WO2004000884A2 - Compositions et methodes pour le dosage de l'apo b48 et de l'apo b100 - Google Patents

Compositions et methodes pour le dosage de l'apo b48 et de l'apo b100 Download PDF

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WO2004000884A2
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • compositions and methods for the determination of Apo B48 and Apo B100 are provided.
  • the present invention relates to compositions and methods for assaying or detecting apolipoprotein B48 and apolipoprotein B100 in samples. It relates in particular to a method allowing the differential detection and quantification of apolipoprotein B48 ("Apo B48") and apolipoprotein B100 ("Apo B100").
  • This invention also relates to synthetic products of Apo B100, the corresponding antibodies, kits comprising them, and their uses for detecting, quantifying and / or monitoring over time the amounts of Apo B48 and / or Apo B100 in a biological sample.
  • the products, materials and kits described above can also be used to differentially modulate the levels of Apo B48 and / or Apo B100 or their activity, in vitro or in vivo, and to regulate lipid metabolism in a topic.
  • the high amounts of plasma triglycerides and the persistence of chylomicrons in the diet are factors that increase the risk of developing cardiovascular diseases which are currently responsible for the majority of deaths worldwide (Hokanson and Austin 1996).
  • the high amount of plasma lipids is correlated with the level of Apo B lipoproteins considered to be atherogenic.
  • Apolipoproteins B are heterogeneous. Very low density lipoproteins (VLDL: Very Low Density Lipoprotein) and low density lipoproteins (LDL: Low Density Lipoprotein) contain an isoform having an apparent molecular weight of approximately 549,000 Da, which is designated by the abbreviation B100 in a percentile nomenclature system, while the isoform predominantly present in chylomicrons (the major postprandial lipoproteins) has an apparent molecular weight of 246,000 Da and is identified by the abbreviation B48 in the same nomenclature.
  • Apo B48 is a truncated form of Apo B100 and is produced by post-transcriptional modification of the messenger RNA encoding Apo B100. This modification transforms codon 2153 (CAA, coding for a Glutamine) into a stop codon (Davidson, Anant et al. 1995).
  • Apo B48 and Apo B100 are key proteins in lipoprotein metabolism in mammals.
  • Apo B100 is essential for the assembly of VLDLs (Havel 1995) in the human liver (Kane 1983) and is also involved in cell capture and LDL catabolism. Its intervention has been demonstrated in the pathway involving the LDL receptor
  • the monoclonal antibody used is directed against the C-terminal region of human Apo B48. This antibody is obtained by the differential conformation of Apo B48 in the particles containing Apo B100, which can lead to different specificity and affinity of the antibodies depending on the lipid composition of the lipoparticles.
  • the present invention provides a new strategy for producing synthetic peptides specific for Apo B100 and new methods for differentially detecting and quantifying Apo B100 and Apo B48.
  • Differential quantification is typically carried out by assaying total Apo B (Apo B100 and Apo B48) in a sample, preferably using a polyclonal anti-Apo B antibody. The sample is then freed from the Apo B100 using a specific anti-Apo B100 antibody, so as to directly and specifically quantify Apo B48.
  • the present invention more particularly describes new methods of producing antibodies specific for Apo B100 using synthetic peptides specific for Apo B100.
  • the invention also describes such antibodies, kits comprising them and their uses for detecting, quantifying, purifying and / or monitoring the evolution of the amounts of Apo B100 and Apo
  • a first particular subject of the invention relates to a synthetic peptide specific for substantially pure Apo B100, comprising the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2, or an immunogenic fragment or a derivative of this peptide.
  • Another subject of the invention relates to a method for producing anti-Apo B100 antibodies comprising an immunization step using a synthetic peptide specific for Apo B100 as defined above.
  • This invention also includes the antibodies prepared according to this method, as well as, more generally, the antibodies capable of binding a peptide as defined above as well as the fragments or derivatives of such antibodies.
  • Another aspect of this invention relates to a method of detecting or assaying Apo B100 and Apo B48 in biological samples.
  • an antibody including a fragment or a derivative thereof as defined above.
  • Another object of this invention relates to a method of detecting the presence, predisposition or risk of developing a disorder linked to lipid metabolism in a subject, comprising the in vitro detection, in a sample of said subject, of Apo B100 and Apo B48 using an antibody (including a fragment or a derivative thereof) as defined above above.
  • the method is particularly suitable for detecting the presence, a predisposition or a risk of development of atherosclerosis or of a cardiovascular pathology such as for example a coronary disease.
  • a specific object of the invention relates to a method for detecting and / or monitoring the formation, development or progression of atherosclerosis in a subject, comprising in vitro detection, in a sample of said subject , the amount or level of Apo B100 and / or Apo B48 using an antibody (including a fragment or derivative thereof) as described above.
  • Another object of this invention relates to a method for detecting or monitoring in a subject the cellular capture of lipoproteins rich in triglycerides and LDL, comprising the in vitro detection of particles containing Apo B using a antibody (including a fragment or a derivative thereof) as defined above.
  • the subject is generally a mammal, preferably a human being, even more preferably a subject presenting a risk of developing cardiovascular diseases linked to a disorder of lipid metabolism such as a coronary disease, or even a subject exhibiting such a sickness.
  • Another object of this invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an antibody (including a fragment or a derivative thereof) as defined above and a pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • one aspect of the present invention relates to a synthetic peptide specific for substantially pure Apo B100 comprising the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2, or a immunogenic fragment or a derivative of this peptide.
  • “Synthetic peptide specific for Apo B100” is understood to mean all peptides synthesized in an artificial manner mimicking part of the native Apo B100 protein and comprising regions or epitopes specific to this protein and essentially absent from other proteins. These are in particular peptides comprising the sequence of an Apo B100 region absent in the other forms of Apo B, particularly in Apo B48.
  • substantially pure indicates that the peptide is essentially devoid of amino acid sequences present in Apo B48 and / or of contaminating proteins normally present or associated with Apo B in lipoparticles, such as in particular Apo Al.
  • synthetic indicates that the peptide is not a molecule obtained in a natural way but that it was prepared by an artificial process (eg, chemical synthesis, assembly, etc.) in particular as described in examples.
  • the synthetic peptide specific for Apo B100 of the invention is preferably essentially non-glycosylated.
  • the present invention now demonstrates that synthetic peptides specific for Apo B100 can be produced and used to generate specific anti-Apo B100 antibodies.
  • the invention further demonstrates that such antibodies are capable of specifically binding to Apo B100 obtained either naturally or in the form of a soluble antigen, or included in lipoparticles.
  • the invention also demonstrates that such antibodies can bind to different lipoparticles containing Apo B100 (IDL (Intermediary Density Lipoprotein), VLDL and LDL), and have immunoprecipitation properties.
  • IDL Intermediary Density Lipoprotein
  • VLDL and LDL Intermediary Density Lipoprotein
  • These synthetic peptides specific for Apo B100 and their corresponding antibodies thus represent new products which are particularly advantageous for detecting Apo B100 and quantifying Apo B100 and Apo B48 in a differential manner.
  • a synthetic peptide specific for the preferred Apo B100 of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 1, as described below, or an immunogenic fragment
  • This peptide corresponds to residues 4105 to 4215 of the sequence of mature human Apo B.
  • a synthetic peptide specific for the preferred Apo B100 of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 2, as described below, or an immunogenic fragment or a derivative of this peptide.
  • This peptide corresponds to residues 3955 to 4062 of the sequence of mature human Apo B.
  • the peptides of the invention advantageously comprise less than 200 amino acids, more preferably less than 180 amino acids.
  • derivative includes peptides comprising one or more mutations, substitutions, deletions and / or additions of one or more amino acid residues and having substantially the same antigenic specificity.
  • Typical examples of derivatives include sequence variations due to Apo B polymorphism, splicing, etc.
  • Particularly preferred derivatives include a SEQ ID NO: 1 sequence or a modified SEQ ID NO: 2 sequence comprising plus 5 amino acid residues distinct from those present in SEQ ID NO: 1 or in SEQ ID NO: 2. Additional residues may correspond to residues of transport or binding sequence, to protective groups, etc.
  • the peptide can be modified for example, chemically, physically and / or enzymatically, so as to increase its stability, increase its immunogenicity or even incorporate a label or a marker, etc.
  • modifications include glycosylation, the addition of a label (eg, myc), a marker (eg, radioactive or enzymatic labeling, etc.), etc.
  • a particular subject of the invention relates to a synthetic peptide specific for Apo B, characterized in that it comprises epitopes specific for Apo B100 and in that it is devoid of epitopes specific for Apo B48, and in what it includes the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2 or a fragment or derivative of these sequences.
  • fragment designates any peptide comprising at least 5, preferably between 5 and 30, consecutive residues of segments 4105-4139 and 4198-4 4215 of the sequence SEQ ID NO: 1 or any peptide comprising at least 5, preferably between 5 and 40, consecutive residues of segment 4022-4062 of the sequence SEQ ID NO: 2.
  • fragment includes any portion as described above of the sequence SEQ ID NO: 1 or of the sequence SEQ ID NO: 2 comprising an epitope, preferably comprising at least 10 consecutive residues of the segments identified above.
  • the peptides can be soluble, purified or complexed with a carrier molecule, such as KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) or serum albumin for example, or any other inert molecule (eg, synthetic) such as a bead, etc.
  • a carrier molecule such as KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) or serum albumin for example, or any other inert molecule (eg, synthetic) such as a bead, etc.
  • the peptides are coupled to a carrier molecule. They are particularly so in the context of their use for producing antibodies. The coupling can be carried out according to conventional methods known to those skilled in the art
  • the peptides can also be conjugated or coupled to a heterologous polypeptide molecule, such as a biologically active molecule for example.
  • a heterologous polypeptide molecule such as a biologically active molecule for example.
  • the heterologous character designates any peptide which is not originating from a human Apo B molecule.
