CN114277095A - 一种检测基因变异的核苷酸组合物及其构建的高通量测序文库 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测基因变异的核苷酸组合物及其构建的高通量测序文库，属于基因检测技术领域。本发明提供的核苷酸组合物基于探针差异连接，用于检测目标模板中的变异，目标模板与非目标模板至少存在一个碱基的变异，包括阻滞探针、连接探针一和连接探针二：阻滞探针与非目标模板特异性结合；目标模板上设有不相连的连接探针一和连接探针二，连接探针一和连接探针二与目标模板特异性结合，且分别位于目标模板变异位点的两侧，与目标模板变异位点互补的碱基位于连接探针一或连接探针二上。本发明的核苷酸组合物能够检测核酸样本中低至0.1％的变异信息，基于此构建的高通量测序文库不需要高深度的测序，测序数据量小，可检测位点数大大增加。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种检测基因变异的核苷酸组合物及其构建的高通量测序文库。
背景技术
基于高通量测序(next-generation sequencing,NGS，也叫二代测序)技术，对游离循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)进行检测的液体活检技术，有望改善肿瘤的诊断和治疗。
与组织活检相比，液体活检具有操作要求低、创伤小、易于频繁采样、采样偏差小等优点。一般来说，肿瘤患者中，细胞凋亡和肿瘤细胞坏死是ctDNA的主要来源，ctDNA在血液、尿液、脑脊液等体液中的含量很低，通常在游离于细胞外的DNA(cell free DNA，cfDNA)中的占比小于1％。
NGS可以一次性对成千上万个位点进行测序，可以应用到肿瘤筛查，靶向用药选择，耐药鉴定，治疗效果评估等方面。不过受制于测序文库构建流程和测序平台，NGS的检测下限一般在2％。基于唯一分子标签(unique molecular identifier，UMI)的文库构建方法可以提高NGS的检测灵敏度至0.1％，但是这通常要求大于25000X的超高测序深度，限制了UMI-NGS技术在检测低于1％的低频变异场景的应用。
目前用于低频变异检测的方法除了UMI-NGS外，常用的方法还包括等位基因阻滞扩增系统(ARMS)和数字PCR技术。ARMS和数字PCR技术的检测灵敏度可达0.1％，但是只能检测有限数量的变异位点，检测通量很难提高。
因此，目前市场急需一种对测序深度要求不高，却能够检测低于1％的低频变异的高通量测序技术。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于探针差异连接的用于检测等位基因变异的核苷酸组合物。
本发明提供了一种检测基因变异的核苷酸组合物，用于检测目标模板中的变异，目标模板与非目标模板至少存在一个碱基的变异，该核苷酸组合物中包括阻滞探针、连接探针一和连接探针二，其中：
阻滞探针根据非目标模板进行设计，与非目标模板特异性结合；
目标模板上设有不相连的连接探针一和连接探针二，连接探针一和连接探针二与目标模板特异性结合，且分别位于目标模板变异位点的下游互补区和上游互补区，与目标模板变异位点互补的碱基位于连接探针一或连接探针二上。
进一步地，连接探针一、连接探针二和目标模板变异位点的对应部分完全互补配对，阻滞探针序列和非目标模板序列完全互补配对。
进一步地，连接探针和阻滞探针依据热动力学原理进行设计，阻滞探针和非目标模板结合的吉布斯自由能(G阻滞)与连接探针和非目标模板结合的吉布斯自由能(G连接)之差ΔG阻滞-连接可以是-9.5～-8.5kcal/mol，-8.5～-7.5kcal/mol，-7.5～-6.5kcal/mol，-6.5～-5.5kcal/mol，-5.5～-4.5kcal/mol，-4.5～-3.5kcal/mol，-3.5～-2.5kcal/mol，-2.5～-1.5kcal/mol，-1.5～-0.5kcal/mol。优选地，ΔG阻滞-连接为-4.5～-3.5kcal/mol或-3.5～-2.5kcal/mol。其中，连接探针和非目标模板结合的吉布斯自由能是指连接探针一和非目标模板结合的吉布斯自由能与连接探针二和非目标模板结合的吉布斯自由能之和。
进一步地，连接探针一和连接探针二与目标模板反向互补且首尾相邻，即连接探针一和连接探针二分别与目标模板不同区域特异性结合后，在变异位点互补碱基处断开，互补碱基位于连接探针一的3′端或位于连接探针二的5′端。
进一步地，连接探针一和连接探针二上远离变异位点的一侧带有文库接头序列(adapter)，本发明的实施例中，连接探针一的5′端和连接探针二的3′端分别带有文库接头序列。
进一步地，连接探针二的5′端进行磷酸化修饰，用于连接酶催化的连接反应。
本发明还提供了一种不依赖于高深度测序的能够检测低频变异的二代测序文库构建方法，包括以下步骤：
(1)将待测样本DNA、阻滞探针、连接探针一和连接探针二进行杂交，杂交完成后进行连接反应，其中，待测样本DNA中包含目标模板和非目标模板；
(2)对步骤(1)得到的连接产物进行样本标签(index)PCR扩增，构建得到高通量测序文库。
进一步地，待测样本DNA可为cfDNA或gDNA，来源于血浆、血清、血液、尿液、汗液、唾液、精液、胸水、腹水、粪便、穿刺样本或石蜡包埋组织(FFPE)样本。
进一步地，在步骤(1)中，加入DNA连接酶进行连接反应。
进一步地，上述高通量测序文库的构建方法具体为：
(1)将待测样本DNA进行变性；
(2)向含有上述待测样本DNA中加入杂交缓冲液、连接探针一、连接探针二和阻滞探针，混合均匀后，进行杂交，得到杂交混合液；
(3)将连接缓冲液A、连接缓冲液B和连接酶混合均匀，加入上述杂交混合液，混匀，进行连接反应；
(4)加入UDI index和上述连接产物，混合均匀，进行PCR反应；
(5)对PCR扩增产物进行纯化，得到最终的高通量测序文库。
本发明中，根据结合自由能的差异设计，当目标模板、非目标模板、阻滞探针以及连接探针存在于同一个体系中进行杂交反应的时候，非目标模板与阻滞探针结合，目标模板与连接探针结合。当连接探针一、连接探针二与目标模板结合后，能够被随后的DNA连接酶连接成一条完整的连接探针。连接探针一和连接探针二上分别带有文库接头序列，可以与随后的index引物发生互补配对，从而被扩增形成完整的测序文库。
上述核苷酸组合物或构建得到的高通量测序文库可用于检测低频变异(低至0.1％的变异)，制备成检测低频变异试剂盒时，包括上述核苷酸组合物或高通量测序文库。
