CN118302521A - 特别适合用于发酵制备邻氨基苯甲酸的3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及3‑脱氧阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸合酶的特定变体用于通过微生物发酵制备邻氨基苯甲酸的用途和适用于该目的的微生物。

Description

特别适合用于发酵制备邻氨基苯甲酸的3-脱氧阿拉伯庚酮糖 酸-7-磷酸合酶
本发明涉及3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶的特定变体用于通过微生物发酵生产邻氨基苯甲酸的用途和适用于该目的的微生物。
借助于一系列遗传修饰的微生物进行的邻氨基苯甲酸(oAB)生产是现有技术已知的，例如Balderas-Hernandez et al.(2009)"Metabolic engineering for improvinganthranilate synthesis from glucose in Escherichia coli"，WO 2015/124687和WO2017/102853。
从EP 0 077 196中已知3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶的变体，在存在芳香族氨基酸的情况下其活性与该酶的其他变体相比受到的抑制更弱。这种酶在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的应用尚未得到证实。也没有证明通过使用该基因可以提高通过发酵进行的oAB生产。
EP 2 147 972公开了DAHP合酶的变体，其与如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶的氨基酸序列不同。其也适用于WO 2018/203947、WO 2019/073033、WO 2020/270587和Bongaerts et al.,2001,"Metabolic engineering for microbial production ofaromatic amino acids",Metabolic Engineering,3:289-300。
在作为本专利申请的基础的研究中，出人意料地发现与使用其他酶变体的情况相比，在存在EP 0077196中记载的DAHP合酶变体的情况下，谷氨酸棒状杆菌生产更多的oAB。本发明及其有利的实施方案在专利权利要求书以及随后在说明书中更详细地限定。
本发明在第一实施方案中涉及具有如SEQ ID NO.11定义的氨基酸序列的3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)或其变体用于通过微生物发酵生产邻氨基苯甲酸(oAB)的用途。当本申请涉及oAB或莽草酸途径的另一种化合物的“生产”时，其是指在此过程中所讨论的化合物以工业相关量从细胞释放到周围培养基中并在其中积累的过程。在该释放和富集的过程中，优选地实现至少1g/L、更优选地至少2g/L和最优选地至少4g/L的相关化合物的细胞外浓度。在本专利申请的上下文中，化合物仅作为代谢途径的细胞内中间产物存在不是“生产”。
用途
具有如SEQ ID NO.11定义的氨基酸序列的3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)的“用途”包括所述酶在至少一种微生物细胞中重组表达，并且该重组表达所述酶的至少一种微生物细胞在能够实现细胞的代谢活性的条件下培养。
根据本发明的如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶的用途不排除微生物细胞额外包含其他遗传修饰，特别是重组表达其他蛋白质。这些修饰优选地是本申请中下文公开的那些修饰。
由于改进的3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶增加了代谢物通过整个莽草酸途径流向oAB的流量，因此在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的改进的DAHP合酶用于通过微生物发酵方式合成至少一种选自以下的化合物：3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸、3-脱氢奎尼酸(3-dehydroquinate)、3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate)、莽草酸(shikimate)、莽草酸3-磷酸(shikimate 3-phosphate)、分支酸(chorismate)、预苯酸(prephenate)和邻氨基苯甲酸。在本发明的另一个优选实施方案中，改进的3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶用于生产至少一种选自以下的化合物：甲基邻氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、香草醛、吲哚、吲哚酚、靛蓝(indigo)、扁桃酸、阿魏酸和肉桂酸。特别优选的是用于生产oAB、甲基邻氨基苯甲酸或对氨基苯甲酸。
