Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsaure
Gebiet der Erfindung;
Die Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Fettsäuren und betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsaure durch enzymatische Hydrolyse ihrer Ester.
Stand der Technik
Linolsäuren mit konjugierten Doppelbindungen, die unter der Bezeichnung "CLA" (conjugated linoleic acid) im Handel sind, sind physiologisch aktiv und werden als Lebensmittelzusatzstoffe eingesetzt. Üblicherweise geht man zur Herstellung von konjugierter Linolsaure von Triglyceriden aus, die über einen hohen Anteil an - üblicherweise nicht- konjugierter - Linolsaure verfügen, wie beispielsweise Distel- oder Sonnenblumenöl. Die Triglyceride werden in Gegenwart von basischen Katalysatoren oder Enzymen isomeri- siert und dann verseift. Von Nachteil dabei ist, dass die Verseifung zum einen eine Menge unerwünschter Abfallstoffe liefert und zudem hohe Mengen an Alkalien erforderlich sind, was rasch zu Korrosion in den Reaktoren führen kann. Um dies zu vermeiden, geht man in neuerer Zeit vorzugsweise von den Linolsäurealkylestern aus, die zunächst zu den CLA-Estern isomerisiert und dann verseift werden. Doch auch dieses Verfahren kann nicht völlig überzeugen, da es ebenfalls mit Nachteile behaftet ist, wie z.B. geringe Ausbeuten, drastische Reaktionsbedingungen, unerwünschte Nebenprodukte und lange Reaktionszeiten.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung hat folglich darin bestanden, ein Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsaure zur Verfügung zu stellen, das die genannten Nachteile des Stands der Technik zuverlässig vermeidet.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von konjugierter Linolsaure, bei dem man
(a) konjugierte Linolsäureniedrigalkylester in Gegenwart von Enzymen mit Wasser unter kontinuierlicher Alkoholentfernung hydrolysiert,
(b) das Hydrolysat in eine organische und eine wässrig/alkoholische Phase auftrennt, und
(c) die die konjugierte Linolsaure enthaltende organische Phase von nicht-umgesetzten konjugierten Linolsäureniedrigalkylestern befreit.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine enzymatische Hydrolyse unter kontinuierlicher Alkoholabtrennung zu Fettsäuren führt, die frei von unerwünschten Nebenprodukten sind. Es werden hohe Ausbeuten erzielt, das Verfahren arbeitet bei milden Bedingungen und mit Katalysatoren, die alle Anforderungen an die Umweltverträglichkeit erfüllen. Erfolgt während des Hydrolyseverfahrens die Alkoholentfernung kontinuierlich direkt aus dem Hydrolysereaktor, erreicht man in einem Einstufenverfahren zudem eine weitaus schnellere Umsetzung.
Konjugierte Linolsäureniedrigalkylester
Als Ausgangsstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren dienen Linolsäureniedrigalkylester, die vorzugsweise der Formel (I) folgen,
R!CO-OR2 (T)
in der R!CO für den Acylrest einer Linolsaure mit konjugierten Doppelbindungen und R2 für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen steht. Insbesondere werden konjugierte Linolsäuremethyl- und/oder -ethylester eingesetzt.
Enzyme
Typische Beispiele für geeignete Enzyme, die jedoch nicht einschränkend sein sollen, sind Lipasen und/oder Esterasen von Mikroorganismen die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Alcaligenes sp., Aspergillus niger, Candida antarctica A, Candida antarctica B, Candida cylindracea, Chromobacterium viscosum, Rhizomucor miehei, Pe- nicilium camenberti, Penicilium roqueforti, Porcine pancreas, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus javanicus, Rhizopus oryzae, Thermomyces lanugeno- sus sowie deren Gemischen. Bevorzugt, weil besonders aktiv, sind Lipasen und Esterasen aus den Organismen Alcaligenes, Candida, Chromobacterium, Rhizomucor, Pseudomonas, Rhizopus und Thermomyces. Die Enzyme werden in der Regel als verdünnte Suspensionen oder wässrige Konzentrate eingesetzt. Die Lipasen/Esterasen können auch immobilisiert auf Trägermaterial eingesetzt und in sogenannten "repeated batches" wiederver- vendet werden.
