WO2004013174A1 - 疾患関連遺伝子の用途 - Google Patents

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WO2004013174A1
WO2004013174A1 PCT/JP2003/009750 JP0309750W WO2004013174A1 WO 2004013174 A1 WO2004013174 A1 WO 2004013174A1 JP 0309750 W JP0309750 W JP 0309750W WO 2004013174 A1 WO2004013174 A1 WO 2004013174A1
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salt
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Akiyoshi Kunugi
Atsushi Nishimura
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to uses of disease-related genes. More specifically, a prophylactic-therapeutic agent and a diagnostic agent for a neurodegenerative disease; or a neurodegenerative disease-related gene (including the corresponding DNA); a disease-related gene product (including a protein or a partial peptide thereof); A method for screening a drug using a related gene-transformed cell or the like; Background art
  • central nervous cells do not regenerate when damaged.
  • many peripheral sensory nerves can be regenerated on a daily basis. This is because there are undifferentiated cells that can divide and proliferate in the sensory organs. It has long been thought that such cells do not exist in neural tissue in the brain.
  • neural stem cells that divide and proliferate in some places in the brain of mature individuals, and attempts have been made to regenerate the central nervous system using these stem cells.
  • the main focus is on transplantation of neural stem cells or differentiated neural cells into the striatum for Parkinson's disease.
  • Alzheimer's disease the earliest degeneration occurs in cholinergic neurons in the septum and hippocampus. Cholinergic neurons have been implicated in impaired behaviors in Alheimer's disease, such as memory and learning. Most current treatments are symptomatic treatments that enhance acetylcholine-mediated neurotransmission pathways. 09750
  • the present invention is intended for the development of therapeutic agents for neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease from the viewpoint of differentiating undifferentiated neurons into cholinergic neurons.
  • mouse EC mouse EC
  • mRNA that expression increased when P19 cells differentiated into cholinergic neurons was found from gene chip analysis.
  • This mRNA is derived from its base sequence by using a known mouse gene (Mus musculus, clone MGC: 28513 IMAGE: 4190480, mRNA, comple te cds gi I 19353180
  • the cDNA corresponding to the mRNA has the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof preferably Is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a salt thereof; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a salt thereof; the amino acid represented by SEQ ID NO: 26
  • a protein comprising a sequence or a salt thereof; and the like preferably, a nerve cell differentiation activity; more preferably, a cholinergic neuron differentiation activity
  • a preventive / therapeutic agent for a neurodegenerative disease preferably, an agent for promoting neuronal differentiation; more preferably, an agent for promoting differentiation into cholinergic neurons
  • a neurodegenerative disease preferably, an agent for promoting neuronal differentiation; more preferably, an agent for promoting differentiation into cholinergic neurons
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof (preferably represented by SEQ ID NO: 14)
  • a protein comprising the amino acid sequence or a salt thereof a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a salt thereof; a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof;
  • a preventive or therapeutic agent for a neurodegenerative disease containing a compound or a salt thereof that regulates (preferably promotes) the expression of a gene (preferably, a neuronal cell differentiation promoter; more preferably, to a cholinergic neuron). Differentiation promoter);
  • a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; etc.) Or an antisense polynucleotide containing a substantially complementary base sequence or a part thereof;
  • the medicament according to the above (4) which is a nerve cell differentiation inhibitor (preferably, a differentiation inhibitor to cholinergic neurons);
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; No .: a protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; etc.
  • a pharmaceutical comprising the antibody of (6) above;
  • the drug according to the above (7) which is a nerve cell differentiation inhibitor (preferably, a differentiation inhibitor to cholinergic neurons);
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; No .: a protein consisting of the amino acid sequence represented by No. 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID No. 26; etc.
  • a neurodegenerative disease comprising a polynucleotide encoding a partial peptide thereof. Diagnostics;
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a salt thereof; or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a salt thereof; or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a protein thereof P2003 / 009750
  • Kit a salt thereof, or a partial peptide thereof or a salt thereof, for screening a compound or a salt thereof which regulates (preferably promotes) the activity of the protein or its partial peptide or a salt thereof.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein comprising the amino acid sequence represented by 16; a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof; or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; Or a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof.
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or the like
  • a polynucleotide encoding a partial peptide thereof preferably A method for screening a compound or a salt thereof;
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or the like
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; or the like
  • a neurodegenerative disease preferably, a neuronal cell differentiation promoting agent; more preferably, a differentiation promoting agent for cholinergic neurons
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 preferably, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof, etc.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, the amino acid represented by SEQ ID NO: 14)
  • a protein consisting of an acid sequence a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof);
  • a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 for production of a therapeutic agent Use of a compound or a salt thereof that promotes the expression of a salt gene;
  • (32) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or a salt thereof; (33) a partial peptide of the protein of the above (32) or a salt thereof;
  • polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the protein of (32) or the partial peptide of (33);
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or a partial peptide thereof or a salt thereof (preferably represented by SEQ ID NO: 14 A protein consisting of an amino acid sequence or a salt thereof; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a salt thereof; No .:
  • a prophylactic and therapeutic agent for a neurodegenerative disease preferably, a neuronal cell differentiation promoting agent; more preferably, a cholinergic neuron
  • a neurodegenerative disease preferably, a neuronal cell differentiation promoting agent; more preferably, a cholinergic neuron
  • Differentiation promoting agent preferably, a neurodegenerative disease comprising a protein having the amino acid sequence represented by 26 or a salt thereof; Differentiation promoting agent
  • a protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (preferably, an amino acid represented by SEQ ID NO: 14)
  • Disease prevention / treatment agent preferably, neuronal cell differentiation promoting agent; more preferably, cholinergic neuron differentiation promoting agent
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence represented by the one-letter code of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: L4.
  • Figure 2 shows the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) shown in SEQ ID NO: 15.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) represented by SEQ ID NO: 15 ([Continued from FIG. 2)).
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 used in the present invention (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention)
  • cells of humans and warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, chicks, egrets, pigs, hidges, horses, monkeys, etc.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 Is an amino acid sequence having about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • the term “homology of amino acid sequences” used herein can be calculated using, for example, the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Search Tool).
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 above.
  • a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 for example, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; : A protein consisting of the amino acid sequence represented by 16; a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; and the like).
  • substantially the same activity examples include an activity of differentiating undifferentiated neurons into cholinergic neurons (hereinafter sometimes referred to as a neuronal cell differentiation activity).
  • a neuronal cell differentiation activity an activity of differentiating undifferentiated neurons into cholinergic neurons
  • the neuronal differentiation activity and the like may be equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times).
  • the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the neural cell differentiation activity can be measured, for example, by a neural cell differentiation inducing system using mouse EC (embryonal carcinoma) cells, P19 cells.
  • the method may be performed according to a method described in an example described later.
  • Examples of the protein used in the present invention include: (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 (for example, about 1 to 100, preferably 1 to 100); An amino acid sequence in which about 30 amino acids are deleted, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids, and (ii) one amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 Or an amino acid sequence to which two or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5) amino acids have been added (Iii) one or two or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 14 (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, Preferably an amino acid sequence in which a number (1 to 5) of amino acids are inserted, (iv) represented by SEQ ID NO: 14 1 or 2 or more in the amino acid sequence (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (capilloxy terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the protein used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 16, has a carboxyl group at the C-terminus (-COOH). It may be any of oxypropylate (_CO ⁇ —), amide (—CONH 2 ) and ester (—COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl
  • C i one 6 alkyl group such as n one-butyl, for example, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl cyclopentyl
  • cyclo for example, phenyl, alpha-naphthyl of which C 6 - 12 Ariru group, e.g., benzyl, phenylene Lou C i_ 2 ⁇ such phenethyl P Hiring 09750
  • the protein used in the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal
  • the protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified is also included in the protein used in the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group at the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected with a protecting group (eg, an acyl group such as an alkanol such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group eg, an acyl group such as an alkanol such as a formyl group or an acetyl group.
  • N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, 1 OH, 1 SH, amino group , Imidazole, indole, guanidino, etc.) are protected with an appropriate protecting group (for example, a —6 alkyl group such as a 16- alkanol group such as a formyl group or an acetyl group), or Includes complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bonded.
  • protein used in the present invention include, for example, a mouse-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; a mouse-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 Protein; a human-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; and the like.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is the above-mentioned partial peptide of the protein of the present invention, and preferably any peptide having the same properties as the above-mentioned protein of the present invention.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted.
  • 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence.
  • 1 or 2 or more amino acid sequences (preferably, 3 009750
  • the C-terminus is any one of a carboxyl group (one CO ⁇ H), a carboxylate (one COO—), an amide (one CONH 2 ) and an ester (one COOR). Is also good.
  • the partial peptides used in the present invention include those having a carbonyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, and those having the N-terminal amino acid.
  • Residue eg, methionine residue
  • Residue whose amino group is protected with a protecting group, N-terminal cleavage in vivo, glutamine residue generated by pyroglutamine oxidation, on the side chain of amino acid in the molecule
  • those in which the substituent is protected by an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for preparing an antibody.
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • Physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), and organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein or its partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cell or tissue by a known method for purifying a protein, or a DNA encoding the protein. Can also be produced by culturing a transformant containing It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography. Purification and isolation can be performed by combining chromatography such as laffy and ion exchange chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can usually be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzylhydramine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and the like.
  • 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) ) Phenoxy resin and the like can be mentioned.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or an amide thereof. To get.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • carbopimides DCC, N, N, diisopropyl carbopimide, N-ethyl-N, 1- (3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like are used. Activation by these involves the addition of the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HOOB t), or a symmetrical acid anhydride or H ⁇ B t ester or HOOB t ester Can be added to the resin after the protected amino acid is activated in advance.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOB t, HOOB t
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfo such as dimethyl sulfoxide 03 009750
  • ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran
  • nitriles such as acetate nitrile and propionitrile
  • esters such as methyl acetate and ethyl acetate
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 212-trophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Branched or cyclic alkyl esterification Branched or cyclic alkyl esterification
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, benzene benzyl ester, benzyl hydryl ester
  • phenacyl ester Benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, those derived from carbonic acids such as lower (C 16 ) alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl group and the like. Groups and the like are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group. P2003 / 009750
  • the 15 protecting group Fueno Ichiru hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used. .
  • Examples of the activated carbonyl group of the raw material include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ B t)].
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ B t
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or the like.
  • Can be The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • cation scavengers such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-1
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, etc.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (protein) chain is extended to a desired amino acid side, and then the amino group at the N-terminal of the peptide chain.
  • a protein or partial peptide from which only the protecting group is removed and a protein or partial peptide from which only the C-terminal carboxyl protecting group has been removed and condensing these proteins or peptides in the above-mentioned mixed solvent. .
  • Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein or peptide.
  • the crude protein or peptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein or peptide. .
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the 0! -Hydroxyloxyl group of the carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide of a protein or peptide, An ester of the desired protein or peptide can be obtained.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide is produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide used in the present invention with the remaining portion, and if the product has a protective group, removing the protective group to produce the desired peptide.
  • Examples of known condensation methods and elimination of protecting groups include the methods described in the following (0) to (V).
  • the partial peptide obtained by the above method When the partial peptide obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide is obtained in the form of a salt, the known method or It can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing a base sequence encoding the protein used in the present invention described above. Preferably it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of total RNA or mRNA fraction from the above-mentioned cell's tissue.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein used in the present invention include, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: , Comprising a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 18 under high stringency conditions, and comprising the amino acid represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 16 described above. Any DNA can be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the sequence.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or the sequence No. 18 and about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 90% or more. 9 0
  • DNA containing a base sequence having a homology of 5% or more is used.
  • Hybridization is performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . I can. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringency end conditions.
  • High stringency end conditions refer to, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65.
  • a sodium concentration of about 19 mM and a temperature of about 65 ° C are most preferable.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or the like is used.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or the like is used.
  • DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, or the like is used.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the aforementioned cells and tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the DNA encoding the partial peptide used in the present invention includes, for example, a DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18, or SEQ ID NO: No .: 15 or a protein comprising a nucleotide sequence hybridizing under high stringency conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27 or 18 and having substantially the same activity as the protein of the present invention
  • a DNA containing a part of a DNA encoding the following is used. 3009750
  • DNA capable of hybridizing to the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18 has the same significance as described above.
  • Hybridization methods and high stringency conditions are the same as described above.
  • the DNA of the present invention can be amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or incorporated into an appropriate vector.
  • the DNA base sequence can be converted by ODA-LAPCR using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), or the like. It can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting.
  • a plasmid derived from Escherichia coli eg, pBR322, pBR325, pBR325, 09750
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSHl9, pSHl5
  • bacteriophages such as ⁇ phage, adenovirus
  • retrovirus vaccinia virus and baculovirus
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when an animal cell is used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • 1p promoter overnight, T7 promoter, etc. if the host is a Bacillus genus, SPOL promoter, SPO2 promoter, pen P promoter, etc. If the host is yeast, PH05 promoter, etc. PGK promoter, GAP promoter overnight, ADH promoter, etc. are preferred. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, P10 promoter overnight, and the like are preferable.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc. can be used.
  • the selection marker one, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r ), the neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as N eo r, include G418 resistance) and the like.
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal of the protein of the present invention. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the PhoA 'signal sequence and the immediate A signal sequence are included. If the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, ⁇ -amylase ⁇ If the host is yeast, the signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. are MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and if the host is an animal cell, the insulin signal sequence, ⁇ -inulin One feron signal sequence, antibody molecule and signal sequence can be used.
  • a transformant can be produced using the thus-constructed vector containing DN ⁇ encoding the protein of the present invention.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • bacterium belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12 ⁇ DH1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1 981)] , JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), HB 101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)] and C600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24 vol., 255 (1983)), 207—21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B112, Schizosaccharomyces pombe NCYC193, NCYC 2036, Pichia pastoris KM71 and the like are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larva of night-moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, Mamestra brassicae Derived cells or Estigmena acrea-derived cells are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhdhr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dfr-) cell). ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloid cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • human cancer cell-derived cell lines (DLD-1 cells, HCT-15 cells, SW-480 cells, LoVo cells, HCT-116 cells, WiDr cells, 11-29 cells, LS-174T EOa SNU—C4 cells, SNU—C2A cells, CX—1 cells, GI—112 cells, HL-60 cells, Raji cells, G361 cells, S3 cells) Used.
  • Transformation of a bacterium belonging to the genus Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 11 (1979).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and includes a carbon source necessary for growth of the transformant.
  • Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included.
  • Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.
  • Nonrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, corn chips; lica, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato
  • inorganic or organic substances and inorganic substances such as an extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing the genus Escherichia for example, M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal 'Ob' Experimmentin Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics) ), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3 ⁇ -indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the culture medium may be, for example, a Parkholder (Burkholder) minimal medium [Bostian, KL et al., Processings' ob 'The' National 'Academy' Ob 'Science' Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and 0.5% casamino acid. SD medium containing [Bitter, GA, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours. Aeration and / or agitation are added as necessary.
  • the culture medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical] The Journal of the American Medical Association, 1999, 519 ( 1 967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. Is used.
  • the pH is about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasound, lysozyme and z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by, for example, a method of obtaining a crude extract of protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride, Triton X—10 o TM And the like.
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, 'gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method that mainly uses differences in molecular weight, a method that uses differences in charges such as ion exchange chromatography, a method that uses specific affinity such as affinity chromatography, and hydrophobic methods such as reverse-phase high-performance liquid chromatography A method using the difference in gender, a method using the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • the protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus-produced protein of the present invention can be measured by, for example, enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention.
