JPH0691821B2 - 細胞の電気化学的制御方法 - Google Patents
細胞の電気化学的制御方法Info
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- JPH0691821B2 JPH0691821B2 JP10210992A JP10210992A JPH0691821B2 JP H0691821 B2 JPH0691821 B2 JP H0691821B2 JP 10210992 A JP10210992 A JP 10210992A JP 10210992 A JP10210992 A JP 10210992A JP H0691821 B2 JPH0691821 B2 JP H0691821B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は各種細胞の電気化学的制
御方法に係わり、より詳しくは微生物、動植物等の、細
胞の種類の新規な制御方法に関する。
御方法に係わり、より詳しくは微生物、動植物等の、細
胞の種類の新規な制御方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】微生物
等の種類の分類学的識別乃至同定は、臨床検査分野を始
めとして広汎な各種産業分野等に於いて極めて重要な位
置を占めているものであるが、その実施は所謂選択培地
を使用したコロニー計数法、顕微鏡直接観察法等に依る
ものであるため、著しく煩雑且つ長時間を要するものと
ならざるを得なかった。
等の種類の分類学的識別乃至同定は、臨床検査分野を始
めとして広汎な各種産業分野等に於いて極めて重要な位
置を占めているものであるが、その実施は所謂選択培地
を使用したコロニー計数法、顕微鏡直接観察法等に依る
ものであるため、著しく煩雑且つ長時間を要するものと
ならざるを得なかった。
【０００３】他方、本発明者らは、先に生細胞が電極に
直接接触すると電流が得られる現象を発見し、この現象
を利用した電気化学的菌数計数法を提案した〔アナリテ
ィカケミカ アクタ、Anal. Chim. Acta, 98, 25(197
8); アプライド アンド エンバイアンメンタル マイ
クロバイオロジー、Appl. Environ. Microbiol., 37,11
7(1979) ；及び、ヨーロピアン ジャーナル オブ ア
プライド マイクロバイオロジー アンド バイオテク
ノロジー、Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1
0, 125(1980) 〕ものであるが、細胞の種類、菌学的性
質等の識別更にはその機作等に関しては全然未解明であ
った。
直接接触すると電流が得られる現象を発見し、この現象
を利用した電気化学的菌数計数法を提案した〔アナリテ
ィカケミカ アクタ、Anal. Chim. Acta, 98, 25(197
8); アプライド アンド エンバイアンメンタル マイ
クロバイオロジー、Appl. Environ. Microbiol., 37,11
7(1979) ；及び、ヨーロピアン ジャーナル オブ ア
プライド マイクロバイオロジー アンド バイオテク
ノロジー、Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1
0, 125(1980) 〕ものであるが、細胞の種類、菌学的性
質等の識別更にはその機作等に関しては全然未解明であ
った。
【０００４】上記に鑑み本発明者らは更に鋭意研究の結
果、細胞と作用電極との接触で得られる電流は、主とし
て、細胞の細胞壁中に存在する補酵素Ａ乃至類似物等の
活性物質と電極間の電子の授受によるものであること、
及び、所謂サイクリックボルタメトリを始めとして、微
分パルスボルタメトリ、微分パルスポーラログラフ、位
相差弁別交流ポーラログラフ或いは矩形波ポーラログラ
フ等々の手法に準じて細胞に走査電位を印加し、生起す
る電流値又は微分電流値を測定すれば極めて高精度に細
胞の種類が識別され得ることを知見した。
果、細胞と作用電極との接触で得られる電流は、主とし
て、細胞の細胞壁中に存在する補酵素Ａ乃至類似物等の
活性物質と電極間の電子の授受によるものであること、
及び、所謂サイクリックボルタメトリを始めとして、微
分パルスボルタメトリ、微分パルスポーラログラフ、位
相差弁別交流ポーラログラフ或いは矩形波ポーラログラ
フ等々の手法に準じて細胞に走査電位を印加し、生起す
る電流値又は微分電流値を測定すれば極めて高精度に細
胞の種類が識別され得ることを知見した。
【０００５】更に、微分パルスボルタメトリ、微分パル
スポーラログラフ、位相差弁別交流ポーラログラフ或い
は矩形波ポーラログラフ等々の手法に準じて、細胞に漸
増走査電位とこれに重畳された適切な微小電位とを印加
し、４，４’−ビピリジンにより増強されて生起する微
分電流値を測定すれば極めて高精度に細胞の種類が識別
され得ることを知見した。
スポーラログラフ、位相差弁別交流ポーラログラフ或い
は矩形波ポーラログラフ等々の手法に準じて、細胞に漸
増走査電位とこれに重畳された適切な微小電位とを印加
し、４，４’−ビピリジンにより増強されて生起する微
分電流値を測定すれば極めて高精度に細胞の種類が識別
され得ることを知見した。
【０００６】すなわち、上記方法により得られる電流−
電位曲線（ボルタモグラム、Voltammogram）又は微分電
流−電位曲線（微分パルスボルタモグラム）、乃至電流
値又は微分電流値の極値を与える電位値（ピーク電位
値）、或いは曲線パターン等は、細胞の種類に応じて相
互に相違するので、これにより各細胞（微生物）相互の
弁別、同定が極めて明瞭に達成され得るものとなる。な
お、上記のピーク電位値は、各種ポーラログラフの手法
によれば半波電位値として求められるものである。
電位曲線（ボルタモグラム、Voltammogram）又は微分電
流−電位曲線（微分パルスボルタモグラム）、乃至電流
値又は微分電流値の極値を与える電位値（ピーク電位
値）、或いは曲線パターン等は、細胞の種類に応じて相
互に相違するので、これにより各細胞（微生物）相互の
弁別、同定が極めて明瞭に達成され得るものとなる。な
お、上記のピーク電位値は、各種ポーラログラフの手法
によれば半波電位値として求められるものである。
【０００７】更に、本発明者が見出したところによれ
ば、メンブラン・フィルタ等の支持体上に細胞等を高密
度に集積させ、作用電極に接触させれば、増強された電
流値又は微分電流値が観測されるので、例えば、測定対
象が細胞希薄懸濁液等の場合も、これをフィルタ処理し
て支持体（濾材）上に集積させて測定することにより、
明瞭判明な識別が可能になる。
ば、メンブラン・フィルタ等の支持体上に細胞等を高密
度に集積させ、作用電極に接触させれば、増強された電
流値又は微分電流値が観測されるので、例えば、測定対
象が細胞希薄懸濁液等の場合も、これをフィルタ処理し
て支持体（濾材）上に集積させて測定することにより、
明瞭判明な識別が可能になる。
【０００８】こうして求められる細胞固有のピーク電位
値について更に研究したところ、各種細胞は、上記の固
有のピーク電位値又はその近傍の電位を外から印加され
ると、呼吸活性等の細胞活性が選択的且つ効果的に抑制
制御されるという驚くべき事実も本発明者は見出した。
従って、本発明は細胞の電気化学的制御方法を提供する
ものである。
値について更に研究したところ、各種細胞は、上記の固
有のピーク電位値又はその近傍の電位を外から印加され
ると、呼吸活性等の細胞活性が選択的且つ効果的に抑制
制御されるという驚くべき事実も本発明者は見出した。
従って、本発明は細胞の電気化学的制御方法を提供する
ものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）制御対
象細胞が電極に接触する条件下で前記電極に走査電位を
印加して生起する電流値または微分電流値から制御対象
細胞固有のピーク電位値を求め、（２）作用電極及び対
向電極を設けた液体中において、前記の細胞固有のピー
ク電位値又はその近傍の電位を前記作用電極に与えるこ
とにより、前記作用電極に接触させた支持体上に担持さ
れた細胞又は前記液体中の細胞の増殖を制御することを
特徴とする細胞の電気化学的制御方法に関する。
象細胞が電極に接触する条件下で前記電極に走査電位を
印加して生起する電流値または微分電流値から制御対象
細胞固有のピーク電位値を求め、（２）作用電極及び対
向電極を設けた液体中において、前記の細胞固有のピー
ク電位値又はその近傍の電位を前記作用電極に与えるこ
とにより、前記作用電極に接触させた支持体上に担持さ
れた細胞又は前記液体中の細胞の増殖を制御することを
特徴とする細胞の電気化学的制御方法に関する。
【００１０】制御対象細胞に固有のピーク電位値を測定
し、同時にその制御対象細胞を識別する方法は種々考え
られるが、それらの方法において本発明者が見出した特
に好ましい測定・識別方法を最初に説明し、続いてその
ピーク電位値を利用する本発明の制御方法について以下
に説明する。測定乃至制御対象 細菌類、放線菌、カビ類、微細藻類、酵母類等の各種微
生物、赤血球、白血球、腫瘍細胞及び培養動植物細胞等
々の各種動植物細胞など、殆ど全ての細胞が識別乃至制
御対象となり得る。又、細胞を識別する場合において
は、生細胞をそのまま用いるのみでなく、例えば、生細
胞を超音波破壊処理して得られる溶出液を放出した細
胞、主に細胞壁を用いてもよい。
し、同時にその制御対象細胞を識別する方法は種々考え
られるが、それらの方法において本発明者が見出した特
に好ましい測定・識別方法を最初に説明し、続いてその
ピーク電位値を利用する本発明の制御方法について以下
に説明する。測定乃至制御対象 細菌類、放線菌、カビ類、微細藻類、酵母類等の各種微
生物、赤血球、白血球、腫瘍細胞及び培養動植物細胞等
々の各種動植物細胞など、殆ど全ての細胞が識別乃至制
御対象となり得る。又、細胞を識別する場合において
は、生細胞をそのまま用いるのみでなく、例えば、生細
胞を超音波破壊処理して得られる溶出液を放出した細
胞、主に細胞壁を用いてもよい。
【００１１】細胞の識別乃至判定 ボルタメトリ等によって、作用電極に走査電位を印加
し、走査電位の印加により生起する電流値又は微分電流
値を測定することにより得られる、細胞−電極間のピー
ク電位値或いは電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線
の形状は、測定に用いられる細胞の細胞壁或いは細胞膜
の特性に起因するものである。
し、走査電位の印加により生起する電流値又は微分電流
値を測定することにより得られる、細胞−電極間のピー
ク電位値或いは電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線
の形状は、測定に用いられる細胞の細胞壁或いは細胞膜
の特性に起因するものである。
【００１２】例えば後記各参考例に示す通り、バチルス
・スブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトバチリス
・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum）、スト
レプトコッカス・サンギス（Streptococcus sanguis ）
及びスタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylo
coccus epidermidis）のようなグラム陽性菌に於けるピ
ーク電位値、電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線
と、上記グラム陽性菌よりも複雑な細胞壁構造を有する
大腸菌（Escherichia coli）及びサルモネラ・チィフィ
ムリウム（Salmonella typhymurium）のようなグラム陰
性菌に於けるピーク電位値、電流−電位曲線又は微分電
流−電位曲線との間には明確な差異が見られる。従っ
て、前記方法に依れば、多種多様の細胞の識別、例え
ば、各種細胞の菌学的弁別、同定、具体的には、グラム
陰陽性菌の分別、所謂エイムズ(Ames)テストに於ける変
異復帰又は非復帰菌株の弁別等々、適切な測定条件を設
定すれば極めて広範囲に亘る識別が可能となるものであ
る。
・スブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトバチリス
・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum）、スト
レプトコッカス・サンギス（Streptococcus sanguis ）
及びスタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylo
coccus epidermidis）のようなグラム陽性菌に於けるピ
ーク電位値、電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線
と、上記グラム陽性菌よりも複雑な細胞壁構造を有する
大腸菌（Escherichia coli）及びサルモネラ・チィフィ
ムリウム（Salmonella typhymurium）のようなグラム陰
性菌に於けるピーク電位値、電流−電位曲線又は微分電
流−電位曲線との間には明確な差異が見られる。従っ
て、前記方法に依れば、多種多様の細胞の識別、例え
ば、各種細胞の菌学的弁別、同定、具体的には、グラム
陰陽性菌の分別、所謂エイムズ(Ames)テストに於ける変
異復帰又は非復帰菌株の弁別等々、適切な測定条件を設
定すれば極めて広範囲に亘る識別が可能となるものであ
る。
【００１３】測定諸条件及び適用分野 装置としては通常の各種ボルタメトリ用装置が使用され
得るものであるが、サイクリックボルタメトリ用装置の
１例につき模式説明図を示せば図１の通りである。
得るものであるが、サイクリックボルタメトリ用装置の
１例につき模式説明図を示せば図１の通りである。
【００１４】すなわち、例示の装置は作用電極１、対向
電極２及び飽和塩化ナトリウム甘汞電極（以下ＳＳＣＥ
という）、飽和塩化カリウム甘汞電極（以下ＳＣＥとい
う）等の参照極３を具備する電解セル４、ポテンシオス
タット５、線型走査乃至掃引電源６及びＸＹ記録計乃至
シンクロスコープ７より構成されている。
電極２及び飽和塩化ナトリウム甘汞電極（以下ＳＳＣＥ
という）、飽和塩化カリウム甘汞電極（以下ＳＣＥとい
う）等の参照極３を具備する電解セル４、ポテンシオス
タット５、線型走査乃至掃引電源６及びＸＹ記録計乃至
シンクロスコープ７より構成されている。
【００１５】ここに於いて、作用電極１、対向電極２と
しては通常の白金、金、銀、水銀、炭素等々の電極及び
これらを電導性高分子等で被覆等の各種修飾電極が使用
され得、又、対向電極２の電位が安定不変である場合は
参照電極３を欠く通常のポーラログラフと同等の回路構
成で足りる。電圧制御装置としては、ポテンシオスタッ
ト及び線型走査乃至掃引電源が必要である。ただし、定
電位電解により細胞の制御を行う際には、ポテンシオス
タットがあればよい。
しては通常の白金、金、銀、水銀、炭素等々の電極及び
これらを電導性高分子等で被覆等の各種修飾電極が使用
され得、又、対向電極２の電位が安定不変である場合は
参照電極３を欠く通常のポーラログラフと同等の回路構
成で足りる。電圧制御装置としては、ポテンシオスタッ
ト及び線型走査乃至掃引電源が必要である。ただし、定
電位電解により細胞の制御を行う際には、ポテンシオス
タットがあればよい。
【００１６】尚、電解セルの具体例としては、図３に示
すとおり、測定対象である細胞（１０７）を保持する支
持体乃至フィルタ（１０８）を接触させた作用電極（１
０５）、これを支えるプラスチック等のケース（１０
９）、対向電極（１０４）及びガラスチューブで仕切ら
れた参照電極（１０６）をリン酸緩衝液中に浸して成る
電極システムが例示される。
すとおり、測定対象である細胞（１０７）を保持する支
持体乃至フィルタ（１０８）を接触させた作用電極（１
０５）、これを支えるプラスチック等のケース（１０
９）、対向電極（１０４）及びガラスチューブで仕切ら
れた参照電極（１０６）をリン酸緩衝液中に浸して成る
電極システムが例示される。
【００１７】上記細胞保持用の支持体乃至フィルタとし
ては、各種合成樹脂多孔質膜、例えば、東洋メンブラン
フィルタ（東洋濾紙株式会社製）又はミリポアフィルタ
（日本ミリポアリミテッド製）、或いは寒天、アルギン
酸等のゲル化剤或いは活性炭等の多孔質基材等を適宜選
択使用し得る。
ては、各種合成樹脂多孔質膜、例えば、東洋メンブラン
フィルタ（東洋濾紙株式会社製）又はミリポアフィルタ
（日本ミリポアリミテッド製）、或いは寒天、アルギン
酸等のゲル化剤或いは活性炭等の多孔質基材等を適宜選
択使用し得る。
【００１８】測定は、支持体にメンブランフィルタを使
用する場合は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによ
りろ過し、細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブラ
ンフィルタを作用電極１に接触し、又は、支持体に寒天
を使用する場合は、寒天入り水溶液に細胞を懸濁してゲ
ル化したものを作用電極１に接触させ、電極間に周期的
走査（掃引）電位を印加して生起する電流を測定するこ
とによりなされるが、通常、その電位走査としては時間
に比例して電位を変化させる所謂線型走査（Linear Swe
ep）が好適に採用される。
用する場合は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによ
りろ過し、細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブラ
ンフィルタを作用電極１に接触し、又は、支持体に寒天
を使用する場合は、寒天入り水溶液に細胞を懸濁してゲ
ル化したものを作用電極１に接触させ、電極間に周期的
走査（掃引）電位を印加して生起する電流を測定するこ
とによりなされるが、通常、その電位走査としては時間
に比例して電位を変化させる所謂線型走査（Linear Swe
ep）が好適に採用される。
【００１９】このようにして得られる電流−電位曲線
は、後に詳述する通り細胞濃度に比例する極大電流値
（ピーク電流値）を与えるのみならず、細胞の種類によ
り相違するピーク電位値やその曲線形状等の特異性によ
り、細菌等の微生物の同定に充分な情報をも与えるもの
となる。すなわち、前記方法によれば、細胞の識別に際
し、応答時間ひいては測定時間の著しい短縮が計られ
る。さらに、測定が走査電位によるため、電極反応に於
ける攪乱的諸要因が排除され得るので、より精密且つ正
確な測定が可能となり、並びに、細胞濃度（数）のみな
らずその種類の同定も同時になされ得る等々の実用上多
大の利点が得られるものである。従って、前記の方法
は、醗酵プロセスのリアル・タイム制御用センサ、水質
の微生物汚染度の測定、赤血球や白血球数の測定等々、
広汎な各分野に於けるセンサ手段として極めて有用なも
のと云い得る。
は、後に詳述する通り細胞濃度に比例する極大電流値
（ピーク電流値）を与えるのみならず、細胞の種類によ
り相違するピーク電位値やその曲線形状等の特異性によ
り、細菌等の微生物の同定に充分な情報をも与えるもの
となる。すなわち、前記方法によれば、細胞の識別に際
し、応答時間ひいては測定時間の著しい短縮が計られ
る。さらに、測定が走査電位によるため、電極反応に於
ける攪乱的諸要因が排除され得るので、より精密且つ正
確な測定が可能となり、並びに、細胞濃度（数）のみな
らずその種類の同定も同時になされ得る等々の実用上多
大の利点が得られるものである。従って、前記の方法
は、醗酵プロセスのリアル・タイム制御用センサ、水質
の微生物汚染度の測定、赤血球や白血球数の測定等々、
広汎な各分野に於けるセンサ手段として極めて有用なも
のと云い得る。
【００２０】他方、細胞識別に特に有用な微分パルスボ
ルタメトリ用装置の１例につき模式説明図を示せば図２
の通りである。すなわち、例示の装置は平面熱分解黒鉛
（以下ＢＰＧという）、高純度分光分析用カーボン（以
下ＨＰＧという）等の黒鉛、炭素、白金、金、銀、水銀
等々より成る作用電極１１及び対向電極１２とＳＳＣ
Ｅ、ＳＣＥ等の参照電極１３を具備するセル１４、パル
スシーケンサ１５、ポテンシャルプログラマ１６、ポテ
ンシオスタット１７、ドロップノッカ１８、電流−電圧
コンバータ１９、サンプル／ホルド（τ）１１０及び同
（τ’）１１１、ディファレンシャルアンプリファイア
１１２及びレコーダ１１３より構成され、公知のシステ
ムで微分パルス電位を印加し記録するものである。電圧
制御装置としては、ポテンシオスタット、パルスシーケ
ンサ、及びポテンシャルプログラマが必要である。ただ
し、定電位電解により細胞の制御を行う際には、ポテン
シオスタットがあればよい。
ルタメトリ用装置の１例につき模式説明図を示せば図２
の通りである。すなわち、例示の装置は平面熱分解黒鉛
（以下ＢＰＧという）、高純度分光分析用カーボン（以
下ＨＰＧという）等の黒鉛、炭素、白金、金、銀、水銀
等々より成る作用電極１１及び対向電極１２とＳＳＣ
Ｅ、ＳＣＥ等の参照電極１３を具備するセル１４、パル
スシーケンサ１５、ポテンシャルプログラマ１６、ポテ
ンシオスタット１７、ドロップノッカ１８、電流−電圧
コンバータ１９、サンプル／ホルド（τ）１１０及び同
（τ’）１１１、ディファレンシャルアンプリファイア
１１２及びレコーダ１１３より構成され、公知のシステ
ムで微分パルス電位を印加し記録するものである。電圧
制御装置としては、ポテンシオスタット、パルスシーケ
ンサ、及びポテンシャルプログラマが必要である。ただ
し、定電位電解により細胞の制御を行う際には、ポテン
シオスタットがあればよい。
【００２１】測定は、支持体にメンブランフィルタを使
用する場合は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによ
りろ過し、細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブラ
ンフィルタをセル１４中の作用電極１１に接触させ、又
は、支持体に寒天を使用する場合は、寒天入り水溶液に
細胞を懸濁してゲル化したものをセル１４中の作用電極
１１に接触させ、電極間に微小電位の重畳された漸増走
査（掃引）電位を印加して、生起する微分電流を測定す
ることによりなされるが、通常、その電位走査としては
時間に比例して電位を変化させる所謂線型走査（Linear
Sweep）が好適に採用される。走査電位に重畳される微
小電位としては、前述の通り、微分電流値を与え得る適