Hydrolyse
Die Hydrolyse der Fettsäurealkylester erfolgt vorzugsweise bei milden Temperaturen im Bereich von 20 bis 80 °C, vorzugsweise 30 bis 70 °C und besonders bevorzugt 35 bis 60 °C unter kontinuierlicher Abtrennung des niederen Alkohols, also üblicherweise von Methanol bzw. Ethanol unter vermindertem Druck, wobei die bevorzugte Temperatur durch das Aktivitätsoptimum der eingesetzten Enzyme vorgegeben wird.
A) Als Hydrolyseverfahren eignet sich eine diskontinuierliche Fahrweise („Batch"), bei der ein konstanter Wassergehalt üblicherweise im Bereich von 30 - 70 Gew.-% im Reaktor über Nachdosierung von Wasser eingestellt wird. Üblicherweise wird die Reaktion bei einer Temperatur von 30 bis 50 °C und einem verminderten Druck von 20 - 60 ± 5 mbar durchgeführt. Bei dieser Fahrweise wird kontinuierlich ein Alkohol/Wasser-Gemisch entfernt („gestrippt").
B) Als weiteres eignet sich ein Hydrolyseverfahren in ebenfalls diskontinuierlicher Fahrweise, bei der Wasser kontinuierlich eingespeist wird und dauerhaft ein Alkohol/Wasser- Gemisch entfernt („gestrippt") wird. Üblicherweise ist der Wassergehalt im Reaktor bei dieser Fahrweise gering (0 bis 20 Gew.-%). Die Reaktion wird üblicherweise bei einer Temperatur von 50 bis 70 °C und einem verminderten Druck von 20 - 60 + 5 mbar durchgeführt.
C) Alternativ eignet sich auch eine mehrstufige Hydrolyse ohne kontinuierliche Entfernung der Alkoholkomponente. Nach erfolgter enzymatischer Hydrolyse wird die Wasserphase, die auch große Teile des wasserlöslichen kurzkettigen Alkohols enthält, von der organischen Phase getrennt und eine frische Wasserphase wird zugegeben. Die Wasserphase wird typischerweise 1 - 3 mal gewechselt. Die Reaktion wird üblicherweise bei einer Temperatur von 20 bis 70 °C durchgeführt und einem Wassergehalt von 50 - 75 % durchgeführt. Die Hydrolyse kann mit immobilisiertem Enzym, dass in jeder Hydrolysestufe erneut eingesetzt werden kann, sowie mit nicht immobiliseirtem Enzym durchgeführt werden. In jeder Hydrolysestufe muss dann frisches Enzym zugegeben werden.
Aufarbeitung
Im Anschluss an die Hydrolyse wird die wässrig/alkoholische von der organischen Phase getrennt und letztere aufgearbeitet, d.h. nicht umgesetzter Alkylester vom- Wertprodukt entfernt. Je nach Dauer der Hydrolyse werden unterschiedliche Spaltraten erhalten. Die Reaktion kann früh, beispielsweise schon im Bereich -einer Umsetzung von 60 Gew. %, abgebrochen werden, so dass die nachfolgende Trennung von Fettsäuren und Fettsäureestern erfolgen muss. Sie kann jedoch auch erst bei über 90 Gew.-%, vorzugsweise über 95 Gew.-% beendet werden, oder sogar bis zu > 99 Gew.-% weitergeführt werden, so dass keine anschließende Abtrennung mehr notwendig ist. Die Trennung kann destillativ oder über Verseifung der freien Fettsäure und anschließender Phasenseparation erfolgen. Insbesondere ist aber eine komplette Hydrolyse der konjugierten Linolsäureester (Spaltgrad > 99 %) unter milden Reaktionsbedingungen bevorzugt, um eine Veränderung der Isomerenzusammensetzung zu vermeiden.
Beispiele
Beispiel 1 Selektion geeigneter Lipasen.
15 Ansätze mit jeweils 4 g konjugiertem Linolsäureethylester und 6 g Wasser in einem verschließbaren Reaktionsgefäß wurden bei Raumtemperatur parallel auf einer Multirühr- platte gerührt. Zu den Ansätzen werden jeweils 40 mg kommerziell erhältliche Lipasen bzw. Esterasen zudosiert. Nach 2 h und 22 h Reaktionszeit werden jeweils Proben genommen. Die organische Phase enthaltend Fettsäureethylester und enzymatisch hydroly- sierte Fettsäure wurden separiert und analysiert. Der Umsatz wurde über die Säurezahl bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 Eingesetzte Lipasen und Esterasen
Alle getesteten Lipasen und Esterasen erwiesen sich in der Hydrolyse der Fettsäureester aktiv. Bevorzugt sind jedoch Mikroorganismen vom Typ Alcaligenes, Candida, Chromobacterium, Penicilium, Pseudomonas, Rhizopus und Thermomyces. Die Reaktion ohne Entfernung von Ethanol reagierte unter obigen Bedingungen bis zu einem Gleichgewicht von etwa 30 Gew.-% freier Fettsäure.
