WO2003093490A1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aromatischen aminosäuren und anderen metaboliten des aromatischen aminosäurebiosyntheseweges - Google Patents

Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aromatischen aminosäuren und anderen metaboliten des aromatischen aminosäurebiosyntheseweges Download PDF

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WO2003093490A1
WO2003093490A1 PCT/DE2003/001380 DE0301380W WO03093490A1 WO 2003093490 A1 WO2003093490 A1 WO 2003093490A1 DE 0301380 W DE0301380 W DE 0301380W WO 03093490 A1 WO03093490 A1 WO 03093490A1
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microorganism
aromatic amino
gene sequence
amino acids
metabolites
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Britta Anderlei
Georg Sprenger
Hermann Sahm
Johannes Bongaerts
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Forschungszentrum Jülich GmbH
Holland Sweetener Company V.O.F.
Dsm Biotech Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)

Definitions

  • the invention relates to a method for the microbial production of aromatic amino acids and other metabolites of the aromatic amino acid biosynthetic pathway.
  • Microbially produced substances such as fine chemicals, in particular aromatic amino acids or metabolites of the aromatic biosynthetic pathway, are of great economic interest, the need for e.g. B. amino acids continues to increase.
  • L-phenylalanine is used for the manufacture of medicaments and in particular also for the manufacture of the sweetener Asparta (cc-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester).
  • L-tryptophan is required as a medication and additive to animal feed;
  • L-tyrosine is also needed as a drug and as a raw material in the pharmaceutical industry.
  • biotechnological production is a very important method for obtaining amino acids in the desired optically active form under economically justifiable conditions. The biotechnological production takes place either enzymatically or with the help of microorganisms.
  • EP 0.077.196 describes a process for the production of aromatic amino acids, in which a 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase (DAHP synthase) which is no longer feedback-inhibited is overexpressed in E. coli.
  • DAHP synthase 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase
  • EP 0.145.156 describes an E. coli strain in which chorismate mutase / prephenate dehydratase is additionally overexpressed for the production of L-phenylalanine.
  • Erythrose-4-phosphate (Ery4P) is required for the condensation to 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP).
  • DAHP 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate
  • Phenylalanine enables EP 0,600,463. Flores et al. showed (Flores et al. 1996. Nature Biotechnology 14: 620-623) that a spontaneous glucose positive revertant of a sugar phosphotransferase system (PTS) negative mutant of Escherichia coli glucose via the galactose permease (GalP) system into the cells infiltrated and was able to grow on glucose. Additional expression of the transketolase gene (tktA) resulted in an increased formation of the intermediate DAHP (Flores et al. Nature Biotechnology 14
  • pyruvate carboxylase plays an important role in the synthesis of the amino acids that are derived from the tricarboxylic acid cycle (TCA cycle).
  • pyruvate carboxylase lies in the anaplerotic reaction that starts from Py- ruvat and C0 2 (or hydrogen carbonate) achieved the provision of C4 bodies (oxaloacetate) (Jitrapakdee and Wallace, Biochemical Journal 340 (1999) 1-16). Oxaloacetate can be metabolized further by reaction with acetyl-CoA in the tricarboxylic acid cycle
  • WO 01/04325 describes, for example, a fermentative process for the production of L-amino acids from the aspartate amino acid family with coryneform microorganisms which are a go from the group dapA (dihydrodipicolinate synthase), lysC (aspartate kinase), gap (glycerol aldehyde-3 - Phosphate dehydrogenase), mqo (malate-quinone oxidoreductase), tkt (transketolase), gnd (6-phosphogluconate dehydrogenase), zwf (glucose-6-phosphate dehydrogenase), lysE (lysine export), zwal (unnamed protein product), eno (enolase), opcA (put
  • genes for a pyruvate carboxylase have been isolated from a number of microorganisms, characterized and expressed in recombinant form.
  • genes for pyruvate carboxylase have already been found in bacteria such as Corynebacteria, Rhizobia, Brevibacteria, Bacillus subtilis, Mycobacteria, Pseudomonas, Rhodopseudomonas spheroides, Campylobacter jejuni, Methanococcus jannaschii, in the yeast Saccharomyces cereviserneae, and humans Payne & Morris J Gen. Microbiol. 59 (1969) 97-101; Peters-Wendisch et al.
  • the object is achieved according to the invention with the features specified in the characterizing part of claim 1.
  • Aromatic amino acids and other metabolites of the aromatic amino acid biosynthetic pathway in the sense of the invention are to be understood in particular to mean the aromatic amino acids L-phenylalanine, L-tryptophan and L-tyrosine.
  • Metabolites from the aromatic amino acid biosynthetic pathway including 3-deoxy-D-
  • Arabino heptulosonate 7-phosphate (DAHP) derived compounds such as D-arabino heptulosonate (DAH), shikimic acid, chorismic acid and all their derivatives, cyclohexadiene transdiols, indigo, indole acetic acid, adipic acid, melanin, quinones, benzoic acid derivatives and their potential
  • D-arabino heptulosonate (DAH) D-arabino heptulosonate
  • shikimic acid chorismic acid and all their derivatives
  • chorismic acid cyclohexadiene transdiols
  • indigo indole acetic acid
  • adipic acid melanin
  • quinones benzoic acid derivatives
  • benzoic acid derivatives and their potential
  • the inventors surprisingly found that after introducing a pyc gene sequence into microorganisms which naturally have no pyruvate carboxylase, or after amplifying an existing pyc gene sequence, aromatic amino acids and metabolites of the aromatic biosynthetic pathway could be produced in an improved manner.
  • introduction should therefore be understood to mean all process steps which result in a pyc gene sequence being inserted into microorganisms which do not have a pyc gene sequence.
  • introduction can also include a Amplification of an existing pyc gene sequence can be understood.
  • the test principle is the detection of oxalacetate formed from pyruvate.
  • the enzyme pyruvate carboxylase catalyzes the carboxylation of pyruvate and thereby forms oxaloacetate.
  • the activity of a pyruvate carboxylase depends on biotin as a prosthetic group on the enzyme and also depends on ATP and magnesium ions.
  • ATP is split into ADP and inorganic phosphate.
  • the carboxyl group is transferred from the enzyme-biotin complex to pyruvate.
  • the pyruvate carboxylase from Brevibacterium lactofermenum can be detected, for example, in crude extracts obtained by ultrasound treatment by carrying out coupled enzyme tests with malate dehydrogenase or citrate synthase, which each serve as evidence for the oxaloacetate formed (Tosaka et al. Agric. Biol. Che. 43 (1979) 1513-1519).
  • the pyruvate carboxylase from Methanococcus jannaschii was detected by coupling with malate dehydrogenase (Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414).
  • CAB Corynebacterium glutamicum cells which had been permeabilized by hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), pyruvate carboxylase activity was detected in a batch method by coupling to a glutamate oxaloacetate transaminase (Peters-Wendisch et al. Microbiology 143 (1997) 1095 - 1103).
  • PEP polypeptide
  • DAH DAHP or its degradation product
  • DAHP which is synthesized by condensation of PEP and Ery4P, forms the starting substance for aromatic amino acids and other metabolites of aromatic amino acid bio pathway.
  • DAHP and DAH are discussed in the literature as signs of increased PEP availability (Frost and Draths Annual Rev. Microbiol. 49 (1995), 557-579; Flores et al. Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623; Bongaerts et al. Metabolie Engineering 3 (2001) 289-300)
  • the term “amplification” of the pyc gene sequence describes the increase in the activity of the pyruvate carboxylase.
  • the following measures can be mentioned by way of example:
  • Gene sequence coding gene copy number z. B. by means of plasmids with the aim of the pyc gene sequence in an increased number of copies, from slightly (z. B. 2 to 5 times) to greatly increased number of copies (z. B. 15 to 50 times) in the microorganism bring in;
  • promoter elements such.
  • overexpression of the pyc gene sequence can also be achieved by changing the media composition and culture management.
  • the addition of essential growth substances to the fermentation medium can also bring about an improved production of the substances in the sense of the invention.
  • Expression is also improved by measures to extend the life of the m-RNA.
  • the enzyme activity is increased by preventing the breakdown of the enzyme protein.
  • UV radiation or mutation-triggering chemicals or by mutations that are generated in a targeted manner using genetic engineering methods such as deletion (s), insertion (s) and / or nucleotide exchange (s). Combinations of the above-mentioned and other, analogous methods can also be used to increase the pyruvate carboxylase activity.
  • the pyc gene sequence is preferably introduced by integrating the pyc gene sequence into one or more gene structures, the pyc gene sequence being introduced into the gene structure as a single copy or in an increased number of copies.
