞および亜細胞の分子反応を優先的に刺激するためのあらかじめ決められた外形（１０）の刺激領域をその後送達するために、あらかじめ決められた外形の電気信号によって有効に調整される。

図３をさらに参照すると、動力源（３１）は制御構成要素（３２）に電流を供給し、供給された電気は送信構成要素（３３）を通って流れ、それによって磁場（３４）を放射する。動力源の多くの実施形態が存在する。例えば、動力源（３１）は、バッテリー；電力の１つの形態を別の所望形態と電圧に変換する電力変換装置（例えば、公益事業会社によって供給される１２０あるいは２４０ボルトのＡＣを電子装置用のよく整備された低電圧ＤＣに変換する装置；低電圧、低電力の直流電源装置は、コンピューターや家庭用のエレクトロニクスなどそれらが供給する装置に一般に一体化される）；切り替え式の電源；線形の制御因子（整流器）；高容量の静電容量動力源；電気取出口動力源；または、任意の組み合わせを含むこともある。

図３を続けて参照すると、装置（３０）の制御構成要素（３２）を用いて所望の電気信号を生成し、それによって、動力源（３１）と送信構成要素（３３）と組み合わせて、あらかじめ決められた外形（１０）の刺激領域を生成する。結果として生じる刺激領域は、以下に議論される送信構成要素（３３）によって、標的組織またはＲＯＩ（２１）にさらに誘導される。制御構成要素（３２）の多くの実施形態が存在する。例えば、制御構成要素（３２）は、関数発生器、任意の波形発生器、デジタルパターン発生器、パルス発生器、または周波数発生器として知られているような電圧またはアンペア数で駆動される信号発生装置；一体型のファームウェアとソフトウェアを備えたコンピューター化されたドングル回路；伝導体；増幅器；センサー；マイクロプロセッサー；または任意の組み合わせを含むこともある。

図３を続けて参照すると、送信構成要素（３３）は、適切な磁場密度中の標的領域にあらかじめ決められた外形の刺激領域を送達する。送信構成要素（３３）の多くの実施形態が利用可能である。例えば、一実施形態では、送信構成要素（３３）はワイヤーを含み、このとき、ワイヤーは、芯のまわりにコイルへ巻きつけられ、ワイヤーの巻き付けは実質的に並んでいる。電流がワイヤーを通過する際、電気的に生成された磁場または電磁場はコイルの中心を通り抜ける。交流電流を用いて、方向が交互に代わる電磁場外形を生成してもよい。コイルの形状と設計に関して多くの実施形態が存在する。例えば、コイルは、直線のチューブ形状；ソレノイドのような螺旋（栓抜きに似ている）；ドーナツ形状に曲げられたソレノイド（つまり環状面）；または、任意の組み合わせを形成することもある。送信構成要素はさらにあらかじめ決められた形状とサイズの容器を含んでもよく、ワイヤーは容器に放射状に配置され、それによってコイルを形成する。またさらに、一実施形態では、送信構成要素はさらに哺乳動物の生理機能に関連する付属器官を包み込むことができるスリーブ（２０）を含んでもよく、ＲＯＩ（２１）は前記哺乳動物の生理機能に関連している。

（結果として生じる時間とともに変化するＢ場）
一実施形態では、刺激領域発生器装置（３０）は、軟骨と骨の回復、修復、改変、および維持の原因である既知の哺乳動物の遺伝子の活性化を引き起こすべく、生化学的な細胞や亜細胞の分子反応を優先的に刺激するためのあらかじめ決められた外形（１０）の刺激領域を送達するために調整される。所望の外形の生成は、刺激領域発生器装置（３０）内に転送される電気を制御することにより達成される。議論されるように、電気または電気の流れは制御構成要素（３２）によって制御される。制御構成要素（３２）は電気信号の観点から電気を管理する。電気信号は電圧、電流、または両方を代表するものであってもよく、時間ベースの情報を伝える。さらに、一実施形態では、電気信号の追加の管理が総エネルギーを正規化するために；結果として生じる外形または波形を選択的に調整するために；外形のデューティサイクル、増加するスルーレート、低下するスルーレートなどを正規化するために；または、任意の組み合わせのために行われることもある。

特に図１を参照すると、一実施形態では、あらかじめ決められた外形（１０）の結果として生じる刺激領域は、実質的に二相の正方形の波形で構成される。一実施形態において、約９Ｈｚから約２００Ｈｚまでの範囲の周波数を含む実質的に二相の正方形の波形が使用されることもある。さらに、以下のＦＯＭ：約０．６Ｇ乃至約２００ＧのＢ場の規模；約１２５μｓ乃至約１ｍｓの立ち上がり時間；約２．０ｋＧ／ｓ乃至約５０．０ｋＧ／ｓの増加するスルーレート、；約１２５μｓ乃至約１ｍｓの立ち下がり時間；約５．０ｋＧ／ｓ乃至約５０．０ｋＧ／ｓ低下するスルーレート；および、６５−８０％のデューティサイクル（および、その後の２０−３５％の休止時間）を含む、結果として生じる外形が使用されることもある。波長、暴露持続時間などのさらなるＦＯＭが使用されることもある。図１は、本革新の実施形態に係る硬骨と組織で使用される刺激波形のための時間とともに変化する刺激領域外形を例証している。

（回転壁式の容器）
上に記載されるように、および特に図４を参照すると、ＲＷＶ（４０）が使用され、ベースユニット（４１）、制御装置ユニット（４２）、および培養容器（ａｋａ容器）（４３）を含んでいた。ＲＷＶ基本ユニット（４１）は、ＲＷＶ（４０）の機械的な部分を構成する。簡潔に言えば、基本ユニットは、培養容器の中心でスピンフィルターに沿って循環を提供する小さな空気ポンプと、すべての培養容器の重量をスピンするように設計されたステッピング・モーターを含んでいる。ＲＷＶ制御装置ユニット（４２）は、一貫したかつ較正された速度になるまで基本ユニット（４１）内のステッピング・モーターにエネルギーを与えるために特別に作成されたエレクトロニクスを収容しており、構成間で等しい回転速度を与えることで、稼働中の各ユニットを同一の速度でスピンさせることができる。ＲＷＶ培養容器（４３）は、低速回転側方容器（Ｓｌｏｗ Ｔｕｒｎｉｎｇ Ｌａｔｅｒａｌ Ｖｅｓｓｅｌ）（ＳＴＬＶ）または高アスペクト回転容器（Ｈｉｇｈ Ａｓｐｅｃｔ Ｒｏｔａｔｉｎｇ Ｖｅｓｓｅｌ）（ＨＡＲＶ）で構成されることもある。細胞サンプル（４４）は培養容器（４３）に含まれている。細胞サンプル（４４）は軟骨細胞、髄核、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、関連する組織、または任意の組み合わせを含むこともある。それぞれのＳＴＬＶは、基部、胴体部、酸素化のための中心コア、シリンジポートを備えたキャップ、およびフィルプラグで構成される。オフガス処理からの細胞に対する潜在的な損害を相殺するために、新しいＨＡＲＶとＳＴＬＶは、エタノールと最初の使用の前の高圧蒸気殺菌を含む手順で解毒されなければならない。