Beispiel 2 Hydrolyse von kurzkettigen konjugierten Linolsäuremethylestern unter kontinuierlichem
Abstrippen von Wasser und Methanol. Hydrolyseversuch nach Verfahren A)
In einen beheizbaren Kolben wurden 400 g konjugierter Linolsäuremethylester, 200 g Wasser und 20 g auf Polypropylen immobilisierte Candida antarctica B Lipase vorgelegt. Die Reaktion wurde mit aufgesetzter Destillationsbrücke bei einem verminderten Druck von 60 mbar und einer Temperatur von 60 °C durchgeführt. Wasser wurde kontinuierlich mit einer Flussrate von 0,5 ml/min in den Kolben gepumpt und im Kolben wird ein Wassergehalt von 30 - 40 % eingestellt. Die Umsetzung der Reaktion wurde über Bestimmung der Säurezahl verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch vom immobilisierten Enzym abfiltriert und die organische Phase von der wässrigen Phasejiber Reparation getrennt. Eine Säurezahl von 200 entsprach 100 % Umsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst:
Tabelle 2 Umsatz unter Abstrippen von Wasser und Methanol nach unterschiedlichen Reaktionszeiten
Nach Analyse der Säurezahl wurde eine konjugierte Linolsaure mit einem Spaltgrad von > 99 % innerhalb von 48 h Reaktionsdauer als klare, schwach gelblich gefärbte Flüssigkeit erhalten.
Über gaschromatographische Analyse wurde das Isomerenmuster der enzymatisch hydro- lysierten CLA mit dem Ausgangssubstrat CLA Methylester verglichen.
Tabelle 3: Vergleich des Isomerenmusters nach enzymatischer Hydrolyse
Im Rahmen der Messungenauigkeit hat keine signifikante Veränderung des Isomerenmusters durch die enzymatische Hydrolyse stattgefunden.
Beispiel 3 Hydrolyse von kurzkettigen konjugierten Linolsäuremethylestern unter kontinuierlichem
Abstrippen von Wasser und Methanol. Hydrolyseversuch nach Verfahren B)
In einen beheizbaren Kolben wurden 100 g konjugierter Linolsäuremethylester, 10 g Wasser und 5 g auf Polypropylen immobilisierte Candida antarctica B Lipase vorgelegt. Die Reaktion wurde mit aufgesetzter Destillationsbrücke bei einem verminderten Druck von 60 mbar und einer Temperatur von 60 °C durchgeführt. Wasser wurde kontinuierlich mit einer Flussrate von 0,25 ml/min (Beispiel 3A) und 0,5 ml/min (Beispiel 3B) in den Kolben gepumpt. Zudosiertes Wasser wurde schnell abdestilliert, so dass der Wassergehalt im Reaktor während der gesamten Reaktionsdauer gering (< 20 %) war. Die Umsetzung der Reaktion wurde über Bestimmung der Säurezahl verfolgt. Die Reaktionen wurden bei Teilumsatz nach 24 h abgebrochen und das immobilisierte Enzym vom Reaktionsgemisch abfiltriert. Dann wurde die organische Phase von der wässrigen Phase über Separation getrennt. Eine Säurezahl von 200 entsprach 100 % Umsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst:
Tabelle 4 Umsatz unter Abstrippen von Wasser und Methanol nach unterschiedlichen Reaktionszeiten
Innerhalb von 24 h wurden je nach Menge des eindosierten Wasser Spaltgrade von 76,5 % bzw. 83,5 % erhalten. Die Destillatmenge in Beispiel 3A betrug nach 24 h 315 g und die destillatmenge in Beispiel 3B 584 g.