本发明的一种低频变异检测方法，对待测样本构建上述高通量测序文库，富集目标模板(变异DNA)，对富集的目标模板进行测序，得到变异信息。
进一步地，对高通量测序文库进行测序时，测序深度为100X-1000X。
本发明用于检测基因变异的优势在于：(1)把高通量测序(next generationsequencing,NGS)技术的检测灵敏度从2％提高至0.1％；(2)由于目标模板的比例被放大，本发明的检测方法不需要高深度的测序，测序数据量较小，赋予桌面型的测序平台开展肿瘤液体活检的能力；(2)与传统的探针杂交捕获文库构建方法相比，本方法操作简单，不需要进行DNA打断和末端修复等过程，显著缩短了文库构建以及基因变异检测的时间；(3)针对变异分子富集的技术平台，现有技术中大都采用定量PCR技术，每管检测的位点少(只有1-5个位点)，若增加位点需要分管进行检测，导致样本量的消耗增大，而对于肿瘤患者，大量采血是比较困难的。本发明属于NGS技术领域，每管可检测的位点从数百到数千，对样本量的要求更低。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明在核苷酸组合物中引入阻滞探针，阻滞探针和连接探针竞争性地与目标模板或非目标模板结合，从而有效地富集变异分子(目标模板)，提高文库中变异等位基因的比例，从而提高检测的灵敏度，可以检测低至0.1％的变异。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明的核苷酸组合物的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中，高通量测序文库的构建方法包括以下步骤：
(1)核酸变性：将cfDNA或者gDNA样本进行变性。变性程序设置为：95℃，2min；25℃，hold。
(2)核酸杂交：往上述含有样本的PCR管中加入1.5μL杂交缓冲液、0.75μL连接探针1和连接探针2混合液、0.75μL阻滞探针。混合均匀后，放入PCR仪中，启动杂交程序。杂交程序设置为：95℃，30sec；60℃，16hrs；60℃，hold。
(3)探针连接：在新的离心管中依次加入3μL连接缓冲液A，3μL连接缓冲液B和1μL连接酶Ligase-65，混合均匀。保持PCR管在PCR仪上，将PCR仪温度降至54℃，在PCR管中加入7μL前述配制好的连接混合液，混匀，运行连接程序。连接程序设置为：54℃，15min；98℃，5min；4℃，hold。
(4)核酸扩增：在新的PCR管中依次加入25μL 2X HiFi PCR MasterMix，5μL UDIindex和20μL上述连接产物。混合均匀后，放入PCR仪中，进行PCR反应。PCR反应的程序设置为：98℃，2min；(98℃，15sec；60℃，30sec；72℃，30sec)X 30cycles；72℃，2min；4℃，hold。
(5)对PCR扩增产物进行纯化，得到最终的测序文库。
根据DNA投入量，各反应使用的酶，缓冲液和反应体系的不同，以上步骤中各反应的温度和时间可以进行调整。上述步骤中各反应的温度和时间仅仅作为示例，并非对本发明范围的限定。应当理解，不脱离探针差异连接(differential probes ligation，DPL)的创造构思而对技术方案进行修改或变形也属于本发明的保护范围之内。
实施例1
本实施例以肺癌相关基因热点变异检测和Illumina高通量测序平台为例。
一、探针设计与合成
针对肺癌相关基因的热点变异位点，根据热动力学原理进行阻滞探针和连接探针的设计与合成，其中连接探针2的5’端进行磷酸化修饰。本发明实施例所涉及的肺癌相关基因热点变异位点和对应的探针分别如表1和表2所示。
表1本发明实施例涉及的肺癌热点变异位点及对应探针序号
表2探针序列信息
本实施例中的探针可以应用到不同品牌的第二代测序平台，包括但不限于Illumina、ThermoFisher和BGI等。
二、待测样本准备
本发明实施例所检测的样本包括24例未知血浆样本和4例cfDNA标准品。未知样本采用DPL技术和对照技术(ARMS PCR技术)同时进行基因检测。cfDNA标准品包含6个单碱基变异(SNV)、1个缺失和1个插入位点，其变异频率经过数字PCR标定，分别为1％、0.5％、0.1％和0％，采用DPL技术分别进行3次重复检测。
三、血浆样本游离DNA提取
1、将10mL新鲜采集的全血样本在4小时内进行血浆的分离，4℃1600g离心20分钟，将上清血浆转移至新的离心管。再于16000g离心10分钟，去除残留细胞，并将上清血浆转移至15mL离心管中。
2、往含有血浆的15mL离心管中依次加入160μL蛋白酶K和400μL样本裂解液，涡旋震荡混匀上述离心管，并于60℃孵育20分钟。
3、孵育的同时，在另一离心管中依次加入游离DNA裂解/结合液和纳米磁珠(每反应加入5mL游离DNA裂解/结合液和60μL纳米磁珠)制备合适反应体积的纳米磁珠结合溶液并混匀。
4、孵育结束后，将离心管平衡至室温，并将制备好的纳米磁珠结合溶液加入已经完成裂解的血浆样本中，颠倒10次混匀。
5、将离心管以1000rpm转速振荡10分钟后，置于磁力架上静置5分钟待管内溶液澄清。
6、小心弃掉上清，将离心管从磁力架上取下，加入1mL洗涤液，并涡旋震荡以重悬纳米磁珠。
7、将已重悬的纳米磁珠溶液转移入一个新的1.5mL离心管，并置于磁力架上静置2分钟待管内溶液澄清。
8、小心弃掉上清，将离心管从磁力架上取下，加入1mL洗涤液，并涡旋震荡以重悬纳米磁珠。短暂离心后，置于磁力架上静置2分钟待管内溶液澄清。
9、小心弃掉上清，将离心管从磁力架上取下，加入1mL新鲜制备的二次洗涤液，并涡旋震荡以重悬纳米磁珠。短暂离心后，置于磁力架上静置2分钟待管内溶液澄清。
10、小心弃掉上清包括管底部残余液体，将离心管置于磁力架上，开盖3分钟室温晾干。
11、将离心管从磁力架上取下，加入45μL洗脱液，充分震荡离心管以使纳米磁珠重悬，室温静置5分钟。
12、将离心管短暂离心后，置于磁力架上2分钟待管内溶液澄清，收集43μL上清(cfDNA)置于另一干净的离心管中进行保存。
13、取1μL cfDNA用Qubit测定cfDNA的浓度。24例cfDNA的浓度如表3所示。
表3 24例血浆样本游离DNA浓度的Qubit测定结果
四、文库构建和高通量测序
DNA变性
1、取30ng cfDNA样本置于0.2mL低吸附离心管中并用0.1X TE补足至30μL。