  • a particular subject of the invention relates to a composition characterized in that it comprises a synthetic peptide comprising the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2, and in that it is devoid of other apolipoprotein.
  • the peptides can be used within the framework of methods for screening for compounds modulating the activity of Apo B, titration methods, as controls, standards or for calibrating analysis methods. They can also be used to modulate the activity of the Apo B100, advantageously in a specific way. They are also particularly useful for producing anti-Apo B100 antibodies.
  • another object of the invention relates to any antibody capable of binding to a peptide as defined above, preferably in a specific manner.
  • the antibodies according to the invention have the capacity to precipitate Apo B100 (immunoprecipitants).
  • the antibody can be polyclonal or monoclonal.
  • the antibodies are monoclonal, they are present in the form of a mixture of monoclonal antibodies.
  • the term antibody also includes all fragments and derivatives of antibodies, in particular fragments and derivatives of said monoclonal or polyclonal antibodies having substantially the same antigenic specificity.
  • the latter include antibody fragments (eg, Fab, F (ab ') 2, CDRs, etc.), humanized antibodies, polyfunctional antibodies, single-stranded antibodies (ScFv), etc.
  • the antibodies of the invention can be produced using conventional methods, including immunizing an animal and recovering its serum (polyclonal) or spleen cells (so as to produce hybridomas by fusion with appropriate cell lines).
  • Preferred Antibodies of the Invention are Prepared by Immunization of a Non-Human Animal Using an Apo-Specific Synthetic Peptide
  • B100 substantially pure as described above, preferably comprising the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2, or an immunogenic fragment or a derivative of this peptide, eg, a sub-fragment comprising at least one epitope, or a mixture of immunogenic fragments or derivatives of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 (oligopeptides) and recovery of antibodies or antibody-producing cells.
  • the Fab or F (ab ') 2 fragments can be produced by digestion using a protease according to conventional techniques.
  • Humanized antibodies can be prepared according to one of the methods described, for example, in Riechmann et al. (Riechmann 1988) (Jones 1986).
  • the invention also relates to a method for producing specific anti-Apo B100 antibodies, comprising the administration (eg, injection) of a peptide of sequence SEQ ID NO: 1 or of sequence SEQ ID NO: 2, or an immunogenic fragment or a derivative of this peptide, as described above, to a non-human animal and the recovery of antibodies or antibody-producing cells.
  • the method advantageously allows the production of specific antibodies and immunoprecipitants.
  • the specificity can be verified by demonstrating the absence of a cross-reaction with other circulating blood proteins comprising Apo B48. More generally, the specificity indicates that the antibodies are capable of binding to Apo B100 with a higher affinity than any other antigen.
  • the polyclonal antibodies of the present invention are immunoprecipitant, and can thus be used to detect Apo B100 or to differentially assay Apo B100 and Apo B48 with high efficiency.
  • the antibodies can be coupled to heterologous fragments such as toxins, markers, drugs or any other therapeutic agent, covalently or not, either directly or through coupling agents.
  • the markers can be chosen from radio-markers, enzymes, fluorescent agents, magnetic particles, etc.
  • Preferred toxins are for example diphtheria toxin, botulinum toxin, etc.
  • the drugs or the therapeutic agents are chosen in particular among lymphokines, antibiotics, antisense sequences, growth factors, etc. Methods allowing the coupling of antibodies and such heterologous fragments are illustrated for example in US patent 4,277,149 and in US patent 3,996,345.
  • the antibodies of the invention have numerous applications including therapeutic, prophylactic, diagnostic, purification, detection, etc. applications.
  • ⁇ In vitro, they can be used as screening agents or to purify antigens from various samples, including various biological samples (e.g., blood samples). They can also be used to detect or quantify the presence or the amount of Apo B100 or indirectly of Apo B48 in the lipoparticles containing Apo B present in a sample collected from a subject, typically a blood sample from a mammal or, preferably, a human.
  • another subject of the invention relates to a method for detecting or quantifying Apo B100, within a biological sample, comprising bringing the sample into contact with an antibody as defined above. above (including fragments or derivatives thereof) and detecting the presence of immune antigen-antibody complexes.
  • the quantification is typically carried out in a differential manner, that is to say by assaying the total Apo B (Apo B100 and Apo B48) in a sample, which is then rid of the Apo B100 using a specific anti-Apo B100 antibody, allowing direct and specific quantification of Apo B48.
  • the concentration of Apo B100 is obtained by difference between the total measurement of Apo B and that of Apo B48.
  • This method therefore makes it possible to determine the levels of Apo B100 and Apo B48 in a sample, by determining the (relative) amounts of immune complexes in the sample (before and after the recovery of Apo B100) and the comparison at standard conditions or a calibration curve for example.
  • a preferred differential detection or quantification method therefore advantageously comprises the following steps: a. determination of the amount of total Apo B in a sample with a total anti-Apo B antibody, b. removal of Apo B100 or lipoparticles containing Apo B100 from said sample, using specific anti-Apo B100 antibodies as described above, and c. determination of the amount of Apo B48 in the sample obtained at the end of step (b) or in the lipoparticles not containing Apo B100 in this sample, with a total anti-Apo B antibody.
  • the quantities obtained in (a) and (c) allow the determination of the quantities of Apo B100 (or of lipoparticles containing Apo B100) in the sample.
  • the antibodies used can be polyclonal, monoclonal or fragments or derivatives thereof, alone, modified and / or mixed. They can in particular be used in soluble form or immobilized on supports, in particular balls, plates, columns, etc.
  • the total anti-Apo B antibody is advantageously composed of a mixture of monoclonals or of a polyclonal, in order to ensure complete detection or quantification of the antigen, in its different forms.
  • the antibody used in steps a) and c) may be the same or different. Generally, it is the same antibody.
  • a total polyclonal anti-Apo B antibody is used.
  • the total anti-Apo B polyclonal antibody can be obtained by any technique known to those skilled in the art, in particular by immunization using whole Apo B. Such antibodies are described in particular in the publications of Li (Li, Wu et al. 1997) and Levinson (Levinson and Wagner 1993).
  • step b) in order to selectively eliminate Apo B100 present in the sample, use is made of one or more specific anti-Apo B100 antibodies according to the invention, the fixation of which on Apo B100 causes the precipitation of the whole.
  • specific anti-Apo B100 antibodies according to the invention, the fixation of which on Apo B100 causes the precipitation of the whole.
  • the specific anti-Apo B100 antibodies used in step b) are polyclonal antibodies, having the property of being immunoprecipitant.
  • Another means of eliminating the lipoproteins containing Apo B100 consists in fixing anti-Apo B100 antibodies specific to proteins A or G or to other chemical molecules (chemical polymers or resins such as polyurethane, activated sepharose, etc.). These complexes can be linked to magnetic beads, allowing the elimination of Apo B100 by application of a magnetic field (eg, precipitation or magnetic separation).
  • the method of analysis according to the invention (and more specifically the detection or quantification of immune antigen-antibody complexes) can be carried out using conventional techniques such as ELISA (direct or competitive immunoassay), RIA methods. (Radio Immuno Assay), EIA (Eiectro immuno assay also called Electro immuno diffusion), turbidimetry, or any other immunological method.
  • a particularly preferred object of the invention relates to a nephelometric analysis method.
  • the antibodies are specific and can immuno-precipitate Apo B100 in a sample, thus making it possible to differentially measure Apo B48 with a polyclonal antibody (or a mixture of monoclonal antibodies or a monoclonal antibody modified to cause precipitation of total Apo B-antibody) anti-Apo B immune complexes.
  • the light intensity emitted by the particles in suspension is measured using an analyzer.
  • the particles are formed during the immunoprecipitation reaction which occurs, in a buffer medium stimulating the formation of polymers, when a specific antibody is brought into contact with a specific antigen.
  • the complex comprising an antigen and an antibody specific for the antigen is formed at a level which gradually increases initially, then increases rapidly and finally passes through a peak value which is proportional to the concentration of antigens.
  • the analysis method is based on the measurement of the maximum rate of change of the intensity of the light signal which is correlated (and can be converted) to the concentration of the antigen.
  • the nephelometric analysis method is carried out using Beckman immunochemical systems (IMMAGE, Beckman Coulter, Foster city, CA, USA) which present the results on an alphametric table.
  • the nephelometric method of the invention is particularly advantageous insofar as it is rapid and reproducible and makes it possible to obtain a high flow rate. Indeed, this method requires only a few seconds to analyze each sample, the techniques of the prior art requiring, by way of comparison, one day delay. On the other hand, the technique according to the invention can be easily automated. Furthermore, the coefficient of variation for the detection of Apo B (whatever the isoform considered) is only 4% in the context of the invention, against 10% in the prior art.
  • a particular subject of the invention thus relates to a method for the differential quantification of Apo B48 and Apo B100 in the lipoparticles present in a biological sample, comprising bringing the sample into contact (or a dilution of the latter) with an antibody as described above (including fragments or derivatives thereof).
  • a biological sample is assayed by a total anti-Apo B antibody in an immuno-nephelometric system thus allowing the quantification of the total circulating Apo B.
  • the biological sample is freed from its Apo B100 by bringing this sample into contact with a specific anti-Apo B100 antibody (preferably generated by the peptides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 ).
  • the amount of Apo B48 in the sample stripped of its Apo B100 is determined by the total anti-Apo B antibody in the same way as the raw sample.
  • the amount of Apo B100 can thus be obtained by simple difference between the amount of total Apo B and the amount of Apo B48.
  • the different dilutions of the biological sample and / or the total anti-Apo B and / or anti-Apo B100 antibodies are subjected to a treatment prior to contacting the sample, with a view to removing the non-immunoglobulin proteins. and / or to concentrate the antibody.
  • Treatment typically includes contacting the antibodies with polyethylene glycol (PEG), as described for example in Ritchie et al. (Ritchie 1972).
