WO2003097874A1 - Verfahren zur parallelen gewinnung von rna und proteinen aus einer gewebeprobe - Google Patents

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WO2003097874A1
WO2003097874A1 PCT/EP2003/005131 EP0305131W WO03097874A1 WO 2003097874 A1 WO2003097874 A1 WO 2003097874A1 EP 0305131 W EP0305131 W EP 0305131W WO 03097874 A1 WO03097874 A1 WO 03097874A1
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rna
proteins
tissue
solution
rnalater
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PCT/EP2003/005131
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Thomas Buschmann
Steffen Heim
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Europroteome Ag
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention relates to a method for the parallel isolation of RNA and proteins from one and the same tissue sample using an immunological purification of epithelial cells from tumor and non-tumor tissue.
  • nucleic acid and protein-containing tissue samples are often taken and analyzed for analysis. This applies in particular to the diagnosis of tumors and other abnormalities in body cells.
  • diagnostic markers which, by means of comparative examinations of the genotype or phenotype of the tumor cells with normal tissue cells, enable indications of existing diseases.
  • the TNM system is widely used in clinical practice
  • TNM system is one
  • TMM pre-therapeutic clinical classification
  • pTNM postoperative histological classification
  • RNA which can be broken down very quickly by nucleases after taking a biological sample. Subsequent later RNA analyzes can therefore be falsified.
  • RNA stabilizing RNA Numerous methods for stabilizing RNA have been described.
  • salt solutions of high concentrations up to saturated solutions have recently become established as suitable preservatives for protecting RNA at temperatures above -20 ° C. (cf. US Pat. No. 6,204,375).
  • Ammonium sulfate is preferably used which- possibly leads to the formation of a protein / RNA complex, whereby the RNA is stabilized.
  • the invention was therefore based on the object of providing a method which allows parallel isolation of both proteins and RNA from only one tissue sample in such a quality that reliable biochemical and genetic analyzes for identifying the RNA and the proteins are possible.
  • the method should be able to be used reliably both for tumor tissue and for non-tumor tissue, in order in particular to be able to carry out comparative studies.
  • the task was solved by a method which ensures the immunological separation of the epithelial cells from the tissue samples while simultaneously stabilizing RNA and proteins, which enables the parallel extraction of RNA and proteins from one and the same tissue sample.
  • the method is characterized in that pieces of tissue (tumor tissue and normal tissue (mucosa)), e.g. tissue expanded from a human patient is stored immediately after the resection in a preparation solution which comprises RNAlater TM with a salt concentration of 40 to 100 g / 100 ml.
  • the RNAlater concentration is preferably 60-100 g / 100 ml, particularly preferably 70-80 g / 100 ml.
  • tissue samples are then mechanically disrupted, the washing solutions according to the invention also being RNAlater TM, preferably 50% RNAlater TM in PBS, include.
  • the epithelial cells are then immunologically separated using antibodies that bind specifically to surface proteins of the epithelial cells.
  • RNAlater TM Despite the high salt concentrations of RNAlater TM, this immunological separation is possible. It is known that high salt concentrations, e.g. high ammonium sulfate concentrations, for precipitation of proteins in solution in the form of a precipitate. Furthermore, it is known that the action of high external salt concentrations on cells leads to hypotension of the cell. Because of these effects and a stabilization of the RNA in the cell, a qualitatively and quantitatively satisfactory extraction of proteins from the cell was surprising.
  • high salt concentrations e.g. high ammonium sulfate concentrations
  • RNA and proteins can be extracted in parallel from one and the same sample in good quality with high accuracy and using conventional techniques.
  • the incubation time in the preparation solution should be at least 15 minutes, this applies both to tumor tissue and to non-tumor tissue. If the tissue pieces are larger than 3-4 mm, they are either shredded or incubated for a long time in RNAlater TM (preferably about 5 minutes longer per 1 mm additional diameter).
  • the method is applicable to all epithelial tissue types, e.g. Stomach, intestines, lungs, pancreas, chest etc.
  • RNAlater TM is a saline solution known to the person skilled in the art (company Ambion, Inc., US). It is highly concentrated Salt solutions (between 20 g / 100 ml and the saturation concentration) which protect the RNA against nucleases (cf. also US 20010026312 AI).
  • sulfates in particular are used, such as, for example, ammonium sulfate, ammonium bisulfate, cesium sulfate, cadmium sulfate, cesium iron (II) sulfate, chromium (III) sulfate, cobalt (II) sulfate, copper (II) sulfate, lithium sulfate, magnesium sulfate, manganese sulfate, Potassium sulfate, sodium sulfate or zinc sulfate.
  • RNAlater TM solution made from ammonium sulfate is particularly preferably used.
  • the immunological separation is preferably carried out using BerEP4 monoclonal or polyclonal antibodies which bind to expressed BerEP4 surface protein.
  • Such antibodies are also known to the person skilled in the art.
  • a mAb is used which is directed against the surface protein BerEP4 and which is described in U. Latza, J. Clin. Pathol. 43, 213 (1990).
  • magnetobead separation takes place, ie, starting from magnetic particles of a defined size, called magnetobeads or dynabeads (after the Norwegian company Dynal), the epithelial cells are magnetically collected and then washed.
  • magnetobeads have a superparamagnetic core and are encased in a polystyrene coating, which is provided with the specific antibodies, so that the beads bind to the surface marker cells.
  • Superparamagnetic is the ability to create magnetic properties in a strong magnetic field acquire that disappear after removing the magnetic field. This prevents the particles from clumping together.