（ヒトの軟骨細胞）
実験室試験では、ＨＣＨは、５０−８５歳の範囲のドナーであって、男性と女性の両方のドナーからの関節の軟骨細胞で構成された。これらは確立されていない原発性の細胞集団または無限に再生産される培養物である。７つの男系と７つの女系が研究された。最小限の５ｘ１０７細胞を凍結保存することができるまで、それぞれの個々のドナーを２Ｄで培養して拡張した。最初の個々の拡張後、男性のドナーを女性のドナーと別にしたまま各ドナーの１つのバイアルをプールにまとめて、プール中の追加の１ｘ１０８細胞を冷凍バンクに保存する（ｃｒｙｏｂａｎｋｅｄ）ことができるまで２Ｄで拡張した。この組み合わせたプールが継代数７を超えることはなかった。培養中の細胞の主要な特性を失ってはならないため、生体外の継代の数を最小限に抑えつつ、利用可能な細胞の数を最大限にすることに労力を費やした。さらに、最初に個体として貯蔵し、その後、プールを作成することによって、この技術は、「戻る」能力と実験の焦点が拡大する場合にはプールされた細胞の追加のバイアルを作成する能力を提供する。この努力の結果が性別当たり追加の４．５ｘ１０８の細胞、または９ｘ１０８の合計細胞であった。

（ヒトの骨芽細胞）
実験室試験では、ヒトの骨芽細胞（ＨＯＢ）は凍結保存された。再度、ＨＯＢを、年配のドナー、この場合、５０から５９歳までの男性と女性の両方ドナーから受け取った。ＨＣＨのように、それぞれのロット／ドナーは個体として拡張および貯蔵され、その後、性別によって複数ドナーのプールへと組み合わされ、５人の男性のドナーのプールと５人の女性のドナーの追加のプールを作成した。

（細胞成長培地）
細胞成長培地（ＧＴＳＦ−２）は、Ｌ−１５／アルファ−ＭＥＭベース上にカスタム処方された（ｃｕｓｔｏｍ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）三糖の二重バッファーされた培地である。標準フラスコまたはプレート中で二次元（２Ｄ）で育てられた細胞は、こうした不自然な状態に晒されるため、その成長必要条件は生体内と比較して偏っている。従って、ほとんどの任意のグルコースを含む、単一バッファーの等張食塩水は、主要な、変形された、トランスフェクトされた、無限に再生産される細胞の状態に関するわずかな例外を除いて、上記の細胞を保持する。しかしながら、ＲＷＶはより多くの生体内の類似する環境を作り出す。細胞には重力や流体のせん断がほとんどなく、その天然のＤＮＡにコードされた特性を完全に発現することができる。すなわち、細胞はその生体内の相当物に似た細胞構造またはほとんど同じの細胞構造さえ区別して発達させることができる。より完全な成長能力に伴って、より多くの完全培地の必要性が生じる。ＧＴＳＦ−２は、ほとんどの成長活性のある培養物中でさえ、生理学的に正常な状態に可能な限り近いｐＨを保証するためのＨＥＰＥＳやＮａＨＣＯ３（重炭酸ナトリウム）と同様に、簡素でかつますます複雑になりつつあるエネルギー源として、グルコース、ガラクトース、およびフルクトースを用いる。ＧＴＳＦ−２は、ＤＰＭＩ ４０％ ＭＥＭ ＡＬＰＨＡ ＭＯＤ／６０％ Ｌ−１５、カタログ番号ＳＨ３Ａ０９９．０１として、その「専門培地」群によって市販の製剤中で利用可能である。

（二次元の（２Ｄ）培養技術）
低継代の細胞のバイアルを可能な限り多く保存し、細胞の冷凍プールの寿命を延ばすことで、あらゆる将来的な必要性に対応するために、冷凍させたＨＣＨまたはＨＯＢのプールした細胞の単一のバイアルを解凍することで、バイオリアクター実験に細胞を使用する。単一の１ｘ１０７から、細胞／バイアルユニットから、ｐ７の継代を超えることなく、１２のＳＴＬＶを定植するのに十分な細胞である２ｘ１０８もの細胞に拡張することができる。標準的な培養技術が使用される。Ｃｏｒｎｉｎｇから購入したＴ型フラスコと１０％のＦＢＳを含むＧＴＳＦ−２培地を用いて、設計した実験に必要とされる数を満たすべくＨＯＢまたはＨＣＨの細胞を十分に拡張する。フラスコ内の細胞集団がおよそ７５−８０％の細胞密度に達すると、前のフラスコのおよそ２５％の細胞密度で標準的なトリプシン処理技術を使用して、細胞を新しいフラスコに継代する。言いかえれば、１個のフラスコは４つに継代される。必要な数の細胞を産出するのに十分なフラスコが利用可能となるまでこれを続ける。正常細胞は長期間２Ｄ培養中で保持されるとは知られていないため、主要な細胞の継続的な成長は困難であるとともに時間を浪費することに注目されたい。

（マイクロキャリア調製物）
いくつかの異なるマイクロキャリア基材は、組織を反復させる必要性を満たすのに利用可能である。例えば、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、シクロデキストラン、コラーゲン、およびゼラチンは、マイクロキャリア基材の典型的な形態である。一実施形態では、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒと呼ばれる、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）からのゼラチン・マイクロキャリアが使用された。Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒはゼラチンでコーティングされたマクロ多孔性のゼラチンビーズであり、表面積の増加によって、細胞負荷の軽いより優れた細胞密度が可能となる。Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒは乾燥粉末として提供され、培養に基づいてミリグラムで量り分けられた。５５ｍｌのＳＴＬＶ中の約３ｍｇ／ｍｌは、ＨＣＨとＨＯＢの培養に十分な成長スペースである。いったん所望の量が量られると、マイクロキャリアは小さな高圧滅菌可能なジャーに入れられ、これが水分を適切に補給することができるように十分な量のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が加えられる。マイクロキャリアをＰＢＳに夜通し「浸す」ことができる。翌日、マイクロキャリアは高圧滅菌することで確実に無菌にする。高圧滅菌後に、マイクロキャリアを使用前に夜通し冷却しなければならない。

