WO2003101466A1 - Composition contenant du glycoside de rubrobusarine - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for oral ingestion that contains rubrofusarin glycoside as an active ingredient and can increase the concentration of dartathione in vivo.
  • Conventional technology contains rubrofusarin glycoside as an active ingredient and can increase the concentration of dartathione in vivo.
  • Dartathion a tripeptide consisting of glutamic acid, cysteine, and glycine, is a multifunctional biological component that is contained in cells at a high concentration of 1 to 1 OmM.
  • daryuthione plays an important role in the elimination of hydrogen peroxide and lipid peroxide as a substrate for glutathione peroxidase. It is involved in detoxification and metabolism as a substrate for one of the enzymes, glutathione-S-transferase. It is also used as a substrate for glutathione dehydrogenase for the reactivation (reduction) of ascorbic acid oxidized in vivo.
  • Oral ingestion of daltathion directly contributes to the increase of dalatathion in living tissues because it is decomposed and no increase in blood concentration of daluthion is observed even when a high dose of daluthion is ingested. Not known (Eur. J. Clin. Pharmaco. 43, 667, 1 992).
  • W094 / 12527 discloses that the r-L-pyrodal mil-L cysteine acyl derivative promotes the biosynthesis of endogenous dalbut thione, which is an oxidative tissue disorder.
  • it is effective for treating various diseases caused by deficiency or deficiency of dartathione such as a pathological condition involving a disorder caused by excessive free radicals.
  • Examples of the diseases mentioned here include alcohol consumption, xenobiotics, radiation damage, intracellular oxidation due to liver disease, poisoning with medicines and other compounds, poisoning with heavy metals, brain physiology Aging (for example, Parkinson's disease, which is a decline in the brain due to loss of memory and learning ability, or a decrease in the concentration of dartation associated with changes in defense mechanisms against bio-oxidants), and acute and chronic neurological diseases (Acute medical conditions include cerebral seizures, hypoglycemia and epileptic seizures as acute ischemic conditions, and chronic medical conditions include amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's disease, Huntington's chorea) However, there are dysfunctions in the immune system, especially reduced immunity against cancer, infertility, especially male infertility. Furthermore, it is disclosed that the above compounds are also suitable for ischemia / reperfusion injury of organs which are the main cause of free radicals.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 1-26516 describes an L-Daltamil-L- It is disclosed that a compound that increases the concentration of dartathione is effective in the treatment and prevention of various diseases including cataract, liver disease and kidney disease.
  • S-lower fatty acid dartathione derivatives are disclosed as anti-inflammatory, anti-allergic, hepatic disorder inhibitors (W091 / 12262, 091/16337), and sugar-containing dalbutione derivatives are disclosed as liver protecting agents (Japanese Patent Laid-Open No. 9-25292). It has been shown that increasing the amount of tissue dull thione is effective in treating and preventing a wide range of diseases. With regard to dartathione ester derivatives, the following findings have been reported to have a protective effect against tissue cell damage as listed below. In other words, butioninsulfoximine-induced cataract (Pro. Natl. Acad. Sci.
  • the present invention is different from the method for supplying precursor amino acids used in the biosynthesis of daryuthione.
  • the present invention provides a composition for oral intake that can promote intracellular biosynthesis of dalbutin.
  • FIG. 1 is a graph showing that rubration concentrations in human hepatocyte-derived HepG2 cells increase over time by rubrofusarin glycoside, compared with silibinin.
  • Fig. 2 is a graph showing a dose-dependent increase in the concentration of dalbutthione in human hepatocyte-derived HepG2 cells compared to 3-naphthoflavone and silibinin due to rubrofusarin glycosides.
  • FIG. 3 is a graph showing the protective effect of rubrofusaline glycoside on the killing of human hepatocyte-derived HepG2 cells against t-butyl hydroperoxide in comparison with 3 naphthoflavone used as a positive control.
  • FIG. 4 is a graph showing that rubrofusarin glycoside and cystine which is a precursor amino acid of daryuthione synergistically contribute to an increase in daryuthione concentration in human hepatocyte-derived HepG2 cells.
  • Fig. 5 is a graph showing that oral administration of a concentrate containing rubrofusarin glycosides has an inhibitory effect on the decrease in dartathione level in liver tissue and the increase in lipid peroxidation (TBARS value) due to restraint stress. .
  • A Liver dull thione content
  • Figure 6 shows that oral administration of a concentrate containing rubrofusarin glycosides has an inhibitory effect on the reduction of brain dalbution levels and increased lipid peroxidation (TBARS) due to restraint stress. It is a graph.
  • A Brain tissue dartathione content
  • B Brain tissue TBARS value.
  • the present inventor conducted a search for an active ingredient that increases the ability to synthesize daryuthione in cells suitable for the above-mentioned purpose using materials having a wide range of dietary experience, and found that an effective ingredient is present in the ketchei extract. We identified that this active ingredient is rubrofusarin glycoside.
  • synthetic compounds such as / 3-naphthoflavone (J. Biol. Chem. (1998) 273, 14683) and silymarin (Planta Med. 55, 420, 1989), Sanohydroxybutene (Toxicol. Appl.
  • Kecameshi is the seed of Cassia obtusifolia, a member of the legume family, and has been roasted and drunk for a long time.
  • Kekmeishi has the following effects: “cleansing the liver, revealing eyes, using water, passing stool” In particular, “blue-blind, eye-skinned skin, red-and-white membrane, redness and pain in the eyes, and things that don't stop with tears coming out, and if you take it for a long time, it will benefit luminescence (eye light)” Cited to the scriptures and introduced that it is an effective herbal medicine for the eyes. It is also referred to as “Ophthalmic Drugs” in the section of “Medical Pharmacy for Clinical Medicine” (Medical and Pharmaceutical Publishing).
  • the present invention relates to a rubrofusarin glycoside for maintaining a high level of in vivo (tissue, intracellular) dalbutione thiophene glycoside, to which rubrofusarin glycoside is added as an active ingredient. It is a composition for oral intake containing this.
  • Ruprofufalin glycoside has the following formula:
  • sugar component A examples include gentiobiose and glucose.
  • a preferred sugar component is gentiobiose, in which case the rubrofusarin glycoside is rubrofusarin gentiobioside.
  • Rubrofusarin glycosides are contained in extracts from natural products, and examples of natural products that can be used as raw materials include Kassmeia (Cass ia ob tus i fo lia) and Cassia (Cass ia occ i dent al is ;
  • Rubrofusarin glycoside may be an active ingredient of the composition of the present invention as a pure substance, or may be an active ingredient of the composition in the form of an extract from a natural product.
  • a preferred natural product as a raw material is Kecamesi, but any material containing rubrofusarin glycosides is not limited to Kecamesi, but can also be used in the same way.
  • the ruburofusarin glycosides are treated according to the purpose such as extraction operation from the raw material such as Kecameshi dried seeds containing rubrofusarin glycosides.
  • a concentrated composition containing a predetermined amount may be used.
  • the solvent used to extract rubrofusarin glycosides from natural products is water or an organic solvent.
  • organic solvents include alcohols such as ethanol and methanol, esters such as ethyl acetate, ketones such as acetone, methyl
  • Ethers such as ethyl ether can be used. Two or more of these water or organic solvents may be used in combination, but when aiming for food or drink, it is appropriate to use water or an aqueous ethanol solution.
  • An example of the preparation of an extract concentrate containing the rubrofusarin glycoside of the present invention using Ketchei as a raw material is as follows.
  • the method and conditions should be adopted so that the concentrate contains as much of the rubrofusarin glycoside as possible.
  • a concentrate containing 1 to 30% by weight of luprofusalin glycoside per concentrate (dry solid) is desirable.
  • the heating temperature is preferably 50 ° C to 95 ° C.