  • the cells can also be isolated by non-magnetic heterogeneous methods using the same ligands or others, e.g. a monospecific antibody or with the help of peptides that bind to an epithelial cell receptor.
  • the method according to the invention enables gene expression studies to be protected by the protection of RNA and at the same time surprisingly has no influence on the "protein quality", so that a simultaneous protein analysis is possible.
  • the tissue determination according to the invention makes it possible to show differences between normal tissue and abnormal tissue, as a result of which disease prognoses are possible.
  • the proteins are determined according to conventional techniques, preferably by means of 2D gel electrophoresis (2D-PAGE).
  • RNA is also isolated and quantified using conventional techniques. This is preferably done using the RNAeasy Kit (Qiagen GmbH, DE) according to the guanidine thiocyanate method or RNA CLEAN.
  • the bioanalyzer system (LabonaChip) from Agilent GmbH, DE is used to quantify and check the integrity of the RNA. The invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment.
  • Ice bath 1-6031 (neoLab ® from Fisher Scientific, dresden, DE)
  • Magnetic particle concentrator MPC-1 (Dynal AG, NOR, Catalog No. 120.01)
  • Magnetic particle concentrator MPC-E-1 (Dynal)
  • RNAlater TM from Ambion # 7024
  • 100 mM Benzamidin ® SIGMA, # B6506
  • Leupeptin ® 100 mg dissolved in 40 ml PBS buffer, 2 ml of this solution containing 5 mg Leupeptin ®
  • RNAlater TM 180 mg ammonium sulfate / 100 ml
  • Tissue explanted by a patient (tumor and normal tissue) is transferred into an ice-cooled glass with 100% RNAlater TM immediately after the resection and incubated for at least 15 min.
  • the epithelial areas are then separated from mucosal tissue using a scalpel, and tumor tissue is cut into small fragments (approx. 1 mm). To further shred the preparations, the tissue is pressed through a steel sieve, if necessary several times, the sieve being cleaned in the meantime with preparation buffer and PBS buffer in order to completely detach the cells.
  • This solution is transferred to an ice-cooled 50 ml microtube and stored on ice. Then the sample is centrifuged at 300g for 10 minutes at 4 ° C, the pellet is diluted depending on its amount in the preparation solution (approx. 5-15ml) and then subjected to an immunological separation, about 4ml of solution being required.
  • the remaining solution is pipetted into microtubes and centrifuged for 5 minutes at 13000rpm and 4 ° C. The supernatant is discarded and all tubes are carefully stored in an ice bath.
  • Ber-EP4 be anti-epithelial cell Dynabeads ® (German Dynal GmbH, Hamburg, Germany) were used. Approximately 80 ⁇ l are pipetted into a 1.6ml microtube for each sample. The tube is placed in a small magnetic concentrator and after about 1 minute the supernatant is carefully aspirated and washed with distilled water. rinsed (approx. equal volume).
  • Vortex the antibody solution 80 ⁇ l of the antibody solution are pipetted into each 15ml tube and stored on ice. 4-5ml of cell sample are added to each tube and then the tubes are placed in a sample mixer or shaker for 30 minutes in a refrigerator (2-8 ° C).
  • the supernatant is then carefully aspirated, rinsed 3-4 times with ice-cooled PBS buffer (up to 8 ml total) and the supernatant aspirated again.
  • the cleaned pellet is dissolved in 12-14 ml preparation buffer and distributed over 6-10 microtubes. These tubes are centrifuged at 13000rpm for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant is carefully discarded and all tubes are placed in the ice bath. The cells are counted with a cell counter.
  • the cell pellets are treated with a denaturing solution, the
  • Protein concentration is determined by the Bradford assay in accordance with the instructions from Bio-Rad Laboratories, GmbH, DE.
  • the strips are then focused at 20 ° C and with increasing voltage from 300 V to 3,500 V within 3 hours, followed by another * 3 hours at 3,500 V (alternatively, the voltage can be linear from 300 V to 3,500 V within 8 hours be increased).
  • the intensity should be 50 ⁇ A per strip (max. 2 mA in total), whereby the voltage is increased to 10OOOV until a volt-hour product of 80-100 kVh is reached.
  • the strips can be frozen in glass tubes at -20 ° C for a few weeks or used immediately for the second dimension.
  • the strips are equilibrated to loosen the proteins and reduce S-S bonds.
  • Each strip is equilibrated twice within 15 minutes (with shaking) with 10 ml of equilibration solution.
  • dithiotreitol DTT
  • IAA iodoacetamide
  • the IPG strips are rinsed with deionized water and then placed on the edge of a piece of filter paper for a few minutes to drain the excess equilibration buffer.
  • the migration conditions are as follows: 2.5 W / gel for 30 minutes and 19 W / gel (170W maximum) for 5 minutes until the bromophenol blue dye is removed from the gel.
  • Dodeca Cell When working with MultiCell or Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad): The SDS gel is sealed at the top with hot 0.5% agarose solution and then the strip is quickly placed on top of the gel. The strip is carefully pressed onto the surface of the SDS gel with a spatula in such a way that complete contact is achieved. The agarose is then given at least 5 minutes to solidify. Molecular weight markers can also be used. The migration conditions are as follows: 25V and 40mA / gel for one hour and then 600V and 40 mA / gel for 5 or 6 hours until the bromophenol blue dye has migrated from the lower end of the gel. The electrophoresis buffer IX must be prepared.