（三次元（３Ｄ）培養の開始）
培養容器のいずれかで使用される細胞とマイクロキャリアの量は、多くの因子に依存する。実験室試験については、ＨＣＨとＨＯＢが主要な細胞である。そういうものとして、これらは変形された細胞株またはトランスフェクトされた細胞株の開始細胞密度よりもかなり高い開始細胞密度を要求する。加えて、ＲＷＶが適切に作用するためには、空間と流体の制限に関する細胞密度を考慮しなければならない。バランスは、培養を確立する決定的な当初の細胞と細胞間の相互作用のために十分な細胞を加えることで保たれるが、そのように十分に多くの細胞を加え過ぎると、培養期間の終わりにかけて細胞密度が大きくなりすぎて流体容量および容器のヘッドスペースで維持することができない。制限された試験を数回行った後、３ｘ１０５細胞／ｍｌ／容器の当初の播種密度は、ＨＣＨとＨＯＢの細胞にとって優れたバランスであったことがわかった。標準的なトリプシン処理技術を用いて、ＨＣＨまたはＨＯＢを拡張するために使用される２ＤフラスコからＨＣＨまたはＨＯＢ細胞を取り除いた。ＨＣＨまたはＨＯＢの細胞は細胞計数を行う間に培地で保存した。一実施形態では、血球計とトリパン（ｔｒｙｐａｎ）排除技術を用いて、細胞数を測定した。いったん、ｍＬ当たりの細胞の数が決定されると、あらかじめ決められた量の細胞を容器に入れて所望の濃度を等しくする。次に、あらかじめ測定されてあらかじめ殺菌されたマイクロキャリアを加えた。最後に、ＧＴＳＦ２培地を含む残りの容量を加えた。すべての培養構成要素を入れた後に、空気とその後のすべての気泡を取り除いて、容器を加圧した。これは容器の頂部上でシリンジポートによって達成される。シリンジを培地で満たし、空気を引き抜きながらその培地を容器に繰り返し反復してその培地を入れることによって、容器中のデッドスペース／空気スペースをすべて満たすことができる。このようにして気泡がすべて取り除かれた後、シリンジ中で液体に圧力をかけることによって容器内で圧力が形成される。容器をその後加圧して仕上げた。容器はＲＷＶの基本ユニットに取り付ける準備ができている。

（３Ｄ培養の維持）
一般的に言えば、培養物は開始後最初の４８時間以内には何も与えられない。これにより、マイクロキャリアと結合し、細胞間の情報伝達や接着の原因であるタンパク質の生成を始める時間が細胞に与えられる。その後の養分の供給は、世界中の病院やクリニックで使用されている携帯型のポータブル血液ガス測定装置であるｉＳｔａｔ（登録商標）（ニュージャージー州プリンストンのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）によって測定される。これによって行われる分析は使用されるカートリッジに依存する。培養する目的のために、上澄み中にあるＮａ＋とＣｌ＋のイオンは、ＮａＣｌが取り込み中に開裂するという点で細胞代謝のインジケータである。さらにグルコースも注目に値する。グルコースはＧＴＳＦ−２中の３つの砂糖のうちの１つであり、現在一貫して分析することができる唯一のものである。グルコースは細胞にとって主要なエネルギー源であり、養分を供給している間の任意の時間に使用される量は細胞の活動レベルに関する情報を提供する。ｉＳｔａｔ（登録商標）上でのＢＵＮ（血液尿素性窒素）の読み取りは、培養物内のストレスレベルに相関する。ＮａＨＣＯ３（重炭酸ナトリウム）レベルは、代謝活性の結果として生成される酸の量に関する情報を提供する。ｉＳｔａｔ（登録商標）が測定する他のパラメータに加えて、こうした様々なイオンは、培養の養分供給の量と頻度に関して優れた決断を下すために必要不可欠である。究極のゴールはバイオリアクター内を生理学的に正常な状態で維持することである。適切な等張性を維持するために、７．２のｐＨ、およそ８０−１００ｍｇ／ｄＬのグルコース、および、溶液の平衡を保つための適切であるが過剰ではない塩と重炭酸塩が達成される。偏差は正常な状態から各２４時間のあいだに測定され、偏差が生じるのにかかる時間が培養の維持スケジュールを決定する方法である。

実験後に利用される解析技術
光学顕微鏡法も、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）と併用して使用される。細胞は、パラフィンマトリックスに埋め込まれ、その後、薄層は切断され、スライド上に載せられる。その後、これらの切片は、ある種の色に又は蛍光色素に結合した抗体で染色され、結合部位を可視化する。抗体は、その特定細胞においてのみ見られる細胞型特異抗原に対するものであり得る。抗体はまた、細胞によって生成されているタンパク質またはサイトカイン生成物に対するものであり得る。組織切片が上に載せられたスライドは、その後、顕微鏡（光学または共焦点のいずれか）を介して見られ、解析および公開のために撮影される。細胞上の色または蛍光色素の濃度は、問題の抗原またはタンパク質の量を示唆している。暗色は高い結合および高い存在を意味し、一方で、明色は減少した存在および低い結合である。ＩＨＣは、一般に「質的」評価と考えられるが、他の技術は、マーカー発現を「定量化する」ために使用される。集合体のような組織の部分は、等分され、フィルター滅菌した水で３回洗浄され、吸引され、ＰＢＳ中で調製された２％のグルタルアルデヒド／３％のホルムアルデヒドの終末濃度で固定される。サンプルは、一晩４℃で最小２４時間固定される。サンプルは、フィルター滅菌した脱イオン水で３回繰り返して流されて塩を除去し、その後、観察および画像化のためにＦＥＩ ＸＬ３０の環境制御型走査電子顕微鏡に移される。遺伝子のアレイ解析は、パラメータの各々の大きな変化または細胞型の変化後の実験中に行われる。

実験室試験
発明者は、細胞プロセスに対する時間と共に変化する刺激領域の効果に関する幾つかの研究を行った。例えば、研究において、ヒト軟骨細胞（ＨＣＨ）の混合種個体群を、５８歳から８１歳の年齢の範囲の患者サンプルから作り出し、貯蔵した。これらのサンプルを、その初期段階の変形性関節症の徴候によって選択した。男性の試験集団を、ＲＷＶ中で約３０日間、継続的方法で電気信号によって生成された、あらかじめ決められたＢ場の規模および波形形状を含むあらかじめ決められた外形を備える刺激領域にさらした。図５は、ＲＷＶおよび刺激領域発生器の統合を組み込む典型的な構成を例証する。倍率変化解析で構成された細胞遺伝子の発現解析は、対照ＨＣＨサンプルと同様に刺激領域にさらされたＨＣＨサンプルを使用して、４７，０００のヒト遺伝子（Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ｃｈｉｐ）に関するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙの調査によって達成された。発現結果は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）のアッセイによって確証された。調節された遺伝子のタイプ間に差があった。実験を、２セットのＨＣＨサンプルを用いて繰り返し、その各々を、あらかじめ決められた外形を備える別々の刺激領域にさらした（サンプルの各セットに対して１つの刺激領域）。各刺激領域のＢ場の規模は、この実験において異なっていた。同様の遺伝子アレイの調査後、異なる刺激領域にさらされた調節された遺伝子のタイプ間に差があった。実験を、２つのＨＯＢサンプルを用いて繰り返し、これらを、あらかじめ決められた外形を備える別々の刺激領域にさらした（サンプルの各セットに対して１つの刺激領域）。各刺激領域に対するＢ場の規模は、この実験において略等しかった。Ｂ場の規模が決定的な変数（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｂｌｅ）であることを関連技術が示唆しているため、細胞遺伝子発現の解析で発現された任意の細胞活性が比較的等しくなることが予想された。しかしながら、実験は予期しない結果をもたらした。具体的には、続く遺伝子アレイ調査は、２つの細胞サンプル間の遺伝子発現の有意差を明らかにした。異なる刺激領域にさらされた調節された遺伝子のタイプの差が観察された。一例として、これらの実験からの遺伝子アレイ調査の結果は、変形性関節症処置に対する使用の可能性に関する刺激領域外形間の有意差を示している。結果は、Ｂ場の規模が決定的な変数ではない１セットの特定のシグナルからの、ヒトの軟骨形成、骨形成、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の堆積によって特定される細胞機構の優先的な調節を明確に示している。むしろ、刺激領域外形（即ち、波形）の形状および（Ｂ場の規模に加えて）ＦＯＭも、影響因子である。