  • PEG polyethylene glycol
  • 0.5 to 1 ⁇ g of specific antibodies are used in this method of analysis, although a person skilled in the art can use different quantities without significantly departing from the present invention.
  • polyclonal antibodies are generally used.
  • the analysis method can be carried out on different biological samples, including in particular blood, plasma, serum, interstitial fluid, cerebrospinal fluid, cell culture supernatant, etc.
  • the sample can be collected from a subject (eg, a human subject) and used directly to implement the analysis method. Alternatively, the sample can be diluted and / or stored (for example in frozen form) to be tested later.
  • the invention also allows the measurement of the concentrations of Apo B48 and Apo B100 contained in the lipoparticles thanks to the use of specific total anti-Apo B and anti-Apo B100 antibodies, with efficiency, safety and throughput. Student.
  • Detection can be carried out under different experimental, clinical and / or diagnostic conditions.
  • the method can be used to detect the predisposition of certain individuals to develop disorders linked to lipid metabolism.
  • a particular object of the invention thus relates to a method for detecting the presence, a predisposition or a risk of developing a disorder linked to lipid metabolism in a subject, comprising in vitro detection or in vitro quantification ( or ex vivo), from a sample taken from the subject, of lipoparticles comprising Apo B48 and Apo B100, using an antibody as defined above (including fragments or derivatives of the last).
  • the high levels of Apo B48 and / or Apo B100 are characteristic of this high risk of developing disorders linked to lipid metabolism.
  • This method is particularly suitable for the detection of the presence, a predisposition or a risk of development of atherosclerosis or of a cardiovascular pathology such as for example a coronary disease.
  • Another subject of the invention relates to a method for detecting or monitoring the cellular uptake of LDL and lipoproteins rich in triglycerides in a subject, comprising the in vitro detection of the amounts of Apo B48 and / or Apo B100 present in lipoparticles, using an antibody as defined above (including fragments or derivatives thereof).
  • Another subject of the invention relates to a method of monitoring a treatment intended to correct disorders linked to lipid metabolism in a subject, comprising the measurement, preferably differential, of the amounts of Apo B48 and / or Apo B100 in vitro, in a sample from said subject, using an antibody as defined above (including fragments or derivatives thereof), after administration of said treatment to said subject.
  • the efficacy of the treatment is correlated with the level of Apo B48 and / or Apo B100 in the subject.
  • These results may be correlated with the ability of the treatment to regulate the amounts or activity of Apo B48 and / or Apo B100 or the ability to restore normal activity or level of Apo B48 and / or Apo B100 in a subject.
  • This method is particularly suitable for monitoring a treatment of atherosclerosis or a cardiovascular pathology such as for example a coronary disease.
  • Another subject of the invention relates to a method for evaluating the physiological state of a subject, eg the level of lipid metabolism in a subject, comprising the detection of the levels of Apo B48 and / or of Apo B100 in vitro in a sample from said subject, using antibodies as defined above (including fragments and derivatives thereof).
  • the antibodies according to the invention can also be used to screen (select) compounds or diets which are capable of modulating the serum or plasma concentration of Apo B48 and / or Apo B100.
  • the method comprises administering to an animal or to a patient a compound or a diet and recovering a biological sample from the animal or from the patient followed by detection of the presence and / or assaying the amounts of Apo B48 and Apo B100 in said sample using an antibody as defined above (including fragments or derivatives thereof).
  • these methods can be carried out on different samples (typically plasma or serum) and by ELISA, RIA, EIA, turbidimetry, etc., or preferably using a nephelometric analysis method.
  • Another object of the present invention comprises the use of an antibody according to the invention for the preparation of a composition intended to selectively regulate in vivo, in a subject, the activity of Apo B100.
  • an antibody according to the invention for the preparation of a composition intended to selectively regulate in vivo, in a subject, the activity of Apo B100.
  • the activity of Apo B100 for example to inhibit the uptake of lipoproteins containing Apo B100
  • Apo B100 activity is understood to mean in particular its role in the assembly and secretion of lipoproteins in the plasma (VLDL) and its role in the uptake of lipoproteins by peripheral cells.
  • the invention further comprises a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an antibody as described above and optionally a pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • the excipient can be any solution, suspension, gel, powder, etc., compatible with pharmaceutical use. Mention may be made of isotonic solutes, buffers, saline solutions, etc., optionally combined with stabilizing agents, such as proteins or other molecules of high molecular weight, for example.
  • This invention also relates to a kit comprising a peptide or an antibody as described above.
  • the kit can be used to detect or quantify Apo B48 and / or Apo B100 in any sample.
  • Figure 1 Specificity of Anti-Apo B100 antibodies.
  • A SDS PAGE; B Immuno Blot. Tracks 1 and 2: Chylomicrons of HTG subjects. Lane 3: VLDL of normolipid subjects.
  • the specific synthetic peptides of Apo B100 were synthesized using a method carried out in solid phase (Merrifield 1963) on an automatic synthesizer of model ABl 431 (Applied Biosystems Inc. Foster city. CA, USA) using a Boc / Bzl strategy, on 0.5 mmol of PAM-Ala resin. Each amino acid was coupled twice using dicyclohexylcarbodiimide / hydroxybenzotriazole without being "wrapped".
  • the crude products were then purified and analyzed by reverse phase HPLC on a Vydac 18 column (Interchim, Montiuzzo, France) comprising a linear gradient ranging from 0 to 100% of buffer B (buffer A: 0.05% TFA in H 2 0 and buffer B: 0.05% TFA, with 60% CH 3 CN in H 2 0).
  • the molecular masses were then analyzed using an API mass spectrometer (Perkin-Elmer, Foster city, CA, USA) equipped with a simple quad-pole and a source of electrospray ions (nebulizer- assisted electrospray) (Sciex, Toronto, Canada).
  • the amino acid analysis was carried out using a Beckman 6300 amino acid analyzer (Beckman instruments, Fullerton, CA, USA), after hydrolysis using a 6N HCl solution containing 0.25% phenol at 110 ° C for 24 hours.
  • An antiserum directed against total Apo B was prepared according to the technique described by Fievet et al (Fievet 1984). Briefly, LDLs with a density between 1.030 and 1.053 (therefore containing only Apo B100) were prepared by ultracentrifugation, then injected into goats in order to produce a total anti-Apo B immune serum recognizing all the forms of Apo B. The specific antiserum of Apo B100 was also prepared in goats essentially according to the protocol described by Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al. 1971).
  • the peptide (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) which served as an antigen was emulsified in a complete Freud's adjuvant and injected subcutaneously in goats, at the rate of 0.5 mg of peptide per injection , for the first two injections followed, fifteen days apart, booster injections using the same adjuvant but with only 0.25 mg of peptide.
  • the IgGs were prepared using the modified protocol of Ritchie et al. (Ritchie
  • Non-immunoglobulin proteins were eliminated from the immune serum and the IgGs were dialyzed and concentrated.
  • Antibodies can be stored between 2 and 8 ° C for example for use during the week, or in frozen form at -20 ° C, for example for prolonged use up to a month. Immunoglobulins contain sodium azide. 4. Specificity of the antibodies
  • Apo B standard comes from a human serum calibrated using an electroimmunodiffusion (EIA) method and tested for HIV and hepatitis viruses. This standard must be handled with the usual precautions in order to avoid any contamination.
  • the standard Apo B level is 100 mg / dl.
  • the standard Apo B can be stored and kept at -
  • Sample preparation Fresh samples are recommended for analysis. The sera should be collected through established procedures and used in clinical laboratories. If necessary, the serum can be stored between 2 and 8 ° C for up to a week. Samples kept frozen can be used for a longer period; frozen samples are stable for up to one year.
  • Preparation of samples without Apo B100 particles In a test tube, 40 ⁇ l of anti-Apo B100 antibody, 40 ⁇ l of serum and 40 ⁇ l of buffer 1 are added in the following order. The preparation is stirred and then the preparation is incubated. for ten minutes at room temperature, then centrifugation is carried out at 3500 rpm for ten minutes and then the supernatant is withdrawn which will be analyzed. The final concentration of Apo B48 in the samples freed from lipoparticles containing Apo B100 is corrected as a function of the dilution of the supernatant.
  • Control serum such as the serum from Dade-Behring GmbH, Marburg, Germany; intended for the control of apolipoproteins
  • antibodies of this invention are the following: the use in all immunological analysis methods for differentially quantifying Apo B100 and Apo B48, the use in the context of detection of Apo B100 and Apo B48 (immunoblot, dot blot, immunohistochemistry and immunocytochemistry), the use in immunoaffinity and immunoprecipitation methods to purify proteins.

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Abstract

La présente invention concerne des compositions et méthodes pour le dosage ou la détection de l’apolipoprotéine B48 dans des échantillons. Elle concerne notamment une méthode permettant de mesurer de faon différentielle l’apolipoprotéine B48 (« Apo B48 ») et l’apoliprotéine B100 (« Apo B100 ») dans des échantillons biologiques. Cette invention concerne également les produits synthétiques de l’Apo B100, les anticorps correspondants et kits les comprenant, ainsi que leurs utilisations pour détecter, quantifier de façon différentielle et/ou enregistrer une quantité d’Apo B48 et/ou d’Apo B100 dans un échantillon, ou encore quantifier et/ou enregistrer les lipoparticules athérogènes dans un échantillon. Les produits, matériels et kits décrits ci-dessus peuvent également être utilisés pour moduler de façon différentielle les niveaux d’Apo B48 et/ou d’Apo B100 ou leur activité, in vitro ou in vivo, et pour réguler le métabolisme lipidique chez un sujet.