  • the amount of solvent added for extraction is, for example, 3 to 10 times the amount of the raw material.
  • the content and purity of rubrofusarin glycoside in the filtrate obtained by extraction is about 2.2% for 70% ethanol extraction and 1.1% for thermal extraction (see Table 1).
  • an adsorption resin such as Diaion HP 20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and activated carbon, which are widely used for industrial purposes, can be used.
  • the extraction filtrate is directly applied to the resin, and when extraction is performed using an aqueous ethanol solution as the solvent, the concentration is reduced under reduced pressure, etc. • Contact the extract with the resin.
  • a decrease in the ethanol concentration is preferable in order to sufficiently adsorb rubrofusarin glycosides.
  • the ethanol concentration is preferably reduced to 20% or less.
  • the concentration of ingredients can be set according to each purpose, and a method suitable for that can be selected.
  • an ethanol solution can be used for elution by a method such as stepwise or concentration gradient.
  • a non-limiting example is 20% ethanol wash Z80% ethanol. Elution, 30% ethanol washing, Z60% ethanol elution, etc. are possible.
  • the eluate thus obtained can be concentrated or dried into powder by ordinary methods such as vacuum concentration and freeze drying.
  • a dry powdered product can be produced using conventional dextrin, polymer starch hydrolyzate, or polymer peptide as an excipient. .
  • rubrofusarin glycosides eg, high-purity rubrofusaringen thiobioside
  • column chromatography, high performance liquid chromatography, liquid-liquid partition chromatography using the above extract concentrate is used.
  • the desired purity can be obtained by treatment according to a conventional method such as:
  • the solvent system is 0.1% trifluoroacetic acid-containing aqueous solution of acetonitrile containing 10% -80% (acetonitrile concentration) gradient elution, resulting in a reproducible peak with good resolution. Since the active ingredient is eluted, if this is collected, rubrofusarin glycoside (eg, rubrofusarin gentiobioside) can be obtained as almost a single ingredient.
  • Example 2 In order to monitor the purity and yield of rubrofusarin during the above extraction / purification process, the measurement method described in Example 2 can be used.
  • rubrofusarin glycoside is a component that contains 3 mg or more of raw cereals per lg. It is considered to be highly safe because it has been drunk considerably and has been used orally. These findings should be reflected in the content setting of the rubrofusarin glycoside of the present invention. Therefore, the composition of the present invention has no substantial upper limit on the amount of rubrofusarin glycoside which is an active ingredient, but preferably 0.5% by weight or more to 30% by weight, more preferably 1% Add more than 15% to less than 15% by weight. '
  • rubrofusa phosphorus glycoside As a pure substance or as a concentrate from a natural raw material, a composition for oral consumption that can be easily ingested in an effective amount can be provided.
  • Rubrofusarin glycosides are sufficiently stable to pH, moisture, oxidation, light, etc. and exhibit some bitterness. Therefore, the composition for oral ingestion according to the present invention can be used in various forms such as foods and drinks, seasonings, alcoholic beverages, functional foods, and pharmaceuticals depending on purposes. It is possible to alleviate or maintain the level of dalbution in cells / tissues / organs caused by oxidative stress. For example, maintaining liver function, brain function, visual function, immune function, etc.
  • compositions include a solid form, a semi-fluid form, and a fluid form.
  • solid foods include biscuits, sheets, tablets such as tablets and capsules, and general foods and health foods in the form of granular powders.
  • Semi-fluid foods include pastes, jellies, and gels.
  • Liquid foods include juices, soft drinks, teas, drinks, and other general and health foods. .
  • composition of the present invention contains an amount of rubrofusarin glycoside that functions to increase the intracellular concentration of dalbutthione, and is not particularly limited except that it is safe to ingest. .
  • rubrofusarin glycoside may be included as a single active ingredient, or alternatively, a precursor for intracellular dalbutione biosynthesis, especially nutritional science.
  • L-cystine ZL-cystine (however, it is known that oral administration of a significant amount of free L-cystine is toxic, Am. J. C li n. Nu tr. 50, 1401, 1989) and L-methionine can be added to achieve a synergistic effect of increasing the function of darumathione.
  • a synergistic effect is a composition containing both of these at the same time compared to the sum of the effect of increasing the intracellular dalbution concentration of a composition containing only rubrofusarin glycoside and the effect of a composition containing only a precursor. This means that this action is larger.
  • precursors include L-cystine ZL-cystine, L-methionine-rich egg white and egg membranes, animal products such as milk whey (milk), proteins such as soybeans and plant-derived yeasts, Peptides processed and prepared from them, and addition of L-cystine and L-methionine approved as food additives can be mentioned.
  • These precursors or foods containing them in high content are preferably blended in a composition of about 0.1 to 10% by weight per solid as L-cysteine content.
  • vitamin C ascorbic acid
  • the composition for ingestion is effective for alleviating physical problems related to lifestyle habits as described above.
  • the usage may be before, after, during, or between meals, but preferably between meals, and the frequency of use is preferably taken 3 times daily, but is not limited to this. It doesn't matter.
  • the tablet shown in Example 10 is designed according to such a setting. Those who specifically recommend the use of this composition for ingestion are those who are concerned about redness of their eyes or vision loss, those who are concerned about senile cataracts as they age, those who are concerned about smoking disorders, smoking Examples include people who are concerned about UV rays, including sunlight, skin with aging, wrinkles, and spots.
  • Example 1 Identification of active ingredients
  • a 70% (v Z v) ethanol extract of Kemeshi is placed on a Diaion HP20 adsorption column and washed with a 30% ethanol solution and then extracted with a 70% ethanol solution. Further purification was performed by liquid chromatography, and the active ingredient of the present invention was identified.
  • Reversed phase high-performance liquid chromatography uses a Develos il ODS-HG5 column (6 X 100mm, manufactured by Nomura Chemical) with a 3D monitor, and 10% of the above extract concentrate (89 mg / ml aqueous solution). Elution was carried out under the conditions of a linear concentration gradient (12 minutes) containing 25% to 40% acetonitrile with 0.1% trifluoroacetic acid, and the fractions collected at intervals of 15 seconds were dried under reduced pressure. Later, it was dissolved in 20 ⁇ 1 dimethyl sulfoxide (DMS0).
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • the culture solution is removed and washed once with phosphate buffered saline (PBS), and then 25 ⁇ 1 of 0.25 mM monochlorobimane-containing PBS solution is added and C0 2 Incubator ( 3 The sample was left in c) for 45 minutes, and after returning to room temperature, 75 ⁇ 1 distilled water was added and homogenized.
  • the fluorescence intensity of the fluorescent substance produced by the reaction between the black-and-white biman and dartathione was measured under the conditions of 355 nm and Z460 nm, and the fluctuation of intracellular dartathione content was observed. As a result, a dose-dependent fraction was observed, and a fraction showing a strong activity of increasing intracellular dartathione was found.
  • Example 3 Decrease in content of rubrofusarin glycoside with roasting
  • extraction was performed at room temperature for 1 day, and a filtrate was obtained by filtration through a filter (dry weight: 14.5 g, rubrofusarin glycoside 3.0% by weight).
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to make a final solution of 500 ml of 20% (v / v) ethanol, then placed on a Diaion ⁇ 0 adsorption column (100m 1) and washed with non-adsorbed components with 100 ml of 20% ethanol solution ( Dry weight of non-adsorbed material: 10.8g).
  • Table 2 summarizes the dry weight and the weight percent of rubrofusarin glycosides.
  • HepG2 cells derived from human hepatocytes were used to examine the time-dependent inducibility of rubu-fusalin glycosides to the intracellular dartathione concentration.