一実施形態では、上に記載されるヒト軟骨細胞の混合種個体群は、培養フラスコ中で拡張した。最初に、組織様集合体（ＴＬＡ）を、正常なヒト軟骨細胞から構築した。これらのＴＬＡから、細胞サンプルを、二次元の培養フラスコ中で成長させた（即ち、拡張させた）。細胞サンプルの個体群は、いくつかの患者サンプルに由来し、これらのサンプルを、プールし、性別で分けた。続く培養物を、ＧＴＳＦ−２成育培地中で確立した。ＧＴＳＦ−２成育培地は、基底細胞の培養培地である。従来の成長因子に加えて、ＧＴＳＦ−２は、その生理学的レベルで３つの糖（グルコース、ガラクトース、およびフルクトース）の混合物を含有している。培養物を、トリプシン−ＥＤＴＡによって２Ｄフラスコから除去し、数えた。

以下の方法で、軟骨細胞のサンプルをあらかじめ決められたプロフィルの刺激領域のあらかじめ決められた時間スケジュールにさらした。既知の細胞容量を、各サンプルセットおよび対照サンプルセットに対して少なくとも３つの回転壁式容器（ＲＷＶ）に植え付け、ここでＲＷＶは、Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．製の商用ユニットである、ＲＣＣＳ−１システムなどの、回転式バイオリアクターに関係している。ＲＷＶを、あらかじめ決められたセットのＦＯＭで構成されたあらかじめ決められた外形の刺激領域を送達するように設計されたあらかじめ決められたコイルへと挿入した。ＲＷＶは、あらかじめ決められた容積のマイクロキャリアを含有していた。続いて、あらかじめ決められた外形に従って、電気をコイルに供給した。ＲＷＶの刺激された微重力環境では、ヒト軟骨細胞およびヒト骨芽細胞は、新しい成長マトリックス（ｎｅｗ ｇｒｏｗｔｈ ｍａｔｒｉｃｅｓ）に付着し、細胞ビーズ凝集物において増殖し始めた。細胞ビーズ凝集物は、あらかじめ決められた暴露時間または複数の暴露時間系列の間に発達し、ここで複数の実施形態が、そこに存在する（例えば、約３０日間；約１時間から約７２０時間の間；２４時間オン、２４時間オフを繰り返して、合計３０日間、など）。

その後、細胞成長の観察および解析を、１サンプル当たり少なくとも３つのＲＷＶに含有されたサンプルセットおよび同様に少なくとも３つのＲＷＶに含有されたサンプルから構成された対照サンプルセットを使用して行った。遺伝子解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）Ａｓｓａｙによって達成された。複数の電気信号によって調節されるように複数の刺激領域外形にさらされた、およそ４７，０００のヒト遺伝子の全体のヒトゲノムに関する調査を行った。

同様の実験を、ヒト骨芽細胞を用いて行った。さらに、再生（例えば、同化）遺伝子対修復（例えば、異化）遺伝子を誘発する異なる外形を備える刺激領域に関して同じ結果が観察されたが、遺伝的活性は増加していた。実験結果のサンプルセットは、以下の通りであり、ここで前記サンプルセットは、革新の様々な実施形態と同様に革新の発達も例証する目的で提供され、いかなる方法でも本革新を制限するようには意図していない。

実施例１（ヒト軟骨細胞）：
第１実験では、少なくとも３つのＲＷＶに含有された第１セットのＨＣＨ細胞サンプルを、約１０Ｈｚの周波数；約５００ｍｓの波長；約０．２Ｔ／ｓ（２．０ｋＧ／ｓ）から約０．４５Ｔ／ｓ（４．５ｋＧ／ｓ）の間の増加するスルーレート；約０．４５Ｔ／ｓ（４．５ｋＧ／ｓ）から約１．５Ｔ／ｓ（１５．５ｋＧ／ｓ）の間の低下するスルーレート；各バースト後の約１０％の休止時間；約８０％オンおよび約２０％オフのデューティサイクル；および結果として生じる約５．９μＴ（０．０５９Ｇ）のＢ場の規模、を有する実質的に二相の正方形の波形から成るあらかじめ決められた外形の第１の時間と共に変化する刺激領域にさらした。実験を１０Ｈｚで行った。参考のために、地球の地球磁場の周波数は、７．８３Ｈｚであり、それ故、実験は、バックグラウンド磁場とは明らかに異なる基準を満たしている。暴露を、この実験の間に継続し、その長さは、約３０日または約７２０時間であった。上に記載するような倍率変化解析を含む遺伝子解析を、第１の時間と共に変化する刺激領域にさらしたＨＣＨ細胞サンプルに対して行った。第１の時間と共に変化する刺激領域に関係する前記遺伝子解析からの典型的な結果は、以下の表２に提供される。

一般に、関連技術のコンセンサスは、場の強度（電場または磁場のいずれか）が、所望の効果を引き起こすために細胞の内部に十分深く浸透するのに十分強力であるべきであることを教示している。これを生じさせるために、印加されたエネルギーレベルは、細胞の内部に十分深く浸透するのに十分高くなければならず、そうでなければ、最小限の表面的な効果しか期待できない。磁場と比較して、電場は遮光効果により影響を受けやすい。上に記載されるように、実験の構成は、第１セットのＨＣＨサンプルに対する少なくとも３つのＲＷＶの使用を含み、ここで少なくとも３つのＲＷＶを、磁場を生成するように設計されたワイヤーコイル内に各々封入した。したがって、干渉のレベルを最小限にし、第１の時間と共に変化する刺激領域の比較的低いＢ場の規模は、結果として２０００を超える遺伝子の調節をもたらした。しかしながら、同等の「有効な」Ｂ場の規模を哺乳動物の被験体に適用することに関する検討には、あらかじめ決められた値のあらかじめ決められた増幅因子または「利得」によってＢ場の規模を増大することを必要とし得、それにより、用量応答曲線の作成が求められる。この増幅因子または利得は、発明者の実験の構成および哺乳類生理学（例えば、骨から構成された骨格構造）に関係する干渉のレベルの違いが原因で必要とされ得る。発明者は、「最適な」有効磁場および状況の解釈が、全体的な生理学に対する適用によって被る全身性の湿潤化（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄａｍｐｅｎｉｎｇ）を考慮に入れなければならないことを規定している。