  • An antibody against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) uses the protein of the present invention as an antigen, It can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible upon administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, a mouse with an antibody titer was selected from a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an antigen for example, a mouse with an antibody titer was selected from a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kellar and Milstein [Nature, 256, 495 (1975) 3].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG100 to PEG600) is used.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding at a concentration of about 10 to 80% and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactive
  • a method for detecting monoclonal antibodies bound to the solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with a substance or enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A; Anti-immunoglobulin antibody or There is a method in which the hybridoma culture supernatant is added to the solid phase to which the oral tin A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in an animal cell culture medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as hybridomas can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which only the antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody.) Can be performed according to (Preparation of polyclonal antibody)
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Absorption / desorption method eg, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which only the antibody is collected using an antigen-binding solid phase
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • a immunizing antigen protein antigen
  • a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing substance and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. What can be done efficiently? PT / JP2003 / 009750
  • the hapten may be crosslinked at any ratio, for example, serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to hapten 1.
  • a method of pulling force at a rate of ⁇ 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier, but an active ester reagent containing a dartalaldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithioviridyl group is used. .
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier and a diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the separation and purification of the monoclonal antibody described above.
  • Polynucleotides encoding the protein or partial peptide used in the present invention eg, DNA (hereinafter, in the description of antisense polynucleotides, these DNAs may be abbreviated as DNA of the present invention)
  • An antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to a nucleotide sequence or a part thereof is complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA of the present invention.
  • Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a base sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA, but antisense DNA is preferable.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention includes, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • (a) in the case of an antisense polynucleotide directed to translation inhibition, a portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention 0
  • the antisense polynucleotide has (mouth) an antisense polynucleotide that directs RNA degradation by RNaseH
  • the complementary strand of the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention, including introns is about 70% or more
  • Antisense polynucleotides having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more are each suitable.
  • An antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA are replaced by chemicals such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted by a modified phosphate residue.
  • the sugar (deoxylipose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′-O-methylation, and the base moiety (pyrimidine, purine) may also be chemically modified.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is designed based on the nucleotide sequence information of the cloned or determined DNA encoding the protein, Can be synthesized.
  • the polynucleotide (nucleic acid) can be hybridized with the RNA of the protein gene of the present invention, and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or the protein-related RNA of the present invention.
  • the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled through the interaction with.
  • Polynucleotides complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention can be used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of protein genes in plants and for treating or diagnosing diseases.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a nucleotide, base sequence or a specific sequence of a nucleic acid including a gene.
  • “Corresponding” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . 5 'end hairpin loop of protein gene, 5' end 6—base pair 'repeat, 5, end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end untranslated region, 3 The palindrome region at the 'end and the hairpin loop at the 3' end can be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene can be selected as the region of interest.
  • Antisense polynucleotides can be polydeoxyliponucleotides containing 2-dexoxy D-reports, polyliponucleotides containing D-reports, N-glycosides of purine or pyrimidine bases or other types.
  • Polynucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • polymers containing special bonds may be DNA or RNA Base pairing as found therein (contains a nucleotide having a configuration permitting base attachment)).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, as well as unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), and Of known modification Appended, e.g., with labels known in the art, capped, methylated, substituted for one or more natural nucleotides with analogs, modified intramolecular nucleotides Such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoradate, olebamate, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate, phospholipidate, etc.)
  • proteins nucleases, nucleases' inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.
  • sugars eg, monosaccharides
  • intercalating compounds eg, acridine, psoralen, etc.
  • chelating compounds eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents those with modified bonds (eg, Anomeric nucleic acids).
  • the “nucleoside”, “nucleotide” and “nucleic acid” may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more hydroxyl groups are replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. May be converted to a functional group.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include a sulfur derivative of a nucleic acid, a thiophosphoate derivative, and a polynucleoside amide, which is resistant to the degradation of oligonucleoside amides.
  • the present invention is not limited thereto. Can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to increase the affinity for the target sense strand, and if toxic If present, make the antisense nucleic acid less toxic.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a prescribed form. Such additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes and increase nucleic acid uptake. (Eg, phospholipids, cholesterol, etc.). Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or the 5' end of nucleic acids for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol. .
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention (eg, DNA (hereinafter, referred to as the present invention) May be abbreviated as DNA)), an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter may be abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense polynucleotide of the DNA of the present invention (
  • the antisense polynucleotide of the present invention may be abbreviated.
  • the protein of the present invention Since the protein of the present invention is frequently expressed in nerve tissue, it can be used as a disease marker. That is, early diagnosis of nervous system diseases, It is useful as a marker for judging severity and predicting disease progression.
  • the protein of the present invention functions as a nerve cell differentiation factor (factor that differentiates undifferentiated neurons into cholinergic neurons), and is frequently expressed in nerve tissues.
  • antisense polynucleotides of the gene encoding the protein of the present invention, compounds that inhibit the activity or expression of the protein of the present invention, or salts thereof, or medicaments containing an antibody against the protein of the present invention include, for example, a neuronal cell differentiation inhibitor (Eg, prophylactic and therapeutic agents for neuroblastoma).
  • a gene encoding the protein of the present invention, an antisense polynucleotide of the gene encoding the protein of the present invention, or an antibody against the protein of the present invention preferably, a gene encoding the protein of the present invention.
  • the antibody against the protein of the present invention can be used as a diagnostic agent for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.).
  • diagnostic agents for neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • the protein of the present invention functions as a nerve cell differentiation factor (a factor that differentiates undifferentiated nerve cells into cholinergic neurons) and is frequently expressed in nerve tissue. Therefore, when the DNA encoding the protein of the present invention is abnormal or deficient, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease) Syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.).
  • nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease
  • spinal cord injury eg., epilepsy, schizophrenia, depression, etc.
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, as drugs for preventing and treating nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.).
  • nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.
  • it is a prophylactic or therapeutic agent for neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.).
  • compounds or salts thereof that promote the activity or expression of the protein of the present invention include, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.) It can be used as a prophylactic and therapeutic agent.
  • the DNA of the present invention may be used alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. After that, it can be administered to humans or other warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the protein purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is preferred to use.
  • the protein of the present invention can be used, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, or the like, which are sugar-coated as required, orally, or aseptic with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • a protein, etc. of the present invention may be used together with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of a pharmaceutical preparation. It can be manufactured by mixing. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, lubricants such as sucrose, lactose or saccharin Suitable sweeteners, flavoring agents such as peppermint, cacao oil, and cellulose are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection are formulated according to standard pharmaceutical practice, such as by dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. be able to.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.). such as an alcohol (e.g., ethanol, etc.), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (e.g., polysorbate one preparative 8 0 TM, HCO- 5 0, etc.) You may use together with.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the vector into which the DNA of the present invention is inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in warm-blooded animals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of the protein of the present invention varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the protein or the like of the present invention is orally administered for the purpose of treating Alzheimer's disease, generally the adult (body weight) is used.
  • the protein per day is from about 0.1 mg to about 0.1 mg L0 O mg, preferably from about 1.0 mg to 50 mg, more preferably from about 1.0 mg to about 20 mg.
  • Administer. When administered parenterally, the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, for the purpose of treating Alzheimer's disease, the protein or the like of the present invention is in the form of an injection.
  • the protein deprivation per day is about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 0.2 O mg, more preferably about 0.1 to 10 mg. It is convenient to administer by injecting about mg to the affected area. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the weight per 6 O kg of body weight.
  • the expression of the protein of the present invention increases at the stage of differentiation from undifferentiated neural stem cells into cholinergic neurons, it can be used as a marker for diseases involving cholinergic neurons. That is, it is useful as a marker for early diagnosis of nervous system disease, judgment of symptom severity, and prediction of disease progression. Therefore, nucleotides of the gene encoding the protein of the present invention, compounds or salts thereof that regulate (promote or inhibit, preferably promote) the activity of the protein of the present invention, and regulate (promote) the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • a compound containing the compound of the present invention or a salt thereof or a protein of the present invention for example, a nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression) It can be used as a therapeutic and prophylactic agent.
  • a nervous system disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression
  • a compound or a compound thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the activity of the protein of the present invention or Salts compounds that regulate (enhance or inhibit, preferably enhance) the expression of the gene of the protein of the present invention or salts thereof include, for example, nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, psychiatry) It can be used as a treatment and prevention agent for schizophrenia, depression, etc.).
  • nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, psychiatry
  • the protein of the present invention regulates (promotes or inhibits, preferably promotes or inhibits, preferably promotes) the activity of the protein of the present invention, or a compound thereof, or the expression of the gene of the protein of the present invention. It is useful as a reagent for screening a compound that promotes (preferably promotes) or a salt thereof.
  • the present invention relates to the activity of the protein of the present invention, which is characterized by using the protein of the present invention (for example, 1) cholinergic neuron differentiation promoting activity or 2) 3 009750
  • a compound that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the expression of the gene of the protein of the present invention is provided. More specifically, in the above screening method, for example, the amount of gene expression of the protein of the present invention in (1) the presence of the test compound and (2) the absence of the test compound is measured and compared. It is characterized by the following.
  • the present invention provides a screening method characterized by regulating the activity of a reporter gene using a promoter such as a gene whose expression is considered to be controlled by a gene product. More specifically, a primary neuronal cell or P19 cell line, or a primary neuronal cell or P19 cell line into which the gene represented by SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 18 has been introduced as a host cell As a reporter / general / attacher.
  • test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds derived from living organisms (such as carbohydrates and lipids), synthetic compounds, microorganism cultures, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts.
  • living organisms such as carbohydrates and lipids
  • synthetic compounds such as synthetic compounds, microorganism cultures, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts.
  • cell extracts such as carbohydrates and lipids
  • plant extracts such as lipids
  • cells having the ability to produce the protein of the present invention are cultured using a medium suitable for screening.
  • the medium of the present invention Any protein may be used as long as it does not affect the gene expression of the protein.
  • a cell having the ability to produce the protein of the present invention for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • a host for example, animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed in cells by culturing by the above-mentioned method is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the above-described method for culturing the transformant of the present invention.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the compound having the activity of promoting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the action of the protein of the present invention.
  • the compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or the screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts Liquid, plasma, etc.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • the gene encoding the protein of the present invention is frequently expressed in nerve tissue, a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) expression of the gene encoding the protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) expression of the gene encoding the protein of the present invention.
  • it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.).
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the expression of a gene encoding the protein of the present invention. is there.
  • Screening methods include (iii) the ability to produce the protein of the present invention. And (iv) a method of comparing the cell culture having the ability to produce the protein used in the present invention in the presence of the test compound.
  • the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) in the cases (ii) and (iv) is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include those described above.
  • the amount of the protein is measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis, ELISA, or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the gene expression level of the present invention can be determined according to a method known per se, for example, Northern blotting, Reverse transcript ion-polymerase chain reaction (RT-PCR), ⁇ TaqMan polymerase chain react ion, or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the compound can be selected as a compound that inhibits or enhances the activity of the protein of the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains a protein or a partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention may be a test compound as described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, A compound selected from a plant extract, an animal tissue extract, plasma, or a salt thereof, or a salt thereof, which regulates (promotes) the activity of the protein of the present invention (eg, nerve cell differentiation activity, etc.) or the gene expression of the protein of the present invention. Or a compound that inhibits, preferably promotes) or a salt thereof.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • a salt thereof, and a compound or a salt thereof that regulates (promotes or inhibits, preferably promotes) the expression of a gene encoding the protein of the present invention for example, a neurological disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome) , Spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.).
  • a neurological disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome
  • Spinal cord injury eg., epilepsy, schizophrenia, depression, etc.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be formulated into a pharmaceutical preparation according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier diluent or excipient usually used in the field of pharmaceuticals.
  • lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc.
  • injections are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, intraarticular. Includes dosage forms such as injections.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above antibody 3 or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like
  • suitable dissolution aids for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Use in combination with propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO- 50 (polyoxyetylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)), etc. May be.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Use in combination with propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO- 50 (polyoxyetylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is suitable for the dosage of the active ingredient. It is advantageous to prepare the dosage unit in a dosage unit.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories. Usually, each dosage unit is 5 to 500 mg, particularly 5 to 100 mg for injection. Other dosage forms preferably contain 10-25 Omg of the antibody.
  • Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, pests, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, pests, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, administration route, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention is regulated (preferably, for the purpose of treating Alzheimer's disease).
  • a compound or a salt thereof is administered orally, generally, in an adult (assuming a body weight of 6 O kg), the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.1 to 0.5 mg / day, preferably about 1 mg / day. 0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg is administered.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention is regulated for the treatment of Alzheimer's disease.
  • the compound or its salt to be administered (preferably promoted) is usually administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection, the compound or its salt is preferably used in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.01 to 3 Omg. It is convenient to administer about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg, by injection to the Alzheimer's lesion. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the body weight of 6 O kg.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention, and therefore, the quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly It can be used for quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention. desirable.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can be detected by tissue staining or the like. You can also.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of an antigen (eg, the amount of a protein) in a test solution.
  • Any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used. From the viewpoint of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 3-galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent. 2003/009750
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the labeling agent, the mass of the protein of the present invention in the test liquid can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • a competition method the antigen in the test wave and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • F labeled antigen
  • B labeled antigen
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using a polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody, etc. or a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • a solid phase method using a soluble first antibody and a solid phase antibody as the second antibody is used.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then a solid phase and a liquid phase are separated.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment can be obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is suitably used.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and written documents.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Also, for preparing an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detecting the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analyzing the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used for
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushfishes, horseshoe, horses, dogs, cats, monkeys) by using them as probes. , Chimpanzee, etc.), the abnormality (gene abnormality) of MA or niRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention can be detected. It is useful as a diagnostic agent for genes such as an increase in DNA or mRNA or overexpression.
  • the above-mentioned genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be carried out, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989, Proc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, 2766-2770 P. 1989).
  • Antisense polynucleotides that complementarily bind to the DNA of the present invention and can regulate the expression of the DNA have low toxicity and regulate the function of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo (preferably Can be used as, for example, a neuronal cell differentiation inhibitor (eg, a prophylactic / therapeutic agent for neuroblastoma).
  • the antisense polynucleotide when used, the antisense polynucleotide is used, the antisense polynucleotide is used alone or after it is inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector or the like. According to the means, it can be administered orally or parenterally to humans or mammals (eg, rats, puppies, sheep, bushes, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered with a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • the antisense polynucleotide is formulated alone or with a carrier such as ribosome (injection), and is intravenously or subcutaneously. It may be administered to the joint cavity, Alzheimer's lesion, or the like.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of DNA of the present invention in tissues or cells and the state of its expression.
  • a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a lipozyme containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a protein of the present invention A deco-oligonucleotide or the like to a DNA sequence to which DNA binds can also suppress the expression of the gene of the present invention, and can suppress the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention in vivo. Therefore, it can be used, for example, as a neuronal cell differentiation inhibitor (eg, a prophylactic / therapeutic agent for neuroblastoma).
  • the double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001).
  • a known liposome is added to a part of RNA encoding the protein of the present invention. It can be manufactured by connecting films.
  • Examples of a part of the RNA encoding the protein of the present invention include a part (RNA fragment) close to a cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known lipozyme.
  • the decoy oligonucleotide is designed based on a DNA sequence to which the protein of the present invention binds, according to a known method (eg, The Journal of Clinical Investigation, 106, 1071, 2000). Can be manufactured. Specifically, the decoy oligonucleotide has a nucleotide sequence that hybridizes with the DNA sequence to which the protein of the present invention binds under highly stringent conditions, and can bind to the protein of the present invention. Any object may be used.
  • the nucleotide sequence capable of hybridizing with the DNA sequence to which the protein of the present invention binds is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 70% or more of the DNA sequence to which the protein of the present invention binds.