2、混合混匀，瞬时离心，放进PCR仪中，启动如下PCR程序：95℃，2min；25℃，∞。
杂交反应
1、从PCR仪中取出PCR管，向PCR管中依次加入1.5μL杂交缓冲液，0.75μL连接探针和0.75μL阻滞探针。
2、混合混匀，瞬时离心，放进PCR仪中，启动如下PCR程序：95℃，30s；60℃，16h；60℃，∞。
连接反应
1、在新的离心管中配制连接混合液，按照每反应依次加入3μL连接缓冲液A，3μL连接缓冲液B和1μL连接酶Ligase-65。
2、将离心管混合均匀，瞬时离心。保持PCR管在PCR仪上，将PCR仪温度降至54℃，打开PCR管盖，加入7μL前述配制好的连接混合液。
3、使用移液器将PCR管中连接反应液吹吸混匀，调节PCR仪进入连接反应程序：54℃，15min；98℃，5min；4℃，hold。
PCR扩增
1、待连接反应结束，在新的PCR管中依次加入25μL 2X HiFi PCR Master Mix，5μLUDI index和20μL上述连接产物。不同的样本使用不同的UDI index。
2、混合混匀，瞬时离心，放进PCR仪中，启动如下PCR程序：98℃，2min；(98℃，15sec；60℃，30sec；72℃，30sec)X 30cycles；72℃，2min；4℃，hold。
文库纯化
1、向含有扩增产物的PCR管中加入60μL提前平衡至室温的Ampure XP Beads，混合均匀，25℃孵育5分钟。
2、将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5分钟至液体完全澄清，使用移液器吸取移弃上清。
3、沿离心管壁缓慢加入200μL新鲜配制的80％乙醇，静置30s，使用移液器移弃上清。
4、重复以上步骤一次。
5、离心管置于磁力架上，使用10μL吸头移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠。
6、将磁珠置于室温干燥2-5分钟，至乙醇挥发完全。
7、移出PCR管，向PCR管中加入21μL TE Solution，将磁珠悬浮混匀，25℃孵育5分钟。
8、将PCR管瞬时离心后放置于磁力架上5分钟至液体完全澄清，使用移液器小心吸取20μL上清转移至一个新的0.2mL PCR管中保存。
高通量测序
DNA文库经QC合格后，在Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台进行2x150 bp双端测序，平均测序深度为1000X。
五、生物信息学数据分析
NovaSeq产生的原始下机数据经过去接头、过滤低质量数据和基因组reference比对后，对靶位点的基因变异进行识别。标准品和血浆样本的检测结果分别见表4和表5。
表4 4例已知变异频率的标准品重复3次检测结果
注：+表示该位点检测结果为阳性，-表示该位点检测结果为阴性。
表5血浆样本检测结果
| 血浆样本编号 | 对照技术检测结果 | DPL检测结果 |
| 1 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | EGFR 19DEL | EGFR 19DEL |
| 3 | EGFR L858R | EGFR L858R |
| 4 | 野生型 | 野生型 |
| 5 | 野生型 | 野生型 |
| 6 | EGFR L858R | EGFR L858R+EGFR G719A |
| 7 | EGFR 19DEL | EGFR 19DEL |
| 8 | EGFR L858R | EGFR L858R |
| 9 | 野生型 | 野生型 |
| 10 | BRAF V600E | BRAF V600E |
| 11 | EGFR T790M | EGFR T790M |
| 12 | KRAS G12X | KRAS G12D |
| 13 | 野生型 | 野生型 |
| 14 | EGFR 19DEL | EGFR 19DEL |
| 15 | 野生型 | 野生型 |
| 16 | 野生型 | 野生型 |
| 17 | EGFR L858R | EGFR L858R |
| 18 | EGFR G719X | EGFR G719A |
| 19 | EGFR T790M | EGFR T790M |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
| 21 | EGFR L858R | EGFR L858R |
| 22 | BRAF V600E | BRAF V600E |
| 23 | 野生型 | 野生型 |
| 24 | 野生型 | 野生型 |
从表4的结果可以看出，本方案对30ng的cfDNA标准品可以稳定检出低至0.1％变异频率的SNV和INDEL，灵敏度和特异性均达100％。
从表5的数据可以看出，24例血浆样本同时使用DPL和对照技术进行检测。其中23例样本，两种方法检测的结果完全一致，包括10例野生型和13例变异型。其中1例样本，6号样本，对照技术检测结果为EGFR L858R；本发明的DPL技术除了同样检出EGFR L858R变异外，还检出了EGFR G719A变异。我们用数字PCR技术对这例样本的G719A位点进行了验证。数字PCR结果显示，G719A的变异频率为0.12％。
以上结果表明，本发明只需要平均1000X的较低测序深度，就可以稳定检出变异频率低至0.1％的基因变异。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司
<120> 一种检测基因变异的核苷酸组合物及其构建的高通量测序文库
<160> 96
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ctacacgacg ctcttccgat ctgcatgtca agatcacaga ttttgggcg 49
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ctacacgacg ctcttccgat ctcctccacc gtgcagctca tcat 44
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ctacacgacg ctcttccgat cttgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc aa 52