  • the operating method is the same as in Example 1. I.e. HepG2 cells were dispensed and fixed at 2.5 x 10 4 cells (100 1) per well of the microplate, and then 25 ⁇ 1 of an evaluation sample diluted to a predetermined concentration was added to RPMI1640 medium. The culture was performed over time until 12, 24 and 48 hours.
  • the concentrate of the present invention prepared according to the method of Example 4 (containing 10.2% (w / w) of rubus mouth fusarin geniobioside) and glutathione in tissues in rats for comparison purposes.
  • hepG2 cells derived from human hepatocytes we examined the dose-dependence of lupus-oralin glycosides on intracellular dartathione concentration.
  • the operating method is in accordance with Example 5.
  • 2.5 x 10 4 cells (100 1) per well of a microplate were dispensed and fixed in HepG2 cells, and 25 1 of a concentrate serially diluted to a predetermined concentration with RPMI1640 medium was added to 25 1 (activity)
  • the final concentration is 0 to 20 xM in terms of rubrofusarin gentiobioside, which is a component, and after further incubation for 48 hours, the intracellular dartathione concentration is not added to the sample.
  • HepG2 cells derived from human hepatocytes were used to show resistance to peroxide compounds by giving rubrofusarin glycosides.
  • the operating method is in accordance with Example 5. That is, after HepG2 cells were dispensed and settled at 2.5 x 10 4 cells (100 n 1) per well of the microplate, the final concentration was 10 / M in terms of rubrofusaringentiobioside in RPMI1640 medium.
  • hepG2 cells derived from human hepatocytes we observed a synergistic effect of rubrofusarin glycoside, which has an activity to increase intracellular dartathione, and a precursor for dartathione biosynthesis.
  • the procedure is the same as in Example 1, but the RPMI1640 medium does not contain L-cystine because it contains a sufficient amount of the precursor L-cystine and does not meet the purpose of this example.
  • -MEM with 10% serum
  • a medium was prepared and used. That is, after HepG2 cells were dispensed and fixed at 2.5 x 10 4 cells (100 a 1) per well of the microphone plate, The medium was changed to the D-MEM medium (100 1) containing no L-cystine.
  • TBARS dartathione and lipid peroxide (thiobarbituric acid reactant: TBARS) in each organ were measured. More specifically, a 9 (w / v) volume of ice-cold homogenization solution (154 mM KC1, 5 mM DTPA, 10 mM KPi buffer) was removed per weight of each organ stored at 80 ° C. , pH 6.8) and a homogenate was prepared using Fiscotron (manufactured by Nisshin Medical Science Instrument Co., Ltd.), and the TBARS value was determined according to the method of Ohkawa et al. Anal. Biochem. 95.
  • Example 1 0 Composition of concentrate-containing tablet
  • Extract concentrate 50.0 22.2 1 1 .1

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Description

明 細 書 ルブロフサリン配糖体含有組成物 発明の分野
本発明は、 有効成分としてルブロフサリン配糖体を含み、 生体内ダルタチオン 濃度を増加させることが可能な経口摂取用組成物に関する。 従来の技術
グルタミン酸、 システィン、 グリシンからなるトリペプチドであるダルタチォ ンは、 細胞内に 1〜 1 OmMと高濃度含有される多機能性の生体成分である。 ダル 夕チオンはそれ自体が抗酸化活性を有しているほか、 ダルタチオンペルォキシダ ーゼ （glutathione peroxidase) の基質として過酸化水素や過酸化脂質の消去に 重要な役割を果たし、 生体異物代謝酵素の一つであるダルタチオン- S-トランス フェラーゼ （glutathione S- transferase) の基質として解毒代謝に関わってい る。 また、 生体内で酸化されたァスコルビン酸の再活性化 （還元） のためにダル タチオンデヒドロゲナーゼ (glutathione dehydrogenase) の基質としても利用 されている。 さらに、 近年、 細胞内の酸化還元 （レドックス） 状態により生体シ グナル伝達が変動することが明らかにされつつあり、 高濃度に存在するダルタチ オンが細胞内レドックス ·バッファ一としての役割を演じていることも示唆され ている（これに関わる総説： Ann. Rev. Biochem. 52, 711, 1983, Curr. Top. Cell Regul. 36, 1, 2000, Curr. Top.' Cell Regul. 36, 151, 2000)。