  • a “gene structure” is to be understood as any gene or nucleotide sequence which carries a pyc gene sequence.
  • Corresponding nucleotide sequences can be, for example, plasmids, vectors, chromosomes, phages or other, non-circularly closed, nucleotide sequences.
  • the pyc gene sequence can be a vector is introduced into the cell or is inserted into a chromosome or is introduced into the cell by a phage. Other combinations of gene distributions are not to be excluded from the invention by these examples.
  • the number of pyc gene sequences contained in the gene structure should exceed the natural number.
  • the pyc gene sequence used for the method according to the invention can, for. B. from Rhizobium (Gokarn et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195), Brevibacterium, Bacillus, Mycobacterium (Mukhopadhyay and Purwantini Biochimica et Biophysica Acta 1475 (2000) 191-206), Methanococcus ( Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414), Saccharomyces cerevisiae (Irani et al.
  • pyc gene sequences can be identified from generally accessible databases (such as, for example, EMBL, NCBI, ERGO) and by techniques of gene cloning, e.g. B. PCR can be cloned from such other organisms using the polymerase chain reaction.
  • microorganisms are used into which a pyc gene sequence has been introduced in a replicable form.
  • organisms from the family Enterobacteriaceae such as. B. Escherichia species, but also microorganisms of the genera Serratia, Bacillus, Corynebacterium or Brevibacterium and other strains known from classic amino acid processes. Escherichia coli is particularly suitable.
  • the transformation of the microorganisms or host cells can be carried out by chemical methods (Hanahan D, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580), and also by electroporation, conjugation, transduction or by subcloning from plasmid structures known in the literature.
  • the cloning of pyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum is suitable for example as the method of polymerase chain reaction (PCR) for the directed amplification of the pyc gene sequence with chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum strains.
  • microorganisms for the transformation in which one or more enzymes, which are additionally involved in the synthesis of the aromatic amino acids and other metabolites of the aromatic amino acid biosynthetic pathway, are deregulated and / or their activity is increased.
  • transformed cells are used which are able to produce an aromatic amino acid, the aromatic amino acid preferably being L-phenylalanine.
  • the genes which code for enzymes which compete with the pyruvate carboxylase for PEP such as, for. B. the PEP carboxylase, the PEP-dependent sugar phosphotransferase system (PTS) or pyruvate kinases, individually or in combination in their expression can be lowered or inactivated or completely switched off and these microorganisms are used.
  • PEP PEP-dependent sugar phosphotransferase system
  • pyruvate kinases individually or in combination in their expression
  • This advantageous embodiment also includes that the activity of a transport protein for PEP-independent uptake of glucose in microorganisms with a PEP-dependent transport system for glucose, the are used in the method according to the invention is increased.
  • the additional integration of a PEP-independent transport system allows an increased supply of glucose in the microorganism producing the substances.
  • PEP as an energy donor is not required for these reactions and, based on a constant material flow in the glycolysis and the pentose phosphate pathway, is increasingly the primary condenser with erythrose-4-phosphate (Ery-4-P) Metabolites of the general biosynthetic pathway for aromatic compounds such as. B.
  • deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate are available and subsequently for the production of, for example, aromatic amino acids, such as. B. L-phenylalanine, tyrosine or tryptophan.
  • the process for the production of substances according to the invention can use microorganisms in which one or more enzymes, which are additionally involved in the synthesis of the substances, are deregulated and / or their activity is increased.
  • enzymes which are additionally involved in the synthesis of the substances, are deregulated and / or their activity is increased.
  • these are in particular the enzymes of the aromatic amino acid metabolism and above all the DAHP synthase (eg in E. coli AroF or AroH), the shikimate kinase and the chorismate mutase / prephenate dehydratase (PheA). All other enzymes involved in the Synthesis of aromatic amino acids or metabolites of the aromatic amino acid biosynthetic pathway and their secondary products involved can be used.
  • Amino acid biosynthetic pathways and their derivatives such as adipic acid, bile acid and quinone compounds, and their derivatives, in addition to the pyc gene sequence, the deregulated and overexpressed DAHP synthase has proven to be particularly suitable.
  • the shikimate kinase should also be regulated and its activity increased.
  • chorismate mutase / prephenate dehydratase is also of particular importance.
  • this is also intended to encompass all other enzymes whose activities contribute to the microbial synthesis of metabolites other than those from the aromatic amino acid biosynthetic pathway, that is to say compounds whose production is favored by the provision of PEP, e.g. B. CMP-ketodeoxyoctulosonic acid,
  • UDP-N-acetylmuramic acid or N-acetyl-neuraminic acid.
  • the increased availability of PEP can not only have a positive effect on the synthesis of DAHP, but can also favor the introduction of a pyruvate group in the synthesis of 3-enolpyruvoylshikimate-5-phosphate as a precursor of chorismate.
  • adipic acid, cyclohexadiene transdi oils and other non-natural secondary products in addition to the process features according to the invention, further genetic changes to the substances producing microorganisms are necessary.
  • FIG. 1 shows the links between the central metabolism and the aromatic amino acid biosynthetic pathway of bacteria, emphasizing the reactions of the phosphoenolpyruvate and pyruvate.
  • Reaction 1 denotes the pyruvate carboxylase reaction
  • reaction 2 the phosphoenolpyruvate carboxylase reaction
  • reaction 3 the PEP-dependent sugar phosphotransferase system (PTS).
  • EPSP enol-pyruvoyl-shikimate phosphate
  • GA3-P glyceraldehyde-3-phosphate
  • pABA para-aminobenzoate
  • PEP phosphoenol pyruvate 2 shows exemplary experimental data from the pyruvate carboxylase activity detection.
  • the abscissa X represents the time in seconds and the ordinate Y the extinction at a wavelength of 412 nm.
  • the measurement points represented by black diamonds are results obtained with E. coli cells which were transformed with a pyc vector were.
  • the measuring points shown with a blank square represent the results of the E. coli cells which were transformed with an empty vector without a pyc gene sequence.
  • the gray solid line shows the regression line.
  • Example 1 Cloning of the pyc gene sequence, expression in Escherichia coli strains
  • the first cloning of the pyc gene sequence from Corynebacteriu glutamicum ATCC13032 is described under Peters-Wendisch et al. Microbiology 144 (1998) 915-927.
  • the subcloning of the pyc gene sequence into the expression vector pVWExl -pyc is described in Peters-Wendisch et al. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 (2001) 295-300.
  • a 3.7 kb DNA fragment with the pyc gene sequence from C. glutamicum was obtained from the vector pVWExl-pyc by restriction with the enzymes SphI and Hindlll.
  • the wild-type strain E. coli K-12 LJ110 was first selected for kanamycin resistance (obtaining the aroK:: Kan marker). In a second PI transduction, selection was then made to obtain the tetracycline resistance marker (obtain the aroL:: Tnl0 marker). Cells showing both resistances were then tested for auxotrophy for the aromatic amino acids L-phenylalanine, L-tyrosine, L- Tryptophan (40 mg / 1 each) and checked for auxotrophy for p-aminobenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid and 2, 3-dihydroxybenzoic acid (20 mg / l each).
  • LJ110 aroB Cells that became pentose-positive but remained aromatic-exotrophic (aroB) were further used as LJ110 aroB (Marco Krämer, dissertation, University of Düsseldorf, 1999, p.34).
  • the strain LJ110 ⁇ ppc was determined by the cross-over-PCR method from Link et al. (Link et al. J. Bacteriol. 179 (1997) 6228-6237).
  • the oligonucleotide primer pairs used for the PCR amplification were: external primer Nin 5 'GTTATAAATTTGGAGTGTGAAGGTTATTGCGTGCATATTACCCCAGACACCCC ATCTTATCG 3 "(Seq. ID. No. 1) and inner primer Nout
  • the cells were then resuspended in the same buffer, and it was adjusted a cell concentration, the 6 oo had an OD of 5 in 1 ml buffer.
  • Such samples were mixed with 10 ul toluene / ml and mixed on a vortex for 1 minute. This was followed by incubation at 4 ° C (on ice) for 10 minutes. This allowed the cells to be permeabilized.
  • the cells were used in 100 ⁇ L aliquots for the subsequent pyruvate carboxylase test.
  • test principle is the detection of the oxaloacetate (OAA) formed from pyruvate and hydrogen carbonate via a coupling with the auxiliary enzyme citrate synthase and acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) after the following reactions:
  • OOA oxaloacetate
  • acetyl-CoA acetyl-CoA
  • CoA derivative mixed disulfide from CoA and thio-nitrobenzoic acid
  • Pyruvate is converted to oxaloacetate (OAA) by pyruvate carboxylase Pyc with ATP hydrolysis (1).