Description

Compositions et méthodes pour le dosage de l'Apo B48 et de l'Apo B100
Introduction et Art Antérieur
La présente invention concerne des compositions et méthodes pour le dosage ou la détection de l'apolipoprotéine B48 et de l'apolipoprotéine B100 dans des échantillons. Elle concerne notamment une méthode permettant de détecter et de quantifier de façon différentielle l'apolipoprotéine B48 (« Apo B48 ») et l'apolipoprotéine B100 (« Apo B100 »). Cette invention concerne également des produits synthétiques de l'Apo B100, les anticorps correspondants, les kits les comprenant, et leurs utilisations pour détecter, quantifier et/ou suivre dans le temps les quantités d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 dans un échantillon biologique. Les produits, matériels et kits décrits ci-dessus peuvent également être utilisés pour moduler de façon différentielle les niveaux d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 ou leur activité, in vitro ou in vivo, et pour réguler le métabolisme lipidique chez un sujet.
Les quantités élevées de triglycérides plasmatiques et la persistance des chylomicrons du régime alimentaire sont des facteurs qui augmentent les risques d'apparition des maladies cardiovasculaires responsables actuellement de la majorité des décès dans le monde (Hokanson and Austin 1996). La quantité élevée de lipides plasmatiques est corrélée au niveau de lipoprotéines Apo B considérées comme étant athérogènes.
Les apolipoprotéines B sont hétérogènes. Les lipoprotéines de très basse densité (VLDL : Very Low Density Lipoprotéin) et les lipoprotéines de basse densité (LDL : Low Density Lipoprotéin) contiennent une isoforme possédant un poids moléculaire apparent d'environ 549 000 Da, laquelle est désignée par l'abréviation B100 dans un système de nomenclature centile, tandis que l'isoforme majoritairement présente dans les chylomicrons (les lipoprotéines postprandiales majoritaires) possède un poids moléculaire apparent de 246 000 Da et est identifiée par l'abréviation B48 dans la même nomenclature. L'Apo B48 est une forme tronquée de l'Apo B100 et est produite par modification post-transcriptionnelle de l'ARN messager codant pour l'Apo B100. Cette modification transforme le codon 2153 (CAA, codant pour une Glutamine) en un codon stop (Davidson, Anant et al. 1995).
L'Apo B48 et l'Apo B100 sont des protéines clés dans le métabolisme des lipoprotéines chez les mammifères. L'Apo B100 est essentielle à l'assemblage des VLDL (Havel 1995) dans le foie humain (Kane 1983) et intervient également dans la capture cellulaire et le catabolisme des LDL. Son intervention a été démontrée dans la voie impliquant le récepteur des LDL
(Goldstein and Brown 1977). L'Apo B48 est requise pour l'assemblage des chylomicrons dans l'intestin (Young 1990) (Kane 1983) et est caractéristique des particules "remnant" (ie. résiduelles) de chylomicrons, lesquelles sont considérées comme des facteurs de risque supplémentaires de l'apparition des maladies coronaires (Simons, Dwyer et al. 1987).
Actuellement, on dispose de très peu d'information sur le caractère athérogène des particules de chylomicrons contenant de l'Apo B48 dérivées de l'intestin et des particules contenant de l'Apo B100 dérivées du foie. Il s'avère donc particulièrement pertinent de développer une méthode permettant de détecter et ou de quantifier de façon différentielle l'Apo B48 et l'Apo B100 de manière à pouvoir, notamment, étudier leurs implications respectives et à mettre en évidence des dérégulations ou dysfonctionnement chez des sujets.
Pour différentes raisons, la mesure de la concentration plasmatique différentielle d'Apo B48 et d'Apo B100 est assez difficile à réaliser. En premier lieu, la séquence en acides aminés de l'Apo B48 est identique à la région N- terminale de l'Apo B100 (représentant 48% de l'Apo B100). En second lieu, l'Apo B48 est présente à très faible concentration dans le plasma, au contraire de l'Apo B100. En troisième lieu, l'expression des épitopes d'Apo B varie en fonction du contenu lipidique des particules. Des procédés basés sur des méthodes immunologiques et permettant de quantifier l'Apo B48 ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier, le procédé d'Uchida et al. (Uchida, Kurano et al. 1998) applique un test ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) pour quantifier l'Apo B48. La précision et le débit obtenus avec ce procédé sont cependant assez faibles d'où la nécessité de procéder à une purification des anticorps et à leur marquage. De plus, l'anticorps monoclonal utilisé est dirigé contre la région C-terminale de l'Apo B48 humaine. Cet anticorps est obtenu grâce à la conformation différentielle de l'Apo B48 dans les particules contenant de l'Apo B100, ce qui peut conduire à une spécificité et à une affinité différentes des anticorps en fonction de la composition lipidique des lipoparticules.
D'autres documents décrivent une quantification de l'Apo B48 à l'aide de techniques non immunochimiques telles que l'électrophorèse capillaire (Proctor and amo 1997), la chromatographie liquide réalisée sur un système HPLC (Hidaka, Kojima et al. 1990) (Wagner, Nustede et al. 1987) ou le SDS
PAGE (Karpe and Hamsten 1994) (Smith, Proctor et al. 1997). Ces méthodes présentent différents inconvénients : elles possèdent un faible débit et nécessitent des étapes de préparation des lipoprotéines et de délipidation pour améliorer la précision des résultats. Ces techniques sont par ailleurs beaucoup moins sensibles que les méthodes immunochimiques.
Résumé de l'Invention
La présente invention fournit une nouvelle stratégie pour produire des peptides synthétiques spécifiques de l'Apo B100 et de nouvelles méthodes permettant de détecter et de quantifier de façon différentielle l'Apo B100 et l'Apo B48. La quantification différentielle est typiquement réalisée par dosage de l'Apo B totale (Apo B100 et Apo B48) dans un échantillon, de préférence à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-Apo B. L'échantillon est ensuite débarrassé de l'Apo B100 à l'aide d'un anticorps anti-Apo B100 spécifique, de manière à quantifier directement et spécifiquement l'Apo B48. La présente invention décrit plus particulièrement de nouvelles méthodes de production d'anticorps spécifiques de l'Apo B100 à l'aide de peptides synthétiques spécifiques de l'Apo B100. L'invention décrit également de tels anticorps, des kits les comprenant et leurs utilisations pour détecter, quantifier, purifier et/ou suivre l'évolution des quantités d'Apo B100 et d'Apo
B48 dans le sérum ou le plasma. Ces anticorps fournissent également une nouvelle approche pour moduler l'activité de l'Apo B in vitro ou in vivo, et pour réguler le métabolisme lipidique chez un sujet.
Un premier objet particulier de l'invention concerne un peptide synthétique spécifique de l'Apo B100 substantiellement pur, comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 ou la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment immunogène ou un dérivé de ce peptide.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de production d'anticorps anti-Apo B100 comprenant une étape d'immunisation à l'aide d'un peptide synthétique spécifique de l'Apo B100 tel que défini ci-dessus. Cette invention comprend également les anticorps préparés selon cette méthode, de même que, plus généralement, les anticorps capables de lier un peptide tel que défini ci-dessus ainsi que les fragments ou dérivés de tels anticorps.
Un autre aspect de cette invention concerne une méthode de détection ou de dosage d'Apo B100 et d'Apo B48 dans des échantillons biologiques
(notamment dans des lipoparticules préparées ou dans des échantillons de plasma ou de sérum), à l'aide d'un anticorps (incluant un fragment ou un dérivé de ce dernier) tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de cette invention concerne une méthode de détection de la présence, d'une prédisposition ou d'un risque de développer un désordre lié au métabolisme des lipides chez un sujet, comprenant la détection in vitro, dans un échantillon dudit sujet, de l'Apo B100 et de l'Apo B48 à l'aide d'un anticorps (incluant un fragment ou un dérivé de ce dernier) tel que défini ci- dessus. La méthode est particulièrement adaptée à la détection de la présence, d'une prédisposition ou d'un risque de développement de l'athérosclérose ou d'une pathologie cardiovasculaire telle que par exemple une maladie coronaire.
A cet égard, un objet spécifique de l'invention concerne une méthode de détection et/ou de suivi de la formation, du développement ou de la progression de l'athérosclérose chez un sujet, comprenant la détection in vitro, dans un échantillon dudit sujet, de la quantité ou du niveau d'Apo B100 et/ou d'Apo B48 à l'aide d'un anticorps (incluant un fragment ou un dérivé de ce dernier) tel que décrit ci-dessus.
Un autre objet de cette invention concerne une méthode de détection ou de suivi chez un sujet de la capture cellulaire de lipoprotéines riches en triglycérides et de LDL, comprenant la détection in vitro de particules contenant de l'Apo B à l'aide d'un anticorps (incluant un fragment ou un dérivé de ce dernier) tel que défini ci-dessus.
Le sujet est généralement un mammifère, de préférence un être humain, de façon encore plus préférée un sujet présentant un risque de développer des maladies cardiovasculaires liées à un désordre du métabolisme des lipides tel qu'une maladie coronaire, ou encore un sujet présentant une telle maladie.
Un autre objet de cette invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un anticorps (incluant un fragment ou un dérivé de ce dernier) tel que défini ci-dessus et un excipient ou un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Description Détaillée de l'Invention
Comme indiqué ci-dessus, un aspect de la présente invention concerne un peptide synthétique spécifique de l'Apo B100 substantiellement pur comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 ou la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment immunogène ou un dérivé de ce peptide. On entend par « peptide synthétique spécifique de l'Apo B100 » tous peptides synthétisés de façon artificielle mimant une partie de la protéine Apo B100 native et comportant des régions ou épitopes propres à cette protéine et essentiellement absents d'autres protéines. Il s'agit notamment de peptides comprenant la séquence d'une région de l'Apo B100 absente dans les autres formes de Apo B, particulièrement dans l'Apo B48. Le terme « substantiellement pur » indique que le peptide est essentiellement dépourvu de séquences d'acides aminés présentes dans l'Apo B48 et/ou de protéines contaminantes normalement présentes ou associées à l'Apo B dans des lipoparticules, telles que notamment l'Apo Al. Le terme « synthétique » indique que le peptide n'est pas une molécule obtenue de façon naturelle mais qu'il a été préparé grâce à un procédé artificiel (e.g., synthèse chimique, assemblage, etc.) notamment tel que décrit dans les exemples. Dans ce contexte, le peptide synthétique spécifique de l'Apo B100 de l'invention est préférentiellement essentiellement non- glycosylé.