  • Glycerol (Sigma Cat. No. G-6279) 300 g
  • Tris-HCl 1.5M PH8.8 Tris (Merck Cat. No. 1.08382) 181.71 g
  • Agarose 0.5% Agarose (Pharmacia Cat.No. US32835) 5 g
  • Ammonium persulfate 10% ammonium persulfate
  • Electrophoresis buffer 10X Tris
  • the gels are washed with 50% methanol in water for 10 minutes and additionally rinsed with water for 10 minutes to remove the residual acid.
  • Sensitization The gels are sensitized by incubation in 0.02% sodium thiosulfate for 1 minute.
  • the gels are rinsed twice with distilled water for one minute. Staining: The gels are incubated in chilled 0.1% silver nitrate solution for 20 minutes.
  • the gels are rinsed twice with distilled water for one minute.
  • Stop reaction with a solution of 5% acetic acid in water.
  • the silver-stained gels are stored in a solution of 1% acetic acid at 4 ° C until analysis.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur parallelen Gewinnung von RNA und Proteinen aus einer Gewebeprobe, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Gewebeprobe nach ihrer Resektion in eine Präparationslösung, die RNAlaterTM in einer Konzentration von 40g/100ml bis 100g/100ml umfaßt, überführt wird, die Gewebeprobe mechanisch aufgeschlossen wird, die Epithelzellen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an Oberflächenproteine der Epithelzellen binden, immunologisch abgetrennt werden und RNA und Proteine mit an sich üblichen Techniken aus den Epithelzellen extrahiert werden.

Description

Verfahren zur parallelen Gewinnung von RNA und Proteinen aus einer Gewebeprobe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur parallelen Isolierung von RNA und Proteinen aus ein und derselben Gewebeprobe unter Anwendung einer immunologischen Aufreinigung von Epithelzellen aus Tumor- und Nicht- Tumorgewebe .
Im medizinischen Bereich werden häufig Nukleinsäure- und Protein-haltige Gewebeproben zur Analyse entnommen und untersucht . Das gilt insbesondere für die Diagnostik von Tumoren und anderen Abnormitäten von Körperzellen. Bekanntermaßen existieren diagnostische Marker, die mittels vergleichender Untersuchungen des Genotyps oder Phenotyps der Tumorzellen mit Normalgewebezellen Hinweise auf vorliegende Erkrankungen ermöglichen.
In der klinischen Praxis findet vielfach das TNM-System
(tumour node metastasis) Anwendung. Das TNM-System ist eine
Art Kurzschrift zur Beschreibung der Stadien bösartiger
Tumoren im Falle epithelialer Tumore und wurde durch die UICC (Union Internationale contre le Cancer, Internationale Gesellschaft gegen Krebs) festgelegt. („TNM classification of malignant tumours", UICC, Springer Verlag, Berlin, 1992) . Die genaue klinische und pathoanatomische Beschreibung bösartiger Neubildungen beinhaltet mehrere Ziele, nämlich dem klinisch arbeitenden Arzt bei der Entwicklung einer Behandlungsstrategie zu helfen, Hinweise auf die Prognose zu geben, der Auswertung von Behandlungsergebnissen zu dienen, den Informationsaustausch zwischen nationalen und internationalen BehandlungsZentren zu vereinfachen und zur Erforschung der Krebserkrankungen beizutragen. Es wird zwischen der prätherapeutischen klinischen Klassifikation (TNM) , die vor der Behandlung erfolgt und der postoperativen feingeweblichen (pathohistologischen) Klassifikation (pTNM) unterschieden.
Vergleichende Studien sind jedoch mit mehreren Nachteilen behaftet, da sie von verschiedenen Proben stammen und somit Variationen und methodologische Probleme auftreten können. Aus WO 98/43091 AI ist deshalb ein Verfahren bekannt, das erlaubt, epitheliale Zellen als Zellmaterial zu isolieren, das frei von Stroma und anderen Verunreinigungen ist . Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch ein immunologisches Trennverfahren, wonach unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (mAk) , der spezifisch für epitheliale Zellen ist, die Zellen von den meisten anderen Gewebeteilen abgetrennt werden. Diese gereinigte Probe von epithelialen Zellen erlaubt dann die weitere Analyse von spezifischen Markern in
Form von Proteinen und Nukleinsäuren zur Ermittlung von phenotypisehen Unterschieden in abnormalen und Normalzellen.
Eine wesentliche Voraussetzung in der Nukleinsäureanalytik ist vor allem eine sofortige Stabilisierung der Nukleinsäuren und Proteine nach Entnahme der Gewebeproben aus ihrer natürlichen Umgebung. Das gilt insbesondere für -RNA, die durch Nukleasen nach Entnahme einer biologischen Probe sehr schnell abgebaut werden kann. Nachfolgende spätere RNA- Analysen können deshalb verfälscht werden.
Es sind zahlreiche Verfahren zur Stabilisierung von RNA beschrieben. Insbesondere haben sich in jüngster Zeit Salzlösungen hoher Konzentrationen bis hin zu gesättigten Lösungen als geeignete Konservierungsmittel zum Schutz von RNA bei Temperaturen oberhalb von -20°C etabliert (vgl. US 6,204,375). Vorzugsweise wird Ammoniumsulfat verwendet, welches- möglicherweise zur Bildung eines Protein/RNA- Komplexes führt, wodurch die RNA stabilisiert wird.