切な波形及び周期を有するものが適宜選択使用され得
る。
用する場合は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによ
りろ過し、細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブラ
ンフィルタをセル１４中の作用電極１１に接触させ、又
は、支持体に寒天を使用する場合は、寒天入り水溶液に
細胞を懸濁してゲル化したものをセル１４中の作用電極
１１に接触させ、電極間に微小電位の重畳された漸増走
査（掃引）電位を印加して、生起する微分電流を測定す
ることによりなされるが、通常、その電位走査としては
時間に比例して電位を変化させる所謂線型走査（Linear
Sweep）が好適に採用される。走査電位に重畳される微
小電位としては、前述の通り、微分電流値を与え得る適
切な波形及び周期を有するものが適宜選択使用され得
る。
【００２２】このようにして得られる微分電流−電位曲
線は、細胞の種類によって相違する明瞭なピーク電位値
を与え、これによりそれらの識別を可能とするのみなら
ず、そのピーク波形の解析により細菌等の微生物の電気
化学的活性に関する情報をも与えるものとなる。すなわ
ち、前記方法に依れば、各種細菌等の識別、同定が極め
て短時間且つ容易に達成されるものである。
線は、細胞の種類によって相違する明瞭なピーク電位値
を与え、これによりそれらの識別を可能とするのみなら
ず、そのピーク波形の解析により細菌等の微生物の電気
化学的活性に関する情報をも与えるものとなる。すなわ
ち、前記方法に依れば、各種細菌等の識別、同定が極め
て短時間且つ容易に達成されるものである。
【００２３】ここで、前記方法においては、細胞−電極
間の電子伝達の重要な賦活剤である４，４’−ビピリジ
ン（以下ＢＰという）を使用してもよく、その使用条件
について要約して示せば次の通りである。すなわち、Ｂ
Ｐは、緩衝液中に直接添加されるか、或いはニトロセル
ロース膜等に固定されて電極に接触されることにより細
胞−電極間反応に関与するものとなる。尚、緩衝液中に
於けるＢＰの濃度は、対象細胞の種類によって変動する
ものであるが、一般には数ｍＭ〜１００ｍＭ程度が好ま
しい。後記参考例にも示す通り、ＢＰ共存下で走査電位
を印加し、走査電位の印加により生起する電流値又は微
分電流値を測定することにより、各種細胞のピーク電流
値の１．５〜２．５倍程度の増強及び波形の鮮明化、微
分電流値のピークの先鋭化がもたらされるものとなる。
尚、高精度の測定が必要でないときは、賦活剤は省略で
きる。
間の電子伝達の重要な賦活剤である４，４’−ビピリジ
ン（以下ＢＰという）を使用してもよく、その使用条件
について要約して示せば次の通りである。すなわち、Ｂ
Ｐは、緩衝液中に直接添加されるか、或いはニトロセル
ロース膜等に固定されて電極に接触されることにより細
胞−電極間反応に関与するものとなる。尚、緩衝液中に
於けるＢＰの濃度は、対象細胞の種類によって変動する
ものであるが、一般には数ｍＭ〜１００ｍＭ程度が好ま
しい。後記参考例にも示す通り、ＢＰ共存下で走査電位
を印加し、走査電位の印加により生起する電流値又は微
分電流値を測定することにより、各種細胞のピーク電流
値の１．５〜２．５倍程度の増強及び波形の鮮明化、微
分電流値のピークの先鋭化がもたらされるものとなる。
尚、高精度の測定が必要でないときは、賦活剤は省略で
きる。
【００２４】電流生成のメカニズム 細胞−電極間の電子授受は補酵素Ａの存在と密接な関係
を持つと考えられる。したがって、ピーク電流値は代謝
経路と関係していることが推定される。そこでサッカロ
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の懸
濁液（２．４×１０8 個／ml）に代謝阻害剤であるロテ
ノン（７．６ｍＭ）、アンティマイシン（５．７ｍ
Ｍ）、青酸塩（１０．８ｍＭ）、亜ヒ酸塩（１０．０ｍ
Ｍ）を各々添加し、走査電位を印加して生起する電流値
を測定した。
を持つと考えられる。したがって、ピーク電流値は代謝
経路と関係していることが推定される。そこでサッカロ
ミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の懸
濁液（２．４×１０8 個／ml）に代謝阻害剤であるロテ
ノン（７．６ｍＭ）、アンティマイシン（５．７ｍ
Ｍ）、青酸塩（１０．８ｍＭ）、亜ヒ酸塩（１０．０ｍ
Ｍ）を各々添加し、走査電位を印加して生起する電流値
を測定した。
【００２５】その結果、ロテノン、アンティマイシン及
び青酸塩の添加によってはピーク電流値は減少しなかっ
た。一方、亜ヒ酸塩の添加によって４．８μＡから３．
７μＡの減少が観察された。ロテノンは、ＮＡＤＨデヒ
ドロゲナーゼに於ける電子授受を特異的に阻害し、アン
ティマイシンはチトクロムｂ、チトクロムｃ間の電子の
移動を阻害し、青酸塩はチトクロムオキシダーゼとＯ2
との間の電子の移動を阻害する。一方、亜ヒ酸塩はピル
ビン酸デヒドロゲナーゼを阻害することが知られてい
る。従って、ピーク電流の生成は、ピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼとクエン酸回路に関係していることが推定され
た。
び青酸塩の添加によってはピーク電流値は減少しなかっ
た。一方、亜ヒ酸塩の添加によって４．８μＡから３．
７μＡの減少が観察された。ロテノンは、ＮＡＤＨデヒ
ドロゲナーゼに於ける電子授受を特異的に阻害し、アン
ティマイシンはチトクロムｂ、チトクロムｃ間の電子の
移動を阻害し、青酸塩はチトクロムオキシダーゼとＯ2
との間の電子の移動を阻害する。一方、亜ヒ酸塩はピル
ビン酸デヒドロゲナーゼを阻害することが知られてい
る。従って、ピーク電流の生成は、ピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼとクエン酸回路に関係していることが推定され
た。
【００２６】また後記参考例に示すように、細胞壁に存
在する化合物を超音波処理することにより得られた、超
音波処理細胞乃至細胞壁及びその溶出液のピーク電流値
を測定した。その結果、該細胞乃至細胞壁からのピーク
電流値（ピーク電位値：０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＳＣ
Ｅ）は減少したが、溶出液のピーク電流値（ピーク電位
値：０．６５Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥ）は次第に増加し
た。超音波処理によって細胞の数が影響されることはな
いので、上記の結果は、細胞壁中の電気化学的に活性な
物質が超音波処理によって溶出し、電気化学的に検出さ
れたことを示す。
在する化合物を超音波処理することにより得られた、超
音波処理細胞乃至細胞壁及びその溶出液のピーク電流値
を測定した。その結果、該細胞乃至細胞壁からのピーク
電流値（ピーク電位値：０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＳＣ
Ｅ）は減少したが、溶出液のピーク電流値（ピーク電位
値：０．６５Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥ）は次第に増加し
た。超音波処理によって細胞の数が影響されることはな
いので、上記の結果は、細胞壁中の電気化学的に活性な
物質が超音波処理によって溶出し、電気化学的に検出さ
れたことを示す。
【００２７】溶出液の波長２６０ｎｍに於ける吸収はア
デニン環と関連を有し、細胞懸濁液を超音波処理すると
ピーク電流値と共に増大する。アデニン環を持つ補酵素
であるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＭＮＨ2 、ＦＡＤ
Ｈ2 、及び補酵素Ａは電気化学的に酸化され得るが、Ｎ
ＡＤＨとＮＡＤＰＨに相当する波長３４０ｎｍに於ける
吸収及びＦＭＮＨ2 、ＦＡＤＨ2 に相当する波長４４５
〜４５０ｎｍに於ける吸収は、溶出液より得られなかっ
た。
デニン環と関連を有し、細胞懸濁液を超音波処理すると
ピーク電流値と共に増大する。アデニン環を持つ補酵素
であるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＭＮＨ2 、ＦＡＤ
Ｈ2 、及び補酵素Ａは電気化学的に酸化され得るが、Ｎ
ＡＤＨとＮＡＤＰＨに相当する波長３４０ｎｍに於ける
吸収及びＦＭＮＨ2 、ＦＡＤＨ2 に相当する波長４４５
〜４５０ｎｍに於ける吸収は、溶出液より得られなかっ
た。
【００２８】さらに、炭素電極における、ＮＡＤＨとＮ
ＡＤＰＨの半波電位値（本発明のピーク電位値）は、
０．３５〜０．７５Ｖ ｖｓ． ＳＣＥの範囲であっ
た。ＦＭＮＨ2 とＦＡＤＨ2 は、−０．４Ｖ ｖｓ．Ｓ
ＣＥに於いて電気化学的に酸化されることが報告されて
いる。又、ＢＰＧ電極を用いてＮＡＤＨ及び補酵素Ａの
電流−電位曲線を得たところ、ＮＡＤＨのピーク電流値
は０．３５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであったのに対し、補酵
素Ａのピーク電流値は０．６５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥに於
いて各々観察された。以上から、補酵素Ａのピーク電位
値は、超音波処理した細胞からのそれと類似しているこ
とがわかった。
ＡＤＰＨの半波電位値（本発明のピーク電位値）は、
０．３５〜０．７５Ｖ ｖｓ． ＳＣＥの範囲であっ
た。ＦＭＮＨ2 とＦＡＤＨ2 は、−０．４Ｖ ｖｓ．Ｓ
ＣＥに於いて電気化学的に酸化されることが報告されて
いる。又、ＢＰＧ電極を用いてＮＡＤＨ及び補酵素Ａの
電流−電位曲線を得たところ、ＮＡＤＨのピーク電流値
は０．３５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであったのに対し、補酵
素Ａのピーク電流値は０．６５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥに於
いて各々観察された。以上から、補酵素Ａのピーク電位
値は、超音波処理した細胞からのそれと類似しているこ
とがわかった。
【００２９】次に、溶出液中の補酵素Ａをスタッドマン
等による方法〔E. R. Stadtman etal.,ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー、 J. Biol. Chem.,
191367(1951)〕で酵素学的に定量したところ、３．６
ｍＭの補酵素Ａが検出された。細胞を超音波処理すると
補酵素Ａの濃度は、溶出液のピーク電流値の増大と共に
増大するので、溶出液から得られるピーク電流値の増大
は、緩衝液中の補酵素Ａの濃度の増大に因ることが推定
される。換言すれば、細胞中の電極活性物質である補酵
素Ａが電極と接触し、酸化されて電流が流れやすくな
り、酸化波（陽極波 anodic wave）のピーク電流値が現
れるものと考えられる。一方、細胞壁に存在する補酵素
Ａは、緩衝液中に溶出するので、細胞乃至細胞壁より得
られるピーク電流値は減少した。
等による方法〔E. R. Stadtman etal.,ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー、 J. Biol. Chem.,