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ctacacgacg ctcttccgat ctagcctacg tgattggcca gcg 43
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ctacacgacg ctcttccgat ctctgaattc aaaaagatca aagtgctggc 50
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
ctacacgacg ctcttccgat ctggcactct tgcctacgcc at 42
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
ctacacgacg ctcttccgat ctgtccctca ttgcactgta ctcctcg 47
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
ctacacgacg ctcttccgat ctcagtgtta cttacctgtc ttgtctttgc 50
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
ctacacgacg ctcttccgat cttgggaccc actccatcga gatttct 47
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ctacacgacg ctcttccgat ctgtagactg ttccaaatga tccagatct 49
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
ctacacgacg ctcttccgat cttgcgcttt tcccaacacc at 42
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
ctacacgacg ctcttccgat ctggtctctc atggcactgt actcttcttt 50
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
ctacacgacg ctcttccgat ctcacgagat cctctctctg aaatcacta 49
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
ctacacgacg ctcttccgat ctgagtattt catgaaacaa atgaatgatg cacg 54
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
ctacacgacg ctcttccgat ctaattccag tggccatcaa agtgtc 46
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
ctacacgacg ctcttccgat ctcatacgtg atggctatac gtgatggc 48
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
ctacacgacg ctcttccgat ctgactaccg agctactttt ccagaagt 48
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
ctacacgacg ctcttccgat ctttgctgat tttggtcttg ccagaa 46
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
ctacacgacg ctcttccgat ctggccgcca ggtcttgatg tactt 45
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
ctacacgacg ctcttccgat ctgctttacg caaataagta agaaggtctc t 51
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
ctacacgacg ctcttccgat ctccccgcca tgagctccat 40
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
ctacacgacg ctcttccgat ctatccagtt cgtcctgttc agagt 45
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
ctacacgacg ctcttccgat cttcactttg actcaccggt ggatgc 46
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
ctacacgacg ctcttccgat ctatggtctt tgagtatatg cggcaca 47
<210> 25
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
ctacacgacg ctcttccgat ctgcttacct gaggaactta ttcaggtctc t 51
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
ctacacgacg ctcttccgat ctctcccagg acaggcacaa acat 44
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
ctacacgacg ctcttccgat ctatgatggt gaggatgggc ctct 44
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
ctacacgacg ctcttccgat ctggctcata gggcaccacc at 42