Es sind bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Verfahren bekannt, die es ermöglichen, aus ein und derselben Gewebeprobe sowohl die RNA als auch Proteine zu bestimmen.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das von lediglich einer Gewebeprobe eine parallele Isolierung sowohl von Proteinen als auch von RNA in einer solchen Qualität gestattet, dass zuverlässige biochemische und genetische Analysen zur Identifizierung der RNA und der Proteine möglich sind. Das Verfahren soll zuverlässig sowohl für Tumorgewebe als auch für Nicht- Tumorgewebe angewendet werden können, um insbesondere auch vergleichende Untersuchungen anstellen zu können.
Überraschend konnte die Aufgabe durch ein Verfahren gelöst werden, das die immunologische Abtrennung der Epithelzellen aus den Gewebeproben unter gleichzeitiger Stabilisierung von RNA und Proteinen gewährleistet, wodurch die parallele Gewinnung von RNA und Proteinen aus ein- und derselben Gewebeprobe möglich wird.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Gewebestücke (Tumorgewebe und Normalgewebe (Mucosa) ) , z.B. von einem humanen Patienten expandiertes Gewebe, unmittelbar nach der Resektion in eine Präparationslösung einlagert, die RNAlater™ mit einer Salzkonzentration von 40 bis lOOg/lOOml umfaßt. Vorzugsweise beträgt die RNAlater-Konzentration 60- lOOg/lOOml, besonders bevorzugt 70-80g/100ml .
Die Gewebeproben werden anschließend mechanisch aufgeschlossen, wobei die Waschlösungen erfindungsgemäß ebenfalls RNAlater™, vorzugsweise 50% RNAlater™ in PBS, umfassen. Danach werden die Epithelzellen unter Einsatz von Antikörpern, die spezifisch an Oberflächenproteine der Epithelzellen binden, immunologisch abgetrennt.
Trotz der hohen Salzkonzentrationen an RNAlater™ ist diese immunologische Trennung möglich. Bekanntermaßen führen hohe Salzkonzentrationen, wie z.B. hohe Ammoniumsulfat- Konzentrationen, zu einer Präzipitation von in Lösung befindlichen Proteinen in Form eines Niederschlages. Desweiteren ist bekannt, dass die Einwirkung von hohen externen Salzkonzentrationen auf Zellen zu einer Hypotonie der Zelle führt. Aufgrund dieser Effekte und einer Stabilisierung der RNA in der Zelle, war eine qualitativ und quantitativ befriedigende Extraktion von Proteinen aus der Zelle überraschend.
Zur Kontrolle wird nach der Aufreinigung ggf . eine immunhistochemische Färbung durchgeführt . Sowohl RNA als auch Proteine können parallel mit hoher Genauigkeit und mit an sich üblichen Techniken aus ein und derselben Probe in guter Qualität extrahiert werden.
Die Inkubationszeit in der Präparationslösung, vorzugsweise RNAlater™, sollte erfindungsgemäß mindestens 15 Minuten betragen, dies gilt sowohl für Tumorgewebe als auch für Nicht-Tumorgewebe. Sind die Gewebestücke größer als 3-4 mm werden sie entweder zerkleinert oder für längere Zeit in RNAlater™ inkubiert (pro 1 mm zusätzlichem Durchmesser bevorzugt ca. 5 min. länger) .
Das Verfahren ist auf alle epithelialen Gewebearten anwendbar, so z.B. Magen, Darm, Lunge, Pankreas, Brust usw..
RNAlater™ ist eine dem Fachmann bekannte Salzlösung (Firma Ambion, Inc., US). Es handelt sich dabei um hochkonzentrierte Salzlösungen (zwischen 20g/l00ml und der Sättigungskonzentration) , welche die RNA vor Nukleasen schützen (vgl. auch US 20010026312 AI). Gemäß der Erfindung werden insbesondere Sulfate eingesetzt, wie z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumbisulfat, Cäsiumsulfat, Cadmiumsulfat, Cäsium-Eisen (II) sulfat, Chrom (III) sulfat, Cobalt (II) sulfat, Kupfer (II) sulfat, Lithiumsulfat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Kaliumsulfat, Natriumsulfat oder Zinksulfat. Aber auch andere Salze können verwendet werden, so z.B. Ammoniumchlorid und Ammoniumacetat, Lithiumchlorid und Lithiumacetat, Magnesiumchlorid, Manganchlorid, Kaliumchlorid, Natriumchlorid und Natriumacetat, Zinkchlorid und Zinkacetat . Besonders bevorzugt wird eine RNAlater™-Lösung aus Ammoniumsulfat eingesetzt.
Die immunologische Trennung erfolgt bevorzugt mit BerEP4 monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die an exprimiertes BerEP4 Oberflächenprotein binden. Solche Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt . Insbesondere wird ein mAK eingesetzt, der gegen das Oberflächenprotein BerEP4 gerichtet ist und der bei U. Latza, J. Clin. Pathol . 43, 213 (1990) beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Magnetobead-Separation, d.h. ausgehend von magnetischen Partikeln definierter Größe, Magnetobeads oder auch Dynabeads genannt (nach der norwegischen Firma Dynal) , werden die Epithelzellen magnetisch gesammelt und anschließend gewaschen. Diese Magnetobeads haben einen superparamag- netischen Kern und sind umhüllt von einer Polystyrol- Beschichtung, die mit den spezifischen Antikörpern versehen ist, so dass die Beads an die Oberflächenmarker Zellen binden. Unter superparamagnetisch versteht man die Fähigkeit, in einem starken Magnetfeld magnetische Eigenschaften zu erwerben, die nach dem Entfernen des Magnetfeldes wieder verschwinden. Dadurch können die Partikel nicht verklumpen.