  • OAA formed is reacted with acetyl-CoA via the citrate synthase reaction (2) to citrate and coenzyme A (HS-CoA).
  • the Pyc activity detection is based on the reaction (3) of the released coenzyme A (HS-CoA) with dithionitrobenzoic acid to a mixed disulfide of CoA and thionitrobenzoic acid and a molar equivalent of yellow-colored 5-thio-2-nitrobenzoate (TNB 2 ⁇ ).
  • TNB 2 This has a molar extinction coefficient of 13.6 rr ⁇ YT 1 cm “1 and can be verified photometrically at a wavelength of 412 nm.
  • the formation rate of TNB 2" correlates directly with the acetylation of OAA and thus with the conversion of pyruvate to OAA by pyruvate carboxylase.
  • reaction vessels were transferred to liquid nitrogen and, during the thawing process, the biomass was removed by centrifugation at 4 ° C. and 15,300 rpm.
  • the absorbance at 412 nm was determined photometrically in the clear supernatants. Approaches without pyruvate served as a reference.
  • Example 3 Fermentation to obtain PAH with recombining pyruvate carboxylase.
  • DAH degradation product of DAHP
  • the process was carried out in 6 Sixfors Vario laboratory fermenters (2 liters) connected in parallel with a filling volume of 1.5 L.
  • Feed medium glucose: 454 g / L

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosynthesewe­ges. Mikrobiell hergestellte Substanzen, wie Feinchemika­lien, insbesondere aromatische Aminosäuren oder Metabo­lite des Aromatenbiosyntheseweges sind von großem wirt­schaftlichen Interesse, wobei der Bedarf an z.B. Ami­nosäuren weiterhin zunimmt. Die Erfinder fanden heraus, daß nach Einbringen einer pyc-Gensequenz in Mikroorganismen, in verbesserter Wei­se aromatische Aminosäuren sowie Metabolite des aromatischen Biosyntheseweges produziert werden konnten. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von L-Phenylalanin.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von aromatischen
Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen
Aminosäurebiosyntheseweges
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosynthesewe- ges.
Mikrobiell hergestellte Substanzen, wie Feinchemikalien, insbesondere aromatische Aminosäuren oder Metabolite des Aromatenbiosyntheseweges sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf an z. B. Aminosäuren weiterhin zunimmt. So wird beispielsweise L- Phenylalanin zur Herstellung von Medikamenten und insbesondere auch bei der Herstellung des Süßstoffes Asparta (cc-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester) verwendet. L-Tryptophan wird als Medikament und Zusatz zu Futtermitteln benötigt; für L-Tyrosin besteht ebenfalls Bedarf als Medikament, sowie als Rohstoff in der pharmazeutischen Industrie. Neben der Isolierung aus natürlichen Materialien ist die biotechnologische Herstellung eine sehr wichtige Methode, um Aminosäuren in der gewünschten optisch aktiven Form unter wirtschaftlich vertretbaren Bedingungen zu erhalten. Die biotechnologische Herstellung erfolgt entweder enzymatisch oder mit Hilfe von Mikroorganismen.
Die letztere, mikrobielle Herstellung hat den Vorteil, daß einfache und preisgünstige Rohstoffe eingesetzt werden können. Da die Biosynthese der Aminosäuren in der Zelle aber in vielfacher Weise kontrolliert wird, sind bereits vielfältige Versuche zur Steigerung der Produktbildung unternommen worden. So wurden z. B. Aminosäure-Analoga eingesetzt, um die Regulation der Bio- synthese auszuschalten. Beispielsweise wurden durch Selektion auf Resistenz gegen Phenylalanin-Analoga Mutanten von Escherichia coli erhalten, die eine erhöhte Produktion von L-Phenylalanin ermöglichten (GB- 2,053,906). Eine ähnliche Strategie führte auch zu überproduzierenden Stämmen von Corynebacterium (JP-19037/1976 und JP-39517/1978) und Bacillus (EP 0,138,526) .
Desweiteren sind durch rekombinante DNS-Techniken kon- struierte Mikroorganismen bekannt, bei denen ebenfalls die Regulation der Biosynthese aufgehoben ist, indem die Gene, die für nicht mehr feedback-inhibierte Schlüsselenzyme kodieren, kloniert und exprimiert werden. Als ein Vorbild beschreibt EP 0,077,196 ein Ver- fahren zur Produktion von aromatischen Aminosäuren, bei dem eine nicht mehr feedback-inhibierte 3-Desoxy-D- Arabino-Heptulosonat-7-Phosphatsynthase (DAHP-Synthase) in E. coli überexprimiert wird. In EP 0,145,156 ist ein E. coli-Stamm beschrieben, in dem zur Produktion von L-Phenylalanin zusätzlich Chorismatmutase/- Prephenat- dehydratase überexprimiert ist.
Den genannten Strategien ist gemeinsam, daß sich der Eingriff zur Verbesserung der Produktion auf den für die aromatischen Aminosäuren spezifischen Biosyntheseweg beschränkt . Eine weitere Erhöhung der Produktion kann jedoch auch durch eine verbesserte Bereitstellung der zur Produktion aromatischer Aminosäuren benötigten Primärmetabolite Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4 -Phosphat (Ery4P) erfolgen. PEP ist ein aktivierter Vorläufer des Glycolyseproduktes Pyruvat (Brenztraubensäure) ; Ery4P ist ein Intermediat des Pentosephosphatweges . Bei der Produktion aromatischer Aminosäuren oder von anderen Metaboliten des Aromatenbiosyntheseweges werden die Primärmetabolite Phosphoenolpyruvat (PEP) und
Erythrose-4-Phosphat (Ery4P) für die Kondensation zu 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphat (DAHP) benötigt. Die Wirkung einer verbesserten Bereitstellung des zel- lulären Primärmetaboliten Phosphoenolpyruvat aus der Glykolyse wurde bereits früher untersucht. So ist bekannt, daß die durch rekombinante Techniken erreichte Überexpression der Transketolase eine erhöhte Bereitstellung von Erythrose-4-P und in Folge eine verbesser- te Produktbildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-
Phenylalanin ermöglicht (EP 0,600,463). Flores et al . zeigten (Flores et al . 1996. Nature Biotechnology 14:620-623), daß eine spontane Glucose positive Revertante einer Zuckerphosphotransferase-System (PTS) -negativen Mutante von Escherichia coli Glucose über das Galactose-Permease (GalP) -System in die Zellen einschleuste und zum Wachstum auf Glucose befähigt war. Durch zusätzliche Expression des Transketolase-Gens (tktA) wurde eine vermehrte Bildung des Intermediaten DAHP beobachtet (Flores et al . Nature Biotechnology 14
(1996) 620-623) . Weitere Verbesserungen der Bereitstellung von Vorl ufermetaboliten für den aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg und Verbesserungen des Flusses im aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg sind dem Fachmann beispielsweise aus Bongaerts et al . (Bongaerts et al . Metabolie Engineering 3 (2001) 289-300) bekannt.
In der Literatur sind weiterhin mehrere Strategien für die Steigerung der Verfügbarkeit von PEP beschrieben, z. B. durch ein PEP-unabhängiges Zuckeraufnahmesystem wobei z . B. das Zuckerphosphotransferase System (PTS) völlig inaktiviert und anschließend durch eine Galakto- se-Permease oder die Gene gif (Glucosefacilitator Protein) und glk (Glucokinase) aus Zymomonas mobilis ersetzt wird (Frost und Draths Annual Rev. Microbiol . 49 (1995), 557-579; Flores et al . Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623; Bongaerts et al . Metabolie Engineering 3 (2001) 289-300)
Auch wurde in früheren Patentanmeldungen (DE 19644566.3; DE 19644567.1; DE 19818541 AI ; US- 6,316,232 ) gezeigt, daß durch die Erhöhung der Enzym- aktivitäten von z. B. Transketolase, Transaldolase, Glucosedehydrogenase oder Glucokinase in Escherichia coli oder durch Kombinationen der angegebenen Enzyme und eines PEP-unabhängigen Transportsystems, Substanzen des aromatischen Biosyntheseweges in erhöhtem Maße be- reitgestellt werden konnten.
In einer Reihe von Mikroorganismen spielt die Pyruvat- carboxylase eine wichtige Rolle für die Synthese der Aminosäuren, die aus dem Tricarbonsäure-Zyklus (TCA- Zyklus) abgeleitet sind.