La présente invention démontre à présent que des peptides synthétiques spécifiques de l'Apo B100 peuvent être produits et utilisés pour générer des anticorps anti-Apo B100 spécifiques. L'invention démontre par ailleurs que de tels anticorps sont capables de se lier de façon spécifique à l'Apo B100 obtenue soit de façon naturelle soit sous la forme d'un antigène soluble, soit incluse dans des lipoparticules. L'invention démontre également que de tels anticorps peuvent se lier à différentes lipoparticules contenant de l'Apo B100 (IDL (Intermediary Density Lipoprotéin), VLDL et LDL), et présentent des propriétés d'immuno-précipitation. Ces peptides synthétiques spécifiques de l'Apo B100 et leurs anticorps correspondants représentent ainsi de nouveaux produits particulièrement avantageux pour détecter l'Apo B100 et quantifier de façon différentielle l'Apo B100 et l'Apo B48. Plus particulièrement, un peptide synthétique spécifique de l'Apo B100 préféré de l'invention comprend la séquence SEQ ID NO : 1 , telle que décrite ci-dessous, ou un fragment immunogène ou un dérivé de ce peptide.
SEQ ID NO : 1 :
KAASGTTGTY QEWKDKAQNL YQELLTQEGQ ASFQGLKDNV FDGLVRVTQK FHMKVKHLID SLIDFLNFPR FQFPGKPGIY TREELSTMFI REVGTVLSQV YSKVHNGSEI L
Ce peptide correspond aux résidus 4105 à 4215 de la séquence de l'Apo B humaine mature.
Selon une variante de l'invention, un peptide synthétique spécifique de l'Apo B100 préféré de l'invention comprend la séquence SEQ ID NO : 2, telle que décrite ci-dessous, ou un fragment immunogène ou un dérivé de ce peptide.
SEQ ID NO : 2 :
AFTDLHLRYQ KDKKGISTSA ASPAVGTVGM DMDEDDDFSK WNFYYSPQSS PDKKLTIFKT ELRVRESDEE TQIKVNWEEE AASGLLTSLK DNVPKATGVL YDYVNKYH
Ce peptide correspond aux résidus 3955 à 4062 de la séquence de l'Apo B humaine mature.
Les peptides de l'invention comportent avantageusement moins de 200 acides aminés, plus préférentiellement moins de 180 acides aminés.
Comme illustré dans les exemples, les peptides de l'invention
(comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 ou la séquence SEQ ID NO : 2) peuvent être préparés de façon particulièrement avantageuse par synthèse en phase solide, plus particulièrement en utilisant une stratégie Boc/Bzl (Merrifield 1963).
Le terme « dérivé » inclut des peptides comprenant une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou de plusieurs résidus d'acides aminés et présentant substantiellement la même spécificité antigénique. Des exemples typiques de dérivés incluent des variations de séquence dues au polymorphisme de l'Apo B, à l'épissage, etc.. Des dérivés particulièrement préférés comprennent une séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence SEQ ID NO : 2 modifiée comprenant au plus 5 résidus d'acides aminés distincts de ceux présents dans la SEQ ID NO : 1 ou dans la SEQ ID NO : 2. Les résidus additionnels peuvent correspondre à des résidus de séquence de transport ou de liaison, à des groupes protecteurs, etc.. De plus, le peptide peut être modifié par exemple, par voie chimique, physique et/ou enzymatique, de manière à augmenter sa stabilité, augmenter son immunogénicité ou encore incorporer une étiquette ou un marqueur, etc.. Des exemples de telles modifications incluent une glycosylation, l'addition d'une étiquette (e.g., myc), d'un marqueur (e.g., marquage radioactif ou enzymatique, etc.), etc..
Un objet particulier de l'invention concerne un peptide synthétique spécifique des Apo B caractérisé en ce qu'il comprend des épitopes spécifiques de l'Apo B100 et en ce qu'il est dépourvu d'épitopes spécifiques de l'Apo B48, et en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID NO : 1 ou la séquence SEQ ID NO : 2 ou un fragment ou dérivé de ces séquences.
Le terme « fragment » désigne tout peptide comprenant au moins 5, de préférence entre 5 et 30, résidus consécutifs des segments 4105-4139 et 4198- 4215 de la séquence SEQ ID NO : 1 ou tout peptide comprenant au moins 5, de préférence entre 5 et 40, résidus consécutifs du segment 4022-4062 de la séquence SEQ ID NO : 2. Le terme « fragment » inclut toute portion telle que décrite ci-dessus de la séquence SEQ ID NO : 1 ou de la séquence SEQ ID NO : 2 comprenant un épitope, de préférence comprenant au moins 10 résidus consécutifs des segments identifiés ci-dessus.
Les peptides peuvent être solubles, purifiés ou complexés à une molécule porteuse, telle que KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) ou la sérum albumine par exemple, ou encore toute autre molécule inerte (e.g., synthétique) telle qu'une bille, etc.. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les peptides sont couplés à une molécule porteuse. Ils le sont en particulier dans ie cadre de leur utilisation pour produire des anticorps. Le couplage peut être réalisé selon des méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier
(Vaitukaitis, Robbins et al. 1971 ) (Bassiri 1979).
Les peptides peuvent également être conjugués ou couplés à une molécule polypeptidique hétérologue, telle qu'une molécule biologiquement active par exemple. Le caractère hétérologue désigne tout peptide qui n'est pas originaire d'une molécule d'Apo B humaine.
Un objet particulier de l'invention concerne une composition caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide synthétique comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 ou la séquence SEQ ID NO : 2, et en ce qu'elle est dépourvue d'autre apolipoprotéine.
Les peptides peuvent être utilisés dans le cadre de méthodes de criblage de composés modulant l'activité de l'Apo B, de méthodes de titration, comme contrôles, standards ou pour calibrer des méthodes d'analyse. Ils peuvent également être utilisés pour moduler l'activité de l'Apo B100, avantageusement de manière spécifique. Ils sont également particulièrement utiles pour produire des anticorps anti-Apo B100.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne tout anticorps capable de se lier à un peptide tel que défini ci-dessus, préférentiellement de manière spécifique. De préférence, les anticorps selon l'invention présentent la capacité de précipiter l'Apo B100 (immuno-précipitants). L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Avantageusement, lorsque les anticorps sont monoclonaux, ils sont présents sous forme de mélange d'anticorps monoclonaux. De plus, le terme anticorps inclut également tous fragments et dérivés d'anticorps, en particulier les fragments et dérivés desdits anticorps monoclonaux ou polyclonaux présentant substantiellement la même spécificité antigénique. Ces derniers comprennent des fragments d'anticorps (e.g., Fab, F(ab')2, CDRs, etc.), des anticorps humanisés, des anticorps polyfonctionnels, des anticorps monocaténaires (ScFv), etc.. Les anticorps de l'invention peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces animales variées incluant les rongeurs (souris, rats, etc.), les primates, les chevaux, les cochons, les moutons, les lapins, la volaille, etc. sont décrites par exemple dans Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al. 1971). L'antigène est combiné avec un adjuvant (e.g., Freud's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins (immun sérum) sont collectés et les immunoglobulines sont séparées.
Des méthodes de production d'anticorps monoclonaux à partir de différentes espèces animales peuvent être trouvées par exemple dans Hariow et al. (Hariow 1988) ou dans Kohler et al. (Kohler and Milstein 1975). Ces méthodes comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les anticorps peuvent également être produits par sélection de banques combinatoires d'immunoglobulines, telles que celles divulguées par exemple dans Ward et al. (Ward, Gussow et al. 1989).
Des anticorps préférés de l'invention sont préparés par immunisation d'un animal non-humain à l'aide d'un peptide synthétique spécifique de l'Apo
B100 substantiellement pur tel que décrit ci-dessus, comprenant de préférence la séquence SEQ ID NO : 1 ou la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment immunogène ou un dérivé de ce peptide, e.g., un sous-fragment comprenant au moins un épitope, ou un mélange de fragments immunogènes ou dérivés des SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 (oligopeptides) et récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps.
Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase selon les techniques conventionnelles. Les anticorps humanisés peuvent être préparés selon l'une des méthodes décrites, par exemple, dans Riechmann et al. (Riechmann 1988) (Jones 1986).
L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps anti-Apo B100 spécifiques, comprenant l'administration (e.g., l'injection) d'un peptide de séquence SEQ ID NO : 1 ou de séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment immunogène ou un dérivé de ce peptide, tel que décrit ci-dessus, à un animal non-humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps.
La méthode permet avantageusement la production d'anticorps spécifiques et immuno-précipitants. La spécificité peut être vérifiée par la démonstration de l'absence d'une réaction croisée avec d'autres protéines circulantes sanguines comprenant de l'Apo B48. Plus généralement, la spécificité indique que les anticorps sont capables de se lier à l'Apo B100 avec une affinité supérieure à tout autre antigène. Comme illustré dans les exemples, les anticorps polyclonaux de la présente invention sont immuno-précipitants, et peuvent ainsi être utilisés pour détecter l'Apo B100 ou pour doser de façon différentielle l'Apo B100 et l'Apo B48 avec une grande efficacité. Les anticorps peuvent être couplés à des fragments hétérologues tels que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc.. Des toxines préférées sont par exemple la toxine diphtérique, la toxine botulique, etc.. Les médicaments ou les agents thérapeutiques sont choisis notamment parmi des lymphokines, des antibiotiques, des séquences anti-sens, des facteurs de croissance, etc.. Des méthodes permettant de réaliser le couplage des anticorps et de tels fragments hétérologues sont illustrées par exemple dans le brevet US 4,277,149 et dans le brevet US 3,996,345.