本申请中下文给出的所有定义也适用于本实施方案。本领域技术人员理解，必须通过降低或完全阻止催化所需产物转化为次级产物的酶的活性来改造所用的微生物细胞的代谢和遗传结构(metabolische und genetische Ausstattung)以适应所需产物。
3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶
术语“3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶”是指催化莽草酸途径的第一反应的酶，即赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸反应以产生3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸和无机磷酸。EP 0077196中公开了具有根据SEQ ID NO.11的氨基酸序列的酶变体。
如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶的“变体”是通过添加、缺失或交换各个酶中存在的至多5％、优选至多2％的氨基酸而获得的酶，条件是位置76和211保持未改变。还优选的是，额外的位置10、13、147、148、150、151、179、209、211和212也保持未改变。在本发明的一个更优选的实施方案中，在变体中额外的位置144、175和215也未改变。在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，除了上述位置之外，位置92、97、165、186和268也未改变。本领域技术人员理解，如果氨基酸缺失或插入，则上述位置相应地移位。上述修饰在原则上可以在酶中的任何所需位点连续或不连续地进行。然而，它们优选地仅在多肽的N-末端和/或C-末端进行。氨基酸置换优选地是保守性置换，即其中修饰的氨基酸具有化学性质与未改变的酶中存在的氨基酸相似的残基的那些置换。因此，特别优选地将具有碱性残基的氨基酸与具有碱性残基的氨基酸交换，将具有酸性残基的氨基酸与具有同样酸性残基的氨基酸交换，将具有极性残基的氨基酸与具有极性残基的氨基酸交换，并且将具有非极性残基的氨基酸与具有非极性残基的氨基酸交换。特别优选的是，DAHP合酶的变体还具有适当的酶活性。变体的酶比活性(specific enzyme activity)特别优选地为根据SEQ ID NO.11的未修饰的DAHP合酶的比活的至少80％。
邻氨基苯甲酸
术语oAB是指邻氨基苯甲酸(ortho-aminobenzoic acid)，也称为“邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)”。由于该化合物具有具有酸性性质的羧基和具有碱性性质的氨基，因此该分子的电荷取决于pH。在本申请的上下文中，术语“邻氨基苯甲酸”是指该分子，而不管其是否具有正电荷、负电荷或无净电荷。
微生物发酵
术语“微生物发酵”是指在能够实现细胞的代谢活性的条件下，在合适的培养基中孵育一种或多种微生物细胞。特别地，这意味着设定和维持合适的pH、合适的氧饱和度、合适的温度和合适的克分子渗透压浓度(osmolarity)。本领域技术人员可以基于他们的专业知识和通常可获得的文献选择适合于所讨论的微生物的培养条件。棒状杆菌(Corynebacterium)，特别是谷氨酸棒状杆菌，优选地在6至8的pH、25℃至40℃的温度和400至2600mOsmol/kg的克分子渗透压浓度下培养。氧饱和度优选地保持尽可能接近在标准压力和标准大气下可实现的最大值。
特别地，在微生物发酵期间还向微生物细胞提供至少一种可发酵碳源。这是一种有机碳化合物，其可被细胞利用来形成oAB。优选的是，它还可以额外用作代谢的能源和微生物生物质发育的碳源。在本发明的一个实施方案中，用于形成微生物生物质和形成oAB的微生物细胞的代谢途径分离到以下程度：至少一种可发酵碳源用于能量代谢和合成代谢，并且至少另一种用于产物形成。优选的可发酵碳源选自C-5单糖、C-6单糖、二糖和三糖。优选的C-5单糖是木糖和阿拉伯糖。优选的C-6单糖是葡萄糖、果糖和甘露糖。优选的二糖是蔗糖。优选的三糖是蔗果三糖。
代谢活性优选地包括oAB的生产和/或生物质的合成，特别优选oAB的生产。允许连续监测代谢活性以实现过程控制的合适参数也是氧摄取速率。其可以例如通过氧电极连续地进行，并且无延迟地提供测量结果，其可以用于调节培养条件。
培养基
适用于培养微生物细胞(特别是棒状杆菌属种)的培养基是现有技术已知的。合适的培养基含有至少一种调节pH的缓冲液、可被所用微生物利用的无机营养物的来源(特别是氮、硫和磷)，以及所用生物体所需的微量元素。根据微生物的不同，添加维生素和/或复合培养基成分(例如蛋白胨或酵母提取物)可能是有用的。特别合适的培养基记载于本申请中包括的工作实施例中。
微生物细胞
微生物细胞优选地是细菌细胞，更优选棒状杆菌属的菌株，甚至更优选谷氨酸棒状杆菌。当在本申请的上下文中使用术语“微生物细胞”时，总是包括多个细胞，因为在合理的时间段内形成可观量的产物需要大量细胞的存在。此外，细胞的培养通常也导致细胞增殖，使得即使在培养基中存在单个细胞的情况下，也在一段时间后形成多个细胞。
微生物细胞是重组微生物细胞。这意味着该细胞包含至少一种编码并非内源性存在于所讨论的细胞中的基因(“外源基因”)的核酸序列。该外源基因也可以是内源性存在的酶的变体，其与内源性存在的酶的不同之处仅在于更高或更低的酶活性或其受到不同的调节机制。该外源基因必须以允许其表达的形式存在。这特别意味着其处在适合于相关微生物细胞的启动子的控制下。在本发明的一个实施方案中，具有适合于所讨论的微生物的启动子序列的外源基因存在于质粒中。在另一个实施方案中，将具有适合于所讨论的微生物的启动子序列的外源基因被整合到微生物细胞的基因组中。强制性地，所述重组微生物细胞包含编码具有如SEQ ID NO：11定义的序列的DAHP合酶或其变体的基因，条件是位置76和211保持未改变。