Beispiel 4 Hydrolyse von kurzkettigen konjugierten Linolsäureethylestern unter kontinuierlichem
Abstrippen von Wasser und Ethanol. Hydrolyseversuch nach Verfahren A)
In einen beheizbaren Kolben wurden 100 g konjugierter Linolsäureethylester, 100 g Wasser und 10 g auf Polypropylen immobilisierte Thermomyces lanugenosus Lipase vorgelegt. Die Reaktion wurde mit aufgesetzter Destillationsbrücke bei einem verminderten Druck von 30 mbar und einer Aussentemperatur von 60 °C durchgeführt. Wasser wurde kontinuierlich mit einer Flussrate von 0,5 ml/min in den Kolben gepumpt und im Kolben wurde ein Wassergehalt von 40 - 60 % eingestellt. Die Innentemperatur im Reaktor wurde dabei auf etwa 40 °C gehalten. Die Umsetzung der Reaktion wurde über Bestimmung der Säurezahl verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das immobilisierte Enzym vom Reaktionsgemisch abfiltriert und die organische Phase von der wässrigen Phase über Separation getrennt. Eine Säurezahl von 200 entsprach 100 % Umsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst:
Tabelle 5 Umsatz unter Abstrippen von Wasser und Ethanol nach unterschiedlichen Reaktionszeiten
Nach Analyse der Säurezahl wurde eine konjugierte Linolsaure mit einem Spaltgrad von 83 % innerhalb von 45 h Reaktionsdauer als klare, farblose Flüssigkeit erhalten.
Beispiel 5 Hydrolyse von kurzkettigen konjugierten Linolsäuremethylestern durch mehrstufige Hydrolyse Hydrolyseversuch nach Verfahren C)
In geschlossenen Gefässen wurden 3 Ansätze mit jeweils 20 g konjugiertem Linolsäuremethylester auf Basis von Sonnenblumenöl und 40 g Wasser eingewogen. Anschliessend wurden jeweils 1 g immobilisierte Lipase zugegeben und die Gemische wurden 5 h bei Raumtemperatur auf einer Magnetrührplatte gerührt. Danach wurden die Enzymimmobilisate abfiltriert und die organische Phase wurde von der wässrigen Phase über Separation getrennt. Zur organischen Phase wurden erneut 40 g Wasser gegeben und die abfiltrierten Enzymimmobilisate wurden erneut zur Reaktionslösung gegeben. Nach Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur wurden die Enzymimmobilisate erneut abfiltriert und die organische Phase wurde von der wässrigen Phase über Separation getrennt. Zur organischen Phase wurden 40 g Wasser gegeben und die abfütrierten Enzymimmobilisate wurden erneut zur Reaktionslösung gegeben. Nach weiteren 5 h Reaktion bei Raumtemperatur wurde die Reaktion abgebrochen. Folgende Enzymimmobilisate wurden eingesetzt: 5A) 1 g Novozym 435
5B) 1 g Candida antarctica B Lipase immobilisiert auf makroporöses Polypropylen 5C) lg Thermomyces lanugenosus Lipase immobilisiert auf makroporöses Polypropylen Die Umsetzung der Reaktion in den einzelnen Stufen wurde über Bestimmung der Säurezahl verfolgt. Eine Säurezahl von 200 entsprach dabei 100 % Umsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst:
Tabelle 6 Umsatz in mehrstufiger Hydrolyse
Beispiel 6 Hydrolyse von kurzkettigen konjugierten Linolsäureethylestern durch mehrstufige Hyd-
. rolyse Hydrolyseversuch nach Verfahren C)
In geschlossenen Gefässen wurden 2 Ansätze mit jeweils 20 g konjugiertem Linolsäure- ethylester auf Basis von Distelöl und 40 g Wasser eingewogen. Anschliessend wurden jeweils 200 mg nicht immobilisierte bzw. 1 g immobilisierte Lipase zugegeben. Die Ansätze wurden behandelt wie in Beispiel 5 beschrieben. Vom nicht immobilisiertem Enzym wurden in jeder Spaltstufe 200 mg frisches Enzym zugesetzt. Folgende Enzyme wurden eingesetzt:
6A) 200 mg Lipomod 34 (Candida cylindracea Lipase) pro Stufe 6B) 1 g Novozym 435 (Chromobacterium viscosum Lipase) pro Stufe Die Umsetzung der Reaktion in den einzelnen Stufen wurde über Bestimmung der Säurezahl verfolgt. Eine Säurezahl von 200 entsprach dabei 100 % Umsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst:
Tabelle 7
Umsatz in mehrstufiger Hydrolyse