Les anticorps de l'invention possèdent de nombreuses applications incluant des applications thérapeutiques, prophylactiques, diagnostiques, de purification, de détection, etc..
In vitro, ils peuvent être utilisés comme agents de criblage ou pour purifier des antigènes provenant d'échantillons divers, incluant des échantillons biologiques variés (e.g., des échantillons sanguins). Ils peuvent également être utilisés pour détecter ou quantifier la présence ou la quantité d'Apo B100 ou indirectement d'Apo B48 dans les lipoparticules contenant l'Apo B présentes au sein d'un échantillon collecté à partir d'un sujet, typiquement, un échantillon sanguin provenant d'un mammifère ou, de manière préférée, d'un être humain.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne une méthode de détection ou de quantification de l'Apo B100, au sein d'un échantillon biologique, comprenant la mise en contact de l'échantillon avec un anticorps tel que défini ci-dessus (incluant des fragments ou des dérivés de ce dernier) et la détection de la présence de complexes immuns antigène-anticorps. La quantification est typiquement réalisée de manière différentielle, c'est- à-dire par dosage de l'Apo B totale (Apo B100 et Apo B48) dans un échantillon, qui est ensuite débarrassé de l'Apo B100 à l'aide d'un anticorps anti-Apo B100 spécifique, permettant de quantifier directement et spécifiquement l'Apo B48. La concentration d'Apo B100 est obtenue par différence entre la mesure totale d'Apo B et celle d'Apo B48. Cette méthode permet donc la détermination des niveaux d'Apo B100 et d'Apo B48 dans un échantillon, par détermination des quantités (relatives) de complexes immuns dans l'échantillon (avant et après la récupération de l'Apo B100) et la comparaison à des conditions standards ou à une courbe de calibrage par exemple.
Une méthode de détection ou de quantification différentielle préférée comprend donc avantageusement les étapes suivantes : a. détermination de la quantité d'Apo B totale dans un échantillon avec un anticorps anti-Apo B totale, b. élimination de l'Apo B100 ou des lipoparticules contenant l'Apo B100 dudit échantillon, à l'aide d'anticorps anti-Apo B100 spécifiques tels que décrits ci-dessus, et c. détermination de la quantité d'Apo B48 dans l'échantillon obtenu à l'issue de l'étape (b) ou dans les lipoparticules ne contenant pas d'Apo B100 au sein de cet échantillon, avec un anticorps anti-Apo B totale.
Par déduction, les quantités obtenues en (a) et (c) permettent la détermination des quantités d'Apo B100 (ou de lipoparticules contenant de l'Apo B100) dans l'échantillon.
Les anticorps utilisés peuvent être polyclonaux, monoclonaux ou des fragments ou dérivés de ceux-ci, seuls, modifiés et/ou en mélange. Ils peuvent en particulier être mis en œuvre sous forme soluble ou immobilisée à des supports, notamment des billes, plaques, colonnes, etc. L'anticorps anti-Apo B totale est avantageusement composé d'un mélange de monoclonaux ou d'un polyclonal, afin d'assurer une détection ou une quantification complète de l'antigène, dans ses différentes formes. Par ailleurs, l'anticorps mis en œuvre dans les étapes a) et c) peut être identique ou différent. Généralement, il s'agit du même anticorps.
On utilise typiquement un anticorps anti-Apo B totale polyclonal. L'anticorps polyclonal anti-Apo B totale peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par immunisation au moyen de l'Apo B entière. De tels anticorps sont décrits notamment dans les publications de Li (Li, Wu et al. 1997) et Levinson (Levinson and Wagner 1993).
Avantageusement, au cours de l'étape b), pour éliminer de manière sélective l'Apo B100 présente dans l'échantillon, on utilise un ou des anticorps spécifiques anti-Apo B100 selon l'invention, dont la fixation sur l'Apo B100 provoque la précipitation de l'ensemble. A titre d'exemples non limitatifs, on peut donc utiliser soit des anticorps polyclonaux, soit un mélange d'anticorps monoclonaux, soit des anticorps (polyclonaux ou monoclonaux) modifiés de manière à provoquer la précipitation des complexes immuns Apo B100- anticorps.
Dans une première variante, les anticorps spécifiques anti-Apo B100 mis en œuvre dans l'étape b) sont des anticorps polyclonaux, possédant la propriété d'être immuno-précipitants.
Dans une autre variante, on peut également utiliser un mélange d'anticorps monoclonaux anti-Apo B spécifiques ou des anticorps monoclonaux modifiés (par exemple liés avec du latex ou d'autres particules) de manière à provoquer la précipitation des complexes immuns Apo B-anticorps.
Un autre moyen d'éliminer les lipoprotéines contenant l'Apo B100 consiste à fixer des anticorps anti-Apo B100 spécifiques à des protéines A ou G ou à d'autres molécules chimiques (polymères chimiques ou résines tels que le polyuréthane, le sépharose activé, etc.). Ces complexes peuvent être liés à des billes magnétiques, permettant l'élimination de l'Apo B100 par application d'un champs magnétique (e.g., précipitation ou séparation magnétique). La méthode d'analyse selon l'invention (et plus spécifiquement la détection ou la quantification de complexes immuns antigène-anticorps) peut être réalisée à l'aide de techniques conventionnelles telles que des méthodes ELISA (immuno-essai direct ou compétitif), RIA (Radio Immuno Assay), EIA (Eiectro immuno assay également nommé Electro immuno diffusion), turbidimétrie, ou toute autre méthode immunologique. Cependant, un objet particulièrement préféré de l'invention concerne une méthode d'analyse néphélométrique. En effet, comme indiqué ci-dessus, les anticorps sont spécifiques et peuvent immuno-précipiter l'Apo B100 dans un échantillon permettant ainsi de doser de façon différentielle l'Apo B48 avec un anticorps polyclonal (ou un mélange d'anticorps monoclonaux ou un anticorps monoclonal modifié de manière à provoquer la précipitation des complexes immuns Apo B-anticorps) anti-Apo B totale.
Dans la méthode d'analyse néphélométrique, l'intensité lumineuse émise par les particules en suspension est mesurée à l'aide d'un analyseur. Les particules sont formées lors de la réaction d'immuno-précipitation qui se produit, dans un milieu tampon stimulant la formation des polymères, quand un anticorps spécifique est mis en contact avec un antigène spécifique. Le complexe comprenant un antigène et un anticorps spécifique de l'antigène se forme à un niveau qui augmente graduellement dans un premier temps, puis augmente rapidement et finalement passe par une valeur pic qui est proportionnelle à la concentration d'antigènes. La méthode d'analyse est basée sur la mesure du taux maximum de changement de l'intensité du signal lumineux qui est corrélé (et peut être converti) à la concentration de l'antigène.
Typiquement, la méthode d'analyse néphélométrique est réalisée à l'aide de systèmes immunochimiques Beckman (IMMAGE, Beckman Coulter, Foster city, CA, USA) qui présentent les résultats sur une table alphamétrique. La méthode néphélométrique de l'invention est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle est rapide et reproductible et permet d'obtenir un débit élevé. En effet, cette méthode ne nécessite que quelques secondes pour analyser chaque échantillon, les techniques de l'art antérieur imposant, à titre de comparaison, un délai d'un jour. D'autre part la technique selon l'invention peut être facilement automatisée. Par ailleurs, le coefficient de variation pour la détection d'Apo B (quelque soit l'isoforme considérée) est de 4 % seulement dans le cadre de l'invention, contre 10% dans l'art antérieur.
Un objet particulier de l'invention concerne ainsi une méthode de quantification différentielle de l'Apo B48 et de l'Apo B100 dans les lipoparticules présentes dans un échantillon biologique, comprenant la mise en contact de l'échantillon (ou d'une dilution de ce dernier) avec un anticorps tel que décrit ci- dessus (incluant les fragments ou les dérivés de celui-ci). Brièvement, dans un premier temps, un échantillon biologique est dosé par un anticorps anti-Apo B totale dans un système immuno-néphélométrique permettant ainsi la quantification de l'Apo B totale circulante. Dans un deuxième temps l'échantillon biologique est débarrassé de son Apo B100 par mise en contact de cet échantillon avec un anticorps anti-Apo B100 spécifique (généré préférentiellement grâce aux peptides de la SEQ ID NO : 1 ou de la SEQ ID NO : 2). Enfin la quantité d'Apo B48 de l'échantillon débarrassé de son Apo B100 est dosée par l'anticorps anti-Apo B totale de la même façon que l'échantillon brut. La quantité d'Apo B100 peut ainsi être obtenue par simple différence entre la quantité de Apo B totale et la quantité de l'Apo B48.
Typiquement les différentes dilutions de l'échantillon biologique et/ou les anticorps anti-Apo B totale et/ou anti-Apo B100 sont soumis à un traitement préalable à la mise en contact avec l'échantillon, en vue de supprimer les protéines non immunoglobulines et/ou de concentrer l'anticorps. Le traitement comprend typiquement la mise en contact des anticorps avec du polyéthylène glycol (PEG), tel que décrit par exemple dans Ritchie et al. (Ritchie 1972). Typiquement, 0,5 à 1 μg d'anticorps spécifiques sont utilisés dans cette méthode d'analyse, bien que l'homme de l'art puisse utiliser différentes quantités sans se démarquer d'une façon significative de la présente invention. Dans une méthode d'analyse néphélométrique, des anticorps polyclonaux sont généralement utilisés. La méthode d'analyse peut être réalisée sur différents échantillons biologiques, incluant notamment du sang, du plasma, du sérum, du fluide interstitiel, du liquide céphalorachidien, du surnageant de cultures cellulaires, etc.. L'échantillon peut être collecté chez un sujet (e.g., un sujet humain) et utilisé directement pour mettre en oeuvre la méthode d'analyse. De manière alternative, l'échantillon peut être dilué et/ou stocké (par exemple sous forme congelée) pour être testé plus tard. L'invention permet également la mesure des concentrations d'Apo B48 et d'Apo B100 contenues dans les lipoparticules grâce à l'utilisation des anticorps anti-Apo B totaux et anti-Apo B100 spécifiques, avec une efficacité, une sûreté et un débit élevé.