予期しない観察が、調節された遺伝子のタイプに関してなされ、それは、再生機能に通常関係する遺伝子（即ち、同化遺伝子）が、修復機能に関係する遺伝子（即ち、異化遺伝子）に対して、はるかに高いパーセンテージでアップレギュレートされたということである。幾つかの場合では、第１の時間と共に変化する刺激領域にさらされた遺伝子は、ダウンレギュレートされ、それによって、異化効果が結果としてもたらされたか、またはアップレギュレートされ、それによって、同化効果が結果としてもたらされたか、あるいはその逆もしかりであった。一実施形態では、１セットの遺伝子は、既知の機能に基づいて選択され得る。前記セットにおける各遺伝子に対する倍率変化は、アップレギュレーション、ダウンレギュレーションと一致するように、または無調節となるように解析且つ測定され得る。調節された遺伝子はそれぞれ、続いて、同化効果、異化効果、または差異的調節なし（ＮＤＲ）に対して解析され得る。さらなる実施形態では、各々の同化および異化の効果の相対値が割り当てられ得る。また、同化および異化の効果の全体的なセットが、各効果の相対値に関して比較され得る。したがって、結果として生じる異化効果対同化効果が測定され得る。本実験でアップレギュレートされた遺伝子（同化）の多くが、胚発生に関係することに留意されたい（Ｌａｎｚａ，２０００）。表１は、第１実験に対する前記効果の概要を提供している。

表１で観察されるように、第１の時間と共に変化する刺激領域に対する結果は、同化または再生の効果を示唆している。表２は、同化および異化の効果が特定されるこの観察に関してさらなる詳細を提供している。

表２は、第１実験でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを受けた幾つかの選択遺伝子を示す。例えば、ＢＭＰは、骨および軟骨の形成を誘発するそれらの能力のために元来発見されたサイトカインとしても知られる成長因子の群であり、軸となる形態形成シグナルの群を構成し、身体の全体にわたって組織構造を編成するとも考えられる。ＢＭＰ２を、第１実験でダウンレギュレートした。ＢＭＰ２は、ジスルフィド結合したホモダイマーとして作用し、骨および軟骨の形成を誘発し、骨芽細胞の分化に重要な役割を果たす。さらに、ＢＭＰ２は、遷延癒合および癒合不能を含む様々な骨関連の疾病の処置に有益である。この実験では、ＢＭＰ２のダウンレギュレーションは、異化効果を表わす。具体的な目的は、ヒト軟骨細胞の成長を増強することであった。１セットのＦＯＭの類似した適用は、結果としてＢＭＰのアップレギュレーションをもたらす。したがって、この実験は、全体的なＢ場と同様にＦＯＭでの変化も、結果を著しく変更し得ることを実証した。別の例として、コラーゲンファミリー内の遺伝子のアップレギュレーションは、同化効果を表わす。

実施例２（ヒト軟骨細胞）：
第２実験では、少なくとも３つのＲＷＶに含有されたＨＣＨ第２セットの細胞サンプルを、約１０Ｈｚの周波数；約５００ｍｓの波長；約０．２Ｔ／ｓ（２．０ｋＧ／ｓ）から約０．４５Ｔ／ｓ（４．５ｋＧ／ｓ）の間の増加するスルーレート；約０．４５Ｔ／ｓ（４．５ｋＧ／ｓ）から約１．５５Ｔ／ｓ（１５．５ｋＧ／ｓ）の間の低下するスルーレート；各バースト後の約１０％の休止時間；約８０％オンおよび約２０％オフのデューティサイクル；および結果として生じる約６５μＴ（０．６５Ｇ）のＢ場の規模、を有する実質的に二相の正方形の波形から成るあらかじめ決められた外形の第２の時間と共に変化する刺激領域にさらした。少なくとも３つのＲＷＶに含有された第３セットのＨＣＨ細胞サンプルを、約１５Ｈｚの周波数；約３０％オンおよび約７０％オフのデューティサイクル；および結果として生じる約２５０μＴ（２．５Ｇ）のＢ場の規模、を有する実質的に単相のデルタ波から成るあらかじめ決められた外形の第３の時間と共に変化する刺激領域にさらした。第３の時間と共に変化する刺激領域は、一般に図２で例証される。第３の時間と共に変化する刺激領域で表わされる波形が、その形状および波長（「パルス時間と共に変化する刺激領域」としても知られる）の両方が原因で「パルス」または「バースト」と明示され得ることに留意されたい。暴露を、この実験の間に継続し、その長さは、約３０日または約７２０時間であった。第２および第３セットのＨＣＨ細胞サンプルのために、同等の機器を使用した。しかしながら、異なる送信構成要素（例えば、アンテナ）を、第１および第２の実験間で利用したことが留意される。

これらの結果は、第１および第２の時間と共に変化する刺激領域間と同様に第２および第３の時間と共に変化する刺激領域に関するＢ場の規模の大きな違いが原因の様々な細胞効果を示唆していた。故に、第２実験の結果は、その表面上では、細胞効果のための決定的な制御因子を含むものとしてＢ場の規模を記載したコンセンサスに関連する当該技術の公報と一致していた。言いかえれば、表４および表２で観察することができるように、第１および第２の時間と共に変化する刺激領域間と同様に第２および第３の時間と共に変化する刺激領域へのヒト軟骨細胞の暴露間で結果として生じる遺伝子発現に大きな差がある。例えば、第１および第２の時間と共に変化する刺激領域間（２０２１対１０９７）の調節された遺伝子の総数は、調節された遺伝子の４６％の減少を構成した。調節された遺伝子のそのような大きな減少が生じることは予想されなかった。むしろ、コンセンサスに関連する当該技術の公報は、Ｂ場の規模が決定的な対照値であり、細胞効果を刺激するために十分に高いＢ場の規模が必要とされることを開示しているために、調節された遺伝子の総数が増加することが予想されていた。発明者は、調節された遺伝子の大きな減少が、異なる送信構成要素を第１および第２の実験に関して使用したという事実と関連すると仮定した。正味の効果に関して、第２実験の結果は、第２の時間と共に変化する刺激領域に関係する異化効果対同化効果に関する発明者の観察を実証するものであった。表３は、遺伝子発現に関する第２実験の概要を表わす。

表３および４で観察することができるように、第２および第３の時間と共に変化する刺激領域に関係する同化および異化の効果は、大きく異なっていた。しかし、第１および第２の刺激領域間、または具体的には、不均衡に大多数の異化対同化の遺伝子反応間の共通化がある。第２の時間と共に変化する刺激領域に対する典型的な結果は、同化または再生の効果を示唆している。逆に、第３の時間と共に変化する刺激領域からの典型的な結果は、異化対同化の効果に関して比較的中立であるが、合計のＢ場ははるかに高い（６５μＴ対２５０μＴ）。この結果は、先行技術の公報を考慮すると予期されず、それ故、不測のものであった。具体的には、６５μＴと比較して２５０μＴではるかに高い効果があるはずであったが、これはそうではなかった。２つの領域の外形に関係する典型的な結果の比較は、以下の表４に提供される。