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
ctacacgacg ctcttccgat ctgctcatgg tgggggcagt 40
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
ctacacgacg ctcttccgat ctagggcaag ttcactacag caaga 45
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
ctacacgacg ctcttccgat ctgccttgag gcctttctta cccc 44
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
ctacacgacg ctcttccgat ctctccaatt caggacccac acgat 45
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 33
ggccaaactg ctgggtgcgg agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 34
gcagctcatg cccttcggct agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 35
aacatctccg aaagccaaca aggaaagatc ggaagagcac acgtctga 48
<210> 36
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 36
ggccagcgtg gacaaccccc agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 37
ctccggtgcg ttcggcacag atcggaagag cacacgtctg a 41
<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 38
cagctccaac taccacaagt ttatattcag atcggaagag cacacgtctg a 51
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 39
tgacctgctg tgtcgagaat atccaaagat cggaagagca cacgtctga 49
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 40
tgatgtttca ataaaaggaa ttccataact tcagatcgga agagcacacg tctga 55
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 41
ctgtagctag accaaaatca cctatttaga tcggaagagc acacgtctga 50
<210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 42
aattctttgt cccactgtaa tctgcagatc ggaagagcac acgtctga 48
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 43
ctgctccaac caccaccagt agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 44
tccagctgta tccagtatgt ccaacaagat cggaagagca cacgtctga 49
<210> 45
<211> 52
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 45
agcaggagaa agattttcta tggagtcaca gatcggaaga gcacacgtct ga 52
<210> 46
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 46
tcatggtggc tggacaacaa aaatgagatc ggaagagcac acgtctga 48
<210> 47
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 47
gagggaaaac acatccccca aagcagatcg gaagagcaca cgtctga 47
<210> 48
<211> 46
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 48
ggtgtgggct ccccatatgt ctcagatcgg aagagcacac gtctga 46
<210> 49
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 49
tatatttcag tttattgttc tgagaaatac ctaagatcgg aagagcacac gtctga 56
<210> 50
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 50
acatgtatga taaagaatac tatagtgtac acaacagatc ggaagagcac acgtctga 58
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 51
ccctacagac gtgcgggtgg agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 52
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 52
tccctccatc agttccagga taatgtatag atcggaagag cacacgtctg a 51
<210> 53
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 53
caggatgaac cggggcagga gatcggaaga gcacacgtct ga 42