Alternativ können die Zellen auch durch nichtmagnetische heterogene Methoden unter Verwendung der gleichen Liganden oder anderer isoliert werden, wie z.B. einem- monospezifischen Antikörper oder mit Hilfe von Peptiden, welche an einen epithelialen Zellrezeptor binden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht durch den Schutz der RNA Genexpressionstudien und hat gleichzeitig überraschender Weise keinen Einfluß auf die „Proteinqualität", so daß eine gleichzeitige Proteinanalyse möglich ist.
Die erfindungsgemäße Gewebebestimmung ermöglicht das Aufzeigen von Unterschieden zwischen Normalgewebe und abnormalem Gewebe, wodurch Krankheitsprognosen möglich werden.
Die Proteine werden nach an sich üblichen Techniken, vorzugsweise mittels 2D Gelelektrophorese (2D-PAGE) bestimmt .
(Ott et al-, The Pharmacogenomics Journal (2001) 1, 142-151).
Die RNA wird ebenfalls mittels an sich üblicher Techniken isoliert und quantifiziert. Dies geschieht vorzugsweise unter Verwendung des RNAeasy Kits (Qiagen GmbH, DE) nach der Guanidinthiocyanat-Methode oder RNA CLEAN. Zur Quantifizierung und zur Kontrolle der integrität der RNA wird das Bioanalyzer-System (LabonaChip) von Agilent GmbH, DE herangezogen. Anschließend soll die Erfindung an einem Ausfuhrungsbeispiel näher erläutert werden.
Ausführuncrsbeispiel
Materialien und Lösungen
2 Zentrifugen (Universal 16R' ' Tischzentrifuge der Firma Hettich, Tuttlingen, DE; und Angle-Rotorzentrifuge „SIGMA 2K 15" Sigma Laborzentrifugen GMbH, DE) - Vortexmixer
Eisbad 1-6031, (neoLab® der Firma Fisher Scientific, dresden, DE)
- Dynal-Sample-Mixer (Dynal AG, NOR)
Konzentrator für magnetische Partikel MPC-1 (Dynal AG, NOR, Katalog-Nr. 120.01)
Konzentrator für magnetische Partikel MPC-E-1 (Dynal
AG, NOR, Katalog-Nr. 120.07)
Sterile Zentrifugenrohrchen aus Polypropylen, 50 ml und
15 ml ( Greiner, DE 227261) - Mikroröhrchen 2 ml (BlOzym diagnostic, DE, Katalog-Nr.
710190)
- Pipetten lOOμlbis zu lOOOμl, Trichter, 2 Keramikschalen mit Stößel
2 Tassen (Kapazität ca. 0,8 1) - 1 normales Scalpel
1 normale Anatomiezange
1 Stahlsieb (Maschengröße 300 μ , Firma Roth, DE) eine Schere
4 Brillen - Handschuhe
- PBS-Puffer (eisgekühlt) , 1 Tasche PBS (SIGMA Diagnostics, USA) gelöst in 1000ml aqua dest., bei 4°C gelagert ,
- RNAlater™ der Firma Ambion #7024) - 100 mM Benzamidin® (SIGMA, #B6506) - Leupeptin®: 100mg gelöst in 40ml PBS-Puffer, wobei 2ml dieser Lösung 5mg Leupeptin® beinhaltet
- Pefabloc® lg: lg gelöst in 20ml PBS-Puffer; 1ml dieser Lösung befindet sich in 1 gefrorenen Aliquot
Auf Eis präparierte Pufferlösung:
50ml PBS-Puffer
+ 50ml RNAlater™ (180 mg Ammoniumsulfat/l00ml)
+ 0,8mM Benzamidin (800μl der gelagerten Lösung) + 3mM EDTA (600μl der gelagerten Lösung) + 5mg Leupeptin® (1 gefrorenes Aliquot, gelagert bei -20°C) + 2mM Pefabloc® (1 gefrorenes Aliquot, gelagert bei -20°C)
Zellreinigunq
Von einem Patienten explantiertes Gewebe (Tumor- und Normalgewebe) wird direkt nach der Resektion in ein Eisgekühltes Glas mit 100% RNAlater™ überführt und mindestens 15 min inkubiert.
Anschließend werden aus Mucosagewebe die Epithelareale mit einem Skalpel abgetrennt, Tumorgewebe wird in kleine Fragmente (ca. 1 mm) zerschnitten. Um die Präparate weiter zu zerkleinern, wird das Gewebe durch ein Stahlsieb gedrückt, ggf. mehrmals, wobei das Sieb zwischenzeitlich mit Präparations-Puffer und PBS-Puffer gereinigt wird, um die Zellen vollständig abzulösen.
Diese Lösung wird in ein eisgekühltes 50ml Mikrorohrchen überführt und auf Eis gelagert . Danach wird die Probe bei 300g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert, das Pellet wird abhängig von seiner Menge in der Präparationslösung (ca. 5-15ml) verdünnt und anschließend einer immunologischen Trennung zugeführt, wobei etwa 4ml Lösung benötigt werden.
Die restliche Lösung wird in Mikrorohrchen pipettiert und für 5 Minuten bei 13000rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und alle Röhrchen werden sorgfältig im Eisbad gelagert.