現在、 社会生活の急激な変化や高齢化が進む中、 糖尿病などに代表される生活 習慣病およびその前駆的な状態やパーキンソン病、 アルツハイマー病などの脳疾 患の増加が危惧されている。 これらの病態に生体内の酸化ストレス （oxidative stress) が深く関わっていることが明らかにされており、 これを評価する指標と して組織内ダルタチオン濃度低下の度合を測定することがよくなされている。 こ のように、 酸化ストレスに起因する多くの疾患において、 また加齢に伴う老化に おいても、 組織内/細胞内のダルタチオン · レベルの低下が認められることから、 生体内のダルタチオン濃度を高めることが予防的に有意義であると考えられる
(これに関わる総説： Ann. Pharmaco ther . 29, 1263, 1995, Al t . Med. Rev. 2, 1 55, 1997, Free Rad. B i o l . Med. 28, 1405, 2000, Prog. Neurob i o l . 62, 649, 2000)。 ' 生体内ダル夕チオン · レベルの増加を図る方法として、 ダルタチオンを経口摂 取することが容易に考えられるが、 消化管内や肝臓においてダル夕チオン分解酵 素 （t r anspept i das e) により速やかに分解されてしまうことや、 高用量のダル夕 チオンを摂取しても血中ダル夕チオン濃度の増加が認められないことなどから、 経口摂取したダルタチオンが直接、 生体組織内のダルタチオン増加には寄与しな いことが知られている（Eur. J . Cl i n. Pharmaco l . 43, 667， 1 992)。
このように、 ダルタチオンそのものを投与しても血中半減期が数分と短く組織 内ダル夕チオン増加に有効でないことが指摘されていることを受けて、 これを解 決する試みが医薬品開発を目的として行われている。
すなわち、 W094/ 1 2527には r - L -ピロダル夕ミル- L システィンのァシル誘導 体が内因性ダル夕チオンの生合成を促進する化合物として開示されており、 この 化合物が、 酸化的な組織障害、 とくに過剰なフリー ' ラジカルによる障害の関わ る病的状態のようなダルタチオンの低下 ·欠乏によって起こる様々な疾患の治療 に有効である旨の開示がある。 ここで述べられている疾患の例としては、 アルコ ール多飲、 生体異物、 放射線障害、 肝疾患によって起こる細胞内の酸化状態、 医 薬やその他の化合物による中毒、 重金属による中毒、 脳の生理学的な加齢 （例え ば、 記憶および学習能力の喪失や、 生体酸化物質に対する防御機構の変化に伴う ダルタチオン濃度の減少に起因した脳の衰退であるパーキンソン病） 、 ならびに、 急性および慢性の神経疾患 （急性の病状としては、 急性の虚血状態としての大脳 の発作、 低血糖症およびてんかん発作などを、 慢性の病状として筋萎縮性側索硬 化症、 アルツハイマー症、 ハンチントン舞踏病などを挙げることができる） 、 免 疫機構の機能異常、 とくにガンに対する免疫能低下、 不妊症、 とくに雄性不妊が 挙げられている。 さらに、 上記の化合物が、 フリー ' ラジカルの主たる原因とな る臓器の虚血 ·再灌流障害にも適すると開示されている。
また、 特開平 1 -26516には、 ァ- L -ダルタミル - L- ダルタチオン濃度を上昇させる化合物として白内障、 肝疾患および腎疾患をはじ めとする各疾患の治療および予防に有効であると開示されている。
さらに、 S-低級脂肪酸ダルタチオン誘導体が抗炎症、 抗アレルギー、 肝障害抑 制剤 （W091/12262、 091 / 16337) 、 糖含有ダル夕チオン誘導体が肝臓保護剤 (特開平 9- 25292) として開示されているなど組織ダル夕チオンを増加させるこ とにより広汎な疾患に対する治療および予防に有効であることが示されている。 ダルタチオン ·エステル誘導体については、 以下に列記するような組織 細胞 障害に対し防御的な効果を示す知見が報告されている。 すなわち、 ブチォニンス ルフォキシミン誘発白内障 （Pro. Natl. Acad. Sci. 86, 8727, 1988) 、 ァセト ァミノフェン誘発肝障害 （Biochem. Pharmacol. 39, 1877, 1990) 、 抗がん剤 (シスプラチンやアルキル化剤） による障害 （FASEB J. 4, 3251, 1990、 Cancer 62, 1275, 1988) 、 紫外線 UVBによる細胞障害 (Biol. Pharm. Bull. 18, 1219, 1995) 、 t -プチルヒドロペルォキシド誘発胃細胞障害 （Eur. J. Pharmacol. 351, 363, 1998) 、 肝臓虚血再灌流障害 （J. Surg. Res. 86, 2, 1999) など。 また、 システィンのプロドラッグであり組織内ダルタチオン濃度を増加させる L- 2-ォキ ソチアゾリジン- 4-カルボン酸についての近年の知見として、 セルレイン誘発塍 炎 （Gastroenterology 112, 1681， 1997) や冠動脈症患者の血管内皮機能 0. Clin. Invest. 101， 1408, 1998) の改善、 エンドトキシン誘発心機能不全の予 防 (Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158， 1109， 1998) 、 慢性アルコール肝障 害の抑制 （Hepatology 31, 391, 2000 ) 、 脊髄外傷に伴う二次障害の軽減 (FASEB J. 15, 243, 2001) などを挙げることができる。
ただし、 このような治療を主たる目的とする試みは医薬的なものであり、 緊急 を要する、 あるいは重篤な場合の対処法である。 生活の質 （Q0L) の向上を目指 した日常的な健康管理の観点からみれば、 ダルタチオンが 「生体自らが合成して まかなう」 生体物質であるという特性に即し、 低レベルとなった組織内ダル夕チ オンの上昇をはかるような試みが待たれている。 発明の概要
本発明は、 ダル夕チオン生合成に用いられる前駆体アミノ酸の供給法とは別の 方法または併用する方法として、 細胞内におけるダルタチオン合成能を増加させ るという観点から、 前駆体アミノ酸以外の有効成分を添加した、 生体内 （組織内、 細胞内） のグルタチオン · レベルを高く維持するために、 細胞内でのダル夕チォ ン生合成を促進させることができる、 経口摂取用の組成物を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ルブロフサリン配糖体によりヒト肝細胞由来 HepG2細胞内のダル夕チ オン濃度が経時的に増加することをシリビニンとの比較で示すグラフである。 図 2は、 ルブロフサリン配糖体によりヒト肝細胞由来 HepG2細胞内のダル夕チ オン濃度が用量依存的に増加することを 3 -ナフトフラボン、 シリビニンとの比 較で示すグラフである。
図 3は、 ルブロフサリン配糖体により t -プチルヒドロペルォキシドに対するヒ ト肝細胞由来 HepG2細胞の死滅の防御効果を陽性対照として用いた 3ナフトフラ ボンとの比較で示すグラフである。
図 4は、 ルブロフサリン配糖体とダル夕チオン前駆アミノ酸であるシスチンが 相乗的にヒト肝細胞由来 HepG2細胞内のダル夕チオン濃度の増加に寄与すること を示すグラフである。
図 5は、 ルブロフサリン配糖体含有濃縮物の経口投与が、 拘束ストレスによる 肝臓組織内ダルタチオン · レベルの低下および脂質過酸化 （TBARS値） の上昇に 対し抑制的に作用することを示すグラフである。
A： 肝臓ダル夕チオン含量；
B ： 肝臓 T B A R S値。
図 6は、 ルブロフサリン配糖体含有濃縮物の経口投与が、 拘束ストレスによる 脳組織内ダル夕チオン · レベルの低下および脂質過酸化 （TBARS値） の上昇に対 し抑制的に作用することを示すグラフである。
A： 脳組織ダルタチオン含量；