La détection peut être réalisée dans différentes conditions expérimentales, cliniques et/ou diagnostiques. En particulier, la méthode peut être utilisée pour détecter la prédisposition de certains individus à développer des désordres liés au métabolisme des lipides.
Un objet particulier de l'invention concerne ainsi une méthode de détection de la présence, d'une prédisposition ou d'un risque de développer un désordre lié au métabolisme des lipides chez un sujet, comprenant la détection in vitro ou la quantification in vitro (ou ex vivo), à partir d'un échantillon prélevé sur le sujet, de lipoparticules comprenant l'Apo B48 et l'Apo B100, à l'aide d'un anticorps tel que défini ci-dessus (incluant des fragments ou des dérivés de ce dernier). Les niveaux élevés d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 (par comparaison à une valeur moyenne chez les sujets normaux) sont caractéristiques de ce risque élevé de développer des désordres liés au métabolisme des lipides. Cette méthode est particulièrement adaptée pour la détection de la présence, d'une prédisposition ou d'un risque de développement de l'athérosclérose ou d'une pathologie cardiovasculaire telle que par exemple une maladie coronaire.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de détection ou de suivi de la capture cellulaire des LDL et des lipoprotéines riches en triglycérides chez un sujet, comprenant la détection in vitro des quantités d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 présentes dans des lipoparticules, à l'aide d'un anticorps tel que défini ci-dessus (incluant des fragments ou des dérivés de ce dernier).
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de suivi d'un traitement destiné à corriger des désordres liés au métabolisme des lipides chez un sujet, comprenant la mesure, de préférence différentielle, des quantités d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 in vitro, dans un échantillon provenant dudit sujet, à l'aide d'un anticorps tel que défini ci-dessus (incluant des fragments ou des dérivés de ce dernier), après l'administration dudit traitement audit sujet. L'efficacité du traitement est corrélée au niveau d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 chez le sujet. Ces résultats peuvent être corrélés avec la capacité du traitement à réguler les quantités ou l'activité d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 ou encore la capacité à restaurer une activité ou un niveau normal d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 chez un sujet. Cette méthode est particulièrement adaptée au suivi d'un traitement de l'athérosclérose ou d'une pathologie cardiovasculaire telle que par exemple une maladie coronaire.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode d'évaluation de l'état physiologique d'un sujet, e.g. le niveau du métabolisme des lipides chez un sujet, comprenant la détection des niveaux d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 in vitro dans un échantillon provenant dudit sujet, à l'aide d'anticorps tels que définis ci-dessus (incluant les fragments et les dérivés de ce dernier).
Les anticorps selon l'invention peuvent également être utilisés pour cribler (sélectionner) des composés ou des régimes alimentaires qui sont susceptibles de moduler la concentration sérique ou plasmatique d'Apo B48 et/ou d'Apo B100. Typiquement, la méthode comprend l'administration à un animal ou à un patient d'un composé ou d'un régime et la récupération d'un échantillon biologique provenant de l'animal ou du patient suivi de la détection de la présence et/ou du dosage des quantités d'Apo B48 et d'Apo B100 dans ledit échantillon à l'aide d'un anticorps tel que défini ci-dessus (incluant des fragments ou dérivés de ce dernier). Comme indiqué ci-dessus, ces méthodes peuvent être réalisées sur différents échantillons (typiquement du plasma ou du sérum) et par ELISA, RIA, EIA, turbidimétrie, etc., ou de préférence grâce à une méthode d'analyse néphélométrique.
Un autre objet de la présente invention comprend l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour la préparation d'une composition destinée à réguler de façon sélective in vivo, chez un sujet, l'activité de l'Apo B100. Par exemple pour inhiber la captation des lipoprotéines contenant de l'Apo B100
(via le LDL-récepteur) par les cellules hépatiques ou périphériques, afin de moduler leur apport lipidique, ou pour inhiber l'assemblage intracellulaire et la sécrétion des lipoprotéines (puisque l'Apo B100 est nécessaire pour cet assemblage), diminuant ainsi la production des lipoprotéines dites athérogènes.
On entend notamment par activité de l'Apo B100 son rôle dans l'assemblage et la sécrétion des lipoprotéines dans le plasma (VLDL) et son rôle dans la captation des lipoprotéines par les cellules périphériques.
L'invention comprend en outre une composition pharmaceutique comprenant un anticorps tel que décrit ci-dessus et éventuellement un excipient ou un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. L'excipient peut être toute solution, suspension, gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique. On peut citer des solutés isotoniques, des tampons, solutions salines, etc., éventuellement combinées à des agents stabilisants, tels que des protéines ou autres molécules de haut poids moléculaire, par exemple.
Cette invention concerne également un kit comprenant un peptide ou un anticorps tel que décrit ci-dessus. Le kit peut être utilisé pour détecter ou quantifier l'Apo B48 et/ou l'Apo B100 dans tout échantillon. D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Légende des figures
Figure 1 : Spécificité des anticorps Anti-Apo B100. A : SDS PAGE ; B Immuno Blot. Pistes 1 et 2 : Chylomicrons de sujets HTG. Piste 3 : VLDL de sujets normolipidiques.
Figure 2 : Méthode d'analyse néphélométrique de l'Apo B : Courbe de calibration.
Exemples
1. Synthèse d'Apo B100
Les peptides synthétiques spécifiques de l'Apo B100 ont été synthétisés à l'aide d'une méthode réalisée en phase solide (Merrifield 1963) sur un synthétiseur automatique de modèle ABl 431 (Applied Biosystems Inc. Foster city. CA, USA) utilisant une stratégie Boc/Bzl, sur 0,5 mmol de résine PAM-Ala. Chaque acide aminé a été couplé deux fois à l'aide de dicyclohexylcarbodiimide/hydroxybenzotriazole sans être « cape ». Les produits bruts ont ensuite été purifiés et analysés par HPLC en phase inverse sur une colonne Vydac 18 (Interchim, Montiuçon, France) comprenant un gradient linéaire allant de 0 à 100% de tampon B (tampon A : 0,05% TFA dans H20 et tampon B : 0,05 % TFA, avec 60 % de CH3CN dans H20). Les masses moléculaires ont ensuite été analysées à l'aide d'un spectromètre de masse API (Perkin-Elmer, Foster city, CA, USA) équipé d'un simple quadri-pôle et d'une source d'ions électrospray (nebulizer-assisted electrospray) (Sciex, Toronto, Canada). L'analyse d'acides aminés a été réalisée à l'aide d'un analyseur d'acides aminés Beckman 6300 (Beckman instruments, Fullerton, CA, USA), après hydrolyse à l'aide d'une solution d'HCI 6N contenant 0,25% de phénol à 110°C pendant 24 heures.
2. Immunisations
Un antisérum dirigé contre l'Apo B totale a été préparé selon la technique décrite par Fievet et al (Fievet 1984). Brièvement, des LDL dont la densité est située entre 1,030 et 1,053 (ne contenant donc que de l'Apo B100) ont été préparées par ultracentrifugation, puis injectées à des chèvres afin de produire un immun-sérum anti-Apo B totale reconnaissant toutes les formes de l'Apo B. L'antisérum spécifique de l'Apo B100 a été préparé également chez des chèvres essentiellement selon le protocole décrit par Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al. 1971). Le peptide (SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2) qui a servi comme antigène a été émulsifié dans un adjuvant complet de Freud et injecté en sous-cutané à des chèvres, à raison de 0,5 mg de peptide par injection, pour les deux premières injections suivies, à quinze jours d'intervalle, d'injections de rappel utilisant le même adjuvant mais avec seulement 0,25 mg de peptide.
3. Isolement d'immunoglobulines (IgG) spécifiques de l'Apo B totale et de l'Apo B100.
Les IgG ont été préparées à l'aide du protocole modifié de Ritchie et al. (Ritchie
1972). Les protéines non-immunoglobulines ont été éliminées du sérum immun et les IgG ont été dialysées et concentrées.
Les anticorps peuvent être conservés entre 2 et 8°C par exemple pour une utilisation dans la semaine, ou sous forme congelée à -20°C, par exemple pour une utilisation prolongée jusqu'à un mois. Les immunoglobulines contiennent de l'azoture de sodium. 4. Spécificité des anticorps
Un immunoblot analytique des chylomicrons et VLDL a été réalisé pour mettre en évidence la spécificité des anticorps anti-Apo B100. Comme le montre la figure 1 , aucune réaction croisée n'a pu être observée avec l'Apo B48 ou les autres protéines des chylomicrons. Au niveau des VLDL, l'anticorps anti-Apo B100 ne reconnaît que la protéine située à 550 kDa qui correspond à la masse moléculaire de l'Apo B100. Ces résultats montrent que l'anticorps anti-peptide de SEQ ID NO : 1 reconnaît de façon spécifique l'Apo B100.
5. Méthode d'analyse immuno-néphélométrique
5.1 Réactifs et matériels utilisés dans le cadre de la méthode d'analyse néphélométrique
TABLEAU 1
Figure imgf000023_0001
Standard : L'Apo B standard provient d'un sérum humain calibré à l'aide d'une méthode d'électro-immunodiffusion (EIA) et testé pour les virus HIV et hépatites. Ce standard doit être manipulé avec les précautions habituelles en vue d'éviter toute contamination. Le niveau de l'Apo B standard est de 100 mg/dl.