  • a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • RNA double-stranded RNA
  • ribozyme or decoy oligonucleotide when used as the above agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention, is useful as a diagnostic agent for nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, psychiatric schizophrenia, depression, etc.). Can be used as It may also be used as a nerve cell differentiation inhibitor (eg, a prophylactic / therapeutic agent for neuroblastoma).
  • nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, psychiatric schizophrenia, depression, etc.
  • Can be used as It may also be used as a nerve cell differentiation inhibitor (eg, a prophylactic / therapeutic agent for neuroblastoma).
  • the above-mentioned agent containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, puppies, sheep, pigs, cats, cats). , Dogs, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally (eg, intra-articular administration).
  • the antibodies of the present invention can be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions may be administered orally or PT / JP2003 / 009750
  • parenteral administration eg, intra-articular administration
  • inhalant e.g., piroxicam
  • compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal having the formula:
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof can be used in unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells containing spermatozoa and their primordial cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method It can be produced by transferring the desired DNA by a method such as microinjection, particle injection, DEAE-dextran method, etc.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. Can be fused with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se to produce the DNA-transferred animal of the present invention.
  • non-human mammal for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, blue herons, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and the like are used.
  • rodents with a relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the development of disease animal model systems and easy reproduction are particularly suitable for rodents, especially mice (for example, C57BL / 6 as pure strains).
  • a cross line such as a line and a DBA2 line
  • a cross line is preferably a BSCS Fi line, a BDFi line, a B6D2F3_ line, a BALBZc line, an ICR line, etc.) or a rat (for example, Wistar, SD, etc.).
  • mammals humans and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • mutant DNA of the present invention those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc.
  • the resulting DNA is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention.
  • a DNA that expresses a protein that suppresses the function of a normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • DNs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • having the DNA of the present invention having a high homology to the DNA are transferred.
  • the DNA construct of the present invention is obtained by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) bound with the human DNA of the present invention into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg downstream of various promoters capable of expressing A. It is possible to create a DNA transgenic mammal that highly expresses the DNA of the present invention.
  • a DNA construct eg, a vector, etc.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacterium such as bacterium phage and the like, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus and a baculovirus. Animal viruses and the like are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates the expression of D ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ include, for example, 1 virus (eg, Promoters of DNA derived from simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc., 2 Various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat) Promoters such as albumin, insulin II, peroplacin II, elasase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth Factor / 3, keratin K1, 10 and 1114, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase / 3 I subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endo
  • the above vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (generally referred to as DNA polymerase).
  • DNA polymerase a DNA-transferred mammal
  • the sequence of each D New Alpha of animal origin can and Mochiiruko, spline preferably c SV40 terminator Chief of simian virus is used other, each DN a for the purpose of further high express foreign DN a of interest
  • PT / JP2003 / 009750 a DNA-transferred mammal
  • the normal translation region of the protein of the present invention is derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). It can be obtained as DNA or all or part of genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries, or as complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA. I can do it.
  • an exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of the DNA indicates that the exogenous DNA of the present invention is present in all of the germ cells and somatic cells of the produced animal. Means to hold.
  • the offspring of such animals that inherit the foreign DNA of the present invention have the foreign DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and should be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. Can be done.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after DNA transfer indicates that all of the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • Means that there is The progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high level of expression of the normal DNA of the present invention, and finally promotes the function of endogenous normal DNA.
  • hyperfunction may develop, and it can be used as a model animal for the disease.
  • using the normal DNA transgenic animal of the present invention elucidation of the pathological mechanism of the protein hyperactivity of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and examination of treatment methods for these diseases. It is possible to do.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal containing the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by the crossing. I can do it.
  • the desired foreign DNA can be incorporated into the above-described plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of the DNA means that all the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal cells and somatic cells. I do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately inhibited by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • Inactive refractory disease may occur and can be used as a model animal for the disease.
  • using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention it is possible to elucidate the pathological mechanism of the protein inactive refractory of the protein of the present invention and to consider a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention is characterized in that the abnormal protein of the present invention inhibits the function of a normal protein (dominant negative action) in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. It becomes a model to elucidate.
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred is the released protein of the present invention.
  • a prophylactic / therapeutic agent for the protein or function-inactive refractory of the present invention such as a nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia) It can also be used for screening tests for preventive and therapeutic agents such as diseases and depression. Preferred are screening tests for preventive and therapeutic agents for neurodegenerative diseases.
  • the DNA-transferred animal of the present invention it is possible to examine the clinical symptoms of a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention, and the like. More detailed pathological findings in each organ of the protein-related disease model can be obtained, which can contribute to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease.
  • each organ can be removed from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells using a protease such as trypsin. It is.
  • the protein producing cell of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism, and its abnormality can be examined. It is an effective research material for elucidating its action.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA in which the DNA of the present invention is inactivated the DNA introduces a repo overnight gene (eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
  • a repo overnight gene eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • the non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a test compound is administered to the non-human mammal described in (8), wherein the rodent is a mouse, and (10) the animal described in (7), and expression of the repo overnight gene is measured.
  • the present invention provides a method of screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter against DNA of the present invention, which is characterized by detecting the compound.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is obtained by artificially mutating the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to thereby suppress the expression ability of the DNA.
  • the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • This may be referred to as a non-human mammalian embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell).
  • the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence by a genetic engineering method, and inserting or substituting another DNA.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by the target non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or a 1 acZ () 3-galactosidase gene), Inserting a repo-nucleic acid gene, such as the cat (clonal ramphenicol acetyltransferase gene), disrupts exon function, or causes gene transcription to occur in the intron between exons.
  • a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or a 1 acZ () 3-galactosidase gene
  • Inserting a repo-nucleic acid gene such as the cat (clonal ramphenicol acetyltransferase gene), disrupts
  • a DNA sequence (hereinafter abbreviated as a targeting vector) having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination.
  • Southern hybridization analysis using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, or the DNA sequence on the evening getter vector and the present invention used for producing the evening getter vector The DNA can be obtained by analyzing the DNA sequence in the neighboring region other than the DNA by a PCR method using the primer as a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established may be used as described above, or according to the known Evans and Kaufma method. May be newly established.
  • mouse ES cells currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, a pure line that substitutes them is immunologically genetic.
  • C57BL / 6 mice and BDFi mice C57BL / 6) in which the number of eggs collected by C57BL / 6 has been reduced by crossing with DBAZ2 Those established using 6) and DBAZ2 Fi
  • C57BL / 6 mice and BDFi mice C57BL / 6 in which the number of eggs collected by C57BL / 6 has been reduced by crossing with DBAZ2 Those established using 6) and DBAZ2 Fi
  • C57BL / 6 mice and BDFi mice C57BL / 6 in which the number of eggs collected by C57BL / 6 has been reduced by crossing with
  • BDFi mice have the advantage of high number of eggs collected and robust eggs, and they also have C57BL Z6 mice as their background, so the ES cells obtained using them can be used to create pathological model mice. It can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting 8-cell embryos and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing germline chimeras. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • a method for determining the sex of ES cells a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be given as an example.
  • the number of ES cells in one colony (about 50) can be reduced, compared to about 10 6 cells for karyotype analysis.
  • the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the time and effort required in the early stage of culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as ST ⁇ fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% Culture at about 37 ° C with 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air, etc.
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 l ⁇ 5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin / ImM EDT TJP2003 / 009750
  • a single cell is prepared by treatment, and seeded on a newly prepared feeder cell. Such subculture is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature, Vol. 292, pp. 154, 1981; GR Martin Proc. 'Ob' National 'Academy' Ob 'Science' U. Sac (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal Lubb. Embriology & Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985]
  • the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is a protein of the present invention in vitro. It is useful in cell biology studies.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be obtained, for example, by introducing the above-described evening targeting vector into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, whereby the DNA of the targeting vector of the present invention becomes inactive by the introduction.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by causing the homologous recombination of the converted DNA sequence to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and as a targeting vector. It can be determined by PCR analysis using the mouse and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention as a primer.
  • a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and as a targeting vector. It can be determined by PCR analysis using the mouse and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention as a primer.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a normal cell having the DNA locus of the present invention and an artificially mutated cell having the DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention by, for example, determining the coat color.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals with heterozygous expression of the protein of the present invention, which are crossed with individuals with heterozygous expression of the protein of the present invention. Can be obtained.
  • transgenic non-human mammals having the targeting vector introduced into the chromosome By injecting the DNA solution, transgenic non-human mammals having the targeting vector introduced into the chromosome can be obtained.Homologous recombination of these transgenic non-human mammals can be achieved.
  • the DNA of the present invention can be obtained by selecting one having a mutation at the DNA locus.
  • the animal individual obtained by mating can confirm that the DNA has been knocked out, and can be reared in a normal breeding environment.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygote animal can be efficiently obtained by rearing the homozygote in a mother animal in such a manner that one normal individual and one homozygote are obtained.
  • male and female heterozygous animals homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it may be caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It can be a model for such diseases, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage, etc. of the present invention.
  • the present invention is characterized in that a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and changes in the animal are observed and measured.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the disease for example, nervous system disease.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method includes the same ones as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound. Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indices. Therapeutic and prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • a test compound was administered to a non-human mammal deficient in DNA expression, and the difference in the degree of onset of nervous system The difference in the degree of healing of the nervous system disease is observed over time in the above tissue.
  • nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect on a disease caused by a deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent. Furthermore, the screening: compounds derived from the compound obtained in training can be used as well.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metal And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids, etc.
  • bases eg, alkali metal And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids, etc.
  • bases eg, alkali metal And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, ox
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the drug containing the protein of the present invention described above.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs, Monkeys.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound when administered, generally, an adult (with a body weight of 6 O kg) of an Alzheimer's disease patient , The compound is administered in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually in the form of an injection for an adult (with a body weight of 60 kg).
  • the compound When administered to a patient with Ruzheimer's disease, the compound is administered at about 0.2 mg / day. It is convenient to administer about 01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention, which comprises detecting a reporter gene expression to promote the activity of a promoter for DNA of the present invention.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the inhibition is provided.
  • the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene.
  • a gene which can express the repo overnight gene under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same one as described above is used, and (3) 3-galactosidase gene (1 acZ), soluble alkaline phosphatase gene, luciferase gene and the like are preferable.
  • the reporter gene is present under the control of the promoter of the DNA of the present invention.
  • the protein of the present invention can be easily prepared by staining with a reagent serving as a substrate for j3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3- ⁇ f-ndolyl-13-galactopyranoside (X-gal). Of the animal in vivo can be observed.
  • a reagent serving as a substrate for j3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3- ⁇ f-ndolyl-13-galactopyranoside (X-gal).
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, and is then phosphate-buffered saline (PBS) After washing with X-ga 1 at room temperature or around 37 for about 30 minutes to 1 hour, the tissue specimen is washed with ImM EDT AZ PBS solution. Stop the 3-galactosidase reaction and observe the coloration. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, alkali metals).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the compound or its salt that promotes or inhibits (preferably promotes) the activity of the promoter of the DNA of the present invention regulates (preferably promotes) the expression of the protein of the present invention, regulates the function of the protein (preferably, To prevent nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.) ⁇ Therapeutic agents, preferably prevention of neurodegenerative diseases ⁇ Useful as a therapeutic agent.
  • nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.
  • the drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the drug containing the protein of the present invention or the salt thereof described above.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (for example, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys). Etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof depends on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. Although there are differences, for example, when a compound that promotes promoter activity against DNA of the present invention is orally administered, the compound is generally administered daily to an adult (assuming a body weight of 60 kg) Alzheimer's disease patient. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like.For example, the compound that promotes the promoter activity of DNA of the present invention is usually in the form of an injection.
  • the compound When administered to an adult (assuming a body weight of 6 O kg) Alzheimer's disease patient, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. Investigation or prevention of various diseases caused by insufficient expression of DNA can greatly contribute to the development of therapeutic agents.
  • transgenic animal a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal).
  • transgenic animal so-called transgenic animal (transgenic animal).
  • the protein of the present invention has the action of specifically promoting or suppressing the ability to produce the protein itself in the body. It can be used as a search system for low molecular compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the relevant field, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • HONB 1-Hydroxy-5-norporene-2,3-dicarpoxyimide DCC
  • Example 2 shows the sequence of mouse-derived cDNA obtained in Example 3.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the Wnt-1 primer used in Example I.
  • Example 3 shows the base sequence of Mash-1 primer used in Example 2.
  • FIG 3 shows the nucleotide sequence of Mash-1 primer used in Example 2.
  • FIG 3 shows the nucleotide sequence of the Mash-1 probe used in Example 2.
  • SEQ ID NO: 14 shows the nucleotide sequence of a probe prepared from SEQ ID NO: 1 used in Example 4.
  • SEQ ID NO: 15 Base of protein coding region (Ooen Reading Frame) shown in 15 2 shows the amino acid sequence deduced from the sequence.
  • the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) in the sequence of the mouse-derived cDNA shown in SEQ ID NO: 1 (the nucleotide sequence corresponding to positions 111 to 2474 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1) Show.
  • Example 3 shows the sequence of human-derived cDNA shown in Example 3.
  • Nucleotide sequence of protein coding region (Open Reading Frame) in human-derived cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 17 (base sequence corresponding to positions 1 to 2361 in sequence shown in SEQ ID NO: 17) Is shown.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 6.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 6.
  • Example 6 shows the sequence of mouse-derived cDNA obtained in Example 6.
  • Example 6 shows the sequence of mouse-derived cDNA obtained in Example 6.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of a MAP2 primer used in Example 7.
  • Example 14 shows the nucleotide sequence of a MAP2 probe used in Example 7.
  • SEQ ID NO: 26 This shows the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) shown by SEQ ID NO: 27.
  • P19 cells purchased from ATCC were cultured in suspension at a cell density of lxlO 5 cells / m1 for 4 days under 0.5 M retinoic acid treatment (BBRC, 284, 1098-1103 (2001)). Differentiated into cholinergic neurons. The differentiation into cholinergic neurons was confirmed by immunostaining using an anti-choline acetyltransferase (ChAT) antibody (Chemicon international, Inc .; AB144P). The cells were fixed with 4% paraformaldehyde, blocking buffer (PBS (-) (Roche; 1-666-789), 5% BSA (Sigma; A-7030), 0.1 Triton X-100 (ICN Biomedicals Inc.
  • ChAT anti-choline acetyltransferase
  • Blocking was performed at room temperature for 1 hour according to 807423). Thereafter, an anti-ChAT antibody (Chemicon international, Inc .; AB144P) was allowed to act as a primary antibody at 4 ° C for 72 hours, followed by a secondary antibody Alexa Fluor 488 (Molecular Probe; A-11055) for 1 hour at room temperature. The cells were examined under a fluorescence microscope. As a result, it was found that about 80% of the P19 cells on day 9 of differentiation induction had differentiated into cholinergic neurons.
  • an anti-ChAT antibody Cemicon international, Inc .; AB144P
  • Alexa Fluor 488 Molecular Probe; A-11055
  • Induction system for differentiation into cholinergic neurons using P19 cells shown in Example 1 In order to search for genes related to regeneration into cholinergic neurons, jump analysis was performed to select candidate genes. In order to determine the number of days of culture for gene chip analysis, the expression of ChAT, a marker of cholinergic neurons, and the expression of Wnt-1 and Mashrl, which are known to be expressed at the stage of differentiation of neuronal cells, were investigated. Beta. According to the method, Taqman PCR was performed using cDNA derived from RNA extracted from P19 cells using ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) as a material.
  • the composition of the reaction solution in the reaction was determined using the above cDNA as type I, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 (ChAT), SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 (Wnt-l), SEQ ID NO: 6 And primers of SEQ ID NO: 7 (Mash_l) at 0.4 / M (final concentration), SEQ ID NO: 8 (ChAT), SEQ ID NO: 9 (Wnt-1), SEQ ID NO: 10 (Mash-1) Probes were added at 0.2 M each (final concentration) and 2X Taqman PGR Master Mix 1-1 to give a volume of 20 ⁇ 1.