表４で観察することができるように、対象の幾つかの選択遺伝子は、第２実験でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを受けた。ＡＤＡＭＴＳ遺伝子は、一般に、アップレギュレートされたときに同化であるが、ダウンレギュレートされたときに異化であると考えられることが留意される。表４で観察することができるように、ＡＤＡＭＴＳ１および５は両方とも、第２の時間と共に変化する刺激領域への暴露に関してアップレギュレートされた。逆に、ＡＤＡＭＴＳ１および５は、第３の時間と共に変化する刺激領域への暴露に関してダウンレギュレートされた。ＭＭＰプロテアーゼは、組織を破壊する（再形成および修復に関係するプロセス）ために、異化であると一般に考えられる。ＭＭＰがダウンレギュレートされるときに、異化効果は抑制され、それによって正味の同化効果を有する。逆に、ＭＭＰがアップレギュレートされるときに、それらの異化効果は増強される。表４で観察することができるように、ＭＭＰ１、３、および１３は、第２の時間と共に変化する刺激領域への暴露に関してダウンレギュレートされた。逆に、ＭＭＰ１、３、および１３は、第３の時間と共に変化する刺激領域への暴露に関してアップレギュレートされた。ＢＭＰ１は、軟骨発育に関係し、再生機能に関連するか又は本質的に同化している。表４は、ＢＭＰ１が、第２の時間と共に変化する刺激領域への暴露に関してアップレギュレートされたことを示している。逆に、ＢＭＰ１は、第３の時間と共に変化する刺激領域への暴露に関してダウンレギュレートされた。

実施例３（ヒト骨芽細胞）：
第３実験では、少なくとも３つのＲＷＶに含有された第１セットのＨＯＢ細胞サンプルを、第２実験におけるあらかじめ決められた外形の第２の時間と共に変化する刺激領域と比較して略同じ時間と共に変化する刺激領域の外形にさらした。明確にするために、この刺激領域の外形は、約１０Ｈｚの周波数；約５００ｍｓの波長；約０．２Ｔ／ｓ（２．０ｋＧ／ｓ）から約０．４５Ｔ／ｓ（４．５ｋＧ／ｓ）の間の増加するスルーレート；約０．４５Ｔ／ｓ（４．５ｋＧ／ｓ）から約１．５５Ｔ／ｓ（１５．５ｋＧ／ｓ）の間の低下するスルーレート；各バースト後の約１０％の休止時間；約８０％オンおよび約２０％オフのデューティサイクル；および結果として生じる約６５μＴ（０．６５Ｇ）のＢ場の規模、を有する実質的に二相の正方形の波形から成るあらかじめ決められた外形の第４の時間と共に変化する刺激領域として言及される。少なくとも３つのＲＷＶに含有された第２セットのＨＯＢ細胞サンプルも、以前に記載された第３の時間と共に変化する刺激領域に対する同じ刺激領域と比較して略同じ刺激領域に別々にさらした。明確にするために、このパルス刺激領域は、約１５Ｈｚの周波数；約３０％オンおよび約７０％オフのデューティサイクル；および結果として生じる約６５μＴ（０．６５Ｇ）のＢ場の規模であって、一方向（即ち、単層）で実質的に固定される、Ｂ場の規模、を有する単相のデルタ波から実質的に成るあらかじめ決められた外形の第５の時間と共に変化する刺激領域として言及される。この実験では、第４および第５の時間と共に変化する刺激領域のＢ場の規模が略等しかったことに留意されたい。第１および第２セットのＨＯＢ細胞サンプルに対して同等の機器を使用した。同等の機器を、第２および第３の実験と比較して使用した。暴露を、この実験の間に継続し、その長さは、約３０日または約７２０時間であった。第２実験でのように、第１および第２セットのＨＯＢ細胞サンプル間の結果として生じる細胞効果は、大きく異なっていた。本明細書では、第１および第２セットのＨＯＢ細胞サンプルに対して２回の別々の遺伝子解析を行ったことが留意される。第１セットのＨＯＢ細胞サンプルに関して、これらの遺伝子解析は、以下の表６および７において、第４の時間と共に変化する刺激領域に対する＃１および＃２の倍増加／減少として定義される。第２セットのＨＯＢ細胞サンプルに関して、これらの遺伝子解析は、以下の表６および７において、第５の時間と共に変化する刺激領域に対する＃３および＃４の倍増加／減少として定義される。２つの領域外形の各々の２回の別々の遺伝子解析に関係する典型的な結果の比較は、下記の表に提供される：

コンセンサスに関連する技術公報に基づくと、第４および第５の時間と共に変化する刺激領域に関係する結果が、Ｂ場の規模が略同じだったと考えれば、略等しい又は少なくとも合理的に等しいとことが予想された。しかしながら、実際の結果は、この予想に反するものであった。実際、第３実験の実際の結果は、遺伝子発現の違いが、実質的にＢ場の規模の結果ではなかったことを示している。むしろ、場の外形に関連する他のＦＯＭは、細胞活性に影響を与え、ここで他のＦＯＭは、Ｂ場の規模の強度に優り得る（またはそれを欠き得る）。解析した４７，０００の遺伝子のうち、およそ２５００の遺伝子が、遺伝子反応の５５０％を超える増加を含む第５の時間と共に変化する刺激領域に対応するおよそ４５０の遺伝子と比較して、第４の時間と共に変化する刺激領域に対応した。遺伝子反応の数と関係するパーセンテージの違いの差は、第５の時間と共に変化する刺激領域と比較して、ＨＯＢに対する著しくより大きな効果を有する第４の時間と共に変化する刺激領域を示唆している。故に、議論されるように、本結果は、第４および第５の時間と共に変化する刺激領域に関係する略同様のＢ場の規模が原因で、略同様の又は少なくとも合理的に同様の結果が予想されたという関連技術分野の予想に反するものである。

特定のタイプの遺伝子およびゲノムのカスケードは、あらかじめ決められた外形の異なる刺激領域に対して異なって反応する。および、第４の時間と共に変化する刺激領域に関して、同化遺伝子は、他のタイプの遺伝子と比較して、実質的にアップレギュレートされる。さらに、発明者は、第４の時間と共に変化する刺激領域にさらされたＨＯＢサンプルに関係する調節された遺伝子のパーセンテージが、第２の時間と共に変化する刺激領域にさらされたＨＣＨサンプルに関係する調節された遺伝子のパーセンテージと比較して、はるかに高かったという別の予期しない結果を実現した。したがって、あらかじめ決められた外形の同じ刺激領域は、ＨＯＢと比較すると、異なってＨＣＨ内の遺伝反応に影響を与える。したがって、同じ刺激領域の外形は、異なる結果が生じる異なる組織に適用され得る。ＨＣＨ内の異なる遺伝反応に関して及びＨＯＢと比較して、発明者は、軟骨対石灰化した骨における合計のＣＡ２＋およびＫ＋の密度の大きな違いが原因で、細胞以下の転写シガナルが、同じ刺激領域にさらされたときに異なると主張している。これは、ＰＥＭＦを使用する科学論文で見られる多くの結果に対する予想されない説明を提示している。したがって、異なる哺乳動物組織のための様々な潜在的な調整する解決策（ｔｕｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が考えられる。