Préparation : Pour la construction d'une courbe de calibrage, le standard doit être dilué dans un tampon 1 comme suit.
TABLEAU 2
Stockage et stabilité : L'Apo B standard peut être stockée et conservée à -
20°C. La stabilité est obtenue à l'aide d'EDTA et d'azoture de sodium. La préparation peut être congelée et séchée.
Préparation des échantillons : Les échantillons frais sont recommandés pour l'analyse. Les sera doivent être collectés grâce à des procédures établies et utilisées dans les laboratoires cliniques. Si besoin, le sérum peut être stocké entre 2 et 8°C jusqu'à une semaine. Les échantillons conservés congelés peuvent être utilisés pendant une plus longue période ; les échantillons congelés sont stables jusqu'à un an.
Préparation des échantillons sans particules Apo B100 : Dans un tube test, on ajoute dans l'ordre suivant : 40 μl d'anticorps anti-Apo B100, 40 μl de sérum et 40 μl de tampon 1. On agite et on incube ensuite la préparation pendant dix minutes à température ambiante, puis on pratique une centrifugation à 3500 tours par minute pendant dix minutes et ensuite on prélève le surnageant qui sera analysé. La concentration finale en Apo B48 dans les échantillons débarrassés des lipoparticules contenant l'Apo B100 est corrigée en fonction de la dilution du surnageant.
5.2 Protocole
Programmer un réactif défini avec les paramètres listés dans le manuel décrivant la manipulation du système immunochimique IMMAGE,
Transférer le réactif contenant les anticorps dans le compartiment A de la cartouche,
Entrer la valeur du standard (la valeur standard actuel d'Apo B est de 1 mg/dl) dans une table de paramétrage, en fonction du schéma de dilution présenté dans le tableau 2,
Utiliser le tampon 1 comme diluant d'échantillon.
5.3 Résumé :
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
à configurer après calibrage. à configurer après la mesure d'Apo B48.
5.4 Résultats
Courbe de calibrage (Figure 2) : la courbe de calibrage est élaborée de façon automatique par l'analyseur.
Contrôle qualité : il est recommandé d'utiliser un sérum de contrôle (tel que le sérum de Dade-Behring GmbH, Marburg, Allemagne; destiné au contrôle des apolipoprotéines) pour chaque échantillon testé.
Valeurs : l'analyseur indique directement la concentration finale. Pour les échantillons traités contenant de l'anticorps anti-Apo B100, la dilution au tiers doit être corrigée.
Intervalle de travail : pour l'Apo B totale : 25 à 300 mg/dl pour la mesure de l'Apo B48 : 1 ,5 à 25 mg/dl pour la mesure de l'Apo B100 : différence entre les mesures d'Apo B totale et d'Apo B48. Coefficient de variation : 4%
Valeurs usuelles (Smith 1997): Apo B48 : 4-6 mg/dl pour un sujet normal en état de jeûne
20 mg/dl pour un sujet se trouvant en période post-prandiale.
6 Autres avantages de l'invention.
D'autres avantages et utilisations des peptides synthétiques spécifiques de l'Apo B100 de l'invention incluent : la production d'anticorps monoclonaux, l'utilisation, comme standard, pour le calibrage de toutes les méthodes d'analyse Apo B100 (ELISA, RIA, électroimmunodiffusion, etc.), - l'utilisation dans l'investigation des différentes voies métaboliques des lipoprotéines, comme l'enregistrement ou l'inhibition de la capture des lipoprotéines contenant de l'Apo B par les récepteurs LDL.
D'autres avantages et utilisations des anticorps de cette invention sont les suivants : l'utilisation dans toutes les méthodes d'analyse immunologiques pour quantifier de façon différentielle l'Apo B100 et l'Apo B48, l'utilisation dans le cadre de la détection différentielle de l'Apo B100 et l'Apo B48 (immunoblot, dot blot, immunohistochimie et immunocytochimie), l'utilisation dans les méthodes d'immuno-affinité et d'immuno- précipitation pour purifier les protéines. Références
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Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide synthétique substantiellement pur, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2 ou un fragment immunogène ou un dérivé de l'une de ces séquences.
2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide est soluble ou complexé à une molécule porteuse telle que KLH, la sérum-albumine ou une bille.
3. Peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il permet de générer des anticorps immuno-précipitants.
4. Anticorps spécifique d'un peptide selon l'une des revendications 1 à
3, ou fragment ou dérivé dudit anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique.
5. Anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est produit par immunisation d'un animal non-humain avec un peptide selon l'une des revendications 1 à 3, et récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps.
6. Anticorps selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps polyclonal.
7. Anticorps selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisés en ce qu'ils correspondent à un mélange d'anticorps monoclonaux.
8. Anticorps selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisés en ce qu'ils présentent la capacité de précipiter l'Apo B100.
9. Méthode de production d'un anticorps anti-Apo B100 spécifique, comprenant l'administration d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 3 à un animal non-humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps.
10. Méthode de production d'un anticorps anti-Apo B100 spécifique, comprenant l'administration d'un mélange de peptides selon l'une des revendications 1 à 3 à un animal non-humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps.
11. Méthode de détection ou de quantification de l'Apo B100 dans un échantillon biologique, comprenant la mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 ou avec un anticorps produit grâce à une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10, et la détection de la présence de complexes immuns antigène-anticorps.
12. Méthode de détection ou de quantification différentielle de l'Apo B100 et de l'Apo B48 dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes :
(a) détermination de la quantité d'Apo B totale dans un échantillon avec un anticorps anti-Apo B totale,
(b) élimination de l'Apo B100 ou des lipoparticules contenant l'Apo B100 dudit échantillon, à l'aide d'un anticorps anti-Apo B100 spécifique selon l'une des revendications 4 à 8 ou produit grâce à une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10, et
(c) détermination de la quantité d'Apo B48 dans l'échantillon obtenu à l'issue de l'étape (b) ou dans les lipoparticules ne contenant pas d'Apo B100 au sein de cet échantillon, avec un anticorps anti-Apo
B totale.
13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que, au cours des étapes a) et/ou c), on utilise un anticorps anti-Apo B totale polyclonal.
14. Méthode selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que l'anticorps anti-Apo B100 spécifique utilisé au cours de l'étape b) est un anticorps polyclonal ou un mélange d'anticorps monoclonaux ou un anticorps modifié permettant la précipitation des complexes immuns.
15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'anticorps anti-Apo B100 spécifique utilisé au cours de l'étape b) est un anticorps polyclonal immuno-précipitant.
16. Méthode selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisée en ce que la présence d'un complexe immun antigène-anticorps est déterminée par ELISA, RIA, EIA, turbidimétrie ou tout autre dosage immunologique.
17. Méthode selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisée en ce que la présence d'un complexe immun antigène-anticorps est déterminée par une méthode d'analyse néphélométrique.
18. Méthode de détection ou de quantification différentielle de l'Apo B100 et de l'Apo B48 dans un échantillon biologique comprenant la mise en contact dudit échantillon avec un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 ou avec un anticorps produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10, et la détection indirecte de la formation de complexes immuns Apo B100-anticorps par une méthode d'analyse néphélométrique.
19. Méthode selon l'une des revendications 11 à 18, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang ou de plasma ou de sérum ou de fluide interstitiel ou de liquide céphalorachidien ou un surnageant de culture cellulaire.
20. Méthode de détection de la présence, d'une prédisposition ou d'un risque de développer un désordre lié au métabolisme des lipides chez un sujet, comprenant la quantification différentielle in vitro des quantités d'Apo B48 et d'Apo B100 dans un échantillon prélevé sur un sujet, avec un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8, ou avec un anticorps produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10.
21. Méthode selon la revendication 20, pour la détection de la présence, d'une prédisposition ou d'un risque de développement de l'athérosclérose ou d'une pathologie cardiovasculaire telle que par exemple une maladie coronaire .
22. Méthode de suivi d'un traitement destiné à corriger des désordres liés au métabolisme des lipides chez un sujet, comprenant la quantification de l'Apo B100 et/ou de l'Apo B48 in vitro, dans un échantillon provenant dudit sujet, à l'aide d'un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 ou d'un anticorps produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10.
23. Méthode selon la revendication 22, pour le suivi d'un traitement de l'athérosclérose ou d'une pathologie cardiovasculaire telle que par exemple une maladie coronaire.
24. Méthode de détection ou de suivi de la capture cellulaire des LDL et des lipoprotéines riches en triglycérides chez un sujet, comprenant la détection in vitro des quantités d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 présentes dans des lipoparticules, à l'aide d'un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 ou d'un anticorps produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10.
25. Méthode d'évaluation de l'état physiologique d'un sujet, comprenant la détection des niveaux d'Apo B48 et/ou d'Apo B100 in vitro dans un échantillon provenant dudit sujet, à l'aide d'anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 ou d'un anticorps produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10.
26. Utilisation d'anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 ou produits par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10 pour cribler des composés ou des régimes alimentaires capables de moduler la concentration sérique ou plasmatique d'Apo B48 et/ou d'Apo B100.
27. Anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 ou produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l'anticorps est couplé à des fragments hétérologues tels que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique.
28. Utilisation d'un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 et 27 ou produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10, pour la préparation d'une composition destinée à réguler de façon sélective in vivo, chez un sujet, l'activité de l'Apo B100.
29. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 et 27 ou produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10 et un excipient ou un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
30. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 3 dans le cadre de méthodes de criblage de composés modulant l'activité de l'Apo B.
31. Utilisation d'un peptide selon l'une des revendications 1 à 3 pour la préparation d'une composition destinée à moduler de manière spécifique l'activité de l'Apo B100.
32. Kit comprenant un peptide selon l'une des revendications 1 à 3 ou un anticorps selon l'une des revendications 4 à 8 et 27 ou produit par une méthode selon l'une des revendications 9 ou 10.
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