在本发明的一个优选的实施方案中，除了存在根据上文定义的SEQ ID NO.11的DAHP合酶或其变体之外，微生物细胞是这样的细胞，其与所讨论的微生物的野生型的区别至少在于以下特征：
与各自的野生型相比，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性降低，但其中必须存在残余活性。残余活性优选地为天然存在于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中的活性的10％至60％，更优选20％至50％。这优选地通过与野生型相比降低邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(trpD)的基因的表达来实现，尽管表达未被完全抑制。这优选地通过以下方式实现：通过使用与内源启动子序列相比具有较低转录活性的启动子序列，或通过更改核糖体结合位点与trpD基因的起始密码子的距离，或通过改变起始密码子本身。在本发明的一个优选实施方案中，通过缺失或失活内源邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(trpD)的基因，并用具有修饰的核糖体结合位点和任选地如SEQ ID NO.1或2(优选SEQ ID NO.2)定义的修饰的起始密码子的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的基因替换该基因，来降低邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性。邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列优选地对应于内源邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶，特别优选地如SEQ ID NO.3或其变体定义。
在一个更优选的实施方案中，微生物细胞额外地特征在于(ii)编码如SEQ IDNO.4定义的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的缺失或失活。这可以以本领域技术人员熟悉的任何方式实现，优选地通过缺失基因或其部分序列，通过引入至少一个终止密码子，或通过缺失或失活启动子序列。特别优选的是缺失基因(SEQ ID NO.5)的蛋白质编码序列的至少一部分。
在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，微生物细胞额外地特征还在于至少一个下述特征：
(iii)莽草酸激酶的活性增加。这优选地通过相应酶的表达增加来实现。在本发明的一个实施方案中，通过增强如SEQ ID NO.6或其变体定义的内源莽草酸激酶的基因的表达来增加活性。在另一个优选的实施方案中，这通过表达外源莽草酸激酶(优选地如SEQ IDNO.7或其变体定义)来实现。基因的表达增强可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现，特别是通过将相应基因的两个或更多个拷贝引入微生物中或通过使用更强的启动子来表达内源酶。用于表达外源基因或增强内源基因表达的特别优选的启动子是如SEQ IDNO.8定义的ptuf。
(iv)3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶和分支酸合酶的活性增强。优选地，这些酶具有如SEQ ID NO 9或其变体和SEQ ID NO 10或其变体定义的氨基酸序列。这优选地通过将编码这些酶的基因的额外拷贝引入微生物中来实现。ptuf启动子优选地用于控制表达。
基于邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(SEQ ID NO.3)、莽草酸激酶(SEQ ID NO.6或7)、3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶(SEQ ID NO.9)和分支酸合酶(SEQ ID NO.10)，“变体”表示通过添加、缺失或交换各酶中存在的氨基酸的至多10％、优选地至多5％而获得的酶。上述修饰在原则上可以在酶中的任何所需位点连续或不连续地进行。然而，它们优选地仅在多肽的N-末端和/或C-末端进行。氨基酸置换优选地是保守性置换，即其中修饰的氨基酸具有化学性质与未改变的酶中存在的氨基酸相似的残基的那些置换。因此，特别优选地将具有碱性残基的氨基酸与具有碱性残基的氨基酸交换，将具有酸性残基的氨基酸与具有酸性残基的氨基酸交换，将具有极性残基的氨基酸与具有极性残基的氨基酸交换，并且将具有非极性残基的氨基酸与具有非极性残基的氨基酸交换。优选地，变体的酶比活性优选地为未修饰的酶的比活的至少80％。本领域技术人员可以在文献中找到验证上述酶的活性的酶测试。
