WO2004007755A3 - Reactions d'acides nucleiques multiplexes - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne diverses techniques de multiplexage utilisées pour amplifier et/ou génotyper simultanément une variété d'échantillons. Cette invention concerne une technique de détection de séquence cible. Cette technique consiste: (a) à mettre en contact une première et une deuxième sonde avec une séquence cible dans des conditions dans lesquelles des sondes complémentaires forment un complexe d'hybridation avec cette séquence cible, la première sonde comprenant un site amont d'amorçage universel et une séquence spécifique de la cible, la deuxième sonde comprenant un site aval d'amorçage universel et une séquence spécifique de la cible et la première ou la deuxième sonde comprenant une séquence d'adaptateur, (b) à étendre la première et la deuxième sonde du complexe d'hybridation de façon à former une sonde modifiée, (c) à amplifier cette sonde modifiée de façon à former un amplicon et, (d) à détecter cet amplicon. Cette invention concerne aussi une technique de détection des quantités relatives de ces séquences cible (au moins deux). Cette technique consiste: (a) à mettre en contact des premières et des deuxièmes sondes avec des premières et des deuxièmes séquences cible dans une population initiale dans des conditions dans lesquelles des sondes complémentaires forment un complexe d'hybridation avec la séquence cible, les premières et les deuxièmes sondes comprenant un site d'amorçage universel, une séquence d'adaptateur et une séquence spécifique de la cible, (b) à amplifier linéairement les premières et les secondes sondes formant le complexe d'hybridation de façon à produire des premiers et des deuxièmes amplicons possédant des séquences d'adaptateur différentes et, (c) à déterminer une quantité relative des premiers et des deuxièmes amplicons que la séquence d'adaptateur puisse distinguer, cette quantité relative d'amplicons donnant une indication sur les quantités relatives des premières et des deuxièmes séquences cible présentes dans la population initiale. Cette invention concerne aussi une technique d'amplification d'une séquence cible de façon à produire un signal dans une plage dynamique d'un dosage de détection. Cette technique consiste: à hybrider une sonde spécifique de la cible possédant un site amont d'amorçage universel (UUP), un site aval d'amorçage universel (DUP) et une séquence d'adaptateur avec un ensemble d'amorces différentielles, cet ensemble d'amorces différentielles comprenant une amorce amont et une première et une deuxième amorce aval, la deuxième amorce aval possédant un Tm inférieur comparé au Tm de l'amorce amont et au Tm de la première amorce aval, (b) à amplifier la sonde avec cet ensemble d'amorces différentielles pendant au moins deux cycles de polymérisation enzymatiques, (c) à augmenter la rigueur des conditions d'hybridation de façon à supprimer l'hybridation de la deuxième amorce aval et, (d) à amplifier la sonde de l'amorce amont et des premières amorces aval de l'ensemble pendant au moins un cycle de polymérisation enzymatique, les signaux différentiels des amplicons produits en provenance d'amplicon des premières et des deuxièmes amorces aval tombant dans une plage dynamique d'un dosage de détection.
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