Die physiologische Rolle der Pyruvatcarboxylase liegt in der anaplerotischen Reaktion, die ausgehend von Py- ruvat und C02 (bzw. Hydrogencarbonat) die Bereitstellung von C4-Körpern (Oxalacetat) erreicht (Jitrapakdee und Wallace, Biochemical Journal 340 (1999) 1-16) . Oxalacetat kann durch Reaktion mit Acetyl-CoA im Tri- carbonsäure-Zyklus weiter verstoffwechselt werden
(z. B. auch zu den Aminosäuren Glutamat und Glutamin) , oder durch Transaminierung zu Asparaginsäure, Vorläufer der Aspartat-Aminosäurefamilie (Aspartat, Asparagin, Homoserin, Threonin, Methionin, Isoleucin und Lysin) bereitstellen (Peters-Wendisch et al . J. Mol. Microbi- ol . Biotechnol . 3 (2001) 295-300). So konnten verschiedene Gruppen zeigen, dass die Aktivität einer Pyruvat- carboxylase für die Produktion von Aminosäuren der Aspartatfamilie in Corynebakterien eine Rolle spielt (DE 19831609; EP 1,067,192; Peters-Wendisch et al .
Journal of . Molecular Microbiology and Biotechnology 3 (2001) 295-300; Sinskey et al . US 6,171,833 bzw. WO 00/39305) . Die WO 01/04325 beschreibt beispielsweise ein fermentatives Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren aus der Aspartat-Aminosäurefamilie mit coryneformen Mikroorganismen, die ein Geh aus der Gruppe dapA (Dihydrodipicolinat- Synthase) , lysC (Aspartat Kinase) , gap (Glycerolaldehyd-3 -Phosphat Dehydrogenase) , mqo (Malat-Quinon Oxidoreduktase) , tkt (Transketo- läse) , gnd (6-Phosphogluconat Dehydrogenase) , zwf (Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase) , lysE (Lysin Export) , zwal (unnamed protein product) , eno (Enolase) , opcA (putative oxidative pentose phosphate cycle protein) sowie auch eine pyc-Gensequenz (Pyruvatcarboxylase) enthalten. Dabei wird die aromatische Aminosäure L-
Tryptophan neben den Aminosäuren der Aspartat-Aminosäurefamilie, ebenfalls als Produkt des in WO 01/04325 beschriebenen Verfahrens angegeben. Eine Angabe, welche spezielle Gensequenz bzw. welches spezielle Enzym für eine spezifische Produktion von aromatischen Aminosäuren und Metaboliten des aromatischen Aminosäu- rebiosyntheseweges geeignet ist, wird jedoch nicht angegeben.
Gene für eine Pyruvatcarboxylase (pyc-Gene) wurden aus einer Reihe von Mikroorganismen isoliert, charakterisiert und in rekombinanter Form ausgeprägt. So wurden Gene für eine Pyruvatcarboxylase bereits in Bakterien wie Corynebakterien, Rhizobien, Brevibacterien, Bacil- lus subtilis, Mycobacterien, Pseudomonas, Rhodopseudo- monas spheroides, Campylobacter jejuni, Methanococcus jannaschii, in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, und in Säugern wie dem Menschen nachgewiesen (Payne & Morris J Gen. Microbiol. 59 (1969) 97-101; Peters-Wendisch et al. Microbiology 144 (1998) 915-927; Gokarn et al . Appl . Microbiol. Biotechnol . 56 (2001) 188-195; Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414; Mukhopadhyay & Purwantini, Biochim. Biophys. Acta 1475 (2000) 191-206; Irani et al . Biotechnol. Bioengin. 66 (1999) 238-246; US 6,171,833; Dünn et al . Arch. Microbiol. 176 (2001) 355-363; Dünn et al . J. Bacteriol . 178 (1996) 5960-5970; Jitrapakdee et al . Biochem. Biophys. Res. Comm. 266 (1999) 512-517; Velayudhan & Kelly Microbiology 148 (2002) 685-694; Mukhopadhyay et al . Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414; EP 1,092,776).
Aus Escherichia coli und anderen Enterobakterien sind bisher keine Pyruvatcarboxylasen beschrieben worden. In rekombinanten Zellen von Escherichia coli oder Sal- monella typhimurium, die das pyc-Gen aus Rhizobium etli tragen, wurde kürzlich gezeigt, dass durch die Expression der Pyruvatcarboxylase das Produktspektrum der Zellen deutlich verändert wurde und zwar in Richtung C4-Körper (z. B. Succinat) unter Verringerung von aus dem Pyruvat abgeleiteten Substanzen wie Lactat oder Acetat (Gokarn et al . Biotechnol. Letters 20 (1998) 795-798; Gokarn et al . Applied Environm. Microbiol. 66 (2000) 1844-1850; Gokarn et al . Appl . Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195; Xie et al . Biotechnol. Letters 23 (2001) 111-117) . Durch Expression eines pyc- Gens aus Bacillus subtilis in E.coli wurde die Bildung der L-Aminosäuren Threonin, Glutaminsäure, Homoserin, Methionin, Arginin, Prolin und Isoleucin erreicht (EP 1,092,776). In der Literatur (Xie et al . Biotechnol. Letters 23 (2001) 111-117; Gokarn et al . Biotechnol. Letters 20 (1998) 795-798; Gokarn et al . Applied Environm. Microbiol. 66 (2000) 1844-1850; Gokarn et al . Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195; EP
1,092,776) ist keine erhöhte Bildung von aromatischen Aminosäuren oder von Metaboliten aus dem Aromatenbio- syntheseweg beschrieben.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem eine Produktion von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosynthesewegs erreicht werden kann. Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, aromatische Aminosäuren sowie Metabolite des aro- matischen Aminosäurebiosyntheseweges mikrobiell herzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von L-Phenylalanin. Unter aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges im Sinne der Erfindung, im folgenden auch als „Substanzen" bezeichnet, sind insbesondere die aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tryptophan und L-Tyrosin zu verstehen. Unter Metaboliten aus dem aromatischen Amino- saurebiosyntheseweg seien darunter auch von 3-Desoxy-D-
Arabino-Heptulosonat-7-Phosphat (DAHP) abgeleitete Verbindungen wie beispielsweise D-Arabino-Heptulosonat (DAH) , Shikimisäure, Chorisminsäure und alle ihre Derivate, Cyclohexadientransdiole, Indigo, Indolessigsäure, Adipinsaure, Melanin, Chinone, Benzoesaure, sowie deren potentielle Derivate und Folgeprodukte zu verstehen. Es sei dabei bemerkt, daß für die Herstellung von Indigo, Adipinsaure und anderen nicht natürlichen Folgeprodukten neben den erfindungsgemäßen Eingriffen weitere ge- netische Veränderungen an den die Substanzen produzierenden Mikroorganismen notwendig sind. Jedoch sollen damit alle Verbindungen umfaßt sein, deren biochemische Synthese durch die erhöhte Bereitstellung von PEP begünstigt wird.
Die Erfinder fanden überraschenderweise heraus, daß nach Einbringen einer pyc-Gensequenz in Mikroorganismen, die natürlicherweise keine Pyruvatcarboxylase aufweisen, bzw. nach Verstärkung einer vorhandenen pyc- Gensequenz, in verbesserter Weise aromatische Aminosäuren sowie Metabolite des aromatischen Biosyntheseweges produziert werden konnten.
Im Rahmen der Erfindung werden im folgenden alle Gensequenzen, die für eine Pyruvatcarboxylase codieren unter der Bezeichnung „pyc-Gensequenz" zusammengefaßt.
Unter dem Begriff „Einbringen" sollen im Rahmen dieser Erfindung also alle Verfahrensschritte verstanden werden, die dazu führen, daß in Mikroorganismen, die keine pyc-Gensequenz aufweisen, eine pyc-Gensequenz eingefügt wird. Weiterhin kann unter dem Begriff "Einbringen" aber auch eine Verstärkung einer bereits vorhandenen pyc-Gensequenz verstanden werden.
Eine Reihe verschiedener Nachweismethoden sind für die Enzymaktivität von Pyruvatcarboxylasen beschrieben. Das Testprinzip ist der Nachweis des aus Pyruvat gebildeten Oxalacetats. Das Enzym Pyruvatcarboxylase katalysiert die Carboxylierung von Pyruvat und bildet dabei Oxalacetat . Die Aktivität einer Pyruvatcarboxylase ist abhängig von Biotin als prosthetischer Gruppe am Enzym und außerdem abhängig von ATP und Magnesiumionen. Im ersten Reaktionsschritt wird ATP in ADP und anorgani- sches Phosphat gespalten. Dabei wird der Enzym- Biotinkomplex durch Hydrogencarbonat carboxyliert . Im zweiten Schritt wird die Carboxylgruppe vom Enzym- Biotinkomplex auf Pyruvat übertragen. Dabei wird Oxalacetat gebildet. Die Pyruvatcarboxylase von Brevibacterium lactofermen- tum läßt sich beispielsweise in durch Ultraschallbehandlung erhaltenen Rohextrakten nachweisen, indem gekoppelte Enzymtests mit Malatdehydrogenase oder Citrat- synthase durchgeführt werden, die jeweils als Nachweis für das gebildete Oxalacetat dienen (Tosaka et al . Agric. Biol.Che . 43 (1979) 1513-1519). Die Pyruvatcarboxylase aus Methanococcus jannaschii wurde durch eine Kopplung mit Malatdehydrogenase nachgewiesen (Mukhopadhyay et al . Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414) .