191367(1951)〕で酵素学的に定量したところ、３．６
ｍＭの補酵素Ａが検出された。細胞を超音波処理すると
補酵素Ａの濃度は、溶出液のピーク電流値の増大と共に
増大するので、溶出液から得られるピーク電流値の増大
は、緩衝液中の補酵素Ａの濃度の増大に因ることが推定
される。換言すれば、細胞中の電極活性物質である補酵
素Ａが電極と接触し、酸化されて電流が流れやすくな
り、酸化波（陽極波 anodic wave）のピーク電流値が現
れるものと考えられる。一方、細胞壁に存在する補酵素
Ａは、緩衝液中に溶出するので、細胞乃至細胞壁より得
られるピーク電流値は減少した。
【００３０】上記の結果は、細胞壁中に存在する補酵素
Ａは、細胞−炭素電極間の電子授受を仲介することを示
す。溶出液より得られるピーク電位値は、補酵素Ａのピ
ーク電位値と類似しており、細胞全体より得られるそれ
とは相違している。ピーク電位値は、ｐＨにより決ま
り、したがって上記の現象は、緩衝液と細胞壁に於ける
補酵素Ａを取り巻く環境との間でのｐＨの差異に基づく
ものであると推定される。
Ａは、細胞−炭素電極間の電子授受を仲介することを示
す。溶出液より得られるピーク電位値は、補酵素Ａのピ
ーク電位値と類似しており、細胞全体より得られるそれ
とは相違している。ピーク電位値は、ｐＨにより決ま
り、したがって上記の現象は、緩衝液と細胞壁に於ける
補酵素Ａを取り巻く環境との間でのｐＨの差異に基づく
ものであると推定される。
【００３１】細胞活性の電気化学的制御 後記実施例に示す通り、呼吸活性等の細胞活性は、その
細胞に固有のピーク電位値又はその近傍の電位値を印加
することにより選択的に制御され得るものであるが、そ
の実施に当っては、フィルタなどの支持体上に集積され
た細胞又は液体中の細胞（細胞懸濁液）を作用電極に接
触させて、これに所定ピーク電位を基準とした周期的走
査電位や定電位を所定時間印加すれば足りるものであ
る。故にこの制御方法は、微生物の選択的活性制御とい
う点で醗酵工学、遺伝子工学等々の各分野に於いて有力
手段として使用できる。
細胞に固有のピーク電位値又はその近傍の電位値を印加
することにより選択的に制御され得るものであるが、そ
の実施に当っては、フィルタなどの支持体上に集積され
た細胞又は液体中の細胞（細胞懸濁液）を作用電極に接
触させて、これに所定ピーク電位を基準とした周期的走
査電位や定電位を所定時間印加すれば足りるものであ
る。故にこの制御方法は、微生物の選択的活性制御とい
う点で醗酵工学、遺伝子工学等々の各分野に於いて有力
手段として使用できる。
【００３２】試験例 （１）グルコース４ｇ、ポリペプトン１ｇ、ＫＨ2 ＰＯ
4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇを含有
する培地１００ml（ｐＨ７．０）にサッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を、３０℃で１
８時間好気的条件下で培養した後、５℃、８０００×ｇ
で遠心分離に付し菌体を採集した。採集した菌体を、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２度洗浄し、こ
れを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０mlに懸濁
し（細胞濃度：９×１０8 個／ml）通気した。次に、上
記培養菌体を３０分間超音波処理し、５℃、８０００×
ｇで遠心分離に付し、溶出液を得、超音波処理細胞壁は
集めて緩衝液に再度懸濁させた。この細胞壁及びその溶
出液を試料として用いた。電解セル（容量約２５ml）、
ポテンシオスタット（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ
ＨＡ３０１）、線型走査電源（北斗電工株式会社製
Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０４）、及びＸＹ記録計（理研電子
Ｆ３５）を図１の通りに回路構成し、これをサイクリ
ックボルタメトリ用装置として使用した。尚、電解セル
を構成する作用電極はＢＰＧ電極であり、対向電極とし
て白金線電極、参照電極としてはＳＳＣＥを用いた。上
記サイクリックボルタメトリ用装置の電解セルに前記各
試料を注入し、２５±２℃の条件下サイクリックボルタ
モグラムを得、各試料のピーク電流値を経時的に測定し
た。
4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇを含有
する培地１００ml（ｐＨ７．０）にサッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を、３０℃で１
８時間好気的条件下で培養した後、５℃、８０００×ｇ
で遠心分離に付し菌体を採集した。採集した菌体を、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２度洗浄し、こ
れを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０mlに懸濁
し（細胞濃度：９×１０8 個／ml）通気した。次に、上
記培養菌体を３０分間超音波処理し、５℃、８０００×
ｇで遠心分離に付し、溶出液を得、超音波処理細胞壁は
集めて緩衝液に再度懸濁させた。この細胞壁及びその溶
出液を試料として用いた。電解セル（容量約２５ml）、
ポテンシオスタット（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ
ＨＡ３０１）、線型走査電源（北斗電工株式会社製
Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０４）、及びＸＹ記録計（理研電子
Ｆ３５）を図１の通りに回路構成し、これをサイクリ
ックボルタメトリ用装置として使用した。尚、電解セル
を構成する作用電極はＢＰＧ電極であり、対向電極とし
て白金線電極、参照電極としてはＳＳＣＥを用いた。上
記サイクリックボルタメトリ用装置の電解セルに前記各
試料を注入し、２５±２℃の条件下サイクリックボルタ
モグラムを得、各試料のピーク電流値を経時的に測定し
た。
【００３３】結果を図４〔縦軸：ピーク電流値（μ
Ａ）；横軸：時間（分）〕に示す。図中、曲線ａは溶出
液の、曲線ｂは細胞壁の、各値である。図から明らかな
ように、電気化学的活性物質は細胞内に存在し、超音波
処理により容易に溶出可能なものと認められる。尚、ピ
ーク電位は破壊されていない細胞（Whole Cell）では
０．７４Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであり、溶出液では０．６
５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥである。
Ａ）；横軸：時間（分）〕に示す。図中、曲線ａは溶出
液の、曲線ｂは細胞壁の、各値である。図から明らかな
ように、電気化学的活性物質は細胞内に存在し、超音波
処理により容易に溶出可能なものと認められる。尚、ピ
ーク電位は破壊されていない細胞（Whole Cell）では
０．７４Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであり、溶出液では０．６
５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥである。
【００３４】（２）次にスタッドマン等の方法により溶
出液中の活性物質を検定したところ、補酵素Ａ乃至その
類似物質であることが確認されたので、別途準備した
３．７ｍＭの補酵素Ａを用いて前記と同様にサイクリッ
クボルタメトリを行ったところ、そのピーク電位として
は前記の溶出液と同じ値である０．６５Ｖ ｖｓ． Ｓ
ＳＣＥの値が得られた。これらのことから、菌体中の補
酵素Ａがピーク電流に影響していることがわかる。
出液中の活性物質を検定したところ、補酵素Ａ乃至その
類似物質であることが確認されたので、別途準備した
３．７ｍＭの補酵素Ａを用いて前記と同様にサイクリッ
クボルタメトリを行ったところ、そのピーク電位として
は前記の溶出液と同じ値である０．６５Ｖ ｖｓ． Ｓ
ＳＣＥの値が得られた。これらのことから、菌体中の補
酵素Ａがピーク電流に影響していることがわかる。
【００３５】
【実施例】以下、参考例及び実施例によって本発明を更
に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するもの
ではない。参考例１ 図３は、細胞識別に用いる電極システムの一例を示すも
のである。この電極システムは、測定対象である細胞
（１０７）を支持する為の支持体であるメンブランフィ
ルタ（１０８）を装着した表面積０．１７cm2 のＢＰＧ
製作用電極（１０５）、白金線よりなる対向電極（１０
４）、ＳＣＥ参照電極（１０６）、ポテンシオスタット
（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＡ３０１）（１
０２）、線型走査電源（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅ
ｌ ＨＢ１０４）（１０１）、及びＸＹ記録計（理研電
子 Ｆ３５）（１０３）より成る。特に指定されている
場合を除き、電極はアルミナの水懸濁液を浸み込ませた
つや出し布で磨いた。上記３電極を有し、隔膜（１１
０）で隔てたガラス製の電解セルを用い、参照電極は、
先端が電解液の通過できるポーラスな焼結ガラスのフリ
ット（１０６ａ）で主要部と結合されたガラスチューブ
に浸すことによってセルの主要部から隔離されている。
に具体的に説明するが、これらは本発明を限定するもの
ではない。参考例１ 図３は、細胞識別に用いる電極システムの一例を示すも
のである。この電極システムは、測定対象である細胞
（１０７）を支持する為の支持体であるメンブランフィ
ルタ（１０８）を装着した表面積０．１７cm2 のＢＰＧ
製作用電極（１０５）、白金線よりなる対向電極（１０
４）、ＳＣＥ参照電極（１０６）、ポテンシオスタット
（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＡ３０１）（１
０２）、線型走査電源（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅ
ｌ ＨＢ１０４）（１０１）、及びＸＹ記録計（理研電
子 Ｆ３５）（１０３）より成る。特に指定されている
場合を除き、電極はアルミナの水懸濁液を浸み込ませた
つや出し布で磨いた。上記３電極を有し、隔膜（１１
０）で隔てたガラス製の電解セルを用い、参照電極は、
先端が電解液の通過できるポーラスな焼結ガラスのフリ
ット（１０６ａ）で主要部と結合されたガラスチューブ
に浸すことによってセルの主要部から隔離されている。
【００３６】大腸菌（Escherichia coli）を寒天培地で
３７℃で１２時間培養した後、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁させた。メンブランフィルタ（東
洋メンブランフィルタ ＴＭ−２タイプ、ニトロセルロ
ース、孔径０．４５μｍ、径２５ｍｍ）の上に上述の培
養細胞の懸濁液５mlをわずかに吸引しながら落とした。
次に、このメンブランフィルタの細胞付着側を炭素電極