またさらに、発明者は、異なる刺激が、再生遺伝子および修復遺伝子の調節に関する細胞に、再生（即ち、同化）または正味の修復（即ち、異化）の効果をもたらすように影響を与えることができるという事実に基づいて、異なる刺激領域およびその関係する暴露時間または時間スケジュールが、カスタマイズされた治療適用を設計するために互いに組み合わせて使用され得ることを認識した。刺激領域とその関係する暴露時間または時間スケジュールを組み合わせるための複数の実施形態が存在する。例えば、一実施形態では、ＨＯＢ細胞、ＨＣＨ細胞、またはその両方において正味の異化効果をもたらすために調整された刺激領域（およびその関係する暴露時間または時間スケジュール）は、正味の異化効果を刺激するために最初に使用され得る。あらかじめ決められた量の異化または修復効果が実現された後、ＨＯＢ細胞、ＨＣＨ細胞、またはその両方において正味の同化効果をもたらすために調整された別の刺激領域（およびその関係する暴露時間または時間スケジュール）は、あらかじめ決められた量の同化または再生効果が実現されるまで利用され得る。所望されると、そのプロセスは繰り返され得る。あるいは、別の実施形態では、ＨＯＢ細胞、ＨＣＨ細胞、またはその両方において正味の同化効果をもたらすように調整された刺激領域（およびその関係する暴露時間または時間スケジュール）と組み合わせて及び同時に、ＨＯＢ細胞、ＨＣＨ細胞、またはその両方において正味の異化効果をもたらすように調整された刺激領域（およびその関係する暴露時間または時間スケジュール）を使用するために、治療適用がカスタマイズされ得ることが考えられる。またさらに、調整された刺激領域の使用は、連続して、平行して、またはその両方で利用されてもよい。

これらの結果は、軟骨および骨の回復、修復、および維持の要因である既知の哺乳動物遺伝子の活性化を引き起こす生化学的な細胞および細胞以下の分子反応を優先的に刺激する（アップレギュレートする、ダウンレギュレートする、またはその両方を組み合わせる）ように、時間と共に変化する刺激領域の少なくとも１つのあらかじめ決められた外形を調整する手段を表わしている。具体的には、この優先的な刺激は、同化効果、異化効果、またはその両方の組み合わせての要因である、特定の遺伝子、遺伝子ファミリー、またはその両方の組み合わせに対する標的となり得る。表２、４、６、および７は、少なくとも１つの調整されたあらかじめ決められた外形の調整された時間と共に変化する刺激領域による優先的な刺激のために標的とされ得るこのような特定の遺伝子および遺伝子ファミリーの例を特定するものとして本明細書に組み込まれる。刺激領域発生器と組み合わせてＲＷＶに入れられた細胞サンプル（ＨＯＢまたはＨＣＨなど（しかし、対象の生物学的事象に依存して、あらゆる種の生物学的な細胞サンプルが使用され得る））およびマイクロキャリアが、遺伝子の同化効果、異化効果、またはその両方の組み合わせを最適化するために、少なくとも１つのあらかじめ決められた外形の時間と共に変化する刺激領域を調整する実験的方法で使用され得ることが実証されてきた。図９を特に参照すると、例えば、以前に記載された一連の実験によって抜粋できるように、調整工程５０は、少なくとも１つの回転壁式容器に少なくとも１セットの細胞サンプルを提供する工程５１；前記少なくとも１セットの細胞サンプルを、少なくとも１つの実験的なあらかじめ決められた外形を含む少なくとも１つの実験的な時間と共に変化する刺激領域にさらす工程５２；前記少なくとも１セットの細胞サンプルに対して少なくとも１つの遺伝子発現解析を行う工程５３；前記少なくとも１つの遺伝子発現解析の結果から遺伝子の同化および異化の効果を解析する工程５４；前記解析する工程から少なくとも１つの結論を導く工程５５；前記少なくとも１つの結論をあらかじめ決められた基準と比較する工程６５；前記少なくとも１つの結論があらかじめ決められた基準を満たさない場合に、少なくとも１つの実験的なあらかじめ決められた外形を前記少なくとも１つの結論に基づいて調節する工程５６；および前記あらかじめ決められた調整された暴露時間または前記複数の調整された暴露時間系列のために少なくとも１つの調整された時間と共に変化する刺激領域の外形を選択する工程５７、を含み得る。工程５６のあらかじめ決められた基準は、例えば、あらかじめ決められた数の同化の遺伝効果または反応；異化の遺伝効果または反応；またはその両方の組み合わせを含み得る。図１０を特に参照すると、例えば、遺伝子の同化および異化の効果を解析する工程は、あらかじめ決められたセットの遺伝子を選択する工程５８；前記少なくとも１つの遺伝子発現の結果から前記セットの遺伝子における各遺伝子に対する倍率変化を計算する工程５９；前記倍率変化の各々が、前記各遺伝子に対するアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションと一致しているかどうかを測定する工程６０；および前記各遺伝子に対する前記アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに基づいて、前記倍率変化の各々を、同化または異化の効果として分類する工程６１、から構成され得る。前記少なくとも１つの結論を導く工程は、前記各遺伝子のための前記アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに対する前記同化または異化の効果の各々に対して相対値を設定する工程６２；前記相対値の各々を組み合わせて比較する工程６３；実質的な正味の同化効果、実質的な正味の異化効果、正味の同化効果、正味の異化効果から構成された、または決定的な効果のない結論を選択する工程６４、から構成され得る。

当業者は、本革新が、対象を実行する、および言及される目的および利点に加えて、それらに固有のものを得るために、十分に適応させることを容易に認識するであろう。本明細書に記載される方法、手順、処理、および生体試料とともに本実施例は、実施形態および好ましい実施形態を本明細書で表わしており、典型的であり、および本革新の範囲を限定するものとして意図されない。本明細書における変更および他の使用は、特許請求の範囲によって定義されるように主題の革新の精神内に包含される当該技術分野の当業者に想到されるだろう。

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Claims (28)