Immunologische Trennung der Epithelzellen
Zur immunologischen Trennung werden vorgetextete Ber-EP4 anti-epitheliale Zellen Dynabeads® (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg, DE) eingesetzt. Ca. 80μl werden für jede Probe in ein 1,6ml Mikrorohrchen pipettiert. Das Röhrchen wird in einem kleinen magnetischen Konzentrator plaziert und nach ca. 1 Minute wird der Überstand sorgfältig abgesaugt und mit aqua dest . gespült (ca. gleiches Volumen) .
Vortexen der Antikörperlösung. Es werden 80μl der Antikδrperlösung in jedes 15ml Röhrchen pipettiert und auf Eis gelagert. 4-5ml Zellprobe werden in jedes Röhrchen gegeben und anschließend werden die Röhrchen in einem Probenmixer oder einem Schüttler für 30 Minuten in einen Kühlschrank (2-8°C) getan.
Danach wird der Überstand sorgfältig angesaugt, mit eisgekühltem PBS-Puffer (bis zu 8ml total) 3-4 mal gespült und der Überstand erneut angesaugt .
Letztendlich wird das gereinigte Pellet in 12-14ml Präparationspuffer gelöst und auf 6-10 Mikrorohrchen verteilt. Diese Röhrchen werden bei 13000rpm für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig verworfen und alle Röhrchen werden in das Eisbad gelegt . Mit einem Zellzähler werden die Zellen gezählt.
Die nachfolgende Protein-Analyse und RNA-Isolierung wird wie folgt durchgeführt:
1. Erste Dimension - Isoelektrofokussierunq (IEF)
Die Zellpellets werden mit einer Denaturierungslosung, dessen
Volumen abhängig von der Pelletgröße ist, behandelt
(Verhältnis Pellet zu Puffer ca. 1:4). Nach der Zugabe der
Denaturierungslosung werden die Proben vorgetextet, unter
Verwendung von Sonoplus (Bandelin electronic GmbH & Co. KG, DE) 3 mal für 10 Sekunden beschallt und für 10 Minuten bei 4°C bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert.
Die Proteinkonzentration wird nach dem Bradford Assay in Übereinstimmung mit den Anweisungen von Bio-Rad Laboratories, GmbH, DE bestimmt.
100 μg der Proteinproben (analytische 2D-PAGE) oder 3 mg der Proteinproben (präparative 2D-PAGE) , gelöst in 300 μl der oben genanten Lösung bei Verwendung von IPG Streifen von Bio- Rad (in 350 μl bei Verwendung von Streifen der Amersham Biosciences Europe GmbH, DE) , werden in die Fokussierungsschale pipettiert. Nach Entfernen des Schutzfilms werden die IPG-Streifen so positioniert, dass das Gel der Streifen mit der Probe in Kontakt ist. Gel und Probe werden zur Vermeidung einer Verdampfung mit etwa 2 ml niedrig viskosem Öl abgedeckt (Mineralöl von Bio-Rad, Kat.Nr. 163- 2129) . Unter Anwendung einer geringen Spannung von 50 V werden die Streifen 8 Stunden rehydratisiert . Die Streifen werden dann bei 20°C und unter steigender Spannung von 300 V bis 3.500 V innerhalb von 3 Stunden, gefolgt von weiteren* 3 Stunden bei 3.500 V, fokussiert (alternativ kann die Spannung linear von 300 V auf 3.500 V innerhalb von 8 Stunden gesteigert werden) . Die Intensität sollte 50 μA pro Streifen (max. 2 mA insgesamt) betragen, wobei die Spannung auf lO.OOOV bis zum Erreichen eines VoltStundenprodukts von 80-100 kVh erhöht wird.
Nach der Durchführung können die Streifen in Glasröhrchen bei -20°C für einige Wochen eingefroren werden oder unmittelbar zur zweiten Dimension verwendet werden.
Lösungen:
Denaturierungs- / Rehydrierungslösung : Harnstoff
(Merck Kat .Nr .1.08487) 420,42 g Thioharnstoff (Merck Kat.Nr. 1.07979) 152,24 g
- Lösen unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur
Amberlit IRN-150L (Pharmacia Kat.Nr. 17-1326-01) 100g
- 10 Minuten rühren und dann Amberlit-Partikel abfiltern
CHAPS (Sigma Kat .Nr .C-9426) 40g DTT (Sigma Kat.Nr. D-9163) 15,42g
Servalyt 4-9T
(Serva Kat.Nr. 42910.03) 50 ml Bromphenol , blau
(Bio-Rad Kat .Nr.161-0404) Spuren HPLC Wasser (J.T.Baker Kat.Nr. 4218) bis zu 11 Lagerung dieser Lösung bei -30°C +/-6°C.
2. Zweite Dimension - SDS-PAGE
Nach dem ersten Dimensionsversuch werden die Streifen aquilibriert, um die Proteine zu lösen und S-S Bindungen zu reduzieren.
Jeder Streifen wird zweimal innerhalb von 15 Minuten (unter Schütteln) mit 10 ml Äquilibrationslδsung äquilibiriert .
Im ersten Äquilibrationsschritt wird Dithiotreitol (DTT) in einer Konzentration von 10 mg/ml der oben genannten Lösung zugegegeben (um die Reduzierung jeglicher rückgebildeter Disulfidbrücken zu sichern) und im weiteren Äquilibrationsschritt wird Iodacetamid (IAA) in einer Konzentration von 48 mg/ml zur gleichen Lösung zugegeben (um die Proteine zu alkylieren und mit reduziertem DTT zu reagieren) .