表面に接触させ培養細胞が炭素電極と接触するようにし
た。電極システムをリン酸緩衝液中に挿入し２５±２℃
でサイクリックボルタモグラムを得た。
３７℃で１２時間培養した後、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁させた。メンブランフィルタ（東
洋メンブランフィルタ ＴＭ−２タイプ、ニトロセルロ
ース、孔径０．４５μｍ、径２５ｍｍ）の上に上述の培
養細胞の懸濁液５mlをわずかに吸引しながら落とした。
次に、このメンブランフィルタの細胞付着側を炭素電極
表面に接触させ培養細胞が炭素電極と接触するようにし
た。電極システムをリン酸緩衝液中に挿入し２５±２℃
でサイクリックボルタモグラムを得た。
【００３７】図５は０〜１．０Ｖ ｖｓ．ＳＣＥの電位
に於けるサイクリックボルタモグラムを示す〔縦軸：電
流値（μＡ）；横軸：電位（Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ）〕。プ
ラス方向への最初の走査に於いて０．７２Ｖ ｖｓ．Ｓ
ＣＥで陽極波のピーク電流値が現れた。逆の走査の際、
それに対応するような減少ピークは見られなかった。従
って、細胞の電極反応は不可逆的なものである。この参
考例の場合は、０．１〜１．９×１０9 個／mlの範囲で
のピーク電流値は、メンブランフィルタ上の細胞数に比
例していた。この結果は、メンブランフィルタ上の大腸
菌（Escherichia coli）の細胞数が、サイクリックボル
タメトリのピーク電流値から求められることを意味す
る。検出可能な最小限度の大腸菌（Escherichia coli）
の細胞数は５×１０7 個／ml（懸濁液換算）である。
に於けるサイクリックボルタモグラムを示す〔縦軸：電
流値（μＡ）；横軸：電位（Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ）〕。プ
ラス方向への最初の走査に於いて０．７２Ｖ ｖｓ．Ｓ
ＣＥで陽極波のピーク電流値が現れた。逆の走査の際、
それに対応するような減少ピークは見られなかった。従
って、細胞の電極反応は不可逆的なものである。この参
考例の場合は、０．１〜１．９×１０9 個／mlの範囲で
のピーク電流値は、メンブランフィルタ上の細胞数に比
例していた。この結果は、メンブランフィルタ上の大腸
菌（Escherichia coli）の細胞数が、サイクリックボル
タメトリのピーク電流値から求められることを意味す
る。検出可能な最小限度の大腸菌（Escherichia coli）
の細胞数は５×１０7 個／ml（懸濁液換算）である。
【００３８】参考例２ 参考例１と同様の電極システムを用い、バチルス・スブ
チリス（Bacillus subtilis ；グラム陽性）、ラクトバ
チリス・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum；
グラム陽性）、ストレプトコッカス・サンギス（Strept
ococcus sanguis ；グラム陽性）、スタフィロコッカス
・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis；グ
ラム陽性）、大腸菌（Escherichia coli；グラム陰
性）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonella typ
hymurium；グラム陰性）各々を前例と同様のメンブラン
フィルタ上に６×１０8 個保持し、それぞれのサイクリ
ックボルタメトリによるピーク電流値の現れる電位を測
定した。結果は下記表１に示す通りである。
チリス（Bacillus subtilis ；グラム陽性）、ラクトバ
チリス・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum；
グラム陽性）、ストレプトコッカス・サンギス（Strept
ococcus sanguis ；グラム陽性）、スタフィロコッカス
・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis；グ
ラム陽性）、大腸菌（Escherichia coli；グラム陰
性）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonella typ
hymurium；グラム陰性）各々を前例と同様のメンブラン
フィルタ上に６×１０8 個保持し、それぞれのサイクリ
ックボルタメトリによるピーク電流値の現れる電位を測
定した。結果は下記表１に示す通りである。
【００３９】
【表１】
【００４０】バチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s ）、ラクトバチリス・ファーメンタム（Lactobachill
us fermentum）、ストレプトコッカス・サンギス（Stre
ptococcus sanguis ）、スタフィロコッカス・エピデル
ミディス（Staphylococcus epidermidis）の様なグラム
陽性菌の細胞膜は、ペプチドグリカン及びティコイル酸
より成る細胞壁（代表的なもので、厚さ約２５０Å）に
囲まれている。大腸菌（Escherichia coli）及びサルモ
ネラ・チィフィムリウム（Salmonella typhymurium）の
様なグラム陰性菌の細胞壁及び細胞膜の構造はより複雑
であり、細胞膜は厚さ約３０Åのペプチドグリカンの壁
に取り囲まれ、その壁はさらにその外側が厚さ約８０Å
のタンパク質、脂質及びリポポリサッカライドのモザイ
クの膜で覆われている。上記の結果は、サイクリックボ
ルタメトリのピーク電位値には細胞壁の構造が影響する
ことを示している。すなわち、より複雑な膜で被覆され
ているグラム陰性菌のピーク電流は、グラム陽性菌のそ
れよりもプラス側の電位に於いて現れた。
s ）、ラクトバチリス・ファーメンタム（Lactobachill
us fermentum）、ストレプトコッカス・サンギス（Stre
ptococcus sanguis ）、スタフィロコッカス・エピデル
ミディス（Staphylococcus epidermidis）の様なグラム
陽性菌の細胞膜は、ペプチドグリカン及びティコイル酸
より成る細胞壁（代表的なもので、厚さ約２５０Å）に
囲まれている。大腸菌（Escherichia coli）及びサルモ
ネラ・チィフィムリウム（Salmonella typhymurium）の
様なグラム陰性菌の細胞壁及び細胞膜の構造はより複雑
であり、細胞膜は厚さ約３０Åのペプチドグリカンの壁
に取り囲まれ、その壁はさらにその外側が厚さ約８０Å
のタンパク質、脂質及びリポポリサッカライドのモザイ
クの膜で覆われている。上記の結果は、サイクリックボ
ルタメトリのピーク電位値には細胞壁の構造が影響する
ことを示している。すなわち、より複雑な膜で被覆され
ているグラム陰性菌のピーク電流は、グラム陽性菌のそ
れよりもプラス側の電位に於いて現れた。
【００４１】参考例３ グラム陽性菌であるバチルス・スブチリス（Bacillus s
ubtilis ）ＩＦＯ３００９を栄養培地（Nutrient Brot
h、牛肉エキス１％、ペプトン１％）中で培養し、対数
期に集菌し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄後、同緩衝液に懸濁し細胞懸濁液（１．２×１０9 個
／ml）を調製した。同様にして、グラム陽性菌であるサ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e、ＹＲＤ培地：酵母エキス１％、ポリペプトン２％、
グルコース２％）、グラム陽性菌であるラクトバチリス
・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum）ＩＦＯ
３０７１（栄養培地）、グラム陽性菌であるロイコノス
トック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroide
s ）ＩＦＯ３８３２（トマトジュース培地：トリプトン
１％、酵母エキス１％、トマトジュース２０％）及びグ
ラム陰性菌である大腸菌（Escherichia coli、栄養培
地）をそれぞれ培養し、対数期に集菌し、前記緩衝液に
懸濁して生菌数濃度１．０３×１０9 、５．０×１
０8 、１．３×１０9 及び１．０×１０10個／mlの各懸
濁液を調製した。
ubtilis ）ＩＦＯ３００９を栄養培地（Nutrient Brot
h、牛肉エキス１％、ペプトン１％）中で培養し、対数
期に集菌し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄後、同緩衝液に懸濁し細胞懸濁液（１．２×１０9 個
／ml）を調製した。同様にして、グラム陽性菌であるサ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e、ＹＲＤ培地：酵母エキス１％、ポリペプトン２％、
グルコース２％）、グラム陽性菌であるラクトバチリス
・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum）ＩＦＯ
３０７１（栄養培地）、グラム陽性菌であるロイコノス
トック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroide
s ）ＩＦＯ３８３２（トマトジュース培地：トリプトン
１％、酵母エキス１％、トマトジュース２０％）及びグ
ラム陰性菌である大腸菌（Escherichia coli、栄養培
地）をそれぞれ培養し、対数期に集菌し、前記緩衝液に
懸濁して生菌数濃度１．０３×１０9 、５．０×１
０8 、１．３×１０9 及び１．０×１０10個／mlの各懸
濁液を調製した。
【００４２】次にこれら細胞各懸濁液を、前例と同様の
メンブランフィルタ上に各５mlわずかに吸引しながら落
とし、その表面にこのメンブランフィルタを取りつけた
作用電極ＢＰＧ、対向電極白金線及び参照電極ＳＳＣＥ
を用いて、走査電位０〜１．０Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥ、サ
ンプリング・タイム２０ミリ秒、変調電圧５０ｍＶ及び
１００ｍＶ、電位単掃引０．５ｍＶ／秒、測定温度２５
℃の条件下、微分パルスボルタメトリを実施した。尚、
装置は扶桑製作所製「ポーラログラフ３１２型」を使用
した。図６はバチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s ）の微分パルスボルタモグラムであり、０．６８Ｖ
ｖｓ ＳＳＣＥに極めて明瞭なピーク電位が認められる
〔図中、符号（ａ）及び（ｂ）は変調電圧１００ｍＶ、
５０ｍＶにそれぞれ対応する〕。 各細菌のピーク電位
値を下記表２に要約して示す。同表からも明らかなよう
に、前記方法に依れば細菌相互の識別が微分パルスボル
タメトリで極めて明瞭且つ容易になされ得るものであ
り、特にグラム陰性菌である大腸菌（Escherichia col
i）とその余の各グラム陽性菌とが明瞭に区別され得る
ことは注目に値するものである。
メンブランフィルタ上に各５mlわずかに吸引しながら落
とし、その表面にこのメンブランフィルタを取りつけた
作用電極ＢＰＧ、対向電極白金線及び参照電極ＳＳＣＥ