In Zellen von Corynebacterium glutamicum, die durch He- xadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) permeabilisiert worden waren, wurde die Pyruvatcarboxylase-Aktivität in einem diskontinuierlichen Verfahren durch Kopplung an eine Glutamat-Oxalacetat-Transaminase nachgewiesen (Peters-Wendisch et al. Microbiology 143 (1997) 1095- 1103) .
Ebenfalls in durch CTAB permeabilisierten Zellen von C. glutamicum verwendeten Uy et al . (Journal of Microbi- ological Methods 39 (1999) 91-96) ein diskontinuierliches Verfahren mit Bestimmung der restlichen Pyruvat- konzentration durch Lactatdehydrogenase und fluoro- metrische Bestimmung der Umsetzung von Pyruvat und NADH zu Laktat und NAD. In rekombinanten E . coli-Zellen, die die pyc-Gensequenz aus Rhizobium etli exprimierten, wurde die Pyruvatcarboxylase-Aktivität in Rohextrakten durch Kopplung mit dem Enzym Citratsynthase und spektrophotometrischem CoenzymA-Nachweis bei 412 nm durch Bildung von Thio- nitrobenzoat bestimmt (Gokarn et al . Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001)188-195; Payne & Morris J. Gen. Microbiol. 59 (1969) 97-101).
Die Aktivität der menschlichen Pyruvatcarboxylase und der rekombinanten Hefe-Pyruvatcarboxylase wurde durch die Fixierung radioaktiv markierten 14C-Carbonats nachgewiesen (Jitrapakdee et al . Biochem. Biophys. Res . Commun. 266 (1999) 512-517; Irani et al . Biotechnol. Bioengin. 66 (1999) 238-246) .
Durch die Verstärkung der Pyruvatcarboxylase-Aktivität bzw. die erstmalige Bereitstellung der Pyruvatcarboxylase in Mikroorganismen, wird vermutlich eine erhöhte intrazelluläre Verfügbarkeit von Phosphoenolpyruvat
(PEP) bewirkt, so daß dieses nicht mehr für anapleroti- sche Reaktionen verbraucht wird. Dies kann dann zu einer verbesserten mikrobiellen Synthese von Substanzen führen, die von PEP abgeleitet werden, insbesondere aromatischen Aminosäuren sowie anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges. Wie von den Erfindern gezeigt werden konnte, wurde durch das Einbringen einer pyc-Gensequenz in Mikroorganismen eine verbesserte mikrobielle Synthese von Substanzen be- wirkt, die vom PEP abgeleitet werden. Insbesondere DAHP bzw. sein Abbauprodukt, DAH, wurde in verstärktem Maße im Kulturüberstand wiedergefunden, wenn der zweite Schritt des Aromatenbiosyntheseweges durch eine Mutation des aroB-Gens blockiert ist. DAHP, welches durch Kondensation von PEP und Ery4P synthetisiert wird, bildet die Ausgangssubstanz für aromatische Aminosäuren sowie andere Metabolite des aromatischen Aminosäurebio- syntheseweges. DAHP bzw. DAH werden in der Literatur als Anzeichen für eine verstärkte PEP-Verfügbarkeit diskutiert (Frost und Draths Annual Rev. Microbiol. 49 (1995), 557-579; Flores et al . Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623; Bongaerts et al . Metabolie Engineering 3 (2001) 289-300)
Der Begriff „Verstärkung" der pyc-Gensequenz beschreibt im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung die Erhöhung der Aktivität der Pyruvatcarboxylase. Zu diesem Zweck können beispielhaft folgende Maßnahmen genannt werden:
- Einführung der pyc-Gensequenz z. B. mittels Vektoren oder temperenter Phagen;
- Erhöhung der für die Pyruvatcarboxylase (pyc-
Gensequenz) codierenden Genkopienzahl z. B. mittels Plasmiden mit dem Ziel die pyc-Gensequenz in erhöhter Kopienzahl, von leicht (z. B. 2- bis 5-fach) bis zu stark erhöhter Kopienzahl (z. B. 15- bis 50- fach) , in den Mikroorganismus einzubringen;
- Erhöhung der Genexpression der pyc-Gensequenz z. B. durch Steigerung der Transkriptionsrate z. B. durch
Verwendung von Promotorelementen wie z. B. Ptac, Ptet oder anderen regulatorischen Nucleotidsequenzen und/oder durch Steigerung der Translationsrate z. B. durch Verwendung einer Konsensusribosomenbindungs- stelle;
- Zusatz von Biotin zum Fermentationsmedium, um die
Zellen besser mit der für die Pyruvatcarboxylase essentiellen prosthetischen Gruppe Biotin zu versorgen oder Verstärkung vorhandener Enzyme, die zur Biotin-Biosynthese befähigt sind bzw. Einführung dieser Enzyme in den Mikroorganismus . Durch die Verwendung von induzierbaren Promotorelementen, z. B. laclq/ Ptac, besteht die Möglichkeit der Zuschaltung neuer Funktionen (Induktion der Enzymsynthe- se) , z. B. durch Zugabe von chemischen Induktoren wie Isopropylthiogalactosid (IPTG) .
Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der pyc- Gensequenz durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Auch die Zugabe es- sentieller Wuchsstoffe zum Fermentationsmedium kann eine verbesserte Produktion der Substanzen in Sinne der Erfindung bewirken.
Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenso die Expression verbessert. Weiterhin wird auch durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins die Enzymaktivität verstärkt. Erhöhung der endogenen Aktivität einer vorhandenen Pyruvatcarboxylase (z. B. in Bacillus subtilis oder Corynebakterien) z. B. durch Mutationen, die nach klassischen Methoden unge- richtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch
UV-Bestrahlung oder mutationsauslösende Chemikalien, oder durch Mutationen, die gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion (en) , Insertion (en) und/oder Nucleotidaustausch(e) erzeugt werden. Auch Kombinationen der genannten und weiteren, analogen Methoden können zur Erhöhung der Pyruvatcarboxylaseakti- vität eingesetzt werden.
Bevorzugt erfolgt das Einbringen der pyc-Gensequenz dadurch, daß eine Integration der pyc-Gensequenz in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen erfolgt, wobei die pyc-Gensequenz als einzelne Kopie oder in erhöhter Kopienzahl in die Genstruktur eingebracht wird. Als „Genstruktur" ist jedes Gen oder jede Nucleotidse- quenz zu verstehen, welche eine pyc-Gensequenz trägt. Entsprechende Nucleotidsequenzen können beispielsweise Plasmide, Vektoren, Chromosomen, Phagen oder andere, nicht zirkulär geschlossene, Nucleotidsequenzen sein. Beispielsweise kann die pyc-Gensequenz auf einem Vektor in die Zelle eingebracht werden oder in ein Chromosom inseriert werden oder durch einen Phagen in die Zelle eingebracht werden. Andere Kombinationen von Genverteilungen sollen durch diese Beispiele nicht von der Erfindung ausgeschlossen werden. Für den Fall, daß bereits eine pyc-Gensequenz vorhanden ist, sollte die Anzahl der in der Genstrukur enthaltenen pyc-Gensequenzen die natürliche Anzahl übersteigen.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete pyc- Gensequenz kann z. B. aus Rhizobium (Gokarn et al . Appl. Microbiol. Biotechnol. 56 (2001) 188-195), Brevi- bacterium, Bacillus, Mycobacterium (Mukhopadhyay und Purwantini Biochimica et Biophysica Acta 1475 (2000) 191-206), Methanococcus (Mukhopadhyay et al . Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414), Saccharomyces cerevisiae (Irani et al . Biotechnology and Bioengineering 66 (1999) 238-246) Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Campylo- bacter oder Methanococcus jannaschii (Mukhopadhyay et al. Arch. Microbiol. 174 (2000) 406-414) stammen. Vorteilhaft hat sich eine pyc-Gensequenz aus Corynebacte- rium-Stämmen, insbesondere aus Corynebacterium glutami- cum (Peters-Wendisch et al . Microbiology 144(1998) 915- 927; Peters-Wendisch et al . J. Mol. Microbiol. Biotech- nol. 3 (2001) 295-300), erwiesen. Ebenso geeignet sind Gene für Pyruvatcarboxylasen aus anderen Organismen. Der Fachmann weiß, daß weitere pyc-Gensequenzen aus allgemein zugänglichen Datenbanken identifizierbar sind (wie z. B. EMBL, NCBI, ERGO) und durch Techniken der Genklonierung, z. B. unter Einsatz der Polymeraseket- tenreaktion PCR aus solchen anderen Organismen klonier- bar sind.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden Mikroorganismen eingesetzt, in die in replizierbarer Form eine pyc- Gensequenz eingebracht wurde .