B ： 脳組織 T B A R S値。 発明の詳細な説明 本発明者は、 上記目的に適う細胞内におけるダル夕チオン合成能を増加させる 有効成分の探索を広く食経験を有する素材を用いて行い、 ケッメイシ抽出物に有 効成分が存在することを見出し、 この有効成分がルブロフサリン配糖体であるこ とを特定した。 細胞内のダルタチオン濃度を増加させるものとして、 合成化合物 である /3-ナフトフラボン （J. Biol. Chem. (1998) 273、 14683) などや天然物 由来の化合物であるシリマリン （Planta Med. 55, 420, 1989) 、 シァノヒドロ キシブテン （Toxicol. Appl. Pharmacol/ 123, 257, 1993) 、 アポシニン （FEBS Lett. 443， 235, 1999) などがすでに知られているが、 ルブロフサリン配糖体の 細胞内のダルタチオン濃度を増加させる作用についてはこれまで知られていない。 なお、 ケッメイシはマメ科に属する和名工ビスグサ （Cassia obtusifolia) の 種子であり、 焙煎したものが昔から煎じて飲用されている。 『中薬大辞典』 （上 海科学技術出版社 小学館編） によれば、 ケッメイシには 「肝を清める、 目を明 らかにする、 水を利す、 便を通す、 の効能がある」 として、 とりわけ 「青盲、 目 淫膚、 赤白膜、 目の充血と痛み、 涙が出て止まらないものを治し、 長く服用すれ ば精光 （眼光） を益す」 （神農本草経） などの経典を引用して目に有効な生薬で あることを紹介しており、 『中医臨床のための中薬学』 （医歯薬出版） のケッメ イシの項にも 「眼科常用の薬物」 と称されるとあるが、 目におけるケッメイシの 効能のメカニズムについては明らかではなかった。 他方、 水晶体をはじめ眼組織 にダルタチオンが著量蓄積され機能していることが知られているとともに、 ダル 夕チオンは医薬品として、 初期老人性白内障、 角膜潰瘍、 角膜上皮剥離、角膜炎 に対する眼科用薬 （白内障治療薬） に適用されている （ 『薬剤師のための常用医 薬品情報集』 （廣川書店） ） 。 以上の知見を本発明の知見と組み合わせると、 ケ ッメイシの医薬としての効能のメカニズムは、 含有されているルブロフサリン配 糖体が眼組織の細胞内ダルタチオン濃度を増加させることに基づいて、 目の機能 を保持 ·改善させ有効に働くものと思われる。 このようなケッメイシの効果に関 しては、 そのメカニズムも有効成分の実体が何であるかも本発明前には知られて いなかった。
本発明は、 有効成分としてルブロフサリン配糖体を添加した、 生体内 （組織内、 細胞内） のダル夕チオン ' レベルを高く維持するための、 ルブロフサリン配糖体 を含有する経口摂取用組成物である。
ルプロフサリン配糖体は、 次式：
Figure imgf000007_0001
(式中、 Aは糖成分である）
で表される。 糖成分 Aの例として、 ゲンチオビオース、 グルコース等があげられ る。 好ましい糖成分はゲンチオビオースであり、 その場合のルブロフサリン配糖 体はルブロフサリンゲンチオビォサイドである。
ルブロフサリン配糖体は、 天然物からの抽出物中に含有され、 原料となる天然 物の例として、 ケッメイシ（Cass i a ob tus i fo l i a)、 カツシァ属に属するハブソゥ (Cass i a occ i dent al i s; 等かめる。
ルブロフサリン配糖体は、 純粋な物質として本発明の組成物の有効成分として もよく、 天然物からの抽出物の状態で組成物の有効成分としてもよい。 原料とな る天然物の好ましいものは、 ケッメイシであるが、 ルブロフサリン配糖体を含有 する素材であればケッメイシに限定されず、 ハブソゥ、 その他も同様に利用する ことができる。
本発明の目的で、 ルブロフサリン配糖体をケッメイシ自体として摂取するとす れば、 毎日 5-30gを煎じるなどして服用することが必要となるが、 現在のライ フ ·スタイルなどを考えてみると継続することが容易ではなく、 また、 特有のに おいやエダ味、 苦みなどのため敬遠する向きも多いと思われる。 近年、 市販され ている配合茶にも香り付け、 味付け等の目的でハブ茶として焙煎したケッメイシ が配合されているものもあるが、 これらに含まれるルブロフサリン配糖体含有量 は著しく低く、 本発明の目的に適うものとは言い難い。 なぜなら、 ケッメイシ乾 燥種子を焙煎処理すると、 ルブロフサリン配糖体の含有量が著しく低下するから である （実施例 3参照） 。
したがって、 ルブロフサリン配糖体を含有するケッメイシ乾燥種子などの素材 から抽出操作をはじめとする目的に即した処理を行い、 ルブロフサリン配糖体を 所定量含有する濃縮組成物を使用するとよい。
天然物原料からルブロフサリン配糖体を抽出するために用いられる溶媒は水あ るいは有機溶媒である。 有機溶媒の例としては、 エタノール、 メタノールなどの アルコール類、 酢酸ェチルなどのエステル類、 アセトンなどのケトン類、 メチル
5 ェチルエーテルなどのエーテル類などを用いることができる。 これらの水または 有機溶媒は 2種類以上組み合わせて使用してもよいが、 飲食物をめざす場合には 水あるいはェ夕ノール水溶液を用いるのが妥当である。
• . ケッメイシを原料.として本発明のルブロフサリン配糖体を含有する抽出濃縮物 . を調製する一例を示すと次のとおりである。 この場合、 濃縮物中にルブロフサリ0 . ン配糖体ができるだけ多くの割合で含有されるような方法および条件を採用すベ きである。 例えば、 濃縮物 （乾燥固形物） 当たりルプロフサリン配糖体を 1〜30 重量％の割合で含有する濃縮物であるのが望ましい。 ケッメイシを直接、 または 抽出効率を高める目的で通常の破悴処理を加えた後に溶媒を加え、 例えば約 30分 〜4時間の加温下あるいは 1〜3日の室温下抽出を行い、 抽出液をろ過し、 粗抽5 出ろ液を得る。 その際の加温の温度は、 50°C〜95°Cであることが好ましい。 抽出 のため添加する溶媒量は原材料に対して、 例えば 3〜 1 0倍量が用いられる。 抽出により得られるろ液中のルブロフサリン配糖体の含有量および純度は、 70 %エタノール抽出では 2. 2 %、 熱抽出では 1 . 1 % (表 1参照） 程度であるが、 さ らに純度を高めることが望ましい場合がある。 この目的のために、 例えば工業的0 に汎用されているダイヤイオン HP 20 (三菱化学社製） などの吸着用樹脂や活性炭 を利用することができる。 水でルブロフサリン配糖体の抽出を行った場合は、 抽 出ろ液を直接樹脂に、 また、 エタノール水溶液を溶媒として用いて抽出を行った 場合は減圧濃縮操作.などによりエタノール濃度を下げた後の抽出液を、 樹脂と接 • 触させる。 エタノール濃度の低下は、 ルブロフサリン配糖体を十分に吸着させる5 ために好ましい。 エタノール濃度は好ましくは 2 0 %以下にまで低下させる。
樹脂からの有効成分の溶出は、 それぞれの目的に応じた成分含有濃度 （重 量％) 設定を行い、 それに適う方法を選択できる。 例えば、 エタノール溶液を用 いてステップワイズや濃度勾配などの方法で溶出することができる。 ステップヮ ィズ溶出においては、 非限定的例示として、 20 %エタノール洗浄 Z80 %エタノー ル溶出、 30 %エタノール洗浄 Z60 %エタノール溶出などの組み合せが可能である このようにして得られた溶出液は通常の減圧濃縮、 凍結乾燥などの方法により 濃縮あるいは乾燥粉体化することができる。 また、 乾燥粉体化が容易でない濃縮 物の場合には、 常用のデキストリン、 高分子澱粉加水分解物、 あるいは高分子べ プチドなどを賦形剤として用いて乾燥粉体化物を製造することができる。
さらに高純度のルブロフサリン配糖体 （例えば、 高純度のルブロフサリンゲン チオビォサイド） を調製するには、 上記の抽出濃縮物を用いてカラムクロマトグ ラフィ一、 高速液体クロマトグラフィー、 液々交流分配クロマトグラフィー等の 常法に従って処理することにより目的とする純度のものを得ることができる。 た とえば、 逆相系クロマトグラフィーを用い、 溶媒系として 0. 1%トリフルォロ酢酸 含有ァセトニトリル水溶液の 10%- 80% (ァセトニトリル濃度） の濃度勾配溶出に より、 分離度のよいピークとして再現性よく有効成分が溶出されるので、 これを 分取すればほぼ単一成分としてルブロフサリン配糖体 （例えば、 ルブロフサリン ゲンチオビォサイド） を得ることができる。