を用いて、走査電位０〜１．０Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥ、サ
ンプリング・タイム２０ミリ秒、変調電圧５０ｍＶ及び
１００ｍＶ、電位単掃引０．５ｍＶ／秒、測定温度２５
℃の条件下、微分パルスボルタメトリを実施した。尚、
装置は扶桑製作所製「ポーラログラフ３１２型」を使用
した。図６はバチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s ）の微分パルスボルタモグラムであり、０．６８Ｖ
ｖｓ ＳＳＣＥに極めて明瞭なピーク電位が認められる
〔図中、符号（ａ）及び（ｂ）は変調電圧１００ｍＶ、
５０ｍＶにそれぞれ対応する〕。 各細菌のピーク電位
値を下記表２に要約して示す。同表からも明らかなよう
に、前記方法に依れば細菌相互の識別が微分パルスボル
タメトリで極めて明瞭且つ容易になされ得るものであ
り、特にグラム陰性菌である大腸菌（Escherichia col
i）とその余の各グラム陽性菌とが明瞭に区別され得る
ことは注目に値するものである。
【００４３】
【表２】
【００４４】参考例４ （１）微生物 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）は、グルコース４ｇ、ポリペプトン１ｇ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇを含
む１００mlの培地（ｐＨ７．０）に好気的に３０℃１２
時間培養した。サルモネラ・チィフィムリウム（Salmon
ella typhymurium）ＴＡ１００は、１ｇのポリペプトン
及び肉エキスを含む１００mlの培地で好気的に３０℃１
５時間培養した。大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２
は、グルコース０．１ｇ、バクトートリプトン１ｇ、酵
母エキス０．５ｇ、及びＮａＣｌの５ｇを含む１００ml
の培地（ｐＨ７．０）に好気的に３０℃１２時間培養し
た。ラクトバチリス・ファーメンタム （Lactobachill
us fermentum）ＡＴＣＣ９３３８は、トリプチケース１
ｇ、トリプトース０．３ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＫＨ
2 ＰＯ4 ０．３ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３ｇ、クエン
酸アンモニウム０．２ｇ、グルコース２ｇ、ツィーン８
０（登録商標）０．１ｇ、システイン塩酸塩０．０２
ｇ、及び０．５mlの溶液（ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １
１．５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．６８％、ＭｎＳ
Ｏ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２．４％含有）を含む１００mlの培地
（ｐＨ６．８）で嫌気的に３７℃１６時間培養した。バ
チルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）ＭＩ１１２
は、Ｋ2 ＨＰＯ4１．４ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．６ｇ、
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．２ｇ、クエン酸ナトリウム
０．１ｇ、カザミノ酸０．５ｇ、グルコース０．５ｇ、
及びＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０２ｇを含む１００ml
の培地（ｐＨ７．０）で好気的に３０℃１５時間培養し
た。
ae）は、グルコース４ｇ、ポリペプトン１ｇ、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇを含
む１００mlの培地（ｐＨ７．０）に好気的に３０℃１２
時間培養した。サルモネラ・チィフィムリウム（Salmon
ella typhymurium）ＴＡ１００は、１ｇのポリペプトン
及び肉エキスを含む１００mlの培地で好気的に３０℃１
５時間培養した。大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２
は、グルコース０．１ｇ、バクトートリプトン１ｇ、酵
母エキス０．５ｇ、及びＮａＣｌの５ｇを含む１００ml
の培地（ｐＨ７．０）に好気的に３０℃１２時間培養し
た。ラクトバチリス・ファーメンタム （Lactobachill
us fermentum）ＡＴＣＣ９３３８は、トリプチケース１
ｇ、トリプトース０．３ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＫＨ
2 ＰＯ4 ０．３ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３ｇ、クエン
酸アンモニウム０．２ｇ、グルコース２ｇ、ツィーン８
０（登録商標）０．１ｇ、システイン塩酸塩０．０２
ｇ、及び０．５mlの溶液（ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １
１．５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．６８％、ＭｎＳ
Ｏ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２．４％含有）を含む１００mlの培地
（ｐＨ６．８）で嫌気的に３７℃１６時間培養した。バ
チルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）ＭＩ１１２
は、Ｋ2 ＨＰＯ4１．４ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．６ｇ、
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．２ｇ、クエン酸ナトリウム
０．１ｇ、カザミノ酸０．５ｇ、グルコース０．５ｇ、
及びＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０２ｇを含む１００ml
の培地（ｐＨ７．０）で好気的に３０℃１５時間培養し
た。
【００４５】（２）４，４’−ビピリジン修飾電極 ４，４’−ビピリジン１．５６ｇを１００mlのメタノー
ルに溶かし、溶液の濃度を１００ｍＭとした。０．３μ
ｍの粒径のアルミナ水懸濁液を浸み込ませたつや出し布
であらかじめ磨いておいたＢＰＧ電極（０．１７cm2 ）
を上記溶液に浸し、１分間ゆっくりと揺り動かした。上
記の様にしてＢＰＧ電極を操作前に毎回磨き、その都度
４，４’−ビピリジンによる修飾も行った。
ルに溶かし、溶液の濃度を１００ｍＭとした。０．３μ
ｍの粒径のアルミナ水懸濁液を浸み込ませたつや出し布
であらかじめ磨いておいたＢＰＧ電極（０．１７cm2 ）
を上記溶液に浸し、１分間ゆっくりと揺り動かした。上
記の様にしてＢＰＧ電極を操作前に毎回磨き、その都度
４，４’−ビピリジンによる修飾も行った。
【００４６】（３）測定方法 ポテンシオスタット（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ
ＨＡ３０１）、線型走査電源（北斗電工株式会社製
Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０４）、及びＸＹ記録計（理研電子
Ｆ３５）を用い４，４’−ビピリジン修飾炭素電極を
用いてサイクリックボルタメトリを実施した。サイクリ
ックボルタメトリの電解セルは、容積２５ml程度のガラ
ス製セルであり、対向電極は白金線、参照電極はＳＣＥ
である。参照電極は先端が焼結ガラスのフリットで主要
部と結合しているガラスチューブに浸すことによって電
解セルの主要部から隔離されている。メンブランフィル
タ（東洋メンブランフィルタＴＭ−２タイプ、ニトロセ
ルロース、孔径０．４５μｍ、径２５ｍｍ）上に測定対
象である各種細胞を１．１×１０9 個保持し、このメン
ブランフィルタを前記４，４’−ビピリジン修飾炭素電
極に取り付け、菌体を電極に接触させた。さらに、測定
は、扶桑製作所製「ポーラログラフ３１２型」及びＸＹ
記録計を用い、サイクリックボルタモグラムと同様の条
件で、微分パルスボルタメトリについても行い、微分パ
ルスボルタモグラムを得た。
ＨＡ３０１）、線型走査電源（北斗電工株式会社製
Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０４）、及びＸＹ記録計（理研電子
Ｆ３５）を用い４，４’−ビピリジン修飾炭素電極を
用いてサイクリックボルタメトリを実施した。サイクリ
ックボルタメトリの電解セルは、容積２５ml程度のガラ
ス製セルであり、対向電極は白金線、参照電極はＳＣＥ
である。参照電極は先端が焼結ガラスのフリットで主要
部と結合しているガラスチューブに浸すことによって電
解セルの主要部から隔離されている。メンブランフィル
タ（東洋メンブランフィルタＴＭ−２タイプ、ニトロセ
ルロース、孔径０．４５μｍ、径２５ｍｍ）上に測定対
象である各種細胞を１．１×１０9 個保持し、このメン
ブランフィルタを前記４，４’−ビピリジン修飾炭素電
極に取り付け、菌体を電極に接触させた。さらに、測定
は、扶桑製作所製「ポーラログラフ３１２型」及びＸＹ
記録計を用い、サイクリックボルタモグラムと同様の条
件で、微分パルスボルタメトリについても行い、微分パ
ルスボルタモグラムを得た。
【００４７】図７はｐＨ７．０に於けるサッカロミセス
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に関するサ
イクリックボルタモグラム及び微分パルスボルタモグラ
ムを示す。図中（Ａ）はサイクリックボルタモグラム、
（Ｂ）は微分パルスボルタモグラムを示し、（ａ）は
４，４’−ビピリジン修飾電極に関し、（ｂ）は４，
４’−ビピリジン修飾をしていない電極に関するもので
ある。また、電流値の大きさを矢印の幅とその幅に相当
する電流値によって示す。測定は２５±２℃で行った。
サイクリックボルタモグラムは、走査速度１０ｍＶ／秒
に於いて、微分パルスボルタモグラムは、走査速度１０
ｍＶ／秒、波高１００ｍＶ及びパルス幅２０ｍ秒で得ら
れた。プラス方向への最初の走査に際し、修飾電極、非
修飾電極共０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＣＥに於いて陽極波
が観察された。サイクリックボルタモグラムのピーク電
位値と微分パルスボルタモグラムのそれは一致してい
る。４，４’−ビピリジン修飾電極より得られたピーク
電流値は、非修飾電極より得られたピーク電流値よりも
高かった。細胞が不在の場合、ピーク電流は生成しなか
った。従って、４，４’−ビピリジン修飾によって電極
が賦活されることがわかる。前記各種微生物試料につい
てピーク電位を測定したところ、大腸菌（Escherichia
coli）０．７２Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ、サルモネラ・チィフ