作为本发明基础的研究已经证明，具有如SEQ ID NO.11定义的氨基酸序列的3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶提高了生产菌株的生长、底物摄取、产物形成以及产物产率。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及棒状杆菌属、芽孢杆菌(Bacillus)属或假单胞菌(Pseudomonas)属的重组细胞，其包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因。优选地，所述细胞是谷氨酸棒状杆菌的菌株的细胞，更优选地谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。在芽孢杆菌属中，优选的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在假单胞菌属中，优选的是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
在本发明的一个优选的实施方案中，该细胞包含以下进一步的遗传修饰：
与各自的野生型相比，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性降低，但其中必须存在残余活性。残余活性优选地为天然存在于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中的活性的10％至60％，更优选20％至50％。这优选地通过与野生型相比降低邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(trpD)的基因的表达来实现，尽管表达未被完全抑制。这优选地通过以下方式实现：通过使用与内源启动子序列相比具有较低转录活性的启动子序列，或通过更改核糖体结合位点与trpD基因的起始密码子的距离，或通过改变起始密码子本身。在本发明的一个优选实施方案中，通过缺失或失活内源邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(trpD)的基因，并用具有修饰的核糖体结合位点和任选地如SEQ ID NO.1或2(优选SEQ ID NO.2)定义的修饰的起始密码子的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的基因替换该基因，来降低邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性。邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列优选地对应于内源邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶，特别优选地如SEQ ID NO.3或其变体定义。
在本发明的一个更优选的实施方案中，微生物细胞额外地特征在于(ii)编码如SEQ ID NO.4定义的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的缺失或失活。这可以以本领域技术人员熟悉的任何方式实现，优选地通过缺失基因或其部分序列，通过引入至少一个终止密码子，或通过缺失或失活启动子序列。特别优选的是缺失基因(SEQ ID NO.5)的蛋白质编码序列的至少一部分。
在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，微生物细胞额外地特征还在于至少一个下述特征：
(iii)莽草酸激酶的活性增加。这优选地通过相应酶的表达增加来实现。在本发明的一个实施方案中，通过增强如SEQ ID NO.6或其变体定义的内源莽草酸激酶的基因的表达来增加活性。在另一个优选的实施方案中，这通过表达外源莽草酸激酶(优选地如SEQ IDNO.7或其变体定义)来实现。基因的增强表达可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现，特别是通过将相应基因的两个或更多个拷贝引入微生物中或通过使用更强的启动子来表达存在的内源酶。用于表达外源基因或增强内源基因表达的特别优选的启动子是如SEQID NO.8定义的ptuf。
(iv)3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶和分支酸合酶的活性增强。优选地，这些酶具有如SEQ ID NO 9或其变体和SEQ ID NO 10或其变体定义的氨基酸序列。这优选地通过将编码这些酶的基因的额外拷贝引入微生物中来实现。ptuf启动子优选地用于控制表达。
上文给出的所有定义，特别是对于酶的“变体”，也适用于本实施方案。
重组微生物细胞的用途
在另一个实施方案中，本发明涉及重组细胞用于通过微生物发酵生产oAB的用途，所述重组细胞包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因，条件是位置76和211保持未改变。
本申请中上文给出的所有定义也适用于本实施方案。“用途”优选地包括在存在可发酵碳源存的情况下在合适的培养基中培养细胞，所述可发酵碳源可被该细胞转化为oAB。
在本发明的一个优选的实施方案中，重组细胞用于通过微生物发酵方式合成至少一种选自以下的化合物：3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱羟基莽草酸、莽草酸、莽草酸3-磷酸、分支酸、预苯酸和邻氨基苯甲酸。
本领域技术人员理解，必须通过降低或完全阻止催化所需产物转化为次级产物的酶的活性来改造所用的微生物细胞的代谢和遗传结构以适应所需产物。