Als Mikroorganismen für die Transformation mit einer pyc-Gensequenz eignen sich Organismen aus der Familie der Enterobacteriaceae wie z. B. Escherichia-Arten, sowie aber auch Mikroorganismen der Gattungen Serratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium und weitere aus klassischen Aminosäureverfahren bekannte Stämme. Besonders geeignet ist Escherichia coli.
Bei der DSMZ wurde gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages am 22.03.2002 der folgende Stamm hinterlegt: Escherichia coli K-12 LJ110 aroB/pF36 unter der Nummer DSM 14881.
Die Transformation der Mikroorganismen bzw. Wirtszellen kann durch chemische Methoden (Hanahan D, J. Mol. Biol . 166 (1983) 557-580) , sowie auch durch Elektroporation, Konjugation, Transduktion oder durch Subklonierung aus in der Literatur bekannten Plasmidstrukturen erfolgen. Im Falle z. B. der Klonierung der Pyruvatcarboxylase aus Corynebacterium glutamicum eignet sich beispiels- weise die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur gerichteten Amplifikation der pyc-Gensequenz mit chromosomaler DNS aus Corynebacterium glutamicum Stämmen. Es ist vorteilhaft für die Transformation Mikroorganismen einzusetzen, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebio- syntheseweges beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind. Insbesondere werden transformierte Zellen verwendet, die in der Lage sind, eine aromatische Aminosäure zu produzieren, wobei die aromatische Aminosäure vorzugsweise L-Phenylalanin ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können in Mikroorganismen mit einer pyc-Gensequenz die Gene, die für Enzyme codieren, die mit der Pyruvatcarboxylase um PEP konkurrieren, wie z. B. die PEP-Carboxylase, das PEP-abhängige Zuckerphosphotransferasesystem (PTS) oder Pyruvatkinasen, einzeln oder im Verbund in ihrer Expression erniedrigt bzw. inaktiviert oder völlig ausgeschaltet werden und diese Mikroorganismen eingesetzt werden. So kann die Bereitstellung von PEP für die Syn- these aromatischer Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges weiter verbessert werden und damit die Herstellung dieser Verbindungen verbessert werden. Diese vorteilhafte Ausfuhrungsform schließt auch ein, daß die Aktivität eines Transportproteins zur PEP unabhängigen Aufnahme von Glucose in Mikroorganismen mit einem PEP-abhängigen TransportSystem für Glucose, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, erhöht wird. Die zusätzliche Integration eines PEP-unabhängigen Transportsystems erlaubt eine erhöhte Bereitstellung von Glucose in dem die Substanzen produ- zierenden Mikroorganismus. PEP als Energie-Donor wird für diese Umsetzungen nicht benötigt und steht damit, ausgehend von einem konstanten Stofffluß in der Glyko- lyse und dem Pentosephosphatweg, vermehrt für die Kondensation mit Erythrose-4-Phosphat (Ery-4-P) zum primä- ren Metaboliten des allgemeinen Biosyntheseweges für aromatische Verbindungen wie z. B. Desoxy-D-arabino- heptulosonat-7-phosphat (DAHP) zur Verfügung und in der Folge für die Produktion von beispielsweise aromatischen Aminosäuren, wie z. B. L-Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan.
Die vorteilhafte Verwendung eines PEP-unabhängigen Zuckertransportsystems, eines Glucosefacilitator-Proteins (Gif) sowie der Gene für Transketolase, Transaldolase und Glucokinase wurde bereits in früheren Patentanmel- düngen gezeigt (DE 19644566.3, DE 19644567.1, DE 19818541 AI ; US 6,316,232)
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von Substanzen können in einer bevorzugten Ausführung Mikroor- ganismen eingesetzt werden, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind. Dies sind insbesondere die Enzyme des aromatischen Aminosäurestoffwechsels und vor allem die DAHP-Synthase (z. B. in E. coli AroF oder AroH) , die Shikimatkinase und die Chorismatmutase/ Prephenatde- hydratase (PheA) . Auch alle anderen Enzyme, die an der Synthese aromatischer Aminosäuren bzw. Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosynthesewegs und deren Folgeprodukten beteiligt sind können verwendet werden.
Für die Herstellung von Metaboliten des aromatischen
Aminosäurebiosyntheseweges und deren Derivaten wie beispielsweise Adipinsaure, Gallensäure und Chinonverbin- dungen, sowie deren Derivate hat sich neben der pyc- Gensequenz besonders die deregulierte und überexpri- mierte DAHP-Synthase als geeignet erwiesen. Zur erhöhten Synthese von beispielsweise L-Tryptophan, L-Tyrosin, Indigo, Derivaten von Hydroxy- und Aminoben- zoesäure und Naphtho- und Anthroquinonen, sowie deren Folgeprodukte sollten zusätzlich die Shikimatkinase de- reguliert und in ihrer Aktivität erhöht werden. Für eine effiziente Produktion von Phenylalanin, Phe- nylbrenztraubensäure und deren Derivaten ist zusätzlich eine deregulierte und überexprimierte Chorismatmutase/- Prephenatdehydratase von besonderer Bedeutung . Jedoch sollen damit auch alle anderen Enzyme umfaßt sein, deren Aktivitäten zur mikrobiellen Synthese von anderen Metaboliten als die aus dem aromatischen Aminosäurebiosyntheseweg beitragen, das heißt Verbindungen deren Produktion durch die Bereitstellung von PEP begünstigt wird, z. B. CMP-Ketodesoxyoctulosonsäure,
UDP-N-Acetylmuraminsäure, oder N-Acetyl-Neuraminsäure . Die vermehrte Bereitstellung von PEP kann sich dabei nicht nur positiv auf die Synthese von DAHP auswirken, sondern kann auch die Einführung einer Pyruvat-Gruppe bei der Synthese von 3-Enolpyruvoylshikimat-5-phosphat als Vorläufer von Chorismat begünstigen. Für die Herstellung von Indigo, Adipinsaure, Cyclohexadientransdi- ölen und anderen nicht natürlichen Folgeprodukten sind neben den erfindungsgemäßen Verfahrensmerkmalen weitere genetische Veränderungen an den Substanzen produzierenden Mikroorganismen notwendig.
Im folgenden sollen die verwendeten Materialien und Methoden angegeben, sowie die Erfindung durch experimentelle Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert wer- den:
Figur 1 zeigt die Verknüpfungen zwischen dem Zentral- Stoffwechsel und dem aromatischen Aminosäurebiosynthe- seweg von Bakterien unter Hervorhebung der Reaktionen des Phosphoenolpyruvats und Pyruvats.
Reaktion 1 bezeichnet die Pyruvatcarboxylase-Reaktion, Reaktion 2 die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase Reaktion und Reaktion 3 das PEP-abhängige Zuckerphosphotransfe- rase-System (PTS) .
CHD = Cyclohexadiencarboxylattransdiole DAHP = 3-Desoxy-Arabino-Heptulosonat-7-Phosphat DAH = 3-Desoxy-Arabino-Heptulosonat DHAP = Dihydroxyacetonphosphat 2,3-DHB = 2 , 3-Dihydroxybenzoat
EPSP = Enol-Pyruvoyl-Shikimat-Phosphat GA3-P = Glyceraldehyd-3-Phosphat pABA = para-Aminobenzoat PEP = Phosphoenolpyruvat Fig. 2 zeigt beispielhaft experimentelle Daten des Py- ruvatcarboxylase-Aktivitätsnachweises . Dabei gibt die Abszisse X die Zeit in Sekunden wieder und die Ordinate Y die Extinktion bei einer Wellenlänge von 412 nm. Die durch schwarz ausgefüllte Rauten dargestellten Meßpunkte sind Ergebnisse, die mit E. coli Zellen, die mit einem pyc-Vektor transformiert wurden, erhalten wurden. Die mit einem nicht ausgefüllten Quadrat dargestellten Meßpunkte, geben die Ergebnisse der E. coli Zellen wie- der, die mit einem Leervektor ohne pyc-Gensequenz transformiert wurden. Die grau durchgezogene Linie gibt die Regressionsgerade wieder.