ィムリウム（Salmonella typhymurium）０．７０Ｖ ｖ
ｓ．ＳＣＥ、バチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s ）０．６８Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ、ラクトバチリス・ファ
ーメンタム（Lactobachillus fermentum）０．６８Ｖ
ｖｓ．ＳＣＥであった。
・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に関するサ
イクリックボルタモグラム及び微分パルスボルタモグラ
ムを示す。図中（Ａ）はサイクリックボルタモグラム、
（Ｂ）は微分パルスボルタモグラムを示し、（ａ）は
４，４’−ビピリジン修飾電極に関し、（ｂ）は４，
４’−ビピリジン修飾をしていない電極に関するもので
ある。また、電流値の大きさを矢印の幅とその幅に相当
する電流値によって示す。測定は２５±２℃で行った。
サイクリックボルタモグラムは、走査速度１０ｍＶ／秒
に於いて、微分パルスボルタモグラムは、走査速度１０
ｍＶ／秒、波高１００ｍＶ及びパルス幅２０ｍ秒で得ら
れた。プラス方向への最初の走査に際し、修飾電極、非
修飾電極共０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＣＥに於いて陽極波
が観察された。サイクリックボルタモグラムのピーク電
位値と微分パルスボルタモグラムのそれは一致してい
る。４，４’−ビピリジン修飾電極より得られたピーク
電流値は、非修飾電極より得られたピーク電流値よりも
高かった。細胞が不在の場合、ピーク電流は生成しなか
った。従って、４，４’−ビピリジン修飾によって電極
が賦活されることがわかる。前記各種微生物試料につい
てピーク電位を測定したところ、大腸菌（Escherichia
coli）０．７２Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ、サルモネラ・チィフ
ィムリウム（Salmonella typhymurium）０．７０Ｖ ｖ
ｓ．ＳＣＥ、バチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s ）０．６８Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ、ラクトバチリス・ファ
ーメンタム（Lactobachillus fermentum）０．６８Ｖ
ｖｓ．ＳＣＥであった。
【００４８】参考例５ バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）ＭＩ１１
２（Ａｒｇ−１５、ｌｅｕ Ｂ８ ｔｈｉ５ ｒ- ｍ-
ｒｅｃ Ｅ４、以下本参考例ではプラスミド無しとい
う）は、スピッツェン培地(Spizizen Medium) １００ml
に、又、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）
ＭＩ１１２（プラスミドＰＴＬ１２含有、以下本参考例
ではプラスミド有りという）は、１μｇ／mlのトリメト
プリム(trimethoprim)を含んだスピッツェン培地(Spizi
zen Medium) １００mlに、各々植菌し、３７℃、１２時
間好気的に培養した。集菌後、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄し、懸濁させて菌体をＢＰＧ電極
表面にメンブランフィルタを用いて接触させた。測定
は、電解セルに２０mlＨ型セルを用い、作用極にはＢＰ
Ｇ（０．１７cm2 ）、対向電極には白金線、参照電極に
はＳＣＥを用いサイクリックボルタメトリにより電気化
学的挙動を測定し、サイクリックボルタモグラムを求め
た。電位走査速度は１０ｍＶ／秒に設定し、測定は２５
℃で行った。プラスミド無しとプラスミド有りのサイク
リックボルタモグラムを求めた結果、下記表３のように
各細胞においてピーク電流の発生するピーク電位が得ら
れた。このことは、プラスミド有りの細胞も同様に測定
出来ることを示している。
２（Ａｒｇ−１５、ｌｅｕ Ｂ８ ｔｈｉ５ ｒ- ｍ-
ｒｅｃ Ｅ４、以下本参考例ではプラスミド無しとい
う）は、スピッツェン培地(Spizizen Medium) １００ml
に、又、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）
ＭＩ１１２（プラスミドＰＴＬ１２含有、以下本参考例
ではプラスミド有りという）は、１μｇ／mlのトリメト
プリム(trimethoprim)を含んだスピッツェン培地(Spizi
zen Medium) １００mlに、各々植菌し、３７℃、１２時
間好気的に培養した。集菌後、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で洗浄し、懸濁させて菌体をＢＰＧ電極
表面にメンブランフィルタを用いて接触させた。測定
は、電解セルに２０mlＨ型セルを用い、作用極にはＢＰ
Ｇ（０．１７cm2 ）、対向電極には白金線、参照電極に
はＳＣＥを用いサイクリックボルタメトリにより電気化
学的挙動を測定し、サイクリックボルタモグラムを求め
た。電位走査速度は１０ｍＶ／秒に設定し、測定は２５
℃で行った。プラスミド無しとプラスミド有りのサイク
リックボルタモグラムを求めた結果、下記表３のように
各細胞においてピーク電流の発生するピーク電位が得ら
れた。このことは、プラスミド有りの細胞も同様に測定
出来ることを示している。
【００４９】
【表３】
【００５０】参考例６ ラクトバチリス・ファーメンタム（Lactobachillus fer
mentum）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（St
aphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・サ
ンギス（Streptococcus sanguis ）、大腸菌（Escheric
hia coli）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonel
la typhymurium）、プロテウス・ブルガリス（Proteus
vulgaris）をロゴサ(Rogosa)培地で３７℃、１６時間、
好気的に静置培養した。各々のコロニーを適量かき取
り、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、
これをメンブランフィルタ上に滴下し、菌体をフィルタ
上に集菌し、ＢＰＧ電極表面（０．１７cm2 ）に接触さ
せて作用極とした。対向電極には白金線、参照電極には
ＳＣＥを用い、電解セルに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１０mlの入ったＨ型セルを用い、サイクリック
ボルタメトリにより電気化学的挙動を測定し、サイクリ
ックボルタモグラムを求めた。各試料についてのピーク
電位の測定結果を下記表４に示す。この結果より、細胞
数が同一でなくても、一定の範囲であれば固有のピーク
電位を示すことがわかる。
mentum）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（St
aphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・サ
ンギス（Streptococcus sanguis ）、大腸菌（Escheric
hia coli）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonel
la typhymurium）、プロテウス・ブルガリス（Proteus
vulgaris）をロゴサ(Rogosa)培地で３７℃、１６時間、
好気的に静置培養した。各々のコロニーを適量かき取
り、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、
これをメンブランフィルタ上に滴下し、菌体をフィルタ
上に集菌し、ＢＰＧ電極表面（０．１７cm2 ）に接触さ
せて作用極とした。対向電極には白金線、参照電極には
ＳＣＥを用い、電解セルに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１０mlの入ったＨ型セルを用い、サイクリック
ボルタメトリにより電気化学的挙動を測定し、サイクリ
ックボルタモグラムを求めた。各試料についてのピーク
電位の測定結果を下記表４に示す。この結果より、細胞
数が同一でなくても、一定の範囲であれば固有のピーク
電位を示すことがわかる。
【００５１】
【表４】
【００５２】参考例７ バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）ＩＦＯ３
００９、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）、ラクトバチリス・ファーメンタム（Lact
obachillus fermentum）ＩＦＯ３０７１、ロイコノスト
ック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides
）ＩＦＯ３８３２、及び、大腸菌（Escherichia col
i）を夫々前記参考例２と同様の条件で培養し、対数期
に集菌し、生菌数１．３×１０9 個／フィルタの各試料
を調製した。次に、フィルタ上に保持したこれらの各試
料につき、前記参考例４で用いた４，４’−ビピリジン
修飾ＢＰＧ電極を使用し、参考例３と同様の条件下、微
分パルスボルタメトリを実施した。各試料のピーク電位
値を表５に要約して示す。同表からも明らかなように、
前記方法に依れば、細胞相互の識別が極めて明瞭かつ容
易になされ得るものである。
００９、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）、ラクトバチリス・ファーメンタム（Lact
obachillus fermentum）ＩＦＯ３０７１、ロイコノスト
ック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides
）ＩＦＯ３８３２、及び、大腸菌（Escherichia col
i）を夫々前記参考例２と同様の条件で培養し、対数期
に集菌し、生菌数１．３×１０9 個／フィルタの各試料
を調製した。次に、フィルタ上に保持したこれらの各試
料につき、前記参考例４で用いた４，４’−ビピリジン
修飾ＢＰＧ電極を使用し、参考例３と同様の条件下、微
分パルスボルタメトリを実施した。各試料のピーク電位
値を表５に要約して示す。同表からも明らかなように、
前記方法に依れば、細胞相互の識別が極めて明瞭かつ容
易になされ得るものである。
【００５３】
【表５】
【００５４】実施例１ １２時間好気的に培養したサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）を集菌後、０．１Ｍリン
酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、菌体を単層にな
るように、メンブランフィルタ上に固定化した後、この
菌体をＢＰＧ電極表面に接触させた。電解セル（２５ml