方法
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，包括以下步骤：
a)提供至少一种重组微生物细胞，其包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因，条件是位置76和211保持未改变；
b)在包含至少一种可发酵碳源的培养基中培养所述至少一种重组微生物细胞，其中生产至少一种选自以下的化合物：oAB、3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢莽草酸、莽草酸、莽草酸3-磷酸、分支酸、预苯酸、甲基邻氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、香草醛、吲哚、吲哚酚、靛蓝、扁桃酸，阿魏酸和肉桂酸。
上文给出的所有定义也适用于本实施方案。重组微生物细胞在本申请中上述用于“微生物发酵”的条件下“培养”。由于该方法旨在有效生产oAB，本领域技术人员理解，在本实施方案中的短语“至少一个重组微生物细胞”优选地表示多个细胞，特别优选至少109个细胞。
“提供”重组微生物细胞表示，在方法步骤结束时，如本申请中上文所述的，存在活的重组细胞。
方法步骤b)优选地进行15至80小时。在一个优选的实施方案中，进行方法步骤b)直至oAB的浓度达到至少1g/L，优选地至少6g/L，最优选地至少9g/L。
组合物
在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，包含：
a)至少一种棒状杆菌属的微生物细胞，其包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因，条件是位置76和211保持未改变；
b)至少一种可发酵碳源；以及
c)至少一种氮源、至少一种磷源、至少一种硫源和微量元素。
上文给出的所有定义也适用于本实施方案。优选地，根据本发明的组合物是包含活体形式的重组微生物细胞的培养基。可发酵碳源是可被微生物细胞利用用于oAB生产的碳源，特别优选葡萄糖、木糖或其混合物。
本领域技术人员理解，在本实施方案中的术语“至少一个”优选地表示多个细胞(特别优选至少109个细胞)以确保微生物发酵的足够时-空产率(space-time yield)。
在本发明的一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物额外地包含oAB，更优选至少1g/L，甚至更优选至少6g/L，最优选至少9g/L的oAB。
以下工作实施例仅用于举例说明本发明。它们并不旨在以任何方式限制权利要求的保护范围。
实施例
材料和方法
使用的生产菌株和表达质粒如表1所示。谷氨酸棒状杆菌菌株在30℃下在CGXII基础培养基(参见表2)中有氧培养，所述CGXII基本培养基具有2％(w/v)葡萄糖作为碳源且光密度(OD)为1。在SY培养基中且然后在VKII培养基中进行预培养(pre-culturing)(参见表2)。在含30ml培养基的500ml玻璃摇瓶中以200rpm转速在旋转振荡器上进行主培养(mainculturing)，或在含100ml培养基的250ml玻璃生物反应器中以分批补料发酵方法进行主培养。将生物反应器中的气体供应和搅拌器速度调节至30％的溶解氧(DO)含量。在发酵开始时最初加入20g/L葡萄糖。如果培养基中的DO超过37％，则通过推注添加(bolus addition)溶解葡萄糖以达到20g/L葡萄糖的浓度。对于pH控制，计量加入1.5mol/L NaOH和4.9mol/L(NH4)2OH的混合物。
为了分析生长，在600nm的波长下进行OD测量。此外，测定细胞的干重。样品的上清液用于在CedexBio分析仪上定量葡萄糖，此外还用于在Luna 3μm C18(2)分离柱上通过HPLC分析测量培养基中的产物浓度。
表1：用于本专利的生产菌株和表达质粒
表2：预培养和主培养基以及储备液的组成
结果
用生产菌株谷氨酸棒状杆菌ΔppcΔtrpD::trpD5进行摇瓶培养，所述菌株已经用不同表达质粒转化。表3示出了在48小时培养期内测量的产物滴度。可以看出，空白质粒对照和携带aroFwt或aroFE154N的表达质粒都没有对菌株背景中的产物形成表现出影响。只有具有aroGnew表达质粒的生产菌株显示最终滴度显著增加54-72％(参见表3)。
表3：来自具有不同表达质粒的摇瓶培养物的产物浓度(g/L)。测量值是来自两个生物学重复的平均值。标准偏差大于5％的测量点用*标记。
为了更精确地表征基因变体aroGnew的积极作用，进行发酵，其中生产菌株谷氨酸棒状杆菌ΔppcΔtrpD::trpD5ΔaroF在每种情况下用表3中所示的表达质粒转化。如表4所示，用携带aroGnew的表达质粒进行的转化对细胞生长、底物摄取、产物滴度和产物产率具有积极影响(参见表4)。基于最终产物产率，aroGnew表达实现了44-48％的提高。
表4：在生物反应器中具有不同表达质粒的生产菌株的发酵表征。
由于上文所示结果证明aroF的表达对测量参数没有影响，菌株谷氨酸棒状杆菌ΔppcΔtrpD::trpD5随后用于进一步研究AroG变体。在这种情况下，菌株谷氨酸棒状杆菌ΔppcΔtrpD::trpD5用pEKEx2_aroGD146N或pEKEx2_aroGS180F转化，用于分别表达来自大肠杆菌的基因变体aroGD146N或aroGS180F。表5清楚地示出了生长、底物消耗和产物滴度明显低于具有aroGnew表达质粒的菌株的测量值(参见表4和5)。应该强调的是，最长达28.9小时的发酵时间，基于质粒的aroGnew表达的产率也明显高于所有其他测试的DAHPS基因变体的产率(参见表4和表5)。在该时间点，aroGnew表达的产物产率分别比aroGD146N和aroGS180F的表达的产物产率高635％和343％。