  • the PCR reaction was carried out by repeating a cycle of 95 ° C. for 10 minutes at 50 ° C.
  • Example 3 the differentiation induction system using P19 cells to differentiate into neural cells shows that neural differentiation from neural progenitor cells to neural cells takes place from day 3 to day 5 of differentiation induction. Was thought. ChAT expression was observed on day 6 after induction of differentiation. From this, it was decided to perform gene chip analysis on RNA from P19 cells on days 0, 3, 5, 6, and 8. RNA was extracted from P19 cells at each culture day.
  • RNA chip analysis was performed on the RNA prepared in Example 2.
  • cRNA was synthesized from RNA prepared from each culture day, and the A-, B-, and C-chips of the MG-U74AV2 chip were subjected to eight hybridizations, followed by washing. And staining were repeated.
  • Gene Spring was used as software for the overnight analysis, the signal of each gene was normalized, and the expression between samples was compared.
  • the expression pattern was similar to that of Taqman PCR.
  • Candidate As a method for narrowing down the genes, genes whose expression was increased three-fold or more on day 5 of differentiation induction from day 3 of differentiation induction and genes whose expression did not decrease after day 5 of differentiation induction were extracted.
  • a Blast search was performed using the public database, Genbank database, based on the single known gene found, namely, the EST base sequence (Genbank AW047036) represented by affy ID 114443-at.
  • Genbank database based on the single known gene found, namely, the EST base sequence (Genbank AW047036) represented by affy ID 114443-at.
  • the analysis revealed that this gene fragment was the mouse gene represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank bc024617) (its ORF (Open Reading Frame) had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15) did.
  • ORF Open Reading Frame
  • the resulting amino acid sequences have 95% homology.
  • the cDNA of mouse MTC panel I (manufactured by Clontech) was designated as type III, and the primers of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and the primer of SEQ ID NO: 13 were used. PCR was carried out in the same manner as in Example 2 using As a result, the gene lacking in SEQ ID NO: 1 was found to have very high expression in the brain.
  • Neural stem cells were prepared by the neurosphere method (Exp Neurol, 1997 Apr; 144 (2): 350-60) using the embryos of Balb / c mice of ⁇ 14-15. To induce differentiation, neural stem cells were cultured on ECL-coated (UPSTATE biotechnology; 08-110) medium containing 100 ng / ml NGF (Genzyme techne; 2256) (DMEM (Gibco; 11995-065), N2 supplement (Gibco; 17502-048).
  • ECL-coated UPSTATE biotechnology; 08-110) medium containing 100 ng / ml NGF (Genzyme techne; 2256) (DMEM (Gibco; 11995-065), N2 supplement (Gibco; 17502-048).
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was the above cDNA as type I, primers of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 were each 0.4 ⁇ L (final concentration), dNTP (TAKARA) was 0.2 mM, and 10 ⁇ 21 Pfu DNA polymerase reaction buffer (stratagene 600250) and 2.5 U of PfuTurbo DNA polymerase (stratagene 600250) were added to make a liquid volume of 201.
  • the PCR reaction repeats 95 ° C for 30 seconds, 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes 30 times, and finally an extension reaction at 72 ° C for 10 minutes.
  • pcDNA3.1 / V5-HisTOPO TA expression kit Invitrogen K4800-01
  • plasmid vector pcDNA3.1 / V5-HisTOPO vector Invitrogen K4800-01
  • SEQ ID NO: 21 containing the same 0RF as SEQ ID NO: 1 and 3 bases less than 0RF of SEQ ID NO: 1 assumed to be a variant (498-500 bp of SEQ ID NO: 1) Deletion
  • the cDNA sequence of SEQ ID NO: 22 was obtained. (Based on the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) in the cDNA of SEQ ID NO: 22 as SEQ ID NO: 27, deduced from the nucleotide sequence of the protein coding region (Open Reading Frame) represented by SEQ ID NO: 27 The amino acid sequence shown is shown as SEQ ID NO: 26.)
  • SEQ ID NO: 27 The amino acid sequence shown is shown as SEQ ID NO: 26.
  • the primers of SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 (MAP2), SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 (ChAT) and SEQ ID NO: PCR was performed by the method of Example 2 using the probe of 25 (MAP2) and SEQ ID NO: 8 (ChAT).
  • the protein used in the present invention is a diagnostic marker for nervous system diseases. Therefore, compounds or salts thereof that promote the activity or gene expression of the protein include, for example, neurological diseases (eg, Alzheimer's disease). , Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy, schizophrenia, depression, etc.) can be used as prophylactic and therapeutic agents.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention can promote the expression of the protein used in the present invention. Examples thereof include nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, spinal cord injury, epilepsy) , Schizophrenia, depression, etc.). Therefore, it is considered that a new therapeutic method for neurodegenerative diseases can be pioneered by appropriately using a drug that regulates the expression of this gene and the function of the gene product.

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Abstract

配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一アミノ酸配列を有するタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、該タンパク質の遺伝子の発現を調節する化合物、該タンパク質またはその部分ペプチド、該タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡなどは、神経変性疾患などの予防・治療剤として使用することができる。

Description

疾患関連遺伝子の用途 技術分野
本発明は、 疾患関連遺伝子の用途に関する。 さらに詳しくは、 神経変性疾患の予 防-治療剤および診断薬等；あるいは神経変性疾患関連遺伝子 （対応する D NAを 含む） 、 該疾患関連遺伝子産物 （タンパク質、 その部分ペプチドを含む） 、 該疾患 関連遺伝子形質転換細胞などを用いて行う薬剤のスクリーニング方法等；に関する。 背景技術
通常、 中枢神経細胞は損傷を受けると再生することはない。しかしながら多くの 末梢の感覚神経は日常的に再生が可能なものが多い。これは感覚器の中に、 分裂、 増殖が可能な未分化な細胞が存在するからである。脳の中の神経組織ではそのよう な細胞は存在しないと長く考えられてきた。しかし、 最近、 成熟個体の脳内でも一 部の場所には、 分裂、 増殖を行う神経幹細胞が存在することがわかり、 これを用い た中枢神経の再生が試みられている。現在主に考えられているのは、 パーキンソン 病を対象とし、 神経幹細胞または分化させた神経細胞を線条体に移植するというも のである。これは臨床での中絶胎児脳の移植実験により移植医療の有効性が示され ていることと、 in vi t roで神経幹細胞がパーキンソン病において変性するドーパミ ン作動性ニューロンに分化しやすいことが示されているからである。しかし、 ドー パミン作動性ニューロン以外の神経の分離法は確立されたものがないため、 他の神 経変性疾患に対してはほとんど再生治療の試みはされていない。現段階では、 各神 経細胞への分化機構の解明が神経変性疾患における神経細胞の再生を可能にする と考えられる。
アルツハイマー病では、 最も初期に変性が見られるのは中隔野や海馬におけるコ リン作動性ニューロンである。 コリン作動性ニューロンは記憶、 学習といったアル ッハイマー病において障害の見られる行動にかかわっているとされている。 現在の 治療法はァセチルコリンを介した神経伝達経路を増強する対症療法がほとんどで 09750
あり、 再生医療をはじめとする新しい医療法が求められている。しかし、 ドーパミ ン作動性ニューロンと異なりコリン作動性ニューロンは胎児脳や神経幹細胞から の分離方法が確立されておらず、 また、 分化機構もあまりわかっていない。そのた め、 再生医療への応用がおくれている。そこで、 コリン作動性ニューロンの分化機 構が解明できれば、 移植用や内在性の神経幹細胞の分化を促進することでアルッハ イマ一病の再生医療が可能になると考えられる。 発明の開示
本発明は、 未分化な神経細胞をコリン作動性ニューロンへ分化させるという観点 からのァルツハイマ一病などの神経変性疾患治療薬開発を念頭に置いており、 その 探索ターゲットの発掘を目的として、 神経変性疾患発症時などに未分化な神経細胞 がコリン作動性ニューロンへ分化する時に発現が上昇する遺伝子を同定し、 その遺 伝子産物であるタンパク質の活性を調節する化合物のスクリーニング方法、 該スク リーニング方法で得られる化合物などを提供するものである。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 マウス EC
(embryonal carc inoma) 細胞である P19細胞を用いた神経細胞分化誘導系で発現 上昇が見られる遺伝子を見出し、 この知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。 即ち、 P19細胞がコリン作動性ニューロンに分化する ときに発現が増加する mRNAをジーンチップ解析から見出した。 この mRNAはその塩 基配列から NCBI (ジーンバンク） に登録された既知のマウス遺伝子（Mus musculus, c l one MGC : 28513 IMAGE : 4190480, mRNA, comple t e cds gi I 19353180 | gb | BC0246 17. I I [19353180] ) であると判明した。 該 mRNAに対応する cDNAは配列番号： 1で 表される塩基配列を有するが、 当該 mRNAの発現プロファイルを詳細に検討した結 果、 この mRNAは、 マウス神経幹細胞を用いたコリン作動性ニューロンへの分化誘 導系で培養 1 日目から 4日目まで発現が上昇することが明らかとなった。 これらの 知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩（好ましく は、 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配 列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番 号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など） の活性 (好ましくは、 神経細胞分化活性；さらに好ましくは、 コリン作動性ニューロンへ の分化活性） を調節 （好ましくは促進） する化合物またはその塩を含有してなる神 経変性疾患の予防 ·治療剤（好ましくは、神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、 コリン作動性ニューロンへの分化促進剤） ；
( 2 ) 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（好ましく は、 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配 列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番 号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など） の遺伝 子の発現を調節 （好ましくは促進） する化合物またはその塩を含有してなる神経変 性疾患の予防，治療剤 （好ましくは、 神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、 コ リン作動性ニューロンへの分化促進剤） ；
( 3 ) 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド （好ましくは、 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号： 1 6で表されるアミ ノ酸配列からなるタンパク質；配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタ ンパク質；等） をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的 に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド；
( 4 ) 上記 （3 ) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬；
( 5 )神経細胞分化抑制剤（好ましくは、 コリン作動性ニューロンへの分化抑制剤） である上記 （4 ) 記載の医薬；
( 6 ) 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸 配列からなるタンパク質；配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパ ク質；配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩； など） またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体； (7) 上記 （6) 記載の抗体を含有してなる医薬；
(8)神経細胞分化抑制剤（好ましくは、 コリン作動性ニューロンへの分化抑制剤） である上記 （7) 記載の医薬；
(9) 上記 （6) 記載の抗体を含有してなる診断薬；
(10) 神経変性疾患の診断薬である上記 （9) 記載の診断薬；
(1 1) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など） また はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患 の診断薬；
(12) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその 塩；など） もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 該 タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を調節 （好ましくは促 進） する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
(13) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその 塩；など） もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 該 タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節 （好まし くは促進） する化合物またはその塩のスクリーニング方法； ·
(14) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその P2003/009750
塩；など） もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 該夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を調節 （好ましくは促 進） する化合物またはその塩のスクリーニング用キット ；
(15) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその 塩；など） もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節 （好ま しくは促進） する化合物またはその塩のスクリーニング用キット ；
(16) 上記 （12) もしくは （13) 記載のスクリーニング方法または上記 （1 4) もしくは （15) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物ま たはその塩；
(17) 上記 （16) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬；
(18) 神経変性疾患の予防 ·治療剤 （好ましくは、 神経細胞分化促進剤；更に好 ましくはコリン作動性ニューロンへの分化促進剤）である上記（17)記載の医薬； (19) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など） また はその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 該 タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を調節 （好ましくは促 進） する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
(20) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など） また はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 該 タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節 （好まし くは促進） する化合物またはその塩のスクリーニング方法；
(21) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など） また はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 該 タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を調節 （好ましくは促 進） する化合物またはその塩のスクリーニング用キット ；
(22) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；など） また はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 該 タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の遺伝子の発現を調節 （好まし くは促進） する化合物またはその塩のスクリーニング用キット；
(23) 上記 （19) もしくは （20) 記載のスクリーニング方法または上記 （2 1) もしくは （22) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物ま たはその塩；
(24) 上記 （23) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬；
(25) 神経変性疾患の予防 ·治療剤 （好ましくは、 神経細胞分化促進剤；更に好 ましくはコリン作動性ニューロンへの分化促進剤）である上記（24)記載の医薬； (26) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその 塩；など） またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とす る神経変性疾患の予防 ·治療方法；
(27) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質 （好ましくは、 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列からなるタンパク質；配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からな.るタン パク質；配列番号： 26で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその 塩；など） またはその部分ペプチドの遺伝子の発現を促進することを特徴とする神 経変性疾患の予防 ·治療方法；
(28) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性 を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする 神経変性疾患の予防 ·治療方法；
(29) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の遺伝 子の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特 徴とする神経変性疾患の予防 ·治療方法；
(30) 神経変性疾患の予防 ·治療剤の製造のための配列番号： 14で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物又はその塩の使用；
(31) 神経変性疾患の予防 ·治療剤の製造のための配列番号： 14で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはそ の塩の使用；
( 32)配列番号： 27で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその塩； (33) 上記 （32) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩；
(34) 上記 （32) 記載のタンパク質または上記 （33) 記載の部分ペプチドを コードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(35) DN Aである上記 （34) 記載のポリヌクレオチド；
(36) 配列番号： 26で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(37) 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（好まし くは、 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩； 配列番号： 16で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；配列番 号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩；など） を含有 してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤 （好ましくは、 神経細胞分化促進剤；さらに 好ましくは、 コリン作動性ニューロンへの分化促進剤） ；
( 3 8 ) 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド （好ましくは、 配列番 号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号： 1 6で表される アミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からな るタンパク質；など） をコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患 の予防 ·治療剤 （好ましくは、 神経細胞分化促進剤；さらに好ましくは、 コリン作 動性ニューロンへの分化促進剤） ；
などに関する。 図面の簡単な説明
図 1は配列番号 L 4で示されるアミノ酸配列を 1文字表記で示したアミノ酸配 列を示す。
図 2は配列番号 1 5で示されるタンパク質コード領域 （Open Read ing Frame) の塩基配列を示す
図 3は配列番号 1 5で示されるタンパク質コード領域 （Open Reading Frame) の塩基配列を示す ( 〔図 2のつづき〕 ） 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質または 本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞（例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 脬臓 ιδ細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロフ ァージ、 Τ細胞、 Β細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳 腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは ガン細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の 各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、'大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎 下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来す るタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 1 4で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以 上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましく は約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列など が挙げられる。 ここで言う 「アミノ酸配列の相同性」 は、 例えば、 相同性計算アル ゴリズム NCBI BLAST (Nat i onal Center for Biotechnology Informat ion Bas ic LocalAl ignment Search Too l) などを用いて計算することができる。
配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質 （例えば、 配列番 号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号： 1 6で表される アミノ酸配列からなるタンパク質；配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からな るタンパク質；など） などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 未分化な神経細胞をコリン作動性ニュー ロンへ分化させる活性 （以下、 神経細胞分化活性と称することがある。 ） などが挙 げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または 薬理学的に）同質であることを示す。したがつて、神経細胞分化活性などが同等（例、 約 0 . 0 1〜 1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2 倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量などの量 的要素は異なっていてもよい。 神経細胞分化活性の測定は、 例えばマウス EC (embryonal carcinoma) 細胞であ る P19細胞を用いた神経細胞分化誘導系などで測定することができる。
具体的には、 後述の実施例に記載の方法などに準じて行えばよい。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （i) 配列番号： 1 4 で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好まし くは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 14で表されるァミノ 酸配列に 1または 2個以上（例えば 1〜1 0 0個程度、好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が付加 したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列に 1または 2 個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配 列、 （iv) 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などの いわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1 4もしくは 配列番号： 2 6または配列番号： 1 6で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質をはじめとする、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端がカルボキシル基 (-COOH) 、 力ルポキシレ一ト（_CO〇—） 、 アミド （一 CONH2) または エステル （—COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n一ブチルなどの C i一 6アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シ クロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルな どの C6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C i_2ァ P 雇画 09750
11 ルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル— アルキル基など の (：7 _ 1 4ァラルキル基、 ピバロィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基（またはカルポキ シレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されて いるものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとして は、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチ ォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アルカノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断さ れて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のァ ミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一 O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基等） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基 などの 一 6アルカノィル基などの — 6ァシル基等） で保護されているもの、 あ るいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質等も含まれる。 本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1 4で表 されるアミノ酸配列を含有するマウス由来のタンパク質；配列番号： 2 6で表され るアミノ酸配列を含有するマウス由来のタンパク質；配列番号： 1 6で表されるァ ミノ酸配列を含有するヒト由来のタンパク質；などがあげられる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明のタンパク質の部 分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有 するものであればいずれのものでもよい。
本発明のタンパク質が構成するアミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ま しくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。 . また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァミノ 酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） の アミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 3 009750
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1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基（一 C O〇H)、 カルポキシレート （一 C O O— ) 、 アミド （一C O NH 2) またはエステル （一 C O O R) の何れであってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられる夕 ンパク質と同様に、 C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を有 しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピロ グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保 護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合べプチ 'ドなども含まれる。 本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原とし ても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に許 容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用 いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭ィ匕水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有 機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒 石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホ ン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前述 したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によ つて製造することもできるし、 タンパク質をコードする D NAを含有する形質転換 体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合成法 に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織また は細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマトグ ラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせ ることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはその アミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そ のような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコー ル樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチ ルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、 4一（2 ' , 4 ' ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 （2 ' ， 4 ' ージメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げること ができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したァ ミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質または部分べプチドを切り 出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合 形成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド 体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活性 化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C、 N, N， ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチルー N， 一 （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによ る活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t , H O O B t ) とともに保護 アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H〇B tエステルあ るいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後 に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質縮 合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリド > ンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホ 03 009750
14 キシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセト 二トリル， プ ピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのェ ステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はタンパク質 結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十 分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分 な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときに は、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化す ることによって、 後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t 一ペンチルォキシカ ルポニル、 ィソポルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォキシカルボ二 ル、 C 1— Z、 B r— Z、ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2一二トロフエニルスルフエニル、 ジフエニルホスフイノ チオイル、 F m o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プ 口ピル、 ブチル、 tーブチル、 シク口ペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルェ ステル化） 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4一二トロベン ジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジルエステル、 ベ ンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシカルポニルヒ ドラジド化、 t —ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などに よって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護すること ができる。 このエステル化に適する基としては、例えば、ァセチル基などの低級（C ュ一 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポ二 ル基、エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t 一ブチル基などである。 P2003/009750
15 チロシンのフエノ一ル性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2 - B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4—メトキシ— 2 , 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 B u m、 B o c、 T r t、 F m o cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 , 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチルアルコー ル、 パラニトロフエノール、 H〇N B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N—ヒドロキ シフタルイミド、 H〇B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の 活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素など の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混 合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルエヂルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺ リジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによる 還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °C の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チ オアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフィド、 1， 4一 ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加 が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2， 4一 ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのイン ドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリ ゥム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護基 の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜 選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 ま P2003/009750
16 ず、 カルポキシ末端アミノ酸のひ—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 ァ ミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖 の N末端のひーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチド とを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮 合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護 タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗タンパク質または ぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで 所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。.