Tab. 1. Verwendete Plasmide und Bakterienstämme
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Beispiel 1: Klonierung der pyc-Gensequenz, Expression in Escherichia coli-Stä men
Die erste Klonierung der pyc-Gensequenz aus Corynebac- teriu glutamicum ATCC13032 ist beschrieben unter Peters-Wendisch et al. Microbiology 144 (1998) 915-927. Die Subklonierung der pyc-Gensequenz in den Expressionsvektor pVWExl -pyc ist beschrieben in Peters-Wendisch et al . J.Mol. Microbiol .Biotechnol . 3 (2001) 295-300. Aus dem Vektor pVWExl-pyc wurde durch Restriktion mit den Enzymen SphI und Hindlll ein 3,7 kb DNA-Fragment mit der pyc-Gensequenz aus C. glutamicum erhalten. Dieses 3.7kb Fragment wurde mit dem Vektor pACYCPtac (SphI plus Hind III-restringiert) ligiert. Die Transformation erfolgte in den E. coli-Stamm DH5α. Die Selektion erfolgte auf LB-Platten mit Chloramphenicol (25 mg/1) . Plasmide mit dem korrekten Insert wurden als pF36 bezeichnet . Die Einführung von Defektmutationen in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren erfolgte durch Pl-vermittelte Transduktion. Die Defekte für die beiden Shikimatkina- sen { aroL und aroK) wurden durch nacheinander erfolgende Pl-Transduktion aus dem Stamm DV80 (aroK: :kan, aroL::Tnl0, Vinella et al . Journal of Bacteriology 178 (1996) 3818-3828) erzeugt. Dazu wurde der Wildtyp-Stamm E.coli K-12 LJ110 zuerst auf Kanamycinresistenz selek- tioniert (Erhalt des aroK: :Kan-Markers) . In einer zweiten Pl-Transduktion erfolgte dann Selektion auf den Erhalt des Tetrazyklin-Resistenzmarkers (Erhalt des aroL: :Tnl0-Markers) . Zellen, die beide Resistenzen aufwiesen, wurden anschließend auf Auxotrophie für die a- romatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L- Tryptophan (je 40 mg/1) und auf Auxotrophie für p- Aminobenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure und 2, 3-Dihydroxybenzoesäure (je 20mg/l) überprüft. Mutanten mit einem Defekt in aroB wurden erhalten, in dem eine Pl-Transduktion aus dem Donorstamm AB2847 rpe::Km aroB in den Stamm LJ110 erfolgte. Im ersten Schritt wurde dabei auf Kanamycin-Resistenz selektioniert . Bakterien, die außerdem auxotroph für aromatische Aminosäuren und für Shikimat waren { aroB-negativ) wurden weiter verwendet. In einer zweiten Pl-Transduktion (mit einem Pl-Lysat aus dem Wildtypstamm LJ110) wurde auf Verwertung von Pentose-Zuckern auf Minimalmedium selektioniert. Der rpe : :Km-Defekt führt zu pentose-negativem Phänotyp, Erhalt von rpe führt zu Pentoseverwertung. Zellen, die pentose-positiv wurden, aber aromatenau- xotroph blieben (aroB) wurden als LJ110 aroB weiter verwendet (Marco Krämer, Dissertation, Universität Düsseldorf, 1999, S.34) . Der Stamm LJ110 Δppc wurde durch die cross-over-PCR- Methode von Link et al . (Link et al . J. Bacteriol . 179 (1997) 6228-6237) hergestellt. Die zur PCR- Amplifikation verwendeten Oligonukleotidprimerpaare waren: Aussenprimer Nin 5 'GTTATAAATTTGGAGTGTGAAGGTTATTGCGTGCATATTACCCCAGACACCCC ATCTTATCG 3 " (Seq. ID. No . 1) und Innenprimer Nout
5'TTGGGCCCGGGCTCAATTAATCAGGCTCATC 3" (Seq. ID. No . 2) für den 5 'Bereich vor dem ppc-Gen. Sowie für den 3 'Bereich hinter dem ppc-Gen: Aussenprimer Cout 5'GAGGCCCGGGTATCCAACGTTTTCTCAAACG 3" (Seq. ID. No . 3) und Innenprimer Cin
5 'CACGCAATAACCTTCACACTCCAAATTTATAACTAATCTTCCTCTTCTGCAAA CCCTCGTGC 3' (Seq. ID. No 4) . Das durch PCR erzeugte DNA-Fragment enthielt eigens eingefügte Schnittstellen für das Restriktionsenzym XmaCI . Durch Klonierung in die XmaCI-Stelle des Vektors pK03 wurde eine in-frame- Deletion des ppc-Gens erzeugt und dann über die be- schriebene Methode (Link et al . J. Bacteriol . 179
(1997) 6228-6237) in den Stamm LJ110 eingeführt. Nach Selektion auf Saccharoseresistenz wurden Stämme erhalten, die auxotroph für die Zugabe von C4-Substraten wie Succinat oder Malat sind. Die korrekte chromosomale De- letion {Appc) wurde durch PCR mit chromosomaler DNS aus diesen Mutanten bestätigt. Die korrekten Mutanten wur-
« den als LJ110 Appc bezeichnet.
Beispiel 2 : Nachweis der Pyruvatcarboxylase-Aktivität
Im folgenden ist beispielhaft die Durchführung des en- zymatischen Pyruvatcarboxylase-Tests in rekombinanten Escherichia coli-Zellen beschrieben. Zellen von Escherichia coli LJ110 Appc, die entweder mit dem Leervektor (Kontrollvektor ohne pyc-Gensequenz) pACYCtac oder mit dem pyc-enthaltenden Vektor pF36 transformiert worden waren, wurden in einem Minimalmedium (s. Vorkulturmedium Tab. 2) mit 0.5% Glucose und Chloramphenicol (25 mg/1) angezogen. Dem Medium wurde Biotin (200 μg/1) zugesetzt, um das Biotin-Bedürfnis der Pyruvatcarboxylase zu erfüllen. Da die Zellen einen PEP-Carboxylase-Defekt haben, wurde dem Minimalmedium 0.5 g/1 Natrium-Succinat zugesetzt. Die Kulturen wurden in Schüttelkolben (500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml Füllvolumen) bei 37°C 6 Stunden auf einem Rundschüttler (200 Umdrehungen pro Minute) inkubiert, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm (OD600)von 1 bis 1,5 erreicht hatten (spät-exponentielle Wachstumsphase) . Zur Induktion der Pyruvatcarboxylase wurde den Kulturmedien IPTG zu einer Endkonzentration von 100 μM zugesetzt. Nach Erreichen der angegeben optischen Dichte wurden die Kulturen durch Zentrifugation geerntet. Die so erhaltenen Sedimente wurden zweimal mit 100 mM TrisHCl-Puffer (pH 7.4) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen im gleichen Puffer resuspendiert und es wurde eine Zellkonzentration eingestellt, die eine OD6oo von 5 in 1 ml Puffer aufwies. Derartige Proben wurden mit 10 μl Tolu- ol/ml versetzt und 1 Minute lang auf einem Vortex- Apparat gemischt. Anschließend erfolgte Inkubation bei 4°C (auf Eis) für 10 Minuten. Dadurch wurden die Zellen permeabilisiert . Für den anschließenden Pyruvatcarboxy- lase-Test wurden die Zellen in 100 μL-Aliquots eingesetzt .
Das Testprinzip ist der Nachweis des aus Pyruvat und Hydrogencarbonat gebildeten Oxalacetats (OAA) über eine Kopplung mit dem Hilfsenzym Citratsynthase und Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) nach folgenden Reaktionen:
Pyruvat + HC03 ' +ATP-> OAA + ADP + V± (1)
OAA + Acetyl-CoA → Citrat + HS-CoA" (2)
HS-CoA + DTNB - CoA-Derivat + TNB2- (3) OAA = Oxalacetat
DTNB = Dithionitrobenzoesäure
TNB2" = 5-Thio-2-Nitrobenzoat
CoA-Derivat = gemischtes Disulfid aus CoA und Thio- nitrobenzoesäure
Pyruvat wird durch die Pyruvatcarboxylase Pyc unter ATP-Hydrolyse zum Oxalacetat (OAA) umgesetzt (1) . Das gebildete OAA wird mit Acetyl-CoA über die Citrat- synthase-Reaktion (2) zu Citrat und CoenzymA (HS-CoA) umgesetzt. Der Pyc-Aktivitätsnachweis beruht auf der Reaktion (3) des freiwerdenden CoenzymA (HS-CoA) mit Dithionitrobenzoesäure zu einem gemischten Disulfid von CoA und Thionitrobenzoesäure sowie einem molaren Äquivalent an gelbgefärbtem 5-Thio-2-Nitrobenzoat (TNB2~) . Dieses hat einen molaren Extinktionskoeffizienten von 13,6 rrϋYT1 cm"1 und kann photometrisch bei einer Wellen- länge von 412 nm nachgewiesen werden. Die Bildungsrate von TNB2" korreliert direkt mit der Acetylierung von OAA und somit mit dem Umsatz von Pyruvat zu OAA durch Pyruvatcarboxylase . Der Testansatz enthielt in 1 mL: NaHC03 (25 mM) , MgCl2 (ImM) , Acetyl-CoA (0,2 πiM) , DTNB (0,2mM), ATP (4mM) , Citratsynthase (1U = 1 Einheit), Zellsuspension (0,5 OD600) , Testpuffer (100 mM Tris-HCl pH 7,3) . Die Ansätze wurden in einem 2 mL Eppendorf- Reaktionsgefäß für 2 Minuten auf 25°C vorgewärmt. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe von Pyruvat
(5mM) .