表5：在生物反应器中具有不同表达质粒的生产菌株的发酵表征。示出的值是来自两个生物学重复的平均值。
讨论
所述实验表明，aroGnew基因变体的引入在生长、底物摄取、产物形成和产物产率方面对于生产菌株具有预料不到的优势。这些观察结果完全是由于在谷氨酸棒状杆菌菌株背景中基于大肠杆菌的aroG基因变体aroGnew的修饰所致，并且不能被所研究的其他DAHP合酶变体复制。

Claims (13)

1.一种棒状杆菌(Corynebacterium)属的重组细胞，其包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因，条件是在所述DAHP合酶的变体中，位置76和211保持未改变。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中在由SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶的变体中，位置10、13、147、148、150、151、179、209、211和212也保持未改变。
3.根据权利要求1或2所述的重组细胞，其中所述细胞是谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组细胞，额外地特征在于
(i)与各自的野生型相比，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性降低，但其中必须存在残余活性；以及
(ii)任选地缺失或失活编码如SEQ ID NO.4定义的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因。
5.包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因的重组细胞用于通过微生物发酵方式生产至少一种化合物的用途，条件是在DAHP合酶的变体中，位置76和211保持未改变，所述至少一种化合物选自oAB、3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢莽草酸、莽草酸、莽草酸3-磷酸、分支酸、预苯酸、甲基邻氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、香草醛、吲哚、吲哚酚、靛蓝、扁桃酸，阿魏酸和肉桂酸。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述微生物细胞是棒状杆菌属种(Corynebacterium sp.)。
7.根据权利要求5或6所述的重组细胞的用途，其中所述重组细胞与相关微生物的野生型的不同之处还在于以下特征：
(i)与各自的野生型相比，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶的活性降低，但其中必须存在残余活性；以及
(ii)任选地缺失或失活编码如SEQ ID NO.4定义的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因。
8.具有如SEQ ID NO.11定义的氨基酸序列的3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)或其变体用于通过微生物发酵生产邻氨基苯甲酸(oAB)的用途，条件是在所述DAHP合酶的变体中，位置76和211保持未改变。
9.一种方法，包含以下步骤：
a)提供至少一种重组微生物细胞，其包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因，条件是位置76和211保持未改变；
b)在包含至少一种可发酵碳源的培养基中培养所述至少一种重组微生物细胞，其中生产oAB。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在方法步骤b)中，在培养基中达到至少1g/L的所述化合物的浓度。
11.一种组合物，其包含：
a)至少一种重组微生物细胞，其包含编码如SEQ ID NO.11定义的DAHP合酶或其变体的基因，条件是在DAHP合酶的变体中，位置76和211保持未改变；
b)至少一种可发酵碳源；以及
c)至少一种氮源、至少一种磷源、至少一种硫源和微量元素。
12.根据权利要求11所述的组合物，还包含至少一种选自以下的化合物：oAB、3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢莽草酸、莽草酸、莽草酸3-磷酸、分支酸、预苯酸、甲基邻氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、香草醛、吲哚、吲哚酚、靛蓝、扁桃酸，阿魏酸和肉桂酸。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述化合物的浓度为至少1g/L。
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