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端ァ ミノ酸の 0!—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルと した後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタンパク質ま たはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のペプチドの合 成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダ一ゼで切 断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用いられる 部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合さ せ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを 製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の (0 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
( i ) M. Bodanszky および M. A. Ondet t i、 ペプチド · シンセシス （Pept ide Synthes i s) , Intersc ience Publ i shers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ'ペプチド（The Pept ide) , Academi c Press, New York (1965年）
(i i i) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年） (v) 矢島洽明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 'カラムクロマトグラフ ィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部 分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが遊離 体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換す ることができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方 法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 前述し た本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであれば いかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記し た細胞 ·組織由来の cDN Aライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
ライブラリ一に使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミ ド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、前記した細胞 '組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T— P C R法と略称する） によって増幅す ることもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番 号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18で表される塩基配列を含有 する DNA、 または配列番号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基 配列を含有し、 前記した配列番号： 14もしくは配列番号： 26または配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有す るタンパク質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18で表される塩基配 列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズできる DN Aとしては、 例え ば、 配列番号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18で表される塩基 配列と約 50%以上、 好ましくは約 60%以上、 さらに好ましくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 9 0
18
5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrooket al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行な。うことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従つ て行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジエンドな条件に従って行 なうことができる。
ハイストリンジエンドな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約 19〜40mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60〜 6 5 の条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65°Cの場合が 最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 14で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 をコードする DNAとしては、 配列番号： 15で表される塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 また、 配列番号： 16で表されるアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 18で表される塩基配列を含有 する DNAなどが用いられる。 また、 配列番号： 26で表されるアミノ酸配列を含 有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 27で表される塩基配 列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DNA) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有 するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DN Aライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番 号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18で表される塩基配列を含有 する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号： 15もしくは配列番号： 2 7または配列番号： 18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハ イブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を 有するタンパク質をコードする DN Aの一部分を含有する DN A等が用いられる。 3009750
19 配列番号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18で表される塩基配 列とハイブリダイズできる D N Aは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダィゼ一シヨンの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする DN Aのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質 と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニングの手段としては、 本発明のタンパク質をコ一ドする塩基配列の一部分を有する合成 DN Aプライマ 一を用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは 合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ一ションによって選別する ことができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー 'クロ一 ニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法等に従って行なうことができる。 又、 市販のライブラ リーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 P CR、公知のキット、例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LAPCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel 法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行 なうことができる。
クロ一ン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのまま、 または 所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することができ る。 該 DN Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよ い。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプタ一を 用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質をコ ードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当な発現 ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、 pBR 322, pBR 325, 09750
20
PUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10， pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9， pSHl 5) 、 λファ ージなどのバクテリオファージ、 アデノウイルス、 レトロウイルス， ワクシニアゥ ィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 1 1、 ρΧΤ 1、 pR c/CMV> pR c/RS V, p c DNA I ZN e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応し て適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿主と して用いる場合は、 SRaプロモータ一、 SV40プロモーター、 LTRプロモー ター、 CMVプロモ一ター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモータ一、 SRo!プロモー 夕一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプ 口モータ—、 プロモータ一、 r e cAプロモータ一、 A PLプロモ一夕一、
1 p プロモ一夕一、 T 7プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO lプロモータ一、 SPO2プロモーター、 p e n Pプロモ一夕一など、 宿主 が酵母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプロモーター、 GAPプロモ 一夕一、 ADHプロモータ一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリ へドリンプロモーター、 P 10プロモ一夕一などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシグ ナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以下、 SV4 0 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることができる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称す る場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺 伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 N e o rと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r 遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカ一 として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端 末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 Pho A 'シグナル配列、 0即 A ·シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ · シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 M F a ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合に は、 インシュリン ·シグナル配列、 α—イン夕一フエロン ·シグナル配列、 抗体分 子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコ一ドする DN Αを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆 虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、例えば、 ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ■ナショナル ·アカデミー - ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 6 0巻， 1 60 (1 968)〕 , J M 1 03 〔ヌクイレック ·ァシッズ ' リサ一チ (Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1 98 1)〕 ， JA22 1 〔ジャーナ ル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology) ， 12 0卷， 5 17 (1978)〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル ·ォブ'モレキュラー 'バイ ォロジ一， 41巻， 459 (1 96 9)〕， C 600 〔ジエネティックス（Genetics) , 3 9巻， 440 (1 954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24卷， 25 5 (1 983)〕 ， 207— 2 1 〔ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリー （Journal of Biochemistry)， 95卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22 R -， NA87 - 1 1 A, DKD- 5 D, 20 B 一 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 9 1 3， NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 7 1 などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由来 株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia ni の中腸由 来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが Bm NPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx iori N細胞； BmN細胞） などが用い られる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細 胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン 'ヴィポ (In Vivo) ，13， 213-217, (1977)) など が用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) , 315卷， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズハム スター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh ί r遺伝子欠損チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d f r— )細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20, マウスミエ口一マ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH 3, ヒト FL細胞などが用いられる。 さらに、 ヒト癌細胞由来細胞株 （DLD— 1 細胞、 H C T— 15細胞、 S W— 480細胞、 L o V o細胞、 H C T— 1 16細胞、 Wi D r細胞、 11丁ー29細胞、 LS— 174T細胞、 SNU—C! EOa SNU —C 4細胞、 SNU— C 2 A細胞、 CX— 1細胞、 G I— 1 12細胞、 HL - 60 細胞、 Ra j i細胞、 G36 1細胞、 S 3細胞） なども用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ ·ォブ'ザ' ナショナル.アカデミー ·ォブ 'サイェンジィズ'ォブ 'ザ'ュ一エスェ一 （Proc. Na(tl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) ， 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー'アンド'ジェネラル ' ジェネティックス （Molecular & General Genetics) , 168卷， 1 1 1 (197 9 )などに記載の方法に従つて行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ'イン'ェンザィモロジ一 （Methods in Enzyraology) , 1 94巻， 182— 187 (1991) 、 プロシージングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 75巻， 1 929 (1 978) などに記載 の方法に従つて行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー (Bio/Technology) ,6, 47- 55 (1988)等に記載の方法に従って行なうことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 ( 1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジ一（Virology) , 52巻， 456 (1973 )に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現べクタ一で形質 転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に 使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に 必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例え ば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例え ば、 アンモニゥム塩類、硝酸塩類、 コーンスチープ.リカ一、ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどが挙げ られる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培 地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル 'ォブ 'ェクスペリメンッ ·ィ ン ·モレキュラー ·ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431— 433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 197 2〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例え ば、 3 ^—インドリルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時間行 ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40°Cで約 6〜24時間行ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 パークホー ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 プロシージングズ'ォブ' ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ'ュ一エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1 980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を 含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ' アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20 °C〜 35 °Cで約 24〜 72時間行な レ 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、
Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C.,ネイチヤー (Nature) , 195,788(1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地 の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 で約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜 20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 50 1 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴィロロジー （Virology) ， 8巻， 396 (19 59)〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·ァメリカン ·メデイカ ル 'アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 1 99巻， 519 (1 967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング ·ォブ 'ザ 'ソサイ.ェ ティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは 約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30 °C〜 40 °Cで約 15〜 60時間行 ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタンパ ク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法に より行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リ ゾチームおよび zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過により夕ンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 緩 衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 10 o TM などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合 には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上 清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精 製は、 自体公知の分離'精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これら の公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、'ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳 動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーな どの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一などの特異的親 和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用す る方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合に は自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変換す ることができる。 なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に 適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべプチ ドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、 トリプシン、 キモ卜リプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシ ダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィムィ ムノアツセィゃウエスタンプロッティングなどにより測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチド又はその塩を認識し得 る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体 の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対 する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清 の製造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕 ( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそ れ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高め るため、 完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバントを投与して もよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。 用いられ る温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、ャギ、ニヮトリが挙げられるが、マウス及びラットが好ましく用いられる。 モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例 えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓ま たはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨 髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル钪体産生ハイプリドーマを調製 することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化タンパク質 と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより 行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラ一とミルスタインの 方法 〔ネイチヤー （Nature)、 256、 495 (1975) 3 に従い実施することができる。 融 合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G) やセンダイウィル スなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0、 A P— 1など の温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いら れる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1： 1〜2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0〜4 0 °C、 好ましくは 3 0 ~ 3 7 °Cで 1〜1 0分 間ィンキュベー卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相 (例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や 酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの 場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固 相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプ 口ティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放射性物質ゃ酵 素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出す る方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行な うことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地としては、 ハ イブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1 〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイブ リドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いること ができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間 は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸 ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清 中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの 分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あ るいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採 取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従つ て製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あるいはそ れとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体 含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キヤ リア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率'良くできれば、 どの様な P T/JP2003/009750
28 ものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンやゥシサ イログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力プルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることがで きるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チォ一 ル基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担 体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロ ィントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好 ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一ナル抗 体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。 本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオ チド （例、 D NA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 これ らの D NAを本発明の D N Aと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補的な、 ま たは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドとしては、 本発明の D N Aの塩基配列に相補的な、 または実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するもので あれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、 アンチセンス D N Aが好ましい。
本発明の D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の: D N Aに相 補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D N Aの相補鎖） の全塩基配列あるいは部分 塩基配列と約 7 0 %以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。 特に、 本発明の D NAの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻害を指向したアンチセン スポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位をコードする部分 0
29 の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95% 以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、 （口） RNa s eHによ る RNA分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 イントロンを含 む本発明の DNAの全塩基配列の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアン チセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、 配列番号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18で表 わされる塩基配列を含有する DN Aの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相補 的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、 好まし くは例えば、 配列番号： 15もしくは配列番号： 27または配列番号： 18で表わ される塩基配列を含有する DN Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部分 を有するアンチセンスポリヌクレオチド (より好ましくは、 配列番号： 15もしく は配列番号： 27または配列番号： 18で表わされる塩基配列を含有する DNAの 塩基配列に相補な塩基配列の一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド） など が挙げられる。 アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 10〜40個程度、 好まし くは 15〜 30個程度の塩基から構成される。