上記の抽出 ·精製過程でルブロフサリンの純度や収率をモニタ一するには、 実 施例 2に記載した測定方法が使用出来る。
ルブロフサリン配糖体は、 後記表 1に示すとおり、 ケッメイシの生種子 l g当 たり 3 mg以上含まれる成分であり、 昔から常時、 決明子煎液ゃハブ茶として一日 に 5〜 3 0 g生種子相当を飲用されており、 経口摂取での実績もあり安全性が高 いと考えられる。 本発明のルブロフサリン配糖体の含有設定においてもこれらの 知見が反映されるべきである。 したがって、 本発明の組成物は、 有効成分である ルブロフサリン配糖体の配合量に実質的上限はないが、 好ましくは固形分当たり 0 . 5重量％以上ないし 3 0重量％、 より好ましくは、 1重量％以上ないし 1 5 重量％以下配合する。 '
ルブロフサ ·リン配糖体を、 純粋な物質として、 または天然原料からの濃縮物と して用いることにより、 簡便に有効量を摂取できる経口摂取用組成物を提供する ことができる。 ルブロフサリン配糖体は、 p H、 水分、 酸化、 光等に対する安定 性が十分高く、 幾分の苦みを呈する。 そのため、 本発明の経口摂取用組成物は、 目的に応じて飲食品、 調味料、 アルコール飲料、 機能食品、 医薬品等の種々の形 態にでき、 酸化ストレスにより引き起こされる細胞内/組織 ·臓器内のダル夕チ オン低下の緩和あるいはレベルの維持を図ることができる。 例えば、 酸化ストレ スに起因すると考えられている肝臓機能、 脳機能、 視覚機能、 免疫能などの保 持 ·改善や疲労倦怠の緩和、 解毒代謝の促進に伴う臓器障害の抑制や発癌リスク の低減化、 免疫機能の保持 ·活性化、 筋肉疲労回復、 肌のくすみ予防、 生活習慣 病予防、 喫煙障害予防、 A I D Sによる慢性疲労症候群の治療、 老化防止などの 効能がある。
組成物の具体的形態としては、 固形状、 半流動状、 流動状などを挙げることが 出来る。 固形状食品としては、 ビスケット状、 シート状、 タブレットやカプセル などの錠剤、 顆粒粉末などの形態の一般食品および健康食品があげられる。 半流 動状食品としては、 ペースト状、 ゼリー状、 ゲル状などの、 また、 流動状食品と しては、 ジュース、 清涼飲料、 茶、 ドリンク剤などの形態の一般食品および健康 食品があげられる。
本発明の組成物は、 細胞内のダル夕チオン濃度を増加させるという機能を奏す る量のルブロフサリン配糖体を含有していて、 経口摂取して安全であること以外 は、 特別の制限はない。
さらに、 上述の各種飲食物形態のいずれにおいても、 ルブロフサリン配糖体が 単一の有効成分として含まれていてもよく、 あるいはまた、 細胞内ダル夕チオン 生合成のための前駆体、 とりわけ栄養学的に律速となっているアミノ酸である L - システィン ZL-シスチン （ただし、 著量の遊離 L-システィンを経口投与すると毒 性を示すことが知られている、 Am. J . C l i n. Nu t r. 50, 1401 , 1989) 、 L-メチ ォニンを配合させることにより、 ダル夕チオン増加機能の相乗作用をめざすこと もできる。 相乗作用とは、 ルブロフサリン配糖体のみを含有する組成物の細胞内 ダル夕チオン濃度増加作用と、 前駆体のみを含有する組成物の当該作用との合計 に比べ、 両者を同時に含有する組成物の当該作用の方が大きいことを意味する。 前駆体の例は、 L -システィン ZL-シスチン、 L-メチォニン含有量の高い卵白や卵 膜、 ミルク ·ホエー （乳精） 等の動物性、 大豆などの植物性および酵母等に由来 する蛋白質あるいはそれらから加工調製されたペプチド、 また、 食品添加物とし て認可されている L-シスチン、 L-メチォ二ンの添加などをあげることができる。 これらの前駆体もしくはそれを高含量で含む食品は、 L一システィン含有量とし て固形物あたり約 0. 1〜 10重量％組成物中に配合することが好ましい。
また、 グルタチオンの細胞内濃度を維持させ有効に機能させる目的からは、 グ ルタチオン前駆体による生合成の促進とともに、 ダルタチオン消費の低減を図る 機能を有するビタミン C (ァスコルビン酸） を同時補給することが好ましいと考 えられる。
経口摂取用組成物は、 既に上述したような生活習慣に関わる身体の不具合の緩 和に有効である。 使用法としては、 食事前後、 食中、 食間いずれでもよいが、 と りわけ食間が望ましく、 使用頻度としては、 毎日 3回摂取するのが望ましいがこ れに限定されるものではなく、 随時摂取でも構わない。 実施例 1 0に示したタブ レツトはこのような設定に則って設計してある。 本経口摂取用組成物の使用を特 に勧める人としては、 眼の充血や視力低下の気になる人、 加齢にともない老人性 白内障が気になる人、 喫煙障害が気になる人、 喫煙、 太陽光を含む紫外線、 加齢 などにともなう肌あれ、 シヮ、 シミなどが気になる人などをあげることができる。 実施例 1 ：有効成分の特定
ケッメイシの 70 % ( v Z v ) エタノ一ル抽出物をダイヤイオン HP20吸着カラム にのせ、 30 %エタノール溶液洗浄後に 70 %エタノール溶液で溶出させ得られた抽 出濃縮物を用い、 逆相系高速液体クロマトグラフィ一によりさらに精製を行い、 本発明の有効成分の特定を行った。
逆相系高速液体クロマトグラフィーは、 3次元モニター付きの装置で Deve l os i l ODS- HG5カラム （ 6 X 100mm, 野村化学製） を用い、 上記の抽出濃縮物 （89 mg/ml水溶液） を 10 1 インジェクトさせ、 0. 1 %トリフルォロ酢酸含有の 25 - 40 %ァセトニトリル直線的濃度勾配 （12分間） 条件下で溶出を行い、 15秒間隔で 分取した分画物をそれぞれ減圧乾固させた後に、 20 ^ 1のジメチルスルフォキシ ド （DMS0) に溶解させた。
各分画物 DMS0溶液の 6 ^ 1を 194 1の RPMI 1640 ( 10 %血清添加） 培地で希釈し た後に、 さらに RPMI 1 640培地で 2倍希釈 4段階の希釈サンプルを調製し細胞内ダル 夕チオン増加活性を測定した。 細胞内ダル夕チオン増加活性は、 ヒト肝細胞由来の HepG2細胞を用い測定した。 さらに具体的には、 96穴マイクロプレ一トに RPMI1640培地にて培養した HepG2細 胞の 2.5x 104細胞 （100 1) を加え細胞を壁に定着させた後に、 上記のサン プルの各 25 zl を加え C02インキュベータ一にて 48時間の培養を行った。 培養後、 培養液を除去し、 リン酸緩衝生理食塩水 （PBS) で一回洗浄した後に、 25^ 1 の 0.25mMモノクロロバィマン （monochlorobimane) 含有 PBS溶液を添加し C02インキ ュベータ一 （3 c) に 45分間放置し、 室温に戻した後に 75^1 の蒸留水を添加し 均一化させた。 モノクロ口バイマンとダルタチオンの反応により生成する蛍光物 質の蛍光強度を 355nmZ460nmの条件で測定し、 細胞内ダルタチオン含量の変動を みた。 これにより、 用量依存性が認められ、 かつ強い細胞内ダルタチオン増加活 性を示す画分が見出された。
この画分を再度、 上記と同じ条件で逆相系高速液体クロマトグラフィーに供し たところほぼ単一のピークであることが確認できたので、 構造を特定する目的で 核磁気共鳴分析 （プロトン-醒 R) および質量分析 （FAB - MS) を行った結果、 質 量分析で（¾1+11)+が597.2でぁることなどから本発明の有効成分の本体が1(^&1^1^ & Takido (1988) Chem. Pharm. Bull. 36, 3980および Hatanakaら（1999) ibid. 47, 1121に記載のルブロフサリン 6-〇- ;3-ゲンチオビォサイド （rubrofusarin 6-0-i3-gentiobioside) であることが明らかとなった。 実施例 2 ：ルブ口フサリン配糖体の定量法