<210> 54
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 54
acacttcagg cagcgtctgg agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 55
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 55
agtggttttc ctccaaatac tgacagcaga tcggaagagc acacgtctga 50
<210> 56
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 56
gggacctcaa ccgcttcctc cagatcggaa gagcacacgt ctga 44
<210> 57
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 57
atgcttcatg tattcaaaga ccatgatgag agatcggaag agcacacgtc tga 53
<210> 58
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 58
gcacctcaaa gctgttccgt ccagatcgga agagcacacg tctga 45
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 59
ggttcatgcc gcccatgcag agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 60
actatgtcga aaagtgtttc tgtcatcaga tcggaagagc acacgtctga 50
<210> 61
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 61
gcctcacaac ctccgtcatg tgagatcgga agagcacacg tctga 45
<210> 62
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 62
gatgtgtggg cctttggggt agatcggaag agcacacgtc tga 43
<210> 63
<211> 46
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 63
gaagcagaag gtgggagaac tgaagatcgg aagagcacac gtctga 46
<210> 64
<211> 50
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 64
gggaagacaa gttcatgtac tttgagtaga tcggaagagc acacgtctga 50
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 65
cagattttgg gctggccaaa ctg 23
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 66
cagctcatca cgcagctcat gc 22
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 67
ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaag 29
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 68
cctacgtgat ggccagcgtg 20
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 69
aagtgctggg ctccggtg 18
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 70
ctacgccacc agctccaact ac 22
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 71
actgtactcc tcttgacctg ctgtg 25
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 72
cctgtcttgt ctttgctgat gtttcaataa 30
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 73
ccatcgagat ttcactgtag ctagacc 27
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 74
atgatccaga tccaattctt tgtccc 26
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 75
ccaacaccac ctgctccaac 20
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 76
actgtactct tcttgtccag ctgtatcc 28
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 77
ctctgaaatc actgagcagg agaaaga 27
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 78
tgaatgatgc acatcatggt ggctg 25
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 79
gccatcaaag tgttgaggga aaacaca 27
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 80
tacgtgatgg ctggtgtggg ct 22