ヌクレア一ゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N A を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホロチ ォェ一ト、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾リン酸残基 に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシリポース） は、 2 ' 一 O—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、 塩基部分 （ピリ ミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであってもよく、 配列番号： 15もしく は配列番号： 27または配列番号： 18で表わされる塩基配列を有する DNAにハ イブリダィズするものであればいずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリ ヌクレオチドは、 公知の DN A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することの できるアンチセンス ·ポリヌクレオチドを、 クローン化した、 あるいは決定された タンパク質をコードする DNAの塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 かか るポリヌクレオチド (核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子の RN Aと八イブリダ ィズすることができ、 該 RNAの合成または機能を阻害することができるか、 ある いは本発明のタンパク質関連 RN Aとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺 伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のタンパク質関連 RN Aの選択 された配列に相補的なポリヌクレオチド、 およぴ本発明のタンパク質関連 RNAと 特異的にハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内および生体 外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気 などの治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌク レオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であ ることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との 間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導さ れる指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝 子の 5 '端ヘアピンループ、 5'端 6—ベースペア 'リピート、 5，端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 ORF翻訳終止コドン、 3 ' 端 非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループは好ましい 対象領域として選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選 択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダィズすることがで きるポリヌクレオチドとの関係は、 対象物と 「アンチセンス」 であるということが できる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 2—デォキシー D—リポースを含有 しているポリデォキシリポヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリリポヌ クレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプ のポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマ一 （例 えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマ一） または特殊な結合 を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは DNAや RNA中に見出される ような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有 する）などが挙げられる。それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本鎖 RNA、 1本鎖 RNA、 さらに DNA： RNAハイブリッドであることができ、 さらに非修 飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の 付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたも の、メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホ ネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルア デート、 力ルバメートなど） を持つも の、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホ 口ジチォェ一トなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ' インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ— L一リジンなど） や糖 (例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インターカレ ン卜化合物（例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つもの、キレ一ト化合物（例 えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ひァノマー型 の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたそ の他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチ ル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あ るいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修 飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水 酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 アミ ンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 R N A、 D NA、 あるいは修飾さ れた核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄 誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレ オシドアミドの分解に抵坑性のものが挙げられるが、 それに限定されるものではな レ^ 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。 すなわ ち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細 胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにす る、 そしてもし毒性があるならァンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。 こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al . , Pharm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vo l . 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke et al . ed. , Ant i sense Research and App l i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開 示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合 を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与され たり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることができう る。 こうして付加形態で ¾いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を中和する ように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コレステロール など） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂質としては、 コ レステロ一ルやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメート、 コール酸な ど） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させるこ とができ、塩基、糖、分子内スクレオシド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ 用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止 するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレング リコ一ル、 テトラエチレングリコ一ルなどのグリコ一ルをはじめとした当該分野で 知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体外 の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて 調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発明 のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分ペプチドを コードするポリヌクレオチド （例、 D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合 がある） ） 、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 (以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 および本発明の D NAのアンチセ ンスポリヌクレオチド （以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する 場合がある） の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、 神経組織において発現が多く見られるので、 疾患マーカ 一として利用することが出来る。 すなわち、 神経系疾患における早期診断、 症状の 重症度の判定、 疾患進行の予測のためのマーカ一として有用である。 また、 本発明 のタンパク質は、 神経細胞分化因子 （未分化な神経細胞をコリン作動性ニューロン へ分化させる因子）として機能し、神経組織において発現が多く見られる。よって、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、 本発明 のタンパク質の活性または発現を阻害する化合物もしくはその塩または本発明の タンパク質に対する抗体を含有する医薬は、 例えば神経細胞分化抑制剤 （例、 神経 芽細胞腫 （neurob l as toma) の予防 ·治療剤など） などとして使用することができ る。 さらに、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子、 本発明のタンパク質をコ一 ドする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドまたは本発明のタンパク質に対す る抗体 （好ましくは、 本発明のタンパク質をコ一ドする遺伝子、 本発明のタンパク 質に対する抗体） は、 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 '脊髄損傷、 てんかん、 精神分裂病、 うつ病など） などの診断薬として使用すること ができる。 好ましくは神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群 など） の診断薬などである。
( 1 ) 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防 ·治療剤
本発明のタンパク質は、 神経細胞分化因子 （未分化な神経細胞をコリン作動性二 ユーロンへ分化させる因子）として機能し、神経組織において発現が多く見られる。 したがって、 本発明のタンパク質をコードする D N Aに異常があったり、 欠損して いる場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、 例えば、 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精神分裂病、 うつ病など） などが発症する。
したがって、 本発明のタンパク質および本発明の D N Aは、 例えば、 神経系疾患 (例、 アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、精神分裂病、 うつ病など） などの予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 好まし くは神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） の予防 '治 療剤などである。 さらに、 本発明のタンパク質の活性または発現を促進する化合物 もしくはその塩は、 例えば、 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症 候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精神分裂病、 うつ病など） などの予防 ·治療剤等の医 薬として使用することができる。好ましくは神経変性疾患の予防'治療剤等である。 例えば、 生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損しているために、 神経細胞分化調節が十分に、あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、 （ィ） 本発明の D N Aをその患者に投与し、 生体内で本発明のタンパク質を発現させるこ とによって、 （口） 細胞に本発明の D NAを揷入し、 本発明のタンパク質を発現さ せた後に、 その細胞を患者に移植することによって、 または （ハ） 本発明のタンパ ク質をその患者に投与することなどによって、 その患者における本発明のタンパク 質の役割を十分に、 あるいは正常に発揮させることができる。
本発明の D NAを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを 単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルス ァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段 に従って、 ヒトまたはその他の温血動物に投与することができる。 本発明の D NA は、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担 体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによ つて投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なくとも 9 0 %、好ましくは 9 5 %以上、より好ましくは 9 8 %以上、さらに好ましくは 9 9 % 以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のタンパク質は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ 以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で 非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担 体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認め られた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造すること ができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られ るようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セルロー スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤などが用いら れる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂の ような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用水のよ うなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出植物油などを溶 解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従つて処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液 （例えば、 D—ソルピトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールな ど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール など） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルべ一ト 8 0 TM、 H C O— 5 0な ど） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが挙げ られ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無 痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど) 、 保存剤 (例えば、 ベンジル アルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注 射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明の D NAが挿入されたべクタ一も上記と同様に製剤化され、 通常、 非経口 的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例 えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジ一など） に対して投与することができる。 本発明のタンパク質の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差 異はあるが、 例えば、 アルツハイマー病の治療目的で本発明のタンパク質等を経口 投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき該夕 ンパク質を約 0 . l m g〜： L 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ま しくは約 1 . 0〜2 0 m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該タンパク質等 の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 ァルツハイ マ一病の治療目的で本発明のタンパク質等を注射剤の形で成人 （体重 6 0 k gとし て） に投与する場合、 一日につき該タンパク質奪を約 0 . 0 1〜3 0 m g程度、 好 ましくは約 0 . 1〜.2 O m g程度、 より好ましくは約 0 . l〜1 0 m g程度を患部 に注射することにより投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O k g当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のタンパク質は未分化な神経幹細胞からコリン作動性ニューロンへの分 化の段階で発現が上昇するので、 コリン作動性ニューロンに関わる疾患マ一カーと して利用することができる。 すなわち、 神経系疾患における早期診断、 症状の重症 度の判定、 疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。 よって、 本発明の タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性を調節 (促進または阻害、 好ましくは促進） する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパ ク質の遺伝子の発現を調節 （促進または阻害、 好ましくは促進） する化合物もしく はその塩または本発明のタンパク質を含有する医薬は、 例えば、 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精神分裂病、 うつ 病など） などの治療 ·予防剤として使用することができる。 好ましくは神経変性疾 患の予防 ·治療剤などである。
( 2 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は耒分化な神経幹細胞からコリン作動性ニューロンへの分 化の段階で発現が上昇するので、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進または阻 害、 好ましくは促進） する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の 発現を調節 （促進または阻害、 好ましくは促進） する化合物もしくはその塩は、 例 えば、 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てん かん、精神分裂病、 うつ病など）などの治療 ·予防剤として使用することができる。 好ましくは神経変性疾患の予防■治療剤などである。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進ま たは阻害、 好ましくは促進） する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質の遺 伝子の発現を調節 （促進または阻害、 好ましくは促進） する化合物もしくはその塩 のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタン パク質の活性 （例えば、 ①コリン作動性ニュ一ロン分化促進活性あるいは②ドーパ 3 009750
37 ミン作動性ニューロン分化抑制活性などの神経細胞分化）を調節（促進または阻害、 好ましくは促進） する化合物、 あるいは本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節 (促進または阻害、好ましくは促進）する化合物のスクリーニング方法を提供する。 より具体的には、 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （1)試験化合物存 在下と（2)試験化合物非存在下の場合における、 本発明のタンパク質の遺伝子発現 量を測定して、 比較することを特徴とするものである。
更に（3)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞あるいは本発明のタン パク質をコードする cDNAを導入した細胞を致死的な条件下で培養を行った場合、 具体的には血清除去下あるいは神経細胞に比較的毒性の強いァドリァマイシンな どの抗癌剤を加えて培養した場合と（4)本発明のタンパク質を産生する能力を有す る細胞あるいは本発明のタンパク質をコードする cDNA を導入した細胞と試験化合 物の混合物とを致死的な条件下で培養を行った場合、 具体的には血清除去下あるい は神経細胞に比較的毒性の強いァドリァマイシンなどの抗癌剤を加えて培養した 場合との比較を行うことを特徴とする調節薬のスクリーニング方法を提供する。 上 記スクリーニング方法においては、 例えば、 （1)と（2)の場合における、 神経細胞保 護作用と本発明のタンパク質の遺伝子発現量を測定して、 比較することを特徴とす るものである。
更に遺伝子産物によって発現が制御されると考えうる遺伝子などのプロモータ 一を用いたレポ一ター ·ジーン ·アツセィにおいてその活性の調節を特徴とするス クリーニング法を提供する。 より具体的には初代神経細胞あるいは P19細胞株ある いは配列番号： 1 5もしくは配列番号： 2 7または配列番号： 1 8で示される遺伝 子を導入した初代神経細胞あるいは P19細胞株を宿主細胞としてレポ一タ一 ·ジー ン ·アツセィを行う。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 生体由来非ペプチド性化 合物 （糖質、 脂質など） 、 合成化合物、 微生物培養物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合物は新規化合物であってもよいし、 公 知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のタンパク質を産生する能力 を有する細胞をスクリーニングに適した培地を用いて培養する。 培地は、 本発明の タンパ 質の遺伝子発現に影響を与えないものであればいずれでもよい。 本,発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した本 発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するべク夕一で形質転換された宿主 (形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、 C O S 7細胞、 C H O細胞、 H E K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタンパク質を細胞に発現さ せた形質転換体が好ましく用いられる。 本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培 養方法は、 前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。 本発明のタンパク質の活性を促進する活性を有する化合物は、 本発明のタンパク 質の作用を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタンパク 質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから' 選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明のペプチドの塩と 同様のものが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子も、 神経組織において発現が多 く見られるので、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節 （促進また は阻害、 好ましくは促進） する化合物またはその塩も、 例えば、 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精神分裂病、 うつ 病など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。 好ましくは神経変性疾 患の予防 ·治療剤などである。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明のタンパク質 をコードする遺伝子の発現を調節 （促進または阻害、 好ましくは促進） する化合物 またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、 （i i i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有 する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明で用いられるタン パク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴と するスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （i i i) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 （具 体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mR N A量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上 記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識する抗 体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウエスタン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明の遺伝子発現量は、 自体公知の方法、 例えば、 ノ一ザンブロッテイングや Reverse transcript ion-polymerase chain reac t ion (RT-PCR) ·^ TaqMan polymerase chain react ion等の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。 例えば、 上記（iv)の場合における遺伝子発現量を、 上記（i i i)の場合に比べて、 約 20%以上、好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害するあるいは増強 する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害するあるいは増強する化合物 として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部 分ペプチドまたはその塩、 または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ぺプ チドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリ ^ニング用キッ卜を用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非 ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明のタンパク質の 活性 （例、 神経細胞分化活性など） あるいは本発明のタンパク質の遺伝子の発現を 調節 （促進または阻害、 好ましくは促進） する化合物またはその塩である。 該化合 物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。 本発明のタンパク質の活性を調節 （促進または阻害、 好ましくは促進） する化合 物またはその塩、 および本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節 （促 進または阻害、 好ましくは促進） する化合物またはその塩はそれぞれ、 例えば、 神 経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精 神分裂病、 うつ病など） などの予防 ·治療剤として有用である。 好ましくは神経変 性疾患の予防 ·治療剤などである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って 製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には 錠剤 （糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル 剤 (ソフトカプセル剤を含む) 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられる。 か かる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる 担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形 剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注 射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関節内注 射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上享 3抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶 解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解 補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレ ングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ 一卜 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyet yl ene ( 5 0 mo l) adduc t of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油 などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを 併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸 投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合するこ とによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するような 投藥単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 それぞれの 投薬単位剤形当たり通常 5〜 500mg、 とりわけ注射剤では 5〜100mg、 そ の他の剤形では 10〜25 Omgの上記抗体が含有されていることが好ましい。 なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じ ない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは温 血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネ コ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与する ことができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルート などにより差異はあるが、 例えば、 アルッハイマ一病の治療の目的で本発明のタン パク質の活性を調節 （好ましくは促進） する化合物またはその塩を経口投与する場 合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） においては、 一日につき該化合物または その塩を約 0.1〜： L 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは 約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはその塩 の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 ァルツハイ マ一病の治療の目的で本発明のタンパク質の活性を調節 （好ましくは促進） する化 合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重 60 k gとして）に投与する場合、 —日につき該化合物またはその塩を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度をアルツハイマー病変 部に注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O kg当た りに換算した量を投与することができる。
(2 a) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明 のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用すること ができる。 すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的 に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定する ことを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(i i) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測 定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部を認 識する抗体で、 他方の抗体が本発明の.タンパク質の C末端部に反応する抗体である ことが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクロ一ナル抗体 （以下、 本発明のモノク 口一ナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえる ほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子 そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきもの ではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原も しくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知 量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 い ずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノメトリツ ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述する サンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1 2 5 I〕、 〔1 3 1 I〕、 〔3H〕、 〔1 4 C〕などが用いられる。上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ）3—ガラクトシダーゼ、 β—グル コシダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素 などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセ ンィソチオシァネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、 ルミノール誘導体、 レシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あ るいは抗原と標識剤との結合にピオチン—アビジン系を用いることもできる。 2003/009750
43 抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常タン パク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法 でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多 糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラ ス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル钪体を反応 させ ( 2次反応) たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検 液中の本発明の夕ンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の 順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンド ィツチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる 抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類 以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次反 応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパク質の 結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2 次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のタン パク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部 以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競 合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができる。 競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反 応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリコ一ル、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗 体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗 体を用いる固相化法とが用いられる。 トリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体 に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗原と 過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固 相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定 し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた 不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物し か得られない場合にもレ一ザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリ一などが 好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別 の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操 作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築す ればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照す ることができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入 江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定 法」 ' (第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 (第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GY」 Vol.