抽出物をはじめ各種グレードのサンプル中に含有するルブロフサリン配糖体を 簡便に定量する必要がある。 実施例 1に示した方法で精製 ·単離したルブロフサ リン 6-〇-]3-ゲンチオビォサイド標品について、 メタノール条件におけるモル 吸光係数 (UVAmax nm (log ε)= 276 (4.72) (Kitanaka S Takido (1988) Chem. Pharm. Bull. 36, 3980) から重量を算出した標品を調製し、 これの一定量を実 施例 1に示した逆相系高速液体クロマトグラフィーに供し、 280nmの吸収ピーク の高さを測定したところ、 定量性が確認できた。 従って、 この方法によりルブロ フサリン配糖体含量をクロマトグラフィー操作により微量のサンプルにおいても 簡便に測定できる。 実施例 3 ：焙煎に伴うルブロフサリン配糖体含量の低下
生種子および焙煎種子の破碎処理したものにそれぞれ 1 0倍容の 70% (v/v) エタ ノールを加え 2日間 （室温） 抽出、 または破砕種子に 20倍容の水を加え、 95°C、 30分加温抽出した後に、 フィル夕一ろ過したろ液を調製し、 これに含まれる固形 分重量および実施例 2に示した方法にしたがいルブロフサリン配糖体含量を測定 した。 結果を表 1にまとめる。 表 1
生種子
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
この表から、 焙煎することにより、 ルブロフサリン配糖体の含量が著しく低下 することが明らかになった。 抽出総量は生種子および焙煎種子いずれにおいても
70% (v/v) エタノール抽出よりも熱水抽出の方が高いが、 これは粘性の高い多糖 などに起因しているものと考えられ、 ルブロフサリン配糖体抽出量は比率的にも 絶対量的にも 70% (v/v) エタノール抽出の方が優れている。 なお、 焙煎種子抽出 物は茶飲料に適う芳ばしい香りを有するのに対して、 生種子抽出物は青臭さ、 生 臭さが認められた。 実施例 4 ：濃縮物の製造
非焙煎の破碎処理したケッメイシ 1 00gに 1 . 0Lの 70 % (v/v) エタノール溶液を 加え、 室温下で 1 日抽出し、 フィルターろ過によりろ液を得た （乾燥重量： 14.5g、 ルブロフサリン配糖体 3.0重量％) 。 ろ液を減圧濃縮し、 最終 500mlの 20% (v/v) エタノール溶解液とした後に、 ダイヤイオン ΗΠ0吸着カラム （100m 1 ) にのせ、 100mlの 20%エタノール溶液で非吸着成分を洗浄した （非吸着物の 乾燥重量： 10.8g) 。 1000mlの 30% (v/v) エタノール溶液、 ついで各 100mlの 40%、 50%、 60%、 70%, 80%、 100% (v/v) エタノール溶液の順にステップヮ ィズに溶出させたときの乾燥重量およびルブロフサリン配糖体の重量％を表 2に まとめる。 表 2
Figure imgf000014_0001
この条件で 30% (v/v) エタノール溶液で充分に洗浄した後に、 50% (v/v) ェ 夕ノール溶液で溶出させることにより、 ケッメイシ 100gから乾燥重量 0.89g、 ル プロフサリン配糖体含有量 133mg (14.9重量％、 回収率 30.5%) の抽出濃縮物が 得られた。 実施例 5 ：細胞内ダルタチオン増加効果の経時的誘導性
ヒト肝細胞由来の HepG2細胞を用いて、 細胞内ダルタチオン濃度に与えるルブ 口フサリン配糖体の経時的誘導性をみた。 操作法は実施例 1に準ずる。 すなわち. HepG2細胞をマイクロプレートの各 wellあたり 2.5x 104細胞 （100 1) を分注 し定着させた後、 RPMI1640培地に所定濃度に希釈した評価標品を 25^1 添加し、 さらに 0時間から 6、 12、 24、 48時間まで経時的に培養を行った。 評価標品とし ては、 実施例 4の方法にしたがって調製した本発明の濃縮物 （ルブ口フサリンゲ ンチオビォサイド 10.2% (w/w)含有物） 、 および比較の目的で、 ラットで組織内 グルタチオン . レベルの増加が報告されているシリマリン （Planta Med. 55, 420, 1-989) の主要活性成分であるシリビニン (シグマ社製) を用い、 細胞内グ ル夕チオン濃度の推移をみた （図 1) 。 この図では、 全てのポイントにおいて無 添加対照を 100%とした相対表示で結果を示している。 シリビニンとの濃度比較 を明瞭にするため、 濃縮物に含まれるルブロフサリン配糖体 (ルブ口フサリンゲ ンチオビォサイド） の濃度で示してある （最終濃度： 1.25、 2.5, 5.0 M) 。 図 1から明らかなように、 本発明の濃縮物の添加 12時間後に顕著な細胞内ダル夕チ オン · レベルの増加が認められ、 用量依存的であった。 他方、 シリビニンは vitro細胞評価系では細胞毒性が強いためか、 添加 12時間後に一過的な弱いダル タチオン · レベルの増加が認められる結果となった。 実施例 6 ：細胞内ダルタチオン増加効果の用量依存性
ヒト肝細胞由来の HepG2細胞を用いて、 細胞内ダルタチオン濃度に与えるルプ 口フサリン配糖体の用量依存性をみた。 操作法は実施例 5に準ずる。 すなわち、 HepG2細胞をマイクロプレートの各 wellあたり 2.5x 104細胞 （100 1) を分注 し定着させたものに、 RPMI1640培地により所定濃度に 2倍希釈系列化した濃縮物 を 25 1 添加 （活性成分であるルブロフサリンゲンチオビォサイド換算で最終濃 度 0〜20 xM ) し、 さらに 48時間培養を行った後に、 細胞内ダルタチオン濃度 をサンプル無添加、 および比較化合物としての] 3_ナフトフラボン （ナカライ社 製） 、 シリビニン （シグマ社製） との相対比較でみた結果を図 2に示す。 なお、 —ナフトフラボンは、 本実施例と同様の細胞レベルにおける解析から、 ダル夕 チオン生合成系の律速酵素であるァ—ダルタミルシスティン ·シンセターゼ （ァ -glutamylcysteine synthetase) 活性および細胞内グルタチオン濃度を用量依存 的に増加させることが知られている化合物である （J. Biol. Chem. 272, 7445, 1997) 。 これから明らかなように、 本有効成分であるルブロフサリン配糖体のグ ルタチオン増加活性は /3-ナフトフラボンとほぼ同等であるが、 高濃度域におけ る細胞毒性が弱いことが示された。 シリビニンは細胞毒性の影響でダル夕チオン 増加活性は認められなかった。
'
実施例 7 ：過酸化化合物に対する防御作用
ヒト肝細胞由来の HepG2細胞を用いて、 ルブロフサリン配糖体を与えることに より過酸化化合物に対して耐性を示すことをみた。 操作法は実施例 5に準ずる。 すなわち、 HepG2細胞をマイクロプレートの各 wellあたり 2.5x 104細胞 （100 n 1) を分注し定着させた後に、 RPMI1640培地で濃縮物のルブロフサリンゲンチ オビォサイド換算で最終濃度が 10 / M となるようにした希釈した濃縮物を 25 1 添加し、 さらに 48時間培養を行った後に、 最終的に 0〜1視となるように過酸 化化合物である t-ブチルヒドロペルォキシド （t-butyl hydroperoxide： t-BHP) を添加し、 3時間後の生存率をサンプル無添加、 および比較化合物としての j8- ナフトフラボン （6 ) 、 シリビニン （IO M ) との相対比較でみた結果を図 3に示す。 細胞の生存率は WST- 1染色法を用いて、 t- BHP無添加対照を 100%とし て算出した。 図 3に示すように、 t- BHPに対する防御作用は /3-ナフトフラボンに 比べ幾分弱いものの、 本有効成分であるルブロフサリン配糖体がダル夕チオンべ ルォキシダ一ゼの基質であるダルタチオンを増加させることにより、 t_プチルヒ ドロペルォキシドをモデルとした生体内過酸化化合物の細胞毒性を軽減させるこ とが示された。 実施例 8 ：前駆体との相乗作用