Nach der Äquilibrierung werden die IPG Streifen mit deionisiertem Wasser gespült und dann am Rand eines Stückchen Filterpapiers für einige Minuten platziert, um den überschüssigen Äquilibrierungspuffer abzuleiten.
SDS-Gele
Wenn mit Ettan Dalt II (Amersham) gearbeitet wird: Verwendung des Pufferkits von Amersham (Kat. r. 17-6002-36) in Übereinstimmung mit den entsprechenden Anweisungen. Der Streifen wird oben auf ein vorgefertigtes Gel 12,5 (Kat.Nr. 17-6002-36) platziert, ebenso ein Filz (an dem rechten Ende des Streifens) , auf welchem die Protein-Molekular- gewichtsstandards (Amersham,- Kat. Nr. RPN5800) geladen sind. Für die Preparation dieser Standards wird die Markerlösung mit dem Ladungspuffer (1:4) gemischt und für 4 Minuten bei 95°C denaturiert. Die Versiegelungslösung wird oben auf das Gel pipettiert und der Streifen sorgfältig mit einem Spatel so angedrückt, dass ein vollständiger Kontakt erreicht wird.
Die Migrationsbedingungen sind folgende: 2,5 W/Gel für 30 Minuten und 19 W/Gel (170W Maximum) für 5 Minuten bis der Bromphenol-Blau-Farbstoff aus dem Gel entfernt ist.
Wenn mit MultiCell oder Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad) gearbeitet wird: Mit heißer 0,5% Agaroselösung wird das SDS- Gel oben abgedichtet und dann schnell der Streifen oben auf dem Gel platziert. Vorsichtig wird der Streifen mit einem Spatel so auf die Oberfläche des SDS-Gels gedrückt, dass ein vollständiger Kontakt erreicht wird. Anschließend wird der Agarose mindestens 5 Minuten Zeit gegeben, um sich zu verfestigen. Molekulargewichtsmarker können auch verwendet werden. Die Migrationsbedingungen sind die folgenden: 25V und 40mA/Gel für eine Stunde und dann 600 V und 40 mA/Gel für 5 oder 6 Stunden, bis der Bromphenol-Blau-Farbstoff aus dem unteren Ende des Gels gewandert ist. Der Elektrophoresepuffer IX muss präpariert werden.
Lösungen
Aquilibrierungslösung: Harnstoff (Merck Kat.Nr. 1.08487) 360 g
SDS (Pharmacia Kat. No. 17-1313-01) 20 g
Glycerol (Sigma Kat. Nr. G-6279) 300 g
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 33,40 ml
Bromphenol blau 0,1% 50 ml Destilliertes Wasser bis zu 11 Tris-HCl 1.5M PH8.8 : Tris (Merck Kat.Nr. 1.08382) 181,71 g
HC1 (Merck Kat.Nr. 1.09057) bis pH 8,8 Destilliertes Wasser bis zu 11
Bromphenol, blau 0,1%: Bromphenol blau
(Bio-Rad Kat.Nr. 161-0404 1 g
Destilliertes Wasser bis zu 11
Agarose 0,5%: Agarose (Pharmacia Kat.Nr. US32835) 5 g
Destilliertes Wasser bis zu 11
Gelpräparatio :
Natriumthiosulfat 5%: Natriumthiosulfat
(Sigma Kat. Nr. S-6672) 5 g
Destilliertes Wasser bis zu 100 ml
Ammoniumpersulfat 10%: Ammoniumpersulfat
(Bio-Rad Kat. Nr. 161-0700) 1 g Destilliertes Wasser bis zu 10 ml
Gellösung: PDA (Bio-Rad Kat.Nr. 161-0202) 1,95 g Tris-HCl 1,5M pH 8,8 150 ml
Acrylamid 40% (Serva Kat .N .10677.01) 182,625 ml Natriumthiosulfat 5% 3 ml
Destilliertes Wasser - bis zu 600 ml - mindestens für 10 Minuten unter Vakuum entgasen - TEMED (Bio-Rad Kat.Nr. 161-0800) 300 μl
Ammoniumpersulfat 10% 3 ml
600 ml erlauben die Herstellung 10 großer Gele. Die Gele können für 6 Monate bei 2-8°C in Tris-HCl 375mM pH 8,8 oder im Elektrophoresepuffer gelagert werden. Elektrophoresepuffer 10X: Tris
(Merck Kat Nr. 1.08382) 30,30 g
Glycin (Merck Kat.Nr.1.04210) 144 g
SDS (Pharmacia Kat.Nr. 17-131-01) 10 g
Destilliertes Wasser bis zu 11
Ladungspuffer : Tris-HCl 1,5M pH 8,8 420 μl
Glycerol (Sigma Kat.Nr. G-6279) 1 ml
SDS 10% 2 ml ß-Mercaptoethanol (Sigma Kat.Nr. M-7154) 500 μl
Bromphenol blau
(Bio-Rad Kat.Nr. 161-0404) Spuren
Destilliertes Wasser bis zu 10 ml
Isolierung der gesamten RNA
um eine gute RNA aus den Proben zu erhalten, ist es erforderlich, die gesamte Zeit Handschuhe zu tragen und nur RNase- und Dnase-freie tips and tubes zu verwenden oder diese zu autoclavieren. es wurde der Qiagen RNeasy Mini Kit Cat no. 74 106 verwendet
l.vor der Verwendung: ß-Mercaptoethanol zum Puffer RLT hinzugeben (lμl ß-ME/lml Puffer) ; 96% Ethanol zum Puffer RPE hinzugeben, wie auf der Flasche angegeben 2. Hinzugeben von 350μl oder 600μl Puffer RLT zum Lysieren der Zellen (in Abhängigkeit vom Pellet, ein größeres Pellet benötigt möglicherweise mehr RLT Puffer)
3. Homogenisieren der Probe mit dem Rotor Stator (30s) oder mit dem Sonicator (10s)
4. Hinzufügen des gleichen Volumens 70%igen Ethanols zu der Probe und Mixen durch Pipettieren (nicht durch Zentrifugieren oder Vortexen)