70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical
Techniques (Part B))、 同書 Vol. 7 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同 書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレ ス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質を 感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによ つて、 本発明のタンパク質の濃度の増加または減少が検出された場合、 例えば神経 系疾患などである、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。又、 本発明の抗体は、 体液や組織等の被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出す るために使用することができる。 又、 本発明のタンパク質を精製するために使用す る抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、 被検細胞内 における本発明のタンパク質の挙動の分析等のために使用することができる。
( 3 ) 遺伝子診断薬
本発明の DNAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは温血 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ィヌ、 ネコ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明のタンパク質または 部分べプチドをコードする MAまたは niRNAの異常 （遺伝子異常） を検出すること ができるので、例えば、該 DNAまたは mRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。 本発明の DNAを用いる上記遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハイプリ ダイゼーシヨンや PCR- SSCP法 （ゲノミックス （Genomi cs) ，第 5巻， 874〜879頁、 1989年、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン シズ ·ォブ ·ュ一エスェ一 (Proceedings o f the Nat i onal Academy of Sc i ences o f the Uni ted St ates o f Amer i ca) ，第 86巻， 2766〜2770頁、 1989年) などにより実 施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダイゼーシヨンにより発現過多または減少が検出され た場合や PCR- SSCP法により DNAの突然変異が検出された場合は、 例えば、 神経系 疾患などである可能性が高いと診断することができる。
( 4 ) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の DNAに相補的に結合し、 該 DNAの発現を調節することができるアンチ センスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発明のタンパク質また は本発明の DNAの機能を調節 （好ましくは抑制） することができるので、 例えば、 神経細胞分化抑制剤 （例、 神経芽細胞腫 （neurob l as t oma) の予防 ·治療剤など） として使用することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の剤として使用する場合、 自体公知の 03 009750
46 方法にしたがつて製剤化し、 投与することができる。
例えば、 該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、 該アンチセンスポリヌク レオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデ ノウィルスァソシエイテツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に揷入した 後、 常套手段にしたがって、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与す ることができる。 該アンチセンスポリヌクレオチドはそのままで、 あるいは摂取促 進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃や ハイド口ゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エア ロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
, さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担体ととも に製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下、 関節腔内、 アルツハイマー病変部等に投与し てもよい。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとし て使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部を含有する二重鎖 R N A、 本発明のタンパク質をコードする R NAの 一部を含有するリポザィム、 本発明のタンパク質が結合する D N A配列に対するデ コィオリゴヌクレオチドなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、 生 体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられる D N Aの 機能を抑制することができるので、 例えば、 神経細胞分化抑制剤 （例、 神経芽細胞 腫 （neurobl as toma) の予防 ·治療剤など） などとして使用することができる。 二重鎖 R N Aは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecul ar Medic ine, 7巻， 221頁， 2001年） に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造すること ができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする R N Aの一部に公知のリポザ ィムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコード する R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断され得る本発明の R N A上の切断部位に近接した部分 （R N A断片） が挙げられる。
デコイオリゴヌクレオチドは、 公知の方法 （例、 The Journal of Cl ini cal Inves t igat i on, 106巻， 1071頁， 2000年） に準じて、 本発明のタンパク質が結合 する D NAの配列を基に設計して製造することができる。 具体的には、 該デコイォ リゴヌクレオチドとしては、 本発明の夕ンパク質が結合する D N Aの配列とハイス トリンジェントな条件下で八イブリダイズする塩基配列を有し、 本発明のタンパク 質が結合し得るものであれば何れのものでもよい。本発明のタンパク質が結合する D N Aの配列とハイブリダィズできる塩基配列としては、 例えば、 本発明のタンパ ク質が結合する D NAの配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ま しくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列など が用いられる。
上記の二重鎖 R N A、 リボザィムまたはデコィオリゴヌクレオチドを上記剤とし て使用する場合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与する ことができる。
( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば神経 系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精神 .分裂病、 うつ病など） などの診断薬として使用することができる。 また、 神経細胞 分化抑制剤 （例、 神経芽細胞腫 （neurobl as toma) の予防 ·治療剤など） などとし て使用してもよい。
本発明の抗体を含有する上記剤は低毒性であり、 そのまま液剤として、 または適 当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物（例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的 （例、 関節内 投与） に投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され 得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口また P T/JP2003/009750
48 は非経口投与 （例、 関節内投与） に適する剤形として提供される。 好ましくは吸入 剤として提供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じ ない限り他の活性成分を含有してもよい。
(6) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明の外 来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DNAと略記 する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において発 現しうる組換えべクタ一を提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本 発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始原細 胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生における胚発 生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞 期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキストラン法な どにより目的とする DN Aを転移することによって作出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明 の外来性 DN Aを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることによ り本発明の DNA転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病 体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57 BL/6 系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B S C S Fi系統， BDFi系統， B 6D 2 F3_系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット （例えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上 記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNAで はなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DNAの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置換 などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DN Aを意味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動 物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあたって は、 該 DN Aを動物細胞で発現させうるプロモータ一の下流に結合した DNAコン ストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト DNAを転 移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する各種哺乳動物（例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の DN Aを発現させうる各種プロモ一ターの下流に、 本発明のヒト DNAを結合した DN Aコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス 受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の DN Aを高発現す る DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌 由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、 λファージなどのパクテリオファ一ジ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまたはバキュ ロウィルスなどの動物ウィルス等が用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミド等が好ましく用いられる。 上記の D Ν Α発現調節を行なうプロモータ一としては、例えば、①ウィルス（例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィル ス、 乳がんウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DN Aのプロモーター、 ② 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ卜、 マ ウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラ キン I I、 エラス夕ーゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナー ゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチオン S—トランスフェラーゼ、 血小板 由来成長因子 /3、 ケラチン K1, 10ぉょび1114、 コラーゲン I型および I I 型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ /3 Iサブユニット、 ジストロフィ ン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レ セプターチ口シンキナ一ゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムァ デノシン 3リン酸化酵素（Na， K— ATP a s e)、ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、 M HCクラス I抗原（H— 2L)、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン) 3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 α) 、 β ァクチン、 ひおよび ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タン パク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロピン、 トロポニン (：、 平滑筋 αァクチ ン、 プレプロエンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモ一夕一などが用いられ る。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 at (EF- 1 α) のプロモー夕一、 ヒトおよびニヮトリ 3ァクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RNA の転写を終結する配列 （一般に夕一ミ.ネ一タ一と呼ばれる） を有していることが好 ましく、 例えばウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 D Ν Αの配列を用いるこ とができ、 好ましくはシミアンウィルスの SV40ターミネータ一等が用いられる c その他、 目的とする外来性 DN Aをさらに高発現させる目的で各 DN Aのスプラ イシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DNAのイントロンの一部などをプロ モータ一領域の 5， 上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3 ' 下流 に連結することも目的により可能である。 P T/JP2003/009750
51 正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥ サギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAライブラ リ一よりゲノム DNAの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを原料として 取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DN Aは、 上記の細胞または組織より 得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領 域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前記の プロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細 胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の 胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動物の後代がす ベて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを保持すること を意味する。 本発明の外来性 DN Aを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細 胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有する。
本発明の外来性正常 DN Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D NAを安定に保持することを確認して、 該 DNA保有動物として通常の飼育環境で 継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細 胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DNA転移後の作出動 物の胚芽細胞において本発明の外来性 DN Aが過剰に存在することは、 作出動物の 子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 DN Aを過剰に有 することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はそ の胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する。
導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の 動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するよう ί 代することができる。 P2003/009750
52 本発明の正常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 DNAが高発現さ せられており、 内在性の正常 DN Aの機能を促進することにより最終的に本発明の 夕ンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として利用す ることができる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本発明のタンパ ク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明および これらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 DN Aを安定に保持することを確認して該 DN A保有動物として通常の飼育環境 で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを前述のプラスミド に組み込んで原料として用いることができる。 プロモ一ターとの DNAコンストラ ク卜は、 通常の DNA工学的手法によって作製することができる。 受精卵細胞段階 における本発明の異常 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全 てに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の胚芽細胞において本発 明の異常 DNAが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細 胞の全てに本発明の異常 DN Aを有することを意味する。 本発明の外来性 D.N Aを 受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異 常 DN Aを有する。 導入 DNAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取 得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するよう に繁殖継代することができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 DN Aが高発現さ せられており、 内在性の正常 DN Aの機能を阻害することにより最終的に本発明の タンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物として利 用することができる。 例えば、 本発明の異常 DNA転移動物を用いて、 本発明の夕 ンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検 討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DN A高発現動物は、 本発明 のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常 タンパク質の機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 DN Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明のタン P2003/009750
53 パク質の減少症状を有することから、 本発明のタンパク質または機能不活性型不応 症に対する予防 ·治療剤、 例えば神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソ ン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精神分裂病、 うつ病など） などの予防 ·治療剤の スクリーニング試験にも利用可能である。 好ましくは神経変性疾患の予防，治療剤 のスクリーニング試験である。
又、上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析するか、 ま たは D N Aにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本発明のタンパ ク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ 一二ング、 および
⑤本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型 不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることが でき、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細 な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による二次的 疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D N A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンなど のタンパク質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養またはそ の培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク質産生 細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけ るシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本発明のタン パク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型 不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のスクリ一二 03009750
54 ング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転移動物または本発明 の外来性 DN A発現べクタ一を用いて、 本発明のタンパク質が関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
(7) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発 明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダ一ゼ遺伝 子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の D N Aが不活性化された該 D N A発現不全非ヒト哺乳動物、 (7) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ遺伝 子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕一遺伝子が本発明の DNAに 対するプロモータ一の制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および (10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発現 を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモータ一活性を促進ま たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳動 物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DN Aの発現能を 抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質 的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さ ない （以下、 本発明のノックアウト DN Aと称することがある） 非ヒト哺乳動物の 胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。 本発明の DN Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的手 法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを揷入または置換させるこ とによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読み取り 枠をずらしたり、 プロモータ一あるいはェキソンの機能を破壊することにより本発 明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DN A不活性化 ES細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記する） の具体例と しては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離し、 そ のェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表と する薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z ()3—ガラクトシダーゼ遺伝子） 、 c a t (ク口ラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子） を代表とするレポ一 夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソ ン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 （例えば、 po l y A付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメッセンジャー RNAを合成できなくする ことによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DN A配列を有する DN A鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法によ り該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA上あるいは その近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダィゼ一ション解析ある いは夕一ゲッティングベクタ一上の DNA配列と夕一ゲッティングベクタ一作製 に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマ一とした P C R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別することにより得ること ができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DN Aを不活化させる元の ES細胞として は、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、 マウスの ES細胞の 場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景が はっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的.背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BL/6マウスや C 57 BL/6の 採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 BL 6と DBAZ2との Fi) を用いて樹立したものなども良好に用いうる。 BDFi マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に加えて、 C 57BL Z6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデルマウス を作出したとき、 C 57BLZ6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景 を C 57 BL/ 6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
• また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用する が、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく 多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖系 列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するためにも できるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性決 定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 こ の方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要していた のに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初期にお ける E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、 早期 に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンディング法による染色体 数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 10 0 %が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺 伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2n = 40 である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発生 できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 ST〇繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜1 000 0 U/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気）で約 37 °Cで培養するなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001〜0.5%トリプ シン /0. l〜5mM EDTA, 好ましくは約 0.1 %トリプシン/ ImM EDT TJP2003/009750
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A) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法など がとられる。 このような継代は、 通常 1〜3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察 を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが 望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細胞 集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種々の タイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネ ィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロシ一デイング ス 'ォブ 'ナショナル 'アカデミー'ォブ'サイエンス 'ュ一エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナ ル ·ォブ。ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の D NA 発現不全細胞は、 インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討に いて有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を用 いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別すること が可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製した 夕一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導入に よりターゲッティングベクターの本発明の DNAが不活性化された D N A配列が 遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明 の DNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DNAをノックァ ゥトさせることができる。
本発明の DNAがノックアウトされた細胞は、 本発明の DNA上またはその近傍 の D N A配列をプロ一ブとしたサザンハィブリダイゼーション解析またはターゲ ッティングベクター上の DNA配列と、 夕一ゲッティングベクターに使用したマウ ス由来の本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列とをプライマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、 03 009750
58 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化された細胞株をクローニング し、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に 注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。 作 出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 このよ うなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての組織 が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラ一の判定等により選別することにより得られる。 このようにして得られ た個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタン パク質のへテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明のタンパク質 のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場^ &は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法で
D N A溶液を注入することによりタ一ゲッティングベクターを染色体内に導入し たトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジェニ ック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に変異の あるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配により得 られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼育 環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該 不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを相同 染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得しうる。 得られたホモザィゴート動 物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴ一ト複数になるような状態で飼 育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の雌雄を交配 することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ口ザィゴ一ト 動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA発 現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 本発^'の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により誘 導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の不活 性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及び治療 法の検討に有用である。
( 8 /a ) 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果 を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷などに 起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリ一二ングに用いるこ とができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投 与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D N Aの欠損や 損傷などに起因する疾病、 例えば神経系疾患などに対して治療 ·予防効果を有する 化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿等があげら れ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。 具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指標 として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射な どが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択するこ とができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質などにあ わせて適宜選択することができる。