1. 哺乳動物の遺伝子の発現レベルを優先的にアップレギュレートするまたはダウンレギュレートするための方法であって、
   関心対象の細胞のサンプルまたは組織の近くに、時間とともに変化する刺激領域を生成する装置を位置決めする工程、および、
   前記装置を用いることによって、あらかじめ決められたＢ場の規模、増加するスルーレート、立ち上がり時間、低下するスルーレート、立ち下がり時間、周波数、波長、デューティサイクル、および、サンプル暴露時間または時間系列を備えた時間とともに変化する刺激領域を生成する工程であって、前記時間とともに変化する刺激領域が哺乳動物の遺伝子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする、工程、
   を含む、方法。
2. 前記時間とともに変化する刺激領域を生成する装置は、動力源、前記動力源に動作可能に接続された制御構成要素、および前記制御構成要素と前記動力源に動作可能に接続された送信構成要素を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞のサンプルは軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、髄核、破骨細胞、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
4. 前記哺乳動物の遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達遺伝子、ウォルバキア外表面タンパク質遺伝子、フォークヘッドボックス遺伝子、性決定領域Ｙ Ｓｒｙ−関連高移動度群ボックス遺伝子、副甲状腺ホルモン遺伝子、形質転換成長因子β超遺伝子、潜在型形質転換成長因子遺伝子、インテグリン遺伝子、インターロイキン遺伝子、トロンボスポンジン遺伝子、ラミニン遺伝子、プロテオグリカン遺伝子、オステオグリシン遺伝子、コラーゲン遺伝子、インスリン遺伝子、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼの遺伝子、トロンボスポンジンモチーフ遺伝子を含むディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、マトリクスメタロペプチダーゼ遺伝子、アクチン遺伝子、カテニン遺伝子、カドヘリン超遺伝子、Ｂ細胞リンパ腫遺伝子、カルモジュリンカルシウム調節遺伝子、カルメニン遺伝子、カテプシン遺伝子、クラスタリン、チトクロムＰ４５０超遺伝子、エンドグリン遺伝子、フィブリリン遺伝子、線維芽細胞増殖因子遺伝子、レプチン遺伝子、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ遺伝子、筋肉部分ホメオボックス遺伝子、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質遺伝子、ミオチリン−ミオパラジン−パラジン遺伝子、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体遺伝子、血小板由来増殖因子遺伝子、レティキュロカルビン遺伝子、ｒｕｎｔ関連転写因子遺伝子、転写遺伝子のシグナル伝達トランスデューサーおよび活性化因子、デカペンタプレジック遺伝子に対する母性因子に類似するもの、スタニオカルシン遺伝子、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、シンデカン遺伝子、腫瘍壊死因子超遺伝子、ＡＫＴ／タンパク質キナーゼＢシグナル伝達遺伝子、およびインポーチン遺伝子である、請求項１に記載の方法。
5. 前記あらかじめ決められた時間とともに変化する刺激領域は、実質的に正方形の二相の波形の形態である、請求項２に記載の方法。
6. 前記実質的に正方形の二相の波形の周波数は、約９Ｈｚ乃至約２００Ｈｚである、請求項２に記載の方法。
7. 前記立ち上がり時間は約１２５μｓ乃至１ｍｓであり、前記増加するスルーレートは約２．０ｋＧ／ｓ乃至約５０．０ｋＧ／ｓである、請求項２に記載の方法。
8. 前記立ち下がり時間は約１２５μｓ乃至１ｍｓであり、前記低下するスルーレートは約２．０ｋＧ／ｓ乃至約５０．０ｋＧ／ｓである、請求項２に記載の方法。
9. 前記装置は、約６５％乃至約８０％のデューティサイクルで動作する、請求項２に記載の方法。
10. 前記装置は、約１時間乃至約１２００時間の暴露時間にわたって動作する、請求項２に記載の方法。
11. ヒトの軟骨細胞に関する前記哺乳動物の遺伝子の発現レベルは、約１０Ｈｚの周波数；約５００ｍｓの波長；約２．０ｋＧ／ｓから約４．５ｋＧ／ｓの間の増加するスルーレート；約４．５ｋＧ／ｓから約１５．５ｋＧ／ｓの間の低下するスルーレート；約８０％または約３０％のデューティサイクル、および７２０時間の暴露時間にわたる約０．０５９Ｇまたは０．６５ＧのＢ場の規模、を備えた実質的に二相の正方形の波形の時間と共に変化する刺激領域によって調節される、請求項１に記載の方法。
12. ヒトの骨芽細胞に関する前記哺乳動物の遺伝子の発現レベルは、約１０Ｈｚ乃至約１５Ｈｚの周波数；約５００ｍｓの波長；約２．０ｋＧ／ｓから約４．５ｋＧ／ｓの間の増加するスルーレート；約４．５ｋＧ／ｓから約１５．５ｋＧ／ｓの間の低下するスルーレート；約８０％または約３０％のデューティサイクル、および７２０時間の暴露時間にわたる約０．６５ＧのＢ場の規模、を備えた実質的に二相の正方形の波形の時間と共に変化する刺激領域によって調節される、請求項１に記載の方法。
13. 関心対象の前記哺乳動物の細胞または組織を、ビタミンＤ、ビタミンＫ、またはビタミンＤとビタミンＫの組み合わせに接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. 哺乳動物の遺伝子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために用いられる少なくとも１つの時間とともに変化する刺激領域のＢ場の規模、増加するスルーレート、立ち上がり時間、低下するスルーレート、立ち下がり時間、周波数、波長、デューティサイクル、および、サンプル暴露時間または時間系列を測定する方法であって、
    少なくとも１つの回転壁式容器中の細胞サンプルを少なくとも１つの前記時間とともに変化する刺激領域に晒す工程、
    前記細胞サンプルに対して遺伝子発現解析を行う工程、および、
    前記哺乳動物の遺伝子を調節するために、時間とともに変化する刺激領域の前記Ｂ場の規模、前記増加するスルーレート、前記立ち上がり時間、前記低下するスルーレート、前記立ち下がり時間、前記周波数、前記波長、前記デューティサイクル、および、前記サンプル暴露時間または時間系列を変更する工程、を含む、方法。
15. 哺乳動物の遺伝子を優先的に活性化させる方法であって、
    時間とともに変化する刺激領域を生成する装置を用いて少なくとも１つの時間とともに変化する刺激領域を生成する工程であって、前記時間とともに変化する刺激領域が哺乳動物の遺伝子を活性化する、工程、
    少なくとも１つの時間とともに変化する刺激領域のＢ場の規模、増加するスルーレート、立ち上がり時間、低下するスルーレート、立ち下がり時間、周波数、波長、デューティサイクル、および、サンプル暴露時間または時間系列を、哺乳動物の遺伝子を活性化するためのあらかじめ決められた値に操作する工程、および、
    前記少なくとも１つの時間とともに変化する刺激領域に細胞のサンプルを晒す工程、
    を含む、方法。
16. 関心対象の前記哺乳動物の細胞または組織を、ビタミンＤ、ビタミンＫ、またはビタミンＤとビタミンＫの組み合わせに接触させる工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記時間とともに変化する刺激領域を生成する装置は、動力源、前記動力源に動作可能に接続された制御構成要素、および前記制御構成要素と前記動力源に動作可能に接続された送信構成要素を含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記哺乳動物の遺伝子は、軟骨、骨、またはその組み合わせの、回復、修復、維持の原因である、請求項１５に記載の方法。
19. 前記哺乳動物の遺伝子は骨形成タンパク質、アクチン、トロンボスポンジン、ラミニン、プロテオグリカン、コラーゲン、腫瘍壊死因子、形質転換増殖因子、細胞骨格遺伝子、またはこれらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
20. 前記時間とともに変化する刺激領域は実質的に正方形の二相の波形の形態である、請求項１５に記載の方法。
21. 前記Ｂ場は約０．６Ｇ乃至約５０Ｇの間である、請求項１５に記載の方法。
22. 前記Ｂ場の周波数は約１０Ｈｚ乃至約１６Ｈｚである、請求項１５に記載の方法。
23. 前記立ち上がり時間は約０．７５ｍｓ乃至１ｍｓであり、前記増加するスルーレートは約２．０ｋＧ／ｓ乃至約４．５ｋＧ／ｓである、請求項１５に記載の方法。
24. 前記立ち下がり時間は約１２５μｓ乃至３００μｓであり、前記低下するスルーレートは約４．５ｋＧ／ｓ乃至約１５．５ｋＧ／ｓである、請求項１５に記載の方法。
25. 前記デューティサイクルは約６５％乃至約８０％である、請求項１５に記載の方法。
26. 前記Ｂ場の規模は約０．６５Ｇである、請求項１５に記載の方法。
27. 前記周波数は約１０Ｈｚである、請求項１５に記載の方法。
28. 前記細胞のサンプルは損傷を受けた軟骨、骨、またはその組み合わせである、請求項１５に記載の方法。