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 81
cttttccaga aggtatattt cagtttattg 30
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 82
gtcttgccag agacatgtat gataaag 27
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 83
gtcttgatgt actcccctac agacg 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 84
taagaaggtc tcctccctcc atcag 25
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 85
atgagctcca gcaggatgaa cc 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 86
ctgttcagag cacacttcag gc 22
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 87
accggtggat gaagtggttt tcc 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 88
tatatgcggc acggggacct caa 23
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 89
cttattcagg tctccatgct tcatgtattc 30
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 90
ggcacaaaca cgcacctcaa ag 22
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 91
tgggcctccg gttcatgcc 19
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 92
gcaccaccac actatgtcga aaag 24
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 93
ggggcagcgc ctcacaac 18
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 94
ctacagcaag tgatgtgtgg gc 22
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 95
ctttcttacc cagaagcaga aggtg 25
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 96
cccacacgac gggaagacaa 20
Claims (10)
1.一种检测基因变异的核苷酸组合物，其特征在于，所述核苷酸组合物用于检测目标模板中的变异，目标模板与非目标模板至少存在一个碱基的变异，该核苷酸组合物包括阻滞探针、连接探针一和连接探针二，其中：
所述阻滞探针根据非目标模板设计，与非目标模板特异性结合；
目标模板上设有不相连的连接探针一和连接探针二，所述连接探针一和连接探针二与目标模板特异性结合，且分别位于目标模板变异位点的下游互补区和上游互补区，与目标模板变异位点互补的碱基位于所述连接探针一或连接探针二上。
2.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其特征在于：所述阻滞探针和非目标模板结合的吉布斯自由能与连接探针和非目标模板结合的吉布斯自由能之差ΔG阻滞-连接为-9.5～-0.5kcal/mol。
3.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其特征在于：与变异位点互补的碱基位于连接探针一的3′端或连接探针二的5′端。
4.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其特征在于：所述连接探针一和连接探针二上远离变异位点的一侧带有文库接头序列。
5.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其特征在于：所述连接探针二的5′端含有磷酸基团。
6.一种基于权利要求1-5任一项所述的核苷酸组合物的高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样本和权利要求1-5任一项所述的核苷酸组合物进行杂交，杂交完成后进行连接反应；
(2)对步骤(1)得到的连接产物进行index PCR扩增，构建得到所述高通量测序文库。
7.权利要求6所述的构建方法构建得到的高通量测序文库。
8.权利要求1-5任一项所述的核苷酸组合物在基因变异检测中的应用。
9.一种检测等位基因变异的方法，其特征在于：按照权利要求6所述的构建方法构建待测样本的高通量测序文库，对所述高通量测序文库进行测序，得到变异信息。
10.一种检测等位基因变异的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1-5任一项所述的核苷酸组合物。
Priority Applications (1)
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| CN202111615985.5A CN114277095A (zh) | 2021-12-27 | 2021-12-27 | 一种检测基因变异的核苷酸组合物及其构建的高通量测序文库 |
Applications Claiming Priority (1)
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- 2021-12-27 CN CN202111615985.5A patent/CN114277095A/zh active Pending
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