神経系疾患（例、 アルツハイマー病、パーキンソン症候群、脊髄損傷、てんかん、 精神分裂病、 うつ病など） など、 好ましくは神経変性疾患に対して治療 ·予防効果 を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動 物に試験化合物を投与し、 試験化合物非投与群と神経系疾患の発症度合いの違いや 神経系疾患の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試験 動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果を有 する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選ば れた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる 疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒性な予防 · 治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリー :ニングで得 られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物の 塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 ァ ルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩 が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化 水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸（例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記し た本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより 差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） のアルツハイマー病患者においては、 一日につき該化合物を約 0 . 1〜 1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m g 投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾 患などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 6 0 k gとして）のァルツハイマー病患者に投与する場合、一日につき該化合物を約 0 . 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. .l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(8b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物 をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レ ポー夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロ モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法 を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物とし ては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の DNA がレポーター遺伝子を導入するこ により不活性化され、 該レポ一夕一遺伝子が本 発明の D N Aに対するプロモータ一の制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ）3—ガラクトシダー ゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子またはルシフェラ —ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポ一ター遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモー夕一の支配 下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすること により、 プロモータ一の活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコ一ドする DN A領域の一部を大腸菌由来の β - ガラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 a c Ζ) で置換している場合、 本来、 本発明のタンパ ク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに /3—ガラクトシダーゼが発 現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4—クロロー 3—^ f ンドリル一 3—ガラク トピラノシド （X— g a l) のような j3—ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用 いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状 態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損マウスまたはそ の組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D T AZ P B S溶液で洗浄することに よって、 /3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常 法に従い、 1 a c Zをコ一ドする mR N Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試験 化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促 進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物の 塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金 属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし い。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル 酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタ ンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進または阻害（好ましくは、促進） する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の調節（好ましくは、促進）、 該タンパク質の機能を調節 （好ましくは、 促進） することができるので、 神経系疾 患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精神分裂 病、. うつ病など） などの予防 ·治療剤、 好ましくは神経変性疾患の予防 ·治療剤と して有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用 いることができる。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記し た本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することが できる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより 差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモー夕一活性を促進する化合 物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） のアルツハイマー病 患者においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1..0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する 場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例 えば、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で 通常成人 （体重 6 O kgとして） のアルツハイマー病患者に投与する場合、 一日に つき該化合物を約 0. 0 1〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。他の動物の場合も、体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
'このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対す るプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニン グする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の原因 究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモータ一領域を含有する DNAを使って、 その 下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注入し ていわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそ のタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さらに 上記プロモーター部分に適当なレポ一夕一遺伝子を結合させ、 これが発現するよう な細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的 に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UPAC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野に おける慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学 異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA . デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン G グァニン
C
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸 d ATP デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y ダリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L e u ロイシン
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
T y r チロシン
T r p トリプトファン
P r o プロリン A s n ：ァスパラギン
G i n ：ダル夕ミン
pG 1 u ： ピログルタミン酸
S e c ：セレノシスティン (selenocysteinej
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記す る。
Me ：メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) 一力ルポキサミド基
T o s p―トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2-Bzl 2， 6ージクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1 -z 2 _クロ口べンジルォキシカルポニル
B r - Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t—ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル
T r t トリチル
Bum t—ブトキシメチル
Fm o c N— 9一フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t
HOOB t 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4一ォキソ一
1, 2, 3一べンゾトリアジン
HONB ： 1 -ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2， 3-ジカルポキシイミド DCC 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
実施例 3で得られたマウス由来の c D N Aの配列を示す。
〔配列番号： 2〕
実施例 2で用いられた ChATプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 2で用いられた ChATプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 2で用いられた Wnt- 1プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 Iで用いられた Wnt- 1プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 2で用いられた Mash- 1プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 2で用いられた Mash- 1プライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 2で用いられた ChATプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 2で用いられた Wnt- 1プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
実施例 2で用いられた Mash- 1プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
実施例 4で用いられた配列番号 1から作製したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 2〕
実施例 4で用いられた配列番号 1から作製したプライマーの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 3〕
実施例 4で用いられた配列番号 1から作製したプローブの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 4〕
配列番号： 1 5で示されるタンパク質コード領域 （Ooen Reading Frame) の塩基 配列から推定されるァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 15〕
配列番号： 1で示されるマウス由来の c DNAの配列におけるタンパク質コード 領域 （Open Reading Frame) の塩基配列 （配列番号： 1で示される配列中の 111番 目から 2474番目に相当する塩基配列） を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 18で示されるタンパク質コード領域 （Open Reading Frame) の塩基 配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 17〕
実施例 3で示されるヒト由来の c DN Aの配列を示す。
〔配列番号： 18〕
配列番号： 17で示されるヒト由来の c DN Aの配列におけるタンパク質コード 領域 （Open Reading Frame) の塩基配列 （配列番号： 17で示される配列中の 1番 目から 2361番目に相当する塩基配列） を示す。
〔配列番号： 19〕
実施例 6で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
実施例 6で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
実施例 6で得られたマウス由来の c DNAの配列を示す。
〔配列番号： 22〕
実施例 6で得られたマウス由来の c DNAの配列を示す。
〔配列番号： 23〕
実施例 7で用いられた MAP2プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
実施例 7で用いられた ΜΑΠプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
実施例 7で用いられた MAP2プローブの塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕 配列番号： 27で示されるタンパク質コード領域 （Open Reading Frame) の塩基 配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 27〕
配列番号： 22で示されるマウス由来の c DNAの配列におけるタンパク質コ一 ド領域 （Open Reading Frame) の塩基配列を示す。 実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はそれに限定さ れるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モリキュラークロ一 ニンク (molecular cloning, 2ηα, J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989年）に記載されている方法に従った。 実施例 1
P19細胞のコリン作動性ニューロンへの培養方法
ATCCから購入した、 P 19細胞を lxlO5細胞/ m 1の細胞密度で 4日間 0,5 Mのレチノイン酸処置下で浮遊培養 （BBRC, 284, 1098-1103 (2001)) することに より、 コリン作動性ニューロンへ分化させた。 コリン作動性ニューロンへの分化の 確認は抗コリンァセチルトランスフェラ一ゼ (C h AT) 抗体 (Chemicon international, Inc.； AB144P) を用いた免疫染色法にて行った。 細胞を 4%パラホ ルムアルデヒドにて固定し、 ブロッキング緩衝液 （PBS (-) (Roche; 1-666-789), 5% BSA (Sigma; A-7030), 0.1 Triton X - 100 (ICN Biomedicals Inc.； 807423)) に て室温、 1 時間ブロッキングを行った。 その後 1 次抗体として抗 Ch AT抗体 (Chemicon international, Inc.； AB144P) を 4°C、 72時間作用させ、 さらに 2 次抗体 Alexa Fluor 488 (Molecular Probe; A- 11055) を室温、 1 時間反応させ、 蛍光顕微鏡にて鏡検した。その結果、分化誘導 9日目の P 19細胞は約 80%がコリ ン作動性ニュ一ロンに分化していることが分かつた。
実施例 2
ジーンチップ解析のためのサンプル調整
実施例 1で示された P 19細胞を用いたコリン作動性ニューロンへの分化誘導系 でコリン作動性ニューロンへの再生に関連した遺伝子を探索する目的でジ一ンチ ップ解析を行い候補遺伝子を選択した。 ジーンチップ解析を行う培養日数を決定す るためにコリン作動性ニューロンのマーカーである ChATの遺伝子発現及び神 経細胞の分化段階で発現することが知られている Wnt-1、 Mashrlの発現について調 ベた。 方法は P 1 9細胞から抽出した RNA由来の c DNAを材料に ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems社） を用レて、 Taqman P C R反応を行つた。該反応における反応液の組成は上記 cDNAを铸型として使用し、 配列番号： 1と配列番号： 3 (ChAT) 、 配列番号： 4と配列番号： 5(Wnt-l)、 配列番 号： 6と配列番号： 7(Mash_l)のプライマーを各 0. 4 /M (最終濃度）、配列番号： 8 (ChAT) 、 配列番号： 9 (Wnt-1) 、 配列番号： 10 (Mash- 1) のプローブを各 0.2 M (最終濃度） 、 2X Taqman PGR Master Mix 1 Ο 1を加え、 20^1の液量とし た。 P C R反応は、 50°〇 ' 2分' 95°〇 ' 1 0分の後、 95で ' 1 5秒、 60t 1分、 のサイクルを 40回繰り返して行った。 算出されたコピー数は内部コント口 ールとしてそれぞれのアミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子のコピー数と同 様に算出したグリセロール 3リン酸脱水酵素のコピー数で補正した。 Wnt-1、 Mash-1 の発現解析の結果から、 P 19細胞を用いた神経細胞への分化誘導系では分化誘導 3日目から 5日目にかけて神経前駆細胞から神経細胞へ分化していることが考えら れた。 また、 ChATの発現は分化誘導 6日目から認められた。 このことから、 ジ —ンチップ解析は培養 0、 3、 5、 6、 8日目の P 1 9細胞由来の RNAに対して行う ことに決定した。 それぞれの培養日数の時点で P 1 9細胞から RNAを抽出した。 実施例 3
ジーンチップ解析
実施例 2にて調製した R N Aに対してジーンチップ解析を行った。 方法は Affymetrix GeneChip Expression analysis manualに従い、 各培養日から調整した RNAから c RNAを合成し、 MG— U 74 A V 2チップの A， B及び Cチップに ついて八イブリダイゼ一.シヨンを行い、 その後、 洗浄と染色を繰り返して行った。 デ一夕の解析にはソフトとしてジーンスプリングを用い、 各遺伝子のシグナルをノ 一マライズしサンプル間の発現の比較を行った。実施例 2で示した 2遺伝子 Wnt - 1、 Mash-1 の発現を調べたところ、 Taqman PCR と同様の発現パターンを示した。 候補 遺伝子絞り込みの方法としてコントロール、 分化誘導 3日目より分化誘導 5日目で 3倍以上発現が上昇している遺伝子で、 かつ分化誘導 5日目以降に発現が低下して いない遺伝子を抽出した。その結果見いだされた 1個の既知遺伝子、すなわち、 affy ID 114443— atで表される ESTの塩基配列 （Genbank AW047036) を基に公のデータべ' ースである Genbankデータベースを用いて Blast検索を行ったところ、 本遺伝子断 片は配列番号： 1 (Genbank bc024617) で示されるマウス遺伝子であること （その ORF (Open Reading Frame) は配列番号： 1 5で示される塩基配列であること） が判明した。 さらに、 当該マウス遺伝子 （bc024617) を GSN(GSP)で Blast検索した 結果、 該マウス遺伝子 （bc024617) のヒトカウンターパートは、 配列番号： 1 7 (W02001-57190に記載の遺伝子） であること （その ORF (Open Reading Frame) は配列番号： 1 8で示される塩基配列であること） が判明した。 配列番号： 1 5お よび配列番号： 1 8でそれぞれ示されるタンパク質コード領域 （Open Reading Frame) の塩基配列から推定されるアミノ酸配列、 すなわち、 配列番号： 14およ び配列番号： 1 6で示されるアミノ酸配列は、 95%の相同性を有する。
実施例 4
正常マウスにおける配列番号： 1で示される遺伝子の組織分布の解析
正常マウスにおける組織分布を調べるため、 mouse MTC panel I (クロンテ ック社製） の cDNAを铸型とし、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 2のプライマーお よび配列番号： 1 3のプロ一ブを用いて実施例 2の方法で PCRを行った。その結果、 配列番号： 1で未される遺伝子は脳で非常に高い発現が認められた。
実施例 5
マウス神経幹細胞分化誘導系における配列番号： 1で示される遺伝子の発現解析 マウス神経幹細胞からコリン作動性ニューロンへの分化誘導系における発現に ついて調べた。 神経幹細胞は ΊΤ14- 15の Balb/cマウスの胎仔を用い、 neurosphere 法 (Exp Neurol, 1997 Apr; 144(2)： 350-60) により調製した。 分化誘導は神経幹 細胞を ECLコート （UPSTATE biotechnology; 08-110) 上で 100ng/ml NGF (Genzyme techne； 2256) を含む培地 (DMEM (Gibco; 11995-065), N2 supplement (Gibco; 17502-048) ) で培養 （条件 37° (：、 5% C02 incubator内） し、 分化誘導 0日から 1 日にかけて S g/ml AraC (cytosine-B-D-arabinofuranoside; Sigma; C1768) 処置 することにより行った。 コリン作動性神経への分化確認のため、 分化誘導を行った 神経幹細胞から調製した cDNAを铸型に、 配列番号： 4、 配列番号： 5のプライ マーと配列番号： 8のプローブを用いて実施例 2の方法で PC Rを行ったところ、 Ch ATの発現上昇を確認した。 配列番号： 1 1、 配列番号： 12のプライマーお よび配列番号： 13のプローブを用いて上記と同様の方法で PCRを行った。 その結 果、 配列番号： 1で示される遺伝子は分化誘導を行った神経幹細胞において発現上 昇が認められた。
実施例 6
配列番号： 1で示される遺伝子のクローニング
マウス脳由来の Marathon- Ready cDNA (Clontech社） を铸型とし、 配列番号： 1 9および配列番号： 20のプライマーを用いて PCR反応を行った。 該反応におけ る反応液の組成は上記 cDNAを铸型として使用し、 配列番号： 19、 配列番号： 2 0のプライマ一を各 0.4 Μ (最終濃度） 、 dNTP(TAKARA)を 0.2 mM、 10X Pfu DNA polymerase reaction buffer (stratagene 600250) 2 1、 PfuTurbo DNA polymerase (stratagene600250) 2.5 U を加え、 20 1 の液量とした。 PCR反応は、 95 · 2 分の後、 95°C ''30秒、 60°C ' 30秒、 72°C · 3分のサイクルを 30回繰り返し、 最後 に 72°C · 10 分の伸長反応を行った。 pcDNA3.1/V5- HisTOPO TA expression kit ( Invitrogen 社 K4800- 01 ) のプロ トコ一ルに従いプラスミ ドベクター pcDNA3.1/V5- HisTOPO ベクター （Invitrogen社 K4800-01) へクローニングした。 これを大腸菌 （Escherichia coli) TOP 10 F， （Invitrogen社 K4800- 01) に導 入し、 c DNAを持つクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、配列番号： 1と同一の 0RFを含む配列番号： 21とバリアントと想定される配列番号： 1の 0RFより 3塩基少ない （配列番号： 1の 498-500 bp欠損） 配列番号： 22の c DNA配列を得た。 （配列番号： 22 の cDNAにおけるタンパク質コード領域 （Open Reading Frame) の塩基配列を配 列番号： 2 7として、配列番号： 27で示されるタンパク質コ一ド領域（Open Reading Frame) の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号： 26として示す。 ） 実施例 7
P19細胞における配列番号： 1で示される遺伝子の機能解析 配列番号： 1で示される遺伝子の機能を調べるため、 P19細胞に配列番号： 22で 示さ れる遺伝子の導入を行い、 神経細胞マ一カ ーであ る ΜΑΠ (Microtubule- associated protein 2) およびコリン作動性神経マーカー ChAT (choline acetyl transferase) の発現について調べた。 遺伝子導入はプロトコ一 ルに従い FUGENE (Roche cat.1814443)で行った。 発現ベクターには実施例 6で構築 した配列番号： 22で示される遺伝子 （以下、 114443遺伝子と称することがある） を発現する pcDNA3.1/V5- HisTOPO ベクターを用いた。 10cm dish に 5.0X105個 /dishで播種した P19細胞に、 FUGENE 発現ベクター 5 gを加え遺伝子導 入を行った。遺伝子導入後 6- 8時間後より実施例 1に示した分化誘導を 2日間行い、 その後 AraC非存在下で 3日間培養を行つた。 分化誘導後より経時的に RNAを調製 し、 その cDNAを铸型とし配列番号： 23、 配列番号： 24 (MAP2) 、 配列番号： 2、 配列番号： 3 (ChAT)のプライマ一及び配列番号： 25 (MAP2) 、 配列番号： 8 (ChAT)のプローブを用いて実施例 2の方法で PCRを行つた。 その結果コントロール と比較し、 114443遺伝子導入により分化誘導後 3日で、 ChATの発現は 1.9倍、 MAP2 の発現は 1.5倍増加した。 このことから、 114443遺伝子は P19細胞においてコリン 作動性神経への分化を促進していることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明で用いられるタンパク質は、 神経系疾患の診断マ一カーであり、 したがつ て、 該タンパク質の活性や遺伝子発現を促進する化合物またはその塩は、 例えば神 経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 脊髄損傷、 てんかん、 精 神分裂病、 うつ病など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。 また、 本発明の夕ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、 本発明で用いられるタンパ ク質の発現を促進することができ、 例えば、 神経系疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、脊髄損傷、 てんかん、精神分裂病、 うつ病など）などの予防 · 治療剤として使用することができる。 従って、 本遺伝子の発現や遺伝子産物の機能 を調節する薬剤を適切に用いることによって神経変性疾患の新たな治療法が開拓 できると考えられる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促 進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
2 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の活 性を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
3 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の活 性を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
4 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の活 性を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
5 . 活性が神経細胞分化活性である請求項 1ないし 4記載の剤。
6 . 神経細胞分化促進剤である請求項 1ないし 4記載の剤。
' 7 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の 発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
8 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の遺 伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治 療剤。
9 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の遺 伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予防 ·治 療剤。
1 0 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩の 遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩を含有してなる神経変性疾患の予 防 ·治療剤。
1 1 . 神経細胞分化促進剤である請求項 7ないし 1 0記載の剤。
1 2 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有し てなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
1 3 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を 含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
1 4 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を 含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
1 5 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩を 含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
1 6 . 神経細胞分化促進剤である請求項 1 2ないし 1 5記載の剤。
1 7 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌク レオチドを含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
1 8 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポ リヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
1 9 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポ リヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
2 0 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一'ドするポ リヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の予防 ·治療剤。
2 1 . 神経細胞分化促進剤である請求項 1 7ないし 2 0記載の剤。
2 2 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレ ォチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分 を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
2 3 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポ リヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
2 4 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポ リヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部分を含有するァンチセンスボリヌクレオチド。
2 5 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポ リヌクレオチドの塩基配列に相補的 ½>しくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部分を含有するァンチセンスポリヌクレオチド。
2 6 . 請求項 2 2ないし 2 5記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる
2 7 . 神経細胞分化抑制剤である請求項 2 6記載の医薬。
2 8 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体。
2 9 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分 ぺプチドまたはその塩に対する抗体。
3 0 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分 ぺプチドまたはその塩に対する抗体。
3 1 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体。
3 2 . 請求項 2 8ないし 3 1記載の抗体を含有してなる医薬。
3 3 . 神経細胞分化抑制剤である請求項 3 2記載の医薬。
3 4. 請求項 2 8ないし 3 1記載の抗体を含有してなる診断薬。
3 5 . 神経変性疾患の診断薬である請求項 3 4記載の診断薬。
3 6 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレ ォチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。
3 7 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分 ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。
3 8 . 配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分 ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。
3 9 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその部分 ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる神経変性疾患の診断薬。
4 0 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる ことを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
4 1 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる ことを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の遺伝子 の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
4 2 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有す ることを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性 を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
4 3 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有す ることを特徴とする、 該夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の遺伝 子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
4 4 . 請求項 4 0もしくは 4 1記載のスクリーニング方法または請求項 4 2もしく は 4 3記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
4 5 . 請求項 4 4記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
4 6 . 神経変性疾患の予防 ·治療剤である請求項 4 5記載の医薬。
4 7 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
4 8 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する夕ンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の遺伝子の発現を促進ずる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法。
4 9 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
5 0 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレ ォチドを用いることを特徴とする、 該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
5 1 . 請求項 4 7もしくは 4 8記載のスクリーニング方法または請求項 4 9もしく は 5 0記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩。
5 2 . 請求項 5 1記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
5 3 . 神経変性疾患の予防 ·治療剤である請求項 5 2記載の医薬。
5 4 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を 促進することを特徴とする神経変性疾患の予防 ·治療方法。
5 5 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する夕ンパク質もしくはその部分べプチドの遺伝子の発現を促進 することを特徴とする神経変性疾患の予防 ·治療方法。
5 6 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする神 経変性疾患の予防 ·治療方法。
5 7 . 配列番号： 1 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の遺伝子 の発現を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴 とする神経変性疾患の予防 ·治療方法。
5 8 . 神経変性疾患の予防 ·治療剤の製造のための配列番号： 1 4で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用。
5 9 . 神経変性疾患の予防 ·治療剤の製造のための配列番号： 1 4で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を促進する化合物またはその 塩の使用。
6 0 .配列番号： 2 7で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
61. 請求項 60記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
62. 請求項 60記載のタンパク質または請求項 61記載の部分ペプチドをコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
63. DN Aである請求項 62記載のポリヌクレオチド。
64. 配列番号： 26で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド。
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