5. 700 μl dieser Mischung auf eine Rneasy-Mini-Spin-Säule geben und schließen, wenn das Volumen 700 μl geladenes Aliquot auf der Säule überschreitet
6. Zentrifugieren für 15s bei 10.000 rpm (manchmal ist es notwendig höher oder länger zu zentrifugieren - es ist abhängig von der Probenviskosität und dem Säulendurchgang)
7. Verwerfen des Durchflusses und Nutzbarmachung der Sammelröhrchen
8. Hinzufügen von 700 μl Puffer RW1 (im Kit)
9. Zentrifugieren für 15 Sekunden bei 10.000 rpm
10. Verwerfen des Durchflusses und der Sammelröhrchen und Transfer der Säule in ein neues Sammelröhrchen
11. Hinzufügen von 500 μl Puffer RPE (im Kit)
12. Zentrifugieren für 15 Sekunden bei 10.000 rpm/Verwerfen des Durchflusses
13. Hinzufügen von weiteren 500 μl RPE Puffer 14. Zentrifugieren für 2 Minuten bei hoher Geschwindigkeit, um vom Puffer zu befreien
15. Zum Eluieren Transfer der Säule in ein neues 1,5 ml Sammelröhrchen und Pipettieren von 30 bis 50 μl Rnase-freiem Wasser (im Kit) direkt auf die Silica-Gel-Membran
16. Zentrifugieren für 1 Minute bei 10.000 rpm
17. Wiederholen von Schritt 15 und 16 in demselben Rδhrchen
18. Verschließen des Röhrchens und Platzieren der RNA direkt auf Eis für spätere Verfahrensschritte oder Einfrieren bei - 20° C
Lösungen
20x SSC Puffer: 175,3g NaCl
88,2g Natriumeitrat-2H20
Lösen in 800 ml H20
Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 mit HC1
Auffüllen auf 1000 ml mit Wasser
Lagern bei Raumtemperatur
10% SDS: 10g SDS/lOOml Wasser Lagern bei Raumtemperatur
35% Guanidinhydrochlorid
(Sigma G7153): • 35 g Guanidinhydro chlorid/100 ml Wasser • Durchleiten durch ein 0, 2μm-Filter, um die Partikel zu entfernen
• Lagern bei 4°C
Waschlösung 1 1,0 ml 10% SDS 25, 0 ml 20xSSC 974, 0 ml Wasser
Waschlösung 2 3, 0 ml 20xSSC 997 ml Wasser
- Vor der Verwendung beide Lösungen durch eine 0,2μm sterile Filtrationseinheit durchleiten
- Lagern bei Raumtemperatur
Silberfärbung
Die folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur mit Hoefer Processor Plus durchgeführt :
Fixierung: Die Gele werden in 50% Methanol/5% Essigsäure in Wasser über Nacht fixiert.
Die Gele werden für 10 Minuten mit 50% Methanol in Wasser gewaschen und zusätzlich für 10 Minuten mit Wasser gespült, um die restliche Säure zu entfernen.
Sensibilisierun : Die Gele werden sensibilisiert mittels einer lminütigen Inkubation in 0,02% Natriumthiosulfat .
Die Gele werden zweimal für eine Minute mit destilliertem Wasser gespült . Färbung: Die Gele werden in gekühlter 0,l%iger Silbernitratlösung für 20 Minuten inkubiert.
Die Gele werden zweimal für eine Minute mit destilliertem Wasser gespült .
Entwicklung: Die Gele werden in der Entwicklungslösung entwickelt .
Reaktionsstopp : mit einer Lösung von 5% Essigsäure in Wasser.
Die Silber-gefärbten Gele werden in einer Lösung von l%iger Essigsäure bei 4° C bis zur Analyse gelagert.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur parallelen Gewinnung von RNA und Proteinen aus einer Gewebeprobe, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe nach ihrer Resektion in eine Präparationslösung, die RNAlater™ in einer Konzentration von 40g/l00ml bis lOOg/lOOml umfaßt, überführt wird, die Gewebeprobe mechanisch aufgeschlossen wird, die Epithelzellen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an Oberflächenproteine der Epithelzellen binden, immunologisch abgetrennt werden und RNA' und Proteine mit an sich üblichen Techniken aus den Epithelzellen extrahiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als RNAlater™ eine Sulfatlösung eingesetzt wird, vorzugsweise Ammoniumsulfat .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an RNAlater™ in der Präparationslösung 60g-100g/l00ml beträgt, vorzugsweise 70-80g/l00ml .
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das resektierte Gewebe pro m Gewebedurchmesser mindestens 5 Minuten in RNAlater™ inkubiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Tumorgewebeprobe, die <0,5cm ist, vor ihrem mechanischen Aufschluß mindestens 15 Minuten in der Präparationslösung inkubiert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass - die immunologische Abtrennung der Epithelzellen von
Humangewebe mit humanen BerEP4 anti-epithelialen Antikörpern, vorzugsweise monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an das Oberflächenprotein BerEP4 binden, erfolgt.
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