Zum Stoppen der Reaktion zu den entsprechenden Zeitpunkten wurden die Reaktionsgefäße in flüssigen Stickstoff überführt und während des Auftauprozesses wurde die Biomasse durch Zentrifugation bei 4°C und 15.300 rpm abgetrennt . In den klaren Überständen wurde die Extinktion bei 412 nm photometrisch bestimmt. Als Referenz dienten Ansätze ohne Pyruvat.
Aus den in Figur 2 gezeigten Daten ergibt sich eine Extinktionszunahme [E412] von 0,029 pro Minute und somit eine absolute Pyruvatcarboxylaseaktivität von 210 mU/mL. Bezogen auf die eingesetzte Zellzahl von OD60o= 0,5 ergibt sich daraus eine spezifische Pyc-Aktivität von 42 mU/θD6oo- In den Kontrollen wurde keine Pyc- Aktivität festgestellt.
Beispiel 3 : Fermentation zur Gewinnung von PAH mit re- kombinanter Pyruvatcarboxylase.
Als erster Metabolit für den AromatenbioSyntheseweg kann durch eine aroB-Mutation die Anhäufung von DAH (Abbauprodukt von DAHP) nachgewiesen werden. Es wurden die Stämme E. coli K-12 LJ110 aroB/pF36 (= DSM14881, „PYC") und der Kontrollstamm E. coli K-12 LJ110 aroB/pACYCtac (Leervektor, „LV") verwendet. Die Durchführung erfolgte in 6 parallel geschalteten Sixfors Va- rio-Laborfermenter (2 Liter) mit einem Füllvolumen von 1,5 L.
Die Untersuchungen wurden mit folgenden MedienZusammensetzungen und unter folgenden Fermentationsbedingungen durchgeführt :
Medien:
Tab. 2: Vorkulturmedium:
Figure imgf000030_0001
Tab. Fermentationsmedium:
Figure imgf000030_0002
Feedmedium: Glucose: 454 g/L
Fermentationsbedingungen und Versuchsdurchführung
■ Fedbatch (6-fach Parallelansatz im gerührten und be- gasten Bioreaktor „Sixfors-Vario" der Firma Infors, mit Abgasanalytik der Firma Rosemount) ■ Dauer: 30 h
■ Temperatur [°C] : 37 (geregelt)
■ pH: 6,5 (geregelt)
■ p02: 30 % (geregelt)
■ Titrationsmittel: 25 % NH3 " Induktionsmittel: IPTG (100 μmol/L) , wird vorgelegt
■ Anfangsvolumen: 1,5 L
■ Startbedingungen:
Rührerdrehzahl: 500 rpm, Flussrate 0,5 L/min - In der Anwachsphase stufenweises Erhöhen der Rührerdrehzahl und der Flussrate (max. 1,5 L/min), bei Erreichen von 900 bis 1000 rpm Einschalten der p02- Regelung über die Rührerdrehzahl
Probenahme alle 2 Stunden ( Bestimmung von: OD52o, Glucosekonzentration mittels „Accutrend" der Firma Röche, pH-offline, Biotrockenmasse BTM) , Aufbewahrung von Fermentationsüberstand und Pellet, (Kontrolle der Plasmidstabilität über die gesamte Prozesszeit) . - Startkonzentration Glucose im Fermenter: 13,64 g/L, keine Regelung der Glucosekonzentration im Fermen- ter, sondern offline-Ermittlung und entsprechender Start des Dosiersystems Fed-batch -Pro der Firma DASGIP, Jülich bei Restmenge von ca. 4 g/L und manuelle Anpassung der Dosierrate, so dass 5 g/L möglichst nicht überschritten wird.
Prozessdatenerfassung über LabView (National Instruments) ■ Stämme: E. coli K-12 LJ110 aroB / pF36 („PYC")
E. coli K-12 LJ110 aroB / pACYCtac („LV")
Die folgende Tabelle 4 gibt die Ergebnisse der Fermentationen wieder.
Tabelle 4: Fermentationsergebnisse zur Gewinnung von DAH mit rekombinanter Pyruvatcarboxylase
Ausbeuten (bezogen auf die verbrauchte Glucose; [mol Produkt/ mol Glucose]) der Stämme: J110 aroB-/pF36 (Pyc-Stamm) und LJ110 aroB-/pACYCtac (Kontrolle mit Leervektor)
Figure imgf000033_0001
Aus den Fermentationsergebnissen wird erkennbar, daß durch das Einbringen der pyc-Gensequenz in E. coli eine deutliche Zunahme der Ausbeute an DAH zu verzeichnen war. Die mit der pyc-Gensequenz transformierten Organismen wiesen eine mindestens 2,5-fache Steigerung der Ausbeute von DAH gegenüber den Kontrollorganismen auf, die mit dem Leervektor (Kontrollvektor ohne pyc- Gensequenz) transformiert wurden bzw. deren Pyruvatcarboxylase nicht durch die Zugabe von IPTG induziert wurde .

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges , gekennzeichnet durch, Einbringen einer pyc-Gensequenz in einen Mikroorganismus und Verwendung dieses Mikroorganismus.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die pyc-Gensequenz in einem Mikroorganismus verstärkt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopienzahl der pyc-Gensequenz in einem Mikroorganismus erhöht wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression der pyc-Gensequenz in einem Mikroorganismus erhöht wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine pyc-Gensequenz verwendet wird, die aus einem Organismus aus der Gruppe der Corynebakterien, Rhizobien, Brevibacterien, Bacillus, Mycobakterien, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Ca pylobacter, Me- thanococcus oder Saccharomyces Stämmen stammt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine pyc-Gensequenz verwendet wird, die aus Corynebacterium glutamicum stammt .
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Herstellung Substanzen aus der Gruppe der aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges be- trifft.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Herstellung die Substanzen L—Phenylalanin, L-Tryptophan sowie L-Tyrosin betrifft.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen aus der Gruppe der Enterobacte- riaceae, Serratia Stämme, Bacillus Stämme, Coryne- bakterium Stämme sowie Brevibacterium Stämme einge- setzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß Escherichia coli eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren eine Fermentation der Mikroorganismen in einem Medium, enthaltend Komponenten aus der Gruppe Biotin, IPTG und essentielle Wuchsstoffe, betrifft.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die pyc-Gensequenz in Genstrukturen eingebaut wird, die in Wirtszellen eingebracht sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein PEP verbrauchendes Enzym in einem Mikroorganismus ausgeschaltet oder inaktiviert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Enzym aus der Gruppe PEP- Carboxylasen, PEP abhängige Zuckerphosphotransfera- sen (PTS) sowie Pyruvatkinasen in einem Mikroorga- nismen ausgeschaltet oder inaktiviert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein PEP unabhängiges Transportsystem für die Glucoseaufnahme in einen Mikroorganismus einge- bracht wird und dieser Mikroorganismus verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein Glucosefacilitator-Protein (Gif) in einen Mikroorganismus eingebracht wird und dieser Mikroorganismus verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß ein Glucosefacilitator-Protein aus Zymomonas mobilis in einen Mikroorganismus eingebracht wird und dieser Mikroorganismus verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß Zuckertransportgene in einen Mikroorganismus eingebracht werden und dieser Mikroorganismus verwendet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Transaldolase und/oder Transketolase in einen Mikroorganismus eingebracht wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Transketolase A und/oder Transketolase B aus E.coli in einen Mikroorganismus eingebracht wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß eine Deregulierung und/oder Verstärkung der En- zyme aus der Gruppe DAHP-Synthase, Shikimatkinase, Chorismatmutase oder Prephenatdehydratase in einem Mikroorganismus durchgeführt wird.
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