ヒト肝細胞由来の HepG2細胞を用いて、 細胞内ダルタチオン増加活性を有する ルブロフサリン配糖体とダルタチオン生合成のための前駆体との相乗作用をみた。 操作法は実施例 1に準ずるが、 RPMI1640培地には前駆体である L-シスチンが充分 量含有しているために本実施例の目的に即さないことから、 L-シスチンを含まな い D-MEM (10%血清添加） 培地を調製して用いた。 すなわち、 HepG2細胞をマイク 口プレートの各 wellあたり 2.5x 104細胞 (100 a 1) を分注し定着させた後に、 上記の L-シスチンを含まない D- MEM 培地 （100 1) に培地交換させた。 L-シス チンを含まない D- MEM培地でルブロフサリン配糖体最終濃度が IO M となるよう にした希釈した濃縮物および所定のシスチン溶液を調製し、 それぞれ 25 zl ずつ 添加し 40時間培養を継続した。 その後、 細胞内ダル夕チオン濃度を測定した。 結 果を図 4に示すように、 L-シスチンの添加濃度に従いダル夕チオンの細胞内濃度 は増加するが、 前駆体である L -シスチンを含有しない条件での本発明濃縮物によ るダルタチオン濃度の増加は認められなかった。 しかし、 ダル夕チオン前駆体で ある L-シスチンが存在する条件では、 L -シスチン単独以上の増加がみられ、 これ はダル夕チオン増加活性を有するルブロフサリン配糖体とダル夕チオン前駆体を 併用すると相乗的に細胞内ダルタチオン濃度が増加することを示している。 実施例 9 ：拘束ストレス Z臓器ダルタチオンレベルの抑制
拘束ストレスに伴う臓器内のダルタチオンレベルの低下に対するルブロフサリ ン配糖体の保護 ' 改善作用についてみた。 被検動物としてマウス C57BL/ 6 (雄） 6週齢、 1群 6匹を用い、 あらかじめ上記の濃縮物の 0.5% tween80懸濁液 を 1日 1回、 200mgZkg (ルブ口フサリン配糖体として 12mg/kg相当） を 8日間、 強制経口投与を行った後に、 拘束ネットに 8時間固定させ拘束ストレスを与えた c 非拘束対照群 （n=6) 、 拘束対照群 （n=6) いずれも 0.5% tween80水溶液を同じ条 件で強制経口投与し、 拘束対照群は同様の拘束ストレスを与えた。 拘束開放直後 に肝臓および小脳を含まない脳組織を摘出し、 各臓器のダルタチオン含量および 過酸化脂質 （チォバルビツール酸反応物： TBARS) 含量を測定した。 さらに具体 的には、 摘出し一 80°Cにて保存した各臓器の重量あたり 9 ( w/v )倍量の氷冷ホ モジエネ一シヨン溶液 （154 mM KC1, 5 mM DTPA, 10 mM KPi buffer, pH 6.8 ) を加えフィスコトロン （日音医理科器械製作所製） を用いてホモジェネートを作 製し、 Ohkawa et al. Anal. Biochem. 95. 351-358, 1979の方法に準じて、 TBARS値を算出した。 また、 各ホモジェネートに等量の酸性緩衝液 （40 mM HC1, 10 mM DTPA, 20 mM ascorbic acid, 10 % TCA) を添加し、 遠心処理により除蛋 白したものを用い、 Senft et al. Anal. Biochem. 280, 80-86, 2000の方法に準 じてダルタチオン含量を算出した。 結果を図 5、 6に示すように、 拘束ストレスを与えると、 肝臓および脳組織いず れもグルタチオン含量が低下し、 同時に過酸化脂質量を示す TBARS値が上昇する。 これに対して、 ルブロフサリン配糖体を含有する本発明の組成物をあらかじめ投 与することにより、 肝臓においては改善する傾向が、 また脳組織においては有意 に （P〈0. 05) に改善することがわかった。 実施例 1 0 ：濃縮物含有タブレツ卜の組成
表 3に示した配合物を均一に混合した後に、 打錠機を用い圧縮成型し 1錠 300 mgの錠剤とした。 抽出濃縮物は実施例 4の方法に従いルブロフサリン配糖体 1 0重 量％として調製したものを用い、 ホェ一ペプチドは DMV JAPAN社製の LE80GFを用 いた。 1日の摂取目安量は 300mg錠で 6錠が好ましく、 この場合に夕ブレット 1、 2、 3からルブロフサリン配糖体をそれぞれ、 90mg、 40mg、 20mg、 また L _シス ティン/ L —メチォニンをそれぞれ 0mg/0mg、 20mg/1 3mg、 32mg/45nig補給するこ とができる。 表 3 タブレット 1 タブレツ卜 2 タブレット 3
成分 配合量(％)配合量(％) 配合量(％)
抽出濃縮物 50.0 22.2 1 1 .1
ホェ一ペプチド 34.7 55.6
L—メチォニン 1 .4
ビタミン C 5.6 1 1 .1
セルロース 6.0 20.4 1 1.6
L根 19.0 2.1
返兀麦牙糖 1 6.0
コーンスターチ 7.0 1 3.0 7.3
蔗糖脂肪酸エステ 2.0 2.0 2.0
ル 実施例 1 1 ：濃縮物含有飲料の組成
実施例 4の方法に従い製造したルブロフサリン配糖体 10重量％含有抽出濃縮物 2.5g、 ホエーペプチド（DMV, JAPAN 社製 WE80B) 17.7g、 ァスコルビン酸ナトリウ ム 1.2g、 ショ糖 26.5g、 クェン酸 2.1g、 溶解水 950gの配合割合の原料を溶解し、 120mlずつ褐色瓶に分注した後にレトルト殺菌（121°C、 15分）し飲料を作成した。 この飲料 1本から 3 Omgのルブロフサリン配糖体、 34mgの L一システィンを補給 できる。 発明の効果
以上のように、 ルブロフサリン配糖体を含有する本発明の濃縮物を摂取するこ とにより、 細胞内/組織内のダルタチオン濃度を維持 ·増加させることができ、 これにより生活習慣病やその前駆状態や脳の機能低下などに深く関わっている酸 化ストレスを防御あるいは緩和することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ルブロフサリン配糖体の少なくとも一種を細胞内ダル夕チオンを増加さ せる有効量で含有する、 細胞内ダルタチオン濃度を維持または増加させるための 経口組成物。
2 . ルブロフサリン配糖体が、 ルブロフサリン配糖体を含有する植物から抽 出されたものである、 請求項 1の組成物。
3 . ルブロフサリン配糖体を含有する植物がケッメイシまたはハブソゥであ る、 請求項 2の組成物。
4 . ルブロフサリン配糖体の全部または主成分が、 ルブロフサリンゲンチォ ピオサイドである、 請求項 1〜 3のいずれか 1項の組成物。
5 . ルブロフサリン配糖体の含有量が、 固形分当たり 0 . 5重量％以上かつ 3 0重量％以下である、 請求項 1〜4のいずれか 1項の組成物。
6 . ルブロフサリン配糖体含有飲食物である、 請求項 1〜5のいずれか 1項 の組成物。
7 . ルブロフサリン配糖体含有健康食品である、 請求項 1〜5のいずれか 1 項の組成物。
8 . ルブロフサリン配糖体含有医薬である、 請求項 1〜5のいずれか 1項の 組成物。
9 . 細胞内ダル夕チオン生合成の前駆体、 および場合によりビタミン C成分 も含有し、 細胞内ダルタチオン濃度を相乗作用的に増加させる、 請求項 1〜8の いずれか 1項の組成物。
1 0 . 細胞内グルタチオン生合成の前駆体が、 卵白、 卵膜、 乳清、 酵母蛋白 質、 大豆等の植物性蛋白質、 L一シスチン、 L—メチォニンからなる群から選択 きれる、 請求項 9の組成物。
1 1 . 細胞内ダルタチオン生合成をさらに補強するための前駆体を L一シス ティンあるいは L _メチォニン含有量として固形分あたり 0 . 1重量％以上かつ 1 0重量％以下含有する請求項 9あるいは請求項 1 0の組成物。
1 2 . 破碎したケッメイシあるいはハブソゥ種子を水あるいは 1 0〜 1 0 0 %有機溶媒で抽出した粗抽出物を、 吸着用樹脂に接触させ、 1 0〜 1 00%有 機溶媒で溶出して採取したものを有効成分とする、 細胞内ダル夕チオン濃度を維 持または増加させるための経口組成物。
1 3. 有機溶媒としてエタノールを用いて抽出及び溶出したものである請求 項 12の組成物。
14. ルブロフサリン配糖体を、 固形分当たり 0. 5重量％以上かつ 30重 量％以下含有する請求項 12あるいは 1 3の組成物。
1 5. ルブロフサリン配糖体がルブロフサリンゲンチオビォサイドである請 求項 14の組成物。
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