Ｈ型）に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れ、
作用極にはＢＰＧ、対向電極には白金線、参照電極には
ＳＣＥを用いて、サイクリックボルタメトリにより電位
走査を行ったところ、０．７４Ｖｖｓ．ＳＣＥ付近に特
異的な電流のピークが得られた。
（Saccharomyces cerevisiae）を集菌後、０．１Ｍリン
酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、菌体を単層にな
るように、メンブランフィルタ上に固定化した後、この
菌体をＢＰＧ電極表面に接触させた。電解セル（２５ml
Ｈ型）に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を入れ、
作用極にはＢＰＧ、対向電極には白金線、参照電極には
ＳＣＥを用いて、サイクリックボルタメトリにより電位
走査を行ったところ、０．７４Ｖｖｓ．ＳＣＥ付近に特
異的な電流のピークが得られた。
【００５５】そこで、細胞表面についている電極活性物
質である補酵素Ａを反応させるため、０〜１．０Ｖ ｖ
ｓ．ＳＣＥで電位走査を繰り返したところ、１回の電位
走査で約４０％、２回で約６０％、３〜１０回で約７０
％の呼吸活性が阻害された。次に、走査電位を種々に変
え、電位走査を３回ずつ行ったところ、０〜０．７Ｖ又
は０〜０．８Ｖまで電位走査したときに、著しく呼吸活
性が阻害され、約４０％まで活性が低下した。以上の結
果より、サッカロミセス・セレビシエは、サイクリック
ボルタメトリにより得られたピーク電位（０．７４Ｖ
ｖｓ．ＳＣＥ）付近の電位を印加することにより、その
呼吸活性が阻害されることが示唆された。
質である補酵素Ａを反応させるため、０〜１．０Ｖ ｖ
ｓ．ＳＣＥで電位走査を繰り返したところ、１回の電位
走査で約４０％、２回で約６０％、３〜１０回で約７０
％の呼吸活性が阻害された。次に、走査電位を種々に変
え、電位走査を３回ずつ行ったところ、０〜０．７Ｖ又
は０〜０．８Ｖまで電位走査したときに、著しく呼吸活
性が阻害され、約４０％まで活性が低下した。以上の結
果より、サッカロミセス・セレビシエは、サイクリック
ボルタメトリにより得られたピーク電位（０．７４Ｖ
ｖｓ．ＳＣＥ）付近の電位を印加することにより、その
呼吸活性が阻害されることが示唆された。
【００５６】又、上記のサイクリックボルタメトリによ
り得られたピーク電位（０．７４Ｖｖｓ．ＳＣＥ）にお
ける定電位電解の、電解時間と呼吸活性の阻害の関係を
調べたところ、時間とともに活性が阻害され、１０分で
７５％まで活性が減少した。そこで、様々な電位で１０
分間の定電位電解を行い、電位と活性阻害の関係を調べ
たところ、０．７〜０．７５Ｖ ｖｓ．ＳＣＥの範囲内
においては、いずれの電位を印加しても、最も効率よく
呼吸活性を阻害することができた。このときの電極表面
のｐＨを測定したところ、ほぼ中性であり、このことか
らこの呼吸活性の阻害は、電極表面のｐＨの変化による
ものではないことがわかった。さらに、電極表面を透析
膜で覆ったり、細胞をプロトプラスト化して細胞表面に
電極活性物質がついていない状態にした場合、呼吸活性
の阻害はほとんどみられなかった。以上から、この呼吸
活性の阻害は、細胞の表面についている電極活性物質
が、電極表面へ泳動することによってのみ起こるのでは
なく、電極活性物質が電極で反応することにより呼吸活
性に影響を与えていることが明らかになった。又、バチ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis グラム陽性）、
大腸菌（Escherichia coliグラム陰性）についても、上
記と同様の方法で定電位電解させたところ、それぞれの
サイクリックボルタメトリにより得られたピーク電位付
近で最も効率よく呼吸活性が阻害された。従って、特定
の電位において特定の細胞種のみ選択的に制御すること
もまた、可能である。
り得られたピーク電位（０．７４Ｖｖｓ．ＳＣＥ）にお
ける定電位電解の、電解時間と呼吸活性の阻害の関係を
調べたところ、時間とともに活性が阻害され、１０分で
７５％まで活性が減少した。そこで、様々な電位で１０
分間の定電位電解を行い、電位と活性阻害の関係を調べ
たところ、０．７〜０．７５Ｖ ｖｓ．ＳＣＥの範囲内
においては、いずれの電位を印加しても、最も効率よく
呼吸活性を阻害することができた。このときの電極表面
のｐＨを測定したところ、ほぼ中性であり、このことか
らこの呼吸活性の阻害は、電極表面のｐＨの変化による
ものではないことがわかった。さらに、電極表面を透析
膜で覆ったり、細胞をプロトプラスト化して細胞表面に
電極活性物質がついていない状態にした場合、呼吸活性
の阻害はほとんどみられなかった。以上から、この呼吸
活性の阻害は、細胞の表面についている電極活性物質
が、電極表面へ泳動することによってのみ起こるのでは
なく、電極活性物質が電極で反応することにより呼吸活
性に影響を与えていることが明らかになった。又、バチ
ルス・スブチリス（Bacillus subtilis グラム陽性）、
大腸菌（Escherichia coliグラム陰性）についても、上
記と同様の方法で定電位電解させたところ、それぞれの
サイクリックボルタメトリにより得られたピーク電位付
近で最も効率よく呼吸活性が阻害された。従って、特定
の電位において特定の細胞種のみ選択的に制御すること
もまた、可能である。
【００５７】
【発明の効果】本発明によれば、化学物質などを使用せ
ずに、電極から特定の電位を与えるだけで、特定の細胞
を選択的に制御することができる。
ずに、電極から特定の電位を与えるだけで、特定の細胞
を選択的に制御することができる。
【図１】本発明で使用するサイクリックボルタメトリ用
装置の模式的説明図である。
装置の模式的説明図である。
【図２】本発明で使用する微分パルスボルタメトリ用装
置の模式的説明図である。
置の模式的説明図である。
【図３】細胞識別に用いる電極システムの一例の模式的
説明図である。
説明図である。
【図４】ピーク電位値の経時変化を示すグラフである。
【図５】大腸菌（Escherichia coli）のサイクリックボ
ルタモグラムである。
ルタモグラムである。
【図６】バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）
の微分パルスボルタモグラムである。
の微分パルスボルタモグラムである。
【図７】サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）のサイクリックボルタモグラム（Ａ）及び
微分パルスボルタモグラムである。
cerevisiae）のサイクリックボルタモグラム（Ａ）及び
微分パルスボルタモグラムである。
４・・・電解セル、 ５・・・ポテンシオスタット、 ６・・・リニア・スイーブ電源、 ７・・・ＸＹ記録計乃至シンクロスコーブ、 １１・・・作用電極、 １２・・・対向電極、 １４・・・電解セル、 １５・・・パルスシーケンサ、 １７・・・ポテンシオスタット、 １１２・・・ディファレンスアンプリフィア １１３・・・レコーダ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/00 8412−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 27/48 Ｚ 7363−2Ｊ 33/483 Ｆ 7055−2Ｊ
Claims (2)
- 【請求項１】 （１）制御対象細胞が電極に接触する条
件下で前記電極に走査電位を印加して生起する電流値ま
たは微分電流値から制御対象細胞固有のピーク電位値を
求め、（２）作用電極及び対向電極を設けた液体中にお
いて、前記の細胞固有のピーク電位値又はその近傍の電
位を前記作用電極に与えることにより、前記作用電極に
接触させた支持体上に担持された細胞又は前記液体中の
細胞の増殖を制御することを特徴とする細胞の電気化学
的制御方法。 - 【請求項２】 液体が水であり、細胞が、微生物、赤血
球、白血球、腫瘍細胞及び培養動植物細胞である請求項
１記載の細胞の電気化学的制御方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10210992A JPH0691821B2 (ja) | 1992-03-28 | 1992-03-28 | 細胞の電気化学的制御方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10210992A JPH0691821B2 (ja) | 1992-03-28 | 1992-03-28 | 細胞の電気化学的制御方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121684A JPH06121684A (ja) | 1994-05-06 |
| JPH0691821B2 true JPH0691821B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=14318640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10210992A Expired - Lifetime JPH0691821B2 (ja) | 1992-03-28 | 1992-03-28 | 細胞の電気化学的制御方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0691821B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002538428A (ja) * | 1999-02-26 | 2002-11-12 | ハネウエル−メジャレクス・コーポレーション | 複数電極成分測定デバイスおよび方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003000225A (ja) * | 2001-06-25 | 2003-01-07 | Hakuju Inst For Health Science Co Ltd | 細胞培養装置及び細胞培養方法 |
| JP4666335B2 (ja) | 2002-09-04 | 2011-04-06 | 晶夫 岸田 | 機械的振動による生物機能の制御方法とその装置 |
| JP7227713B2 (ja) * | 2018-08-29 | 2023-02-22 | 住友重機械工業株式会社 | 微生物の活性を測定する測定装置及び測定方法、生物処理システム及び生物処理方法 |
-
1992
- 1992-03-28 JP JP10210992A patent/JPH0691821B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002538428A (ja) * | 1999-02-26 | 2002-11-12 | ハネウエル−メジャレクス・コーポレーション | 複数電極成分測定デバイスおよび方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06121684A (ja) | 1994-05-06 |
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